Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток

Свинарева, Людмила Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток"

На правах рукописи

Свинарева Людмила Владимировна

Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степепи кандидата химических наук

Москва 2010

-2 ДЕК 2010

004614544

Работа выполнена в ГУЗ Московском НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Глухов Александр Иванович

академик РАМН Швед Виталий Иванович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Серебренникова Галина Андреевна

кандидат химических наук Посыпанова Галина Ароновна

Ведущая организация: НИИ экспериментальной диагностики

и терапии опухолей РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Защита состоится «

заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, ауд. М-И 9.

Ваши отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат представлен на сайте www.mitht.ru.

Автореферат диссертации разослан «

» ноября 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01 If И Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из важных задач современной онкологии и фармакологии является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм.

Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности (неограниченного репликативного потенциала). Приобретение иммортальности клетками опухолей напрямую связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее в процессе каждого деления клетки. Теломеразная активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека, в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Особую группу соединений, исследуемых в настоящее время в качестве потенциальных ингибиторов теломеразы, представляют антисмысловые олигонуклеотиды. В отличие от обычной стратегии, где антисмысловые олигонуклеотиды подавляют экспрессию определенного гена, ингибирование теломеразы основано на непосредственном блокировании функции фермента олигонуклеотидами, комплементарными его РНК-компоненту (ЬП1). Дня защиты антисмысловых олигонуклеотидов от деградации, вызываемой действием нуклеаз, при введении в организм применяют методы их химической модификации. На протяжении последних десяти лет активно изучаются механизмы действия и степень влияния на теломеразу модифицированных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, в число которых входят фосфоротиоатные (РБ), фосфорамидатные

олигонуклеотиды (NP), пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA), а также 2'-0-алкилированные РНК-олигонуклеотиды. Цель работы

Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричному участку РНК-компонента теломеразы, а также олигонуклеотидов, состоящих из теломерных повторов, на теломеразную активность in vitro и оценке их возможного использования в качестве эффективных ингибиторов роста опухолевых клеток. Задачи исследования:

1. Изучить эффективность ингибирования теломеразной активности модифицированными ДНК- и РНК-олигонуклеотидами в экстрактах, полученных из клеток опухолевых линий, а также из клинического материала от пациентов с различными онкопатологиями.

2. Проанализировать влияние исследуемых ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на рост и выживаемость опухолевых клеток in vitro.

3. Определить характер действия рассматриваемых олигонуклеотидов на стадии клеточного цикла и апоптоз.

4. Исследовать динамику накопления и локализацию модифицированных олигонуклеотидов внутри опухолевых клеток методом конфокальной микроскопии.

Научная новизна работы:

1. Впервые показана возможность применения фосфоротиоатных олигонуклеотидов для ингибирования теломеразной активности в лизатах клеток трех типов онкопатологий (рак желудка, рак простаты, рак щитовидной железы).

2. В результате проведенного исследования выявлены два соединения, способные подавлять рост опухолевых клеток с достаточно высокой эффективностью.

3. Методом конфокальной микроскопии впервые обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды, ингибирующие теломеразную активность, характеризуются различной компартментализацией внутри опухолевых клеток в зависимости от их нуклеотидного состава. Практическая значимость исследования

Результаты работы совместно с литературными данными позволяют дополнить представления о важной роли теломеразы в

онкогенезе таких новообразований как рак желудка, рак предстательной и щитовидной желез.

Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, способные подавлять ТА и рост опухолевых клеток, могут использоваться в дальнейших исследованиях с целью создания противоопухолевых препаратов нового поколения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Теломераза играет ключевую роль в процессе онкогенеза злокачественных новообразований желудка, предстательной и щитовидной желез.

2. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 (комплементарный матричному участку ЬТЯ) и Р8-ТМ024С (имитирующий в-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии МСР-7 и характеризуются 1С5о, равными 10 нМ, в то время как 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (Те1Р5-Я) с последовательностью, комплементарной матричному участку ЬТЯ, не оказывает влияния на ТА.

3. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 и Р5-ТМ024в снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в 8-фазе клеточного цикла, стимулируют апоптоз, а также характеризуются различной локализацией после трансфекции в опухолевые клетки.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на Российских и Международных конференциях: V Московский Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2009), III Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины" (Ростов-на-Дону, Россия, 2009), III Научно-практическая конференция "Перспективы развития инноваций в биологии" (Москва, Россия, 2009), Московская международная научно-практическая конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, Россия, 2010), VII Конференция с международным участием "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, Россия, 2010). Публикации

По результатам диссертационной работы опубликовано 2 оригинальные статьи в журналах, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК, а также 6 тезисов докладов на Российских и Международных конференциях.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 165 источников. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 8 таблицами.

Работа выполнялась при поддержке программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).

Содержание работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы фосфоротиоатные (PS) ДНК-олигонуклеотиды, 2'-оксиметилированнные РНК-олигонуклеотиды (2'-0-Ме-РНК), а также меченные FAM (карбоксифлуоресцеином) PS-ДНК-олигонуклеотиды, синтезированные фирмами "Syntol" и "ДНК-синтез" (Россия). Изучались олигонуклеотиды 4 типов: 1) Те1Р5, полностью комплементарные матричному участку hTR; 2) ТМО (telomere mimic oligonucleotides), имитирующие фрагмент G-богатой цепи теломерной ДНК; 3) ТМО, имитирующие фрагмент С-богатой цепи теломерной ДНК; 4) контрольные олигонуклеотиды SSG со случайной последовательностью (табл. 1).

Таблица 1. Последовательности исследуемых олигонуклеотидов.

Модификация Олиго-нуклеотид 5' -3'последовательность Тип

Го.?3" yj Фосфоро-о тиоатная 9 PS-TelP5 cccttctcagttagggttag 1

PS-TM024G (ttaggg)4 2

PS-TM024C (aatccc)4 3

PS-SSG agctctgccacgccttcg 4

?R Q Base УJ 2'-0-Ме-РНК 0=j>-cr О TelP5-R cccuucucaguuaggguuag 1

TM018G-R (uuaggg)3 2

TM018C-R (aatccc)3 3

SSG-R agctctgccacgccttcg 4

5 '-ttaggg-З' - теломерный повтор

Исследования проводились на клеточных линиях НеЬа (карцинома шейки матки человека), МСР-7 (карцинома молочной железы человека) и Ме1-10 (меланома человека), а также на образцах биопсий и операционном материале тканей желудка, предстательной и щитовидной желез от пациентов, проходивших обследование и

лечение в Факультетской хирургической клинике им. Н.Н. Бурденко ММА им. И.М. Сеченова (табл. 2).

Таблица 2. Харакгеристика образцов, вошедших в исследование._

Онкодатология Диагноз по результатам гистологического анализа Число пациентов в группе, п

Рак желудка (РЖ) Умереннодифференцированная аденокарцинома желудка 20

Рак предстательной железы (РПЖ) Умереннодифференцированный рак предстательной железы 17

Рак щитовидной железы (РЩЖ) Фолликулярный рак щитовидной железы 14

При получении экстрактов из клеток тканей пациентов замороженные образцы тканей массой 20-50 мг помещали в стеклянные гомогенизаторы и гомогенизировали в холодном лизирующем буфере CHAPS, который добавляли из расчета 8 мкл на 1 мг ткани. Гомогенизирование проводили на льду в течение 30 мин. При получении экстрактов из опухолевой линии MCF-7 лизирующий буфер брали из расчета 1 мкл на 10000 клеток, гомогенизацию при этом не проводили. Полученные экстракты центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин при +4°С, после чего супернатант переносили в чистые пробирки и быстро замораживали в жидком азоте. Готовые экстракты хранили при -70°С.

Определение ТА в экстрактах из клеток проводили с помощью модифицированного метода TRAP [Glukhov A.I. et. al., 1998], который основан на ПЦР-амплификации продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера. Метод состоит из двух этапов: сначала к лизату клеток добавляется олигонуклеотидный субстрат (TS-праймер), который при наличии в лизате активной теломеразы удлиняется за счет присоединения ферментом теломерных последовательностей к 3'-концу субстрата, затем удлиненный олигонуклеотид амплифицируется методом ПЦР. TRAP-анализ проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% Tween-20, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 50 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP), 0,1 мкг TS-праймера (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'), а также различные объемы клеточных экстрактов, эквивалентные 0,7, 2, 4, и 8 мкг белка. Опосредованное теломеразой удлинение TS-праймера проходило при инкубации реакционной смеси при 37°С в течение 25 мин. По окончании

инкубации смесь выдерживали 10 мин при 96°С для инактивации теломеразы, а затем добавляли 0,1 мкг СХ-праймера (5'-СССТТАСССТТАСССТТАСССТАА-3') и 2,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь подвергали 34 циклам ПЦР в следующем режиме: 94°С - 60 с, 50°С - 60 с, 72°С - 90 с. Разделение амплификационных продуктов (TRAP-продукты) осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем ПААГ, используя lxTris-6opaTHbiii-EDTA (TBE) буфер. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе (А,=300 нм). Цифровые фотографии гелей оценивали с помощью программы для анализа изображений Image J 1.351 ("National Institute of Health", США).

Определение цитотоксической активности исследуемых олигонуклеотидов проводили с помощью МТТ-теста [Mosmann Т., 1983].

Исследование апоптоза и распределения клеток по фазам клеточного цикла осуществляли на проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток ("EPICS", США) при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны эмиссии 680 нм.

Изучение локализации FAM-меченых олигонуклеотидов проводили на на конфокальном лазерном микроскопе LSM 510 МЕТА ("Carl Zeiss", Германия) в диапазоне 5-10 мкм.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ активности теломеразы в экстрактах тканей пациентов с различными онкопатологиями. Наличие ТА является специфической особенностью раковых клеток большинства типов опухолей. Этот факт вызывает необходимость более детального исследования роли теломеразы в процессе злокачественной трансформации при различных типах онкопатологий. Информация об уровне ТА имеет большое значение для постановки диагноза, а также играет важную роль в понимании механизмов развития раковых заболеваний на молекулярном уровне, что, в свою очередь, необходимо для последующего создания новых противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразу.

Для того чтобы определить, насколько активность теломеразы характерна для некоторых злокачественных патологий, нами был проведен TRAP-анализ экстрактов, полученных из тканей пациентов с аденокарциномой желудка (РЖ) и простаты (РПЖ), а также фолликулярной карциномой щитовидной железы (РЩЖ).

В проведенном исследовании ТА была обнаружена у 18 из 20 пациентов с РЖ (90%). Полученные данные согласуются с

результатами, опубликованными другими авторами, которые также детектировали ТА у 88% больных с аденокарциномой желудка [Zhan W. et. al., 1999]. При TRAP-анализе образцов от пациентов с РПЖ активная теломераза детектировалась в 100% случаев. При обработке экстрактов, полученных из клинического материала от пациентов с РЩЖ, ТА была выявлена у 71% пациентов с данным диагнозом.

В большинстве анализируемых экстрактов наблюдалась характерная специфическая "лестница" TRAP-продуктов, причем интенсивность свечения этих полос значительно варьировала среди образцов от пациентов с онкозаболеваниями (рис. 1). В связи с этим, для более качественной характеристики полученных результатов, с помощью программы Image J 1.351 для каждого из исследуемых образцов была определена интенсивность свечения TRAP-продуктов и рассчитан относительный уровень ТА.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 1. Результаты анализа ТА в образцах со "средним" и "высоким" относительным уровнем ТА, а также с отсутствием ТА. Дорожки 1-4 -отсутствие ТА в образце от пациента с РЩЖ; дорожки 5-8 - "средний" уровень ТА в образце от пациента с РПЖ (объемы экстракта в реакции эквивалентны 8, 4, 2 и 0,7 мкг белка соответственно); дорожки 9-12 -"высокий" уровень ТА в образце от пациента с РЖ (объемы экстракта в реакции эквивалентны 8, 4, 2 и 0,7 мкг белка соответственно); дорожка 13 -положительный контрольный образец; дорожка 14 - отрицательный контрольный образец. Фотографии TRAP-продуктов в 10% ПААГ, окрашенном SYBR Gold.

На основании показателей относительного уровня ТА пациенты были разделены на группы с "низким", "средним" и "высоким" уровнем ТА. На рис. 2 показано распределение больных с исследуемыми онкопатологиями по уровню ТА при использовании в TRAP-анализе реакционной смеси, содержащей 0,7 мкг белка лизата клинического материала. Как видно из рис. 2, образцы во всех выборках характеризовались "высоким" и "средним" уровнями ТА, а

также отсутствием ТА. Пациентов с "низким" уровнем ТА в трех исследуемых выборках обнаружено не было.

□ РЖ (п=20) ■ РПЖ (п=17) □ РЩЖ (п=14)

100

X X

л Ц

о ю

Сред няя ТА

Рис. 2. Распределение больных по уровню ТА (полуколичественное исследование). Реакционная смесь при ТИАР-анализе содержала 0,7 мкг белка лизата клинического материала.

В проведенном исследовании не удалось выявить ТА у четырех пациентов (29%) с РЩЖ и у двух пациентов с РЖ (10%). Отсутствие ТА могло быть связано с наличием в экстрактах ингибиторов теломеразы или Taq-пoлимepaзы. Для проверки данного предположения смешивали контрольный экстракт, содержащий активную теломеразу (0,7 мкг белка), и различные объемы экстрактов, предположительно содержащих ингибиторы (0,7, 2, и 4 мкг белка). Далее вносили эти образцы в реакционную смесь для проведения ТБ1АР-анализа. Данный эксперимент не подтвердил присутствия ингибиторов ТИАР-реакции в исследуемых теломеразонегативных лизатах. Как видно из рис. 3, ТА не только не уменьшалась, но и незначительно увеличивалась (рис. 3, дорожки 3-8) по сравнению с контрольными образцами (рис. 3, дорожки 1, 2), что, по-видимому, связано с неспецифическим стабилизирующим влиянием белков, присутствующих в лизатах, на Тац -полимеразу.

В случае РЖ полученные результаты (наличие теломеразонегативных образцов) могут быть связаны с инактивацией теломеразы в процессе проведения хирургической операции и забора образца после нее. Например, во время операции при перевязке сосудов на длительное время могло наступить состояние гипоксии и, как следствие, развитие некроза в тканях, в частности, приводящее к снижению ТА. С другой стороны, не исключена возможность наличия

очагов фиброза в опухоли, что приводит к уменьшению количества живых клеток и снижению ТА. В пользу наших предположений говорит и тот факт, что только в этих двух теломеразонегативных образцах был существенно снижен уровень экспрессии мРНК конститутивного гена Р-актина (данные не приведены).

1 23 456789

Рис. 3. Анализ теломеразонегативных экстрактов на наличие ингибиторов TRAP. Дорожки 1,2- положительные контрольные образцы без добавления теломеразонегативных экстрактов (0,7 мкг белка). Дорожки 3, 4, 5 — синтез TRAP-продуктов в присутствии теломеразонегативного экстракта, полученного из клеток пациента с РЩЖ, количество вносимого теломеразонегативного экстракта эквивалентно 0,7, 2 и 4 мкг белка, соответственно; дорожки 6, 7, 8 - синтез TRAP-продуктов в присутствии теломеразонегативного экстракта, полученного из клеток пациента с РЖ. Количество вносимого теломеразонегативного экстракта эквивалентно 0,7, 2 и 4 мкг белка, соответственно. Дорожка 9 - отрицательный контроль.

2. Изучение влияния модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на теломеразную активность in vitro. На начальном этапе исследования нами был проведен сравнительный анализ ингибирования ТА олигонуклеотидами в бесклеточной системе in vitro. Результаты экспериментов, проведенных на клеточной линии MCF-7, показали, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды практически не ингибировали Taq-полимеразу и, следовательно, не оказывали влияния на стадию амплификации, за исключением PS-TM024G, внесенного в реакцию в концентрации 60 нМ (рис, 4 Б, линия 8). PS-TM024G содержит G-богатые участки, что позволяет ему образовывать квадруплексы и через них взаимодействовать с различными белковыми последовательностями. Известно, что подобные структуры обладают аптамерными свойствами и могут взаимодействовать с белками. В остальных случаях ингибирующий эффект был обусловлен воздействием на теломеразу. Значения 1С50 для PS-TelP5 и PS-TM024G составили 10 нМ (рис. 4 А и 4 Б, линии 1), а

при концентрациях 40 и 60 нМ наблюдалось практически полное подавление ТА (рис. 4 А и 4 Б, линии 5, 7),

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ни шва а ,- j. ■ ■ j s 1i§i Р|Ц Шуя f 1 И! 1 "л щ % \

«IS ы 1 » ~ д *-«■ А ** GSl

1 234 56789 10 1 2 34 5678 9 10

Рис. 4. Иншбирующий эффект олигонуклеотидов PS-TelP5 (A), PS-TM024G (Б), PS-SSG (В) и PS-TM024C (Г) на ТА в лизатах опухолевых клеток MCF-7. Линии 1,3,5,7- добавление олигонуклеотида перед теломеразной реакцией. Линии 2, 4, 6, 8 - добавление олигонуклеотида перед стадией ПЦР-амплификации. Концентрации олигонуклеотида в реакционной смеси - 10 нМ (линии 1, 2), 20 нМ (линии 3, 4), 40 нМ (линии 5, 6), 60 нМ (линии 7, 8) соответственно. Линия 9 - положительный контроль, линия 10 -отрицательный контроль. Представлены фотографии TRAP-продуктов в 10% ПААГ, окрашенном SYBR Gold.

Олигонуклеотид со случайной последовательностью PS-SSG тоже оказывал ингибирующее действие на теломеразу, но его 1С50 была выше - 60 нМ (рис, 4 В). Наблюдаемый эффект может быть связан с неспецифическим взаимодействием этого олигонуклеотида с теломеразой через SH-связи, поскольку известно, что фосфоротиоатные соединения могут неспецифически связываться с белками, нарушая их функции. Аналогичный эффект проявлялся при воздействии на теломеразу PS-TM024C (рис. 4 Г). Подавление ТА на 50% наблюдалось в концентрации 60 нМ. Следует отметить, что две эти последовательности имеют почти одинаковое количество

нуклеотидных звеньев: РЗ-ЯБО состоит из 20 нуклеотидов, а РБ-ТМ024С - из 24.

Основываясь на вышеописанных результатах можно сделать вывод, что олигонуклеотидная последовательность Р8-ТМ024С, как и РЗ-ББО, ингибирует ТА неспецифически и, по всей видимости, не влияет на активность теломеразного комплекса. Исходя из полученных данных, нами были рассчитаны коэффициенты специфичности ингибирования для исследуемых фосфоротиоатных олигонуклеотидов (табл. 3). Как видно из табл. 3, ингибирование ТА олигонуклеотидами Р8-Те1Р5 и Р8-ТМ024в происходит в 6 раз эффективнее по сравнению с действием РЗ-ББО и Р8-ТМ024С, из чего можно сделать вывод, что первые обладают более сильным сродством к ЬТ11, так как их последовательности комплементарны участку ЬТЯ, отвечающему за синтез теломерного повтора.

Таблица 3. Коэффициенты специфичности ингибирования для

Олигонуклеотид 1С5о, нМ Коэффициент специфичности, 1^50 олигонуклеотила.

Р8-Те1Р5 10 6

Р8-ТМ024С 10 6

Р8-ТМ024С 60 1

Рв-ввв 60 1

2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид Те1Р5-Я, нуклеотидная последовательность которого гомологична Р8-Те1Р5 и комплементарна матричной области синтеза теломерных повторов на МП, не подавлял ТА при высоких концентрациях (200 нМ) и при увеличении времени его инкубации с экстрактом без Т8-праймера (данные не приведены). ТМ018С-К также не оказывал влияния на активность теломеразы (рис. 5 А), в отличие от действия Р8-ТМ024С, который незначительно ингибировал ТА (рис. 4 Г). В случае добавления в реакционную смесь 880-11 в концентрациях 10, 20, 40 и 60 нМ, ингибирование теломеразы и Taq-пoлимepaзы также отсутствовало. Из четырех исследуемых 2'-0-Ме РНК-олигонуклеотидов ингибирующий эффект проявил только ТМ0180-Я, его 1С50 составила 40 нМ (рис. 5 Б). Однако, как видно из рис. 5 Б при внесении исследуемого соединения в реакционную смесь перед стадией ПЦР-амплификации наблюдалось незначительное подавление активности Тац-полимеразы, более выраженное при высоких концентрациях ТМ018С-Я (рис. 5 Б, линии 6, 8). Отсутствие ингибирующей активности у исследованных 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотидов может быть связано с особенностями механизма

катализа фермента. Теломераза, как ДНК-полимераза, по-видимому, не распознает и не связывает РНК-матрицы (кроме своего РНК-компонента). При этом фермент дискриминирует любую РНК, попадающую в активный центр, поскольку субстратом для него служит однонитевая ДНК. Поэтому 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотиды не способны связываться в активном центре каталитической субъединицы фермента (hTERT) и, следовательно, не могут конкурировать с ДНК-субстратом для теломеразы, в частности, с TS-праймером.

Однако, основываясь на результатах проведенных экспериментов, можно предположить, что ингибирующее действие олигонуклеотида TM018G-R на ТА объясняется формированием им квадруплексной структуры, образование которой возможно благодаря наличию G-богатых участков, по аналогии с PS-TM024G.

1 23456789 10 1 2 3 4 56789 10

МУ^УЙЙУШ ' W-

Н'^ппр ЧнИкИиЛ

УЙиЫЬь .дшаУвУи«§ s

А Б

Рис. 5. Ингибирующий эффект олигонуклеотидов TM018C-R (А) и TMOl 8G-R (Б) на ТА в лизатах опухолевых клеток MCF-7. Линии 1, 3, 5, 7 — добавление олигонуклеотида перед теломеразной реакцией. Линии 2, 4, 6, 8 — добавление олигонуклеотида перед стадией амплификации. Концентрации олигонуклеотида в реакционной смеси - 10 нМ (линии 1, 2), 20 нМ (линии 3, 4), 40 нМ (линии 5, 6), 60 нМ (линии 7, 8) соответственно. Линия 9 -положительный контроль, линия 10 - отрицательный контроль. Представлены фотографии TRAP-продуктов в 10% ПААГ, окрашенном SYBR Gold.

Описанные выше экспериментальные данные показали эффективность ингибирования ТА некоторыми модифицированными ДНК- и РНК-олигонуклеотидами в лизатах опухолевой клеточной линии MCF-7. Далее нами была проведена серия экспериментов на экстрактах, полученных из биопсийного и операционного материала от пациентов с тремя видами онкопатологий (РЖ, РПЖ и РЩЖ). Данное исследование дало возможность оценить степень ингибирующего эффекта модифицированных олигонуклеотидов на ТА в лизатах из клеток различных тканей, поскольку универсальность действия является важной характеристикой при создании противоопухолевого препарата. Кроме того, необходимо было выяснить, имеются ли

различия в структурной организации теломеразных комплексов, связанные с тканеспецифичностыо исследуемых образцов. Таблица 4. Ингибирование теломеразы и Тая-полимеразы модифицированными олигонуклеотидами (концентрация в реакционной смеси составляла 60 нМ) в экстрактах клеток от пациентов с различивши онкопатологиями. Представлены результаты трех независимых экспериментов._

Ингибирование Ингибирование Taq-

Олиго- теломеразы иолимеразы, %

нуклеотид

РЖ РПЖ РЩЖ РЖ РПЖ РЩЖ

(п=15) (п=10) (п=10) (п=15) (п=10) (п=10)

PS-TeIP5 100 100 100 0 0 0

PS-TM024G 100 100 91,3±8,2 25,2±5,7 26,1±4,3 23,2±5,1

PS-TM024C 53,1±5,4 52,9±2,8 52,1±4,7 0 0 0

PS-SSG 51,4±6,3 53,6±6,5 52,7±3,8 0 0 0

TM018G-R 80,2±7,1 90,2±4,3 91,2±6,5 55,б±2,9 51±3,7 52,1±3.2

В результате проведенных экспериментов, было показано, что ингибирование ТА PS-олигонуклеотидами имело одинаковую тенденцию в клинических образцах от исследуемых групп пациентов (табл. 4). Это говорит о том, что эти олигонуклеотиды возможно могут применяться в дальнейшем в качестве лекарственной субстанции при лечении, по крайней мере, трех представленных в работе видов онкопатологий. Концентрация всех олигонуклеотидов в реакционной смеси составляла 60 нМ. Как показали наши исследования, олигонуклеотид PS-TelP5 подавлял ТА в лизатах, полученных из клинического материала от исследуемых групп пациентов, не влияя на стадию ПЦР-апмлификации. PS-TM024G подавлял ТА полностью, но при этом оказывал также ингибирующее действие на активность Taq-полимеразы (рис. 6). PS-SSG, а также PS-TM024C воздействовали на теломеразу, ингибируя активность фермента на 50% по сравнению с положительным контролем (табл. 4). Это еще раз подтверждает тот факт, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды способны неспецифически взаимодействовать с белками через SH-связи. Однако, из данных таблицы 4 видно, что PS-TelP5 и PS-TM024G имеют более выраженную специфичность по отношению к теломеразе. В связи с тем, что 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид TM018G-R оказывал сильное влияние на стадию амплификации TRAP-продуктов и, соответственно, обладал низкой специфичностью по отношению к теломеразе, в дальнейших экспериментах в клеточной системе in vitro он не исследовался.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 6. Ингибирующий эффект PS-TelP5 (дорожки 1, 2), PS-TM024G (дорожки 3, 4), PS-SSG (дорожки 5, 6) на примере экстракта, полученного из ткани пациента с раком желудка. Дорожка 7 - положительный контрольный образец. Дорожка 8 - отрицательный контрольный образец. Концентрация олигонуклеотидов в реакционной смеси 60 нМ. Концентрация вносимого в реакцию экстракта эквивалентна 0,7 мкг белка. Дорожки 1, 3, 5 - добавление олигонуклеотидов перед теломеразной реакцией. Дорожки 2, 4, 6 — добавление олигонуклеотидов перед стадией амплификации. Электрофорез в 10% полиакриламидном геле, окрашенном SYBR Gold.

3. Исследование динамики накопления модифицированных ДНК-олигонуклеотидов и их влияния на рост и выживаемость опухолевых клеток. В качестве объекта исследования для изучения динамики накопления модифицированных PS-олигонуклеогидов была выбрана культура опухолевых клеток Ме1-10 (меланома человека). В ходе эксперимента проводили инкубирование клеток в среде, содержащей исследуемые FAM-меченые олигонуклеотиды (PS-TelP5, PS-TM024G, PS-SSG), а также применяли трансфекцию в клетки данных олигонуклеотидов с помощью реагента для трансфекции метафектина ("Biontex", Германия).

На примере FAM-меченого PS-TM024G было показано, что применение метафектина в качестве трансфецирующего агента позволяло значительно повысить количество олигонуклеотида в клетке. Поэтому дальнейшие эксперименты по изучению влияния PS-олигонуклеотидов на рост и размножение клеток опухолевой линии проводили с его использованием. Как видно из рис. 7, с увеличением времени инкубации клеток с исследуемыми олигонуклеотидами в случае PS-TM024G наблюдалось постепенное уменьшение его количества в клетках, а в случае остальных олигонуклеотидов -постепенное их накопление в клетках. В период инкубации от 3 до 24 ч происходило двукратное накопление в клетках олигонуклеотидов PS-SSG и PS-TelP5, в то время как содержание в клетках FAM-меченого

Р8-ТМ0240 за период от 3 до 6 ч уменьшилось вдвое. Исходя из этого, можно сделать вывод, что все три олигонуклеотида эффективно попадают внутрь клеток, однако Р8-ТМ0240 активно ими выводится.

250 ■

1 ? I |

Ь Й

200

150 -

100

время, ч

-контроль

-рБ-Те1Р5

-рз-ТМ0249

• рэ-вЗС

Рис. 7. Динамика изменения среднего значения интенсивности флуоресценции БАМ-меченых олигонуклеотидов (1 мкг/мл среды) в клетках Ме1-10 с метафектином (3 мкл/мл среды). Контроль - аутофлуоресценция клеток. Представлены результаты трех независимых экспериментов.

Исследование распределения клеток Ме1-10 по стадиям клеточного цикла показало, что через 24 ч после проведения трансфекции происходило увеличение количества апоптозных клеток по сравнению с контролем, а также увеличение доли клеток в 8-фазе клеточного цикла (рис. 8). Самое сильное действие по блокированию клеток в 8-фазе оказывал Р8-Те1Р5. Данный эффект можно объяснить тем, что этот олигонуклеотид комплементарен матричному участку НТК теломеразы и поэтому может быстро и эффективно блокировать функции фермента. Отсутствие активной теломеразы приводит к невозможности протекания процесса удлинения теломер в конце 8-фазы, что способствует остановке клеток перед фазой в2. Р8-ТМ0240 демонстрировал менее выраженное действие на перераспределение клеток по фазам клеточного цикла, что может быть связано с его повышенной скоростью выведения из клеток и недостаточно продолжительным временем после трансфекции для проявления его ингибирующих свойств. Следует отметить, что опухолевые клетки выводили Р8-ТМ024в (рис. 7). Возможно, поэтому количество

апоптозных клеток в случае его трансфекции примерно в два раза меньше, чем в случае Р8-Те1Р5 (рис. 8).

5 60 га 50 о

р 40

2 30 ф

ю 20 о

5 ю

3е о

12 3 4

олигонуклеотиды

■ апоптоз ■ фаза О Э фаза О 02/М фазь^

Рис. 8. Распределение клеток по фазам клеточного цикла после 24 ч инкубации с различными олигонуклеотидами (1 мкг/мл) в комплексе с метафектином (3 мкл/мл). 1 - Р8-Те1Р5, 2 - РБ-ТМСШО, 3 - РБ^С, 4 -контроль. Представлены результаты трех независимых экспериментов.

При исследовании влияния Р8-олигонуклеотидов на рост опухолевых клеток, для возможности сравнения полученных эффектов, для эксперимента была взята вторая опухолевая линия -НеЬа (карцинома шейки матки человека). Как показали эксперименты, влияние олигонуклеотидов на выживаемость опухолевых клеток практически не зависело от вида клеток. Наиболее токсичным в обоих случаях оказался Р8-'1М024С. После его двукратного введения с интервалом в 24 ч по истечении 48 ч погибло 28% клеток линии НеЬа и 30% клеток линии Ме1-10. Возможно, из-за высокой токсичности опухолевые клетки, при попадании в них Р51-ТМ()24Сг. активно от него избавляются. Кроме того, Р8-ТМ0240 представляет собой четыре гексамерных повтора 5'-ТТАС(Ю-3\ Было показано, что подобные структуры, попадая в клетку, индуцируют апоптоз и активируют механизмы, связанные с двуцепочечным повреждением ДНК [ЕПег М.8. е1 а1., 2002]. При действии Р8-Те)Р5 через 48 ч погибало 20 и 25% клеток опухолевых линий НеЬа и Ме1-10 соответственно, практически не подавлял рост клеток в обеих культурах. 4. Исследование внутриклеточной локализации

траисфецироваиных олигонуклеотидов посредством

конфокальной микроскопии. Для изучения внутриклеточной локализации БАМ-меченых Р8-олигонуклеотидов проводили

ШёУ

Рис. ТО. Клетки Ме1-10 через 4 ч после трансфекции РАМ-Р5-ТМ0240 с использованием метафектина. Цитоплазматические включения РБ-ТМ024 отмечены стрелками. А - сигнал БАМ-канала. Б - фазовый контраст.

конфокальную микроскопию препаратов клеток линии Ме1-10 после определенного времени инкубации или трансфекции РАМ-меченого олигонуклеотида с помощью метафектина.

Рис. 9. Клетки Ме1-10 через 4 ч после инкубации с РАМ-Р5-ТМ0240. Цитоплазматические включения отмечены стрелками. А - сигнал БАМ-канала. Б - фазовый контраст.

В контрольной культуре при длине волны сигнала от РАМ была заметна лишь слабая аутофлуоресценция клеток. В экспериментальной культуре через 4 ч после инкубации клеток с олигонуклеотидом РАМ-Р8-ТМ0240 была заметна его локализация в цитоплазме в виде более интенсивного фона, чем в контроле, и небольших сферических включений (рис. 9).

При проведении трансфекции с помощью метафектина наблюдались более интенсивные по количеству скопления цитоплазматических включений, содержащих РАМ-Р8-ТМ0240 (рис. 10). Таким образом, можно утверждать, что в случае применения метафектина концентрация олигонуклеотида в клетках значительно выше.

Рис. 11. Клетки Ме1-10 через 24 ч после трансфекции РАМ-Р8-ТМ024С с использованием метафектина. Зоны внутриядерной локализации отмечены стрелками. А - сигнал БАМ-канала. Б - фазовый контраст.

На препаратах, приготовленных через 24 ч после проведения трансфекции, происходило снижение интенсивности флуоресценции цитоплазматических включений РАМ-Р8-ТМ024С и появление зеленых зон внутри ядра (рис. 11). Это говорит о том, что непосредственно после трансфекции Р8-ТМ0240 накапливается в цитоплазме, а через некоторое время проникает в ядра клеток.

Рис. 12. Клетки Ме1-10 через 96 ч после трансфекции РАМ-Р8-ТМ024С с использованием метафектина. Зоны внутриядерной локализации отмечены стрелками. А - сигнал РАМ-канала. Б - фазовый контраст.

Через 96 ч после трансфекции наблюдалось прогрессирующее падение интенсивности флуоресценции цитоплазматических включений и увеличение зон с меткой внутри ядра (рис. 12). Эти зоны располагались по объему ядра не равномерно и локализовались в дискретных сферических структурах. Скорее всего, метка ассоциируется с локализацией теломеразы или других ферментов, способных к связыванию G-квадруплексной структуры. Возможно также, что увеличение внутриядерной локализации FAM-PS-TM024G является следствием блокирования клеточного цикла в S-фазе и накоплением таких клеток в культуре с течением времени.

При изучении внутриклеточной локализации FAM-PS-TelP5 и FAM-PS-SSG было установлено, что они после проведения трансфекции через 24 ч накапливались преимущественно в ядре. При этом происходило уменьшение размеров цитоплазматических депо, содержащих FAM-меченые олигонуклеотиды. FAM-PS-TelP5 и FAM-PS-SSG диффузно распределялись по всему объему ядра, окрашивая хроматин с различной интенсивностью, что говорит о предпочтительном связывании олигонуклеотидов с определенными его зонами.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что теломераза играет важную роль в процессе онкогенеза злокачественных новообразований желудка, предстательной и щитовидной желез, о чем свидетельствует высокий и средний уровни теломеразной активности, обнаруженные в большинстве клинических образцов от пациентов с этими типами опухолей.

2. Установлено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 (комплементарный матричному участку hTR) и PS-TM024G (имитирующий G-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии MCF-7 и характеризуются 1С5о, равными 10 нМ.

3. Выявлено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-TM024G в концентрации 60 нМ полностью ингибируют ТА в экстрактах клинического материала пациентов с онкопатологиями желудка, простаты и щитовидной железы.

4. Доказано, что 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (TelP5-R), комплементарный матричному участку hTR, в отличие от гомологичного ДНК-олигонуклеотида (PS-TelP5) не оказывает влияния на активность теломеразы in vitro.

5. Обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-TM024G снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в S-фазе клеточного цикла и стимулируют апоптоз.

6. Показано, что олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-SSG, через 24 ч после трансфекции, накапливаются преимущественно в ядре, где ассоциируются с зонами хроматина, в то время как PS-TM024G активно выводится частью клеток, накапливается в цитоплазме и в значительно меньшей степени проникает в ядра клеток, где локализуется в дискретных сферических структурах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование активности теломеразы при онкопатологиях желудка / Л.В. Свинарева, А.И. Глухов, ОБ. Зимник, И.И. Быков, Т.В. Хоробрых, В.И. Швец // Биомедицинская химия. -2010. -Т.56, № 5. - С. 602-608.

2. Ингибиторы теломеразы - противоопухолевые лекарственные препараты нового поколения / А.И. Глухов, Л.В. Свинарева, С.Е. Северин, В.И. Швец // Биотехнология. - 2010. - № 4. - С. 8-16.

3. Исследование влияния модифицированных олигонуклеотидов на активность теломеразы in vitro / Л.В. Свинарева, А.И. Глухов, О.В. Зимник, В.И. Швец // Тезисы докладов Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». -Москва, Россия, 2010. - С. 489-490.

4. Свинарева, Л.В. Ингибирование теломеразы как новый подход к лечению онкологических заболеваний / Л.В. Свинарева, Я.А. Литвин // Тезисы докладов III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии». - Москва, Россия, 2009. - С. 141-142.

5. Исследование активности теломеразы при онкопатологиях желудка / Л.В. Свинарева, А.И. Глухов, О.В. Зимник, В.И. Швец, И.И. Быков // Тезисы докладов III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины». - Ростов-на-Дону, Россия, 2009.-С. 145.

6. Свинарева, Л.В. Ингибирование активности теломеразы модифицированными олигонуклеотидами / Л.В. Свинарева,

А.И. Глухов, В.И. Швец // Тезисы докладов V Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, Россия, 2009. - С. 210.

7. Динамика накопления олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, их внутриклеточное распределение и влияние на выживаемость опухолевых клеток / А.И. Глухов, Е.Ю. Москалева, Я.А. Литвин, JI.B. Свинарева, Ш.Ю. Хапчаев, О.Н. Попова // Тезисы докладов VII Конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, Россия, 2010. - С. 59-60.

8. Исследование влияния олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на распределение опухолевых клеток по фазам клеточного цикла / А.И. Глухов, Е.Ю. Москалева, Я.А. Литвин, Л.В. Свинарева, О.Н. Попова // Тезисы докладов VII Конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасностъ». - Москва, Россия, 2010. - С. 5758.

Подписано в печать ЯгЛ 10 Формат 60x84/16. бумага писчая. Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Свинарева, Людмила Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции теломер.

1.1.1. Лимит Хейфлика.

1.1.2. Проблема концевой недорепликации.

1.1.3. Строение теломер.

1.1.4. Шелтериновый комплекс.

1.2. Структура и функции теломеразы.

1.2.1. Строение фермента.

1.2.2. Принцип действия теломеразы.

1.2.3. Альтернативные способы удлинения теломер.

1.2.4. Роль теломеразы в иммортализации клеток.

1.3. Регуляция теломеразной активности.

1.3.1. Транскрипция гена ЬТЕЯТ.

1.3.2. Альтернативный сплайсинг мРНК ИТЕЯТ.

1.3.3. Регуляция на уровне посттранскрипционных изменений.

1.4. Активность теломеразы в нормальных и опухолевых клетках человека.

1.5. Ингибиторы теломеразной активности.

1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы теломеразы.

1.5.2. Антисенс-терапия.

1.5.3. Рибозимы.

1.5.4. Соединения, взаимодейстующие с теломерным в-квадруплексом

1.5.5. РНК-интерференция.

1.6. Внетеломерные функции теломеразы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Олигонуклеотиды.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение экстрактов из клеток опухолевых линий и тканей пациентов.

2.2.2. Анализ теломеразной активности.

2.2.3. Определение цитотоксической активности исследуемых олигонуклеотидов.

2.2.4. Исследование апоптоза и распределения клеток по фазам клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии.

2.2.5. Исследование препаратов клеток Ме1-10, содержащих БАМ-меченые олигонуклеотиды, методом конфокальной микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ активности теломеразы в тканевых экстрактах пациентов с различными онкопатологиями.

3.2. Исследование влияния модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на теломеразную активность in vitro.

3.3. Исследование динамики накопления модифицированных ДНК-олигонуклеотидов и их влияния на рост и выживаемость опухолевых клеток.

3.4. Исследование внутриклеточной локализации FAM-меченых фосфоротиоатных олигонуклеотидов посредством конфокальной микроскопии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток"

Актуальность темы.

Приобретение иммортальности клетками опухолей напрямую связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее в процессе каждого деления клетки. Теломеразная* активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека, в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Особую группу соединений, исследуемых в настоящее время в качестве потенциальных ингибиторов теломеразы, представляют антисмысловые олигонуклеотиды. В отличие от обычной стратегии, где антисмысловые олигонуклеотиды подавляют экспрессию определенного гена, ингибирование теломеразы основано на непосредственном блокировании функции фермента олигонуклеотидами, комплементарными его РНК-компоненту (hTR). Для защиты антисмысловых олигонуклеотидов от деградации, вызываемой действием нуклеаз, при введении в организм применяют методы их химической модификации. На протяжении последних десяти лет активно изучаются механизмы действия и степень влияния на теломеразу модифицированных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, в число которых входят фосфоротиоатные (PS), фосфорамидатные олигонуклеотиды (NP), пептиднонуклеиновые кислоты (PNA), а также 2'-0-алкилированные РНК-олигонуклеотиды.

Цель работы.

Задачи исследования:

1. Изучить эффективность ингибирования теломеразной активности г модифицированными ДНК- и РНК-олигонуклеотидами в экстрактах, полученных из клеток опухолевых линий, а также из клинического материала от пациентов с различными онкопатологиями.

3. Определить характер действия рассматриваемых олигонуклеотидов на стадии клеточного цикла и апоптоз.

4. Исследовать динамику ' накопления и локализацию модифицированных олигонуклеотидов внутри опухолевых клеток методом конфокальной микроскопии.

Научная новизна работы.

1. Впервые показана возможность применения фосфоротиоатпых олигонуклеотидов для ингибирования ТА в лизатах клеток трех типов онкопатологий (рак желудка, рак предстательной железы, рак щитовидной железы).

3. Методом конфокальной микроскопии впервые обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды, ингибирующие ТА, характеризуются различной компартментализацией внутри опухолевых клеток в зависимости от их нуклеотидного состава.

Практическая значимость исследования

Результаты работы совместно с литературными данными позволяют дополнить представления о важной роли теломеразы в онкогенезе таких новообразований как рак желудка, рак предстательной железы и щитовидной железы.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

2. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 (комплементарный матричному участку ЬТЯ) и Р8-ТМ0240 (имитирующий С-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии МСР-7 и характеризуются 1С50, равными 10 нМ, в то время как 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (Те1Р5-К) с последовательностью, комплементарной матричному участку ЬТЯ, не оказывает влияния на ТА.

3. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 и Р8-ТМ0240 снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в 8-фазе клеточного цикла, стимулируют апоптоз, а также характеризуются различной локализацией после трансфекции в опухолевые клетки.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Свинарева, Людмила Владимировна

выводы

1. Показано, что большинство клинических образцов от пациентов со злокачественными новообразованиями желудка, предстательной и щитовидной' желез характеризуются средним и высоким уровнем теломеразной активности, что указывает на важную роль теломеразы в процессе-онкогенезадри-данных типах опухолей.

4: Доказано, что 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (TelP5-R), комплементарный матричному участку hTR, в отличие от гомологичного ДНК-олигонуклеотида (PS-TelP5) не оказывает влияния на активность теломеразы in vitro.

6. Показано, что олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-SSG, через 24 ч после трансфекции, накапливаются преимущественно в ядре, где ассоциируются с зонами хроматина, в то время как PS-TM024G активно выводится частью клеток, накапливается в цитоплазме и значительно в меньшей степени проникает в ядра клеток, где локализуется в дискретных сферических структурах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Свинарева, Людмила Владимировна, Москва

1. HayflickL., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains//Exp. Cell Res. 1961. 25. P. 585-621.

2. Counter C.M., Gupta I., Harley C.B., Leber В., Bacchetti S. Telomerase activity in normal leucocytes and in hematologic malignancies // Blood. 1995. 85. P. 2315-2320" ~ ~ "

3. Hiyama K., Hirai Y., Kyoizumi S., Alciyama M., Hiyama E., Piatyszek M., Shay J.W. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells // J. Immunol. 1995. 155. P. 3711-3715.

4. Альтшулер M.JI., Северин C.E., Глухов А.И. Теломераза в свете современных представлений о злокачественной трансформации клетки // Биохимия. 2003. 68(12). С. 1587-1596.

5. Оловников A.M. Принципы маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов // Докл. АН СССР. 1971. 201. С. 1496-1499.

6. Lingner J., Cooper J.P., Cech T.R. Telomerase and DNA end replication: no longer a laggingstrand problem? // Science. 1995. 269. P. 15331534.

7. McClintock B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays // Genetics. 1941. 26. P. 234-282.

8. Mueller H.J. The remaking of chromosome // The Colleting Net-Woods Hole. 1938. 13. P. 181-198.

9. Скулачев В.П. Старение организма — особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана//Биохимия. 1997. 62(11). С. 1394-1399.

10. Levy M.Z., Allsopp R.C., Futcher А.В., Greider C.W., Harley СВ.

11. Telomere end-replication problem and cell aging // J. Mol. Biol. 1992. 225. P. 951-960.

12. Watson J.D. Origin of concatemeric T7 DNA // Nature New Biol. 1972. 239. P. 197-201.

13. Rowley P.T. Telomerase: putting an end to DNA // Cancer Investigation. 1998. 16(3). P. 170-174.

14. Prescott J., Blackburn E. H. Functionally interacting telomerase RNAs in the yeast telomerase complex// Genes Dev. 1997. 11. P. 2790-2800.

15. Hemann M.T., Rudolph K.L., Strong M.A., DePinho R.A., Chin L., Greider C.W. Telomere dysfunction triggers developmentally regulated germ cell apoptosis // Mol. Biol. Cell. 2001. 12. P. 2023-2030.

16. Blackburn E.H., Gall J.G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena //J. Mol. Biol. 1978. 120. P. 33-53.

17. Cooke IT. J., Smith B.A. Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region// Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. 51(1). P. 213-219.

18. Brown W.R.A., MacKinnon P.J., Villasante A., Spurr N., Bukle V.J., Dobson M.J. Structure and polymorphism of human telomere-associated DNA // Cell. 1990. 63. P. 119-132.

19. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. 88. P. 9051-9055.

20. De Lange T. Shelterin: The protein complex that shapes and safeguards human telomeres // Genes Dev. 2005. 19. P. 2100-2110.

21. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A, Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop // Cell. 1999. 97. 4. P. 503-514.

22. Stansel R.M., De Lange T., Griffith J. T-loop assembly in vitro involves binding of trf2 near the 30 telomeric overhang. EMBO J. // 2001. 20. P. 5532-5540.

23. Amiard S., Doudeau M., Pinte S.,Poulet A., Lenain C., Faivre-Moslcalenko C., Angelov D. A topological mechanism for trf2-enhanced strand invasion //Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. 14. P 147-154.

24. Hockemeyer D., Sfeir A., Shay J., Wright W.E., De Lange T. Potl protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end// EMBO J. 2005. 24. P. 2667-2678.

25. Hockemeyer D., Daniels J., Talcai H., De Lange T. Recent expansion of the telomeric complexin rodents. Two distinct potl proteins protect mouse telomeres//Cell. 2006. 126. P. 63-77.

26. Wu L., Multani A., He H., Cosme-Blanco W., Deng Y., Deng J.M., Bachilo O., Pathak S. Potl deficiency initiates DNA damage checkpoint91activation and aberrant homologous recombination at telomeres // Cell. 2006. 126. P. 49-62.

27. Li B., Oestreich S., De Lange T. Identification of human rapl: Implications for telomere evolution // Cell. 2000. 101. P. 471-483.

28. Smogorzewska A., De Lange T. Regulation of telomerase by telomeric proteins//Ann. Rev. Biochem. 2004. 73. P. 177-208.

29. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is ribonucleoprotein that synthesize TTAGGG repeats // Cell. 1989. 59(3). P. 521-529.

30. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Harley C.B., Lingner J. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human // Science. 1997. 277(5328). P. 955-959.

31. Feng J., Funk W.D., Wang S.S., Weinrich S.L., Avilion A.A., Chiu C.P., Adams R.R. The RNA component of human telomerase // Science. 1995. 269. P. 1236-1241.

32. Cong Y.-S., Wright W.E., Shay J.W. Humal telomerase and its regulation//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. 66(3). P. 407-425.

33. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V.,92

34. Cech T.R. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase // Science. 1997. 276. P. 561-567.

35. Counter C.M., Meyerson M., Eaton E.N., Weinberg R.A. The catalytic subunit of yeast telomerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94. P. 92029207.

36. Weinrich S.L., Pruzan R., Ma L., Ouellette M., Tesmer V.M., Holt S.E., Bodnar A.G., et al. Reconstituton of human telomerase with the template RNA component hTRT and the catalytic protein subunit hTRT // Nature Genetics. 1997. 17. P. 498-502.

37. Cong Y.S., Wen J., Bacchetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter // Hum. Mol. Genet. 1999. 8. P. 137-142.

38. Shay J.W., Wright W.E. Implications of mapping the human telomerase gene (hTERT) as the most distal gene on chromosome 5p // Neoplasia. 2000. 2(3). P. 195-196.

39. Meyerson M., Counter C.M., Eaton E.N., Ellisen L.W., Steiner P., Caddie S.D., Ziaugra L. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization // Cell. 1997. 90. P. 785-795.

40. Wick M., Zubov D., Hagen G. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) // Gene. 1999. 232(1). P. 97-106.

41. Robart A.R., Collins К. Investigation of human telomerase holoenzyme assembly, activity, and processivity using disease-linked subunit variants // J. Biol. Chem. 2010. 285(7). P. 4375-4386.

42. Meyerson M. Telomerase enzyme activation and human cell immortalization//Toxicol. Lett. 1998. 102-103. P. 41-45.

43. Fajkus J., Simickova M., Malaska J. Tiptoeing to chromosome tips: facts, promises and perils of today's human telomere biology // Royal society. 2001. 12. P. 545-562.

44. Collins K., Kobayashi R., Greider C.W. Purification of Tetrahymena telomerase and cloning of genes encoding the two protein components of the enzyme // Cell. 1995. 81. P. 677-686.

45. Rowley P.T. Telomerase: putting an end to DNA. Cancer In vest. 1998. 16(3). P. 170-174.

46. Глухов А.И., Гордеев C.A., Апрятин C.A., Северин С.Е. Теломераза: клеточное старение, иммортализация и онкогенез // Вестник научно-исследовательского института молекулярной медицины. 2006. 6. С. 33-56.

47. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы // Биологические мембраны. 2001. 3. С. 249-256.

48. Bryan Т.М., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R.R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity //EMBO J. 1995. 14. P. 4240-4248.

49. Grobelny J.V., Kulp-McEliece M., Broccoli D. Effects of reconstitution of telomerase activity on telomere maintenance by the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway // Hum. Mol. Genet. 2001. 10. P.1953-1961.

50. Henson J.D., Neumann A.A., Yeager T.R., Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells // Oncogene. 2002. 21. P. 598-610.

51. Tokutake Y., Matsumoto T., Watanabe T., Maeda S., Tahara H., Sakamoto S., Niida H., et. al. Extrachromosome telomere repeat DNA in telomerase-negative immortalized cell lines // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 247. P. 765-772.

52. Lundblad V., Blackburn E.H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues estl- senescence // Cell. 1993. 73. P. 347-360.

53. Cerone M.A., Autexier C., Londono-Vallejo J.A., Bacchetti S. A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT // Oncogene. 2005. 24. P. 7893-78101.

54. Dunham M.A., Neumann A.A., Fasching C.L., Reddel R.R. Telomere maintenance by recombination in human cells // Nat. Genet. 2000. 26. P. 447450.

55. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres, telomerase, and cancer//Cancer Lett. 2003. 194. P. 155-162.

56. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? // Mutat. Res. 1991. 256. P. 271-282.

57. Reddel R.E. A reassessment of the telomere hypothesis of senescence //BioEssays. 1998. 20. P. 977-984.

58. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. 131. P. 861-872.

59. Stadtfeld M., Maherali N., Breault D.T., Hochedlinger K. Definingmolecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse Cell Stem Cell. 2008. 2(3) P. 230-240.

60. Holt S.E., Shay J.W., Wright W.E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer // Nature Biotech. 1996. 14. P. 834-837.

61. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells // Science. 2001. 292(5524). P. 2075-2077.

62. Colgin L.M., Reddel R.R. Telomere maintenance mechanisms and cellular immortalization // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. 99(1). P. 97-103.

63. Greider C.W., Blackburn E.H. Telomeres, telomerase and cancer // Scientific American. 1996. 274. P. 92-97.

64. Hahn W.C., Counter C.M., Lundberg A.S., Beijersbergen R.L., Brooks M.W., Weinberg, R.A. Creation of human tumor cells with defined genetic elements//Nature. 1999. 400(6743). P. 464-468.

65. Hahn W.C., Dessain S.K., Brooks M.W. Enumeration of the simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation // Mol. Cell. Biol. 2002. 22(10). P. 3562.

66. Duss S., André S., Nicoulaz A.L. Fiche M., Bonnefoi H., Brisken C., Iggo R.D. An oestrogen-dependent model of breast cancer created by transformation of normal human mammary epithelial cells // Breast Cancer Res. 2007. 9(3). R38.

67. Fusco A., Berlingieri M.T., Di Fiore P.P. One- and two-step transformations of rat thyroid epithelial cells by retroviral oncogenes // Mol. Cell. Biol. 1987. 7(9). P. 3365-3370.

68. Henderson S., Allsopp R., Spector D., Wang, S.-S., Harley C. In situ analysis of changes in telomere size during replicative aging and celltransformation // J. Cell Biol. 1996. 134. P. 1-12.

69. Counter C.M., Botelho F.M., Wang P., Harley C.B., Bacchetti S. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes // J. Virol. 1994. 68(5). P. 3410-3414.

70. Horikawa I., Cable P.L., Afshari C., Barrett J.C. Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene // Cancer Res. 1999. 59. P. 826-830.

71. Horikawa I., Barrett J.C. Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms // Carcinogenesis. 2003. 24(7). P. 1167-1176.

72. Shay J.W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer // Eur. J. Cancer 1997. 33. P. 787-791.

73. Kyo S., Takakura M., Taira IC., Kanaya T., Itoh H., Yutsudo M., Ariga H., Inoue M. Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) // Nucleic Acids Res. 2000. 28(3). P. 669-677.

74. Wang J.L., Xie Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. Myc activates telomerase.//Genes Dev. 1998. 12. P. 1769-1774.

75. Misiti S., Nanni S., Fontemaggi G., Cong Y.S., Wen J., Hirte H.W., Piaggio G., et. al. Induction of hTERT expression and telomerase activity byestrogens in human ovary epithelium cells // Mol. Cell Biol. 2000. 20(11). P. 3764-3771.

76. Kyo S., Takakura M., ICanaya T., Zhuo W., Fujimoto K., Nishio Y., Orimo A., Inoue M. Estrogen activates telomerase // Cancer Res. 1999. 59. P. 5917-5921.

77. Oh S., Song Y.H., Yim J., Kim T.K. Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT ) gene // Oncogene. 2000. 19. P. 1485-1490.

78. Xu D., Wang Q., Gruber A., Bjorkholm M., Chen Z., Zaid A., Selivanova G., et. al. Downregulation of telomerase reverse transcriptase mRNA expression by wild type p53 in human tumor cells // Oncogene 2000. 19. P. 5123-5133.

79. Nguyen D.C., Crowe D.L. Intact functional domains of the retinoblastoma gene product (pRb) are required for downregulation of telomerase activity // Biochim. Biophys. Acta. 1999. 1445(2). P. 207-215.

80. Mukhopadhyay T., Multani A.S., Roth J.A., Pathak S. Reduced telomeric signals and increased telomeric associations in human lung cancer cell lines undergoing p53-mediated apoptosis // Oncogene. 1998. 17. P. 901-906.

81. Ford L.P., Wright W.E., Shay J.W. A model for heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in telomere and telomerase regulation // Oncogene. 2002. 21 P. 580-583.

82. Horikawa I., Barrett J.C. Trancriptional regulation of the telomerasehTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms // Carcinogenesis. 2003. 24(7). P. 1167-1176.

83. Villa R., Porta C.D., Folini M., Daidone M.G., Zaffaroni N. Possible regulation of telomerase activity by transcription and alternative splicing of telomerase reverse transcriptase in human melanoma // J. Invest. Dermatology. 2001. 116. P. 867-873.

84. Nagao K., Katsumata K., Aizawa Y., Saito N., Hirata H., Sasaki H., Yamamoto S., et. al. Differential alternative splicing expressions of telomerase reverse transcriptase in gastrointestinal cell lines // Oncol, rep. 2004. 11. P. 127131.

85. Hisatomi H.5 Ohyashiki K., Ohyashiki J.H., Nagao K., Kanamaru T., Hirata H., Hibi N., Tsukada Y. Expression profile of a y-deletion variant of the human telomerase reverse transcriptase gene // Neoplasia. 2003. 5(3). P. 193197.

86. Yi X., White D.M., Aisner D.L., Baur J.A., Wright W.E., Shay J.W. An alternate splicing variant of the human telomerase catalytic subunit inhibits telomerase activity //Neoplasia. 2000. 2. P. 433-440.

87. Elentioba-Johnson K.S.J. Complex regulation of telomerase activity // Am. J. Pathol. 159(2). 2001. P. 405-410.

88. Harrington L., McPhail T., Mar V., Zhou W., Oulton R., Bass M. B., Arruda I., Robinson M. O. A mammalian telomerase-associated protein //

89. Science. 1997. 275. P. 973-977.

90. Haendeler J., Hoffman J., Rahman S., Zeiher A.M., Dimmeler S. Regulation of telomerase activity and anti-apoptotic functions by protein-protein interaction and phosphorylation // FEBS letters. 2003. 536. P.180-186.

91. Li H., Zhao L.L., Funder J.W., Liu J.P. Protein phosphatase 2A inhibits nuclear telomerase activity in human breast cancer cells // J. Biol. Chem. 1997. 272. 16729-16732.

92. Kang S.S., Kwon Т., Kwon D.Y., Do S.I. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit//J. Biol. Chem. 1999. 274. P. 13085-13090.

93. Smith S., de Lange T. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells // Curr. Biol. 2000. 10. P. 1299-12302.

94. Cook B.D., Dynek J.N., Chang W., Shostak G., Smith S. Role for the related poly(ADPRibose) polymerases tankyrase 1 and 2 at human telomeres // Mol. Cell. Biol. 2002. 22(1). P. 332-342.

95. Gomez M., Wu J., Schreiber V., Dunlap J., Dantzer F., Wang Y. PARP1 is a TRF2-associated poly(ADP-ribose)polymerase and protects eroded telomeres //Mol. Biol. Cell. 2006. 17. P. 1686-1696.

96. Counter C.M., Hirte H.W., Bacchetti S., Harley C.B. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. P. 2900-2904.

97. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.M., et. al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer // Science. 1994. 266. P. 2011-2015.

98. Микер A.K., Коффи Д.С. Теломераза: многообещающий маркер биологического бессмертия половых, стволовых и раковых клеток //100

99. Биохимия. 1997. 62(11). С. 1547-1557.

100. Жуликов Д.В. Предоперационная дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы на основе анализа содержания теломеразы в ткани: дис. . канд. мед. наук// 2010. 121 С.

101. Hiyama Е., Gollahon L., Kataoka Т., Kuroi К., Yokoyama Т., Gazdar A.F., Hiyama К. Telomerase activity in human breast tumors // J. Natl. Cancer Inst. 1996. 88. P. 116-122.

102. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev.

103. Genet. 1996. 18. P. 173-179.

104. Chiu C.-P., Dragowska W., Kim N.W., Vaziri H., Yui J., Thomas Т.Е., Harley C.B., Lansdorp P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow // Stem Cells. 1996. 14. P. 239-248.

105. Hiyama K., Hirai Y., Kyoizumi S., Alciyama M., Hiyama E., Piatyszek M.A., Shay J.W. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells // J. Immunol. 1995. 155(8). P. 3711-3715.

106. Kyo S., Takakura M., Kohama Т., Kohama Т., Inoue M. Telomerase activity in human endometrium. Cancer Res. 1997.57. P. 610-614.

107. Tahara H., Nalcanishi Т., Kitamoto M., Nakashio R., Shay J.W., Tahara E., Kajiyama G. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas // Cancer Res. 1995. 55. P. 2734-2736.

108. Flores I., Cayuela M.L., Blasco M.A. Effects of telomerase and telomere length on epidermal stem cell behavior // Science. 2005. 309. P. 12531256.

109. Chadeneau C., Hay IC., Hirte H.W., Gallinger S., Bacchetti S. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer // Cancer Res. 1995. 55. P. 2533-2536.

110. Taylor R.S., Ramirez R.D., Ogoshi M., Chaffms M., Piatyszek M;A., Shay J.W. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin -conditions-//-J-InvestrDermatol-l 996-1 G6rP-759-765:---—

111. Hiyama E., Hiyama K., Tatsumoto N., Shay J.W., Yokoyama T. Telomerase activity in human intestine // Int. J. Oncol. 1996. 9. P. 453-458.

112. Gomez D.E., Tejera A.M., Olivero OA. Irreversible telomere shortening by 3'-azido-2',3-dideoxythymidine (AZT) treatment // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 246(1). P. 107-110.

113. Pai R.B., Pai S.B., Kukhanova M., Dutschman G.E., Guo X., Cheng Y. Telomerase from human leukemia cells: properties and its interaction with deoxynucleoside analogues//Cancer Res. 1998. 58. P. 1909-1913.

114. Strahl C., Blackburn Ii.H. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase in two immortalized human cell lines // Mol. Cell. Biol. 1996. 16(1). P. 53-65. ;

115. De Cian A., Lacroix L., Douarre C., Temime-Smaali N., Trentesaux C., Riou J.F., Mergny J.L. Targeting telomeres and telomerase // Biochimie. 2008. 90. P. 131-155.

116. Pendino F., Flexor M., Delhommeau F., Buet D., Lanotte M., Segal-Bendirdjian E. Retinoids down-regulate telomerase and telomere length in a pathway distinct from leukemia cell differentiation// Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98(12). P. 6662-6667.

117. Togashi K., Kakeya H;, Morishita M., Song Y., Osada H:. Inhibition of human telomerase activity by alterperylenol // Oncol. Res. 1998. 10. P. 449. • 102

118. Yamakuchi M., Nakata M., Kawahara K., Kitajima I., Maruyama I. New quinolones, ofloxacin and levofloxacin, inhibit telomerase activity in transitional cell carcinoma cell lines // Cancer Lett. 1997. 119(2). P. 213-219.

119. Huang P.R., Yeh Y.M., Wang T.C. Potent inhibition of human telomerase by helenalin // Cancer Lett. 2005. 227(2). P. 169-174.

120. Naasani I., Seimiya H., Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomere shortening and senescence of cancer cells by tea catechins // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 249. P. 391-396.

121. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma//Antisense Res. Dev. 1991. l.P. 141-151.

122. Feng J., Funk W.D., Wang S., Weinrich S.L., Avilion A.A., Chiu C., Adams R.R., et. al. The RNA component of human telomerase // Science. 1995. 269. P. 1236-1241.

123. Glukhov A.I., Zimnik O.V., Gordeev S.A., Severin S.E. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 248. P. 368-371.

124. Norton J.C., Piatyszek M.A., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids // Nat. Biotechnol. 1996. 14. P. 615-619.

125. Gryaznov S., Asai A., Oshima Y., Yamamoto Y., Pongracz K.,103

126. Pruzan R., Wunder E., et. al. Oligonucleotide N3' --> P5' thio-phosphoramidate telomerase template antagonists as potential anticancer agents // Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids. 2003. 22. P. 577-581.

127. Wang E.S., Wu K., Chin A.C., Chen-Kiang S., Pongracz K. Gryaznov S., Moore M.A. Telomerase inhibition with an oligonucleotide "telomerase templatelmtagonistl in vitro andTn^vivcTstudies inmultipleTnyeloma and lymphoma//Blood. 2004. 103(1). P. 258-266.

128. Kondo S., Kondo Y., Li G., Silverman R.H., Cowell J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA // Oncogene. 1998. 16(25). P. 3323-3330.

129. Kondo Y., Koga S., Komata T., Kondo S. Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component // Oncogene. 2000. 19(18). P. 2205-2211.

130. Kraemer K., Fuessel S., Schmidt U., Kotzsch M., Schwenzer B., Wirth M.P., Meye A. Antisense-mediated hTERT inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells // Clin. Cancer Res. 2003. 9(10). P. 3794-3800.

131. Cao Y., Li H., Deb S., Liu J.P. TERT regulates cell survivalindependent of telomerase enzymatic activity // Oncogene. 2002. 21(20). P. 3130-3138.

132. Yokoyama Y., Takahashi Y., Shinohara A., Wan X., Takahashi S., Niwa K., Tamaya1 T. The 5'-end of hTERT mRNA is a good target for hammerhead ribozyme to suppress telomerase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 273(1). P. 316-321.

133. Ludwig A., Saretzki G., Holm P.S., Tiemann F., Lorenz M., Emrich T., Harley C.B., von Zglinicki T. Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase // Cancer Res. 2001.61(7). P. 3053-306L.

134. Zahler A.M., Williamson J.R., Cech T.R., Prescott D.M. Inhibition of telomerase by G-quartet DNA structures //Nature. 1991. 350. P. 718-720.

135. Phatalc P., Burger A.M. Telomerase and its potential for therapeutic intervention // Br. J. Pharmacol. 2007. 152. P. 1003-1011.

136. Sun D., Thompson B., Cathers B.E. Inhibition of human telomerase by a G-quadruplexinteractive compound // J. Med. Chem. 1997. 40. P. 21132116.

137. Perry P.J., Gowan S.M., Reszka A.P., Polucci P., Jenkins T.C., Kelland L.R., Neidle S. 1,4-and 2,6-Disubstituted amidoanthracene-9,10-dione derivatives as^inhibitors^of^human telomerase V/ TrMedrChem^l 998r 4 lrPr 3253-3260.

138. Cairns D., Michalitsi E., Jenkins T., Maclcay S. Molecular modelling and cytotoxicity of substituted anthraquinones as inhibitors of human telomerase //Bioorg. Med. Chem. 2002. 10(3) 803-807.

139. Wheelhouse R.T., Sun D., Han H., Han F.X., Hurley L.H. Cationic porphyrins as telomerase inhibitors: the interaction of tetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphine with quadruplex DNA // J. Amer. Chem. Soc. 1998. 120. P. 3261-3262.

140. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Hurley L. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99(18). P. 1 1593-11598.

141. Binz N., Shalaby T., Rivera P., Shin-yab IC., Grotzer M.A. Telomerase inhibition, telomere shortening, cell growth suppression and induction of apoptosis by telomestatin in childhood neuroblastoma cells // Eur. J. Cancer. 2005. 41(18). P. 2873-2881.

142. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. 391. P. 806-811.

143. Kosciolek B.A., Kalantidis K., Tabler M., Rowley P.T. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference // Mol. Cancer Ther r2003r2 (3 )rP r 209-216r—-—---—

144. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth: 1983. 65. P. 55-63.

145. Hu X., Wu H., Zhang S., Yuan H., Cao L. Clinical Significance of Telomerase Activity in Gastric Carcinoma and Peritoneal Dissemination // J. Intern. Med. Res. 2009. 37(4). P. 1127-1138.

146. Scates D.K., Muir G.H., Venitt S., Carmichael P.L. Detection of telomerase activity in humane prostate: a diagnostic marker for prostatic cancer?

147. Br. J. Urol. 1997. 80(2). P. 263-268.

148. Orlando C., Gelmini S. Telomerase in endocrine and endocrine-dependent tumors // J. Steroid Biochem Mol Biol. 2001. 78(3). P. 201-214.

149. Zhan W., Ma J., Peng J. Gao J., Cai S, Wang J., Zheng Z., Wang L. Telomerase activity in gastric cancer // 1999. World J. Gastroenterol. 5(4). P. 316^319~ ~

150. Gatto B., Palumbo M., Sissi C. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential // Curr. Med. Chem. 2009. 16(10). P. 1248-1265.

151. Heidenreich O., Kang S.-H., Xu X., Nerenberg M. Application of antisense technology to therapeutics // Molec. Med. Today. 1995. 1. P. 128-133.

152. Pitts A.E., Corey D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-(9-methyl-RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. 95. P. 11549-11554.

153. Eller M.S., Puri N, Hadshiew I.M., Venna S.S., Gilchrest B.A. Induction of Apoptosis by Telomere 3' Overhang-Specific DNA // Exp. Cell Res. 2002. 276. P. 185-183.

Информация о работе

Свинарева, Людмила Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы