Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека

Марченко, Ирина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека"

На правах рукописи

иио471373

Марченко Ирина Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ТЕЛОМЕРАЗЫ И ДРУГИХ МАРКЕРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ПРИ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 £ <Щ 2800

Москва - 2009

003471373

Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова РОСЗДРАВА

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Глухов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гроздова Ирина Дмитриевна

доктор биологических наук Хомяков Юрий Николаевич

Ведущая организация: Биологический факультет Московского

Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « 2009 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, Д. 6.

Автореферат разослан ¿¿¿¿¿е^ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.13

профессор, доктор биологических наук ^Р ¿¿^ Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественные опухоли щитовидной железы (ЩЖ) составляют всего 1-3% в общей структуре онкологической заболеваемости. В то же время это самая распространенная опухоль органов эндокринной системы [Валдина Е.А., 2006]. Статистические данные свидетельствуют о значительном росте этой патологии. За последнее десятилетие количество заболевших раком ЩЖ (РЩЖ) в России увеличилось в 1,5-2 раза в зависимости от региона страны [Шойхет Я.Н., 2005].

До настоящего времени в Российской Федерации поздние стадии (III-IV) РЩЖ устанавливаются более чем у 39% вновь выявленных больных. Основные трудности в своевременной диагностике обусловлены тем, что рак может длительное время существовать под видом или на фоне других заболеваний ЩЖ. Так, по некоторым данным, почти в 90% случаев РЩЖ на ранних стадиях развивается в виде узлового зоба [Пачес А.И., 1995]. На данный момент цитологический анализ с применением тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) является «золотым стандартом» в дифференциальной диагностике узловых образований ЩЖ. Чувствительность цитологического анализа с использованием ТАБ под ультразвуковым контролем составляет 78%, специфичность - 62% [Шойхет Я.Н., 2005]. В 15-30% случаев стандартная ТАБ не может дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли, имеющие сходную цитоморфологическую картину: фолликулярную аденому и фолликулярный рак, а также фолликулярный вариант папиллярного рака и гюртлеклеточные опухоли [Belfiore А., 2002]. Таким образом, диагностика РЩЖ остается достаточно сложной и актуальной задачей, особенно в случае высокодифференцированных и ранних форм злокачественной опухоли.

В настоящее время количество работ, в которых был бы изучен широкий спектр молекулярно-генетических маркеров РЩЖ и проведена комплексная оценка различных показателей диагностической ценности при их индивидуальном и совместном использовании, весьма незначительно. На основе анализа литературы и понимания общих механизмов развития рака нами были предложены следующие потенциальные маркеры РЩЖ: циклооксигеназа-2 (СОХ-2), транскрипционный фактор RelA, онкобелок с-Мус, онкосупрессор р53, металлопротеиназа 7 (ММР-7), теломераза и теломер-связывающий фактор TRF1.

СОХ-2 - индуцибельная изоформа фермента, участвующего в образовании простагландинов из арахидоновой кислоты. Гиперэкспрессия СОХ-2 в злокачественных опухолях опосредует устойчивость к апоптозу, усиление пролиферативной активности клеток, инвазивность, ангиогенез и метастазирование [Trifan О.С., 2003]. При злокачественных новообразованиях ЩЖ обнаружено повышение экспрессии гена СОХ-2, в то же время экспрессия гена СОХ-2 отсутствует или находится на низком уровне в нормальной ткани ЩЖ, при тиреоидитах и доброкачественных опухолях ЩЖ [Kajita S., 2005].

Белок p65/RelA входит в состав транскрипционного фактора NF-кВ (nuclear factor kappa В) позвоночных. Значительное повышение экспрессии гена RelA на уровне мРНК и продукции белка было обнаружено в клеточных линиях карцином ЩЖ человека по сравнению с нормальными клетками ЩЖ [Visconti R., 1994].

Онкобелок с-Мус участвует в регуляции клеточного цикла, усиливает клеточный метаболизм, ингибирует клеточную адгезию, стимулирует неоангиогенез и апоптоз [Pelengaris S., 2002].

В опухолях различного происхождения часто наблюдаются мутации в гене р53, однако при РЩЖ частота инактивирующих мутаций в гене р53 согласно базе данных International Agency for Research on Cancer (2005) составляет всего 11,3%. Данный факт косвенно свидетельствует о существовании других способов инактивации р53 при РЩЖ.

Участие металлопротеиназ в опухолевой трансформации, а также в процессах инвазии и метастазирования хорошо доказано экспериментами in vitro и in vivo. Особенностью металлопротеиназы ММР-7 является то, что она экспрессируется самими опухолевыми клетками и участвует в развитии рака на его ранних стадиях [Ii V., 2006].

Высокая активность теломеразы (AT) и экспрессия гена каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) наблюдается в большинстве злокачественных опухолей. AT обнаружена в среднем в 80% случаев фолликулярного рака, 51% случаев папиллярного рака, 50% случаев анапластического рака, 43% случаев медуллярного рака и 33% случаев карциномы из клеток Гюртля. AT также выявлена при фолликулярной аденоме (ФА) (в среднем 17% случаев), в 36-100% случаев при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) [Orlando С., 2001]. В образцах коллоидного зоба (КЗ) AT, как правило, отсутствует [Hoang-Vu С., 2002]. В регуляции функций теломеразного комплекса принимает участие фактор TRF1 (telomeric repeat binding factorl). TRF1 взаимодействует с последовательностью TTAGGG на концах хромосом и препятствует доступу теломеразы к теломерам [de Lange Т., 2005]. Экспрессия данного фактора в опухолях ЩЖ до настоящего времени в мире не изучена.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы состояла в оценке значимости теломеразы и других онкомаркеров (СОХ-2, TRF1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) в дифференциальной диагностике рака и доброкачественных новообразований щитовидной железы, таких как коллоидный зоб, фолликулярная аденома и аутоиммунный тиреоидит.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать условия проведения анализа экспрессии генов СОХ-2, TRF\, ММР-7, с-Мус, р53 и RelA методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР).

2. Провести полуколичественный анализ экспрессии генов потенциальных онкомаркеров (hTERT, СОХ-2, TRF1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) методом ОТ-ПЦР в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с различными новообразованиями щитовидной железы, а именно папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.

3. Исследовать активность теломеразы с помощью модифицированного метода TRAP (telomeric repeat amplification protocol) в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.

4. Оценить значимость предложенных онкомаркеров для диагностики рака щитовидной железы с помощью ROC (Receiver Operating Characteristic analysis)-анализа и выбрать онкомаркеры, имеющие наилучшую диагностическую эффективность в отношении рака щитовидной железы.

5. Разработать логистическую регрессионную модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы с использованием наиболее значимых онкомаркеров.

Научная новизна исследования. Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов hTERT, СОХ-2, TRFl, ММР-1, с-Мус, р53, RelA, а также активности теломеразы в образцах опухолей, полученных от больных с РЩЖ, КЗ, ФА и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, что позволило получить новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе.

В работе впервые показано, что в дифференцированных карциномах ЩЖ (папиллярный и фолликулярный рак) одним из механизмов инактивации онкосупрессора р53 является подавление экспрессии генар53 на транскрипционном уровне.

Впервые обнаружено, что при РЩЖ наблюдается тенденция к уменьшению уровня экспрессии гена TRF1 по сравнению с КЗ, ФА и АИТ.

Впервые описаны различные варианты альтернативного сплайсинга пре-мРНК RelA в опухолях ЩЖ.

Получены новые данные по экспрессии генов некоторых молекулярных маркеров при АИТ, дополняющие представления об АИТ как о сложном в патогенетическом отношении заболевании.

Практическая значимость работы. Проведена оптимизация условий анализа экспрессии генов СОХ-2, TRF\, ММР-1, с-Мус, р53 и RelA методом ОТ-ПЦР. Оптимизированные методики апробированы на клинических образцах тканей больных с различными новообразованиями ЩЖ.

Осуществлен сравнительный анализ различных показателей, определяющих ценность предложенных онкомаркеров в дифференциальной диагностике новообразований ЩЖ, таких как чувствительность, специфичность, точность, положительная и отрицательная прогностическая ценность, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов, отношение шансов диагностического теста. Установлено, что наиболее полезными для диагностики РЩЖ являются онкомаркеры СОХ-2, р53 и TRF1, менее полезными - с-Мус и ММР-7, не имеющими диагностического значения - RelA и hTERT.

Разработана логистическая регрессионная модель дифференциальной диагностики РЩЖ у больных с неаутоиммунными заболеваниями данного органа на основе оценки относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRFI и ММР-1. Полученные данные позволяют провести дополнительные исследования на материале ТАБ на предмет создания диагностического теста с целью выявления РЩЖ на дооперационном этапе.

непролиферирующих нормальных тканях и в нашем исследовании AT обнаружена у 71% больных РЩЖ, после проведения дополнительных исследований анализ AT в ТАБ может быть предложен в качестве прогностического критерия развития РЩЖ у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на XVI Российском симпозиуме по хирургической эндокринологии «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (сентябрь 2007 г., Саранск); XXIII конференции IATMO «Cancer, cell death and differentiation» (октябрь 2007 г., Триест, Италия); V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (май 2008 г., Москва); 6-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (сентябрь 2008 г., Астрахань); XII Российском онкологическом конгрессе (ноябрь 2008 г., Москва); научных семинарах кафедры биологической химии лечебного факультета ММА им. И.М. Сеченова Росздрава; заседаниях Ученого совета ГУЗ Московского НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы.

Апробация диссертационной работы состоялась на заседании кафедры биологической химии лечебного факультета ММА им. И.М. Сеченова Росздрава 22 декабря 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Дифференцированные формы РЩЖ (фолликулярный и папиллярный) характеризуются снижением экспрессии генов р53, TRF1 и увеличением экспрессии генов ММР-1, СОХ-2 и с-Мус.

2. Для АИТ характерны высокие уровни AT и экспрессии гена hTERT.

3. Использование логистической регрессионной модели, основанной на оценке относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRF1 и ММР-1, позволяет с высокой точностью диагностировать рак у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. У больных с АИТ высокоспецифичными маркерами РЩЖ являются СОХ-2 и TRF1.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста. Работа содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 198 источников (23 отечественных, 175 зарубежных). Работа иллюстрирована 14 таблицами и 54 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинический материал.

Материалом для исследования служили постоперационные образцы тканей ЩЖ от 55 больных, проходивших обследование и лечение в Факультетской хирургической клинике им. H.H. Бурденко ММА им. И.М. Сеченова. Среди пациентов были 51 (92,7%) женщина и четыре (7,3%) мужчины. Средний возраст больных составил 49,4±13 лет (от 17 до 76 лет).

На основании результатов гистологического исследования операционного материала все больные были распределены на четыре группы (табл.1): пациенты с РЩЖ (14 человек), пациенты с ФА (19 человек), пациенты с КЗ (11 человек) и пациенты с АИТ (11 человек). РЩЖ был представлен дифференцированными формами. Фолликулярный РЩЖ был выявлен у четырех пациентов (29%), папиллярный рак - у десяти больных (71%). У девяти больных папиллярный рак был представлен классическим вариантом, фолликулярный вариант папиллярного рака наблюдался у одного пациента. Инвазия капсулы и/или окружающих тканей наблюдалась у шести (43%) пациентов с РЩЖ. Метастазы в один из шейных лимфатических узлов были выявлены у двух больных. В группу пациентов с АИТ вошли больные с классическим тиреоидитом Хашимото (пять пациентов), один больной со смешанным зобом Хашимото и де Кервина, а также пациенты, имеющие доброкачественные узловые формы заболеваний ЩЖ на фоне АИТ (пять пациентов).

Таблица 1. Распределение больных узловыми формами заболеваний ЩЖ на

группы в зависимости от гистологического диагноза

Морфологическая форма Количество больных %

Рак 14 25

Фолликулярная аденома 19 35

Коллоидный зоб 11 20

Аутоиммунный тиреоидит 11 20

Всего: 55 100

Получение экстрактов для анализа активности теломеразы.

Экстракты из клеток линии Вго и клинических образцов ткани ЩЖ получали по методике, предложенной Kim N.W. [Kim N.W., 1994], с некоторыми модификациями.

Измерение концентрации белка в экстрактах.

Концентрацию белка в экстрактах из клеток и тканей определяли с помощью красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 («Fluka», Швейцария) по методу Брэдфорд [Bradford М.М., 1976] с некоторыми модификациями.

Анализ активности теломеразы методом TRAP с модификациями.

Определение AT в экстрактах из клеток и тканей проводили с помощью модифицированного неизотопного метода TRAP [Glukhov A.I., 1998].

Разделение амплифицированных продуктов теломеразной реакции (TRAP-продукты) осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем ПААГ, используя lxTBE (Трис-борат-ЭДТА) буфер. Визуализацию разделенных продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (к 300 нм) после окрашивания геля в течение 30 мин в растворе красителя SYBR Gold («Molecular Probes», США). Окрашенные гели фотографировали цифровой камерой. Полученные цифровые фотографии TRAP-продуктов оценивали визуально и с помощью программы для анализа изображений ImageJ 1.351 («NIH», США). При этом исследуемые пробы сравнивались с контрольным образцом - экстрактом, полученным из клеток линии

Вго и содержащим 0,7 мкг белка. Теломеразная активность в контрольном образце принималась за единицу. Исследуемый образец считался теломеразопозитивным и подлежал обсчету при выявлении трех и более горизонтальных полос, располагающихся на расстоянии друг от друга, отличающемся на длину (6 пар нуклеотидов (п.н.)) одного теломерного повтора (ТТАССО). После полуколичественного анализа АТ в экстрактах, содержащих 8 мкг белка, производили деление пациентов на группы с высокой АТ (при уровне АТ >0,4 отн.ед.), средней (0,2-0,39 отн.ед.), низкой (0,1-0,19 отн.ед.) и тех, у кого АТ отсутствует (рис.1).

Рис. 1. Результаты исследования АТ в тканевых экстрактах ЩЖ. Дорожки: 1 - образец РЩЖ с высокой АТ; 2 - образец ФА со средней АТ; 3 -образец ФА, АТ отсутствует; 4 - образец КЗ с низкой АТ. К+ - положительный контроль (теломеразопозитивная клеточная линия Вго). К--отрицательный контроль (проба, не содержащая экстракта). В реакции ТИАР вносили 8 мкг белка каждого экстракта, за исключением К+ (0,7 мкг белка).

Выделение РНК.

Тотальную клеточную РНК выделяли из клинических образцов тканей ЩЖ и культур клеток описанным ранее методом [С1ютсгуш1а Р., ЗассЫ 14., 1987] с некоторыми модификациями.

Концентрацию полученных растворов РНК измеряли спектрофотометрически. Чистоту РНК определяли по отношениям поглощений при длинах волн 260, 280 и 230 нм. Для оценки степени деградации выделенной РНК проводили электрофорез образцов РНК (по 1 мкг) в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг/мл), используя в качестве буфера 1хТВЕ (рН 8,3).

Обратная транскрипция.

Обратную транскрипцию (ОТ) (синтез кДНК) проводили в реакционной смеси конечным объемом 20 мкл, приготовленной на обработанной диэтилпирокарбонатом деионизованной стерильной воде и содержащей 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,8); 16,6 мМ (Ш^О^ 0,01% (в/о) Тдуееп 20; 4 мМ М^С12; 1 мМ каждый дезоксирибонуклеозидтрифосфат (с1ЫТР); 3,2 мкг гексамерных праймеров со случайной последовательностью; 10 мМ дитиотрейтол; 10 ед. ингибитора рибонуклеаз; 30 ед. рекомбинантной обратной транскриптазы М-МЬУ; 1 мкг тотальной РНК. Смесь инкубировали при 42°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали путем тепловой инактивации обратной транскриптазы, выдерживая смесь при 94°С в течение 10 мин.

ПЦР с праймерами к генам ИТЕЯТ, СОХ-2, ТЯП, ММР-1, с-Мус,р53, Яе1А и ¡¡-актина.

ПЦР проводили в реакционной смеси конечным объемом 50 мкл, содержащей 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,8); 16,6 мМ (МН4)2804; 0,01% (в/о) Т\уееп 20; 1,5 мМ МеС12; 0,2 мМ каждый сИЧТР; 15 пкмоль каждого из пары праймеров; 2,5 ед.

рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы; 5 мкл реакционной ОТ-смеси, содержащей кДНК. Для амплификации кДНК использовали описанные ранее последовательности специфических праймеров для с-Мус [Cerezo А., 2003]; р53 [Kinscherf R., 1998]; ММР-1 [Yamamoto H., 2004]; СОХ-2 [Lo C.Y., 2005]; RelA [Tian F., 2006]; hTERT [Ulaner G.A., 1998]; TRF\ [Fujimoto R., 2003 ]; ß-актина [Choy M.Y., 2004].

Продукты ОТ-ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5% (для р53, RelA, TRF1, СОХ-2, ММР-7) или 2% (для с-Мус) агарозных гелях, содержащих 0,5 мкг/мл бромистого этидия. При анализе экспрессии гена h TER Т электрофорез проводили в 1,8% агарозном геле с последующей окраской геля раствором высокочувствительного красителя SYBR Green I («Molecular Probes», США). Гели визуализировали в УФ свете, снимали на цифровую фотокамеру Kodak и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программ ImageJ 1.351 («NIH», США) и Quanty One v.4.4.0 («Bio-Rad», США).

В качестве положительного контроля в реакциях ПЦР с праймерами к генам СОХ-2, с-Мус, RelA, TRFI и р53 была использована кДНК клеточной линии меланомы человека Вго. Положительным контролем в реакциях ПЦР с праймерами клинического образца, в котором была выявлена высокая экспрессия ММР-1. В качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь ОТ, не содержащую кДНК. Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (ß-актина), который принимали за единицу. Уровень экспрессии исследуемого гена ниже 0,15 отн.ед. расценивали как очень низкий, от 0,15 до 0,29 отн.ед. - низкий, от 0,3 до 0,54 отн.ед. - средний, от 0,55 до 0,99 отн.ед. - высокий, выше 1 отн.ед. - очень высокий (гиперэкспрессия).

Статистическая обработка результатов.

Каждый эксперимент повторяли 3 раза и находили средние арифметические значения определяемых показателей по результатам трех измерений. Для оценки значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия и рассчитанные коэффициенты корреляции (г) считались достоверными при уровне значимости р<0,05. Для построения диагностической модели нами был применен логистический регрессионный анализ.

ROC-анализ диагностической ценности онкомаркеров.

Для оценки диагностической значимости маркеров в отношении РЩЖ вычисляли чувствительность (долю истинно положительных ответов среди больных РЩЖ), специфичность (долю истинно отрицательных ответов тестов среди больных с доброкачественными заболеваниями ЩЖ), точность (долю истинных результатов среди всех результатов теста), положительную прогностическую ценность (долю истинно положительных ответов среди всех положительных), отрицательную прогностическую ценность (долю истинно отрицательных ответов среди всех отрицательных), отношение правдоподобия положительного (ОППР) и отрицательного результатов (ОПОР), отношение шансов диагностического теста (ОШДТ) по общепринятым в медицине формулам [Меньшиков В.В., 1997; Флетчер Р., 1998; Реброва О.Ю., 2003].

Б качестве одного из наиболее полных и современных методов оценки информативности диагностического теста использовали ROC-анализ. Диагностическая эффективность каждого из онкомаркеров (или предсказательная способность, информационная ценность теста, качество модели) оценивалась по общепринятой экспертной шкале для значений площади под характеристической (ROC-) кривой AUC (Area Under Curve) [Hanley J.A., 1989; Zweig M.H. 1993].

Расчеты выполнены на персональном компьютере с использованием программных средств пакетов STATISTICA v7.1 и MedCalc for Windows v9.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор праймеров и оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР.

Проанализированы и выбраны опубликованные последовательности праймеров, комплементарные разным экзонам исследуемых генов, что позволило проводить полуколичественный анализ экспрессии генов даже в присутствии микропримесей геномной ДНК. Оптимизация условий ПЦР (температурных параметров и количества циклов) была проведена с кДНК линии Вго и кДНК ЩЖ. Выбор оптимального количества циклов ПЦР проводился на основании анализа экспоненциальных кривых выхода специфического ампликона.

Анализ активности теломеразы в тканевых и клеточном экстрактах от пациентов с различными онкопатологиями щитовидной железы.

АТ была выявлена у десяти из 14 (71%) больных РЩЖ, причем высокий и средний уровень АТ имели по пять больных (рис.2). У оставшихся четырех больных АТ не найдена (29%). Отсутствие АТ могло быть связано с наличием в экстрактах ингибиторов теломеразы или Taq ДНК-полимеразы, однако по результатам экспериментальной проверки данная гипотеза не получила подтверждения.

АТ была выявлена у семи из 19 (37%) больных с ФА, причем у трех обнаружен высокий уровень АТ, а у четырех - средний. При анализе образцов КЗ АТ была выявлена у семи из 11 больных (63,6%), среди которых был один пациент с высокой АТ, двое - со средней АТ и четыре - с низким уровнем АТ.

Высокая АТ Средняя АТ Низкая АТ Отсутствует

I РЩЖ □ ФА Ш КЗ ШАИТ

Рис. 2. Распределение больных с новообразованиями ЩЖ по уровню АТ (полуколичественное исследование). Реакционная смесь при ТИАР-анализе содержала 8 мкг белка.

По нашим данным, высокая АТ у больных с РЩЖ выявлена в среднем 2,2 раза чаще, чем у больных с ФА, и в 4 раза чаще, чем у больных с КЗ. Так как активная теломераза является маркером злокачественности в непролиферирующих нормальных тканях, выявление АТ в доброкачественных опухолях ЩЖ может быть признаком ранней стадии злокачественной трансформации, не определяемой при гистологическом исследовании. В связи с этим, анализ АТ в материале ТАБ после проведения дополнительных может быть использован в качестве прогностического критерия развития РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

У всех больных с АИТ была обнаружена АТ, при этом подавляющее большинство больных (91%) имели высокий уровень АТ и только один пациент -средний.

Исследование экспрессии генов ¡гТЕЯТ, с-Мус, р53, СОХ-2, TR.F1, р65/Не1А, ММР-1 и р-актина в опухолях щитовидной железы.

Уровень экспрессии конститутивного гена р-актина практически не различался во всех исследуемых образцах, что указывало на хорошее качество тотальной РНК из клинического материала.

Статистическая обработка данных показала, что по уровню экспрессии р53 РЩЖ достоверно отличается от ФА. Также статистически значимые различия уровней экспрессии гена р53 выявлены между группами «АИТ» и «ФА»; «АИТ» и «КЗ» (рис.3). Установлено, что у пациентов с РЩЖ более часто, чем в других группах, наблюдалось снижение экспрессии гена онкосупрессора р53: низкий и средний уровни экспрессии этого гена были выявлены у шести (43%) из 14 пациентов с РЩЖ и только у двух больных (18%) с АИТ, по одному больному с КЗ (9%) и ФА (5%) (табл.2).

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии гена р53 в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ. Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости

различий (р) меяеду группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии р53 при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 0,71; 0,83; 0,80 и 0,63 отн.ед., соответственно.

а: 1,8

а 1,5

| "л О 1,2

«а, я я 0,9 о

и а 0,6

с.

и а 0,3

(Г) 0,0

|з=0.74 1

■ 1....... ___________о= р=0,38 0.045 ............. 1

1 1 р=0.0071 р=0.355

• о=0,017 • Г Г ' 1

..........1 -•- 1 ......... • _ ♦........

• • » • Т •

• • .........

РЩЖ (п=14) КЗ (П=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11) Таблица 2. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости

Уровень экспрессии р53 Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Низкий и очень низкий 2/14 (14%) 0% 0% 1/11 (9%)

Средний 4/14 (29%) 1/19(5%) 1/11 (9%) 1/11 (9%)

Высокий 8/14 (57%) 18/19(95%) 10/11 (91%) 9/11 (82%)

Статистическая обработка данных показала, что по уровню экспрессии с-Мус РЩЖ достоверно отличается от ФА и КЗ, но не отличим от АИТ. Также достоверные различия уровня экспрессии с-Мус обнаружены между АИТ и КЗ (рис.4).

Рис. 4. Относительный уровень экспрессии гена с-Мус в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ.

Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости

различий (р) между группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии с-Мус при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 0,46; 0,39; 0,32 и 0,44 отн.ед., соответственно.

В целом, следует отметить, что для РЩЖ и АИТ характерны более высокие значения уровней экспрессии гена с-Мус: низкий уровень экспрессии гена с-Мус был детектирован менее чем в 10% случаев РЩЖ и АИТ, 37% случаев ФА и 36% случаев КЗ (табл.3).

Таблица 3. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости _от уровня относительной экспрессии гена с-Мус_

Уровень экспрессии с-Мус Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Высокий 2/14 (14%) 0% 0% 2/11 (18%)

Средний 11/14(79%) 12/19 (63%) 7/14 (64%) 8/11 (73%)

Низкий 1/14 (7%) 7/19 (37%) 4/11 (36%) 1/11 (9%)

На рис.5, представлены характерные результаты анализа экспрессии гена СОХ-2 в различных группах больных.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 К+ К-

Рис. 5. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии гена СОХ-2 в клинических образцах, полученных от пациентов с РЩЖ (1-4), ФА (5-8), КЗ (9-12) и АИТ (13-16). К+ -положительный контроль (клеточная линия Вго). К- - отрицательный контроль (ОТ-ПЦР проводили в отсутствие тотальной РНК). Стрелкой указан специфический продукт ОТ-ПЦР размером 724 п.н. Фото 1,5% агарозного геля, окрашенного бромистым этидием.

к з

и и V О, С и ¡4 (Т)

1,2 1,0

0,8

ч »

аз 0,6

~0,4 0,2 0,0

р=0,823

р=0.0062

р=0.024

р=0.089

Р=0.116

р=0.0043

\ * * ' • I I :

РЩЖ (п=14) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

Статистическая обработка полученных результатов позволила установить, что по уровню экспрессии СОХ-2 группа больных РЩЖ достоверно отличается от всех остальных исследуемых групп (рис.6).

Рис. 6. Относительный уровень экспрессии гена СОХ-2 в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ.

Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости

различий (р) между группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии СОХ-2 при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 0,30; 0,03; 0,05 и 0,05 отн.ед, соответственно.

Высокий уровень экспрессии СОХ-2 наблюдался только в группе пациентов с РЩЖ (14% случаев). Средний уровень экспрессии СОХ-2 был выявлен у шести (36%) больных РЩЖ и только у одного больного с АИТ. Во всех остальных случаях АИТ, а также во всех случаях ФА и КЗ детектировалась лишь низкая и очень низкая экспрессия СОХ-2 (табл.4).

Таблица 4. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости _от уровня относительной экспрессии гена СОХ-2_

Уровень экспрессии СОХ-2 Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Высокий 2/14 (14%) 0% 0% 0%

Средний 5/14 (36%) 0% 0% 1/11 (9%)

Низкий и очень низкий 7/14 (50%) 19/19(100%) 11/11 (100%) 10/11 (91%)

При полуколичественном анализе уровней экспрессии гена ММР-1 в исследуемых группах оказалось, что гиперэкспрессия ММР-1 наблюдалась у 50% пациентов с РЩЖ, 45% больных АИТ и только у одного больного с ФА (5%) и двух пациентов с КЗ (18%) (табл. 5).

Таблица 5. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости _от уровня относительной экспрессии гена ММР-1_

Уровень экспрессии ММР-1 Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Высокий 7/14 (50%) 1/19(5%) 2/11 (18)% 1/11 (9%)

Средний 3/14(21,5%) 3/19(16%) 1/11 (9%) 0%

Низкий 1/14 (7%) 7/19 (37%) 4/11 (36,5%) 5/11 (45,5%)

Очень низкий 3/14(21,5%) 8/19(42%) 4/11 (36,5%) 5/11 (45,5%)

1,0 0,8

I в

8 е!

к £,0,4

ч0,6

и и о

с. в и

СП

0,2 0,0

,_р=0|049_

р=0.01? , р=0,0074|

........•........'......р=0.451...............

в ',р=0.846 , ' ........*.........'...........1 р=о,577........

• 1-1

— •

I I I Г

РЩЖ (п=14) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

Статистическая обработка данных показала, что по уровню экспрессии ММР-1 РЩЖ достоверно отличается от ФА. Также статистически значимые различия уровней экспрессии гена ММР-1 выявлены между группами «АИТ» и «ФА», «АИТ» и «КЗ». Важно отметить, что уровень значимости различий между группами «РЩЖ» и «КЗ» был близок к достоверному (рис.7).

Рис. 7. Относительный уровень экспрессии гена ММР-1 в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ.

Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости

различий (р) между группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии ММР-1 при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 1,0; 0,19; 0,22 и 0,87 отн.ед., соответственно.

В нашем исследовании была выявлена статистически достоверная, прямая корреляция между уровнем экспрессии ММР-1 и наличием инвазии и/или метастазов: коэффициент корреляции г=0,76 (р<0,05).

При анализе экспрессии RelA впервые в ткани ЩЖ обнаружены различные варианты альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена RelA (рис.8). Во всех случаях новообразований ЩЖ наблюдался полноразмерный транскрипт гена RelA, которому соответствовал ПЦР-фрагмент длиной 630 п.н. Наряду с преобладающим полноразмерным вариантом транскрипта гена RelA, при опухолях ЩЖ были обнаружены две формы мРНК с делениями, затрагивающими RHD (Reí Homology Оотат)-домен белка p65/RelA: р65 дельта 1 (ему соответствует ПЦР-фрагмент длиной 600 п.н.), р65 дельта 3 (ему соответствует ПЦР-фрагмент длиной 309 п.н.).

1 2 3 4 5 6 7 8. 9 10 11 12 13 14 15 16 К± К-

600 пн*| J

Рис. 8. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии гена RelA в клинических образцах, полученных от пациентов с РЩЖ (1-4), ФА (5-8), КЗ (9-12) и АИТ (13-16). К+ -положительный контроль (клеточная линия Вго). К- - отрицательный контроль (ОТ-ПЦР проводили в отсутствие тотальной РНК). Стрелками указаны специфические продукты ОТ-ПЦР и их размер. Фото 1,5% агарозного геля, окрашенного бромистым этидием.

я а 1

2 «

§ X н

« 3

Ьс 3

а л

2,4 2,0 1,6 1.2 0,8 0,4 0,0

р= 0,83

.......... '. о=0.071 ................1...............

0.015 р=0,0024

"-р-0,028

• 1 |

А • • • • • i 1 ♦

• I • I

* t * •

РЩЖ (п=14) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

Статистическая обработка данных по экспрессии гена Яе1А при различных новообразованиях ЩЖ не выявила достоверных различий между исследуемыми группами (рис.9). Однако, следует отметить, что более чем у половины больных РЩЖ (58%) наблюдалась гиперэкспрессия Ке1А, тогда как доля больных ФА и КЗ, имеющих очень высокий уровень экспрессии Ке1А, составила 26% и 18% соответственно (табл.6).

р=0.622

р=0.156

|Р=0,Ч73 .....р=0|4&1.

р=0.813 р=0.341

♦ 1 I 1

I | } Т

I........I.........I........

РЩЖ (п=13) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

Рис. 9. Относительный уровень экспрессии гена Яе1А в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ.

Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости различий (р) между группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии Ле1А при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 1,01; 0,68; 0,74 и 0,88 отн.ед., соответственно.

Таблица 6. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости _от уровня относительной экспрессии гена Яе1А_

Уровень экспрессии RelA Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Очень высокий 7/13 (54%) 5/19 (26%) 2/11 (18%) ■5/11 (46%)

Высокий 3/13 (23%) 8/19(42%) 5/11 (46%) 4/11 (36%)

Средний 3/13 (23%) 6/19(32%) 3/11 (27%) 1/11 (9%)

Низкий и очень низкий 0% 0% 1/11 (9%) 1/11 (9%)

При РЩЖ была выявлена статистически значимая корреляция между уровнями экспрессии Ке1А и СОХ-2 (г=0,8), а также между уровнями экспрессии Ке1А и р53 (1=0,71).

Статистическая обработка полученных результатов позволила установить, что уровень экспрессии TR.Fl в группе больных РЩЖ понижен и достоверно отличается от всех остальных исследуемых групп пациентов с новообразованиями ЩЖ. Также статистически значимые различия уровней экспрессии гена TRF\ выявлены между группами «АИТ» и «ФА» (рис.10).

Рис. 10. Относительный уровень экспрессии гена TRF-1 в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ. Указаны медиана (-) и уровень статистической

значимости различий (р) между группами.

п - количество пациентов.

Медианы уровня экспрессии TRF1 при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 0,83; 1,22; 1,17 и 1,03 отн.ед., соответственно.

В ходе ОТ-ПЦР-анализа экспрессии гена hTERT в образцах опухолей ЩЖ преимущественно обнаружены ампликоны, соответствующие полноразмерному транскрипту гена hTERT (+а, +ß) и (-Р)-варианту альтернативного сплайсинга пре-мРНК hTERT, размером 457 и 275 п.н., соответственно (рис.11).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 К+ К-

457 п.н 275 п.н

Рис. 11. Анализ методом ОТ-ПЦР экспрессии гена hTERT в клинических образцах, полученных от пациентов с РЩЖ (1-4), ФА (5-8), КЗ (9-12) и АИТ (13-16). К+ -положительный контроль (клеточная линия Вго). К- - отрицательный контроль (ОТ-ПЦР проводили в отсутствие тотальной РНК). Стрелками указаны специфические продукты ОТ-ПЦР и их размер. Фото 1,8% агарозного геля, окрашенного Sybr Green I.

Статистическая обработка данных показала, что по уровню экспрессии гена hTERT группа пациентов с РЩЖ не отличается от групп больных с ФА и КЗ. В то же время уровень экспрессии гена hTERT был достоверно выше в группе больных с АИТ по сравнению со всеми остальными группами пациентов (рис.12).

Рис. 12. Относительный уровень экспрессии гена hTERT в операционном материале от пациентов с новообразованиями ЩЖ.

Указаны медиана (-) и уровень статистической значимости

различий (р) между группами, п - количество пациентов. Медианы уровня экспрессии hTERT при РЩЖ, ФА, КЗ и АИТ составили 0,053; 0,027; 0,047 и 0,34 отн.ед., соответственно.

а к

I \ Е'

о. а

2,4 г 2,0 1,6

В 1,2

н ©

" 0,8 0,4 0,0

,_р=0.04_

р=0.014 р=0,00007 р=0Д)15

р=0.15 р=0,41

! i ! !

РЩЖ (п=13) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

1,2 1,0

Й5. ^ g

5 0,4

и t> о, к

х m

0,2 0,0

р=0,0018

р=0.35

р=0,065 i

р=0,0001

р=0.0009

, Р=0.78

А_1

РЩЖ (п=14) КЗ (п=11)

ФА (п=19) АИТ (п=11)

Распределение пациентов в зависимости от уровня экспрессии гена ИТЕКТ представлено в табл.7.

Таблица 7. Распределение пациентов с новообразованиями ЩЖ в зависимости

от уровня относительной экспрессии гена hTERT

Уровень экспрессии hTERT Количество больных

Рак ФА КЗ АИТ

Высокий 0% 0% 0% 2/11 (18%)

Средний 1/14 (7%) 1/19(5%) 0% 3/11 (27%)

Низкий 2/14 (14%) 0% 2/11 (18%) 3/11 (27%)

Очень низкий 11/14(79%) 18/19(95%) 9/11 (82%) 3/11 (27%)

В ходе корреляционного анализа было обнаружено, что существует достаточно высокая достоверная прямая корреляция (г=0,74) между уровнем экспрессии hTERT и уровнем AT. Также была выявлена статистически значимая прямая корреляция между уровнями экспрессии hTERT и с-Мус (r=0,36), hTERT и ММР-1 (г=0,49).

На рис.13 приведены результаты анализа некоторых онкомаркеров в патологичном опухолевом узле и прилежащей к узлу ткани ЩЖ пациента с доброкачественным КЗ и двух пациентов с РЩЖ. В образце КЗ в узле и окружающей ткани уровень экспрессии онкомаркеров укладывается в значения, характерные для доброкачественных заболеваний ЩЖ, AT не обнаружена. При папиллярном раке с мультифокальным типом роста наблюдаются изменения в уровне онкомаркеров (повышена экспрессия СОХ-2 и ММР-1) как в самом узле, так и в окружающей ткани, содержащей микрофокусы рака. В образце фолликулярного рака в опухолевом узле повышена экспрессия СОХ-2 и AT, в то же время в окружающей опухоль ткани, не имеющей морфологических признаков злокачественности (гистологический диагноз - макро-микрофолликулярный зоб), наблюдается не только активация теломеразы, но и снижение экспрессии онкосупрессора р53. Обнаружение AT и изменений в уровне экспрессии онкомаркеров позволяет предположить о развитии рака в морфологически пока не измененной ткани.

Особенности экспрессии онкомаркеров и активность теломеразы у больных аутоиммунным тпреоидитом.

По экспрессии генов большинства используемых в работе маркеров, за исключением СОХ-2 и TRF1, АИТ не отличается от РЩЖ. У всех больных с АИТ была обнаружена AT, при этом подавляющее большинство больных (91%) имели высокий уровень AT и только один пациент - средний. Нет данных относительно того, каким клеткам в таких случаях принадлежит AT - фолликулярным клеткам ЩЖ или лимфоцитам. Столь высокий уровень AT при АИТ объясняют наличием лимфоцитарной инфильтрации ткани ЩЖ [Ahn M.J., 1997]. Однако в лимфоцитах периферической крови AT находится на низком уровне [Weng N.P., 1997]. Кроме того, в нашем исследовании показательными являются случаи отсутствия AT при анализе экстрактов с 0,7 мкг белка в образце ФА с лимфоцитарной инфильтрацией и в образце папиллярного рака на фоне очагового тиреоидита. В то же время замечено, что на фоне АИТ повышается риск развития папиллярного рака и

■ р53 0 СОХ-2 □ MVP-7 И с-М/с Ш AT

44 44а 3 За 12 12а

Рис. 13. Относительные уровни экспрессии генов р53, СОХ-2, ММР-1, с-Мус и AT в патологичном узле и в прилежащей к нему ткани ЩЖ. Образец 44 - один из узлов пациента с диагнозом многоузловой КЗ, 44а - прилежащая к узлу ткань. Образец 3 -умеренно дифференцированный фолликулярный рак, За - в окружающей ткани макро-микрофолликулярный КЗ. Образец 12 - папиллярный рак с прорастанием капсулы органа, 12а - в окружающей ткани микрофокусы рака. По оси абсцисс -номер клинического образца, по оси ординат -относительный уровень экспрессии конкретного гена, отн.ед.

*- AT, отн.ед. В образце 3 AT составила 0,19 отн.ед., в образце За - 0,37 отн.ед., в образце 12 - 0,03 отн.ед. В реакции TRAP вносили 0,7 мкг белка каждого экстракта.

лимфом. Например, развитие лимфомы ЩЖ на фоне АИТ зарегистрировано у 63% больных [Кулаев И.А., 2006]. Факты развития у пациентов с АИТ лимфомы ЩЖ позволяют отнести АИТ к предраковому заболеванию [Иванова О.И., 2006].

На фоне аутоиммунных поражений ЩЖ часто наблюдается трансформация фолликулярного эпителия, что не позволяет исключить злокачественность процесса при цитологическом исследовании. Анализ маркеров СОХ-2 и TRF1 может стать дополнительным критерием в дифференциальной диагностике АИТ и РЩЖ. Так, обнаружение повышения экспрессии СОХ-2 и снижения экспрессии TRF\ позволит верифицировать РЩЖ на фоне АИТ.

Оценка диагностической значимости онкомаркеров.

По нашим данным, изменения в уровне экспрессии многих изученных генов при АИТ соответствуют изменениям, наблюдаемым при РЩЖ. В связи с этим, анализ диагностической значимости каждого онкомаркера проводили дважды: сначала группу больных РЩЖ сравнивали с объединенной группой больных с ФА, КЗ и АИТ, а затем больных РЩЖ сравнивали с больными неаутоиммунными доброкачественными заболеваниями ЩЖ (ФА и КЗ). Результаты определения различных параметров, определяющих диагностическую ценность онкомаркеров, представлены в табл.8.

Таблица 8. Показатели диагностической ценности онкомаркеров при индивидуальном использовании

Показатель р53 СОХ-2 с-Мус RelA ММР-7 TRF1 hTERT AT

Значение «Cut-off», отн.ед. <0,534 >0,228 >0,437 >0,819 >0,931 <0,83 >0,028 >0,19

Чувствительность 42,9%* (42,9%)** 57,1% (57,1%) 64,3% (64,3%) 69,2% (69,2%) 57,1% (57,1%) 53,9% (53,9%) 85,7% (85,7%) 71,5% (71,5%)

Специфичность 92,7% (96,7%) 97,5% (96,7%) 78% (90%) 63,4% (70%) 80,5% (90%) 95,1% (96,7%) 41,5% (56,7 %) 48,8% (66,7%)

Точность 80% (79,5%) 87,3% (84,1%) 74,5% (81,8%) 64,8% (69,8%) 63,1% (79,5%) 85,2% (83,7%) 52,7% (65,9%) 54,5% (68,2%)

Положительная прогностическая ценность 66,7% (85,7%) 88,8% (88,8%) 50% (75%) 37,5% (50%) 50% (72,7%) 77,8% (87,5%) 33,3% (48%) 32,3% (50%)

Отрицательная прогностическая ценность 82,6% (78,4%) 87% (82,9%) 86,5% (84,4%) 86,7% (84%) 84,6% (81,8%) 86,7% (82,9%) 89,5% (89,5%) 83,3% (83,3%)

ОППР 5,86 (12,86) 11,71 (17,14) 2,93 (6,43) 1,89 (2,31) 2,93 (5,71) 11,04 (16,15) 1,46 (1,98) 1,39 (2,14)

ОПОР 0,62 (0,59) 0,45 (0,44) 0,46 (0,40) 0,49 (0,44) 0,53 (0,48) 0,49 (0,48) 0,34 (0,25) 0,59 (0,43)

ОШДТ 9,5 (21,8) 26,0 (38,9) 6,4 (16,1) 4,01 (5,25) 5,5 (11,9) 22,5 (33,6) 4,3 (7,92) 2,36 (4,98)

Площадь под кривой AUC 0,613 (0,669) 0,767 (0,78) 0,702 (0,767) 0,629 (0,654) 0,681 (0,738) 0,841 (0,874) 0,518 (0,661) 0,497 (0,667)

Уровень значимости р для AUC 0,178 (0,045) 0,0009 (0,0006) 0,019 (0,001) 0,166 (0,105) 0,039 (0,005) 0,0001 (0,0001) 0,84 (0,08) 0,98 (0,0688)

Примечание. * - группой сравнения для расчета показателей являлись больные с ФА, КЗ

АИТ, ** - группой сравнения для расчета показателей являлись больные с неаутоиммунными доброкачественными заболеваниями ЩЖ (ФА и КЗ). «Cut-off» - порог отсечения.

Из табл.8 следует, что наиболее полезными маркерами по уровню ОППР в дифференциальной диагностике РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ, являются СОХ-2, р53 и ТШЧ (ОППР>5), полезными - ММР-7 и с-Мус (2<ОППР<5). Маркеры Яе1А и ЬТЕЯТ не имеют диагностического значения в отношении РЩЖ (ОППР<2).

При оценке площади под характеристической кривой АИС было установлено, что статистически значимой (р<0,05) наилучшей диагностической эффективностью в отношении РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ (оценена как очень хорошая) обладает TR.F1, хорошей - СОХ-2, с-Мус, ММР-7, удовлетворительной - р53 (рис.14).

Диагностическая эффективность онкомаркера

Отличная

0,9

U 0,8

< 0,7 0,6 0,5

0,87*

0,78* 0.77*

0,67*

0,74'

0,65

0,6g

0.67

Очень хорошая

Хорошая

Удовлетворительная

Неудовлетворительная

р53 СОХ-2 с-Мус RelA ММР-7 TRF1 hTERT AT

Рис. 14. ROC-анализ диагностической ценности исследуемых онкомаркеров у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. AUC - площадь под характеристической (ROC-) кривой. * - уровень значимости р<0,05

Таким образом, использование различных подходов для оценки диагностической значимости позволило сделать вывод, что в качестве потенциальных маркеров РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ могут рассматриваться СОХ-2, р53, ТНР-1, ММР-7 и с-Мус. Анализ экспрессии Яе1А и ЬТЕЯТне имеет диагностического значения в отношении РЩЖ.

Относительно диагностики РЩЖ у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ следует отметить, что в клинике диагноз АИТ устанавливается на дооперационном этапе по совокупности результатов обследования (пальпация, УЗИ, определение аутоантител к тиреоглобулину, микросомальной фракции или тиреопероксидазе). Настороженность у врачей вызывает наличие на фоне АИТ узлоподобных образований. По нашим данным, наиболее надежными маркерами, позволяющим диагностировать РЩЖ на фоне АИТ, являются СОХ-2 и TR.F1: группы больных с РЩЖ и АИТ достоверно отличались по уровню экспрессии СОХ-2 и 77УП, а ОППР для них >10.

Обработка результатов исследования с целью нахождения логистической регрессионной модели, позволяющей определить наличие РЩЖ у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

Целью данного статистического моделирования явилось нахождение параметров уравнения регрессии, позволяющего определить наличие РЩЖ у

больных с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. В исследование входило 14 больных с диагнозом «РЩЖ» и 30 больных с ФА и КЗ, которым не был поставлен диагноз «РЩЖ» (далее диагноз «не рак»). Исследуемая зависимая бинарная переменная (Р) имеет два значения: 1 (наличие рака) или 0 (отсутствие рака).

В регрессионную модель были включены только те онкомаркеры (независимые признаки X), которые имели статистически значимую (р<0,05) корреляционную связь с зависимым признаком и имеющие уровень значимости для регрессионных коэффициентов р<0,2: р53, СОХ-2, ММР-7, ТЯР1.

В результате проведения логистического регрессионного анализа была получена следующая формула модели:

У = 15,27 - 7,47X1 + 12,26Х2 - 13,6Х3 + 2,14X4,

где Х1 - относительный уровень экспрессии р53, Х2 - относительный уровень экспрессии СОХ-2, Хз - относительный уровень экспрессии ТЯГ1, Х4 -относительный уровень экспрессии ММР-7; У= 1о§Ц (Р) = 1п (Р/(1-Р)).

Уровень значимости для модели в целом составил р=0,0000002. Для признака X, уровень значимости р=0,107, для Х2 р=0,039, для Х3 р=0,041, для Х4 р=0,17.

Расчет предсказанных значений Р производился по формуле: Р= еЛ' / 1+еу. Все наблюдения с предсказанными значениями Р<0,5 классифицировались как имеющие предсказанный диагноз «не РЩЖ», остальные, с предсказываемыми значениями Р>0,5, классифицировались как имеющие диагноз «РЩЖ». Результаты классификации больных по предсказанному диагнозу в сравнении с наблюдаемым диагнозом представлены в табл.9.

Таблица 9. Классификация наблюдений по диагнозу, предсказанному с помощью логистической регрессионной модели, в сравнении с наблюдаемым

диагнозом

Предсказанный Предсказанный Процент

диагноз диагноз правильных

«РЩЖ» «не РЩЖ» диагнозов

Действительный диагноз «РЩЖ» 12 2 84%

Действительный диагноз «не РЩЖ» 1 29 96%

Таким образом, полученная в результате логистического регрессионного анализа модель диагностики РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ, основанная на анализе онкомаркеров р53, СОХ-2, ММР-7 и ТИП, является статистически значимой и обладает высокой специфичностью (96%), чувствительностью (84%) и точностью (93%).

выводы

1. Впервые обнаружено, что в дифференцированных карциномах щитовидной железы происходит снижение экспрессии гена онкосупрессора р53 на транскрипционном уровне.

2. Впервые показано, что при раке щитовидной железы наблюдается тенденция к уменьшению уровня экспрессии гена теломер-связывающего фактора 1 (TRF\) по сравнению с другими заболеваниями этого органа.

3. Установлено, что наиболее полезными в дифференциальной диагностике рака щитовидной железы у больных неаутоиммуными заболеваниями щитовидной железы являются онкомаркеры циклооксигеназа 2 (СОХ-2), TRF1 и р53, полезными - онкобелок с-Мус и металлопротеиназа ММР-7, не имеющими диагностической значимости - транскрипционный фактор RelA и каталитическая субъединица теломеразы (hTERT).

4. Установлено, что для дифференциальной диагностики рака щитовидной железы у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы могут быть использованы онкомаркеры СОХ-2 и TRF1.

5. Показано, что высокая активность теломеразы значительно чаще обнаруживается у пациентов с раком щитовидной железы, чем у больных с фолликулярной аденомой и коллоидным зобом. У всех больных с аутоиммунным тиреоидитом выявлены высокие уровни активности теломеразы и экспрессии гена hTERT.

6. Разработана логистическая регрессионная модель диагностики рака щитовидной железы у больных неаутоиммунными заболеваниями данного органа, основанная на оценке относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRFI и ММР-1 и обладающая высокой диагностической точностью в отношении дифференцированных форм рака.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Марченко И.А., Коваленко H.A. Разработка метода выделения суммарной РНК, свободной от ДНК, из малого количества опухолевой ткани с целью изучения экспрессии каталитической субъединицы (hTERT) теломеразы // Тезисы работ участников открытого российского конкурса на лучшую работу студентов 2004 года по разделу «Медицинские науки». - М., 2005. - С.111-112.

2. Глухов А.И., Харнас С. С., Ипполитов Л.И., Зимник О.В., Жуликов Д.В., Быков И.И., Марченко И.А., Ветшев С.П. Теломераза: новые возможности в диагностике заболеваний щитовидной железы и надпочечников // Современные аспекты хирургической эндокринологии: Материалы XVI Российского симпозиума по хирургической эндокринологии, Саранск, 18-20 сентября 2007 г. - Саранск, 2007. - С.63-64.

3. Glukhov A.I., Marchenko I.A., Zimnik O.V., Gordeev S.A., Ippolitov L.I., Zhulikov D.V. Study of hTERT and c-myc expression and telomerase activity in neoplastic thyroid tissues and autoimmune thyroiditis // Cancer, cell death and differentiation:

XXIII International Academy of Tumor Marker Oncology conference, Triest, Italy, October 19-21 2007. - Triest, 2007. - P. 17.

4. Глухов А.И., Харнас C.C., Ипполитов Л.И., Жуликов Д.В., Быков И.И., Марченко И.А. Теломераза как потенциальный опухолевый маркер в дифференциальной диагностике новообразований щитовидной железы и надпочечников // Анналы хирургии. - 2007. - №6. - С.22-25.

5. Марченко И.А., Глухов А.И. Разработка молекулярно-биологических подходов и выбор критериев для дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы // Тезисы работ участников конкурса на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (медицинское и фармацевтическое образование) в рамках реализации «Программы формирования инновационного образовательного пространства Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова». - М., 2007. - С.70-71.

6. Марченко И.А., Высоцкая О.В. Исследование экспрессии генов с-тус и р53 при различных новообразованиях щитовидной железы // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием, Москва, 19-22 мая 2008 г. Приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук». -М„ 2008. - №6. - С.273-274.

7. Глухов А.И., Марченко И.А., Высоцкая О.В., Зимник О.В., Жуликов Д.В., Гордеев С.А., Апрятин С.А., Свинарева JI.B., Северин С.Е. Анализ изменений в уровнях экспрессии генов циклооксигеназы-2, р53 и с-тус и оценка их диагностической значимости при онкопатологиях щитовидной железы // Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины: Материалы 6-ой международной научно-практической конференции, Астрахань, 8-11 сентября 2008 г. Приложение к журналу «Астраханский медицинский журнал». - Астрахань, 2008. - Том 3, №3. -С.27-28.

8. Марченко И.А., Глухов А.И., Бритвин Т.А., Зимник О.В., Жуликов Д.В., Высоцкая О.В. Особенности экспрессии гена ММР-7 при новообразованиях щитовидной железы // Материалы XII Российского онкологического конгресса, Москва, 18-20 ноября 2008 г. - М., 2008 - С.171.

9. Марченко И.А., Глухов А.И., Зимник О.В., Высоцкая О.В., Жуликов Д.В., Ипполитов Л.И. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров в опухолях щитовидной железы // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2009. - №3. - С.29-32.

Марченко Ирина Анатольевна Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы

человека

Данная работа посвящена оценке значимости теломеразы и других онкомаркеров (СОХ-2, TRF1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) в дифференциальной диагностике рака и доброкачественных новообразований щитовидной железы, таких как коллоидный зоб, фолликулярная аденома и аутоиммунный тиреоидит. Установлено, что наиболее полезными в дифференциальной диагностике рака щитовидной железы у больных неаутоиммуными заболеваниями щитовидной железы являются онкомаркеры СОХ-2, TRF1 и р53, полезными -с-Мус и ММР-7, не имеющими диагностической значимости - RelA и hTERT. Показано, что для дифференциальной диагностики рака щитовидной железы у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы могут быть использованы онкомаркеры СОХ-2 и TRF1. Высокая активность теломеразы значительно чаще была обнаружена у пациентов с раком щитовидной железы, чем у больных с фолликулярной аденомой и коллоидным зобом. У всех больных с аутоиммунным тиреоидитом выявлена активность теломеразы. Разработана эффективная логистическая регрессионная модель диагностики рака щитовидной железы у больных неаутоиммунными заболеваниями щитовидной железы на основе оценки относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRF1 и ММР-7.

Marchenko Irina Anatolievna Study of diagnostic significance of telomerase and other markers of malignant transformation in human thyroid neoplasms

The current study is devoted to assessment of significance of telomerase and other transformation markers (COX-2, TRF1, MMP-7, c-Myc, p53, RelA) in the differential diagnosis of cancer and benign thyroid tumors such as colloidal goiter, follicular adenoma and autoimmune thyroiditis. We have found that more useful markers in the differential diagnosis of malignancy in patients with non-autoimmune thyroid diseases are COX-2, TRF1 and p53, less useful markers are c-Myc and MMP-7, markers RelA and hTERT have no diagnostic significance. It was shown that COX-2 and TRF1 can be used for differential diagnosis of cancer in patients with autoimmune thyroid diseases. High telomerase activity was found more frequently in patients with thyroid cancer than in patients with follicular adenoma and colloidal goiter. All patients with autoimmune thyroiditis had telomerase activity. We have developed the effective logistic regression model based on the estimation of expression levels of COX-2, p53, TRF1 and MMP-7 genes for diagnosis of thyroid cancer in patients with non-autoimmune thyroid diseases.

Заказ № 42-а/05/09 Подписано в печать 19.05.2009 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,5

^-хЧ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марченко, Ирина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теломераза.

1.1.1. Проблема концевой репликации линейных молекул ДНК.

1.1.2. Теломеры.

1.1.3. Лимит Хейфлика.

1.1.4. Теломераза.

1.1.4.1. Каталитическая субъединица теломеразы hTERT.

1.1.4.1.1. Регуляция транскрипции гена hTERT.

1.1.4.1.2. Альтернанивный сплайсинг транскрипта гена hTERT.

1.1.4.1.3. Пострансляционная модификация белка hTERT.

1.1.4.1.3.1. Фосфорилирование/дефосфорилирование белка hTERT.

1.1.4.1.3.2. Транспорт hTERT в ядро.

1.1.4.2. РНК-компонент теломеразы hTR.

1.1.4.3. Как работает теломераза.

1.1.4.4. Теломеры, теломераза и шелтериновый комплекс.

1.1.4.5. Активность теломеразы в нормальных и опухолевых клетках человека.

1.1.4.6. Иммортализация, злокачественная трансформация и теломераза.

1.1.4.6.1. Иммортализация.

1.1.4.6.2. Злокачественная трансформация.

1.1.4.7. Активность теломеразы при онкопатологиях щитовидной железы.

1.2. Онкобелок с-Мус.

1.2.1. Строение гена и белка.

1.2.2. с-Мус как транскрипционный фактор.

1.2.3. Функции с-Мус: регуляция клеточного цикла, дифференцировки и апоптоза.

1.2.4. с-Мус и теломераза.

1.2.5. с-Мус при онкопатологиях щитовидной железы.

1.3. Онкосупрессор р53.

1.3.1. Строение гена и белка.

1.3.2. Гены-мишени белка р53.

1.3.3. Нарушение функций р53 при опухолях.

1.4. Транскрипционный фактор P65/RelA.

1.4.1. Семейство транскрипционных факторов NF-kB.

1.4.2. Структура гена RelA.

1.4.3. Гены-мишени транскрипционного фактора NF-kB.

1.4.4. Активность транскрипционных факторов NF-kB при раке.

1.5. Циклооксигеназа СОХ-2.

1.6. Матрилизин (ММР-7).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Приборы и компьютерные программы.

2.1.2.1. Приборы.

2.1.2.2. Компьютерные программы.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Анализ активности теломеразы.

2.2.1.1. Получение экстрактов для анализа активности теломеразы.

2.2.1.2. Измерение концентрации белка в экстрактах

2.2.1.3. Анализ активности теломеразы методом TRAP с модификациями.

2.2.2. Анализ экспрессии генов hTERT, с-Мус, р53, СОХ-2, TRF\, p65/RelA, ММР-7 и Р-актина

2.2.2.1. Выделение РНК.

2.2.2.2. ОТ-ПЦР.

2.2.3. Статистическая обработка результатов.

2.2.4. ROC-анализ диагностической ценности онкомаркеров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР

3.2. Анализ активности теломеразы в тканевых и клеточном экстрактах от пациентов с различными онкопатологиями щитовидной железы.

3.3. Исследование экспрессии генов hTERT, с-Мус, р53, СОХ-2, TRF\, p65/RelA, ММР-1 и fi-актина в опухолях щитовидной железы.

3.4. Особенности экспрессии онкомаркеров и активность теломеразы у больных аутоиммунным тиреоидитом.

3.5. ROC-анализ диагностической ценности онкомаркеров.

3.6. Обработка результатов исследования с целью нахождения логистической регрессионной модели, позволяющей определить наличие рака щитовидной железы у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями данного органа.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека"

Актуальность проблемы.

Злокачественные опухоли щитовидной железы (ЩЖ) составляют всего 1-3% в общей структуре онкологической заболеваемости. В то же время это самая распространенная опухоль органов эндокринной системы [4]. Статистические данные свидетельствуют о значительном росте этой патологии. За последнее десятилетие количество заболевших раком ЩЖ (РЩЖ) в России увеличилось в 1,5-2 раза в зависимости от региона страны. РЩЖ встречается у людей всех возрастов, но лица трудоспособного возраста составляют большую часть (до 80%) больных [23]. Риск развития злокачественных новообразований ЩЖ, начиная с пубертатного возраста, значительно выше в женской популяции. Так, в возрасте 30-39 лет женщины заболевают в 7 раз чаще мужчин [21]. РЩЖ является причиной смерти 1% больных из общего числа ежегодно умирающих от злокачественных опухолей

Согласно большинству опубликованных работ относительное число случаев РЩЖ среди больных, оперируемых по поводу различных заболеваний ЩЖ, составляет 4,8-22%. Вместе с тем ряд сообщений, преимущественно зарубежных авторов, свидетельствует о гораздо большей распространенности РЩЖ в популяции [23].

До настоящего времени в Российской Федерации поздние стадии (III-IV) РЩЖ устанавливаются более чем у 39% вновь выявленных больных [19]. На начальных стадиях рака ошибки диагностики составляют 50-100%) [6]. Большинство случаев раннего выявления этого заболевания является гистологической находкой при плановом исследовании ткани ЩЖ, удаленной по поводу предполагавшегося доброкачественного заболевания. Основные трудности в своевременной диагностике обусловлены тем, что рак может длительное время существовать под видом или на фоне других заболеваний ЩЖ. Особенно сложной является диагностика раннего рака в связи с отсутствием патагномоничных для него симптомов, частым сочетанием с другими видами патологий ЩЖ. Так, по некоторым данным почти в 90% случаев РЩЖ на ранних стадиях развивается в виде узлового зоба [16].

На данный момент цитологический анализ с применением тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) является «золотым стандартом» в дифференциальной диагностике узловых образований ЩЖ, так как в отличие от других методов диагностики дает морфологическую характеристику узла. Чувствительность цитологического анализа с использованием ТАБ под контролем УЗИ составляет 78%, специфичность - 62%, частота неинформативных пунктатов варьирует от 0 до 32% [23]. В 15-30% случаев стандартная ТАБ не позволяет дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли, имеющие сходную цитоморфологическую картину: фолликулярную аденому (ФА) и фолликулярный рак, а также фолликулярный вариант папиллярного рака и гюртлеклеточные опухоли [35]. Так, по мнению большинства авторов, диагноз фолликулярной карциномы ЩЖ требует демонстрации инвазии капсулы и/или сосудов, то есть может быть установлен только на гистологическом уровне [1]. Таким образом, диагностика РЩЖ остается достаточно сложной и актуальной задачей, особенно в случае высокодифференцированных и ранних форм злокачественной опухоли.

К традиционно рассматриваемым молекулярным маркерам РЩЖ относятся онкогены RAS, BRAF, химерные гены RET/PTC, РАШРРАЯу и другие. В 2,6-34% случаев папиллярного рака обнаруживаются перестройки гена RET, в 29-83% случаев - мутации в гене BRAF [132]. Для фолликулярного рака характерными являются мутации в гене RAS (18-52% случаев), в то же время они обнаруживаются и при ФА практически с такой же частотой (2452%) [125]. Поскольку ни один из предложенных онкомаркеров не обладает 100%) чувствительностью и специфичностью, и ценность этих маркеров в диагностике ранних форм рака достаточно низка, в мире продолжаются исследования, направленные на выявление новых эффективных онкомаркеров РЩЖ.

Цель исследования.

Цель данной работы состояла в оценке значимости теломеразы и других онкомаркеров (СОХ-2, TRP1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) в дифференциальной диагностике рака и доброкачественных новообразований щитовидной железы, таких как коллоидный зоб, фолликулярная аденома и аутоиммунный тиреоидит.

Задачи исследования.

1) Оптимизировать условия проведения анализа экспрессии генов СОХ-2, TRF1, ММР-7, с-Мус, р53 и RelA методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР.

2) Провести полуколичественный анализ экспрессии генов потенциальных онкомаркеров (hTERT, СОХ-2, TRP1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с различными новообразованиями щитовидной железы, а именно папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.

3) Исследовать активность теломеразы с помощью модифицированного метода TRAP (telomeric repeat amplification protocol) в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.

4) Оценить значимость предложенных онкомаркеров для диагностики рака щитовидной железы с помощью ROC-анализа и выбрать онкомаркеры, имеющие наилучшую диагностическую эффективностью в отношении рака щитовидной железы.

5) Разработать логистическую регрессионную модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы с использованием наиболее значимых онкомаркеров.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов hTERT, СОХ-% TRF\, ММР-1, с-Мус, р53, RelA, а также активности теломеразы (AT) в опухолях, полученных от больных с РЩЖ, КЗ, ФА и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, что позволило получить новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе.

В работе впервые показано, что в дифференцированных карциномах ЩЖ (папиллярный и фолликулярный рак) одним из механизмов инактивации онкосупрессора р53 является подавление экспрессии гена р53 на транскрипционном уровне.

Впервые описаны различные варианты альтернативного сплайсинга пре-мРНК RelA в опухолях ЩЖ.

Практическая значимость работы.

Проведена оптимизация условий анализа экспрессии генов СОХ-2, TRF\, ММР-1, с-Мус, р53 и RelA методом ОТ-ПЦР. Оптимизированные методики апробированы на клинических образцах тканей больных с различными новообразованиями ЩЖ.

Осуществлен сравнительный анализ различных показателей, определяющих ценность предложенных онкомаркеров в дифференциальной диагностике новообразований ЩЖ: чувствительности, специфичности, точности, положительной и отрицательной прогностической ценности, отношений правдоподобия положительного и отрицательного результатов, отношение шансов диагностического теста. Установлено, что наиболее полезными для диагностики РЩЖ являются онкомаркеры СОХ-2, р53 и TRF1, менее полезными - с-Мус и ММР-7, не имеющими диагностического значения - RelA и hTERT.

Разработана логистическая регрессионная модель дифференциальной диагностики РЩЖ у больных с неаутоиммунными заболеваниями данного органа на основе оценки относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRF1 и ММР-7. Полученные данные позволяют провести дополнительные исследования на материале ТАБ на предмет создания диагностического теста с целью выявления РЩЖ на дооперационном этапе.

Высокая AT в постоперационных образцах у больных РЩЖ выявлена в среднем 2,2 раза чаще, чем у больных с ФА, и в 4 раза чаще, чем у больных с КЗ. Так как активная теломераза является маркером злокачественности в непролиферирующих нормальных тканях и в нашем исследовании AT обнаружена у 71% больных РЩЖ, после проведения дополнительных исследований анализ AT в ТАБ может быть предложен в качестве прогностического критерия развития РЩЖ у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Дифференцированные формы РЩЖ (фолликулярный и папиллярный) характеризуются снижением экспрессии генов р53, TRF1 и увеличением экспрессии генов ММР-7, СОХ-2 и с-Мус.

2. Для АИТ характерны высокие уровни AT и экспрессии гена hTERT.

3. Использование логистической регрессионной модели, основанной на оценке относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRF1 и ММР-7, позволяет с высокой точностью диагностировать рак у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. У больных с АИТ высокоспецифичными маркерами РЩЖ являются СОХ-2 и TRF1.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Марченко, Ирина Анатольевна

134 ВЫВОДЫ

2. Впервые показано, что при раке щитовидной железы наблюдается тенденция к уменьшению уровня экспрессии гена теломер-связывающего фактора 1 (TRF1) по сравнению с другими заболеваниями этого органа.

3. Установлено, что наиболее полезными в дифференциальной диагностике рака щитовидной железы у больных неаутоиммуными заболеваниями щитовидной железы являются онкомаркеры циклооксигеназа 2 (СОХ-2), TRF1 и р53, полезными — онкобелок с-Мус и металлопротеиназа ММР-7, не имеющими диагностической значимости — транскрипционный фактор RelA и каталитическая субъединица теломеразы (hTERT).

6. Разработана логистическая регрессионная модель диагностики рака щитовидной железы у больных неаутоиммунными заболеваниями данного органа, основанная на оценке относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRFX и ММР-1 и обладающая высокой диагностической точностью в отношении дифференцированных форм рака.

135

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марченко, Ирина Анатольевна, Москва

1. Аветисьян И.Л., Самолойлов А.А., Гульчий Н.В., Яровой А.О. Аспирационная биопсия щитовидной железы: клинические аспекты цитологических исследований // Украинський медичний часопис. 2002. -№3(29). - С.121-126.

2. Альтшулер М.Л., Северин С.Е., Глухов А.И. Теломераза в свете современных представлений о злокачественной трансформации клетки // Биохимия.-2003.-Т. 68, №12.-С. 1587-1596.

3. Богданов А.А. Теломеры и теломеразы // Соросовский образовательный журнал.-1998.-№12.-С. 12-18.

4. Валдина Е.А. Заболевания щитовидной железы: руководство. 3-е изд-СПб.: Питер, 2006. - 368 с.

5. Голубев А.Г. Естественная история теломер // Успехи геронтологии. — 2001.-№7.-С. 95-104.

6. Дубский С.В. Комплексная диагностика рака щитовидной железы // Сибирский онкологический журнал. — 2006. — №2(18). С.62-67.

7. Дымшиц Г.М. Проблема репликации концов линейных молекул ДНК и теломераза // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т.6, №5. - С. 8— 13.

8. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы // Биологические мембраны. 2001. - №3. - С. 249-256.

9. Зимник О.В. Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro : дис. . канд. биол. наук. М., 2000. - 111 с.

10. Иванова О.И., Соломина М.С., Логвинов С.В., Соломатина Т.В. Современные аспекты этиологии и патогенеза хронического аутоиммунного тиреоидита // Сибирский онкологический журнал. 2006. - №1(17). - С. 55-60.

11. П.Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Фундаментальная онкология: наиболее примечательные события 2004 года // Практическая онкология. — 2005. — Т.6, №5.-С. 1-4.

12. Кулаев И.А. Морфологическая характеристика злокачественной лимфомы щитовидной железы // Сибирский онкологический журнал. 2006. -№3(19).-С. 108-109.

13. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Вопросы онкологии. 2000. -Т.46, №2. — С. 121-128.

14. Меньшиков В.В. Клинический диагноз-лабораторные основы. — М.: Лабинформ, 1997. 320 с.

15. Микер А.К., Коффи Д.С. Теломераза: многообещающий маркер биологического бессмертия половых, стволовых и раковых клеток // Биохимия. 1997.-Т.62,№11.-С. 1547-1557.

16. Пачес А.И., Пропп P.M. Рак щитовидной железы. М.: Центр внедрения науки и техники, 1995. - 369 с.

17. Реброва А.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

18. Резван В.В., Бокарев И.Н. Теломераза: новые возможности дифференциальной диагностики лимфаденопатии // Российские медицинские вести. 2001. - Т. VI, №2. - С. 4-8.

19. Толпинский А.П. Рак щитовидной железы: учебное пособие. -Петрозаводск: ПетрГУ, 2000. 17 с.

20. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. М.: Медиа Сфера, 1998. - 352 с.

21. Чиссов В.И., Дарьялова С.Л. Клинические рекомендации. Онкология. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 720 с.

22. Чумаков П.М. Белок Р53 и его универсальные функции в организме // Успехи биологической химии. Т. 47. - 2007. - С. 3-52.

23. Шойхет Я.Н., Баженова Е.А., Баженов А.А. Диагностика микрокарцином щитовидной железы // Пробл. Клин. Мед. 2005. - №2. - С. 126-132.

24. Adhikary S., Eilers M. Transcriptional regulation and transformation by Мус proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 6(8). - P. 635-645.

25. Adolph K.W., Liska D.J., Bornstein P. Analysis of the promoter and transcription start sites of the human thrombospondin 2 gene (THBS2) // Gene. -1997.-Vol. 193(1).-P. 5-11.

26. Ahn M.-J., Tae K., Park Y.-S. et al. Telomerase activity in benign and malignant human thyroid nodules // Exp. Mol. Med. 1997. - Vol. 29(3). - P. 157160.

27. Ain K.B. Papillary thyroid carcinoma. Etiology, assessment, and therapy // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 1995. - Vol. 24(4). - P. 711-760.

28. Akiyama M., Hideshima Т., Hayashi T. et al. Nuclear factor-kappaB p65 mediates tumor necrosis factor alpha-induced nuclear translocation of telomerase reverse transcriptase protein // Cancer Res. 2003. - Vol. 63(1). - P. 18-21.

29. Alitalo K., Schwab M. Oncogene amplification in tumor cells // Adv. Cancer Res. 1986. - Vol. 47. - P. 235-281.

30. Asaad N.Y., Abd El-Wahed M.M., Mohammed A.G. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression in thyroid carcinoma: diagnostic and prognostic role // J. Egypt. Natl. Cane. Inst. 2006. - Vol. 18(1). - P. 8-16.

31. Balint E., Reisman D. Increased rate of transcription contributes to elevated expression of the mutant p53 gene in Burkitt's lymphoma cells // Cancer Res. 1996. -Vol. 56(7).-P. 1648-1653.

32. Barkett M., Gilmore T.D. Control of apoptosis by Rel/NF-kappaB transcription factors // Oncogene. 1999. - Vol. 18(49). - P. 6910-24.

33. Beattie T.L., Zhou W., Robinson M.O. et al. Functional multimerization of the human telomerase reverse transcriptase // Mol. Cell. Biol. 2001. — Vol. 21(18). -P. 6151-6160.

34. Beg A.A., Ruben S.M., Scheinman R.I. et al. I kappa В interacts with the nuclear localization sequences of the subunits of NF-kappa B: a mechanism for cytoplasmic retention // Genes Dev. 1992. - Vol. 6(10). - P. 1899-1913.

35. Belfiore A. The use of fine needle aspiration biopsy in thyroid disease // Thyroid Intern. 2002. - №2. - P. 1-17.

36. Bhatia K., Huppi K., Spangler G. et al. Point mutations in the c-Myc transactivation domain are common in Burkitt's lymphoma and mouse plasmacytomas //Nat. Genet. 1993. - Vol. 5(1). - P. 56-61.

37. Bienz-Tadmor В., Zakut-Houri R., Libresco S. et al. The 5' region of the p53 gene: evolutionary conservation and evidence for a negative regulatory element // EMBO J. 1985. - Vol. 4(12). - P. 3209-3213.

38. Boltze C., Schneider-Stock R., Roessner A. et al. Function of HSP90 and p23 in the telomerase complex of thyroid tumors // Pathol. Res. Pract. 2003. - Vol. 199(9).-P. 573-579.

39. Bornstein-Quevedo L., Garcia-Hernandez M.L., Camacho-Arroyo I. et al. Telomerase activity in well-differentiated papillary thyroid carcinoma correlates with advanced clinical stage of the disease // Endocr. Pathol. 2003. - Vol. 14(3). - P. 213-19.

40. Boxer L.M., Dang C.V. Translocations involving c-myc and c-myc function // Oncogene. 2001. - Vol. 20(40). - P. 5595-5610.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

42. Bryce L.A., Morrison N., Hoare S.F. et al. Mapping of the gene for the human reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5pl5.33 by fluorescence in situ hybridization // Neoplasia. 2000. - Vol. 2(3). - P. 197-201.

43. Cady B. Papillary carcinoma of the thyroid // Semin. Surg. Oncol. 1991. — Vol. 7(2).-P. 81-86.

44. Cemi С. Telomeres, telomerase, and myc. An update // Mutat. Res. 2000. -Vol. 462(1).-P. 31-47.

45. Cha C., Chen H., Westra W.H., Udelsman R. Primary thyroid lymphoma: can the diagnosis be made solely by fine-needle aspiration? // Ann. Surg. Oncol. 2002. -Vol. 9(3).-P. 298-302.

46. Chin L.3 Artandi S.E., Shen Q. et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis // Cell. 1999. - Vol. 97(4). - P. 527-538.

47. Chistiakov D.A. Immunogenetics of Hashimoto's thyroiditis // J. Autoimmune Dis. 2005. - Vol. 2(1) Электронный ресурс. - URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=555850&blobtype=pdf (дата обращения 11.12.2008).

48. Cho Mar K., Eimoto Т., Tateyama H. et al. Expression of matrix metalloproteinases in benign and malignant follicular thyroid lesions // Histopathology. 2006 - Vol. 48(3). - P. 286-294.

49. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.

50. Choy M.Y., Siu S.-S. N., Leung T. N., Lau Т. K. Human decidual production of hepatocyte-growth factor is not influenced by trophoblastic invasion in vivo // Fertility and Sterility. 2004. - Vol. 82(3). - P. 1220-1225.

51. Chuengsamarn S. Hashimoto's thyroiditis in a patient with non-Hodgkin's thyroid lymphoma of В cell type and originated from mucosa-associated lymphoid tissue (MALT): A case report // J. Med. Assoc. Thai. 2005. - Vol. 88(1). - P.73-78.

52. Cong Y.S., Wen J.P., Bacchetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter // Hum. Mol. Genet. -1999. Vol. 8(1). - P. 137-142.

53. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1 // Science. — 1994. -Vol. 265(5178).-P. 1582-1584.

54. De Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres // Genes & Dev. 2005. - Vol. 19(18). - P. 2100-2110.

55. Deichman G.J., Matveeva V.A., Kashkina L.M. et al. Cell transforming genes and tumor progression: in vivo unified secondary phenotypic cell changes // Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 75(2). - P. 277-283

56. Del Senno L., Gambari R., degli Uberti E. et al. c-myc oncogene alterations in human thyroid carcinomas // Cancer Detect. Prev. 1987. - Vol. 10(3-4). - P. 159-166.

57. Dunham M.A., Neumann A.A, Fasching C.L, Reddel R.R. Telomere maintenance by recombination in human cells // Nat. Genet. 2000. - Vol. 26(4). -P. 447-450.

58. Duss S., Andre S., Nicoulaz A.L. et al. An oestrogen-dependent model of breast cancer created by transformation of normal human mammary epithelial cells // Breast Cancer Res. 2007. - Vol. 9(3). - R38.

59. Evan G.I., Vousden K.H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer // Nature. 2001. - Vol. 411(6835). - P. 342-348.

60. Facchini L.M., Penn L.Z. The molecular role of Мус in growth and transformation: recent discoveries lead to new insights // FASEB J. 1998. - Vol. 12(9).-P. 633-651.

61. Fang J.Y., Cheng Z.H., Chen Y.X. et al. Expression of Dnmtl, demethylase, MeCP2 and methylation of tumor-related genes in human gastric cancer // World J. Gastroenterol. 2004. - Vol. 10(23). - P. 3394-3398.

62. Feng J.L., Funk W.D., Wang S.S. et al. The RNA component of human telomerase // Science. 1995. - Vol. 269(5228). - P. 1236-1241.

63. Fujimoto R., Kamata N., Taki M. et al. Gene expression of telomerase related proteins in human normal oral and ectocervical epithelial cells // Oral Oncology. -2003. Vol. 39(5). - P. 445-452.

64. Funk W.D., Рак D.T., Karas R.H. et al. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes // Mol. Cell. Biol. 1992. - Vol. 12(6).-P. 2866-2871.

65. Fusco A., Berlingieri M.T., Di Fiore P.P. One- and two-step transformations of rat thyroid epithelial cells by retroviral oncogenes // Mol. Cell. Biol. — 1987. Vol. 7(9).-P. 3365-3370.

66. Glukhov A.I., Zimnik O.V., Gordeev S.A., Severin S.E. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Vol. 248(2). - P. 368-371.

67. Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., Zakian V.A. Position effect at S. cerevisiae telomeres: reversibile repression of Pol II transcription // Cell. — 1990. -Vol. 63(4).-P. 751-762.

68. Grimm S., Baeuerle P.A. Failure of the splicing variant p65 delta of the NF-kappa В subunit p65 to transform fibroblasts // Oncogene. 1994. - Vol. 9(8). P. 2391-2398.

69. Hahn W.C., Counter C.M., Lumdberg A.S. et al. Creation of human tumor cells with defined genetic elements // Nature. 1999. - Vol. 400(6743). - P. 464468.

70. Hahn W.C., Dessain S.K., Brooks M.W. Enumeration of the simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation // Mol. Cell. Biol. -2002. Vol. 22(10). - P. 3562.

71. Hanley J.A. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve // Radiology. 1989. - Vol. 143(1). - P. 29-36.

72. Harrington L., McPhaul Т., Mar V. et al. A mammalian telomerase-associated protein // Science. 1997. - Vol. 275 (5302). - P. 973-977.

73. Haupt Y., Rowan S., Shaulian E. et al. p53 mediated apoptosis in HeLa cells: transcription dependent and independent mechanisms // Leukemia. 1997. - Vol. 11(3).-P. 337-339.

74. Hisatomi H., Ohyashiki K., Ohyashik J. H. et al. Expression profile of gamma-deletion variant of reverse transcriptase gene // Neoplasia. 2003. — Vol. 5(3).-P. 193-197.

75. Hiyama E., Gollahon L., Kataoka T. et al. Telomerase activity in human breast tumors // J. Natl. Cancer Inst. 1996. - Vol. 88(2). - P. 116-122.

76. Hiyama E., Hiyama K., Yokoyama T. et al. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes // Nat. Med. 1995. - Vol. 1(3). - P. 249-255

77. Hiyama K., Ishioka S., Shirotani Y. et al. Alterations in telomeric repeat length in lung cancer are associated with loss of heterozygosity in p53 and Rb // Oncogene. 1995. - Vol. 10(5). - P. 937-944

78. Hoang-Vu C., Boltze C., Gimm O. et al. Expression of telomerase genes in thyroid carcinoma// Int. J. Oncol. 2002. - Vol. 21(2). - P. 265-272.

79. Holm L. E., Blomgren H., Lowhagen T. Cancer risks in patients with chronic lymphocytic thiroiditis // N. Engl. J. Med. 1985. - Vol. 312 (10). - P. 601-604.

80. Horikawa I., Barrett J.C. Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms // Carcinogenesis. — 2003. Vol. 24(7). - P. 1167-1176.

81. Hull M.A., Ко S.C., Hawcroft G. Prostaglandin EP receptors: targets for treatment and prevention of colorectal cancer? // Mol Cancer Ther. 2004. - Vol. 3(8).-P. 1031-1039.

82. Ii M., Yamamoto H., Adachi Y. et al. Role of matrix metalloproteinase-7 (matrilysin) in human cancer invasion, apoptosis, growth, and angiogenesis // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2006. - Vol. 231(1). - P. 20-27.

83. Ito Y., Yoshida H., Kakudo K. et al. Inverse relationships between the expression of MMP-7 and MMP-11 and predictors of poor prognosis of papillary thyroid carcinoma // Pathology. 2006. - Vol. 38(5). - P. 421^125.

84. Kajita S., Ruebel K.H., Casey M.B. et al. Role of COX-2, thromboxane A2 synthase, and prostaglandin 12 synthase in papillary thyroid carcinoma growth // Mod. Pathol. 2005. - Vol. 18(2). - P. 221-227.

85. Kanaya Т., Kyo S., Takahura M. et al. hTERT is a critical determinant of telomerase activity in renal-cell carcinoma // Int. J. Cancer. 1998. — Vol. 78(5). - P. 539-543.

86. Kaneko Y., Shibuya M., Nakayama T. et al. Hypomethylation of c-myc and epidermal growth factor receptor genes in human hepatocellular carcinoma and fetal liver//Jpn. J. Cancer Res. 1985.-Vol. 76(12).-P. 1136-1140.

87. Kannan S., Tahara H., Yokozaki H. et al. Telomerase activity in premalignant and malignant lesions of human oral mucosa // Cancer Epidem. Biomarkers Prevent. 1997.-Vol. 6(6). - P. 413—420.

88. Karayan-Tapon L., Menet E., Guilhot J. et al. Topoisomerase II alpha and telomerase expression in papillary thyroid carcinomas // Eur. J. Surg. Oncol. — 2004. -Vol. 30(1).-P. 73-79.

89. Kato J.-Y., Matsushime H. , Hiebert S.W. et al. Direct binding of cycline D to the retinoblastoma gene product (pRb) and pRb phosphorylation by the cycline D-dependent kinase cdk4 // Genes Dev. 1993. -Vol. 7(3). - P. 331-342.

90. Kauffmann-Zeh A., Rodriguez-Viciana P., Ulrich E. et al. Suppression of c-Myc-induced apoptosis by Ras signalling through PI(3)K and PKB // Nature. 1997. -Vol. 385(6616).-P. 544-548.

91. Kern S.E., Kinzler K.W., Bruskin A. et al. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein // Science. 1991. - Vol. 252(5013). - P. 1708-1711.

92. Kilian A., Bowtell D.D., Abud H.E. et al. Isolation of a candidate human telomerase catalytic subunit gene, which reveals complex splicing patterns in different cell types // Hum. Mol. Genet. 1997. - Vol. 6(12). - P. 2011-2019.

93. Kim N.W., Piatyszec M.A., Prowse K.R. et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell lines and cancer // Science. 1994. — Vol. 266(5193).-P. 2011-2015.

94. Kinscherf R., Claus R., Wagner M. et al., Apoptosis caused by oxidized LDL is manganese superoxide dismutase and p53 dependent // FASEB J. 1998. - Vol. 12(6).-P. 461-467.

95. Kishi S., Wulf G., Nakamura M., Lu K.P. Telomeric protein Pin2/TRF1 induces mitotic entry and apoptosis in cells with short telomeres and is down-regulated in human breast tumors // Oncogene. 2001. - Vol. 20(12). - P. 14971508.

96. Kubbutat M.H., Jones S.N. and Vousden K.H. Regulation of p53 stability by Mdm2 //Nature. 1997. - Vol. 387(6630). - P. 299-303.

97. Kyo S., Kunimio K., Uchibayashi T. et al. Telomerase activity in human urothelial tumor // Am. J. Clin. Pathol. 1997. - Vol. 107(5). - P. 555-560.

98. Lacy J., Summers W.P., Summers W.C. Post-transcriptional mechanisms of deregulation of MYC following conversion of a human В cell line by Epstein-Barr virus//EMBO J.-1989.-Vol. 8(7).-P. 1973-1980.

99. Lang W., Borrusch H., Bauer L. Occult carcinomas of the thyroid. Evaluation of 1,020 sequential autopsies // Am. J. Clin. Pathol. 1988. - Vol. 90(1). - P. 72-76.

100. Lei M., Zaug A.J., Podell E.R., Cech T.R. Switching Human Telomerase On and Off with hPOTl Protein in Vitro // Biol. Chem. 2005. - Vol. 280(21). - P. 20449-20456.

101. Levy M.Z., Allsopp R.C., Futcher A.B. et al. Telomere end-replication problem and cell aging // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 225(4). - P. 951-960.

102. Liao D.J., Dickson R.B. c-Myc in breast cancer // Endocrine-Related Cancer. -2000.-Vol. 7(3).-P. 143-164.

103. Lin A.W., Barradas M., Stone J.C. et al. Premature senescence involving p53 and pi6 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling // Genes Dev. 1998. - Vol. 12(19). - P. 3008-3019.

104. Lo C.-Y., Lam K.Y., Leung P.P., Luk J.M. High prevalence of cyclooxygenase 2 expression in papillary thyroid carcinoma // European Journal of Endocrinology. 2005. - Vol. 152(4). - P. 545-550.

105. Lowe S.W., Bodis S., McClatchey A. et al. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo // Science. 1994. - Vol. 266(5186). P. 807-810.

106. Lundblad V., Blackburn E.H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est 1-senescence // Cell. 1993. - Vol. 73(2). - P. 347-360.

107. Lyle R., Valleley E.M., Sharpe P.T., Hewitt J.E. An alternatively spliced transcript, p65 delta 2, of the gene encoding the p65 subunit of the transcription factor NF-kappa В // Gene. 1994. - Vol. 138(1-2). - P. 265-266.

108. Malaguarnera R., Vella V., Vigneri R., Frasca F. p53 family proteins in thyroid cancer // Endocr. Relat. Cancer. 2007. - Vol. 14(1). - P. 43-60.

109. Matthews P., Jones C.J. Clinical implications of telomerase detection // Histopathology. 2001. - Vol. 38(6). - P. 485-498.

110. Maxwell S.A., Mukhopadhyay T. A novel NF-kappa В p65 spliced transcript lacking exons 6 and 7 in a non-small cell lung carcinoma cell line // Gene. 1995. -Vol. 166(2).-P. 339-340.

111. Mergny J.-L., Riou J.-F., Mailliet P. et al. Natural and pharmacological regulation of telomerase // Nucleic Acids Res. 2002. -Vol. 30(4). - P. 839-865.

112. Meyerson M., Counter C.M., Eaton E.N. et al. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization // Cell. -1997. Vol. 90(4). - P. 785-795.

113. Minamino Т., Kourembanas S. Mechanisms of telomerase induction during vascular smooth muscle cell proliferation // Circ. Res. 2001. - Vol. 89(3). - P. 237243.

114. Mitchell J.R., Wood E., Collin K. A telomerase component defective in the human disease dyskeratosis congenita // Nature. 1999. - Vol. 402 (6761). - P. 551— 555.

115. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is ribonucleoprotein that synthesize TTAGGG repeats // Cell. 1989. - Vol. 59(3). - P. 521-529.

116. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B. et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human // Science. 1997. - Vol. 277(5328). - P. 955-959.

117. Namba H., Saenko V., Yamashita S. Nuclear factor-kB in thyroid carcinogenesis and progression: a novel therapeutic target for advanced thyroid cancer // Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. 2007. - Vol. 51(5). - P. 843-851.

118. Narayanan R., Klement J.F., Ruben S.M. et al. Identification of a naturally occurring transforming variant of the p65 subunit of NF-kappa В // Science. 1992. -Vol. 256(5055). P. 367-370.

119. Neumann A.A., Reddel R.R. Telomere maintenance and cancer — look, no telomerase // Nat. Rev. Cancer. 2002. -Vol. 2(11). - P. 879-884.

120. Oh S., Song Y.-H., Yim J., Kim Т. K. Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT) gene // Oncogene. 2000. - Vol. 19(11). - P. 14851490.

121. Onel K., Cordon-Cardo C. MDM2 and prognosis // Mol. Cancer Res. 2004. -Vol. 2(1).-P. 1-8.

122. Orlando C., Gelmini S. Telomerase in endocrine and endocrine-dependent tumors // J. Steroid Biochem Mol Biol. 2001. - Vol. 78(3). - P. 201-214.

123. Pacifico F., Mauro C., Barone C. et al. Oncogenic and Anti-apoptotic Activity of NF-кВ in Human Thyroid Carcinomas // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279(52). -P. 54610-54619.

124. Patel K.N., Singh B. Genetic considerations in thyroid cancer // Cancer Control. 2006. - Vol. 13(2). - P. 111-118.

125. Pelengaris S., Khan M., Evan G. c-MYC: more than just a matter of life and death // Nat. Rev. Cancer. 2002. - Vol. 2(10). - P. 764-776.

126. Perkins N.D., Gilmore T.D. Good cop, bad cop: the different faces of NF-kappaB // Cell Death Differ. 2006. - Vol. 13(5). - P. 759-772

127. Pomerantz J., Schreiber-Agus N., Liegeois NJ. et al. The Ink4a tumor suppressor gene product, pl9Arf, interacts with MDM2 and neutralizes MDM2's inhibition of p53 // Cell. 1998. - Vol. 92(6). - P. 713-723.

128. Prendergast G.C. Mechanisms of apoptosis by c-Myc // Oncogene. 1999. — Vol. 18(19). - P. 2967-8297.

129. Prescott J., Blackburn E. H. Functionally interacting telomerase RNAs in the yeast telomerase complex // Genes Dev. 1997. - №11. - P. 2790-2800.

130. Raman V., Martensen S.A., Reisman D. et al. Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours // Nature. 2000. - Vol. 405(6789). - P. 974-978.

131. Resnitzky D., Reed S.I. Different roles for cyclins D1 and E in regulation of the Gl-to-S transition//Mol. Cell. Biol. 1995.-Vol. 15(8).-P. 3463-3469.

132. Romano M., Claria J. Cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase converging functions on cell proliferation and tumor angiogenesis: implications for cancer therapy // The FASEB Journal. 2003. - Vol. 17(14). - P. 1986-1995.

133. Saji M., Xydas S., Westra W.H. et al. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression in thyroid neoplasms // Clin. Cancer Res. 1999. - Vol. 5(6).-P. 1483-1489.

134. Salghetti S.E., Kim S.Y., Tansey W.P. Destruction of Мус by ubiquitin-mediated proteolysis: cancer-associated and transforming mutations stabilize Мус // EMBO J. 1999. - Vol. 18(3).-P. 717-726.

135. Santana V., Rose N.R. Neoplastic lymphoproliferation in autoimmune disease: an updated review // Clin. Immunol. Immunopathol. 1992. - Vol. 63(3). -P. 205-213.

136. Sears R., Leone G., DeGregori J., Nevins J.R. Ras enhances Мус protein stability // Mol. Cell. 1999. - Vol. 3(2). - P. 169-179.

137. Seimiya H., Sawada H., Muramatsu Y. et al. Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase // EMBO J. 2000. - Vol. 19(11). - P. 26522661.

138. Sen R., Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein Nf-kappa В by a posttranslational mechanism // Cell. 1986. - Vol. 47(6). -P. 921-928.

139. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E. et al. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a // Cell. 1997. - Vol. 88(5). - P. 593-602.

140. Shay J.W., Wright W.E. Implications of mapping the human telomerase gene (hTERT) as the most distal gene on chromosome 5p // Neoplasia. — 2000. Vol. 2(3). -P. 195-196.

141. Sherr C.J. Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway // Genes Dev. -1998.-Vol. 12(19).-P. 298Ф-2991.

142. Shih M.L., Lee J.A., Hsieh C.B. et al. Thyroidectomy for Hashimoto's thyroiditis: complications and associated cancers // Thyroid. 2008. - Vol. 18(7). -P. 729-734.

143. Siddiqui M.T., Greene K.L., Clark D.P. et al. Human telomerase reverse transcriptase expression in Diff-Quik-stained FNA samples from thyroid nodules // Diagn. Mol. Pathol. -2001. Vol. 10(2). - P. 123-129.

144. Sidransky D., Hollstein M. Clinical implications of the p53 gene // Annu. Rev. Med. 1996. - Vol. 47. - P. 285-301.

145. Smogorzewska A., van Steensel В., Bianchi A. et al. Control of human telomere length by TRF1 and TRF2 // Mol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 20(5). - P. 1659-1668.

146. Soder A.I., Hoare S.F., Muir S. et al. Amplification, increased dosage and in situ expression of the telomerase RNA gene in human cancer // Oncogene. 1997. — Vol. 14(9).-P. 1013-1021.

147. Sommerfield H.-J., Meeker A. K., Piatyszek M. A. et al. Telomerase activity: a prevalent marker of malignant human prostate tissue // Cancer Res. — 1996. — Vol. 56(1).-P. 218-222.

148. Specht M.C., Tucker O.N., Hocever M. et al. Cyclooxygenase-2 expression in thyroid nodules // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - Vol. 87(1). - P. 358-363.

149. Sun X., Shimizu H., Yamamoto K. Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression // Mol. Cell. Biol. 1995.-Vol. 15(8).-P. 4489—4496.

150. Suzuki S., Fukushima Т., Ami H. et al. New attempt of preoperative differential diagnosis of thyroid neoplasms by telomerase activity measurement // Oncol. Rep. 2002. - Vol. 9(3). - P. 539-544.

151. Tahara H., Kumiyasu, H., Yokozaki H. et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions // Clin. Cancer Res. -1995. Vol. 1(11).-P. 1245-1251.

152. Tahara H., Nakanishi Т., Kitamoto M. et al. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas // Cancer Res. 1995. -Vol. 55(13). - P. 2734-2736.

153. Terrier P., Sheng Z.M., Schlumberger M. et al. Structure and expression of c-myc and c-fos proto-oncogenes in thyroid carcinomas // Br. J. Cancer. — 1988. Vol. 57(1).-P. 43-47.

154. Tessner T.G., Muhale F., Riehl Т.Е. et al. Prostaglandin E2 reduces radiation-induced epithelial apoptosis through a mechanism involving АКТ activation and bax translocation // J. Clin. Invest. 2004. - Vol. 114(11). - P. 1676-1685.

155. T6tterman Т.Н., Maenpaa J., Gordin A. et al. Blood and thyroid-infiltrating lymphocyte subclasses in juvenile autoimmune thyroiditis // Clin. Exp. Immunol. -1977.-Vol. 30(2).-P. 193-199.

156. Trifan O.C., Hla T. Cyclooxygenase-2 modulates cellular growth and promotes tumorigenesis // J. Cell. Mol. Med. 2003. - Vol. 7(3). - P. 207-222.

157. Trulsson L.M., Velin A.K., Herder A. et al. Telomerase activity in surgical specimens and fine-needle aspiration biopsies from hyperplastic and neoplastic human thyroid tissues // Am. J. Surg. 2003. - Vol. 186(1). - P. 83-88.

158. Tuck S.P., Crawford L. Characterization of the human p53 gene promoter // Mol. Cell. Biol. 1989. - Vol. 9(5). - P. 2163-2172.

159. Ueberla K., Lu Y., Chung E., Haseltine W.A. The NF-kappa В p65 promoter // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 1993. - Vol. 6(3). - P. 227-230.

160. Ulaner G.A., Giudice L.C. Developmental regulation of telomerase activity in human fetal tissues during gestation // Molecular Human Reproduction. 1997. -Vol. 3(9).-P. 769-773.

161. Ulaner G.A., Hu J.F., Vu Т.Н. et al. Regulation of telomerase by alternate splicing of human telomerase reverse transcriptase (HTERT) in normal andneoplastic ovary, endometrium and myometrium // Int. J. Cancer. 2000. - Vol. 85(3).-P. 330-335.

162. Ulaner G.A., Hu J.F., Vu Т.Н. et al. Telomerase activity in human development is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts // Cancer Res. 1998. -Vol. 58(18).-P. 4168-4172.

163. Umbricht C.B., Conrad G.T., Clark D.P. et al. Human telomerase reverse transcriptase gene expression and the surgical management of suspicious thyroid tumors // Clin. Cancer Res. -2004. Vol. 10(17). - P. 5762-5768.

164. Van Waes C. Nuclear factor-kappaB in development, prevention, and therapy of cancer // Clin. Cancer Res. 2007. - Vol. 13(4). - P. 1076-1082.

165. Vande Woude G.F., Klein G. Advances in cancer research. New York: Academic Press, 2007 - Vol.97.- 346 p.

166. Vande Woude G.F., Klein G. Advances in Cancer Research. New York: Academic Press, 2008. - Vol.99. - 426 p.

167. Varkondi E., Gyori F., Nagy A. et al. Investigation of oncogene amplification or deletion, and oncoprotein expression in papillary thyroid cancer // Magy. Onkol. — 2001. Vol. 45(5). - P. 424-429.

168. Vennstrom В., Sheiness D., Zabielski J., Bishop J.M. Isolation and characterization of c-myc, a cellular homolog of the oncogene (v-myc) of avian myelocytomatosis vims strain 29 // J. Virol. 1982. - Vol. 42(3). - P. 773-779.

169. Visconti R., Cerutti J., Battista S. et al. Expression of the neoplastic phenotype by human thyroid carcinoma cell lines requires NFkappaB p65 protein expression // Oncogene. 1997. - Vol. 15(16). - P. 1987-1994.

170. Vita M., Henriksson M. The Мус oncoprotein as a therapeutic target for human cancer// Semin. Cancer Biol. -2006. Vol. 16(4). - P. 318-330.

171. Voutsadakis I.A. Pathogenesis of colorectal carcinoma and therapeutic implications:the roles of the ubiquitin-proteasome system and Cox // J. Cell. Mol. Med. Vol. 11(2). - 2007. - P. 252-285.

172. Wang C.Y., Guttridge D.C., Mayo M.W., Baldwin A.S. Jr. NF-kappaB induces expression of the Bcl-2 homologue Al/Bfl-1 to preferentially suppress chemotherapy-induced apoptosis // Mol. Cell. Biol. 1999. - Vol. 19(9). - P. 59235929.

173. Weng N.P., Palmer L.D., Levine B.L. et al. Tales of tails: regulation of telomere length and telomerase activity during lymphocyte development, differentiation, activation, and aging // Immunol. Rev. 1997. — Vol. 160. - P. 4354.

174. Westermarck J., Kahari V.M. Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor invasion // FASEB J. 1999. - Vol. 13(8). - P. 781-792.

175. Wick M., Zubov D., Hagen G. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT)//Gene.-1999.-Vol. 232(1).-P. 97-106.

176. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E. et al. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells // Dev. Genet. 1996. — Vol. 18(2). -P. 173-179.

177. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence // Trends Genet. 1992. - Vol. 8(6). - P. 193-197.

178. Wu К. K. Transcription-based COX-2 inhibition: A therapeutic strategy // Thromb, Haemost. 2006. - Vol. 96(4). - P. 417-422.

179. Wyllie F.S, Lemoine N.R., Williams E.D., Wynford-Thomas D. Structure and expression of nuclear oncogenes in multi-stage thyroid tumorigenesis // Br. J. Cancer. 1989.-Vol. 60(4).-P.561-565.

180. Yamamoto H., Horiuchi S., Adachi Y. et al. Expression of ets-related transcriptional factor El AF is associated with tumor progression and over-expression of matrilysin in human gastric cancer // Carcinogenesis. 2004. - Vol. 25(3). - P. 325-332.

181. Yamamoto Y., Maeda Т., Izumi K., Otsuka H. Occult papillary carcinoma of the thyroid. A study of 408 autopsy cases // Cancer. 1990. - Vol. 65(5). - P. 11731179.л

182. Yashima К., Vuitch F., Gazdar A.F., Fahey T.J. Telomerase activity in benign and malignant thyroid diseases. // Surgery. 1997. - Vol. 122(6). - P. 1141-1146.

183. Yates L.L., Gorecki D.C. The nuclear factor-kappaB (NF-kappaB): from a versatile transcription factor to a ubiquitous therapeutic target // Acta Biochim. Pol. 2006. Vol. 53(4). - P. 651-662.

184. Yeh E., Cunningham M., Arnold H. et al. A signalling pathway controlling c-Myc degradation that impacts oncogenic transformation of human cells // Nat. Cell Biol. 2004. - Vol. 6(4).-P. 308-318.

185. Yi X., Shay J.W., Wright W.E. Quantitation of telomerase components and hTERT mRNA splicing patterns in immortal human cells // Nucleic Acids Res. -2001,- Vol. 29(23). P. 4818-4825.

186. Yi X., Wight D.M., Aisner D.L. et al. An alternate splicing variant of the human telomerase catalytic subunit inhibits telomerase activity // Neoplasia. — 2000. -Vol. 2(5).-P. 433-440.

187. Zajac-Kaye M. Мус oncogene: a key component in cell cycle regulation and its implication for lung cancer // Lung Cancer. 2001. - Vol. 34(2). - S.43-46.

188. Zeiger M.A., Smallridge R.C., Clark D.P. et al. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression in FNA samples from thyroid neoplasms // Surgery. 1999. -Vol. 126(6).-P. 1195-1199.

189. Zweig M.H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine // Clin. Chem. 1993. - Vol. 39(4). - P. 561577.

Информация о работе

Марченко, Ирина Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование диагностической значимости теломеразы и других маркеров злокачественной трансформации при новообразованиях щитовидной железы человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы