Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндоэкологические особенности влияния ингибитора теломеразы aITEL1296 на теломеразную активность в опухолевых клетках и развитие ксенографтной опухоли

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эндоэкологические особенности влияния ингибитора теломеразы aITEL1296 на теломеразную активность в опухолевых клетках и развитие ксенографтной опухоли"

005015913 На правах рукописи

Жданов Дмитрий Дмитриевич

Эидоэкологические особенности влияния ингибитора теломеразы аГГЕЫ296 на теломеразную активность в опухолевых клетках и развитие ксенографтной опухоли

03.02.08 - ЭКОЛОГИЯ, 03.01.04 - БИОХИМИЯ

3 ¡VIА /I 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005015913

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии Экологического факультета Российского университета дружбы народов и в Первом московском государственном медицинском университете имени И. М. Сеченова.

Научный руководитель

доктор биологических наук Орлова Елена Владимировна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Радыш Иван Васильевич

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится «Jj\ » MA,? 2012 г. в 14 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.203.17 в Российском университете дружбы народов по адресу: 115093, г. Москва, Подольское шоссе, д. 8/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117923, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « »tX/tt^-lA^ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета , у

кандидат биологических наук, доцент Карпухина Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современное состояние окружающей среды характеризуют как экологический кризис, одной из отличительных черт которого является загрязнение биосферы. Химические, физические и биологические ксенобиотические агенты, воздействуя на организм, вызывают развитие множества патологических состояний, снижающих продолжительность и качество жизни людей. Продолжительность жизни населения является одним из основных параметров определяющих экологическое благополучие страны. Увеличение продолжительности жизни возможно при минимизации воздействия патогенных факторов окружающей среды на организм, а также при своевременном нивелировании эффектов (терапии заболеваний), вызванных этими факторами. Многие из ксенобиотиков при длительном воздействии на организм человека вызывают появление генетических мутаций, приводящих к злокачественной трансформации клеток и способствующих развитию опухолевого процесса. Одной из важных задач современной экологии, фармакологии и медицины является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм, а именно, обеспечивать необходимый набор эндоэкологических составляющих. Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и становятся бессмертными (обладают неограниченным репликативным потенциалом). Иммортализация клеток опухолей напрямую связана с активацией теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее при каждом делении клетки.

Теломераза - рибонуклеопротеиновый комплекс, обладающий обратно транскриптазной активностью, катализирующий синтез теломерных повторов на концах хромосом у эукариот. Реактивация теломеразы является одним из ключевых событий при злокачественной трансформации клеток и развитии опухолевого процесса (Hanahan D. et al., 2011). Теломеразная активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека независимо от вида и степени дифференциации (Shay J.W. et al., 1997), в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Активная теломераза поддерживает длину теломер в опухолевых клетках, что позволяет им делиться неограниченное количество раз. Ингибирование теломеразы в активно делящихся опухолевых клетках ведет к укорочению и нарушению структуры и функций теломер,

что вызывает активацию системы ответа на повреждение ДНК и, в конечном итоге, апоптоз опухолевых клеток. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Поиску ингибиторов ТА в опухолевых клетках посвящено большое количество исследований. Найденные ингибиторы принадлежат к различным группам химических веществ и ингибируют ТА по различным механизмам. Однако не все ингибиторы ввиду высокой токсичности, плохой растворимости и проницаемости через клеточные мембраны, быстрому разрушению в организме и пр. являются перспективными для терапевтических целей. Перспективным направлением работ по поиску противоопухолевых препаратов является выявление природных и создание синтетических ингибиторов ТА и их исследование. Такие соединения, как правило, различной химической природы, должны обладать высокой способностью проникновения в клетки, иметь высокую специфичность ингибирующего действия и, следовательно, малое количество побочных эффектов. Однако обнаружено и синтезировано всего несколько соединений, обладающих описанными выше свойствами (Kelland L. R. et al., 2005).

Этими обстоятельствами, а также возможностью использования ингибиторов теломеразы в терапии злокачественных заболеваний (для нивелирования отрицательных эндоэкологических факторов) объясняется необходимость поиска новых ингибиторов ТА и изучения их действия, что делает важным и актуальным настоящее исследование.

Целью работы явился поиск и исследование эндоэкологических особенностей биологического действия нового природного ненуклеозидного ингибитора ТА aITEL1296.

В связи с поставленной целью основные задачи исследования были сформулированы следующим образом.

1. Выявление связи определенного транскрипционного варианта (ТВ) белка теплового шока HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА.

2. Изучение механизма действия обнаруженного соединения aITEL1296 на активность теломеразы.

3. Определение влияния aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса.

4. Определение ингибирования ТА внутри клеток в условиях in vitro.

5. Изучение действия aITEL1296 на рост опухолевых и нормальных клеток в условиях in vitro и совместного действия с другими терапевтическими агентами.

6. Исследование противоопухолевой активности aITEL1296, а также его действия на ТА опухолевых клеток в условиях in vivo на модели с ксенографтной опухолью.

Научная новизна. Впервые проведено исследование экологических особенностей способности нового природного соединения aITEL1296 ингибировать теломеразу в клеточных лизатах и внутриклеточную ТА, а также его способности активировать процесс апоптоза в опухолевых клетках. Выявлена связь транскрипционного варианта 1 белка теплового шока HSP90a с экспрессией каталитической субъединицы теломеразы и ТА. Изучено влияние aITEL1296 на транскрипцию генов основных субъединиц теломеразного комплекса. Осуществлено компьютерное моделирование взаимодействия aITEL1296 с hTERT. Также проведено исследование способности aITEL1296 ингибировать ТА в клетках опухолей и противоопухолевой активности aITEL1296 в условиях in vivo на модели штамма ксенографтной опухоли. Полученные данные позволяют более полно изучать влияние ксенобиотических агентов окружающей среды на организм животных и человека.

Практическая значимость. Полученные данные о связи TBI HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА могут использоваться в качестве дополнительной информации при создании специфических к HSP90a ингибиторов теломеразы. На основании результатов исследования биологического действия aITEL1296, нового ингибитора ТА, можно считать, что данное соединение при дальнейшем изучении может служить основой для создания нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата и изучения влияния факторов окружающей среды на организм. aITEL1296 может также использоваться для фундаментальных медико-экологических исследований в области биологии теломер и теломеразы.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований доложены на конференциях: XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2009), «Experimental Biology - 2010» (Anahaim, USA); 5-ой международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine» (GPBNM-2010, St.Petersburg-Kizhi-Mandrogy-Valaam-Kovenets- St.Petersburg, Russia); 1-ой международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, Россия, 2010); 22nd International Congress on Anti-Cancer Treatment, (Paris, France, 2011). По материалам диссертации опубликовано 4 печатные статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 145 источников. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 6 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение aITEL1296 проводили в Государственном научном центре по антибиотикам под руководством д.б.н. Бибиковой М.В. при постоянном тестировании проб на способность ингибировать ТА.

Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток. Прямое действия aITEL1296 на ТА определяли в лизатах клеток Jurkat (Т-клеточная лейкемия человека) с помощью модифицированного метода TRAP, основанного на ПЦР-амплификации продуктов ТА (Kim N. W. et al., 1994). Кинетические параметры ингибирующей активности aITEL1296 проводили определением ТА в присутствии различных концентраций субстратов (TS-праймера, дАТФ, дТТФ и дГТФ) и aITEL1296. Значение константы Михаэлиса (Km) определяли по зависимости двойных обратных величин Лайнуивера-Берка (Кретович В. Л., 1974, Уэбб Л., 1999). Значение константы ингибирования (Ki) определяли по ряду измерений Km при различных концентрациях ингибитора и вычисляли по зависимости Ki = Km/tg угла наклона полученной кривой (Pascolo Е. et al., 2002).

Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена HSP90a и гена hTERT проводили по анализу количества мРНК данных генов методом ОТ-ПЦР в тканях удаленных первичных опухолей пациентов с раком желудка и кишечника находившихся на лечении в ПМГМУ им. И.М. Сеченова в 2007-2008гг.

Влияние aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса и |5-галоктозидазы определяли по уровню синтеза мРНК генов HSP90a, hTERT, hTR, [l-галоктозидазы ({¡-Gal в качестве маркера состояния репликативного старения) и /32-микроглобулина (В2-М в качестве положительного контроля) в лизатах клеток Jurkat и фибробластах при инкубации с aITEL1296 в течение 72 ч.

Ингибирование aITEL1296 вирусной обратной транскриптазы и компьютерное моделирование взаимодействия aITEL1296 с hTERT. Проводили оценку влияния aITEL1296 на активность гомолога hTERT, обратной транскриптазы (ОТ) вируса мышиной лейкемии Молони (M-MuLV) по анализу способности данного фермента катализировать реакцию обратной транскрипции мРНК гена В2-М в присутствии ингибитора. Компьютерное моделирование взаимодействия aITEL1296 с молекулой

hTERT осуществляли с помощью сервиса SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org) на основе известной структуры TERT 3KYL (аналог hTERT) Tribolium castaneum, из базы данных Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) (Mitchell M. et al. 2010). Оптимизацию модели и построение трехмерной структуры проводили с помощью программы SYBYL 8.1, молекулярный докинг alTEL1296 осуществляли с помощью программы DOCK 6.4 (Rizzo R. С. et al., 2006).

Определение действия aITEL1296 на культивируемые клетки. Для определения влияния на ТА внутри клеток в 24-х луночный планшет вносили клетки линии Jurkat, через 24 часа добавляли aITEL1296 в концентрациях 5, 20 и 50 нг/мл в четырех повторах. Клетки отбирали через 3, 6, 12, 24, 48 и 72 часа после добавления ингибитора. Изучение ингибирования внутриклеточной ТА проводили описанным выше методом. Исследования антипролиферативного действия aITEL1296 выполнены на клетках, обладающих активной теломеразой Jurkat, MCF-7 (карцинома молочной железы), LnCap (карцинома простаты), Colo320 HSR (карцинома толстого кишечника) и нормальных фибробластах человека при помощи МТТ-теста (Mosmann Т., 1983). Для изучения совместного действия aITEL1295 и других терапевтических агентов клетки Jurkat инкубировали с метотрексатом, доксорубицином и циклофосфамидом в концентрациях Vi от GI50 и оценивали их выживаемость.

Определение апоптотических клеток и анализ клеточного цикла проводили методом проточной цитометрии на цитометре BDFACSAria («Becton Dickinson», США) при окрашивании клеток, инкубированных с aITEL1295 72 ч., пропидий йодидиом (Walker Р. R. et al., 1993).

Исследование противоопухолевой активности aITEL1296. Для оценки острого токсического действия aITEL1296 in vivo препарат вводили группам (п = 6) самцов мышей Balb/c весом 20 - 22 г внутрибрюшинно в 0,5% концентрации в дозах 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0 и 14,0 мг/кг однократно. Регистрировали количество погибших мышей, сутки гибели, а также изменение массы тела. Количественную токсичность aITEL1296 определяли по методу наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. Для изучения противоопухолевой активности alTEL1296 вводили в дозах 0,5 и 0,25 от LD|o однократно самцам мышей Balb/c nude (n = 10) с ксенографтной опухолью рака молочной железы человека (РМЖ). Эффективность лечения мышей оценивали по критерию торможения роста опухоли (ТРО) по сравнению с контрольной группой. Во всех экспериментах различия считали статистически достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Накопление научных данных о биологической роли теломер и ферментативном комплексе - теломеразе позволяет предположить успешность терапевтического применения ингибиторов теломеразы как значимого фактора в эндоэкологии, биологии и медицине. Данная работа посвящена исследованию механизма биологического действия нового природного ингибитора ТА а1ТЕ1Л296 и его влияния на рост опухолевых клеток.

Поиск и получение а1ТЕ1Л296

Были исследованы экстракты из мицелия и нативного раствора, полученные в конце ферментации 25 мицелиальных грибов и 55 актиномицетов, выделенных из почвы различных регионов России, а также полученными из коллекции культур микроорганизмов. В результате проделанной работы исследованы 160 экстрактов, из которых высокая ингибирующая активность была выявлена только у экстракта штамма ВггерЮтусея яр. 1296. Хроматография ацетонового экстракта из мицелийной биомассы штамма Йгер^отусе.? эр. 1296 методом тонкослойная хроматография на кизелгеле позволила разделить три группы веществ, отличающихся гидрофильными свойствами (рис. 1).

Установлено, что вещества групп 1 и 2 не оказывают влияние на ТА и оказывают токсическое действие на опухолевые (клетки линии 1игка(:) и нормальные (фибробласты) клетки уже через 24 часа после добавления в культуральную среду. Поэтому вещества групп 1 и 2 были исключены из дальнейшей работы. Одно из веществ зоны 3 проявило способность ингибировать ТА, потому все последующие исследования проводили с данным веществом. Активному соединению было дано название аП'ЯЬ 1296.

Рас. 1 Тонкослойная хроматограмма ацетонового экстракта З^ерЮтусеэ 5р. 1296.

Увеличение гндрофняьности

ГРУППА 3 | ГРУППА 2

ГРУППА 1

Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток

Дозозависимое снижение интенсивности флуоресценции продуктов амплификации ТА в виде «лестницы» дискретных полос с периодичностью 6 пар нуклеотидов обнаруживается при использовании а1ТЕЫ296 в различных концентрациях, что говорит об ингибировании ТА данным соединением (рис. 2). Для а1ТЕЫ296 определено значение 1С50 = 8,4 ± 1,2 нМ и 1С90 = 23,6 ± 4,7 нМ. Данные результаты говорят о высокой эффективности ингибирования ТА.

Для характеристики механизма ингибирования а1ТЕЫ296 взаимодействия теломеразы с четырьмя субстратами была проведена серия кинетических экспериментов. Дозозависимый характер увеличения ТА наблюдался при увеличении концентрации ТБ-праймера в реакционной смеси при отсутствии а!ТЕЫ296.

Рис. 2 Эффективность ингибирования ТА: А -Электрофорез продуктов амплификации ТА в опытах по ингибированию а1ТЕЬ1296. «-» - отрицательный контроль, «+» - положительный контроль; Б - Зависимость ингибирования ТА от концентрации а1ТЕЫ29б.

При добавлении в реакционную смесь а1ТЕЬ1296 наблюдалось заметное снижение Ушах. При наиболее высокой из исследуемых концентраций ингибитора (10 нМ) понижение значения Ушах составило около 60%. Полученные данные были использованы для определения К.т в отсутствие и в присутствии 10 нМ а1ТЕЫ296, а также Кл по отношению к субстратному праймеру (рис. 3).

50 -2 40 - | 30 | 20£ 10 В| я

Кт аКт

Рис. 3 Константа Михаэлиса для ТБ-праймера при отсутствии (Кт) и в присутствии (аКт) 10 нм а!ТЕЬ1296.

Кш и аКш для Т8-праймера имеют значительное отличие, что указывает на влияние а1ТЕЫ296 на взаимодействие теломеразы с субстратным праймером. Вероятным механизмом является ингибирование активного центра взаимодействия с Тв-праймером в молекуле ЬТЕЯТ или нарушение структуры данного центра в результате конформационных изменений молекулы ЬТЕЯТ при взаимодействии с ингибитором.

а!ТЕЫ296 вызывает снижение Ушах на различном уровне для каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), что характерно для неконкурентного ингибирования (рис.4). Увеличение значения аКгп происходит до различного уровня для каждого из дНТФ. Эти данные указывают на различное снижение аффинности активного центра связывания с дНТФ в молекуле ЬТЕЯТ.

Рис. 4 Константы Михаэлиса для каждого дНТФ при отсутствии (Кт) и в присутствии (аКт) 10 нм а!ТЕЫ296.

Увеличение Km по отношению к субстратам и снижение уровня Vmax при добавлении ингибитора характеризует смешанный механизм ингибирования активности теломеразного комплекса. Поскольку aITEL1296 оказывает влияние на взаимодействие теломеразного комплекса с субстратами, то наиболее вероятным представляется ингибирование aITEL1296 каталитической функции молекулы hTERT.

Для определения влияния aITEL1296 на избыточное количество теломеразы был проведен эксперимент по определению ТА в смесях, содержащих повышенное (относительно контроля в 2 тыс. клеток) количество теломеразы. Было установлено, что увеличение теломеразы в реакционной смеси, содержащей aITEL1296, вызывает незначительное изменение количества продуктов ТА (значения статистически недостоверны, р > 0,05). На ТА в большей степени влияет концентрация ингибитора (р < 0,05). Однако данные эксперимента не могут считаться ошибочными, поскольку наблюдалось увеличение продуктов ТА пропорционально возрастанию исходного количества теломеразы при отсутствии в реакционной смеси. Эти данные являются предпосылкой, позволяющей считать, что при ингибировании ТА aITEL1296 увеличение количества теломеразы in vivo в клетках опухолей не приведет к

8

регенерации длины теломер, не повысит выживаемость клеток, и не будет способствовать дальнейшему развитию опухоли.

На основании электрофореграмм амплификатов продуктов ТА можно предположить, что aITEL1296 не оказывает действия на процессивность (способность синтезировать на TS-праймере большое количество теломерных повторов), тогда как действие другого широко изучаемого ингибитора BIBR1532 (Damm К. et al., 2001) вызывает снижение количества синтезируемых повторов TTAGGG (длины теломер) in vitro. В то время как действие aITEL1296 вызывает снижение общего количества теломерных повторов. BIBR1532 является синтетическим ненуклеозидным соединением и обладает наивысшей, из ранее известных ингибиторов, способностью ингибировать ТА (1С50 = 93 нМ) (Ward R. J. et al., 2005). Эти данные указывают на различие участков взаимодействия BIBR1532 и aITEL1296 в молекуле hTERT. Для соединения TMPI это значение составляет 1 мкМ (Hayakawa N. et al., 1999), а для TNQX 1,4 мкМ (Kim J. Н. et al., 2003). Механизм ингибирования ТА aITEL1296, вероятнее всего, основан на снижении аффинности молекулы hTERT к субстратному праймеру (теломерной ДНК в клетках) и уменьшении количества образовавшихся комплексов hTERT с TS-праймером. В пользу этого говорит тот факт, что добавление aITEL1296 в реакционную смесь вызывает повышение Km по отношению к субстратному праймеру. Приведенные данные, однако, не исключают возможность существования другого механизма действия aITEL1296, влияющего и на взаимодействие hTERT с дНТФ.

Вероятной также представляется возможность, при которой взаимодействие aITEL1296 с определенным участком в молекуле hTERT вызывает конформационные изменения сразу в нескольких активных сайтах и изменение их аффинности по отношению к субстратам.

Для терапии злокачественных заболеваний способность снижать аффиность hTERT к теломерной ДНК является более предпочтительной, чем уменьшение процессивности теломеразы, поскольку снижение процессивности не исключает саму возможность синтеза теломер. В этом случае длина теломер, достаточная для дальнейшей пролиферации опухолевых клеток может быть достигнута при увеличении количества теломеразы.

Снижение аффинности теломеразного комплекса к теломерной ДНК в присутствии aITEL1296 говорит о глубоких структурных нарушениях конформации молекулы hTERT (или, по крайней мере, домена, взаимодействующего с теломерной ДНК), что значительно снижает саму возможность образования комплексов hTERT с теломерной ДНК и начала синтеза теломерных повторов.

Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена Н$Р90а и гена /гТЕНТ

Исследование связи ТА с экспрессией определенного ТВ гена НБРЯОа и гена ИТЕЯТ было проведено с целью определения возможного участия определенного ТВ ШР90 в формировании теломеразного комплекса. Продукт ТА обнаруживается в 82,4 и 100% случаев злокачественных заболеваний желудка и кишечника, соответственно, независимо от стадии заболевания и степени дифференцированности опухоли. В окружающей нормальной ткани активность фермента не обнаруживается. Экспрессия гена каталитической субъединицы - ИТЕЯТ наблюдается в 65% случаев при раке желудка и в 80% случаев при раке кишечника (рис. 5).

Рис. 5 Экспрессия исследуемых генов в тканях желудка (А) и кишечника (Б)

I. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР изучаемых генов в исследуемой ткани а — ткань опухоли; б - нормальная ткань; 1 - ген В2-микроглобулина; 2 - ген ШР90АА1 ТВ1; 3 - ген Н8Р90АА1 ТВ2; 4- ген ИТЕЯТ; 5 - отрицательный контроль;

II. Электрофорез продуктов ТА: М - маркер молекулярных масс; 1 — активная теломераза в опухолевой ткани; 2 — инактивированная теломераза; 3 - ТА в нормальной ткани;

III. Выявленная экспрессия изучаемых генов и ТА.

Экспрессия сплайс-формы ИТЕЯТ обнаружена во всех образцах, показавших также положительный результат в отношении полноразмерной формы. Экспрессия ИТЕЯТ, также как и активность теломеразы, не зависит от степени дифференцированности и стадии заболевания. Оказалось, что экспрессия ТВ2 гена Н8Р90АА1 не отличается в нормальной и опухолевой ткани и обнаруживается во всех образцах. Данный факт позволяет говорить о конститутивном синтезе данного ТВ белка в нормальной и опухолевой ткани. Экспрессия ТВ1 гена Н8Р90АА1 также обнаруживается во всех образцах, но увеличена при раке в большинстве случаев,

10

особенно значительно при раке кишечника. Уровень экспрессии ТВ1 коррелирует с ТА (г = 0,86) и уровнем экспрессии гена ЬТЕКТ (г = 0,78). Это позволяет сделать предположение об участии именно ТВ! данного белка в формировании теломеразного комплекса и роли сплайсинга для этого белка в регуляции ТА.

Влияние а1ТЕЬ1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса

а1ТЕЫ296 вызывает ингибирование ТА, однако возможно также влияние ингибитора на экспрессию генов белков теломеразного комплекса. Методом ОТ-ПЦР установлено, что а1ТЕЫ296 не вызывает изменений в экспрессии генов ИТЕЯТ, ТВ1 и ТВ2 гена Н8Р90АА1, и ИТЯ при инкубации опухолевых клеток с а1ТЕЕ1296 в течение 72 ч. (рис. 6). Экспрессия сохраняется на постоянном уровне даже в период активации процессов апоптоза в популяции клеток.

Обнаружено, что экспрессия гена [¡-Са1 начинается через 48 часов после добавления ингибитора и увеличивается к 72 часам. Таким образом, нами показано, что ингибирование ТА а1ТЕЫ296 вызывает переход клеток в состояние репликативного старения без активации апоптоза.

Развитие апоптотических процессов через 72 часа после добавления ингибитора, вероятнее всего, связано с укорочением теломер до критических значений, при которых они не выполняют защитной функции, и активацией системы

клеточного ответа на повреждение ДНК.

Время инкубации

(часы)

К 12 24 48 72 Ф

Р2-М ——

HSP90A.il ТВ1 ---

HSP90A.il ТВ2 Г-::..

ИТЕИТ

11ТК. -------

р-Оа1

Рис. 6 Влияние а1ТЕЫ29б на экспрессию изучаемых генов белков теломеразного комплекса и [!-Са1 в клетках Мгка! и фибробластах: К- контроль, Ф -фибробласты.

При определении уровня экспрессии ^-ба/ в фибробластах использовали РНК, выделенную из клеток инкубированных 72 часа с а1ТЕЬ1296. Отсутствие экспрессии в данном случае указывает на отсутствие влияния а1ТЕЬ1296 на активность данного гена и доказывает, что увеличение синтеза р-Оа1 в опухолевых клетках является прямым результатом перехода клеток в состояние репликативного старения.

Ингибирование а1ТЕЬ1296 вирусной ОТ и компьютерное моделирование взаимодействия а!ТЕЬ1296 с ЬТЕИТ

Добавление а1ТЕЫ296 в реакционную смесь для ОТ вызывает снижение количества ОТ-ПЦР амплификатов гена В2-М, что говорит о способности а1ТЕЬ1296 ингибировать реакцию ОТ, катализируемую обратной транскриптазой М-МиЦУ (рис. 7). Данный факт дает основания полагать, что а1ТЕЫ296 взаимодействует с каталитической субъединицей ЬТЕЯТ теломеразного комплекса и ингибирует реакцию обратной транскрипции при синтезе теломерных повторов на матрице ЬТЛ.

aITEL1296 (мкМ) M 0,05 0,25 0,5 2,5 5 0

WÈÈSÈÊÊÊÈÊÈSÊ

боо п.н -mi Щ

500 п н-BP fPPI ' **

Рис. 7 Электрофорез продуктов амплификации гена р2-М. М - маркер молекулярных масс.

Методом сравнения аминокислотных последовательностей молекулы M-MuLV и белковых компонентов теломеразного комплекса удалось обнаружить несколько участков гомологии с молекулой hTERT. С белковыми молекулами других компонентов теломеразного комплекса гомологии не выявлено. Эти данные также указывают на возможность взаимодействия aITEL1296 именно с каталитической субъединицей теломеразы.

В результате проведенного моделирования структуры hTERT и докинга в данную молекулу aITEL1296 было найдено единственное возможное место взаимодействия ингибитора с белком - домен обратной транскрипции. На расстоянии ЗА0 молекула aITEL1296 взаимодействует со следующими аминокислотами в ОТ домене: LYS - 659, ALA - 660, LEU - 661, LEU - 665, ALA - 670, ARG - 671, PRO -673, LEU - 675, ASP - 685, SER - 843, GLY - 847, GLU - 850, LEU - 864, ARG - 865, LEU - 866, VAL - 867.

Взаимодействие а1ТЕЫ296 с ОТ доменом ИТЕЯТ полностью согласуется с результатами экспериментов по ингибированию данным соединением реакции ОТ М-МиЬУ. Внутри ОТ домена а1ТЕЬ1296 располагается в участке, осуществляющем взаимодействие с теломерной ДНК. Эти данные подтверждают результаты кинетических экспериментов, в которых применение а1ТЕЫ296 вызывало снижение аффинности ИТЕЯТ к ТБ-праймеру (аналогу теломерной ДНК в клетке).

Результаты моделирования также говорят в пользу такого механизма ингибирования ТА, при котором взаимодействие а1ТЕЕ1296 с участком в ОТ домене молекулы ИТЕЯТ вызывает структурные изменения в участке связывания с теломерной ДНК, что нарушает образование комплексов теломеразы с теломерной ДНК.

Определение действия ингибитора ТА на культивируемые клетки

Исследование ингибирования ТА внутри опухолевых клеток показало дозовую зависимость от концентрации а1ТЕЬ1296 (данные статистически достоверны, р < 0,05) и значительное снижение ТА в период 6-24 часа после добавления а1ТЕЕ1296 (рис. 8).

Рис. 8 Зависимость ингибирования ТА внутри клеток ЛгкШ от времени инкубации с ингибитором и концентрации а1ТЕЫ296.

В период 24 - 72 часа ТА находилась на низком уровне и не зависела от концентрации а1ТЕЬ1296. В период 3-6 часов ингибирования ТА не наблюдалось. Это время, вероятно, необходимо для проникновения а1ТЕЕ1296 через клеточные мембраны и взаимодействия с теломеразой.

При помощи МТТ-теста установлено, что в период 24 - 48 часов после добавления в культуральную среду а1ТЕЫ296 не оказывает действия на опухолевые клетки всех изучаемых линий. Это указывает на отсутствие острого цитотоксического эффекта данного соединения. Через 72 часа после добавления а1ТЕЕ1296 наблюдается массовая дозозависимая клеточная гибель во всех изучаемых опухолевых клеточных линиях (рис. 9).

Иг

+-

I

¥

- -Т.

0 б 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 Время (часы)

¡ЦТЕ1Л296 - ■ -Зшг/ш —20«г/ил «Ш-Миг/мл —♦— Контроль

Рис. 9 Зависимость выживаемости опухолевых клеток от времени и концентрации а1ТЕЫ296.

а1ТЕЫ296 обладает мощным антипролиферативным эффектом, и в пролонгированном действии эффект малых доз сравним с действием высоких доз. Значения О150 и СТ90 представлены в таблице 1.

На нормальные фибробласты человека (клетки без активной теломеразы и нормальной длиной теломер) а1ТЕЫ296 не оказывает подавляющего действия в дозах, критичных для опухолевых клеток (рис. 10). Ингибирование роста (и, вероятно, жизнеспособности) фибробластов наблюдается при увеличении концентрации а1ТЕЫ296 на порядок и через 24 часа, что указывает на клеточную смерть, вероятно, по некротическому пути.

Рис. 10 Зависимость выживаемости фибробластов от времени инкубации и концентрации а1ТЕЫ296.

Отсутствие влияния а1ТЕЫ296 на нормальные фибробласты человека в дозах, критичных для опухолевых клеток, указывает на избирательность действия данного соединения по отношению к опухолевым клеткам.

Анализируя полученную информацию можно сделать предположение о механизме влияния а1ТЕЫ296 на опухолевые клетки. Добавление а1ТЕЫ296 в культуральную среду вызывает ингибирование ТА в клетках, однако в течение 48

часов клетки сохраняют жизнеспособность, активный метаболизм и продолжают активно делиться. В процессе деления клеток утративших ТА, происходит уменьшение длины теломер до критических значений, часть клеток переходит в состояние репликативного старения. Дальнейшее укорочение теломер вызывает потерю их защитных функций, и через 72 часа в клетках активируются процессы, приводящие к клеточной гибели.

Таблица 1. Значение &5о и О1д0 для различных клеточных линий опухолей через 72 часа после добавления а!ТЕЬ1296.

Клеточная линия Значение Gl50 (нг/мл) Значение GI90 (нг/мл)

Jurkat 10,7 ±0,5 64,4 ± 2,6

LnCap 5,0 ± 0,2 48,6 ± 1,8

MCF-7 12,9 ±0,5 93,4 ±4,5

Colo 320HSR 16,8 ±0,8 57,0 ± 1,3

Изучение совместного действия aITEL1296 и противоопухолевых препаратов на

рост опухолевых клеток

По результатам МТТ-теста установлено, что aITEL1296 вызывает усиление действия всех изучаемых противоопухолевых соединений (рис. 11). Наиболее выраженный синергетический антипролиферативный эффект наблюдается при применении метотрексата. aITEL1296 вызывает повышение цитотоксичности данного препарата более чем в 3 раза. Концентрация aITELI296 не оказывает значительного влияния на действие изучаемых препаратов (различие между группами клеток с разными концентрациями aITEL1296 не достоверны, р > 0,05).

Более существенным оказывается сам факт присутствия aITEL1296 (различия между группами клеток в присутствии и в отсутствии aITEL1296 достоверны, р < 0,05).

В литературе имеются данные, указывающие на протективный эффект молекулы hTERT к действию патогенных факторов окружающей среды (Ahmed S. et al., 2008, Lu С. et al., 2001). Вероятнее всего ингибирование hTERT вызывает потерю данных функций, что ведет к нарушению эндоэкологического равновесия и вызывает гибель опухолевых клеток. Результаты, полученные в данном эксперименте могут

использоваться при разработке химиотерапии опухолевых заболеваний по комбинированной схеме.

Рис. 11 Совместное действие а1ТЕЬ1296 и противоопухолевых терапевтических препаратов на рост клеток Лгка1: А - метотрексат (2,5 мкг/мл), Б - доксорубицин (0,35 мкг/мл), В - циклофосфамид (3,4 мкг/мл).

Определение влияния аГТЕЫ296 на клеточный цикл и апоптоз в культивируемых клетках

В клетках, инкубированных с а!ТЕЫ296, через 72 часа после его добавления наблюдается активация процессов апоптоза. Количество опухолевых клеток, находящихся в стадии апоптоза, вызванного применением а1ТЕЫ296, показано на рис. 12. При использовании а1ТЕЫ296 в клетках .1игка1: наблюдается изменение клеточного цикла, при котором клетки находятся преимущественно в стадии во/О! и не вступают в стадию 02/М (табл. 2).

. «}........ * 40 4......... ¡1 :ц || £ Г 11 : | :.......г Л|1 || 1

1игка< 1_пСар МСР-7 Сок.320ШК □ Контроль И аГШ.1296

Рис. 12 Количество опухолевых клеток в стадии апоптоза в отсутствие и в присутствии а!ТЕЬ1296.

Такое изменение цикла может объясняться укорочением теломер до минимальных значений у большинства клеток в популяции и их переход в состояние репликативного старения, при котором сохраняется жизнеспособность и активный клеточный метаболизм. А в клетках, теломеры которых, вероятно, укоротились до

критических значений и утратили защитные функции, активируются процессы апоптоза.

Различие значений С150 и С190 у различных клеточных линий вероятнее всего объясняется разницей изначальных длин теломер и интенсивностей деления клеток. Клетки, имеющие более короткие теломеры и делящиеся более интенсивно, достигают предела клеточного деления (лимита Хэйфлиха) раньше, чем клетки с более длинными теломерами и малой интенсивностью деления. Следовательно, количество клеток в состоянии апоптоза будет выше в линиях с короткими теломерами.

Таблица 2. Клеточный цикл при инкубации с а/ТЕИ296.

Стадия клеточного цикла Процент клеток в популяции

Jurkat LnCap MCF-7 Colo 320HSR

Контроль alTEL 1296 Контроль alTEL 1296 Контроль alTEL 1296 Контроль alTEL 1296

Со/С1 52,2 ± 0,5 67,6 ± 2,9 59,8 ± 0,6 64,8 ± 2,3 65,3 ± 0,4 67,0 ± 1,3* 57,6 ± 0,6 57,8 ± 1,9*

8 27,2 ± 0,5 27,2 ± 0,7* 20,0 ± 0,4 12,3 ± 0,6 21,0 ± 0,3 18,3 ± 0,5 26,5 ± 0,6 17,3 ± 1,0

02/М 20,7 ± 0,4 5,3 ± 0,2 20,2 ± 0,2 22,9 ± 0,6 13,7 ± 0,5 14,7 ± 0,5* 15,6 ± 0,3 25,0 ± 1,2

* Не достоверно по отношению к контролю (р > 0,05)

Увеличенный уровень синтеза ЬТЕЯТ опухолевыми клетками может явиться одним из механизмов повышения устойчивости клеток к действию ксенобиотиков, чужеродных для организма веществ, вызывающих нарушение биологических процессов как эндоэкологической составляющей, включая заболевание и гибель организма. Злокачественная трансформация нормальных клеток, и как следствие, развитие опухолевого процесса, вероятно, является результатом нарушения адаптативных возможностей клеток, тканей и организма в целом. Таким образом, молекула ЬТЕЯТ функционирует в опухолевых клетках, в качестве регулятора внутриклеточного гомеостаза, т.е. способности сохранять постоянство скоррелированных процессов, поддерживающих жизнедеятельность клетки. Молекула ЬТЕЯТ позволяет опухолевым клеткам осуществлять гетеростазис, т.е. достигать более устойчивого состояния внутренней среды, служащего основой для усиления опухолевого процесса.

Изучение противоопухолевой активности а1ТЕЫ296

Для определения противоопухолевой активности осуществляли подбор дозы а1ТЕЬ1296 на основе данных эксперимента по установлению острой токсичности препарата у мышей Ва1Ь/с. а1ТЕ1Л296 в токсических дозах вызывал гибель животных на 5 — 7 сутки после введения (табл. 3) на фоне снижения двигательной активности и потери массы тела на 15 - 25%. Это свидетельствует, как следует из литературных данных, о вероятном гематотоксическом действии соединения (Трещалин И. Д., 1983). У выживших мышей (мышей, получивших более низкие дозы а1ТЕЫ296) в течение 17-21 суток после введения отмечено снижение массы тела на 15 - 20% с восстановлением к 25 - 30 суткам. В табл. 4 Представлены рассчитанные токсические дозы а1ТЕЬ1296, на основании которых значение ЬОю считали равным 5,0 мг/кг. Таким образом, за дозы для исследования противоопухолевой активности аГГЕЬ1296 приняли \/21Л\ъ и 1/41ЛЭц), т.е. 0,250 и 0,125 мг/кг соответственно.

При определении противоопухолевой активности а!ТЕЬ1296 вводили однократно для минимизации травматического действия процедуры. Введение а1ТЕЬ1296 на 4-е сутки после трансплантации опухоли вызывало торможение ее роста в течение всего периода наблюдения, что особенно заметно на более поздних сроках (рис. 13).

Таблица. 3. Сроки гибели мышей, получивших токсические дозы а1ТЕЫ29б.

Доза, мг/кг Сутки гибели Гибель (погибшие/количество особей в группе)

4,0 - 0/6

6,0 7 1/6

8,0 5, 6,6 3/6

10,0 5, 5, 6, 7 4/6

12,0 5, 5, 5, 6, 6 5/6

14,0 5, 5, 5, 5, 6 6/6

Таблица 4. Токсические дозы а!ТЕЫ296.

Токсические дозы, мг/кг

1Л),6 ьо50 Ь084 ЕОюо

5,35 8,60 11,80 13,4

К концу периода наблюдения в группах мышей, получивших а1ТЕ1Л296, показатель ТРО составил 33 - 40% в зависимости от дозы. Однако значимых различий между уровнями ТРО у групп животных, получивших различные дозы аГГЕЫ296, не наблюдалось (р > 0,05), поскольку индивидуальный разброс показателя ТРО в данных группах был достаточно велик, что не позволило получить достоверных различий между группами. Отсутствие достоверных различий, в данном случае, может быть объяснено не высокой чувствительностью клеток опухоли РМЖ к действию данного ингибитора.

Анализ полученных данных показывает, что модель РМЖ является чувствительной к действию а1ТЕЬ1296. Увеличение эффекта противоопухолевого действия а1ТЕЫ296 может быть достигнуто при применении более высоких доз а1ТЕ1Л296 и неднократном введении. Таким образом, можно считать, что а1ТЕЫ296 обладает противоопухолевым действие на раковые клетки с активной теломеразой.

а1ТЕЫ296 может также использоваться для фундаментальных исследований в области биологии теломер и теломеразы.

Высокая специфичность действия соединения снижает вероятность появления побочных эффектов, что усиливает экологичность, увеличивая качество и продолжительность жизни людей. Средняя ожидаемая продолжительность жизни населения, т.е. число лет, которое в среднем предстоит прожить представителям данного поколения при предположении, что их смертность при переходе из одной

19

возрастной группы в другую будет равна современному уровню смертности в этих возрастных группах, является одним из главных показателей экологического благополучия страны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные подходы к терапии злокачественных заболеваний заключаются в воздействии на специфические для опухолевых клеток молекулы-мишени, т.е. развивается т.н. таргетная терапия как один из важных эндоэкологических критериев в современной биологии и медицине. Теломераза активна в большинстве опухолей человека и является одной из таких молекул. Воздействие на теломеразу специфическими ингибиторами вызывает в процессе пролиферации клеток уменьшение длины теломер, нарушение их структуры и потерю функций. Эти процессы приводят к активации процессов апоптоза и вызывают гибель опухолевых клеток.

В данной работе показано, что обнаруженное нами новое природное соединение ненуклеозидного ряда а1ТЕЫ296 обладает способностью ингибировать ТА в клеточных лизатах. Изучение кинетических характеристик процесса ингибирования позволило сделать вывод о смешанном неконкурентном (по отношению к субстратам) характере взаимодействия а!ТЕЫ296 с теломеразным комплексом.

Изучение связи ТВ белка Н8Р90а с ТА и экспрессией гена ИТЕЯТ дало возможность сделать предположение о наиболее вероятном участии ТВ1 Н8Р90а в формировании теломеразного комплекса. Исследование количества мРНК белков теломеразного комплекса в клетках, инкубированных с аГГЕЫ296, указывает на отсутствие влияния ингибитора на экспрессию данных генов. Исследование уровня экспрессии гена /?-С7а/ в этих клетках доказало их пребывание в состоянии репликативного старения.

На основании данных, полученных из экспериментов по ингибированию действия вирусной обратной транскриптазы а1ТЕ1Л296 и анализа степени ее гомологии с субъединицами теломеразного комплекса, удалось выявить участки гомологии лишь в молекуле ЬТЕЛТ. Эти данные были использованы для построения компьютерной модели взаимодействия а1ТЕ1Л296 с молекулой ИТЕЯТ. Наиболее вероятным представляется взаимодействие аГГЕЫ296 с участком домена обратной транскрипции молекулы каталитической субъединицы теломеразы, что вызывает нарушение образования комплексов теломеразы с теломерной ДНК и ингибирование ТА.

aITEL1296 легко проникает через клеточные мембраны и вызывает устойчивое ингибирование ТА внутри опухолевых клеток. Ингибирование ТА aITEL1296 вызывает активацию процессов апоптоза и гибель опухолевых клеток. В дозах, критичных для опухолевых клеток, aITEL1296 не оказывает действия на пролиферацию нормальных фибробластов человека, что указывает на избирательность его действия. aITEL1296 вызывает усиление действия других противоопухолевых терапевтических препаратов.

Исследование противоопухолевого действия aITEL1296 в условиях in vivo на модели ксенографтной опухоли РМЖ показало способность данного соединения ингибировать ТА внутри клеток опухоли и подавлять рост опухоли.

Данная работа является фундаментальным эндоэкологическим исследованием биологического действия нового ингибитора ТА, который обладает хорошей проницаемостью через клеточные мембраны, высокой специфичностью действия и низкой токсической активностью. На основании данного ингибитора, при условии дальнейшего исследования, возможно создание нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата. aITEL1296 также может быть использован в исследованиях в области биологии теломер и теломеразы.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено новое природное соединение aITEL1296, которое эффективно ингибирует ТА в клеточных лизатах (1С50 = 8,4 ± 1,2 нМ), вероятно, взаимодействуя с доменом обратной транскрипции каталитической субъединицы теломеразного комплекса по механизму смешанного неконкурентного взаимодействия.

2. Показано, что TBI HSP90a участвует в формировании теломеразного комплекса.

3. aITEL1296 не влияет на экспрессию генов белков теломеразного комплекса.

4. В условиях in vitro aITEL1296 эффективно ингибирует ТА внутри опухолевых клеток, что вызывает их переход в состояние репликативного старения и активацию процессов апоптоза. В дозах критичных для опухолевых клеток aITEL1296 не оказывает действия на пролиферацию нормальных клеток.

5. aITEL1296 ингибирует ТА в условиях in vivo и обладает противоопухолевым действием на модели с ксенографтной опухолью РМЖ.

6. aITEL1296 усиливает действие других противоопухолевых агентов и при дальнейшем исследовании может служить основой для создания высокоспецифичного препарата для терапии злокачественных опухолей.

21

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Жданов Д. Д., Коваленко Н. А., Хоробрых Т. В., Быков И. И., Северин С. Е., Орлова В. С. Теломеразная активность и ее связь с экспрессией транскрипционных вариантов гена HSP90a и гена каталитической субъединицы теломеразы при опухолевых заболеваниях желудка и кишечника // Молекулярная медицина. - 2009. -№6 -С. 37-41.

2. Жданов Д. Д., Орлова Е. В. Ингибиторы функций теломер и теломеразы // Молекулярная медицина. -2011,- № 2. - С. 3-17.

3. Коваленко Н. А., Жданов Д. Д., Бибикова М.В., Готовцева В. Ю. Влияние соединения aITEL1296 на теломеразную активность и рост опухолевых клеток // Биомедицинская химия.-2011.-Том. 57.-С. 501 -510.

4. Жданов Д. Д., Соколов Н. Н. Механизм альтернативного удлинения теломер в опухолевых клетках // Молекулярная медицина. - 2011. - №5. - С. 3 - 16.

Другие научные издания

5. Жданов Д. Д. Теломеразная активность и ее связь с экспрессией транскрипционных вариантов гена HSP90a и гена каталитической субъединицы теломеразы при опухолевых заболеваниях желудка и кишечника // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»— Москва, 2009. - С. 9.

6. Zhdanov D., Kovalenko N., Orlova E. Molecular chaperone HSP90a isoform 1 forms telomerase complex // FASEB Journal. - 2010. - Vol. 24. - P. 464.3

7. Zhdanov D. D., Kovalenko N. A., Abakumova O. Y., Bibikova M. V. Gotovtseva V. Y. Telomerase inhibitor suppresses growth of cancer cells in vitro // Abstract Book of 5lh International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine", Russia, St.Petersburg-Kizhi-Mandrogy-Valaam-Kovenets- St.Petersburg. -2010.-P. 70.

8. Жданов Д. Д., Коваленко Н. А., Абакумова О. Ю., Бибикова М.В., Готовцева В. Ю., Соколов Н. Н. Исследование взаимодействия ингибитора теломеразной активности с субъединицами теломеразы // Материалы I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». - Москва, 2010. - С. 102.

9. Zhdanov D. D., Kovalenko N. A., Bibikova М. V. Gotovtseva V. Y Influence of compounds ITEL1296 and aITEL1296 on telomerase activity and the growth of cancer cells // Materials of 22nd International Congress of Anti-Cancer treatment. - France, Paris, 2011. -P. 352.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю - доктору биологических наук, профессору Орловой Елене Владимировне за помощь и поддержку при выполнении данной работы, а также всему профессорско-преподавательскому составу Российского университета дружбы народов за полученные знания. Особо благодарю кандидата биологических наук, старшего научного сотрудника Первого Московского Государственного Медицинского Университета им. И. М. Сеченова Коваленко Наталию Аркадьевну за руководство и помощь при выполнении и написании данной работы. Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории медицинской биотехнологии Учреждения российской академии медицинских наук НИИ Биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН и лично доктору биологических наук, профессору Соколову Николаю Николаевичу за предоставление материально-технической базы для проведение экспериментов и полезные рекомендации, а также доктору биологических наук ОАО «ГосНИИ Синтез-белок» Бибиковой Маргарите Васильевне и ее коллегам за предоставление а!ТЕЬ1296.

Список сокращений

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

дГТФ - дезоксигуанидинтрифосфат

кДНК - комплементарная ДНК

ОТ - обратная транскрипция

РМЖ - рак молочной железы

ПААГ - полиакриламидный гель

П.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТА - теломеразная активность

ТВ - транскрипционный вариант

ТРО - торможение роста опухоли

HSP - heat shock protein, белок теплового шока

hTR - human telomerase RNA, теломеразная РНК человека

hTERT - human telomerase reverse transcriptase, теломеразная обратная транскриптаза человека

TRAP - telomeric repeat amplification protocol, метод амплификации теломерных повторов

Заказ № 76-П/04/2012 Подписано в печать 13.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жданов, Дмитрий Дмитриевич, Москва

61 12-3/906

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

ЖДАНОВ ДМИТРИЙ ДМИТРИЕВИЧ

ЭНДОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ ИНГИБИТОРА ТЕЛОМЕРАЗЫ аГГЕЫ296 НА ТЕЛОМЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ И РАЗВИТИЕ КСЕНОГРАФТНОЙ ОПУХОЛИ

Специальность 03.02.08 - Экология 03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Орлова Елена Владимировна

Москва

2012

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1 Структурно-функциональная организация и регуляция функций теломер и теломеразы 10

1.2 Эндоэкологические особенности теломеразы при минимизации воздействия патогенных факторов окружающей среды 19

1.3 Роль теломеразы при канцерогенезе и других заболеваниях 20

1.4 Способы определения теломеразной активности 24

1.5 Ингибирование ТА 29 Глава 2. Материалы и методы 46

2.1 Поиск и получение действующего вещества 46

2.2 Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток 47

2.3 Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена НБРЯОа и

гена кТЕЯТ 50

2.4 Влияние аГГЕЬ1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса 54

2.5 Ингибирование аГГЕЫ296 вирусной ОТ и компьютерное моделирование взаимодействия а1ТЕЬ 1296 с ИТЕЯТ 5 5

2.6 Определение действия а1ТЕЕ1296 на культивируемые клетки 56

2.7 Определение апоптотических клеток и анализ

клеточного цикла 58

2.8 Исследование противоопухолевой активности аГГЕЬ 1296 59 Глава 3. Результаты и их обсуждение 62 3.1 Поиск и получение а1ТЕЬ 1296 62

3.2 Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток 68

3.3 Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена HSP90a

и гена hTERT 77

3.4 Влияние aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса 82

3.5 Ингибирование aITEL1296 вирусной ОТ и компьютерное моделирование взаимодействия alTEL 1296 с hTERT 85

3.6 Определение действия ингибитора ТА на

культивируемые клетки 90

3.7 Изучение совместного действия aITEL1296 и противоопухолевых препаратов на рост опухолевых клеток 94

3.8 Определение влияния alTEL 1296 на клеточный цикл и

апоптоз в культивируемых клетках 96

3.9 Изучение противоопухолевой активности alTEL 1296 101 Заключение 208 Выводы ид Литература Ш Благодарности 126

Список сокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

дГТФ - дезоксигуанидинтрифосфат

кДНК - комплементарная ДНК

ОТ - обратная транскрипция

РМЖ - рак молочной железы

ПААГ - полиакриламидный гель

П.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТА - теломеразная активность

ТВ - транскрипционный вариант

ТРО - торможение роста опухоли

HSP - heat shock protein, белок теплового шока

hTR - human telomerase RNA, теломеразная РНК человека

hTERT - human telomerase reverse transcriptase, теломеразная обратная транскриптаза человека

TRAP - telomeric repeat amplification protocol, метод амплификации теломерных повторов

Введение

Актуальность работы

Современное состояние окружающей среды характеризуют как экологический кризис, одной из отличительных черт которого является загрязнение биосферы. Химические, физические и биологические ксенобиотические агенты, воздействуя на организм, вызывают развитие множества патологических состояний, снижающих продолжительность и качество жизни людей. Продолжительность жизни населения является одним из основных параметров, определяющих экологическое благополучие страны. Увеличение продолжительности жизни возможно при минимизации воздействия патогенных факторов окружающей среды на организм, а также при своевременном нивелировании эффектов (терапии заболеваний), вызванных этими факторами. Многие из ксенобиотиков при длительном воздействии на организм человека вызывают появление генетических мутаций, приводящих к злокачественной трансформации клеток и способствующих развитию опухолевого процесса.

Одной из важных задач современной экологии, фармакологии и медицины является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм, а именно, обеспечивать необходимый набор эндоэкологических составляющих. Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных

соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и становятся бессмертными (обладают неограниченным репликативным потенциалом). Иммортализация клеток опухолей напрямую связана с активацией теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее при каждом делении клетки.

Теломераза - рибонуклеопротеиновый комплекс, обладающий обратно транскриптазной активностью, катализирующий синтез теломерных повторов на концах хромосом у эукариот. Реактивация теломеразы является одним из ключевых событий при злокачественной трансформации клеток и развитии опухолевого процесса [56].

Теломеразная активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека независимо от вида и степени дифференциации [120], в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Активная теломераза поддерживает длину теломер в опухолевых клетках, что позволяет им делиться неограниченное количество раз. Ингибирование теломеразы в активно делящихся опухолевых клетках ведет к укорочению и нарушению структуры и функций теломер, что вызывает активацию системы ответа на повреждение ДНК и, в конечном итоге, апоптоз опухолевых клеток. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Поиску ингибиторов ТА в опухолевых клетках посвящено большое количество исследований. Найденные ингибиторы принадлежат к

различным группам химических веществ и ингибируют ТА по различным механизмам. Однако не все ингибиторы ввиду высокой токсичности, плохой растворимости и проницаемости через клеточные мембраны, быстрому разрушению в организме и пр. являются перспективными для терапевтических целей.

Перспективным направлением работ по поиску противоопухолевых препаратов является выявление природных и создание синтетических ингибиторов ТА и их исследование. Такие соединения, как правило, различной химической природы, должны обладать высокой способностью проникновения в клетки, иметь высокую специфичность ингибирующего действия и, следовательно, малое количество побочных эффектов. Однако обнаружено и синтезировано всего несколько соединений, обладающих описанными выше свойствами [64].

Этими обстоятельствами, а также возможностью использования ингибиторов теломеразы в терапии злокачественных заболеваний (для нивелирования отрицательных эндоэкологических факторов) объясняется необходимость поиска новых ингибиторов ТА и изучения их действия, что делает важным и актуальным настоящее исследование.

Целью работы явился поиск и исследование эндоэкологических особенностей биологического действия нового природного ненуклеозидного ингибитора ТА аГГЕЫ296.

В связи с поставленной целью основные задачи исследования были сформулированы следующим образом.

1. Выявление связи определенного транскрипционного варианта (ТВ) белка теплового шока HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА.

2. Изучение механизма действия обнаруженного соединения aITEL1296 на активность теломеразы.

3. Определение влияния aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса.

4. Определение ингибирования ТА внутри клеток в условиях in vitro.

5. Изучение действия aITEL1296 на рост опухолевых и нормальных клеток в условиях in vitro и его совместного действия с другими терапевтическими агентами.

6. Исследование противоопухолевой активности aITEL1296, а также его действия на ТА опухолевых клеток в условиях in vivo на модели с ксенографтной опухолью.

Научная новизна работы

Впервые проведено исследование экологических особенностей способности нового природного соединения aITEL1296 ингибировать теломеразу в клеточных лизатах и внутриклеточную ТА, а также его способности активировать процесс апоптоза в опухолевых клетках. Выявлена связь транскрипционного варианта 1 белка теплового шока HSP90a с экспрессией каталитической субъединицы теломеразы и ТА. Изучено влияние aITEL1296 на транскрипцию генов основных субъединиц теломеразного комплекса. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия aITEL1296 с hTERT. Также проведено исследование

способности aITEL1296 ингибировать ТА в клетках опухолей и противоопухолевой активности aITEL1296 в условиях in vivo на модели штамма ксенографтной опухоли. Полученные данные позволяют более полно изучать влияние ксенобиотических агентов окружающей среды на организм животных и человека.

Практическая значимость работы

Полученные данные о связи TBI HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА могут использоваться в качестве дополнительной информации при создании специфических к HSP90a ингибиторов теломеразы. На основании результатов исследования биологического действия aITEL1296, нового ингибитора ТА, можно считать, что данное соединение при дальнейшем изучении может служить основой для создания нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата и изучения влияния факторов окружающей среды на организм. aITEL1296 может также использоваться для фундаментальных медико-экологических исследований в области биологии теломер и теломеразы.

Апробация работы и публикации по теме исследования

Результаты исследований доложены на конференциях: XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2009), «Experimental Biology - 2010» (Anahaim, USA); 5-ой международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine» (GPBNM-2010, St.Petersburg-Kizhi-Mandrogy-Valaam-Kovenets- St.Petersburg, Russia); 1-ой

международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, Россия, 2010); 22nd International Congress on Anti-Cancer Treatment, (Paris, France, 2011). По материалам диссертации опубликовано 4 печатных статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре экологического факультета Российского университета дружбы народов 17 октября 2011 года

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 126 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 145 источников. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 6 таблицами.

Работа выполнена на базе кафедры прикладной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов, а также на базе лаборатории биотехнологии Первого московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структурно-функциональная организация и регуляция функций теломер и теломеразы

На концах хромосом всех эукариотических и некоторых прокариотических организмов с линейной ДНК расположены теломеры -ДНК-белковые комплексы. Длина теломер уменьшается на 50 - 200 нуклеотидов при каждом цикле репликации, поэтому клетки способны делиться лишь ограниченное число раз («лимит Хэйфлика»). Теломеры позвоночных организмов в т.ч. и человека состоят из двуцепочечных повторов 5'-(TTAGGG)n-3> в количестве 2-30 тыс. п. н. и заканчиваются на 3"-конце одноцепочечной цепью из 50 - 300 нуклеотидов (т.н. 3"overhang). Теломерный конец хромосом загибается под углом 180° и образует т.н. Т-петлю (telomere loop), а 3"overhang взаимодействует с комплементарным участком комплементарной цепи и образует т.н. D-петлю (displacement loop) (рис. 1 а [31]) [54].

ДНК обычно представляет собой димерную молекулу, в которой комплементарные друг другу основания удерживаются водородными связями. Однако некоторые последовательности ДНК, содержащие большое количество гуанина, при некоторых условиях могут образовывать структуры из 4-х гуаниновых оснований, называемые G-quadruplex. Такие структуры были обнаружены на концах хромосом в теломерах. G-quadruplex образуются при взаимодействии 4-х близкорасположенных гуанинов, соединенных друг с другом 8-ю хугстиновскими водородными связями (рис 1. Б [98]). Каждый гуанин приобретает anti- или syп-конформацию в зависимости от ориентации своей гликозидной связи и образует две водородные связи с соседним гуанином (N1 образует

водородную связь с Об, а N2 с N7). ДНК способны образовывать в-диаёгир1ех структуры, состоящие из 1 - 4 слоев при различных условиях.

Рис 1. Строение теломерной ДНК: (а) Теломерный участок на концах хромосом и вид Т- и О-петелъ; (б) 4 гуаниновых основания связанные хугстиновскими водородными связями; (в) строение теломерной С-

циас1гир1ех структуры.

Множество исследований было проведено с целью установления топологического строения теломерных 0-яиаёгир1ех. Было найдено, что в теломерах образуется устойчивая структура из трех С-яиас1гир1ех слоев, ориентированных «апП-апП-Буп-зуп» и соединенных ТТА-петлями по латеральным и диагональным направлениям. Такая структура образуется в присутствии иона Были также обнаружены другие формы в-

Яиаёгир1ех в присутствии иона К+ в специфических условиях (рис 1 в [98]) [23].

S'-TTAGGC GGGTTA-3'

3'-AATCCCAATCGCAA7 CCCAAT-5'

TRF2 QE

JO'

—.

пшат

■ВШ

S'-TTAO1

СНА и

POT I

Till 2

13®

POT1

зтваа-а*

TMF1 TRF2/f?ap1

Рис. 2 Белки шелтеринового комплекса: (а) Доменное строение белков и их взаимодействие с другими белками и ДНК; (б) Шелтериновый комплекс на

теломерной ДНК.

Шесть белков шелтеринового комплекса взаимодействуют с теломерными повторами (рис. 2 [32]). TRF1 (telomere repeat binding factor 1) - гомодимерный белок, содержащий С-концевой Myb-домен, который

W V/ \Т V

взаимодействует с теломерной последовательностью и N-концевой домен с кислотными свойствами. TRF2 имеет схожую структуру, но содержит N-концевой домен с основными свойствами. TRF1 имеет сродство к двойной теломерной ДНК приблизительно в 4 раза большую чем TRF2. Белок РОТ1 (protection of telomerase 1) - белок, имеющий сродство к одноцепочечной

ДНК 3"overhang из-за присутствия в его молекуле специфических ОВ-доменов (oligonucleotide binding domen). РОТ1 также взаимодействует с белками TRF1 и TRF2 опосредованно, через белок ТРР1 (telomere protection protein 1) и TIN2 (TRF1 interacting nuclear protein 2), который также связывается с TRF1 и TRF2. Белок RAP1 (repressor-activator protein 1) содержит Myb-домен, взаимодействующий с двойной теломерной ДНК и домен для взаимодействия с TRF2 [123].

Шелтериновый комплекс участвует в образовании 3" overhang (рис. 3 а [32]). После процесса репликации 5'-конец каждой хромосомы подвергается действию неизвестной нуклеазы, которая последовательно отщепляет нуклеотиды до встречи с последовательностью 5 -АТС. Таким образом на Зл-конце комплементарной цепи образуется участок для взаимодействия с РОТ1. При отсутствии белка РОТ1 нуклеазная активность либо отсутствует, либо образует дефектный 3'overhang, который вызывает негомологичное присоединение к концам теломер других спонтанных нуклеиновых фрагментов, теломер-теломерные взаимодействия и, в конечном итоге, хромосомную дестабилизацию.

Шелтериновый комплекс также участвует в образовании Т- и D-петель (рис. 3 б [32]). Был предложен механизм, согласно которому с одним Зл overhang могут связываться белки РОТ1 сразу от нескольких шелтериновых комплексов, что вызывает поворот конца хромосомы на 180°. Далее РОТ1 взаимодействует с 3"-цепью на дуплексном участке теломерной ДНК, что вызывает образование водородных связей между 3'overhang и комплементарным ему участком на 5"-цепи [32].

Было установлено, что шелтериновый комплекс принимает участие в регуляции синтеза длины теломер теломеразой (см. ниже). Поскольку количество шелтерина пропорционально количеству теломерных

повторов, то при достаточной длине теломер количество белка РОТ1 является достаточным для стабилизации теломерного комплекса. 3" overhang в данном случае жестко фиксирован и недоступен для присоединения к нему теломеразы. В случае, когда длина теломер сокращается до критических значений, количество шелтерина, а, следовательно, и количество РОТ1, связанного с 3"overhang также сокращается. Недостаточное количество шелтериновых комплексов на теломерных повторах приводит к дестабилизации теломер и 3" overhang приобретает более доступное для теломеразы состояние (рис. 3 в [32]) [74].

На теломерах в процессе транскри