Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro"

На правах рукописи

ЗИМНИК ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РЯДА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА АКТИВНОСТЬ ТЕЛОМЕРАЗЫ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ Ш ШТЛО

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии и на кафедре биохимии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научные руководители: доктор биологических наук

А.И. Глухов

доктор химических наук, профессор С.Е. Северин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор П.Г. Свешников

доктор биологических наук О.Д. Лопина

Ведущая организация: Межведомственный научно-исследовательский и учебно-методический Центр биомедицинских технологий

Защита состоится " ^"¿^>^2000 года в_часов на заседании Диссертационного совета

Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан и2\Р ¿2000 ]

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

В.В. Отраднова

А

-1 к/

« t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из самых важных задач современной медицины и фармакологии является создание высокоэффективных и специфически действующих препаратов для лечения злокачественных новообразований. Большие усилия исследователей, ведущих поиск путей повышения эффективности и специфичности действия таких препаратов, направлены па более глубокое изучение природы опухолевого роста. Совершенно очевидно, что проникновение в суть данного процесса поможет выявить такие биологические и фенотипические особенности раковых клеток, которые станут своего рода объектами для воздействия на них с целью остановки роста опухолей. Одной из таких особенностей, которая в настоящее время исследуется наиболее интенсивно, является неограниченный репликативный потенциал или иммортальность [Stamps А.С. et al., 1992]. Данное свойство считается одним из основных признаков, отличающих раковые клетки от нормальных. В некотором смысле ограниченный репликативный потенциал нормальных соматических клеток, обусловленный достеленным укорочением концевых участков хромосом (геломер) в каждом цикле клеточного деления, может рассматриваться в качестве элементарного способа опухолевой супрессии [Harley C.B. and Kim N.W., 1996]. Иными словами, в нормальных соматических клетках существует генетически наслбдуемый механизм контроля пролиферации. Раковые клетки, как выяснилось, обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности. По мнению многих исследователей, приобретение свойства иммортальности клетками опухолей связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение геломер [Harley С.В and Villeponteau В., 1995].

К настоящему времени накоплено много данных, свидетельствующих в пользу того, что активация теломеразы может быть важным фактором в прогрессии злокачественных опухолей. С момента разработки высокочувствительного метода определения активности теломеразы (TRAP) [Kim N.W. et al., 1994] были исследованы тысячи образцов различных тканей человека. Наличие активной теломеразы в подавляющем большинстве злокачественных опухолей и отсутствие ее в нормальных соматических тканях [Shay J.W. and Wright W.E., 1996] дают основание считать активность теломеразы наиболее специфической характеристикой раковых клеток. Именно поэтому данный фермент вызывает большой интерес в кругу исследователей в качестве потенциальной "мишени" в терапии злокачественных новообразований, а также маркера для диагностики

онкологических заболеваний. Основываясь на данных, полученных при изучении свойств теломеразы, в настоящее время уже ведется поиск ее ингибиторов [Sharma S. et al., 1997].

Цель работы. Целью настоящей работы являлось исследование возможности ингибирования активности теломеразы в экстрактах опухолевых клеток различными группами биологически активных веществ (БАВ).

Основные задачи исследования. Выполнение работы заключалось в решении следующих задач:

1) разработка неизотопного варианта метода анализа активности теломеразы в экстрактах клеток;

2) оценка возможности использования разработанного варианта метода TRAP для определения активности теломеразы в клинических образцах;

3) исследование влияния на активность теломеразы различных групп БАВ: производных нуклеозидов, пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами, производных ретиноевой кислоты, фосфодиэфирных и фосфоротиоатных синтетических олигонуклеотидов, а также некоторых других соединений.

Научная новизна. Разработан нензотопный вариант метода определения активности теломеразы в экстрактах клеток, по чувствительности сопоставимый с традиционным радиоизотошшм методом TRAP. В результате скрининга среди 57 различных БАВ обнаружено 5 новых соединений, способных подавлять активность теломеразы с достаточно высокой эффективностью.

Практическая ценность работы. Разработанный неизотопный вариант метода TRAP может быть использован для анализа активности теломеразы как в клинической, так и в научной практике. БАВ, у которых в процессе исследования была обнаружена способность подавлять активность теломеразы, могут использоваться в дальнейших исследованиях с целью создания новых противоопухолевых средств.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научном семинаре кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова; на совместном научном семинаре МНИИМЭ, ВНЦМДЛ и ЦМЭП РАЕН; the 26th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Umea, Sweden, 1998; the 15th Meeting of European Association for Cancer Research (EACR), Stockholm, Sweden, 1998; the 27th Meeting of the ISOBM, Kyoto, Japan, 1999; the 17th International Conference on Human Tumor Markers, Hong Kong SAR, China, 2000; the 28th Meeting of the ISOBM, Munich, Germany, 2000.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

« *

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 193 источника. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 7 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы. В работе были использованы следующие реактивы: фосфатно-солевой буфер (PBS) (pH 7,4), цитрат натрия, Tris-HCl, Tris-base, хлорид магния, EGTA, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), ß-меркалтоэтанол, глицерин, 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмоний]-1-пропансульфонат (CHAPS), борная кислота, EDTA, акриламид, N,N'-метилепбисакриламид, TEMED, персульфат аммония, гликоген, фенол, хлороформ, дезоксирибоиуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Tween-20, ацетат натрия, сульфат аммония, агароза, РНКаза А, пирофосфат натрия, бромид этидия ("Sigma", США); SYBR Gold nucleic acid gel stain ("Molecular Probes", США); Taq DNA-полимераза ("Диалат", Москва); среда для выделения лимфоцитов (Lymphocytes Separation Medium, "Gibco", США); производные нуклеозидов и ретиноевой кислоты, синтезированные в группе органического синтеза Московского НИИ медицинской экологии; производные пиридоксина, нуклеотидов и бифосфоновых кислот, а также фосфономуравьиная кислота, синтезированные в лаборатории д.х.н., проф. М.Я. Карпейского, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; препарат Олипифат, предоставленный руководителем лаборатории оргсинтеза, онкофармакологии и токсикологии НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ, д.б.н., проф. В.А. Филовым.

Клеточные липии. Клетки меланомы человека SK-Mel-28 выращивали в среде RPMI-1640 ("Sigma", США) с добавлением 15-20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) ("Gibco", США). Клетки карциномы молочной железы человека MCF-7 и карциномы шейки матки человека HeLa культивировали в среде DMEM ("Sigma") в присутствии 10% FBS и 50 мкг/мл гентамицина ("Sigma"). Клетки СЕМ (Т-клеточная лимфома человека) и LNCaP (карцинома предстательной железы человека) выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 5% лошадиной сыворотки ("Sigma") (для клеток LNCaP).

Клипический материал. Образцы периферической крови были взяты у 40 больных различными типами гемобластозов (лимфосаркомами, лейкозами, множественной миеломой, лифогрануломатозом, миелодиспластическим синдромом). В качестве контрольной группы

были выбраны 20 здоровых доноров. Кровь обрабатывали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 для предотвращения свертывания.

Выделение лимфоцитов из периферической крови. Образцы периферической крови, смешанные с равным объемом PBS, центрифугировали в градиенте плотности раствора Lymphocytes Separation Medium в течение 30 мин при 400 g и комнатной температуре. Интерфазу, содержащую лимфоциты, отбирали и трижды промывали четырехкратным избытком PBS. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Получение экстрактов из лимфоцитов и клеток опухолевых линий. Экстракты из лимфоцитов и клеток опухолевых линий получали описанным ранее методом [Kim N.W. et al„ 1994].

Анализ теломеразной активности. В данной работе метод TRAP использовали с некоторыми модификациями. Элонгацию олигонуклеотидного субстрата и последующую амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% Tween-20, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 50 мкМ каждого дезоксирнбонуклеозидтрифосфата (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,1 мкг TS-праймера, 1 мкл клеточного экстракта, разбавленного лизирующим буфером CHAPS и эквивалентного определенному количеству клеток. На поверхность реакционной смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла для предотвращения испарения жидкости. Смесь инкубировали 25 мин при 37°С, выдерживали 10 минут при 96°С для инактивации теломеразы, а затем добавляли 0,1 мкг СХ-праймера и 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. После проведения 30 циклов ПЦР амплифицированные продукты разделяли методом электрофореза в 10% неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Визуализацию разделенных продуктов проводили на УФ-трансиллюминагоре (Я 300 нм) после выдерживания геля в течение 30 мин в растворе красителя SYBR Gold.

Постановка контролен на ингибирование соединениями Taq ДНК-полимеразы в системе амплификации фрагмента гена р-глобина человека. Каждое исследуемое соединение добавляли в реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую 67 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% Tween-20, 1,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 15 пмоль каждого праймера, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы и 0,756 мкг геномной ДНК человека На поверхность смеси наносили 50 мкл легкого минерального масла и проводили 25 циклов ПЦР. Продукты реакции исследовали на УФ-трансиллюминаторе после проведения электрофореза в 1,5% агарозном геле и окрашивания бромидом этидия.

s

Очистка продуктов теломеразпой реакции методом осаждения. После элонгации TS-праймера теломеразой и температурной инактивации фермента к реакционной смеси, разведенной водой до объема 97 мкл, добавляли 48,5 мкл фенола к столько же хлороформа. Смесь центрифугировали 4 мин при 10000 g. Водную фазу отбирали, добавляли равный объем хлороформа и проводили еще одну экстракцию. К водной фазе, отделившейся после хлороформной экстракции, добавляли 10 мкг гликогена, 1/20 часть от объема водной фазы 4 М ацетата натрия и 2,5 объема 96% этанола. Осаждали продукты при -20°С в течение 18 часов. После центрифугирования при 10000 g в течение 20 мин надосадочную жидкость сливали, осадок промывали дважды холодным 70% этанолом, высушивали и растворяли в 50 мкл смеси, содержащей все компоненты, необходимые для амплификации.

Очистка продуктов теломеразпой реакции методом ультрафильтрации. После проведения теломеразной реакции в присутствии соединения К-6 и температурной инактивации фермента к 48,5 мкл реакционной смеси добавляли 450 мкл воды и центрифугировали в микрококцентраторах Centricon-100 ("Amicon", США) при 1000 g 30 мин. Оставшуюся на поверхности мембраны концентратора жидкость переносили в смесь, содержащую все компоненты, необходимые для амплификации.

Определение ингибирующей активности соединений. IC50 каждого ингибитора определяли с помощью компьютерной программы по анализу изображений Kodak ID v.3.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение активности теломеразы (AT) в экстрактах клеток опухолевых линий с помощью модифицированного метода TRAP

Для анализа AT в клеточных экстрактах обычно используют метод TRAP, в котором детекция амплифицированных продуктов теломеразной реакции осуществляется авторадиографически. Разработанная нами неизотопная модификация метода TRAP основана на применении для детекции амплифицированных продуктов теломеразной реакции высокочувствительного красителя SYBR Gold.

1.1. Оценка чувствительности модифицированного метода TRAP. AT определяли в экстрактах клеток линий СЕМ, SK-Mel, HeLa и MCF-7, последовательно разведенных лизирующим буфером и эквивалентных различному количеству клеток (от 2000 до 16). Во всех образцах, в которые были добавлены клеточные экстракты, при проведении анализа были обнаружены дискретные полосы ДНК-фрагментов, отличающиеся друг от друга на 6 п.н. При этом интенсивность свечения полос постепенно ослабевала с уменьшением количества клеток, содержащихся в экстракте (рис. 1).

1 2

Р": ". ! т. п ; »-> р

t

' - «у^:-; ? 5

I I; 1 •вй^Я^-'-ч^

Рис. 1. Определение чувствительности модифицированного метода TRAP. Линии 1-4 - AT в экстрактах из 2000, 400, 80 и 16 клеток HeLa, соответственно. Линии 5-7 - AT в экстрактах из 400, 80 и 16 клеток SK-Mel-28, соответственно. Линия 8 - отрицательный контрольный образец (без добавления клеточного экстракта).

Результаты исследования показали, что используемый нами модифицированный метод определения AT по чувствительности практически не уступает первоначальному варианту TRAP-анализа. Согласно литературным данным, радиоизотопным методом TRAP можно зарегистрировать AT в образцах, эквивалентных 10 клеткам [KimN.W. et al., 1994; Okayasu I. et al., 1997]. С помощью используемого нами метода AT детектировалась в экстрактах, эквивалентных 16 клеткам.

1.2. Подтверждение специфичности продуктов теломеразной реакции. Экстракты, эквивалентные 2000 клеток, обрабатывали свободной от ДНКаз РНКазой А (5 мкг на 1 мкл экстракта, инкубация при 37°С в течение 20 мик или при 20°С в течение 30 мин) или выдерживали при высокой температуре (инкубация на кипящей водяной бане в течение 5 мин или при 95°С в течение 10 мин) для инактивации РНК-компонента (hTR) и белковой субьединицы теломеразы. При исследовании инактивированных такими способами экстрактов дискретные полосы ДНК-фрагментов в геле отсутствовали (рис. 2, линии 1-4). Следовательно, детектируемые в случае интажтных клеточных экстрактов ДНК-продукты являлись специфичными для теломеразной реакции.

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Постановка контрольных экспериментов для подтверждения специфичности продуктов теломеразной реакции. Линии 1,2- экстракты клеток МСР-7 и СЕМ, обработанные РНКазой А. Линии 3, 4 - экстракты клеток МСР-7 и СЕМ, инактивированные нагреванием. Линия 5 -положительный контрольный образец (экстракт из 1000 клеток МСР-7). Линия 6 - замена ТЭ-праймера на олигонуклеотид Те!Р5.

Еще один контрольный эксперимент был поставлен для подтверждения зависимости теломеразного сигнала от специфического праймера, который служит затравкой для синтеза теломерных последовательностей. Для этого вместо Т8-праймера в реакцию был внесен

олигонуклеотид Те1Р5, который не мог использоваться теломеразой в качестве субстрата для присоединения к нему гексануклеотидных повторов (рис. 2, линия 6). Кроме того, специфичность продуктов теломеразной реакции была подтверждена отсутствием в геле характерных дискретных полос при анализе экстракта из 2000 теломеразонегативных нормальных фибробластов (рис. 3, лилия 3).

1 2 3

Рис. 3. Определение AT в экстрактах различных клеток человека. Линия 1 - AT в экстракте из 1000 клеток LNCaP. Линия 2 - AT в экстракте из 1000 клеток MCF-7. Линия 3 - экстракт из 2000 нормальных фибробластов.

2. Определение AT в экстрактах лимфоцитов больных гемобластозами

С помощью неизотопного варианта метода TRAP AT определяли в экстрактах

лимфоцитов больных гемобластозами и здоровых доноров. Исследование контрольной

группы здоровых доноров показало, что уровень AT в экстрактах нормальных лимфоцитов,

эквивалентных 2000 клеток, чрезвычайно низок. При детекции продуктов реакции в 19

контрольных экстрактах из 20 характерные дискретные полосы отсутствовали (рис. 4).

Только в 1 контрольном экстракте из 20 была обнаружена "лестница" TRAP-продуктов, но

интенсивность свечения их оказалась очень слабой.

1234 5678 9 10

Рис. 4, Определение АТ в экстрактах лимфоцитов здоровых доноров. Линии 1-8 - экстракты из 2000 лимфоцитов здоровых доноров. Линия 9 - положительный контрольный образец (экстракт из 2000 клеток СЕМ). Линия 10 - отрицательный контрольный образец (без добавления клеточного экстракта).

При анализе АТ в экстрактах лимфоцитов больных гемобластозами (табл. I) в 40% случаев ее уровень был сопоставим с уровнем, наблюдаемым в экстрактах лимфоцитов здоровых доноров. Однако в большинстве случаев (60%) в лимфоцитах больных гемобластозами наблюдалась характерная "лестница" ТЯАР-продуктов.

Интенсивность свечения этих полос широко варьировала среди отдельных образцов (рис. 5),

Таблица X. АТ а экстрактах лимфоцитов здоровых доноров и больных гемоблаетозами

Исследуемая группа Общее количество больных/ допоров Количество больных/ доноров с АТ % больных/ доноров с АТ

Здоровые доноры 20 1 5

Больные лимфосаркомами 26 14 53,8

Больные лейкозами 7 6 85,7

Больные другими типами гемобластозов (множественной миеломой, лимфогранулематозом, миелодиспластическим синдромом) 7 4 57

Всего (среди больных гемоблаетозами) 40 24 60

поэтому для более четкой характеристики результатов АТ условно была подразделена на 3 уровня: "высокий", "средний" и "низкий". Каждый из этих уровней приблизительно соответствовал уровню АТ в экстрактах, эквивалентных 2000, 500 или 50 опухолевым клеткам линии СЕМ. Результаты определения относительных уровней АТ представлены в табл. II.

Рис. 5. Определение АТ в экстрактах лимфоцитов больных гемоблаетозами. Линии 1-6 - АТ в экстрактах из 2000 лимфоцитов больных гемоблаетозами. Линия 7 - отрицательный контрольный образец (без добавления клеточного экстракта).

Таблица II. Относительные уровни АТ в экстрактах лимфоцитов больных гемоблаетозами

Исследуемая группа % больных с высокой АТ % больных со средней АТ % больных с низкой АТ

Больные яимфосаркомой 21,4 14,3 64,3

Больные лейкозом 16,7 0 83,3

Больные другими типами гемобластозов 0 0 100

(множественной миеломой, лимфогра-

нуломатозом, миелодиспластическим

синдромом)

3. Исследование влияния па АТ некоторых производных нуклеозидов

Для исследовали возможности ингибирования теломеразы были выбраны различные производные нуклеозидов. Предполагалось, что такие соединения, представляющие собой аналоги нуклеотидпых субстратов теломеразы, будут связываться с ферментом и блокировать синтез теломерных последовательностей. Группа исследованных нами соединений включала 7 производных тимидина, 3 производных 5-фторурндина, а также 5-фторурацил (табл. Ш).

Таблица Ш. Производные нуклеозидов, использованные для исследования влияния на АТ

Название Структурная формула Название Структурная формула

1. 3'-азидо-2',3'-ди-дезокситимидин но-сн2 т 7. Г-гидроксиметил-2' -дезокситимидин £ СНз—ОН

2. 4'-метил-3'-азидо- 2',3'-дидезокси- гимидин N3 8. 5-фторуридин НО—СИ? и-5-Г он он

3. 3'-амино-2',3'-ди-цезокситимидин но—сн2 т тг 9. 4'-метил-3'-азидо-2' ,3 '-дидезокси-5-фторуридин N1

4. 4'-метил-3'-фтор- 2',3'-дидезокси- шмидин вд-сн2 т -¿Г* 10. 4'-метил-3'-фтор- 2',3'-дцдезокси-5- фторуридин НО—СНг и-5-Р

5. 3'-хлор-2\3'-ди-дезокситимидин но-сн2 Т 11. 5-фторурацил Л'

б. 2',3'-дидезокси- 2',3'-дидегидро- гимидип но-сн2 т

Каждое соединение в виде раствора в 96% этаноле добавляли в реакционную смесь перед проведением реакции удлинения ТБ-праймера. Концентрация каждого нуклеозидного производного в реакционной смеси варьировала от 0,312 мкМ до 200 мкМ, что превышало концентрацию каждого сИЧТР в 4 раза. Как выяснилось в ходе эксперимента, ни одно из исследованных нами нуклеозидных производных не оказывало ингибирующего действия на теломеразу даже в максимальной концентрации. Отсутствие ингибирующего влияния на АТ исследованных нами нуклеозидных производных, вероятно, связано с тем, что теломераза либо не способна узнавать не содержащие трифосфатные группы аналоги нуклеотидов в качестве субстратов, либо данные соединения легко диссоциируют из комплекса с ферментом и не вызывают терминации синтеза ДНК теломерного повтора. Иными словами, теломераза обладает высоковыраженной дискриминирующей активностью в отношении вышеуказанных соединений.

4. Исследование влияния на АТ производных пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторых других, соединений

Производные пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторые другие соединения, использованные для исследования влияния на АТ, представлены в табл. IV. Выбранные нами производные пиридоксина имеют некоторое конформационное сходство с нуклеотидами - субстратами теломеразы. На основании этого было сделано предположение, что данные соединения, а также производные нуклеотидов, конкурируя с истинными субстратами фермента, будут препятствовать синтезу теломерных последовательностей. В то же время бифосфоновая группировка является структурным аналогом пирофосфага, который представляет собой один из продуктов теломеразной реакции и может приводить к ингибированию фермента по принципу обратной связи.

Таблица IV. Производные пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторые другие соединения, использованные для исследования влияния на АТ

Название Структурнан формула Название Структурная формула

1. К-10 (пиридок-сальфосфат) V0 0—РОзНг ИзС^М^ 14. МВС-12 (ангидрид аденозин-5'-монофосфорной и 1-гидроксиэтилиден-1,1 -бифосфоновой кислот*) —С—Г—0—Р—О онбн ОНСН3 А он ¿н

2. МВС-18 (производное пиридокс-аминфосфата и янтарной кислоты*) соон ОТг-МН-СН—СН!—соси 15. МВС-23 (ангидрид 2'-дезокси-аденозин-5' -монофосфорной и 1-гидроксиэтилиден-1,1-бифосфоновой кислот*) Н)Т V I ЧгОзР—С— Р—О—Р-0 OH¿H 01! ¿11! л он

3. МВС-19 (производное пиридокс-аминфосфата и глу-таровой кислоты*) соои СН^КН-СН—1СНгЬ—еоон НО^А^^Шг-О-РОЛ, 16. МВС-8 (ангидрид гуанозин-5'-монофосфорой и мегиленбифосфоно-вой кислот*) 0 0 Н201?—СНт—0- 0 ¿Н ¿«¿Н2 С У^Г ¿н 6н

4. МВС-13 (производное пиридок-самина и метилен-бифосфоновой кислоты*) РОЛ КН-СН—РОЙ НО^Хаум 17. МВС-10 (ангидрид цитидин-5'-монофосфорной и 1-гидрокснзтилиден-1,1-бифосфоновой кислот*) ? V НаО,Р—С—Р-0—Р—0 ¿Н&Н ¿Н ¿Нг С он 6н

5. МВС-14 (производное пиридокс-аминфосфата и метиленбифосфоно-вой кислоты*) Стг-ын—СН-РОзН2 Ю^/ч-СЧг-О-ТОЛ Ис'Чг 18. МВС-11 (ангидрид арацитидин-5'-монофосфорной и 1 -гидроксиэтилиден-1,1-бифосфоновой кислот*) Н3С 0 0 НгОзР—С—Р—0—г—0 ¿«¿Н ¿«¿Ч, с

б. МВС-4 (производное пиридокс-амина и 1-гидрок-сипропилиден-1,1-бифосфоновой кислоты*) РОЛ СНг—ЫН—[СКЖ—с-он ш^Хгвдн РОЛ 19. МВС-7 (ангидрид уридин-5'-монофосфорной и 1-гидроксиэтшшден-1,1 -бифосфоновой кислот*) НгОзР-^-^-О-?-^ ОН ОН ОНСНг 1! он он

7. МВС-6 (производное пиридокс-амипфосфага и 1 -гидроксипропилиден -1,1 -бифосфоновой кислоты*) РОД [СП;Ь—9-ол СНг рад НО^А^^СНг-О-РОЛ цсг'Чг 20. МВС-9 (ангидрид 5-фторуридиц-5'-монофосфорной и метиленбифосфоно-вой кислот*) ? ? НгО^-СНз—Р—О-Р-О ¿н ¿"К^" ОЙ он

8. МВС-15 (ангад-рид аденозин-5'-монофосфорной и метиленбифосфоно-вой кислот*) ОН ¿НСН; А V1/ он он 21. МВС-1 (ангидрид 5-фторуридин-5'-монофосфорной и 1-гидроксиэтшшден-1,1 -бифосфоновой кислот*) И, С О О Н20>?-<;—о~|—о ОН ОН ОНСН» Ь-$-Р он Он

9. МВС-22 (ангидрид 2'-дезоксиаде-нозин-5' -монофосфорной и метилен-бифосфоновой килот*) « ? НзО}р—СНг— Р-О- Р—о ¿И ¿Н СН3 А 22. МВС-3 (ангидрид 1-(2'-оксиэтокси-метилен)-5-фтор-урадил-2'-фосфорной и 1-гидроксиэтили-ден-1,1 -бифосфоновой кислот*) [СН^г—^ ОН ОН ОН

10. К-6 (метилен-бифосфоновая кислота*) Нг03Р—СН^РОэН, 23. К-4 (1-гадрокси-З-аминопропилиден-1,1-бифосфоновая кислота*) СНг—СНг-Шг НАР-Й-РОД

11. К-5 (аминомети- ленбифосфоновая кислота*) ш2 Н205Р—СН-РО1Н2 24. К-8 (1-гидрокси-3-диметиламино-пропилиден-1,1 -би-фосфоновая кислота*) СНг—СНг-!]1-СН> Н20з?-С—Р03н2 сн3 ¿н

12. К-9 (дихлор-метиленбифосфоно-вая кислота*) С1 1 Н20;Р—С—РОэНг ¿1 25. Фосфономуравьи-ная кислота НгОэР—СООН

13. К-3 (1-гидрокси- 26. Олипифат Вытяжка из лигни-

этилиден-1,1 -бифос- Рь фицированных рас-

НгО,Р—с-го,нг

фоновая кислота*) ¿н тительных тканей и

КадРгСЬ

"соли №

Концентрация исследуемых соединений в реакционной смеси составляла 1 мМ. Для выяснения возможного ингибирующего воздействия соединений на участвующую в процессе амплификации Taq ДНК-полимеразу были поставлены контрольные эксперименты, в которых исследуемые соединения вносили в реакционную смесь непосредственно перед стадией амплификации. Результаты исследований показали, что среди производных пиридоксина только два соединения (МВС-6 и МВС-14) в концентрации 1 мМ оказывали сильное ингибирующее действие на синтез ТИАР-продуктов. Однако сопоставление интенсивности свечения в геле ДНК-фрагментов с образцами сравнения, в которые данные соединения вносили перед амплификацией, позволило объяснить наблюдаемый ингибирующий эффект исключительно подавлением активности Taq ДНК-полимеразы.

Все исследованные производные нуклеотидов, имеющие в своем составе фрагменты бифосфоновых кислот, также оказались неэффективными ингибиторами. Их подавляющее действие в ТНАР-анализе в концентрации 1 мМ проявлялось лишь незначительно.

Г ' 1.-----, 1 а Я >1 тт - { * £■ ; ? & 4 » ':

[ ~ д й '1 1

К 4 ' - [ 'й - ¿1 й

ч*- ^

Рис. 6. Ингибнрование синтеза ТИАР-продукгов соединением К-6. Линии 1-4 - синтез Т11АР-продукгов в присутствии К-б. Концентрация К-6 в реакционной смеси - 0,183, 0,150, 0,125 и 0,096 мМ, соответственно. Лнния 5 - положительный контрольный образец (АТ в экстракте из ¡000 клеток МСР-7).

Полное ингабирование синтеза ТЯАР-продуктов в максимальной концентрации наблюдалось у трех производных бифосфоновых кислот (К-6, К-5 и К-8). 1С50 соединений К-5 и К-8 составляла 0,5 мМ. При этом так же, как и в случае с производными пиридоксина МВС-6 и МВС-14, эффект ингибирования был обусловлен подавлением активности Taq ДНК-полимеразы. Более эффективным ингибитором оказался структурный аналог пирофосфата - соединение К-6. Его 1С;о составила 0,15 мМ, а полное ингабирование синтеза ТЯАР-продукгов соответствовало концентрации 0,183 мМ (рис. 6). Дяя сравнения:

пирофосфат натрия оказывал ингибирующее действие в ШАР-анализе в концентрации более 0,5 мМ.

Как и в предыдущих экспериментах, оказалось, что снижение интенсивности свечения ДНК-фрагментов в образцах, содержащих соединение К-6 в концентрации 0,15 мМ, связано с ингибированием Taq ДНК-полимеразы. Однако при проведении эксперимента с удалением соединения К-б из реакционной смеси перед стадией амплификации было обнаружено, что ингибирование теломеразы тоже имеет место (рис. 7, 8). Подавление АТ на 50% происходило при концентрации К-6, равной 0,26 мМ. Полное ингибирование теломеразы наблюдалось в концентрации 0,33 мМ.

1 2

Рис. 7. Ингибирующий эффект соединения К-6 в концентрации 0,2 мМ. Очистка продуктов теломеразной реакции методом осаждения. Линия 1 - добавление К-6 перед теломеразной реакцией. Линия 2 - положительный контрольный образец (без добавления К-6). Линия 3 -добавление К-6 перед стадией амплификации. Линия 4 - добавление К-6 перед стадией очистки; снижение интенсивности свечения ДНК-фрагментов обусловлено подавлением активности Тая ДНК-полимеразы остатками К-6.

Рис 8. Ингибирующий эффект соединения К-6. Очистка продуктов теломеразной реакции методом ультрафильтрацин. Линии 1-3 - добавление К-6 перед теломеразной реакцией. Концентрация К-6 в реакционной смеси - 0,33, 0,26 и 0,15 мМ, соответственно. Линии 4-6 - добавление К-6 перед стадией очистки. Концентрация К-6 в реакционной смеси - 0,33, 0,26 и 0,15 мМ, соответственно.

Аналогичные эксперименты были проведены и с некоторыми соединениями, не относящимися к описанным выше группам. При этом было обнаружено, что фосфономуравьиная кислота снижает АТ на 50% в концентрации 0,25 мМ (рис. 9), а препарат Олипифат - в концентрации 10 мкМ (рис. 10).

J ' . ъщ ;>„ f ^

"V „ г, г'- , чТ^г} ®. ""Ï.ÎV»* >

Рис. 9. Ингибирующий эффект фосфономуравьиной кислоты. Линии 1, 3, 5, 7 и 9 - добавление фосфономуравьиной кислоты перед теломеразной реакцией. Концентрация ингибитора в реакционной смеси - 1, 0,5, 0,25, 0,125 и 0,06 мМ, соответственно. Линии 2, 4, 6, 8 и 10 -добавление фосфономуравьнной кислоты перед стадией амплификации. Концентрация ингибитора в реакционной смеси - 1,0,5, 0,25,0,125 и 0,06 мМ, соответственно.

12 3 4

Рис. 10. Ингибирующий эффект препарата Олипифат в концентрации 10 мкМ. Очистка продуктов теломеразной реакции методом осаждения. Линия 1 - добавление препарата перед теломеразной реакцией. Линия 2 - добавление препарата перед стадией очистки. Линия 3 -добавление препарата перед стадией амплификации. Линия 4 - положительный контрольный образец (без добавления препарата).

5. Исследование влияния на активность теломеразы производных ретиноевой кислоты

Для исследования были выбраны 4 синтетических производных ретиноевой кислоты, содержащие нуклеозидный компонент (табл. V).

Таблица У. Производные региноевой кислоты, использованные для исследования влияния на АТ

Название Структурная формула

1. К.-1 (сложный эфир 3'-фтор-2',3'-дидезокси-5-фторуридина и 9-(4-метокси-2,3,6-триметилфенил)-3,7-диметил-2,4,б,8-нонатетраеновой кислоты) СН, СН, СИ, 0 И.С J. /Ч. JL i-O-ÇHi VS.F HjCO^ CHj Г

2. Л-2 (сложный эфир 3'-фтор-2',3'-дидезокси-5-фторуридина и 9-(4-фторфенил)-3,7-диметил-2,4,6,8-нонатеграеновой кислоты) СН, ÇH» Q F

3. Я-3 (сложный эфир 3'-азидо-2',3'-дидезокси-5-фторуридина и 9-(4-метокси-2,3,6-триметилфеннл)-3,7-диметил-2,4,6,8-нонатетраеновой кислоты) СИ, СН, гн, о Hjco-^V^CH, ]- N,

4. Я.-4 (сложный эфир 3'-азидо-2',3'-дидезокси-5-фторуридина и 9-(4-фторфенил)-3,7-диметил-2,4,6,8-нонатетраеновой кислоты) СИ, СН, о Ni

Максимальная концентрация каждого соединения в реакционной смеси составляла 1 мМ. Постановка контролен на ингибирование Taq ДНК-полимеразы показала, что одно из четырех соединений (К-З) обладало способностью подавлять активность данного фермента. Его Ю50 составляла 0,125 мМ, а полное ингибирование соответствовало концентрации 0,2 мМ. Остальные три соединения никакого воздействия на Taq ДНК-полимеразу, как и на теломеразу, не оказывали. Чтобы исключить влияние соединения К-З на Taq ДНК-полимеразу, ингибитор удаляли из реакционной смеси перед началом амплификации теломеразных продуктов. Результаты эксперимента показали, что соединение Я-З способно подавлять АТ с 1С50, равной 0,15 мМ (рис. 11а, линия 1). В концентрации 0,25 мМ АТ подавлялась практически полностью (рис. 116, линия 1).

Рис. 11. йнгибирующий эффект соединения R.-3 в концентрации 0,15 мМ (а) и 0,25 мМ (б). Очистка продуктов теломеразной реакции методом осаждения. Линии 1 - добавление R-3 перед теломеразной реакцией. Линии 2 - добавление R-3 перед стадией очистки. Линии 3 -добавление R-3 перед стадией амплификации. Линии 4 - положительный контрольный образец (без добавления R-3).

6. Исследование влияния на активность теломсразы фосфодиэфирных и фосфоротноатных олигоиуклеотидов

Для исследований были выбраны олигонуклеотиды TelP, четыре из которых комплементарны (Те1Р2, Те1Р4, Те1Р5 и Те1Рб), а два другие гомологичны (TelPl и Те1РЗ) определенным участкам РНК-субъединшш теломеразы (Те1Р5 и Те1Р6 комплементарны области, которая непосредственно служит матрицей для синтеза теломерных повторов); олигонуклеотиды ТМО (Telomere Mimic Oligonucleotide), а также олигонуклеотиды со случайными последовательностями (TS7 - TS9) и включающие в себя один или два теломерных повтора (ASOl - AS03). Результаты анализа влияния перечисленных олигоиуклеотидов на синтез TRAP-продуктов представлены в табл. VI.

Таблица VI. Анализ влияния на АТ фосфодиэфирных и фосфоротиоатных олигонуклеотидов

Инги-бирование синтеза ТНАР-продуктов Ингибирование синтеза Т11АР-продуктов обусловлено

Олиго-нукле-отнд 5'-3' последовательность подавлением активности Taq ДНК-полимеразы конку-рентиым влиянием на стадии отжига праймеров Подавлением АТ

Те1Р1 gtaggcgccgtgcttttgct - - - -

Те1Р2 ggggactcgctccgttcctc - - - -

Те1РЗ дсс£ссйссасс§^саН - - - -

Те1Р4 aactcttcgcggtggcagtg - - - -

Те1Р5 cccttctcagttagggttag 5 нМ и выше - + ?

Те1Рб cttctcagttagggttagac 5 нМ и выше - + ?

тмо6 - - - -

ТМО,2 5 нМ и выше - + ?

ТМО18 (ttaggg)з 5 нМ и выше - + ?

ТМ024 5 нМ и выше - + ?

ТМ03о (ttaggg)5 5 нМ и выше - + ?

ТЭ7 agagttccccaaggggag - - - -

ТБ8 tcgagcagacttcccttaccc - - - -

Тв9 ttagggítaccctaaccc - - - -

А801 ttagggacttgcggtgcagcttgg 60 нМ и выше - + ?

АБ02 gcttggacttgcggtgcattaggg 60 нМ и выше - + ?

АвОЗ ttagggacttgcggtgcattaggg 60 нМ и выше - + ?

РБ- Фосфоротиоатный 10 нМ и выше Более 240 нМ - +

Те1Р5 cccttctcagttagggttag

РБ- Фосфоротиоатный 5 нМ и выше Более 60 нМ - +

ТМ024

РЗ-ЗЭО agctctgccacgccttcg 20 нМ и выше Более 240 нМ - +

ЩШ ё^ймерйьй. й<

? - эффект определить невозможно из-за искажения результатов анализа конкурентным влиянием олигонуклеотида на стадии отжига праймеров;

ЪТИ - РНК-субьединица теломеразы

Все олигонуклеотады, оказавшие ингибирующее действие на сиптез TRAP-продуктов, бьши протестированы на способность подавлять активность Taq ДНК-полимеразы в системе амплификации участка гена ß-глобина человека. Концентрация олигонуклеотидов в смеси составляла 0,48 мкМ. Результаты эксперимента показали, что ни одно из исследованных соединений не оказывало кнгибирующего действия на Taq ДНК-полимеразу. Более того, эффект подавления олигонуклеотидами синтеза TRAP-продуктов не связан и с ингибированием теломеразы. Такой вывод позволили сделать результаты следующей серии контрольных экспериментов: каждое соединение добавляли в смесь для проведения TRAP-анализа после элонгации теломеразой TS-праймера. При этом были получены результаты, абсолютно идентичные тем, которые наблюдались при внесении олигонуклеотидов в смесь на стадии теломеразной реакции. Следовательно, ингибирующий эффект соединений был обусловлен не воздействием на теломеразу, а конкурентным влиянием их на амплификацию теломеразных продуктов, точнее - на отжиг праймеров, с которыми исследуемые олигонуклеотады образовывали различные дуплексные формы.

Фосфоротиоатные (PS) олигонуклеотады обладают меньшим сродством к комплементарным последовательностям, по сравнению с фосфодиэфирными аналогами. Но это свойство при исследовании PS соединений в бесклеточной системе могло бы оказаться наиболее ценным с точки зрения слабого взаимодействия их с праймерами на стадии амплификации в методе TRAP. Именно поэтому нами была исследована возможность ингибирования теломеразы олигонуклеотидами, имеющими PS связи (табл. VI).

Концентрация PS олигонуклеотидов в реакционной смеси составляла 0,005 - 0,06 мкМ. В каждом конкретном случае в качестве образца сравнения была взята реакционная смесь, в которую олигонуклеотид добавлялся непосредственно перед амплификацией. Такой контроль позволял определить степень влияния соединения на данную стадию TRAP-анализа. Результаты эксперимента показали, что ни одно из соединений не оказывало воздействия на амплификацию продуктов теломеразной реакции даже в максимальной концентраци. Таким образом, снижение интенсивности свечения TRAP-продуктов в образцах, в которые соединения добавлялись перед началом теломеразной реакции, было обусловлено подавлением AT. 1С50 олигонуклеотидов PS-TelP5 и PS-TM024 составляла 0,02 и 0,015 мкМ, соответственно. Следует заметить, что PS олигонуклеотид со случайной последовательностью (PS-SSG) тоже оказывал ингибирующее действие на теломеразу, а его IC50 была сопоставима с IC50 PS-TelP5 и PS-TMCfo- Таким образом, коэффициенты специфичности для PS-TelP5 и PS-TMO24 оказались довольно низкими (табл. VII).

Таблица УП. Коэффициенты специфичности фосфоротиоатных олигонуклеотидов

Олпгонуклеотпд IC50, мкМ Коэффициент специфичности, IC50 SSG/ICso олигануклсогада, комплементарного hTR

PS-TelP5 0,02 1,5

PS-TMO24 0,015 2

PS-SSG 0,03 -

Стоит учесть, что PS соединения могут неспецифически взаимодействовать с белками, нарушая их функции [Heidenreich О. et al., 1995]. Поставленные нами дополнительные эксперименты еще раз подтвердили это. В концентрации более 0,06 мкМ все три PS олигонуклеотида начинали подавлять активность Taq ДНК-полимеразы. В концентрации

0.48.мкМ соединения PS-TelP5 и PS-SSG подавляли активность Taq ДНК-полимеразы на 50%, а соединение PS-TM024 - полностью.

Таким образом, при воздействии на теломеразу PS олигонуклеотидами степень их комплементарности РНК-компоненту фермента не имеет существенного значения. Но даже несмотря на это такие соединения остаются очень эффективными ингибиторами, поскольку уже в яаномолярных концентрациях подавляют AT.

ВЫВОДЫ

1. Разработан неизотопный вариант метода определения активности теломеразы в экстрактах клеток, по чувствительности практически не уступающий традиционному методу TRAP.

2. С помощью модифицированного метода TRAP теломеразная активность была обнаружена в лимфоцитах большинства больных злокачественными опухолями кроветворной и лимфовдной ткани. Полученные результаты подтверждают возможность использования данного варианта метода TRAP для анализа активности теломеразы в клинических образцах.

3. Показало, что производные нуклеозидов на основе тимина и 5-фторурацила, производные пиридоксина, а также эфиры нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами не оказывают заметного влияния на активность теломеразы.

4. Установлено, что производное бифосфоновой кислоты К-6, производное ретиноевой

кислоты R-3, фосфономуравышая кислота и препарат Олипифат способны подавлять активность теломеразы в микромолярных концентрациях.

5. Показано, что изучение кнгнбирующего действия на активность теломеразы фосфодиэфирных олигонуклеотидов, комплементарных РНК-компоненту фермента, и ТМО невозможно из-за их влияния на стадию отжига праймеров в TRAP-анализе.

6. Обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды являются очень эффективными ингибиторами теломеразы, однако их эффективность мало зависит от степени комплементарности РНК-компоненту фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Glukhov, A.I., Zimnik, O.V., Gotdeev, S.A., Severin, S.E. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998,248, p. 368-371.

2. Severin, S.E., Glukhov, A.I., Mikerin, I.E., Zimnik, O.V. Study of effects of nucleoside derivatives and antisense oligonucleotides on telomerase activity in tumor cell lysates. The 26th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Umea, Sweden, 1998, p. 100.

3. Glukhov, A., Zimnik, O., Mikerin, I., Ratukov, V., Severin, S. Influence of nucleoside derivatives and antisense oligonucleotides on activity of telomerase in human melanoma cell line lysates in vitro. The 15th Meeting of European Association for Cancer Research (EACR), Stockholm, Sweden, 1998, p. 170.

4. Severin, S.E., Zimnik, O.V., Glukhov, A.I., Khaitov, R.M. Regulation of telomerase activity by synthetic oligonucleotides. The 27th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Kyoto, Japan, 1999, p. 65.

5. Глухов, А.И., Зимник, O.B., Гордеев, C.A., Северин, С.Е., Разработка амплификационных тест-систем для анализа теломеразы. Аллергия, астма и клиническая иммунология, Москва, 1999, 9, с. 173-175.

6. Zimnik, O.V., Glukhov, A.I., Gordeev, S.A., Severin, S.E. Antisense oligonucleotides as regulators of human telomerase activity. The 17th International Conference on Human Tumor Markers, Hong Kong SAR, China, 2000, p. 37.

7. Severin, S:E., Khaitov, R.M., Zimnik, O.V., Glukhov, A.I. Effect of oligonucleotides inhibiting telomerase activity in vitro on the growth of human tumor cells. The 28th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Munich, Germany, 2000, p. 101.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зимник, Ольга Валерьевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структура и функции теломер.

1.2. Структура и функции теломеразы.

1.3. Теломерная гипотеза клеточного старения и иммортализации.

1.4. Активность теломеразы в опухолевых клетках человека.

1.5. Экспрессия теломеразы в нормальных клетках человека.

1.6. Регуляция длины теломер и активности теломеразы.

1.7. Ингибиторы теломеразы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Олигонуклеотиды.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови.

2.2.2. Получение экстрактов из лимфоцитов и клеток опухолевых линий

2.2.3. Анализ активности теломеразы.

2.2.4. Постановка контролей на ингибирование соединениями

Taq ДНК-полимеразы в системе амплификации фрагмента гена ß-глобина человека.

2.2.5. Очистка продуктов теломеразной реакции методом осаждения.

2.2.6. Очистка продуктов теломеразной реакции методом ультрафильтрации.

2.2.7. Определение ингибирующей активности соединений.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение активности теломеразы в экстрактах клеток опухолевых линий с помощью модифицированного метода ТИАР.

3.2. Определение активности теломеразы в экстрактах лимфоцитов больных гемобластозами.

3.3. Исследование влияния на активность теломеразы некоторых производных нуклеозидов.

3.4. Исследование влияния на активность теломеразы производных пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторых других соединений.

3.5. Исследование влияния на активность теломеразы производных ретиноевой кислоты.

3.6. Исследование влияния на активность теломеразы фосфодиэфирных и фосфоротиоатных синтетических олигонуклеотидов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro"

Одной из самых важных задач современной медицины и фармакологии является создание высокоэффективных и специфически действующих препаратов для лечения злокачественных новообразований. Большие усилия исследователей, ведущих поиск путей повышения эффективности и специфичности действия таких препаратов, направлены на более глубокое изучение природы опухолевого роста. Совершенно очевидно, что проникновение в суть данного процесса поможет выявить такие биологические и фенотипические особенности раковых клеток, которые станут своего рода объектами для воздействия на них с целью остановки роста опухолей. Одной из таких особенностей, которая в настоящее время исследуется наиболее интенсивно, является неограниченный репликативный потенциал или иммортальность (154). Данное свойство считается одним из основных признаков, отличающих раковые клетки от нормальных. В некотором смысле ограниченный репликативный потенциал нормальных соматических клеток, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления, может рассматриваться в качестве элементарного способа опухолевой супрессии (54). Иными словами, в нормальных соматических клетках существует генетически наследуемый механизм контроля пролиферации. Раковые клетки, как выяснилось, обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности. По мнению многих исследователей, приобретение свойства иммортальности клетками опухолей связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер (56).

К настоящему времени накоплено много данных, свидетельствующих в пользу того, что активация теломеразы может быть важным фактором в прогрессии злокачественных опухолей. С момента разработки высокочувствительного метода определения активности 6 теломеразы (TRAP) (79) были исследованы тысячи образцов различных тканей человека. Наличие активной теломеразы в подавляющем большинстве злокачественных опухолей и отсутствие ее в нормальных соматических тканях (79, 147) дают основание считать активность теломеразы наиболее специфической характеристикой раковых клеток. Именно поэтому данный фермент вызывает большой интерес в кругу исследователей в качестве потенциальной "мишени" в терапии злокачественных новообразований, а также маркера для диагностики онкологических заболеваний.

Золотым стандартом" в диагностике большинства злокачественных опухолей на сегодняшний день является гистологический анализ. В то же время в некоторых случаях использование теломеразы в качестве маркера раковых клеток могло бы позволить обойтись более простыми и щадящими способами получения клинических образцов для постановки диагноза. Так, например, высокая чувствительность метода, применяемого для измерения активности теломеразы, дает возможность при определенных типах опухолей зафиксировать наличие раковых клеток в образцах крови (161) и мочи (192), в промывных жидкостях толстого кишечника (191) и полости рта (22), а также в других образцах, полученных неинвазивными и минимально инвазивными способами. Многие авторы считают, что кроме диагностических тестов теломераза может найти применение и в качестве прогностического маркера, поскольку для некоторых видов опухолей была обнаружена корреляция между активностью теломеразы и определенными клиникопатологическими показателями (65, 66). Диагностический и прогностический потенциал теломеразы как наиболее специфичного и универсального на сегодняшний день опухолевого маркера требует дальнейшего проведения широких клинических исследований. В процессе таких исследований должно быть установлено, насколько четко активность теломеразы коррелирует с наличием того или иного типа злокачественной опухоли, какова разница между уровнем активности фермента в 7 клетках, вовлеченных в канцерогенез, и соответствующих интактных клетках. Для этих целей необходимо также усовершенствование методов количественного определения активности теломеразы.

Возможность практического применения теломеразы в онкологии распространяется не только на диагностику и прогнозирование исхода заболевания. Наибольшую ценность может иметь использование данного фермента в качестве терапевтической "мишени". Как указывалось выше, активация теломеразы является специфической характеристикой раковых клеток, поэтому избирательное воздействие на нее может стать основной целью при создании нового класса противоопухолевых препаратов. Основываясь на данных, полученных при изучении свойств теломеразы, в настоящее время уже ведется поиск ее ингибиторов (144). 8

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зимник, Ольга Валерьевна

Выводы

1. Разработан неизотопный вариант метода определения активности теломеразы в экстрактах клеток, по чувствительности практически не уступающий традиционному методу TRAP.

2. С помощью модифицированного метода TRAP теломеразная активность была обнаружена в лимфоцитах большинства больных злокачественными опухолями кроветворной и лимфоидной ткани. Полученные результаты подтверждают возможность использования данного варианта метода для анализа активности теломеразы в клинических образцах.

3. Показано, что производные нуклеозидов на основе тимина и 5-фторурацила, производные пиридоксина, а также эфиры нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами не оказывают заметного влияния на активность теломеразы.

4. Установлено, что производное бифосфоновой кислоты К-6, производное ретиноевой кислоты R-3, фосфономуравьиная кислота и препарат Олипифат способны подавлять активность теломеразы в микромолярных концентрациях.

5. Показано, что изучение ингибирующего действия на активность теломеразы фосфодиэфирных олигонуклеотидов, комплементарных РНК-компоненту фермента, и ТМО невозможно из-за их влияния на стадию отжига праймеров в TRAP-анализе.

6. Обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды являются очень эффективными ингибиторами теломеразы, однако их эффективность мало зависит от степени комплементарности РНК-компоненту фермента.

91

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зимник, Ольга Валерьевна, Москва

1. Оловников, A.M. Принципы маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. АН СССР, 1971, 201, 1496-1499.

2. Adams, M.D., Rudner, D.Z., Rio, D.C. Biochemistry and regulation of pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Cell Biol., 1996, 8, 331-339.

3. Aldous, W.K., Grabill, N.R. A fluorescent method for detection of telomerase activity. Diagnostic Molecular Pathology, 1997, 6, 102-110.

4. Allsopp, R.C., Vaziri, H., Patterson, C., Goldstein, S., Younglai, E.V., Futcher, А.В., Greider, C.W., Harley, C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10114-10118.

5. Bechter, O.E., Eisterer, W., Pall, G., Hilbe, W., Kuhr, Т., Thaler, J. Telomere length and telomerase activity predict survival in patients with В cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer Research, 1998, 58, 4918, 4922.

6. Beltz, L., Moran, R., Elsawy, O., Sadler, J., Jurgenson, J. The effects of telomerase inhibitors on lymphocyte function. Anticancer Research, 1999, 19, 3205-3212.

7. Bianchi, A., Smith, S., Chong, L., Elias, P., de Lange, T. TRF1 is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J., 1997, 16, 1785-1794.

8. Bilaud, Т., Gilson, E. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 1294-1303.

9. Blackburn, E.H., Gall, J.G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J. Mol. Biol., 1978, 120, 33-63.

10. Blasco, M.A., Lec, H., Hande, M.P., Samper, E., Lansdorp, P.M., DePinho, R.A., Greider, C.W. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell, 1997,91,25-34.

11. Bouffler, S.D. Involvment of telomeric sequences in chromosomal aberrations. Mutation Research, 1998,404, 199-204.

12. Broccoli, D., Smogorzewska, A., Chong, L., de Lange, T. Human telomeres contain twodistinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2. Nat. Genet., 1997, 17, 231-235.

13. Broccoli, D., Young, J.W., de Lange, T. Telomerase activity in normal and malignanthematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9082-9086.

14. Brousset, P., A1 Saati, T., Chaouche, N., Zenou, R.-C., Schlaifer, D., Chittal, S., Delsol, G.

15. Telomerase activity in reactive and neoplastic lymphoid tissues: infrequent detection ofactivity in Hodgkin's disease. Blood, 1997, 89, 26-31.

16. Burger, A.M., Biddy, M.C., Double, J.A. Telomerase activity in normal and malignant tissues: feasibility of telomerase as a target for cancer chemotherapy. British Journal of Cancer, 1997, 75,516-522.

17. Califano, J., Ahrendt, S.A., Meininger, G., Westra, W.H., Koch, W.M., Sidransky, D. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res., 1996, 56, 5720-5722.

18. Chen, S.-F., Maine, I.P., Windle, B. Effect of 3'-azidothymidine triphosphate (AZTTP) and 3'-azidothymidine (AZT) on telomerase activiy and telomere function. Abstract. Proc. Ann. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 1995, 36, A3302.

19. Chiu, C.-P., Dragowska, W., Kim, N.W., Vaziri, H., Yui, J., Thomas, T.E., Harley, C.B., Lansdorp, P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow. Stem Cells, 1996, 14, 239-248.

20. Cooke, H.J., Smith, B.A. Variability at the telomeres of human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 1986, 51,213-219.

21. Counter, C.M., Botelho, F.M., Wang, P., Harley, C.B., Bacchetti, S. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes. J. Virol., 1994, 68, 3410-3414.

22. Fletcher, T.M., Salazar, M., Chen, S.-F. Human telomerase inhibition by 7-deaza-2'-deoxypurine nucleoside triphosphates. Biochemistry, 1996, 35, 15611-15617.

23. Fletcher, T.M., Sun, D., Salazar, M., Hurley, L.H. Effect of DNA secondary structure on human telomerase activity. Biochemistry, 1998, 37, 5536-5541.

24. Fujimoto, K., Takahashi, M. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1997, 241, 775-781.

25. Geliert M., Lipsett, M.N., Davies, D.R. Helix formation by guanylic acid. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1962, 48, 2013-2918.

26. Greider, C.W., Blackburn, E.H. Telomeres, telomerase and cancer. Scientific American, 1996, 274,92-97.

27. W.R., Shay, J.W., Corey, D.R. Identification of determinants for inhibitor binding within the RNA active site of human telomerase using PNA scanning. Biochemistry, 1997, 36, 11873-11880.

28. Harley, C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutation Research, 1991, 256, 271-282.

29. Harley, C.B. Telomeres and aging. In "Telomeres" (E.H. Blackburn and C.W. Greider, Eds.). Cold Spring Harbor Press, New York, 1995, 247-263.

30. Harley, C.B., Futcher, A.B., Greider, C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990, 345, 458-460.

31. Harley, C.B., Kim, N.W. Telomerase and cancer. In De Vita, V.T., Hellmans, S., Rosenberg, S.A. eds. /Important Advances in Oncology 1996/. Philadelphia, LippincottRaven Publishers, 1996, 57-67.

32. Harley, C.B., Vaziri, H., Counter, C.M., Allsopp, R.C. The telomere hypothesis of cellular aging. Exp. Gerontol., 1992, 27, 375-382.

33. Harley, C.B., Villeponteau, B. Telomeres and telomerase in aging and cancer. Curr. Opin. Genet. Dev., 1995, 5, 249-255.

34. Harrington, L., McPhail, T., Mar, V., Zhou, W., Oulton,R., Bass, M.B., Arruda, I., Robinson, M.O. A mammalian telomerase-associated protein. Science, 1997, 275, 973977.

35. Harrington, L., Zhou, W., McPhail, T., Oulton, R., Yeung, D.S.K., Mar, V., Bass, M.B., Robinson, M.O. Human telomerase contains evolutionarily conserved catalytic and structural subunits. Genes Dev., 1997, 11, 3109-3115.

36. Hastie, N.D., Dempster, M., Dunlop, M.G., Thompson, A.M., Green, D.K., Allshire, R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with aging. Nature, 1990, 346,866.868.

37. Hayflick, L., Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res., 1961,25,585-621.

38. Heidenreich, O., Kang, S.-H., Xu, X., Nerenberg, M. Application of antisense technology to therapeutics. Molecular Medicine Today, 1995, 1, 128-133.

39. Henderson, S., Allsopp, R., Spector, D., Wang, S.-S., Harley, C. In situ analysis of changes in telomere size during replicative aging and cell transformation. Journal of Cell Biology, 1996, 134,1-12.

40. Hiyama, E., Hiyama, K., Tatsumoto, N., Shay, J.W., Yokoyama, T. Telomerase activity in human intestine. Int. J. Oncol., 1996, 9, 453-458.

41. Hiyama, E., Hiyama, K., Yokoyama, T., Ichikawa, T., Matsuura, Y. Length of telomeric repeats in neuroblastoma; correlation with prognosis and other biological characteristics. Jpn. J. Cancer Res., 1992, 83, 159-164.

42. Hiyama, E., Hiyama, K., Yokoyama, T., Matsuura, Y., Piatyszek, M.A., Shay, J.W. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nature Med., 1995,1,249-255.

43. Holt, S.E., Shay, J.W., Wright, W.E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer. Nature Biotech., 1996,14, 834-837.

44. Joshi, S.S., Palen, B.N., Mata, J.E., Iversen, P.L. Growth inhibitory effects of telomere -mimic oligonucleotides on human leukemia/lymphoma cells in vitro. Abstract., Proc. Ann. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 1995, 36, A2449.

45. Joshi, S.S., Wu, A.G., Verbik, D.J. et al. Oligonucleotides complementary c-myb messenger RNA inhibit cell growth and induce apoptosis in human Burkitt lymphoma cells. Int. J. Oncol., 1996, 8, 815-820.

46. Kang, C., Zhang, X., Ratliff, R., Moyzis, R., Rich, A. Crystal structure of four-stranded Oxytricha telomeric DNA. Nature, 1992, 356, 126-131.

47. Kang, M.K., Guo, W., Park, N.-H., Replicative senescence of normal human oral keratinocytes is associated with the loss of telomerase activity without shortening oftelomeres. Cell Growth Differ., 1998, 9, 85-95.

48. Kondo, S., Kondo, Y., Li, G., Silverman, R.H., Cowell, J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene, 1998, 16, 3323-3330.

49. Kramer, K.M., Haber, J.E. New telomeres in yeast are initiated with a highly selected subset of TG1.3 repeats. Genes Develop. 1993, 7, 2345-2356.

50. Kyo, S., Takakura, M., Kohama, T., Inoue, M. Telomerase activity in human endometrium. Cancer Res., 1997, 57, 610-614.

51. Makarov, V.L., Hirose, Y., Langmore, J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell, 1997, 88, 657-666.

52. Marusic, L., Anton, M., Tidy, A., Wang, B., Villeponteau, B., Bacchetti, S.

53. Reprogramming of telomerase by expression of mutant telomerase RNA template in human cells leads to altered telomeres that correlate with reduced cell viability. Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 6394-6401.

54. Matthes, E., Lehmann, Ch. Telomerase protein rather than its RNA is the target of phosphorothioate-modified oligonucleotides. Nucleic Acids Research, 1999, 27, 11521158.

55. McClintock, B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics, 1941, 26, 234-282.

56. Melana, S.M., Holland, J.F., Pogo, B.G.-T. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3'-azido-3'-deoxythymidine. Clin. Cancer Res., 1998, 4, 693-696.

57. Melek, M., Shippen, D.E. Chromosome healing: Spontaneous and programmed de novo telomere formation by telomerase. BioEssays, 1996, 18, 301-308.

58. Mergny, J.-L., Mailliet, P., Lavelle, F., Riou, J.-F., Laoui, A., Helene, C. The development of telomerase inhibitors: the G-quartet approach. Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14, 327339.

59. Metcalfe, J.A., Parkhill, J., Campbell, L. et al. Accelerated telomere shortening in ataxia telangiectasia. Nature Genet., 1996, 13, 350-353.

60. Meyerson, M., Counter, C.M., Eaton, E.N., Ellisen, L.W., Steiner, P., Caddie, S.D., Ziaugra, L., Beijersbergen, R.L., Davidoff, M.J., Liu, Q., Bacchetti, S., Haber, D.A.,

61. Morin, G. Recognition of a chromosome truncation site associated with alpha-thalassemia by human telomerase. Nature, 1991, 353, 454-456.

62. Mueller, H.J. The remaking of chromosome. The Colleting Net Woods Hole, 1938, 13, 181-198.

63. Murnane, J.P., Sabatier, L., Marder, B.A., Morgan, W.F. Telomere dynamics in an immortal human cell line. EMBO J., 1994, 13, 4953-4962.

64. Naasani, I., Seimiya, H., Tsuruo, T. Telomerase inhibition, telomere shortening and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 249, 391-396.

65. Nakamura, T.M., Morin, G.B., Chapman, K.B., Weinrich, S.L., Andrews, W.H., Lingner, J., Harley, C.B., Cech, T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science, 1997, 277, 955-959.

66. Nakayama, J., Tahara, H., Tahara, E., Saito, K.I., Nakamura, H., Nakanishi, T., Tahara, E., Ide, T., Ishikawa, F. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nature Genetics, 1998, 18, 65-68.

67. Nakayama, J.-I., Saito, M., Nakamura, H., Matsuura, A., Ishikawa, F. TLP1: A gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. Cell, 1997, 88, 875-884.

68. Neer, E.J., Schmidt, C.J., Nambudripad, R., Smith, T.F. The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature, 1994, 371, 297-300.

69. Nilsson, P., Mehle, C., Remes, K., Roos, G. Telomerase activity in vivo in human malignant hematopoietic cells. Oncogene, 1994, 9, 3043-3048.

70. Noble, J.R., Rogan, E.M., Neumann, A.A., Maclean, K., Bryan, T.M., Reddel, R.R. Association of extended in vitro proliferative potential with loss of pl6INK4 expression. Oncogene, 1996, 13, 1259-1268.

71. Odagiri, E., Kanda, N., Jibiki, K., Demura, R., Aikawa, E., Demura, H. Reduction of telomeric length and c-erbB-2 gene amplification in human breast cancer, fibroadenoma and gynecomastia. Cancer, 1994, 73, 2978-2984.

72. Ohnuma, T., Li, F.-L., Holland, J.F. Inhibitory effects of telomere-mimic phosphorothioate oligonucleotides on various human tumor cells in vitro. Anticancer Research, 1997, 17, 2455-2458.

73. Ohyashiki, J., Ohyashiki, K., Fujimura, T., Kawakubo, K., Shimamoto, T., Iwabuchi, A., Toyama, K. Telomere shortening associated with disease evolution patterns in myelodisplastic syndromes. Cancer Res., 1994, 54, 3557-3560.

74. Page, T.J., Mata, J.E., Bridge, J.A., Siebler, J.C., Neff, J.R., Iversen, P.L. The cytotoxic effects of single-stranded telomere mimics on OMA-BL1 cells. Experimental Cell Research, 1999, 252,41-49.

75. Perry, P.J., Gowan, S.M., Reszka, A.P., Polucci, P., Jenkins, T.C., Kelland, L.R., Neidle,

76. S. 1,4- and 2,6-Disubstituted amidoanthracene-9,10-dione derivatives as inhibitors ofhuman telomerase. Journal of medicinal Chemistry, 1998, 41, 3253-3260.

77. Perry, P.J., Reszka, A.P., Wood, A.A., Read, M.A., Gowan, S.M., Dosanjh, H.S., Trent,

78. J.O., Jenkins, T.C., Kelland, L.R., Neidle, S. Human telomerase inhibition byregioisomeric disubstituted amidoanthracene-9,10-diones. Journal of Medicinal Chemistry,1998,41,4873-4884.

79. Pitts, A.E., Corey, D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-0-methyl-RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 11549-11554.

80. Renauld, H., Aparicio, O.M., Zierath, P.D., Billington, B.L., Chhablani, S.K., Gottschling,

81. D.E. Silent domains are assembled continuously from the telomere and are defined bypromoter distance and strength. Genes Develop., 1993, 7, 1133-1145.

82. Rhodes, D., Giraldo, R. Telomere structure and function. Curr. Opin. Struct. Biol., 1995, 5,311.322.

83. Rogan, E.M., Bryan, T.M., Hukku, B., Maclean, K., Chang, A.C.-M., Moy, E.L., Englezou,

84. A., Warneford, S.G., Dalla-Pozza, L., Reddel, R.R. Alterations in p53 and pl6iNK4 expression and telomere length during spontaneous immortalization of Li-Fraumeni syndrome fibroblasts. Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 4745-4753.

85. Schechtman, M.G. Isolation of telomeric DNA from Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol., 1987, 7,3168-3177.

86. Sen, D., Gilbert, W. Formation of parallel four-stranded complex by guanine-rich motifs in DNA and its implication for meiosis. Nature, 1988, 334, 364-366.

87. Shay, J.W., Van Der Haegen, B.A., Ying, Y., Wright, W.E. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen. Exp. Cell Res., 1993, 209, 45-52.

88. Shay, J.W., Wright, W.E. Telomerase activity in human cancer. Curr. Opin. Oncol., 1996, 8,66-71.

89. Shulz, V.P., Zakian, V.A., Osbum, C.E. et al. Accelerated loss of telomeric repeats maynot explain accelerated replicative decline of Werner syndrome cells. Hum. Genet., 1996, 97, 750-754.

90. Slijepcevic, P., Hände, M.P., Bouffier, S.D., Lansdorp, P.M., Bryant, P.E. Telomere length, chromatin structure and chromosome fusigenic potential. Chromosoma, 1997, 106, 413421.

91. Smith, F.W., Feigon, J. Quadruplex structures of Oxytricha telomeric DNA oligonucleotides. Nature, 1992, 356, 164-168.

92. Smith, J., Yeh, G. Telomere reduction in endometrial adenocarcinoma. Am. J. Obstet. Gynecol., 1992, 167, 1883-1887.

93. Smith, S., de Lange, T. TRF1, a mammalian telomeric protein. Trends Genet., 1997, 13, 21-26.

94. Smith, S., Giriat, I., Schmitt, A., de Lange, T. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science, 1998, 282, 1484-1487.

95. Stamps, A.C., Gusterson, B.A., O'Hare, M.J. Are tumors immortal? Eur. J. Cancer, 1992, 28A, 1495-1499.

96. Sundquist, W.I., Klug, A. Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetradsbetween hairpin loops. Nature, 1989, 342, 825-829.

97. Tao, M., Naoko, M.-K., Takai, K., Takaku, H. Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent, FuGENE6-antisense phosphorothioate oligonucleotide complex in HeLa cells. FEBS Letters, 1999, 454, 312-316.

98. Vaziri, H., Benchimol, S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. Current Biology, 1998, 8, 279-282.

99. Vaziri, H., Dragowska, W., Allsopp, R.C., Thomas, T.E., Harley, C.B., Lansdorp, P.M. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 9857-9860.

100. Vaziri, H., Schachter, F., Uchida, I., Wei, L., Zhu, X., Effros, R., Cohen, D., Harley, C.B. Loss of telomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. American Journal of Human Genetics, 1993, 52, 661-667.

101. Vermeesch, J.R., Petit, P., Speleman, F., Deuriendt, K., Fryns, J.P., Marynen, P. Interstitial telomeric sequences at the junction site of a jumping translocation. Hum. Genet., 1997, 99, 735-737.

102. Wainwright, J., Middleton, P.G., Rees, J.L. Changes in mean telomere length in basal cellcarcinomas of the skin. Genes, Chromosomes Cancer, 1995, 12, 45-49.

103. Wan, M.S.K., Fell, P.L., Akhtar, S. Synthetic 2'-0-methyl-modified hammerheadribozymes targeted to the RNA component of telomerase as sequence-specific inhibitors oftelomerase activity. Antisense & nucleic acid drug development, 1998, 8, 309-317.

104. Wang, J., Xie, L.Y., Allan, S., Beach, D., Hannon, G.J. Myc activates telomerase. Genes

105. Dev., 1998, 12, 1769-1774.

106. Wang, Y., Patel, D.J. Solution structure of the human telomeric repeat dAG3(T2AG3)3. G-tetraplex. Structure, 1993, 1, 263-282.

107. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Human naive and memory T lymphocytes differ in telomeric length and replicative potential. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92, 11091-11094.

108. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. J. Exp. Med., 1996, 183, 2471-2479.

109. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Regulation of telomerase RNA template expression in human T lymphocyte development and activation. The Journal of Immunology, 1997, 158, 3215-3220.

110. Wilkie, A.O.M., Lamb, J., Harris, P.C., Finney, R.D., Higgs, D.R. A truncated human chromosome 16 associated with a-thalassemia is stabilized by addition of telomeric repeats (TTAGGG)n. Nature, 1990, 346, 868-871.

111. Williamson, J.R. G-quartet structures in telomeric DNA. Ann. Rev. Boiphys. Biomol. Struct., 1994, 23, 703-730.