Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

СУРИНА ЕЛИЗАВЕТА РАФАЭЛЕВНА

ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка 8ир35р дрожжей Басскаготусез сеге\п$1ае

03.01.03 - молекулярная биология

005535025

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 7 ОКТ 2013

Москва 2013

005535025

Работа выполнена в лаборатории оптимизации экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Беневоленский Сергей Владимирович

ИНБИ РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

ЗАО «АГРИ», г. Москва Машко Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор, ОАО «Всероссийский научный центр

молекулярной диагностики и лечения» Свешников Пётр Георгиевич

Ведущая организация: ФГБУ НИИ вирусологии им.

Д.И. Ивановского

Защита диссертации состоится 2013 года в « » часов на заседании

Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИГенетика») по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при

ФГУП «ГосНИИГенетика».

Реферат разослан » 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Прионы - это особый класс инфекционных агентов, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Их отличие от всех других патогенов состоит в отсутствии генома, состоящего из нуклеиновой кислоты. Их инфекционные свойства связаны с белком РгР, открытым С. Прузинером в 80-х годах прошлого века. Этот гидрофобный, асоциированный с мембраной белок может существовать в двух различных конформационных формах: инфекционной (РгР50) и неинфекционной (РгРс), причем РгР5с способна катализировать превращение РгРс в РгР5с посредством белок-белковых взаимодействий. Белок РгР в инфекционной изоформе проявляет склонность к агрегации; кроме того, РгР5с отличается от РгРс повышенным содержанием Р-слоев и устойчивостью к действию детергентов и протеаз.

Белковые агрегаты могут образовываться не только при прионных заболеваниях. По своей природе прионы очень напоминают другой широко распространенный феномен -амилоиды. Амилоиды - это нерастворимые фибриллярные отложения белков, накашивающиеся при некоторых болезнях человека, называемых амилоидозами. Несмотря на разницу в структуре и функции амилоидогенных белков, все они формируют похожие по свойствам фибриллы

В 90-х годах прошлого века прионы были найдены у дрожжей 8ассНаготусе$ сегехч$1ае, а также у мицелиального гриба РоЛозрога атегта и некоторых других эукариот. В отличие от человека и млекопитающих, подверженных нейродегенеративным прионным заболеваниям, низшие эукариоты при переходе белков в автокаталитически поддерживаемое прионное состояние приобретают нехромосомно наследуемые признаки, зачастую эволюционно прогрессивные.

Нехромосомно наследуемый детерминант [Р5/+] дрожжей ЗассИаготусея сегеУ131ае является фенотипическим отражением прионного состояния белка Бир35р - члена семейства факторов терминации трансляции еЛРЗ. Среди прионных детерминант низших эукариот [Р57+] является наиболее хорошо изученным.

Как известно, дрожжи - это классический модельный объект генетических и молекулярно-биологических исследований. Поскольку прионы дрожжей не передаются человеку, изучение прионного феномена на дрожжевых моделях представляется безопасным и перспективным подходом к разработке систем диагностики и лечения прионных заболеваний.

Аптамеры (лат. арШ5 - подходящий) - это молекулы однонитевой РНК или ДНК, которые связывают избранную мишень с высокой аффинностью и специфичносгью за сч&г своей вторичной и третичной структуры. Именно вторичная структура аптамера позволяет ему образовывать с мишенью гидрофобные, водородные и электростатические контакты. Известно, что основными элементами вторичной структуры аптамеров являются короткие двуточечные участки, образованные за счет комплементарной, спаривания оснований, и одноточечные петли. При этом одноточечные участей аптамера отвечают за специфичность взаимодействия аптамера с мишенью, а двухцепочечные стабилизируют структуру аптамера и обеспечивают правильное расположение функциональных трупп для узнавания аптамером мишени [Кульбачинский,

2006].

Аптамеры по су-™ являются аналогами моноклональных шггител. Соответственно, основные области применения аптамеров и атгаггел совпадают - аптамеры могут использоваться как в протеомике, для изучения пространственных структур и функциональных свойств белков, так и в медицине, для диагностики и лечения ряда

заболеваний.

Явление прионного перехода мономер -> полимер до сих пор до конца не изучено, и использование аптамеров является перспективным подходом к исследованию прионного феномена и лечению приемных болезней. На данный момент получены аптамеры как к белкам РгР различных млекопитающих, так и к некоторым амилоидным белкам человека.

Поскольку прионные и амилоидные фибриллы, образованные не родственными по первичной последовательности белками, сходны между собой, структурно-чувствительные аптамеры, полученные к фибриллярной форме дрожжевого прионного белка ЭирЗЗр, могут иметь сродство к прионным и амилоидным полимерам других белков. Такие аптамеры могут послужить основой для разработки инструмента диагностики известных и неизвестных прионов.

Цели работы:

1) Получение аптамеров, распознающих фибриллярные формы белка 8ир35р, но не имеющие сродства к его растворимой форме.

2) Характеристика полученных аптамеров; проверка их сродства к другим прионным

и амилоидным белкам.

Экспериментальные задачи:

1) Выделить рекомбинантный фрагмент NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae в препаративных количествах из клеток Escherichia coli.

2) Полимеризовать препарат мономера Sup35NM и охарактеризовать полученные фибриллы. Составить мишень для SELEX из полимеров белка Sup35NM.

3) Отобрать аптамеры к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM.

4) Охарактеризовать полученные аптамеры: проанализировать первичные последовательности, найти возможные группы гомологии, выбрать последовательности для химического синтеза. Отследить возможные особенности вторичной структуры избранных аптамеров при помощи компьютерных программ.

5) Подтвердить специфичность избранных аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM, измерить Kd комплексов [аптамер-фибриллярный Sup35NM] для избранных аптамеров.

6) Проверить специфичность охарактеризованных аптамеров к не растворимым в детергентах агрегатам белка Sup35p, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Определить сродство аптамеров к не растворимым в детергентах агрегатам ряда других амилоидогенных белков, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Научная новизна:

1) Впервые получены аптамеры к белку Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Эти аптамеры распознают фибриллярные формы белка Sup35p, но не имеют сродства к его растворимой форме.

2) Доказано, что химический синтез избранных аптамеров с 5'-биотином не препятствует специфическому связыванию их с мишенями. Таким образом, стрептавидин-биотиновая система применима для детекции специфического связывания аптамеров с мишенями в любом из протоколов.

3) Изучены особенности первичной последовательности и вторичной структуры ряда полученных аптамеров.

4) Впервые проведйн масштабный анализ выборки аптамеров с итоговым разбиением их на группы по кросс-специфичности к различным прионным и амилоидным белкам.

5) Впервые в одной выборке получены и охарактеризованы аптамеры как с широким, так и с узким спектром специфичности. Впервые получена выборка аптамеров,

распознающих альтернативную мишень (агрегаты РгР) с той же специфичностью, что и собственную (полимеры 8ир35ЫМ).

Структура диссертации:

Диссертация включает: 1) Введение, 2) Обзор литературы, 3) Материалы и методы, 4) Результаты, 5) Обсуждение, 6) Выводы, 7) Список литературы.

Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 17 рисунками и 20 таблицами.

Список цитируемой литературы содержит 157 ссылок.

Апробация работы и публикации:

Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Биотехнологии будущего», Санкт-Петербург, Россия, 2006; 34-м Конгрессе FEBS "Life's Molecular Interactions", Прага, Чехия, 2009; Международной научной школы-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, Москва-Пушино, 2009; а также на совместном заседании межлабораторного семинара Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и Секции молекулярной биолог™ Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 апреля 2013 года.

По основным результатам диссертации опубликовано 2 статьи, подана 1 заявка на патент РФ, также имеются материалы в сборниках 3 конференций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 5V-H19 [PSI*]. [PIN+] (чггамм с «сильным» прионным фенотипом, выделение прионных агрегатов- Sup35p), 5V-H19 [Р5/+]„ [PIN+] (штамм со «слабым» прионным фенотипом, выделение прионных агрегатов Sup35p), 74-D694 [psi-] [PIN*] (гиперпродуцекг Sup35p, в клетках содержатся амилоидные агрегаты Sup35p), 74-D694 [psi-] [PIN*] (агрегаты прионного белка Rnql), 74-D694AKM21 [/»<-] (продуцент РгР,о-23.). 74-D694AS35 [pin-] (гиперпродукция 103Q-GFP), 74-D694 [psi] [pin] (отрицательный контроль), любезно предоставил д.б.н. чл.-корр. РАН М. Д. Тер-Аванесян. Клетки £ cerevisiae выращивали при 30°С в полной (среда YPD: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы) или синтетической среде с селективными добавками (Среда SC: 0,67% YNB (Difco), 2% глюкозы,

необходимые аминокислоты).

Основные буферы, использованные в работе:

А - 5mM Na2HP04, 150тМ NaCl, азид натрия 0,01%, 200тМ мочевины, 2тМ MgCl2, рН 7,4.

Р - 5mM Na2HP04, 150mM NaCl, азид натрия 0,01%, pH 7,4.

PSU - 5mM Na2HP04,150mM NaCl, 0,2 mM мочевина, pH 6.

Аптамеры получили на основе библиотеки (libS) следующего состава: 5'-GGGTACCTGAAGCACTAATCTATGC-40N-ACCTTATGTTGTAGCATCTGCAGCC-3', где N - любой нуклеотид. Для амплификации использовали праймеры

dirS 5 '-GGGTACCTGAAGCACTAATCTATGC-3'

и revS 5'-GGCTGCAGATGCTACAACATAAGGT -3'.

Для анализа последовательностей аптамеров использовали пакеты программ DNA-SUN (ГосНИИ «Генетика») и Vector NT1 (Invitrogen). Для расчёта значений констант диссоциации комплекса аптамер-фибриллярный Sup35NM использовали ENZFITTER (version 1.05(CGA)). Для поиска последовательностей предположительных G-квартетов в последовательностях аптамеров использовали онлайн-программу QGRS Mapper (htto://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analvze.php). Для предсказания вторичных структур аптамеров использовали онлайн-программу OligoAnalyzer 3.1 фирмы Integrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/analv7:er/ApDlications/01igoAnalvzer/').

В ИФА-подобном протоколе в 96-луночные иммунологические планшеты ("Linbro", Великобритания) вносили аликвоты препаратов белка Sup35NM в мономерной или полимерной форме в буфере А. Далее следовала сорбция, затем - этапы промывки и блокировки неспецифического связывания. На стадии специфического связывания антитела заменили аптамерами, меченными биотитом, в концентрации 15 нМ. После отмывки в лунки вносили коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином ("ИМТЕК", Москва). Цветную реакцию проявляли о-фенилендиамином ("Sigma"). Считывание на планшетном ридере Multiscan проводили при длине волны 490нм.

Выделение не растворимых в детергентах агрегатов различных белков из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и электрофорез в полуденатурирую тих условиях в агарозном геле проводили согласно ранее описанной методике [Kushnirov etal., 2006].

Специфическое окрашивание белков на нитроцеллюлозных мембранах производили растворами биотинилированных аптамеров в концентрации 12 нМ в буфере PSU. Окрашивание проявляли при помощи диаминобензидина или флюоресцентного реагента ECL (ThennoScientific, США) согласно инструкции производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение рекомбинантного фрагмента NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Штамм Е. coli BL21(DE3) («Invitrogen») трансформировали экспрессионной плазмидой pET30a-Sup35NM-His6 (любезно предоставлена Д.б.н. чл.-корр. РАН М.Д. Тер-Аванесяном). Полученные трансформанты выращивали при 37°С на ротационной качалке на питательной среде, содержащей канамицин, до достижения 0п6„„=0,8-1,0, затем вносили индуктор изопропилтиогалактозид и инкубировали в течение 3 часов. Клеточный осадок ресуспендировали в равном объеме лизирующего буфера, и клетки разрушай в ультразвуковой ванне. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, супернатант наносили на колонку Ni-CAM™ (Sigma), аффинную к белкам, содержащим 6-гистидиновую метку. После промывки буфером для лизиса сорбированный Sup35NM смывали градиентом концентрации имидазола согласно инструкции производителя.

Для очистки от низкомолекулярных полигистидин-содержащих фрагментов Sup35NM мы провели ионообменную хроматографию на СМ-сефарозе; колонку (HR5/5, "Pharmacia") уравновешивали буфером с 8М мочевиной, и наносили SuP35NM-содержащий элюат с Ni-CAM колонки. Колонку промывали до достижения базового значения оптической плотности, измеренного при помощи проточного УФ-спектрофотометра. Элюцию производили градиентом NaCl. На рис. 1 приведен результат сравнительного электрофореза образцов после Ni-CAM и СМ-хроматографии.

Таким образом, в результате двух последовательных хроматографии целевой мономер оказался очищенным от различных примесей примерно на 95%. Процедура обеспечила выделение примерно 1 мг белка из 20 мл осветленного лизата. Концентрация конечного продукта, оцененная по электрофорезу (см. рис. 1), составляет примерно 3 мг/мл

(111мкМ).

Рисунок 1. Сравнение образцов белка после №-САМ и последующей СМ-хроматографии при помощи электрофореза в 10% ПААГ. Дорожки: 1 -элюат с №-САМ колонки (10 мкл), 2 - бычий сывороточный альбумин (1 мкг), 3 - элюат с СМ-сефарозы (2 мкл). Стрелка указывает на полосу, соответствующую мономеру Sup35NM.

i -5up35NM

\<r—

2. Полимеризация рекомбинантного белка Sup35NM in vitro.

После получения мономера , белка Sup35NM- перед нами встала задача его полимеризации, то есть получения фибрилл - непосредственной мишени SELEX. При этом, фибриллы-мишени по возможности должны были быть гетерогенными, чтобы в результате SELEX получились аптамеры широкого спектра специфичности. В рамках этой задачи мы провели ряд опытов по подбору условий полимеризации и отделения полимеров Sup35NM. Мы варьировали состав буфера, температуру полимеризации; подобрали условия разделения полимеров и мономеров; выяснили, что оптимальным методом разделения служит центрифугирование на микроцентрифуге. Также мы оценили влияние ультразвуковой обработки и заморозки на картины электрофоретического разделения полимеров.

Для оценки полимеризации мы использовали тест, основанный на том, что прионные фибриллы устойчивы к обработке додецилсульфатом натрия, и разлагаются до мономеров только при высоких температурах в присутствии денатурирующих агентов, в отличие от неспецифических агрегатов мономеров [Kryndushkin etal., 2003].

После того, как все условия были подобраны, мы получили и охарактеризовали большой объем фибрилл - мишеней SELEX. Для этого мы центрифугировали 2 мл (6 мг) мономера Sup35NM в течение 20 минут при 16000 g с целью очистки от возможных преформированных агрегатов, супернатанты перенесли в чистые микроцентрифужные пробирки и разбавили буфером Р в 33 раза. Половину объёма пробы инкубировали в холодильнике при 8°С на шейкере для иммуноферментного анализа в течение 63,5 часов, вторую половину инкубировали при 37°С на ротационной качалке в течение 63,5 часов. В таблице 1 приведен результат измерения белка в полученных пробах до и после центрифугирования. На рис. 2 приведён результат контрольного электрофореза в полиакриламидном геле.

Таблица 1. Измерение концентрации белка по методу Брэдфорд в образцах,

полимеризованных при 8°С и 37°С, до и после центрифугирования

^"^^Условия полимеризации Центрифупфование~"~'-\_ Полимериза ция при 8°С, (мкг/мл) Полимериза ция при 37°С, (мкг/мл)

Общий белок 28,5 53

Супернатанты 18 20

1 2 3 4 5 6 7 8

Mi

Рисунок 2. Оценка полимеризации 5иР35НМ при 8°С и 37°С. Электрофорез белков в полиакриламидном геле, окраска Кумасси. Дорожки: 1,2 - супернатант (8°С), 3,4 -осадок (8°С), 5,6 - осадок (37°С), 7 - супернатант (37°С). Дорожки 1,3,5,7 - пробы инкубировали с додецилсульфатом натрия при 37°С, дорожки 2,4,6,8 - пробы кипятили с додецилсульфатом натрия.

Мишень для ЭЕЬЕХ решено было составить таким образом, чтобы приблизительно уравнять количества фибрилл, полученных при .разных температурах. Исходя из данных по концентрациям белка, подкреплённых разной интенсивностью окрашивания белковых полос (рис. 2, дорожки 3-6), на 1 объем образца, полимеризованного при 37°С, брали 2 объёма образца, инкубировавшегося при 8°С, и смешивали их. Количество белка в осадке

в смешанном образце оценивается в 25 мкг/мл.

Прямым доказательством образования фибрилл служит электронная микроскопия. Мы провели электронно-микроскопическое исследование белковых препаратов (Рис. 3)

Ж

ЙЗЬ

•" Чвр™ "в™-

а гчиию.-. - - - Б - ' *

Рисунок 3. Электронные микрофотографии препаратов белка Sup35NM; А - раствор мономера Sup35NM в ЮшМ Tris, 450mM имидазола, 6-7М мочевины, ЮОтМ NaCl Б -Полимер Sup35NM в буфере 5тМ Na2HP04, 150тМ NaCl, рН 7,4, азид натрия 0,01%, 200тМ мочевины (результат смешивания полимеров, сформированных при температуре 8°С и 37°С в течение 63,5 часов). Полоска имеет относительную длину 100 нм.

Судя по электронным микрофотографиям, нам удалось получить фибриллы Бир35ЫМ в результате выбранной последовательности процедур. Полученные фибриллы 5ир35>}М имеют примерно Юнм в диаметре, что соответствует опубликованным данным. Небольшая длина полученных фибрилл, по сравнению с опубликованными данными, как и меньшее количество фибрилл в поле зрения, является следствием более низкой концентрации белка в полимеризуемом препарате.

3. Получение аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка вир35№М.

БЕЬЕХ проводили по следующей обобщённой методике (рис. 4):

1. Библиотеку 90-звенных олигонуклеотидов с 40-нуклеотидной рандомизированной сердцевиной (4,5 нМ) разводили буфером А с 200тМ мочевины, 2тМ \lgCl2. В целях унификации структур одноцепочечных олигонуклеотидов проводили 5-минутную денатурацию олигонуклеотидов на кипящей водяной бане с последующей медленной ренатурацией при естественном остывании бани до 25-30°С (рис. 4, п. 1).

2. В микроцентрифужных пробирках готовили рабочую смесь для БЕЬЕХ: к 4,5нМ олигонуклеотида добавляли 0,45нМ размороженных фибрилл (молярное соотношение ДНК:мишень=10:1) (рис. 4, п. 3)

3. Связывание олигонуклеотидов с мишенью проводили в течение 1 часа при комнатной температуре, при перемешивании (300 об/мин).

4. Комплексы мишень-олигонуклеотид отделяли от мономеров и несвязавшихся олигонуклеотидов центрифугированием (рис.4, п. 4).

5. Осадок дважды промывали буфером А.

6. К осадку добавляли 10 мкл бидистиллированной воды и кипятили 2 мин. При этом связавшиеся олигонуклеотиды денатурируют и выходят в раствор. Жидкость переносили в чистую микроцентрифужную пробирку и использовали как матрицу для полимеразных цепных реакций.

7. С помощью первой полимеразной цепной реакции («дцПЦР») мы амплифицировали двухцепочечную форму олигонуклеотидов, связавшихся с мишенью. В реакционную смесь добавляли равное количество праймеров <Иг$ и геуБ. Продукт реакции, по размеру соответствующий контрольному (полученному в результате «дцПЦР» на матрице /(¿Б), элюировали с геля и использовали в качестве матрицы для следующей ПЦР.

8. Вторая полимеразная цепная реакция («оцПЦР»), проводимая в 10-кратном избытке одного праймера служила для наработки ДНК-материала для

следующего цикла БЕЬЕХ. Продукт реакции, по размеру соответствующий контрольному (!№), элюировали с геля и использовали для следующего цикла БЕЬЕХ (рис. 4, п. 5).

25N 40N 2?N

Ni ^

<40%

>40%

8

Рисунок 4. Схема SELEX. 1. Библиотека одноцепочечных олигонуклеотидов, 2. Фибриллы Sup35NM, 3. Смешивание, инкубация, 4. Разделение центрифугированием, 5. Полимеразная цепная реакция, 6. Оценка связывания олигонуклеотидов с мишенью при помощи радиоавтографии, 7. Повторение цикла. 8. Клонирование, секвенирование.

Мы оценивали эффективность связывания ДНК-материала с мишенью после циклов 3,6,7,8,9 (рис. 4, п. 6). Радиоактивно меченную одноцепочечную ДНК, синтезируемую после соответствующего цикла, смешивали с мишенью в молярном соотношении 1:10 (в отличие от SELEX, белок брали в 10-кратном избытке). После гибридизации и центрифугирования верхнюю половину объёма пробы переносили в чистую пробирку, и измеряли удельную радиоактивность обеих фракций (А^ и Аводн) на сцинтилляторе. Для расчёта эффективности связывания в % пользовались формулой: КАооал -АводяУ(Аосш +Авода)]*100%. Погрешности рассчитывали по формуле стандартного отклонения. Результаты оценки сродства аптамеров к мишени представлены в табл. 2.

Цикл 3 6 7 8 9

Эффективность связывания олигонуклеотид-мишень, % 1±0,9 12±4 20±1,5 29±5 40±2

По достижении 40% эффективности связывания олигонуклеотидов с мишенью SELEX остановили, чтобы сохранить возможное разнообразие аптамеров (рис. 4, п. 8).

Двухцепочечную ДНК, синтезированную на основе материала, полученного после 9 цикла SELEX, клонировали в вектор pUC19 (ВКПМ ГосНИИ «Генетика»). Полученным ДНК-материалом трансформировали клетки Е. coli штамма TG1, трансформантов дискриминировали по цвету при выращивании на среде LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, 2% агар-агара) при 37°С с добавлением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-О-галактопиранозида и изопропилтиогалактозида. Из трансформантов выделили ДНК плазмид и оценили размер вставки при помоши рестрикции. Плазмиды, содержащие вставки расчётного размера (90 или 180 пар нуклеотидов), секвенировали. В результате получили последовательности 43 аптамеров.

Мы предприняли гомологический поиск по полученной выборке, при этом все последовательности сравнивали попарно. Хотя поиск не выявил консенсусных последовательностей, некоторые олигонуклеотиды имели участки, сходные между собой.

Для химического синтеза и последующей индивидуальной характеристики было выбрано 10 последовательностей. Выбор осуществили на основе результатов гомологического поиска: старались охватить наиболее широкий спектр аптамеров. Некоторые аптамеры были выбраны по признаку своеобразия нуклеотидной последовательности (S6, см. табл. 3). Нуклеотидные последовательности, выбранные для индивидуального синтеза, получили названия S1-S10 (табл. 3).

Таблица 3. Обозначения и последовательности аптамеров, полученных после 9 цикла SELEX.

Название Нуклеотидная последовательность

S70r 5'-bio-AGCACTAATCTATGC-40(A,T,G,С)-ACCTTATGTTGTAGC

SI 5'-bio-AGCACTAATCTATGCccgacgctagcgacctatcccataaacgagacacgggtccACCTTATGTTGTAGC

S2 5'-bio-AGCACTAATCTATGCccgaccaacgttgttaccttccctataacaacaggagccgACCTTATGTTGTAGC

S3 5'-bio-AGCACTAATCTATGCcccactgcacacgtctctaaacacacgccccgtcatccggACCTTATGTTGTAGC

S4 5'-bio-AGCACTAATCTATGCccccgggaaccaccctataacgtaccgctaagtacgcgcgACCTTATGTTGTAGC

S5 S'-bio-AGCACTAATCTATGCccaccctgagctccgtagacatttatcgctctacccgcccACCTTATGTTGTAGC

S6 5'-bio-AGCACTAATCTATGCcgcgggagggggaggggaagagcotgggggagacggcaggACCTTATGTTGTAGC

S7 5'-bio-AGCACTAATCTATGCcccgacaaccaacggctttagggtgcagccaacccgcctgACCTTATGTTGTAGC

S8 5'-bio-AGCACTAATCTATGCcccgactttccggtatacgcattccacaacactgtcctggACCTTATGTTGTAGC

S9 5' -bio-AGCACTAATCTATGCccaccagtgataacggaaggaaccagtagaacatccgtccgACCTTATGTTGTAGC

S10 5'-bio-GCACTAATCTATGCcggcaccgaacgccccacaggaaacagcgtctgcgcgcgACCTTATGTTGTAGC

Первоначально мы синтезировали шесть 90-нуклеотидных последовательностей аптамеров, включающих полноразмерные праймеры. К 5'-концу каждого ашамера добавляли биотин. В качестве контрольного олигонуклеотида в первых опытах использовали праймер dirS, помеченный биотином с 5'-конца.

В результате серии опытов по гибридизации аптамеров с мономерной и полимерной формами Sup35NM в ИФА-подобном протоколе нам удалось выяснить, что все аптамеры связываются с полимером Sup35NM в различной эффективностью (данные не приведены).

Для повышения эффективности химического синтеза решено было убрать по 10 концевых нуклеотидов с каждой стороны у каждого аптамера. Кроме того, мы решили попытаться полностью удалить праймеры у аптамера S5, показавшего наиболее воспроизводимое связывание с полимером Sup35NM в серии предварительных опытов.

90- и 70-нуклеотидные аптамеры сравнили в ИФА-подобном протоколе и выяснили, что 70-членные аптамеры связываются с полимером Sup35NM с той же эффективностью, что и 90-членные. При проверке укороченного до 40 нуклеотидов варианта аптамера S5 оказалось, что данный олигонуклеотид теряет сродство к Sup35NM (данные не приведены).

4. Описание аптамеров с помощью ИФА-подобной методики, определение Kd.

Для выборки аптамеров, приведённой в таблице 3, были определены константы диссоциации комплекса аптамер-мишень. Делали допущение о наличии у каждой молекулы в составе полимера одного участка связывания с аптамером. Эксперимент проводили в трёх повторностях, стандартное отклонение не превышало 10%. Экспериментальные данные обрабатывали при помощи программы ENZFITTER (version 1.05(CGA)). В табл. 4 представлены полученные результаты.

Таблица 4. Константы диссоциации (Kj) комплексов ДНК-аптамеров с фибриллами

Аптамер, название S1 S2 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

мкМ 0,38 0,62 0,3 0,24 0,38 0,83 1,19 0,83 0,86

Согласно полученным данным, почти все (кроме М, для которого значение Кл слишком велико, либо каждая молекула белка в составе полимера имеет более одного участка связывания с олигонуклеотидом) аптамеры взаимодействуют с фибриллярной формой белка вирЗЗЛМ. Порядок измеренных К, (0,2-1,0 мкМ) согласуется с результатами друг,« авторов. В ряде случаев полученные другими исследователями

12

аптамеры связывались с амилоид-формирующими мишенями с большей аффинностью: Кй на 1-2 порядка меньше измеренных нами. Для сравнения, известные Кл комплекса [антиген-антитело] для Ргрс составляют 0,1-10 нМ, для Ргр5с - 10 мкМ [АШопуик е! а!., 2009].

Целью вЕЬЕХ было получение аптамеров, связывающихся с полимерной формой белка 8ир35ММ, и не связывающихся с его мономерной формой. Специфичность связывания химически синтезированных аптамеров тестировали по ИФА-подобной методике с полимером и мономером вирЗэЫМ в качестве субстрата. Погрешности в трёх повторностях не превышали 10%. Результаты представлены в виде диаграммы на рис. 5. ОП 490

1,4 -I-!-;-:------. ■..,- ' "'■■■ .'.,. : ........

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

гЬ

Б2

Э4

Б5

Э6

Б7

Э8

Б10

Рисунок 5. Сродство ДНК-агттамеров к белку 8ир35ММ, находящемуся в мономерной (черные столбцы) и полимерной (белые столбцы) форме.

Согласно полученным данным, все исследуемые аптамеры связываются с полимерной формой 5ир35ЫМ в 5-10 раз эффективнее, чем с мономерной. Некоторое сродство аптамеров к мономеру, возможно, объясняется полимеризацией препарата мономера, начинающейся в лунках планшета при сорбции. Таким образом, цель проведённого БЕЬЕХ достигнута.

5. Проведение дополнительного цикла 8ЕЬЕХ.

Полученные нами после 9го цикла ЭЕЬЕХ аптамеры имеют разнообразные нуклеотидные последовательности. При этом, почти все они удовлетворяют цели проведённого ЗЕЬЕХ, а именно связываются с фибриллами Бир35ЫМ, и не связываются с мономером того же белка. Таким образом, проведение Юге цикла ЗЕЬЕХ не грозило потерей разнообразия нуклеотидных последовательностей аптамеров, но могло бы помочь

нам выявить нукпеотидные мотивы, критичные для связывания аптамеров с фибриллярной формой Sup35NM.

10й цикл SELEX был проведён аналогично 9ти предьщущим. В результате было получено 33 новых нуклеотидных последовательности аптамеров.

Внутри новой группы последовательностей аптамеров был предпринят гомологический поиск с попарным сравнением всех последовательностей. Кроме того, аптамеры первого отбора (S1-S10) попарно сравнивали с аптамерами второго отбора (А1-А39). Согласно всем полученным данным, мы сделали вывод о том, что две выборки аптамеров дивергируют не слишком сильно.

Из второй группы последовательностей 11 были выбраны для индивидуального синтеза. При отборе руководствовались следующими принципами: а) сходство с наибольшим количеством последовательностей внутри группы (А) и между группами (А и S) (А8, А18, А26, А31) б) наличие протяженных гомологичных участков (А2, А18, А22, А36, А37) в) своеобразие нуклеотидной последовательности (А5, А21, А24). В таблице 5 приведены полные нукпеотидные последовательности выборки аптамеров, синтезированных после 10 цикла SELEX.

Таблица 5. Обозначения и последовательности аптамеров, синтезированных после 10 цикла ЭЕЬЕХ. Вариабельные части последовательностей выделены жирным шрифтом.

Назв ание Последовательность

А2 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCCTGGGGrrCCAGAGACGAGTAGTAGAACGCÄTTCCCGGACCTTATGTTGTAGC

А5 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCCCTCAACAGCGTGTTGCACCCAATCAGTACCTGCCGTGACCTTATGTTGTAGC

Ад 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCATGGAGACCCGCGCGTATTTGTAGTGTTTATGCCCGCGACCTTATGTTGTAGC

Al 8 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCGCCCGTGAATAAGCTACCATCCAGAACGACGCCTGGCACCTTATGTTGTAGC

А21 5- -bio-AGCACTAATCTATGCCCGGGACAGCGTATTGAAGCTATGAGGCGGCCCTTCCCCAACCTTATGTTGTAGC

А22 5- -bio-AGCACTAATCTATGCCGACCGTGAAAAGCTAGGTAATCTTACCCATTCCGCGCGCGCACCTTATGTTGTAGC

А24 5'-bio-AGCACTAATCTATGCCGACCCAGTCAAGTTGTAGCTATTGTAACGCCCAAACCGCACCTTATGTTGTAGC

А26 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCGCAGCCGACTAGGGCGGAGGATTCAGACCCCGACGCGACCTTATGTTGTAGC

А31 5'-bio-AGCACTAATCTATGCCCCCGACGCCGTGGACTAGGTAACACCCTATCTTACTGCACCTTATGTTGTAGC

A3 6 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCAGGCGCCAGAGCCGCGTGTTCGTTTCCTCACGCTTTGCACCTTATGTTGTAGC

A3 7 5' -bio-AGCACTAATCTATGCCCCGGGGCGCCAGAGACGAGTAGGTGCAGCGGTTGTCATTGGGACCTTATGTTGTAGC

Таким образом, после 9 и 10 циклов БЕЬЕХ мы синтезировали 21 аптамер, меченный биотином. Каждый аптамер содержал вариабельную часть (40 нуклеотидов±2 нуклеотида, за счёт ошибок, допускаемых Тац ДНК полимеразой в ходе полимеразной цепной реакции) и по 15 нуклеотидов от праймеров сИг$ и ге\$ с каждой стороны, согласно данным, ранее полученным при оптимизации последовательностей аптамеров (группы «Б»),

Данные по связыванию аптамеров группы «А» с мишенью - агрегатами полимеров белка БирЗЗр, выделенными из клеток дрожжей, - приведены ниже, см. пункт 7.

6. Структурные особенности аптамеров

Известно, что вторичная структура аптамеров определяет их специфичность. Шпилька - это самый распространённый структурный мотив, встречающийся в аптамерах. Шпилька - это структура, содержащая двухнитевой стебель и однонитевую петлю. Для ДНК-аггтамеров характерны также квадруплексы - четырёхнитевые структуры, поперечное сечение которых, как правило, образовано четверкой гуаниновых нуклеотидов (G-квартетом) [Решетников с соавт., 2010]. Мы анализировали вторичную структуру полученных аптамеров с помощью компьютерных программ.

Среди последовательностей аптамеров, потенциально содержащих квадруплексы, S6 выделяется содержанием триплетов гуанина, то есть предположительный квадруплекс сформирован тремя G-квартетами (а не двумя, как у всех остальных аптамеров). Несмотря на своеобразие, данный аптамер имеет средний показатель A'd комплекса [аптамер-фибриллы Sup35NM] (см. табл. 4). Следовательно, в данном случае такой структурный элемент, как квадруплекс, не является определяющим в специфическом взаимодействии

аптамеров с полимером Sup35NM.

Вторичные структуры аптамеров были рассчитаны при концентрации ДНК=15нМ, концентрации ионов №+=150мМ, температуре 25°С. Для каждого аптамера рассматривалась единственная из возможных конформаций, расчётная температура плавления (Тт) которой оказалась максимальной, а показатель изменения свободной энергии (AG) - минимальным. Выяснилось, что в целом рассматриваемая выборка аптамеров определяется структурным полиморфизмом, что согласуется с полиморфизмом их первичных последовательностей, но у 17 аптамеров первая шпилька, соответствующая праймерному участку, одинакова. Исключениями являются аптамеры S3, S9, А8 и А26.

По термодинамическим показателям - АО и Тт, - выборка вторичных структур аптамеров может быть подразделена следующим образом: аптамеры с очень низкими показателями (А24), аптамеры с показателями ниже среднего (А18, А31), аптамеры со средними показателями (S1-S8, S10, А2, А5, А8, А21, А22, А26), аптамеры с показателями выше среднего (S9, А36, А37). В этом подразделении отражена жёсткость вторичной структуры; так, аптамер А24, имеющий минимальный показатель Тт и максимальный -AG, не формирует вторичную структуру при заданных условиях (либо структура крайне нестабильна). Далее, с возрастанием Тт и уменьшением AG, возрастает и жёсткость вторичной структуры аптамеров.

В одной из опубликованных работ авторы сочетали химические и компьютерные методы исследования структуры РНК-аптамеров [Бауег е/ а/., 2004]. Мы ввели нуклеотидную последовательность аптамера 8АР-93(1^о) в программу 0^оАпа1угег 3.1 и выяснили, что при условиях, заданных нами при анализе выборки, ДО вторичной структуры аптамера 8АР-93(1-б0), эмпирически подтверждённой авторами, составляет -4,17 ккал/моль, а Тт составляет 43,7°С. Оба эти показателя соответствуют полученным нами порядкам значений Дв и Тга для аптамеров со средними термодинамическими показателями.

Вероятность образования гомодимеров была оценена по длине палиндромов, содержащихся в нуклеотидной последовательности, и по показателю изменения свободной энергии (ДО). В результате аптамеры были условно разделены на две группы. К первой группе были отнесены аптамеры Б!, 52, Б4, Бб, Б10, А8, А21, А22, АЗб и А37. Эти аптамеры имеют высокий показатель Ай гомодимера (менее -14 ккал/моль); их палиндромная часть состоит как минимум из шести нуклеотидов, и содержит преимущественно гуанин и цитозин. Ко второй принадлежали все остальные аптамеры, а именно БЗ, 85, 87, 88, 89, А2, А5, А18, А24, А26 и А31. Показатели ДО гомодимера в данной группе больше -14 ккал/моль; палиндромы состоят из 6 и менее нуклеотидов и включают тимин и аденин.

Очевидно, что в случае димеризации вторичные структуры, предсказанные для мономеров, претерпевают критические изменения: палиндромные области пересекаются как минимум с одной шпилькой в структуре каждого аптамера.

С учётом большого количества интерферирующих факторов, компьютерный анализ не может дать нам чётких ответов на вопросы о структуре аптамеров. Часто барьер между оптимальной и субоптимальной структурой, рассчитанной по алгоритмам, условен, и выбирать приходится между 4 непохожими конформациями. Показательным является тот факт, при при повышении температуры расчёта вторичных структур до 37°С у аптамеров 84, 810, А2, А5, А8, А18, А24, А26, А31 и А36 появляются новые конфигурации, не отображаемые при 25°С. Однако, данный анализ сужает поле поиска реальных вторичных структур, и позволяет выделить несколько условных групп аптамеров по признакам димеризации и структурообразования.

7. Характеристика связывания аптамеров с не растворимыми в детергентах прионными и неприонными агрегатами Sup35p и некоторых других белков, выделенных из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Аптамеры были испытаны на различных мишенях - агрегатах белка Sup35p, сформированных in vivo, а также на других прионных белках.

Прежде всего, нам было необходимо убедиться в том, что аптамеры, полученные к фибриллам, сформированным in vitro, имеют сродство к нативным фибриллам. Из клеток дрожжей штамма 5V-H19 с фенотипом [/>£/% [/W] выделили не растворимые в додецилсульфате натрия агрегаты, и провели скрининг при помощи дот-блот. В качестве отрицательного контроля использовали материал, выделенный из клеток с фенотипом [psí ] [pin] штамма - производного5 V-H19. Результат представлен на рис. 6.

^ а Рисунок 6. Дот-блот-скрининг аптамеров. Названия

аптамеров написаны слева. Сверху указаны серийные разведения мишени - агрегатов белка Sup35p, выделенных из клеток дрожжей штамма 5V-H19

[«T]s [«ЛЛ] \psí] -отрицательный контроль - материал, выделенный из клеток дрожжей штамма-производного 5V-H19 с фенотипом |>sf] [piri\, разведение аналогично первому («1»).

Большая часть аптамеров связывается с агрегатами, выделенными из клеток дрожжей с фенотипом [PST4-] [Р1Щ, с различной эффективностью. Аптамеры не окрашивают контроль [ря ] \pin"\ (кроме А24).

Из дальнейших исследований было исключено три аптамера: А24, показавший связывание с отрицательным контролем, а также А31 и А37, сравнительно слабо окрашивающие агрегаты Sup35p. Примечательно, что при предсказании вторичных структур аптамеры А24 и А31 выделялись невысокими термодинамическими показателями, сопряженными с нестабильностью вторичной структуры. Аптамер A3 7 также отличается от других аптамеров; в своём составе он содержит 10-нуклеотидный палиндром, и показатель AG димера у данного аптамера минимален. Возможно, димеризация в данном случае влечёт за собой потерю аффинности.

S1 • • *

S2 • •

S3 * • « т »

S4: * ♦ щ 4

S5 i • * I * *

S6 • • т 0 *

S7 • • 9 W «

S8 * » т •

S9 • • т *

S10 • • • • *

А2 • • • т *

А5 • • * ■« ■

А8 * • » Ф

А18 • т * *

А21 «МП • «

А22 • • т онр

А24 • • * ■ •

А26 • • ш

А31 * • ■■■ ф,

A3 6 • т » ♦

А37 4 * V

Исходя из положения о структурном сходстве прионных и амилоидных фибрилл, сформированных неродственными по первичной последовательности белками, мы предположили, что аптамеры, полученные к прионным формам белка Sup35NM, могут узнавать полимеры других прионных и амилоидных белков. С другой стороны, шгаммовое разнообразие приона [PSI+], как известно, основано на структурных различиях фибрилл, формируемых белком Sup35p. Мы предположили, что имеются аптамеры, способные избирательно связывать полимеры Sup35p в зависимости от штамма приона, из которого эти полимеры были выделены.

При помощи дог-блот-методики мы проверили связывание аптамеров с прионными и амилоидными агрегатами Sup35p, агрегатами прионнного белка Rnqlp, агрегатами рекомбинантного белка мыши №90-231, а также с агрегатами 103Q-GFP (синтетический аналог хантингтина человека), выделенными из клеток дрожжей. Все аптамеры специфически взаимодействуют с прионными агрегатами Sup35p, выделенными из клеток штамма с «сильным» прионным фенотипом (5V-H19 [f57+]s [PIN+]), а также с агрегатами Prp9o-23i- Ни один алтамер не связывается с фракцией, соответствующей агрегатам, выделенной из клеток штамма 74-D694 [ps/-] [рш-], то есть с отрицательным контролем.

По сродству к остальным субстратам нам удалось разделить 18 аптамеров на 5 классов. В табл. 8 представлено разделение аптамеров на классы специфичности. На рис. 7 представлены примеры реакции аптамеров-представителей каждого класса с различными субстратами в дот-блот и при переносе белков с агарозного геля.

Таким образом, аптамеры, полученные к фибриллам, сформированным рекомбинантным белком Sup35NM in vitro, способны распознавать устойчивые к детергентам агрегаты различных неродственных амилоидных белков, выделенные из клеток дрожжей. Разные аптамеры при этом обладают различной специфичностью.

Таблица 6. Взаимодействие аптамеров с различными прионными и неприонными агрегатами

Мишень

1 Прионные агрегаты Sup35p «сильные» ([PiT^s)

1 Прионные агрегаты Sup35p «слабые» ([PSf]w)

Класс ДНК-аптамера (названия аптамеров)

I

(S2, S3 S6, S7, S9, S10, А2, А8, А21)

2 Неприонные агрегаты Sup35p и прионные агрегаты Rnqlp

Прионные агрегаты Rnqlp

([Я/ЛГ])

4 Агрегаты 103Q-GFP

' Агрегаты РГР90-231

5 фракция, соответствующая агрегатам - отрицательный контроль

II

(S1, А18, А22, A3 6)

III

(S4, S8, А5)

IV

(А26)

(S5)

1 штамм 5V-H19 2 штамм 74-D694 [psi-] [PIN+] (гиперпродуцент Sup35p; неприонные

агрегаты Sup35p, прионные агрегаты Rnqlp) 3 urraMM74-D694 |psi-] [PIN+] (прионные

агрегаты Rnqlp) 4 штамм 74-D694AS35 [pin-] (гиперпродуцент 103Q-GFP) 5 штамм 74-

D694ARNQ1 bs,-] (агрегаты Ргр,о.23,) 6 штамм 74-D694 [psi-] [pin-] (отрицательный

контроль)

Д MOHO РгР РгР • ,# * • * * • • 1 • # * •

MOHO 103Q ■ • ЫШшЕЩ! * x?

103Q • . :.». " . ■ f^j|j||||H¡|| • • ■

MOHO [PIN*] ¡glj ■РчЯИИ • s В Jíiiííf-íS Я щШ m Ялам«»

[PIN*] щзяни • ■ •

MOHO [PSI*]s » ' •

[psi] * ШЩШШ m ■

неприон. Sup35 агрегаты K • • • ■■■ • • m • ШЩЯШт

[PSI*] w • • • _ • • m *

[PSI*] s • • • • m Ф « • • «•

A21 A18 S4 А26 S5

Рисунок 7. Взаимодействие аптамеров - представителей разных классов с агрегатами различных прионных и амилоидных белков, выделенными из клеток дрожжей А) Дот-блот; образцы белка представлены в трёх серийных разведениях (1х, 2х, 4х) Б) SDD-AGE; представлены только мишени, различно окрашиваемые разными классами аптамеров. Белки-мишени выделены из следующих штаммов: РгР - штамм 74-D694ARNQ1 [рм-], 103Q - штамм 74-D694AS35 [pin-], [PIN+] - штамм74-0694 |psi-] [PIN+ ], неприонные агрегаты Sup35p - штамм 74-D694 [pi/-] [PIN+], [/>SY+]W и [PSI+]s - соответствующие производные штамма 5V-H19. Отрицательные контроли: [psi-] и все образцы с пометкой «моно», получены при кипячении соответствующих агрегатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате первой части нашей работы,, посвященной получению ДНК-аптамеров, связывающихся с полимерной формой белка БирЗбр дрожжей БассИаготусез сеге^ае, и не связывающихся с его мономерной формой, мы секвенировали 82 аптамера, клонированных после 9 и 10 цикла БЕЬЕХ. Характерной чертой аптамеров является отсутствие значимой гомологии в их нуклеотидных последовательностях, что соответствует данным других авторов, получавших аптамеры к прионным и амилоид-формирующим белкам [Вилка е1 а!., 2007, Ogasawara е/ а!., 2007].

В рамках характеризации полученных аптамеров, составляющей вторую часть нашей работы, были определены величины К* комплекса [аптамер-фибриллы 5ир35ЫМ] для 9 аптамеров, полученных после 9 цикла БЕЬЕХ. В основном, порядок измеренных величин Кл (0,2-1,0 мкМ) согласуется с результатами других авторов [С^алуата е! а/., 2007].

Далее, была проведена проверка связывания аптамеров с агрегатами различных приокных и амилоидных белков. Оказалось, что многие аптамеры проявляют сродство к полимерам белков КпЧ1р, ро1уО, и все аптамеры имеют сродство к агрегатам фрагмента РгР9о-231 мыши, выделенным из клеток дрожжей. По совокупности данных мы сделали вывод о том, что полученные нами аптамеры действительно являются конформационно-чувствительными; они обладают сродством к амилоидным структурам.

При предсказании вторичных структур аптамеров мы воспользовались алгоритмом ШАК>М. При сравнении термодинамических показателей с опубликованными данными выяснилось, что для большей части аптамеров показатели совпадают с таковыми для эпмирически проверенной структуры [Бауег е! а!.. 2004]. В случае, когда теоретически предсказанная структура отличилась низкими термодинамическими показателями, олигонуклеотид оказался неспецифичным (А24). Таким образом, несмотря на отсутствие явных общих черт, полученные аптамеры взаимодействуют с мишенями за счёт своих вторичных структур.

Полученные аптамеры могут служить инструментом для детекции амилоидных агрегатов в сравнительно агрессивных условиях, в частности непосредственно в клеточных лизатах [МЙке^сЬ Ы., 2012]. Сродство аптамеров к агрегатам белка РгР делает их перспективной основой для разработки диагностикума для прионных болезней человека и животных.

выводы

1. Методом 5ЕЬЕХ получены ДНК-аптамеры к фибриллярной форме прионного белка дрожжей ЗассИаготусез сеге\1$1ае 5ир35р.

2. Популяция полученных аптамеров является гетерогенной по первичной последовательности и не группируется по гомологии.

3. Аптамеры разделены на 5 классов по специфичности взаимодействия с различными мишенями.

4. Аптамеры могут обладать различной аффинностью к полимерным формам белка ЭирЗбр, в зависимости от штамма приона.

5. Некоторые аптамеры связываются с амилоидными белками, не родственными Бир35р по первичной последовательности.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1). Сурина Е. Р., Морозкина Е. В., Марченко А. Н„ Антипин А. А., Митькевич О. В., Кушниров В. В., Беневоленский С. В., Тер-Аванесян М. Д. Селекция ДНК-аптамеров, специфически взаимодействующих с фибриллярной формой белка Sup35 дрожжей. Молекулярная биология - 2009,43(4), 682-688.

2) Mitkevich O.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Surina E.R., Benevolensky S.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. DNA aptamers detecting generic amyloid

epitopes. Prion - 2012. 6(4):400-6.

3) Антипин А.А., Надгочей Г.А., Тер-Аванесян М.Д., Митькевич O.B., Кушниров В.В., Сурина Е.Р., Беневоленский С.В., Марченко А.Н., Морозкина Е.В. Олигонуклеотид и его конъюгат для детекции белков в амилоидном состоянии и способ детекции белков в амилоидном состоянии. Заявка на патент РФ №

2010125875 от 24.06.2010.

4) Surina E.R., Morozkina E.V., Marchenko A.N., Antipin A.A., Mitkevich O.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Benevolensky S.V. Selection of DNA aptamers, specifically interacting with fibrillar form of the yeast Sup35 protein. 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions", 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic. FEBS

Journal, v.276, suppl.l, p.328-329.

5) Морозкина E. В., Сурина E. P., Марченко A. H„ Антипин А. А., Митькевич О. В., Кушниров В. В., Тер-Аванесян М. Д., Беневоленский С. В. Селекция ДНК-аптамеров, специфически взаимодействующих с фибриллярной формой белка Sup35 дрожжей. Международная научная школа-конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября - 1 октября, 2009, Москва-Пущино. Материалы конференции, том 2, стр. 157-160.

6) Сурина Е.Р., Митькевич О.В. Характеристика ДНК-аптамеров, полученных к полимерным формам NM-фрагмента белка Sup35p. Международная школа-конференция «Биотехнология будущего», 5-9 июня, 2006, Санкт-Петербург, сборник статей стр. 89-90.

Подписано в печать: 16.08.2013 Тираж: 100 экз. Заказ №97 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сурина, Елизавета Рафаэлевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ» (ФГУП «ГосНИИГенетика»)

На правах рукописи

04201365896 СУРИНА ЕЛИЗАВЕТА РАФАЭЛЕВНА

ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка 8ир35р дрожжей БасскаготусеБ сегех'шае

Специальность: 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук C.B. Беневоленский

Москва 2013

Оглавление

Введение...................................................................................................6

Список сокращений и обозначений......................................................9

Обзор литературы.................................................................................10

Часть I. Прионы.....................................................................................10

Прионная концепция............................................................................10

Прионные болезни человека.............................................................................11

Прионы других организмов..............................................................................13

Функции белка 8ир35р......................................................................................14

Биохимические свойства белка БирЗбр...........................................................16

Свойства белка иге2р........................................................................................17

Фибриллы, образованные белками 8ир35р и 11ге2р.......................................17

Прионы дрожжей: общие черты.......................................................................20

Другие прионы дрожжей. Поиск новых белков с прионными свойствами. 22

Две модели прионной конверсии.....................................................................22

Роль Нзр104р и других белков в образовании [Р57+]....................................24

Штаммы прионов...............................................................................................26

Межвидовые барьеры........................................................................................29

Надфибриллярные структуры. Структура прионных полимеров................30

Значение прионов..............................................................................................32

Строение белка Ргр. Подходы к диагностике и лечению прионных

болезней..............................................................................................................32

Часть II. БЕЬЕХ.....................................................................................35

История БЕЬЕХ..................................................................................................36

Методология БЕЬЕХ.........................................................................................37

Библиотека олигонуклеотидов.......................................................................................38

Стадия связывания...........................................................................................................40

Стадия разделения............................................................................................................40

Стадия амплификации.....................................................................................................41

Мониторинг........................................................................................................................42

2

Обработка аптамеров.........................................................................................42

Структура аптамеров.........................................................................................43

Преимущества аптамеров перед антителами..................................................45

Вариации 8ЕЬЕХ и модификации аптамеров.................................................46

Применение аптамеров.....................................................................................49

Часть III. Аптамеры к прионным и амилоидным белкам.................50

Заключение к обзору литературы....................................................................52

Материалы и методы............................................................................54

Материалы..........................................................................................................54

Штаммы..............................................................................................................................54

Питательные среды...........................................................................................................54

Условия культивирования..............................................................................................54

Олигонуклеотиды (СИНТОЛ)........................................................................................55

Буферные растворы:.........................................................................................................55

Реактивы:............................................................................................................................55

Компьютерные программы:...........................................................................................56

Генно-инженерные методы...............................................................................56

Работа с белками................................................................................................56

Электроблоттинг................................................................................................57

Осаждение растворенных белков.....................................................................57

Электронная микроскопия................................................................................57

Полимеразная цепная реакция.........................................................................57

Радиоактивное мечение ДНК...........................................................................58

ИФА-подобная методика определения эффективности связывания с

мишенью ДНК-аптамеров, содержащих 5'-биотин.......................................58

Определение констант диссоциации комплексов [аптамер-мишень]..........58

Выделение белковых агрегатов, нерастворимых в детергентах, из клеток

дрожжей БасскаготусеБ сегегг81ае...................................................................59

Разделение белков в полуденатурирующих условиях в агарозном геле (ЗОБ-АСЕ).........................................................................................................59

Дот-блот и специфическое окрашивание аптамерами белков на

нитроцеллюлозных мембранах........................................................................60

Результаты.............................................................................................61

1. Получение рекомбинантного фрагмента NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae...................................................................................61

1.1. Выделение и хроматографическая очистка белка Sup35NM из клеток E.coli. ...............................................................................................................................................61

1.2. Изучение свойств рекомбинантного белка Sup35NM.........................................63

2. Полимеризация рекомбинантного белка Sup35NM in vitro......................65

2.1. Дискриминация фибрилл и мономеров.................................................................65

2.2. Подбор буферных условий........................................................................................65

2.3. Подбор условий центрифугирования.....................................................................67

2.4. Подбор температурных режимов полимеризации...............................................69

2.5. Оценка влияния ультразвука на размер полимеров Sup35NM........................70

2.6. Влияние инкубации при отрицательной температуре на седиментацию фибрилл...............................................................................................................................71

2.7. Препаративная наработка фибрилл Sup35NM, характеристика полученного образца.................................................................................................................................72

2.8. Электронное микроскопирование полимеров белка Sup35NM, выделенного из клеток Е. coli...................................................................................................................73

3. Получение аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM.............................................................................................................74

3.1. Выбор нуклеотидной последовательности исходного ДНК-материала для SELEX..................................................................................................................................74

3.2. Проведение SELEX.....................................................................................................75

3.3. Клонирование и секвенирование двухцепочечных копий ДНК-аптамеров по окончании SELEX.............................................................................................................77

3.4. Обработка нуклеотидных последовательностей аптамеров: поиск гомологий. ...............................................................................................................................................78

3.5. Выбор последовательностей для индивидуального синтеза..............................81

3.6. Оптимизация последовательностей аптамеров...................................................81

4. Описание аптамеров с помощью ИФА-подобной методики, определение Kj. Формирование окончательной выборки аптамеров.................................83

4.1. Определение К& комплексов аптамер-фибриллярный Sup35NM для 10 выбранных аптамеров......................................................................................................83

4.2. Определение специфичности аптамеров: гибридизация с мономером и полимером белка Sup35NM в ИФА-подобном протоколе.........................................84

4.3. Проведение дополнительного цикла БЕЬЕХ........................................................84

4.4. Финальная выборка аптамеров..............................................................................87

5. Структурные особенности аптамеров.........................................................88

5.1. Квадруплексы.............................................................................................................88

5.2. Шпильки...................................................................................................................89

5.3. Палиндромы и димеры..............................................................................................95

6. Характеристика связывания аптамеров с нерастворимыми в детергентах прионными и неприонными агрегатами 8ир35р и некоторых других белков, выделенных из клеток дрожжей Басскаготусез сегеу1$1ае...........................96

6.1. Взаимодействие аптамеров с нерастворимыми в 8Б8 агрегатами белка 8ир35р, выделенными из клеток дрожжей...................................................................97

6.2. Аптамеры взаимодействуют с устойчивыми к детегрентам агрегатами различных амилоидогенных белков..............................................................................98

Обсуждение.........................................................................................104

Выводы.................................................................................................109

Список литературы.............................................................................110

Введение

Прионы - это особый класс инфекционных агентов, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Их отличие от всех других патогенов - бактерий, вирусов, состоит в отсутствии генома, состоящего из нуклеиновой кислоты. Их инфекционные свойства связаны с белком. Этот инфекционный белок, как предполагается, может существовать в двух различных конформационных формах: инфекционной и неинфекционной, причем инфекционная форма способна катализировать превращение нормальной формы в инфекционную посредством белок-белковых взаимодействий [9].

У человека известны четыре прионных болезни, связанные с агрегацией прионного белка, РгР. Это болезнь куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба, а также синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера и фатальная семейная инсомния.

Особенностью прионных заболеваний является долгий латентный период: он может измеряться десятилетиями. Особую опасность представляет возможность межвидовой передачи прионных болезней. Например, эпидемия так называемого «бешенства коров» послужила причиной возникновения «нового варианта болезни Крейтцфельда-Якоба» (нвБКЯ) у людей, принимавших в пищу мясо заражённых животных. Название болезни отражает клиническую картину, практически не отличимую от таковой при классическом варианте болезни Крейтцфельда-Якоба (БКЯ) [4, 123].

Следует отметить, что белковые агрегаты могут образовываться не только при прионных заболеваниях. По своей природе прионы очень напоминают другой широко распространенный феномен - амилоиды. Амилоиды - это отложения фибриллярных белков, накапливающиеся при некоторых болезнях человека, называемых амилоидозами.

В 90-х годах прошлого века прионы были найдены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также у мицелиального гриба Podospora anserina и некоторых других эукариот [38, 41, 150]. В отличие от человека и млекопитающих, подверженных нейродегенеративным прионным заболеваниям, низшие эукариоты при переходе белков в автокаталитически поддерживаемое прионное состояние приобретают нехромосомно наследуемые признаки, зачастую эволюционно прогрессивные.

Обнаружение белков с прионными свойствами у низших организмов имеет не только самостоятельную научную ценность, но также открывает возможности для всестороннего изучения феномена прионизации, ведь дрожжевые прионы не опасны для человека, следовательно, на работу с ними не накладываются ограничения, актуальные для работы с инфекционными белками животных. Кроме того, дрожжи Saccharomyces cerevisiae в качестве классического объекта генетических исследований имеют широкую базу хорошо

6

разработанных молекулярно-биологических методов, что способствует быстрой наработке данных по прионам дрожжей.

Нехромосомно наследуемый детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae является фенотипическим отражением прионного состояния белка Sup35p - члена семейства факторов терминации трансляции eRF3. Среди прионных детерминант низших эукариот [P/S7+] является наиболее хорошо изученным.

Аптамеры (лат. aptus - подходящий) - это молекулы однонитевой РНК или ДНК, которые связывают избранную мишень с высокой аффинностью и специфичностью за счёт своей вторичной и третичной структуры. Именно вторичная структура аптамера позволяет ему образовывать с мишенью гидрофобные, водородные и электростатические контакты. Известно, что основными элементами вторичной структуры аптамеров являются короткие двуцепочечные участки, образованные за счет комплементарного спаривания оснований, и одноцечочечные петли. При этом одноцепочечные участки аптамера отвечают за специфичность взаимодействия аптамера с мишенью, а двухцепочечные стабилизируют структуру аптамера и обеспечивают правильное расположение функциональных групп для узнавания аптамером мишени [2].

Аптамеры по сути являются аналогами моноклональных антител. Соответственно, основные области применения аптамеров и антител совпадают - аптамеры могут использоваться как в протеомике, для изучения пространственных структур и функциональных свойств белков, так и в медицине, для диагностики и лечения ряда заболеваний [102, 131].

Опасные свойства прионов - инфекционность и способность преодолевать межвидовые барьеры, - обусловливают высокий интерес к их исследованию. Разработка систем диагностики и лечения прионных болезней представляет важную научно-медицинскую задачу. Особую сложность представляет преодоление гематоэнцефалического барьера, так как на поздних стадиях болезни агрегаты РгР локализуются в мозгу, что сопуствтует нарастанию нежелательной неврологической симптоматики [4].

Явление прионного перехода мономер -> полимер до сих пор до конца не изучено, и использование аптамеров является перспективным подходом к исследованию прионного феномена. На данный момент получены аптамеры как к белку РгР различных млекопитающих [90, 87, 98, 105, 112, 131], так и к некоторым амилоидным белкам человека [29, 111].

Основываясь на структурной схожести прионных и амилоидных фибрилл, образованных не родственными по первичной структуре мономерами, мы избрали своей

целью получение аптамеров к фибриллярной форме дрожжевого прионного белка Sup35p, и предположили, что эти аптамеры смогут взаимодействовать с прионными и амилоидными полимерами других белков. Для достижения данной цели мы поставили перед собой следующие задачи:

• Выделить рекомбинантный фрагмент NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae в препаративных количествах из продуцирующих его клеток Escherichia coli.

• Полимеризовать препарат мономера Sup35NM и охарактеризовать полученные полимеры. Составить мишень для SELEX из полимеров белка Sup35NM.

• Отобрать аптамеры к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM.

• Охарактеризовать полученные аптамеры: проанализировать первичные последовательности, найти возможные группы гомологии, выбрать последовательности для химического синтеза.

• Подтвердить специфичность избранных аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM в ИФА-подобном протоколе, измерить Kd комплексов [аптамер-фибриллярный Sup35NM] для избранных аптамеров. Отследить возможные особенности вторичной структуры избранных аптамеров при помощи компьютерных программ.

• Определить специфичность охарактеризованных аптамеров к нерастворимым в детергентах агрегатам белка Sup35p, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Проверить сродство аптамеров к нерастворимым в детергентах агрегатам ряда других амилоидогенных белков, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Список сокращений и обозначений

РНК - рибонуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ SDS - додецилсульфат натрия

PrD - прионный домен; домен белка, необходимый для поддержания его прионного состояния

БСА - бычий сывороточный альбумин ПААГ - полиакриламидный гель ДАБ - диаминобензидин Е. coli — Escherichia coli

Xgal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-0-галактопиранозид

IPTG - изопропилтиогалактозид

a.o. - амнокислотный остаток

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

«дцПЦР» - полимеразная цепная реакция с равным соотношением праймеров dirS и revS, с получением двухцепочечного ДНК-продукта

«оцПЦР» - полимеразная цепная реакция с соотношением праймеров ¿//rS:revS=10:l, с получением преимущественно одноцепочечного продукта

Обзор литературы Часть I. Прионы

Прионная концепция

Прионная концепция возникла при необходимости объяснения ненуклеиновой природы некоторых инфекционных энцефалопатий. Необычные свойства инфекционного агента, вызывающего скрейпи, были впервые отмечены ещё в 1966 году [13], а в начале 80-х С. Прузинер выделил из мозга животных, больных скрейпи, инфекционный агент, и описал его свойства. Оказалось, что инфекционные свойства выделенного агента сохраняются после обработки протеиназой К, мочевиной, SDS, хаотропными солями, нуклеазами и псораленами, однако теряются после обработки ионизирующим излучением в присутствии кислорода. Таким образом, патоген проявляет свойства не нуклеиновой кислоты, но гидрофобного белка, ассоциированного с мембраной [109]. В связи с этим авторы ввели термин «прион»