Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие гетероаренантрацендионов с G-квадруплексами ДНК-противоопухолевой мишенью

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие гетероаренантрацендионов с G-квадруплексами ДНК-противоопухолевой мишенью"

На правах рукописи

ИЛЬИНСКИЙ НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕТЕРОАРЕНАНТРАЦЕНДИОНОВ С С-КВАДРУПЛЕКСАМИ ДНК - ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ МИШЕНЬЮ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

6 НОЯ 2014

Москва - 2014

005554326

005554326

Работа выполнена в Лаборатории ДНК-белковых взаимодействий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук и частично на Кафедре молекулярной и клеточной биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)».

Научный руководитель:

старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, кандидат физико-математических наук Калюжный Дмитрий Николаевич Официальные оппоненты:

заведующий Лабораторией моделирования биомолекулярных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, доктор физико-математических наук, профессор Ефремов Роман Гербертович

заведующая Лабораторией искусственного антителогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», доктор химических наук, профессор Позмогова Галина Евгеньевна Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук

Защита состоится « 23 » декабря 2014 г. в 14°° час. на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН. Автореферат диссертации разослан «T/faC/fTScp-S 2014 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Кандидат химических наук

Крицын А.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Опухолевые заболевания являются одной из основных причин смертности населения России и большинства развитых стран. Производные антрацен-9,10-диона (антрахинона), к которым относятся антрациклиновые антибиотики (доксорубицин, рубомицин) и их аналоги (митоксантрон), представляют собой один из важнейших классов лекарственных средств противоопухолевой химиотерапии. Недостаточная избирательность действия соединений на опухолевые клетки приводит к повышенной органотоксичности. Для снижения побочных эффектов необходимо повышать аффинность и селективность лигандов к мишеням, критичным преимущественно для жизнедеятельности опухолевых клеток.

Одна из таких мишеней - в-квадруплексные структуры нуклеиновых кислот. Стабилизация теломерного в-квадруплекса малыми молекулами приводит к подавлению активности рибонуклеопротеина теломеразы, экспрессированного в большинстве опухолевых и практически отсутствующего в дифференцированных здоровых клетках. Стабилизация в-квадруплексов в промоторных участках онкогенов позволяет влиять на их экспрессию.

Другая проблема, снижающая эффективность химиотерапии, состоит в развитии в опухолевых клетках лекарственной устойчивости. Действие на несколько клеточных процессов является одним из перспективных направлений преодоления резистентности. Поэтому важно оптимизировать структуру производных антрацендиона для действия на в-квадруплексы, что в совокупности с ингибированием топоизомеразы, свойственным для этого класса веществ, может способствовать увеличению активности соединений против устойчивых линий клеток.

Перспективным классом для поиска противоопухолевых веществ являются линейные гетероаренантрацендионы, на основе которых в НИИ ИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН получен ряд препаратов, блокирующих рост опухолевых клеток, включая линии с активированными механизмами множественной лекарственной устойчивости. Для валидации квадруплексных структур как внутриклеточных мишеней для действия гетероаренантрацендионов, необходимо исследовать

механизм взаимодействия лигандов с ДНК и выявить элементы химической структуры соединений, обеспечивающие высокие аффинность и избирательность связывания с G-квадруплексами по сравнению с дуплексной ДНК. Определение закономерностей структура-активность необходимо для разработки селективных квадруплексных лигандов и создания на основе гетероаренантрацендионов противоопухолевых средств нового поколения. Цель и задачи исследования

Цель работы - выявить влияние химических модификаций гетероаренантрацендионов на аффинность и селективность взаимодействия с противоопухолевой клеточной мишенью - G-квадруплексом ДНК. Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

1) определить механизм связывания гетероаренантрацендионов с ДНК,

2) отработать методику отбора соединений по аффинности и избирательности связывания с квадруплексными и дуплексными структурами ДНК с учётом характеристик гетероаренантрацендионов,

3) установить влияние структурных элементов соединений на аффинность и селективность к G-квадруплексу.

Методы исследования

Абсорбционная спектроскопия в ультрафиолетовом и видимом спектральных диапазонах, флуоресценция (собственная, контактный перенос энергии, время затухания, тушение, вытеснение методом G4-FID, плавление по FRET), круговой дихроизм, ЯМР-спектроскопия, нативный ПААГ-электрофорез, изотермическая титрационная калориметрия, компьютерное моделирование взаимодействия лиганд-мишень методом молекулярной динамики. Все эксперименты проведены в 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.8), при температуре 25°С, если не указано иначе. Научная новизна работы

1. Впервые показано, что лиганды на основе гетероаренантрацендионов индуцируют разрушение структурных единиц G-квадруплексов (G-квартетов).

2. Выведены формулы для оценки констант связывания с мишенью по стабилизационному эффекту и доле вытеснения флуоресцентного зонда.

3. Впервые выработаны требования к структуре гетероаренантрацендионов,

обеспечивающие им высокие аффинность и селективность к теломерному С-кпадруплексу ДНК - противоопухолевой мишени. 4. Найден прототип для создания направленно действующего лекарственного препарата - высокоаффинный и селективный в-квадруплексный лиганд на основе антра[2,3-6]тиофен-5,10-диона. Практическая значимость

Результаты диссертации могут быть использованы для рационального дизайна селективного противоопухолевого препарата на основе гетероаренантрацендионов. Для научно-исследовательской работы важны предложенные формулы для оценки констант связывания лигандов с мишенью. Апробация результатов работы

Основные положения и результаты диссертации докладывались, обсуждались и получили положительную оценку на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», ИБХ, 2011; трёх всероссийских научных конференциях «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», МФТИ (2010, 2012, 2013); двух международных зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», ИБХ (2011, 2013); трёх Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2011, -2012, -2013, МГУ; международной молодёжной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы "Биохимическая физика" 2012; международных конференциях в США, 2010, Сингапуре, 2013. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список, утверждённый Высшей аттестационной комиссией, а также 13 тезисов докладов, выдан патент на изобретение. Структура и объём работы

По своей структуре диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, списка литературы. Объём диссертации составляют 138 страниц текста, включая 45 рисунков и 8 таблиц. Список использованных источников содержит 274 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель, задачи и методы исследования, отражены научная новизна, практическая значимость работы, описана апробация полученных результатов.

В первой главе представлен обзор современной иностранной и российской научной литературы по теме диссертации. Аргументируется ценность С-квадруплексов ДНК в качестве терапевтической мишени. Описаны механизмы цитотоксического действия производных антрацендиона. Обосновывается перспективность новых соединений класса гетероаренантрацендионов (рис. 1А) для создания противоопухолевых препаратов направленного действия.

Во второй главе представлено исследование взаимодействия исходных гетероаренантрацендионов 1581 и 1794 (рис. 1Б) с ДНК разной структуры. Лиганды представляли собой антратиофендионы с двумя боковыми цепями в 4-ом и 11-ом положениях, этильными спенсерами и гуанидиновыми (соединение 1581) или ацетамидиновыми (1794) терминальными заместителями боковых цепей. Мишенями для связывания были следующие вторичные структуры ДНК: двойная спираль -ДНК тимуса телёнка (тимДНК), АТ-, ОС-, теломерный (с1я-1е1) дуплексы; С-квадруплексные структуры теломерной нуклеотидной последовательности (3(ТТАОСО)4 (01е1, антипараллельная (рис. 1В) и гибридная (рис. 1Г) конформации), последовательностями промоторных участков онкогенов с-МУС (ОсМУС (¡(АСООТОООО),) и с-К1Т (ОсЮТ1 с1(ССС А ООО СССТ СЮС АССЛ вев) и всКШ с!(ССО С СйО СССйА всо А вое в)) (параллельные конформации по типу (рис. 1Д)); неструктурированная ДНК - олигонуклеотид мутантной теломерной последовательности ш-1е1

((¡[ттасссттас;АС(ТТАССО)2]).

NH

1581 R =-NH

>4

1794 R=-NH

nh2

nh

ch3

Д

1. Структуры исследованных низкомолекулярных лигандов и модели мишеней - G-квадруплексных структур ДНК.

A. Направления модификации гетероаренантрацендионов. 1. Гетероциклическое ядро (X=NH, О, S; Y = СН, N). 2. Число боковых цепей и структура терминального заместителя в боковой цепи (R]; R2, R3). 3. Длина боковых цепей (n, к = 1,2, 3, 4).

Б. Исходные антра[2,3-6]гиофен-5,10-дионы ЛХТА-1581 и ЛХТА-1794.

B. Антипараллельный теломерный квадруплекс, формирующийся в присутствии Na+ (на основании структуры PDB ID 143D). Г. Гибридная конформация теломерного квадруплекса (К+, PDB ID 2JSM/2JSK). Д. Параллельный квадруплекс GcMYC (К+, PDB ID 1XAV). Серым обозначены гуанины гликозидной конформации син, белым - ан/ии-гуанины (Engelhart, Nucleic Acid-Metal Ion Interactions 2009).

Физические свойства лигандов

Показано, что соединения 1581 и 1794 поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой спектральных областях и флуоресцируют. Это позволяет исследовать их взаимодействие с ДНК оптическими методами. Выявлена агрегация изучаемых веществ в растворе, характерная для производных антрахинона (Lown, Biochemistry 1985). Межмолекулярная ассоциация осложняет исследование механизма связывания лигандов с ДНК.

Параметры связывания с ДНК дуплексами и теломерными С-квадрунлекеами

Батохромный сдвиг спектра поглощения лиганда 1794 в присутствии всех исследованных образцов ДНК (рис. 2А) свидетельствует об экранировании малой молекулы от растворителя при образовании комплекса. Для определения параметров связывания с дуплексами ДНК построены изотермы адсорбции в координатах Скэтчарда (рис. 2Б). Константы и стехиометрия связывания определены аппроксимацией изотерм уравнением Гурского-Заседателева (Заседателев, Молекулярная биология 1971), описывающим модель связывания протяжённого лиганда на бесконечной линейной матрице:

-^ = Кь-(1-пг)( 1 ™ уЛ

Cf l-(n-l)r

(1)

где Кь - константа связывания, п - максимальное количество пар оснований, которое может занять лиганд (стехиометрия), г — отношение концентрации связанного с ДНК лиганда к концентрации ДНК, Cf — концентрации свободного лиганда.

Поглощение, ОЕ_ г/С. 106 М"1

1 1 к

0,01

55о 600 650

А Длина волны, им Б г

Рис. 2. Связывание антратиофендиона 1794 с дуплексами ДНК разного нуклеотидного состава. А. Спектры поглощения 1мкМ 1794 при титровании тимусной ДНК. Б. Изотермы комплексообразования в координатах Скэтчарда: (•)тимДНК, (о) GC-дуплекс, (Т) АТ-дуплекс, (Д) ds-tel. Раствор содержал ЮОмМ NaCI. Спектрофотометр Jasco V-550, Япония.

Выявлена слабая предпочтительность антратиофендиона 1794 к АТ-богатым участкам двойной спирали ДНК (трёхкратная по сравнению с теломерным, GC-дуплексами и тимусной ДНК, для которых Kb=106 М"1), стехиометрия 3-5 пар нуклеотидов на молекулу соединения.

700

0.2

В случае теломерных в-квадруплексов спектры поглощения соединений отражали агрегацию лигандов на ДНК (наблюдалось две изобестических точки, рис. ЗА). С помощью деконволюции выделены спектры, соответствующие неагрегационному типу связывания, построены изотермы в координатах Лэнгмюра (рис. ЗБ). Параметры связывания определялись по уравнению 2:

Сь„а пК„С*

Св,л 1 + КьС*' (2)

где Кь - константа связывания, п - стехиометрия, С0ыа- концентрация ДНК, СЬпа -концентрация лиганда, связанного неагрегационным способом, С* - суммарная концентрация свободного лиганда и лиганда, связанного агрегационным способом.

Экстинкция. М 'см"1

2 ю

с/щнк]

Ь па -

550 600 650

Длина волны, нм

700

10°

10"'

с*. м

10"°

10-

Рис. 3. Взаимодействие 1794 с олигонуклеотидами теломерной последовательности. А. Спектры молярного поглощения 1794 при его титровании в раствор с 1мкМ(нитей) теломерного квадруплекса С1е1 в ЮОмМ №С1: (м) лиганд, связанный на ДНК неагрегационным образом (при малом заполнении ДНК), (•) агрегаты свободного лиганда, (о) несвязанные мономеры 1794.

Б. Изотермы связывания в координатах Лэнгмюра: с в-квадруплексом в (•) ЮОмМ №С1, (■) ЮОмМ КС1; (о) с неструктурированным олигонуклеотидом пИ:е1 в ЮОмМ №С1.

Методом изотермической титрационной калориметрии (ИТК, совместно с к.ф,-м.н. Цветковым Ф.О. (ИМБ РАН), таблица 1) подтверждено высокое сродство к ДНК дуплексу (Кь с^еГ-Ю6 М"1). Однако большая аффинность наблюдается к гибридной конформации теломерного квадруплекса (Кьс^к-Ю7 М"'). Удивительно, что константа ассоциации лиганда на неструктурированном олигонуклеотиде мутантной теломерной последовательности превосходит аффинность ко всем другим формам ДНК (Кь т-1с1~Ю8 М"1). Такая предпочтительность к т-(с1 может стать причиной структурного воздействия лигандов на теломерный О-квадруплекс.

Таблица 1. Константа и стехиометрия связывания лиганда 1794 с теломерными олигонуклеотидами, определённые по поглощению и методом изотермической титрационной калориметрии._____

Поглощение Kb, 106 M"1 n, молекул/ нить ИТК Kb, 106 M"1 n, молекул/ нить

ds-tel 1,4±0.1 4.7±0.1 ds-tel 2.2±0.1 5.6±0.1

GtelNa 2.7±0.6 3.0±0.2 GtelNa 0.9±0.1 3.0±0.1

GtelK 14±2 1.0±0.1 GtelK 11±2 7.0±0.1

m-tel 9.4±0.7 2.0±0.1 m-tel 200±70; 5.7±1.6 1±0.1; 5.8±0.1

Изменение структуры ДНК G-квадруплексов гетероаренантрацендионами

Спектры кругового дихроизма отражают стэкинг взаимодействие G-квартетов в квадруплексе (Gray, Chirality 2008). При связывании лигандов с антипараллельным теломерным G-квадруплексом, формирующимся в растворе с ионами Na+(pnc. 1В), наблюдалось значительное изменение спектров кругового дихроизма в области поглощения ДНК (рие. 4А). Такое же изменение спектров происходит при плавлении квадруплекса (рис. 4Б), следовательно, антратиофендионы нарушают стэкинг-контакты между G-квартетами.

20°С

260 280 300 д Длина волны, нм £

Рис. 4. Полное нарушение стэкинга в антипараллельном теломерном квадруплексе в ЮОмМ NaCl по спектрам кругового дихроизма: (А) в присутствии лиганда 1794: (о) GtelNa концентрацией 1мкМ(нитей); (•) при добавлении бмкМ лиганда; температура 20°С; (Б) при тепловой денатурации: (о) 20°С; (А) 60°С; (•) 75°С. Врезки: изменения сигнала в (А) 265 нм, (•) 295 нм. Спектрополяриметр Jasco 715, Япония.

240

260 280 300 320 Длина волны, нм

340

При добавлении соединений к теломерному квадруплексу в ЮОмМ NaCl наблюдалось уменьшение поглощения (гипохромизм) в длине волны 295 нм (рис. 5А), характеризующей присутствие G-квартетов (Mergny, FEBS Lett. 1998).

Разрушение Хугстиновских водородных связей в G-квартетах показано по исчезновению пиков иминовых протонов (рис. 5Б, В) в характерной (Adrian, Methods 2012) области 10-12 миллионных долей ЯМР спектра (совместно с Новиковым P.A., ИМБ РАН).

Рис. 5. Разрушение G-квартетов в теломерном квадруплексе в ЮОмМ NaCl в присутствии соединения 1794.

А. Поглощение в 295нм (из значения при текущей температуре вычтена величина поглощения при 90°С) (о) G-квадруплекса; (п) мутантного теломерного олигонуклеотида без G-квартетов; комплексов 1794:С-квадруплекс в отношении: (Ж) 1:1, (•) 6:1. Концентрации ДНК 1мкМ(нитей).

Спектры 'Н ЯМР теломерного квадруплекса. Б. Обзорный ЯМР спектр. В. Участок спектра ЯМР иминовых протонов (10-12 миллионных долей, соответствует Хугстиновским связям в G-квартетах). Нижние - без лиганда; верхние - комплекс 1794:квадруплекс в отношении 10:1 (ЮОмкМ 1794 и ЮмкМ(нитей) G-квадруплекса). Для подавления сигналов воды использовалась градиентная импульсная последовательность W5. Водный раствор содержал 8% D20, температура 7°С. Время накопления спектров 12 часов, ЯМР-спектрометр Bruker AMXIII-400 (400 МГц), Германия.

Компьютерное моделирование комплекса антипараллельного теломерного квадруплекса с лигандом 1794 методом молекулярной динамики (совместно с к.х.н, с.н.с. Цветковым В.Б., ИБМХ РАМН, ИНХС РАН) демонстрирует разрушение О-квартетов.

Подвижность в нативном полиакриламидном геле теломерного

олигонуклеотида, имеющего квадруплексную структуру, значительно выше, чем для

неструктурированной ДНК мутантной последовательности (рис. 6, вторая и третья

дорожки). При добавлении соединения 1794 к теломерному квадруплексу

подвижность олигонуклеотида не снижается, что свидетельствует о сохранении им

свёрнутой конформации (рис. 6, Зя и 4-6 дорожки).

Рис. 6. Сохранение структурированности сахарофосфатного остова теломерного

олигонуклеотида в ЮОмМ КаС1 при добавлении лиганда 1794. Электрофоретическая подвижность в нативном 16% полиакриламидном геле. Дорожки: (1) контроль, нт — количество нуклеотидов; (2) ш-1е1 - мутантный теломерный олигонуклеотид; С1е1 - в-квадруплекс: (3) концентрацией 20нМ(нитей) без лиганда; в комплексе с (4) 1мкМ, (5) 5мкМ, (6) ЮмкМ 1794.

В качестве мишеней опробованы также квадруплексы из промоторных областей онкогенов с-МУС и с-К1Т. В присутствии антратиофендионов спектры кругового дихроизма квадруплексов параллельной конформации (рис. 1Д) ОсМУС (рН 7.8), СсК1Т2 изменяются так же, как при плавлении квадруплекса без соединений. Следовательно, как и в случае теломерного квадруплекса, лиганд нарушает стэкинг-контакты в промоторных квадруплексах. Соединение 1581 индуцирует агрегацию квадруплексов ОсМУС (рН 6.5) и ОсКГП, что проявляется отрицательной полосой в спектрах кругового дихроизма (рис. 7А). Различие в действии на квадруплекс ОсМУС при разной кислотности раствора может быть связано с тем, что при рН 6.5 антратиофендионы менее гидрофобны из-за протонирования основных групп боковых цепей.

,ьш1е1_С1е1

+ 1794

О 1 5 ЮмкМ

40нтр

з:

2К8

А Длина волны, нм Б Длина волны, нм

Рис. 7 А. Агрегация квадруплекса GcKITl в присутствии 1581, выявленная методом кругового дихроизма. Врезка: изменения сигнала в 255 нм.

Б. Разрушение одного параллельного G-квартета в теломерном G-квадруплексе в ЮОмМ КС1 при добавлении лиганда 1794. Частичное нарушение стэкинга по спектрам кругового дихроизма: (о) 1мкМ(нитей) Gtel без лиганда, (•) с 9 мкМ 1794. Врезка: изменения сигнала в (Ж) 265 нм и (•) 295 нм. Раствор содержал ЮОмМ КС1.

Параметры взаимодействия, определённые аппроксимацией кривых изменения интенсивностей сигнала при титровании в одной длине волны уравнением, основанном на законе действующих масс (рис. 7А, врезка), показывают высокую аффинность (Кь~107 М"1) соединений к квадруплексам из промоторных участков онкогенов. Значит, такие структуры также являются мишенями для гетероаренантрацендионов.

Для теломерного G-квадруплекса в ЮОмМ КС1 (гибридной конформации, рис. 1Г) спектры кругового дихроизма (рис. 7Б) и величина поглощения в 295 нм показывают лишь частичную денатурацию структуры в присутствии соединений (разрушается один G-квартет).

Таким образом, охарактеризовано взаимодействие антратиофендионов с ДНК разной вторичной структуры. Впервые показано, что производные гетероаренантрацендионов изменяют структуру G-квадруплексов. Деструктивное влияние лигандов имеет некоторую общность - разрушаются G-квартеты в теломерных квадруплексах, квадруплексах из промоторов онкогенов c-MYC, c-KlT. Разрушение структурных единиц G-квадруплексов малыми молекулами наблюдалась ранее (например, для GcKIT (Waller, JACS 2009)), но для теломерного G-квадруплекса ДНК обнаружено впервые.

В третьей главе описана отработка методики массового отбора лигандов по аффинности и селективности к гибридному теломерному G-квадруплексу с учётом свойств гетероаренантрацендионов. В связи с образованием лигандами агрегационных комплексов, выбраны методы тушения флуоресценции, плавления, детектируемого по безызлучательному переносу энергии (FRET), в которых используются малые концентрации соединений. Более того, данные подходы позволяют быстро, массово проводить анализ соединений. Эти преимущества делают возможным выявление химических модификаций, необходимых для оптимизации структуры гетероаренантрацендионов как квадруплексных лигандов. Применявшиеся методы абсорбционной спектроскопии, изотермической титрационной калориметрии требуют больших концентраций и для поставленной «скрининговой» задачи не подходят.

На основании обобщения экспериментальных данных формализованы требования к биофизическим характеристикам и биологической активности квадруплексных лигандов (Neidle, FEBS J 2010). На молекулярном уровне они должны стабилизировать G-квадруплекс, иметь к нему высокую аффинность и предпочтительность связывания по сравнению с дуплексом ДНК. Молекулярной мишенью выбран гибридный теломерный G-квадруплекс GtelK (образующийся в присутствии ионов К+), так как он может формироваться в клеточных условиях, изучаемые производные гетероаренантрацендионов высокоаффинны к нему (таблица 1).

Сравнение аффинности гетероаренантрацендионов к гибридному теломерному G-квадруплексу методом вытеснения лигандом из ДНК флуоресцентного зонда

Аффинность соединений к теломерному G-квадруплексу в ЮОмМ KCl определена по тушению флуоресценции тиазолового оранжевого, вытесняемого лигандами из ДНК (метод G4-FID, рис. 8А). Проведено сравнительное исследование исходных антратиофендионов 1581, 1794 (рис. 1Б) и серии их структурных аналогов. Протестированы бисгуанидиновое производное с пиррольным гетероциклом (1815), антратиофендионы, содержащие в боковых цепях другие терминальные заместители: две метиламиногруппы (1120), одну гуанидино- и одну

аминогруппу (2100, 2106), гуанидино- и метиламиногруппу (2102, 2103). Кроме того, проведён анализ 4,11-диаминоантратиофендиона (2093), не имеющего боковых цепей, а также антратиофендионов, содержащих одну (2096, 2097) и три боковые цепи (2082) с терминальной гуанидиногруппой. Трисгуанидин 2082 (рис. 8Б) оказался лигандом, который вытесняет флуоресцентный зонд при наименьшей

концентрации.

Вытеснение тиазолового оранжевого, % 1001-1-1— -1--1-

n_^NH 3HCI н nh,

0.5 1 1.5 2 2 5

концентрация лиганда, мкМ

Рис. 8 А. Связывание гетероаренантрацендионов с гибридным теломерным в-квадруплексом, опеределённое методом 04-РШ. Соединения: (■) 1581, (♦) 1794, (а) 1815, (•) 1120, (□) 2100, (х) 2106, (0) 2102, (Д) 2103, (Ж) 2093, (+) 2096, (о) 2097, (Т)2082. Раствор содержал ЮОмМ КС1, 0.25мкМ(нитей) теломерного олигонуклеотида, 1мкМ тиазолового оранжевого.

Б. Соединение-лидер //-(2-гуанидиноэтил)-4,11 -бис(2-гуанидиноэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-6]тиофен-2-карбоксамид.

Впервые выведена формула для оценки константы связывания лиганда с ДНК по изменению флуоресценции тиазолового оранжевого в присутствии лиганда:

К.

Ж I(L)

-1

1 + K.F

(3)

где Kb fid и Kf - константы связывания лиганда и зонда с мишенью, L и F — их концентрации; 1(0) и I(L) — флуоресценция тиазолового оранжевого без лиганда и при его концентрации L. Данное соотношение основывается на законе действующих масс и пропорциональности интенсивности флуоресценции концентрации флуорофора. Константы связывания, определённые по формуле 3, представлены в таблице 2. Возможность оценки аффинности при физиологической температуре является достоинством метода. Однако необходимость тестирования тушения при нескольких концентрациях лиганда замедляет отбор.

Определение влияния структуры гетероаренантрацендионов на сродство и селективность к теломерному G-квадруплексу методом плавления по FRET

Самым массовым подходом для сравнения малых молекул является метод плавления по FRET (безызлучательному переносу энергии между флуорофором и тушителем, ковалентно связанными с 5'- и З'-концами теломерного олигонуклеотида). Для качественной оценки аффинности достаточно определить стабилизационный эффект лиганда на квадруплекс при одной подобранной заранее концентрации (рис. 9). Селективность квадруплекс/дуплекс оценивается по степени уменьшения стабилизационного эффекта в присутствии дуплекса, конкурирующего за связывание с лигандом.

Флуоресценция, уе Рис. 9. Плавление флуоресцентно меченого

теломерного квадруплекса Gtel|< по FRET. Кривые плавления при разных концентрациях 1581: (о)ОмкМ, (м) 0.05мкМ, (о) О.ЗмкМ, (♦) 0.5мкМ, (0) 1мкМ, (•) ЗмкМ. Концентрация квадруплекса 0.2мкМ(нитей). Раствор содержал ЮмМ KCl, 80мМ LiCl. Температура плавления свободного GtelK ТМ=65±0.4°С. w - ширина перехода (плавления). Прибор Applied Biosystems

"20 30 40 50 60 70 so 90 7500 RT-PCR system, США.

Температура, °С

Для изучения возможности модулирования аффинности и селективности лигандов к G-квадруплексу за счёт уменьшения или увеличения стэкинг-взаимодействий с G-квартетом проведено сравнительное исследование бис(гуанидино)антратиофендиона 1581 и серии его аналогов, различающихся структурой гетероциклического фрагмента (рис. 10А). Аналоги с пиррольным (1815), фурановым (1816) и пиразольным (1817) гетероциклами продемонстрировали несколько больший стабилизационный эффект по сравнению с антратиофендионом 1581 (15°С для 1817 против 12°С для 1581).

В присутствии самокомплементарного олигонуклеотида ds26 (5'-d(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG)-3'), образующего дуплекс, стабилизация плавления квадруплекса заметно снижалась. Селективность квадруплекс/дуплекс, определённая по формуле 4

sfRET = дтм (+10мкМ ds2ô/атм, (4)

невелика и максимальна для соединения 1817 с пиразольным ядром (0.2 доли от 1).

О

о <

20

10

т

_ г _............

1 - ш Ш 1 •X» •>>

lüi $ 1 к >:•:• m Ш

21b. К*, gg « •M» ш m

1581 1815 1816 1817

cnoosooo—i 00 «rHfvt^-H-'Oin

В

Рис. 10. Стабилизация гибридного теломерного G-квадруплекса в ЮОмМ KCl (GtelK) гетероаренантрацендионами, определённая методом плавления по FRET. А. Роль гетероцикла лиганда. Б. Влияние терминальных заместителей боковых цепей. Врезка: стабилизационный эффект лигандов 1518, 2106, 2015 на GtelK в присутствии конкурирующего дуплекса ds26: штрихованные колонки -ОмкМ(нитей), серые - ЗмкМ(нитей), чёрные - ЮмкМ(нитей) ds26, что соответствует 0-, 65- и 217-кратному избытку концентрации дуплекса (в парах оснований) над концентрацией квадруплекса (в квартетах оснований). В. Роль числа боковых цепей. Г. Влияние длины боковых цепей антратиофендионов с различными терминальными основными группами: две аминогруппы - 1502 (2), 2014 (3), 2015 (4), 2332 (5), 2333 (6); две гуанидиногруппы - 1581 (2), 1982 (3), 1983 (4); три гуанидиногруппы - 2082 (2), 2247 (3), 2399 (5). В скобках указано число метиленовых звеньев в боковых цепях, расположенных в положениях 4, 11 хромофора. Концентрация квадруплекса - 0.2мкМ(нитей), лигандов — 1мкМ.

Известно, что гуаниднно- и амидиногруппы уменьшают проникновение соединений в клетку (Sun, J Med Chem 2009). Для оценки влияния структуры терминальных основных групп лигандов на базе гетероаренантрацендионов была исследована серия аналогов 1581, содержащих одну гуанидино- и аминогруппу (2100, 2102, 2106), две аминогруппы (2015, 1120) или две ацетамидиногруппы -(1794, 1795) (рис. 10Б). Лучшими стабилизаторами оказались антратиофендионы, содержащие терминальные аминогруппы (2106 (9.9°С), 2015 (12.2°С)), что может объясняться большей способностью первичной аминогруппы образовывать водородные связи по сравнению с метиламиногруппами (2102, 2103, 1120 -ДТМ<6°С) и ацетамидинами (1794, 7°С). Кроме того, аналог 2015 имеет большую селективность связывания квадруплекс/дуплекс по сравнению с бисгуанидиновым 1581 (рис. 10Б, врезка). Таким образом, полученные результаты показали возможность замены гуанидиногрупп в гетероаренантрацендионах на первичные аминогруппы без существенного снижения аффинности лигандов.

Заряжаемые при связывании (in situ) боковые цепи лигандов играют важную роль в ассоциации с ДНК благодаря электростатическому взаимодействию с сахарофосфатным остовом. Поскольку G-квадруплексные структуры имеют четыре бороздки, увеличение числа боковых цепей в лиганде может усилить связывание. Такой эффект наблюдался для акридиновых соединений BSU6039, BRACO-19 (2, 3 боковых цепи соответственно, рис. 10В, Read, PNAS 2001).

Для определения роли числа боковых цепей в связывании антратиофендионов с теломерным G-квадруплексом исследована серия аналогов бисгуанидина 1581, содержащих одну (2096), три боковые цепи (2082), а также не имеющий боковых цепей антратиофендион 2093 (рис. 10В). Введение третьей боковой цепи, содержащей терминальную гуанидиногруппу, увеличило стабилизационный эффект антратиофендиона 2082 в 2 раза по сравнению с бисгуанидином 1581. Соединение 2082 с тремя цепями проявляет себя как стабилизатор на уровне наиболее активных известных квадруплексных лигандов. Таким образом, число катионных боковых цепей является критически важным для связывания лигандов на основе гетероаренантрацендионов с Gtel.

На примере антратиофендионов 2100 и 2106 (этиловый и пропиловый спейсер

соответственно) показано, что длина боковой цепи оказывает существенное влияние на стабилизацию и связывание с теломерным квадруплексом (ДТ„ 5°С против 9.9°С, рис. 10Б, таблица 2). Поэтому было проведено сравнительное исследование аффинности серии аналогов бисгуанидина 1581, бисамина 2015 и трисгуанидина 2082 с разной длиной боковых цепей (рис. ЮГ). Оказалось, что лучшую стабилизацию квадруплекса вызывают лиганды 2015,1982, 2247, имеющие боковые цепи с пропильными или бутильными спейсерными группами.

Итак, методом плавления по FRET выявлено, что для высокой стабилизации квадруплекса антратиофендионы должны содержать три боковые цепи с амино- или гуанидиногруппами, связанными спейсерами, содержащими от 3 до 5 метиленовых звеньев. С учётом этих данных в НИИ ИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН были синтезированы новые антратиофендионы 2400 (три аминогруппы) и 2413 (две амино- и одна гуанидиногруппа) с целью повышения селективности связывания с G-квадруплексом (рис. 11).

О X X

оно < s а

m

Рис. 11. А. Стабилизация квадруплекса в присутствии разных концентраций дуплексной ДНК (1з26: штрихованные колонки — без (^26, серые — ЗмкМ(нитей), чёрные — ЮмкМ(нитей) дуплекса, что соответствует 0-, 65- и 217-кратному избытку концентрации дуплекса над концентрацией квадруплекса. Б. Селективность соединений к О-квадруплексу по сравнению с дуплексной ДНК, рассчитанная по формуле 4.

Лиганд 2400 вызывал меньшую стабилизацию, чем трисгуанидин 2247. Соединение 2413 с двумя амино- и одной гуанидиногруппой сочетает в себе очень высокую стабилизацию (на уровне квадруплексного лиганда В1Ъ\СО-19,

19

рис. НА) и исключительную селективность связывания (рис. 11 Б, таблица 2). На рис. 11 для сравнения также представлены стабилизационные эффекты и селективности гетероаренантрацендионов с двумя боковыми цепями 1581, 2015, 2332, трисгуанидинов 2082, 2247, 2399 и клинически применяемых препаратов митоксантрона (MTX) и доксорбицина (DOX).

С использованием взаимосвязи равновесных концентраций компонентов реакции и свободной энергии Гиббса была выведена формула для оценки константы связывания малой молекулы с мишенью (квадруплексом) и конкурентом (дуплексом) по величине стабилизации плавления мишени:

ехр(4——)-1 ехр(4АТ"'~АТ'"А)-1

К__W т^__w_

^Ь FRET — ^ i ""Ь A FRET _ д > (■>)

где ДТт, ДТтЛ - сдвиги температуры плавления мишени, вызванные связыванием с лигандом без и в присутствии конкурента; w - ширина кривой плавления свободного олигонуклеотида (см. рис. 9); L, А - концентрация лиганда, конкурента. Недостаток такой оценки в том, что константа соответствует температуре плавления 65°С. Константы, не зависящие от соотношения концентраций, лучше стабилизационных сдвигов подходят для сравнения лигандов.

На основании кривых вытеснения тиазолового оранжевого (G4-FID, рис. 8, уравнение 3) и стабилизационных эффектов (плавление по FRET, уравнение 5) получены оценки констант связывания гетероаренантрацендионов с теломерным G-квадруплексом и дуплексом ДНК (таблица 2). Константы, определённые методом G4-FID, согласуются с данным изотермической титрационной калориметрии (НТК), полученными совместно с к.х.н, с.н.с. Митькевичем В.А. (ИМБ РАН). Получаемые массовым методом плавления по FRET константы связывания подходят для сравнения аффинностей лигандов между собой. Ранжирование лигандов, построенное по FRET, соответствует иерархиям G4-FID и НТК.

Новые производные гетероаренантрацендионов подавляют активность теломеразы в микромолярных концентрациях (как показали к.х.н., доцент Зверева М.Э., Ажибек Д.М. (МГУ)), а также имеют антипролиферативный эффект на опухолевые клетки (профессор Baizarini J., Rega Institute for Medical Research) (Ilyinsky, Eur J Med Chem 2014).

Таблица 2. Константы связывания гетероаренантрацендионов с ДНК, определённые методами вытеснения тиазолового оранжевого (G4-FID), изотермической титрационной калориметрии и плавления по FRET; селективность связывания с

G-квадруплексом.

Лнганд GtelK+ дцДНК Кь gteik/ Кь диднк Sfret (АТМ (ЮмкМ дцДНК/ АТМ)

K-b g4-f1d, 10б M"1, 25°С Кь нтк, 10б М"', 25°С К.ь fret, Ю6 М"1,65°С Kb fret, Ю М"',65°С

1581 8±2 - 7±3 0.11 ±0.03 65 0.1

1815 5±1 - 12±3 0.26±0.08 45 0

1816 .* - 12±4 0.2±0.1 60 0.1

1817 - - 13±4 0.26±0.06 80 0.2

1120 11±2 1.6±0.3 1.1±0.8 - - -

2102 6±1 5±1 1.6±0.4 - - -

1794 8±2 11±2 2.3±0.9 - - -

1795 - - 1.7±0.5 - - -

2100 12±2 11±2 1.5±0.7 - - -

2106 9±1 3.7±0.7 5±2 0.04±0.02 120 0.4

2015 - - 7±1 0.05±0.02 150 0.4

2093 1.3±0.3 - -0.01 - - -

2096 2.1±0.7 0.5±0.1 0.1±0.2 - - -

1982 - - 10±2 - - -

2332 - - 6±1 0.03±0.01 180 0.5

2082 16±4 - 98±26 1.0±0.3 110 0.2

2247 - - 110±33 0.13±0.05 850 0.6

2413 - 20±3 86±3 0.013±0.003 6500 0.9

DOX - 0.18±0.03 1.1±0.6 - - -

* Не тестировалось.

Таким образом, были выведены формулы оценки констант связывания и отработаны методики проведения экспериментов, позволяющие проводить массовое тестирование соединений с целью отбора квадруплексных лигандов. Для серии гетероаренантрацендионов выявлены важные закономерности о связи структура-аффинность, позволившие получить новое производное 2413, значительно превосходящее по параметрам связывания исходные лиганды (1581, 1794) и имеющее аффинность к мишени на уровне наиболее активных из известных в литературе квадруплексных лигандов (ДТМ=25.7°С, Кь~107 М"1, кит^0.9,

Кь Ссж/Кь дцД11К~Ю3).

выводы

1. Впервые установлено, что лиганды на основе гетероаренантрацендионов вызывают разрушение гуаниновых квартетов теломерного G-квадруплекса, квадруплексов из промоторов онкогенов c-MYC, c-KIT.

2. Отработана методика для быстрого определения аффинности агрегирующих малых молекул к ДНК-мишеням. Новые методы оценки констант связывания лигандов по величине стабилизации квадруплекса и доле вытеснения флуоресцентного зонда дают результаты, согласующиеся с общепризнанными подходами. Методика позволяет проводить массовый быстрый анализ лигандов с использованием малого количества реагентов.

3. В результате исследования серии из 40 лигандов на основе гетероаренантрацендионов выявлен ряд закономерностей о связи их свойств со структурой. Установлено, что высокое сродство лигандов обеспечивается терминальными гуанидино- и аминогруппами боковых цепей. Селективность связывания лигандов с G-квадруплексными структурами ДНК повышается при введении в гетероаренантрацендионы трёх боковых цепей с основными группами.

4. Выявленные закономерности структура-активность позволили провести направленную оптимизацию гетероаренантрацендионов, в результате которой получен селективный G-квадруплексный лиганд, способный ингибировать теломеразу и блокировать пролиферацию опухолевых клеток.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.С. Ильинский. A.M. Варижук, А.Д. Вениаминов, М.А. Пузанов, А.К. Щёлкина, Д.Н. Калюжный G-квадруплексные лиганды: механизмы противоопухолевого действия и связывания с мишенью // Молекулярная биология. - 2014. - Т. 48, № 6. - С. 893-909. (из перечня ВАК).

2. N.S. Ilvinskv. A.K. Shchyolkina, O.F. Borisova, O.K. Mamaeva, M.I. Zvereva, D.M. Azhibek, M.A. Livshits, V.A. Mitkevich, Jan Baizarini, Y.B. Sinkevich, Y.N. Luzikov, L.G. Dezhenkova, E.S. Kolotova, A.A. Shtil, A.E. Shchekotikhin, D.N. Kaluzhny Novel multi-targeting anthra[2, 3-Z>]thiophene-5,10-diones with guanidine-containing side chains: Interaction with telomeric G-quadruplex, inhibition of telomerase and

22

topoisomerase I and cytotoxic properties // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - Vol. 85. - pp. 605-614. (из перечня ВАК).

3. D Kaluzhny, N Ilyinsky. A Shchekotikhin, Y Sinkevich, PO Tsvetkov, V Tsvetkov, A Veselovsky, M Livshits, О Borisova, A Shtil, A Shchyolkina Disordering of human telomeric G-quadruplex with novel antiproliferative anthrathiophenedione // PLOS ONE.- 2011.-Vol. 6,№ 11.-e27151.(из перечня ВАК).

4. D.N. Kaluzhny, А.К. Shchyolkina, N.S. Ilyinsky, O.F. Borisova and A.A. Shtil. Novel indolocarbazole derivative 12-(a-L-arabinopyranosyl)indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-5,7-dione) is a preferred c-Myc guanine quadruplex ligand // Journal of Nucleic Acids. - 2011,- Vol.2011.- 184735. (из перечня ВАК).

5. Щекотихин А.Е., Тихомиров А.С., Ильинский Н.С.. Калюжный Д.Н., Щелкина А.К., Борисова О.Ф., Лившиц М.А., Цветков В.Б., Бычкова Е.Н., Малютина Н.М., Деженкова Л.Г., Штиль А.А., Преображенская М.Н. Новые лиганды G-квадруплексов на основе гетероаренантрацендионов, ингибирующие рост опухолевых клеток (патент на изобретение №2527459).

6. N.S. Ilyinsky. А.К. Shchyolkina, O.F. Borisova, М.А. Livshits, M.I. Zvereva, D.M. Azhibek, V.B. Tsvetkov, A.A. Shtil, A.E. Shchekotikhin, D.N. Kaluzhny. Novel antraquinone derivatives have dual targeting to telomeric G-quadruplex and double stranded DNA // Book of abstracts of 4th International Meeting on Quadruplex Nucleic Acids. - Nanyang Technological University, Singapore, 2013. - p. 103.

7. A.E. Shchekotikhin, L.G. Dezhenkova, V.A. Glazunova, D.N. Kaluzhny, N.S. Ilyinsky. A.A. Shtil, M.N. Preobrazhenskaya, J.-J. Lin, H.-S. Huang. Novel anthrathiophene derivatives bind telomeric G-quadruplex and inhibit telomerase // Annals of Oncology 21. -2010. - Supplement 2. - pp. ii32-ii33.

Автор выражает глубокую благодарность за сотрудничество в исследовательской работе д.х.н., в.н.с. А.Е. Щекотихину (НИИНА РАМН), д.м.н., заведующему Лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН А.А. Штилю, а также д.ф.-м.н., в.н.с. А.К. Щёлкиной, д.ф.-м.н. О.Ф. Борисовой, д.ф.-м.н., гл.н.с. М.А. Лившицу (Лаборатория ДНК-белковых взаимодействий ИМБ РАН) за помощь в интерпретации экспериментальных данных.

Ильинский Николай Сергеевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕТЕРОАРЕНАНТРАЦЕНДИОНОВ С в-КВАДРУПЛЕКСАМИ ДНК - ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ

МИШЕНЬЮ

Автореферат

Подписано в печать 22.10.2014. Формат 60 х 84 1/16. Усл. печ. л. 1,25.

Тираж 100 экз. Заказ № 389. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)" Отдел оперативной полиграфии "Физтех-полиграф" 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9