Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прионоподобный детерминант (PSI) дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE: механизм репликации и роль в терминации трансляции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Прионоподобный детерминант (PSI) дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE: механизм репликации и роль в терминации трансляции"

од

На правах рукописи

ПАУШКИН Сергей Владимирович

ПРИОНОПОДОБНЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ [Я5Г] ДРОЖЖЕЙ ЪАССНЛКОтСЕЪ СЕЯЕУтЛЕ-. МЕХАНИЗМ РЕПЛИКАЦИИ И РОЛЬ В ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ПАУШКИН Сергей Владимирович

ПРИОНОПОДОБНЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ \Р$Г] ДРОЖЖЕЙ ЯАССНАКОЖСЕБ СЕЯЕтМЕ: МЕХАНИЗМ РЕПЛИКАЦИИ И РОЛЬ В ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

03.00.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор М. Д. Тер-Аванесян Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор О. О. Фаворова доктор химических наук А. Б. Вартапетян

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Зашита состоится 17 июня 1998г. в 11 часов

на заседании диссертационного совета К 074.22.02 в Институте экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Автореферат разослан «/^ » АС^З. $__1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

О

Т. И. Венгеровя

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, задачи работы. Предлагаемая работа посвящена созданию удобной экспериментальной модели для исследования молекулярной природы уникального класса нейродегенеративных заболеваний человека и животных, таких как скрэйпи овец и синдром Крейцфельда-Лкоба человека. Несмотря на то, что у животных эгн заболевания описаны около двухсот лет назад, а у человека в начале этого века, их природа оставалась непонятной вплоть до последнего времени. Объяснение столь медленному прогрессу в исследовании природы этих заболеваний заключается в их исключительно необычной этиологии: известно, что данные заболевания могут возникать спорадически и в то же время они могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Долгое время комбинация этих трех свойств казалась абсолютно необъяснимой. В 1967 была предложена так называемая «белковая» гипотеза, подразумевающая, что инфекционный агент, вызывающий эти заболевания, который полущи названия «прион», представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподдержанию при помощи некоего автокаталиткческого механизма. Эта революционная гипотеза получила в настоящее Еремя солидное экспериментальное подтверждение в основном благодаря использованию удобных животных моделей и переходу на генно-инженерные методы исследования. В последнее время данные заболевания приковали к себе особо пристальное внимание исследователей не только в силу своей уникальности с точки зрения фундаментальной медицины и биологии, но из-за эпидемического характера их распространения у сельскохозяйственных животных в ряде стран Западной Европы. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку.

Три года назад появилась работа, предсказывающая существование прионов у дрожжей Засскаготусей сегехчзгае. Высказанная гипотеза подразумевала, что цитоплазматический способ наследования двух необычных генетических детерминант дрожжей [Л!>/] и [Ь'ЯЕЗ] объясняется их прионоподобной природой. Эта революционная концепция была основана исключительно на генетических наблюдениях и нуждалась в биохимическом подтверждении. В связи с этим конкретная задача данной работы состояла, в основном, в исследовании природы прионоподобного детерминанта [Л?/4], а именно: в доказательстве зависимости свойств белка Бир35р от детерминанта [Р.?/], в исследовании механизмов проявления супрессорного фенотипа детерминанта [.Р&Г], в

изучении механизмов наследования детерминанта [Р^Г], в исследовании влияния мутаций в гене SUP35 на наследование и проявление детерминанта [PS1/"].

Научная новизна результатов. В ходе работы впервые удалось доказать, что фенотип [/W] действительно связан с белком Sup35p. Также было показано, что данный белок обладает рядом свойств, присущих прионам. Были исследованы механизмы взаимодействия Sup35p с белком Sup45p, в результате чего был предложен новый механизм регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне. Была разработана бесклеточная система для исследования прионоподобного превращения белка Sup35p, при помощи которой было показано, что Sup35ppsi" превращается в прионоподобную протеазоустойчивую форму, если он прединкубируется с Sup35pPSI'. Такой конформационный переход был повторен в последовательных циклах, что позволило смоделировать in vitro наследование детерминанта [PSÍ], Белок Sup35pps" был очищен и показана его высокая способность к превращению Sup35ppb'~ в прионоподобную изоформу [PS/1']. Это доказывает, что Sup35ppsl+ является единственным белком, требующимся для прионоподобного превращения белка Sup35p, таким образом, подтверждает верность прионной концепции для детерминанта [PS/]. В ходе работы были получены данные, указывающие на справедливость полимеризациоиной модели . прионоподобного превращения белка Sup35p. Был также установлен механизм элиминации детерминанта [/\S'/h] за счет мутации в N-концевой последовательности гена SUP35. Следует отметить, что значение работы не исчерпывается только созданием простой экспериментальной системы для исследования этиологии и патогенеза прионных заболеваний, но имеет гораздо более широкое общебиологическое значение, поскольку открывает перспективы изучения некоторых механизмов эпигенетической («белковой») наследственности.

Практическая ценность работы. Изучение прионных заболеваний на моделях трансгенных животных встречает ряд технологических трудностей. Использование дрожжей Sacharomyces cerevisiae в качестве модельного объекта значительно облегчает изучение общих механизмов, присущих явлению прионов, так как дрожжи представляют собой наиболее удобный для молекулярно-генетического анализа эукариотический организм.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 17-ой Международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Lisboa, 1995), 50-ой конференции Корейской Ассоциации Биологических Наук (Seoul, 1996), Международной конференции «Translational control» (Cold Spring Harbor, 1996), Международной конференции имени Жака Moho «Post-transcriptional regulation: molecular

and functional aspects» (Assois, 1997), межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б статей и 2 тезисных сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 120 страницах и включает 23 рисунка, 2 таблицы и список литературы, содержащий 116 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке 1 схематически изображены различные варианты белка Stip35p. Все плазмиды, использованные в работе, были любезно предоставлены В.В Кушнировым, Н.В. Кочневой-Первуховой, М.О. Агафоновым (лаборатория молекулярной генетики ИЭК РКНПК, Москва), а также М. Богутоп (Институт биохимии и биофизики, Варшава).

Большая часть биохимических методов бьиа разработана автором в ходе работы.

В работе использовали следующие штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: 5V-1119 (МАТа adc2-l SUQ5 canl-100 leu2-3,112 игаЗ-52, [PS/] или [ртГ]), 1-5V-H19 (5V-H19 с заменой SUP35 на sup35-C), 2-5V-H19 (5V-H19 с заменой SUP35 на sup35-MC), 3-5V-I119 (5V-H19 с заменой SUP35 на sup35-AB\ P-5V-H19 (5V-H19 с заменой SUP35 на SUP35-P2).

\ ЦЩ гр

м

Рисунок 1

Варианты белка вирЗБр, использованные в работе. Вверху приведены положения аминокислотных остатков.

Белок Аллель

Sup35p SUP35

Sup35ABp svp33-AB

Sup35MCp mp35-MC

Sup35Cp suplS-C

Sup35MC'ASp sup35-MCAS

Sup35Nlp sup35-Nl

Sup35Mp svp35-M

Sup35N2p sup35-N2

Sup35NMp sup35-NM

Sup35ASp sup35-,\S

GST-Sup35p GST-SUP35 GST-Sup35NMp GST-s,ip35-N.\f GST-Sup35Cp GST-sup35-C

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Способность белка Sup35p к олигомеризации in vitro зависит от его статуса.

Как было показано ранее, N-концевой домен белка Sup35p необходим для существования детерминанта [Я5/ ] (Ter-Avanesyan el al., 1994). Это позволило предположить, что прионоподобные свойства белка Sup35p могут зависеть от состояния его N-концевого домена. Поскольку прионная концепция предполагает, что процесс конформационной перестройки происходит во время взаимодействия белков РгРс и PrPSt, бьша проверена способность молекул белка Sup35p к олигомеризации, а также изучена роль домена N белка Sup35p в таком взаимодействии.

Для этого в E.coli был экспрессирован гибридный белок, состоящий из N-концевого фрагмента белка Sup35p и глютатион S-трансферазы. Затем к иммобилизованному на глютатион сефарозе белку был добавлен лизаг клеток [PSt] шти [/мГ] штамма 5.V-H19. Взаимодействия с белком Sup35p не удалось установить. Было высказано предположение о том, что глютатион S-трансфераза ингибирует такое взаимодействие. Поэтому N-концевой фрагмент белка Sup35p был протеолитически отщеплен от глютатион S-трансферазы при помощи тромбина и коваленгно связан с носителем Affi-Gel 10. Затем Affi-Gel с иммобилизованным N-концевым доменом Sup35p был использован для изучения взаимодействия с белком Sup35p из лизатов клеток [PS1/*] и [pjf] штамма 5V-H19. В результате было зафиксировано взаимодействие с белком Sup35p га лизата клеток [Л9Г], но не из [psi] (рис.2). Из этого можно было сделать следующие выводы:

о. а.

2 5

Рисунок 2

Взаимодействие белка БирЗбр из лизата клеток $ й дрожжей с бактериально-экспрессированным

§" §" Ы-концевым фрагментом белка ¿ир35р.

_ 2 —41 Белковые препараты анализировали методом

О О О О иммуноблоттинга с использованием антител к

£ £ 1 £ Е 8ир35р. < < с; < < Обозначения

...... ~~ ~~ Лизат: пизаты клеток [Р5Г] и [ряг].

§ир35„_^ . __ _ ■■ А№-ве1: А№-Эе! 10 после инкубации с лизатами

[РЭП и [рвг] клеток.

АШ-Ое1-Бир35ЫМр: АЯЬСе! 10 с иммобилизованным Эир35ЫМр после инкубации с лизатами [РЭГ] и [рэг] клеток.

[psn Ipsi]

1. Молекулы белка БирЗбр могут существовать по крайней мере в двух формах: [Р57'] (8ир35рге|+) или [/иГ] (8ир35рр51-), различающихся по способности образовывать олигомеры.

2. Взаимодействие между молекулами белка Sup35p происходит с участием их N-концевых доменов.

3. Слияние глютатион S-трансферазы с N-концевым участком Sup35p блокирует олигомеризацшо молекул белка Sup35p.

Белок Sup35p образует высокомолекулярные агрегаты в клетках fPS/*"!.

Способность молекул белка Sup35p к олигомеризации позволила предположить, что Sup35p подобно прионам млекопитающих может агрегировать в клетках [Р5Г]. Для того, чтобы проверить это предположение экстракты клеток [PS/*] и \psî\ штамма 5V-H19 были фракционированы при помощи гель-фильтрации на Сефакриле S-300. Snp35p из лизата клеток [PS/*] был найден в высокомолекулярных фракциях и практически не обнаруживался во фракциях, молекулярный вес которых был меньше 1000 кДа, в то время как приблизительно 70 % белка Sup35p из лизата клеток \psî] было найдено во фракции, молекулярный вес которой соответствует 140 кДа (рис.ЗА). Центрифугирование лнзатов

А

свооодныи объем колонки

669 кДа

I

140 кДа

I

67 кДа

I

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

цитозоль 40S 60S 80S

I ""l I if"

12 3 4 5 6

ПОЛИСОМЫ

I-*

7 8 ч 10 11 12

О л

U

\psr\

[¿>Sr]

[Р5Л]

\psi-]

обнаружены цитозольные белки, рибосомные субъединицы (40Э также полирибосомы.

О; осадок, полученный в результате центрифугирования, Л: исходный лизат клеток. Цифрами обозначены номера фракций.

Рисунок 3

Фракционирование белков лизатов [PSI*] и [psr] клеток (А) Гель-фильтрация на колонке с Sephacryl S-300 (Б) Центрифугирование в линейном градиента сахарозы Белковые препараты

анализировали методом

иммуноблоттинга с

использованием антител к Sup35p. Обозначения:

(А): Стрелки указывают на фракции , в которых были зафиксированы пики выхода белков, использованных для калибровки колонки. (Б): Стрелки указывают на фракции линейного градиента сахарозы, в которых были 60S), монорибосомы (80S), а

клеток и [/от"] через линейный градиент сахарозы показало, что белок 5ир35р

коседиментнрует с полирибосомами и что больше половины его находится в осадке, коэффициент седиментации которого соответствует коэффициенту седиментации

полирибосом, состоящих из 8-10 рибосом (рис.ЗБ). Для того чтобы исключить ассоциацию белка Sup35p с полирибосомами, лизат клеток [PS/*] бьш обработан веществами, стабилизирующими или разрушающими полирибосомы: ингибитором элонгации трансляции циклогексемидом, ингибитором шшциации трансляции NaN3 или РНКазой А. Ни одна из этих обработок не привела к перераспределению Sup35p, доказывая, что полирибосомы не являются существенным компонентом агрегатов Sup35p. Обработка этих комплексов при помощи 1М КС1, 1М UC1 или 1% Triton Х-100 (неионный детергент) также не привела к существенному перераспределению белка Sup35p, вместе с тем, другие белки переходили в более низкомолекулярную форму и не тестировались в осадках характерных для клеток [PS1/].

Белок S^Sp1^1' устойчив к действию протеаз.

При помощи метода иммуноблоттинга с поликлональными антителами к белку Sup35p было выявлено, что количество Sup35p в клетках [PSf] штамма 5V-H19 примерно в 10 раз выше по сравнению с клетками |/wf] того же штамма. Более того, Sup35p в лизатах клеток [psf] имел более высокую степень деградации по сравнению с лизатом клеток [Р5/~]. Поскольку уровень мРНК гена SUP35 в клетках [PS/^] не отличался от такового в клетках [р.?Г] (Ter-Avanesyan eta!., 1994), то накопление Sup35p в клетках [PSI] могло являться следствием повышенной протеазоустойчивости белка Sup35pPSIl\ Клеточные экстракты клеток [PSt] и [psi] были обработаны протеииазой К, в результате чего была выявлена повышенная протеазоустойчивость Sup35ppsl+ (рис.4). Разница в протеазоусгойчивости

но 8 0 4.0 2.0 1.0 0 4 0.2

протеиназа К (мкг/мл)

Sup35p•

Sup35p ■

[рт/-]

[PSl>

Рисунок 4

Протеазоустойчивость белка Sup35p в клетках [PSI*] и [psr].

Белковые препараты анализировали методом иммуноблоттинга с использованием антител к белку Sup35p.

Обозначения:

НО: клеточные лизаты, не обработанные протеиназой К.

Цифрами обозначены соответствующие концентрации протеиназы К.

Дорожка НО показывает повышенное содержание белка вирЗбр в [РЭ/*] клетках по

сравнению с клетками \psi-], поскольку при нанесении на акриламидный гель препараты

клеток [Рй/*] были разведены в 10 раз по сравнению препаратами клеток [рзг]. Препараты,

обработанные протеиназой К были нанесены на гель в тех же пропорциях.

Sup35pps,+ и Sup35ppM" может быть объяснена способностью молекул белка Sup35pPSI+ к формированию агрегатов, устойчивых к действию протеаз. Однако стоит отметить, что [Р.ЧТ^-зависимая протеазоустойчивость не была столь сильно выражена, как это имеет место в случае прионов млекопитающих (Meyer et al., 1986). Более того, в отличии от прионов млекопитающих, в молекулах белка Sup35pPS1+ не было обнаружено протеазоустойчивого ядра (core).

Супрессорный фенотип клеток [7'.S7'1 связан с агрегацией белка Sup35p.

Было предположено, что [PST*] агрегация белка Sup35p ингибирует его активность в терминации трансляции, повышая уровень сквозного прочтения нонсенс-кодонов, что приводит к супрессорному фенотипу, характерному для клеток [PS-/"]. Поскольку N-концевой домен белка Sup35p необходим для [/>5/+]-зависимой олигомеризации молекул Sup35p, можно предположить, что молекулы Sup35p с утраченным доменом N не способны включаться в Sup35pps!+ агрегаты. Чтобы проверить это, штамм 5V-H19 [P.ST] был трансформирован плазмидой, кодирующей белок Sup35p, в котором отсутствовали первые 123 аминокислоты. Клеточный лизат такого трансформанта был проанализирован при помощи дифференциального центрифугирован™ через 30% сахарозу. В результате, большая часть белка с N-концсвон делецией была обнаружена в растворимой фракции, в то время как полноразмерный Sup35p преимущественно был найден в осадке. В отличии от штамма 5V-H19 [PS/4"] анализируемый трансформант имел ярко выраженный ангисупрессорный фенотип. Таким образом, белок Sup35p с нарушениями в N домене препятствует проявлению супрессорного фенотипа детерминанта [Р^Г] в связи с тем, что он остается в растворимой функционально активной форме.

Черновым с соавторами было показано, что 2-4-кратная сверхэкспрессия шаперона Hspl04p ингибирует проявление супрессорного фенотипа в клетках [P.ST], При этом, сверхэкспрессия Hspl04p вызывает элиминацию детерминанта [PS/] (Chernoff et al., 1995). Поскольку Hspl04p растворяет белковые агрегаты (Parsell et al, 1994), было предположено, что средний уровень экспрессии Hspl04p может частично растворять Sup35ppsu агрегаты, приводя к появлению Sup35p в растворимой функционально активной форме, которая является причиной антисупрессорного фенотипа. Чтобы проверить это предположение, штамм 5V-H19 [PSt] был трансформирован многокопийной плазмидой, кодирующей ген HSP104. Такие трансформанты обладали антисупрессорным фенотипом и постепенно накапливали клетки [psf]. Клетки одного из таких трансформантов были собраны и лизированы на 5-ый день после трансформации. При помощи

дифференциального центрифугирования данного лизата был выявлен достаточно высокий уровень растворимой формы 5ир35р (рис.5Д). Появление 8ир35р в растворимой фракции

4

5

4

5

А

Г

Д

Sup35p ■ Sup45p ■

Sup35p Sup.35/\Bp -Sup35NMp

«■»«a» ■;;«ии(р.:

--'r'.^—)

S»'

Sup45p —

В Sup35p^

Sup35ABp —

Sup35N2p —

Sup45p —

&W :

Sup35p Sup35dBp — trtar

Sup35Nip • Sup45p ■

•y«

Ȏa>

Sup35p • Sup45p *

Рисунок S

Распределение Sup35p и Sup45p в [PSI*] и [psr] клетках.

(A) 5V-H19 [PS/*] и [psi-]

(Б) 3-5V-H19 [PS/*] и 5V-H19 [psr], трансформированные плазмидой pYex4-SUP35NM, кодирующей белок Sup35NMp

(B) 3-5V-H19 [PS/*] и 5V-H19 [psr], трансформированные плазмидой pYex4-SUP35N2, кодирующей белок Sup35N2p

(Г) 3-5V-H19 [PSr] и 5V-H19 [psr], трансформированные плазмидой pYex4-SUP35N1, кодирующей белок Sup35N1p

(Д) 5V-H19 [PS/*],

трансформированный плазмидой pFL44L-HSP104, кодирующей белок Hsp104p

Лизаты клеток были

фракционированы посредством центрифугирования через 30% сахарозу. Полученные фракции были проанализированы методом иммуноблоттинга с

поликлональными антителами к белкам Sup35p и Sup45p. Обозначения:

цитозоль, сахароза, осадок: название фракций, полученных в результате дифференциального центрифугирования.

8

[Р£/+] \psi-]

не могло быть объяснено накоплением клеток [psf], поскольку последние составляли только 2% в культуре. Это наблюдение указывает на то, что Hspl04p растворяет агрегаты Sup35pps|f. Вначале это приводит к появлению Sup35p в растворимой форме и,

соответственно, к антисупрессорному фенотипу, а затем ведет к потере детерминанта ¡PSI ] вследствие полного растворения агрегатов Sup35pPSI+.

N-кониевые фрагменты белка Sup35p также формируют агрегаты в клетках [Р51/].

Как было показано ранее, первые 113 аминокислот белка Sup35p играют ключевую роль в поддержании детерминанта [P.S/] (Ter-Avanesyan et al., 1994). Однако ранее не было показано, что эта часть Sup35p достаточна для его олигомеризаиии. Чтобы проверить это, клеточные экстракты [PSI*] и [ртг"] штаммов, экспрессируютдих N-концевые фрагменты Sup35p, были проанализированы при помощи дифференциального центрифугирования. Для получения [PS/] формы различных делеционных вариантов Sup35p, штамм 3-5V-H19 [/«;"] с частичной делецией N-концевой последовательности гена SUP35 был трансформирован многокопийнами плазмидами, кодирующимий Sup35Nlp, Sup35N2p, либо Sup35NMp. Такая трансформация приводила к появлению и накоплению клеток, содержащих детерминант [PSf], что было подтверждено в генетических экспериментах. Введение таких плазмвд в штамм 5V-H19 \psi], содержащий полную последовательность гена SUP35, не приводило к появлению de novo детерминанта [PSf], что позволило использовать этот штамм в качестве контроля [pjf]. Фракции, полученные в результате центрифугирования лизатов через 30% сахарозную подушку, были проанализированы при помощи иммуноблогтинга с поликлональными антителами к Sup35p. Sup35NMp был найден в цитозольной и сахарозной фракциях лизата [ртГ], в то время как в лизате [PS/] данный белок обнаруживался в сахарозной фракции и в осадке (рис.5Б). Разница в распределении Sup35NMp была похожа на распределение Sup35p в [/".ST"'] и в [/«;"] клетках. Sup35N2p и Sup35Nlp преимущественно находились в цитозольной фракции в клетках [psf], в то время как в клетках [PS/] они перемещались в сахарозную фракцию (рис.5В,Г). Таким образом, все три N-концевых фрагмента белка Sup35p могут образовывать агрегаты в клетках [PS/]. Белок Sup35ABp, у которого отсутствует способность к олигомернзацип, не включался в состав агрегатов [PS/] и всегда находился в растворимых фракциях лизатов клеток [PSf]. Стоит обратить внимание на то, что агрегаты [PSi] белков Sup35Nlp и Sup35N2p седнментировали более медленно, чем Sup35p и Sup35NMp. Это может быть следствием следующих причин:

1. Данные белки имеют более низкий уровень экспрессии;

2. Они имеют более низкий молекулярный вес;

3. Некоторые взаимодействующие белки могут включаться в состав агрегатов Sup35p и Sup35NMp, но не [PS/] агрегаты Sup35Nlp и Sup35N2p.

[Р..5,Г]-специфичные агрегаты N-концевьгх фрагментов белка Sup35p обладают повышенной протеазоустойчиростыо.

Как было показано ранее, Sup35p в состоянии [PS/] обладает повышенной устойчивостью к действию клеточных протеаз и протеиназы К (рис.4). Повышенная устойчивость к действию протеаз коррелировала с накоплением Sup35p в клетках [PS71]. Было установлено, что количество Sup35NMp в клетках [AS1/] в 8 раз превышает его содержание в клетках \psi~\. Для Sup35N2p характерно 4-х кратное превышение количества белка Sup35N2p в клетках [PS/], а для Sup35Nlp - 3-х кратное превышение. Этот результат позволил предположить, что находясь в состоянии [PS.T] эти белки обладают повышенной устойчивостью к действию протеаз. Обработка этих белков протеиназой К подтвердила данное предположение. Таким образом, все варианты Sup35p, которые образуют агрегаты в клетках [PSI'], проявляют повышенную устойчивость к действию протеиназы К.

Sup35pp"" переходит в форму [PS/] in vitro в присутствии белка Sup35ppsi+.

Несмотря на то, что результаты представленные выше свидетельствовали в пользу прионной концепции детерминанта [Р5/ ], для подтверждения этой гипотезы необходимо было показать, что именно Sup35pPsl+ вызывает переход Sup35ppM" в прионоподобную форму [PS'/']. В связи с этим, была разработана специальная система для изучения таких переходов in vitro.

Как было показано ранее, N-концевые фрагменты Sup35p, экспрессирующиеся в клетках [PS/], обладают теми же свойствами, что и полноразмерный Sup35pPslt, то есть способностью к агрегации и протеазоустойчивостью. Это обстоятельство позволило нам в дальнейшем отличать белок Sup35p в смесях лизатов клеток [psf] и [Р5/4]. Переход в прионоподобную форму [Р£Г] регистрировали по иереходу Sup35ppsi" из цишзолыюй фракции во фракцию осадка. Чтобы проверить, возможно ли такое превращение, лизат клеток штамма 5V-H19 [psf], трансформированного многокопийной плазмидой, кодирующей Sup35NMp, был смешан с лизатом клеток штамма 5V-H19 [PSf], После двухчасовой инкубации Sup35NMp и Snp35p проявляли повышенную протеазоустойчивость и седиментировали во время дифференциального центрифугирования подобно Sup35pPSI+ (рис.6). В качестве контроля лизат клеток соответствующего штамма \psi] инкубировати в течении 2 часов без добавления лизата клеток [PS/]. В данном случае никакой агрегации и протеазоустойчивости белков Sup35NMp и Sup35p не было зафиксировано (рис.6). Эффективность перехода Sup35ppsJ' в

и

Центрифугирование

20 мин.

\rsi-]

Обработка протеиназой К

_о__о_ но 4Ю 2^^0 04 РК (мкг/мл)

2 часа

\psl-]

■ 5ир35НМр

■ — 8ир35р

Рисунок 6

Переход белка 5ир35ММрР3'-в агрегированную лротеазоустойчивую форму в присутствии белка 8ир35рР№.

Клеточные лизаты [РЭ/*] и [рэг] клеток смешивали и инкубировали в течение 20 минут или 2 часов. Затем препараты были обработаны протеиназой К и проанализированы методом дифференциального центрифугирования с последующим иммуноблоттингом с антителами к ЭирЗБр.

о. о

Эксперимент: лизат клеток штамма 5\/-Н19 [рзг], трансформированного многокопийной плазмидой рУех4-511Р35ММ, был смешан с лизатом клеток штамма 5\/-Н19 [Р5/*]. Контроль: лизат клеток штамма 5У-Н19 [ргг], трансформированного многокопийной плазмидой рУех4-311Р35Ш, был инкубирован в течение 2 часов, а затем обработан протеиназой К и проанализирован методом дифференциального центрифугирования. Также приведена картина распределения белка БирЗбр в экстракте клеток штамма 5\/-Н19 [Рв/*] до его смешивания с лизатом клеток [р$г]. Обозначения:

цитозоль, сахароза, осадок: название фракций, полученных в результате

дифференциального центрифугирования.

НО: клеточные лизаты, не обработанные протеиназой К

Цифрами обозначены соответствующие концентрации протеиназы К (РК).

форму [Р5/'] зависела от времени инкубации: так, уже после 20 минутной инкубации, большая часть 5ир35ЫМрр5'~ переходила в форму [Р5Г], в то время как 2 часовая инкубация приводила к полному исчезновению цитозольной формы этого белка. Была проверена способность полноразмерного белка 8ир35рр5'" превращаться в прионоподобную форму [Р5Г] под действием 5ир35КМрР511'. Эффективность такого превращения была несколько ниже, чем в первом случае. Так, 90% 5ир35ррз'" переходило в агрегированную протеазоустой'швую форму после 2 часовой инкубации. Это свидетельствует о том, что удаление домена С приводит к повышению способности белка 8ир35р к переходу в прионоподобную форму [Р5/*]. Во всех экспериментах, описанных выше, белок [Р5Г] брали в реакцию в 2-х кратном избытке по отношению к белку [р^Г]. Уменьшение количества белка [Р5/], взятого для инициации реакции, приводило к снижению эффективности перехода. Так например, 10-кратный избыток формы [р^Г] белка 8ир35р

приводил к тому, что только 50% ЗирЗбр1™" переходило в состояние [/'5/+] в течение 3-х часовой инкубации.

А

осадок

осадок

л с; о

о о

I-П

5ир35р — « 8ир35Л5р—

л

с;

о О

ч о Ч

го (11

о о

о Я о

т» ега

с; о

5

о ч га о о

л л м

с; ц Ц

о о о

го О С0 О п О

О ч о ч О ч

1- го н го 1- го

о о ^ о

Л* о и о :х о

вирЗЗММр-

J L

J 1_

Конфоль 1 Кон фоль 2

Рисунок 7

Последовательные циклы прионоподобного превращения (А) Схематическое изображение эксперимента

(Б) Дифференциальное центрифугирование с последующим иммуноблоттингом с антителами к 3ир35р.

1 - первый цикл: клеточные лизаты штамма 1-5У-Н19 [Рй/*], трансформированного многокопийной плазмидой рУех4-311Р35ЫМ, и 5\/-Н19 [р5г] смешивались и инкубировались в течение 2 часов. Белок 5ир35рР5'~ был взят в 10-кратном избытке по сравнению с белком 5ир35КМрр5'*.

2 - второй цикл: осадок, полученный в результате реакции 1-го цикла был смешан с лизатом клеток штамма 5\/-Н19 [рэг] при 7-кратном избытке белка 3ир35р3'-.

3 - третий цикл: осадок, полученный в результате реакции 2-го цикла был смешан с лизатом клеток штамма 5\/-Н19 [ряг] при 7-кратном избытке белка 3ир35р5''.

4 - четвертый цикл: осадок, полученный в результате реакции 3-го цикла был смешан с лизатом клеток штамма 5\/-Н19 [ргг], трасформированного плазмидой рУех4-31)Р35АЗ. Соотношение количества белка 8ир35Д8рР!1'" к белку ЭирЗБр из осадка, полученного в 3-ем цикле, составляло 4:1.

Контроль 1 - является контролем к первым 3-м циклам: распределение белка БирЗбр в лизате штамма 5\/-Н19 [рэг] после 2-х часовой инкубации.

Контроль 2 - является котролем к 4-му циклу: распределение белка 8ир35ЛЭрР5'- в лизате штамма 5\/-Н19 [рзг], трансформированного многокопийной плазмидой рУех4-311Р35ЛЗ, после 2-х часовой инкубации. Обозначения:

цитозоль и осадок: цитозольная фракция и фракция осадка, полученные в результате дифференциального центрифугирования.

I

Функциональные критерии прионоподобного перехода Sup35p.

Для того чтобы подтвердить прионоподобиые свойства агрегатов Sup35p, образующихся в результате реакции, осадок, полугенный в результате дифференциального центрифугирования реакционной смеси, был использован в качестве вещества для инициации следующего перехода. Такие циклы были повторены 4 раза. В первой реакции лпзат, содержащий Sup35NMppsl+, был смешан с лизатом [píf], содержащим полноразмерный Sup35p. В двух последующих циклах к качестве инициирующего субстрата был взят осадок, полученный в предыдущем цикле. В последнем 4-ом цикле был использован N-концевой фрагмент Sup35ASp, находящийся в форме [psf]. Следует подчеркнуть, что при прохождении каждого последующего цикла скорость перехода Sup35ppsl~ в форму [PSÍ] не снижалась, хотя количество агрегированного Sup35p, полученного в результате первой реакции, уменьшалось от 4 до 6 раз в каждом цикле (рис.7). Таким образом, при проведении всех циклов количество этого белка уменьшилось приблизительно в 400 раз. В связи с этим, Sup35NMpPSb, использованный для инициации реакции в первом цикле, обнаружимся в следовых количествах в осадке, полученном после второго цикла, и не обнаруживался там вовсе после проведения третьего цикла (рис.7). Таким способом, агрегированная форма белка Sup35p, образовавшаяся в результате реакции, обладает прионоподобными свойствами и может быть использована в качестве материала для запуска новых раундов реакций, что в конечном итоге в системе in viíro моделирует распространение детерминанта [PSP] ш vivo и может служить функциональным критерием прионоподобного перехода белка Sup35pp!1" в форму [PS/1"].

За переход формы ipsЛ белка Sup35p в форму [PSP] отвечают Sup35pPSU агрегаты.

Для объяснения информационного превращения белка РгРс было предложено две модели. Согласно "гетеродимерной" модели переход в PrPSc происходит во время взаимодействия мономерных форм белков РгРс и PrPSc. "Полнмеризационная" модель предполагает, что инфекционные свойства приобретаются во время присоединения молекул белка РгРс к прионному полимеру. При помощи системы, описанной в двух предыдущих разделах, нам удалось проверить верность полимеризационной модели для поддержания прионоподобного детерминанта [PS/]. Клеточный лизат штамма 5V-H19 [Р5Г] был фракционирован при помощи центрифугирования через линейный градиент сахарозы, как было описано ранее. Различные фракции проверялись на их способность переводить растворимую форму [psf] белка Sup35NMp в агрегированную форму [PSÍ], Было установлено, что цитозольная фракция и фракция, имеющая коэффициент

седиментации ЮОБ, не приводили к агрегации 8ир35КМрр!1~, в то время как фракции с более высоким коэффициентом седиментации (2008, 270Б и осадок) обладали способностью переводить 8ир35КМрр"" в состояние [Р5Г]. Таким образом, скорее всего только агрегаты 5ир35рге1+ обладают способностью осуществлять прионоподобное превращение белка 5ир35р в форму [Р5У*]. Можно было бы предположить, что в лизате клеток [ЛУ/*] присутствует специальный цитоплазматический фермент, осуществляющий такое превращение. Тем не менее, отсутствие такой способности у цитозольной фракции противоречит данному утвервдеишо. Данные результаты свидетельствуют в пользу

А

1 2 3

кДа

112 —

846352-

1 2 3

л га л

с; п ц

о О о

1- со о. о к Г)

го о то <=1 го О

т н X га п 1-

го о

с: 3 о о С 3"

.—№р104р

' — 8ир35Д5р — Бир45р

«£«$*«««> «»«а —

БирЗЗр 8ир35Д8р

3532-

Рисунок 8

Способность очищенного белка 5ир35Д8рРЗИ" осуществлять прионоподобное превращение.

(А) Результат очистки белка 8ир35Л5рРВ1 (Б) Результат реакций по смешиванию белков.

На рисунке (А) слева приведен результат БОБ-электрофореза (окрашивание красителем Кумасси голубым); справа приведен результат иммуноблоттинга с поликлональными антителами к НэрКИр, Бир45р, Бир35р.

Дорожка 1 - осадок, полученный в результате первичной очистки клеточного лизата штамма 1-5\/-Н19 [РЙП, трансформированного многокопийной плазмидой рУех4-ЗиР3545.

Дорожки 2 и 3 демонстрируют чистоту препарата после обработки осадка, полученного в результате первичной очистки гидрохлоридом гуанидина (дорожка 1 - 1.25 М; дорожка 2 -2.5 М). На рисунке слева указаны молекулярные массы белков, использованных в качестве стандарта.

Препарат после обработки 2.5 М гидрохлорида гуанидина был смешан с клеточным

лизатом штамма 5\/-Н19 [рвг] [(Б) справа). В качестве контроля тот же лизат, был смешан с

экстрактом клеток штамма 1-5\/-Н19 [РЙГ], трансформированного плазмидой рУех4-

ЗиРЗбДЭ, которая кодирует белок БирЭйДБр [(Б) слева].

Количество белка 5ир35Д5рге|*' в обоих экспериментах было одинаково.

Соотношение количества белка $ир35АЗрР3'* к белку Бир35рР5'- составляло 1:8.

После 2-х часовой инкубации реакционные смеси были проанализированы при помощи

метода дифференциального центрифугирования с последующим иммуноблоттингом с

антителами к 3ир35р, результат которого представлен на рисунке (Б).

Обозначения:

лизат: препараты после смешивания

цитозоль, сахароза, осадок: название фракций, полученных в результате дифференциального центрифугирования.

полимеризационной модели прионоподобного превращения белка Sup35p.

Для подтверждения прионоподобной природы Sup35p, белок Snp35ASppsl+ бьщ очищен до гомогенного состояния и было показано, что такой белок обладает способностью осуществлять прионное превращение с той же эффективностью, что и дрожжевой лизат, содержащий такое же количество белка Sup35ASpPS1+(pnc.8).

Белок Sup35P2p превращается в прионоподобную форму с более низкой эффективностью по сравнению с Sup35p.

Ранее была идентифицирована мутация PNM2 (Psi No More) в гене SUP35 (аллель SUP35-P2), которая приводит к исчезновению детерминанта [PST] (Doel et al., 1994). Данная мутация вызывает замену глицина на аспарагиновую кислоту в 58-ом положении в соответствующем белке (Sup35P2p). В противоположность делециям в N-концевой последовательности Sup35p, данная точковая мутация имеет доминантное проявление, что является свидетельством того, что Sup35P2p мешает превращению белка Sup35p,)SI" в форму [PS/]. Поэтому было решено проверить способность Sup35P2p к превращению в форму [PS/]. Для этого лизат клеток штамма P-5V-H19 [ртГ], экспрессиругощего Sup35P2p, был смешан с осадком, полугенным в результате дифференциального центрифугирования штамма 1-5V-H19 [PS/], трансформированного многокопийной гшазмидой pYex4-SUP35AS. В качестве контроля был взят лизат штамма 5V-H19 [psi], содержащий белок Sup35p дикого типа. Было установлено, что оба белка, полноразмерный Sup35p и Sup35P2p, переходили в агрегированную протеазоустойчивую форму, хотя количество агрегированного Sup35P2p было несколько ниже по сравнению с белком Sup35p дикого типа. Это свидетельствует о том, что Sup35P2p способен превращаться в прионоподобную форму [PS/], но с более низкой эффективностью, чем Sup35p.

Sup35P2p образует прионоподобные агрегаты в клетках [PS/]

В нашей лаборатории было показано (Кочнева-Первухова, неоиубликовано), что детерминант [PS/] способен индуцироваться сверхэкспрессией Sup35P2p. Так как характерной чертой прионной формы белка Sup35p является накопление в клетках [PS/] агрегированной формы Sup35p, то в ходе данной работы бьшо решено проверить, обладает ли подобными свойствами форма [PS/] белка Sup35P2p. Для этого при помощи дифференциального центрифугирования через 30% сахарозу бьщ проанализирован лизат штамма 1-5V-H19 [PS/], трансформированного многокопийной плазмидой, кодирующей

белок Sup35P2AS. Данный белок накапливался в высокомолекулярных агрегатах. Белок с утраченным N доменом (Sup35Cp), кодируемый геномом штамма 1-5V-H19, не включался в состав Sup35P2ASpps,+ агрегатов, поскольку, как мы показали ранее, у белка Sup35Cp отсутствует способность колигомеризации, а следовательно и к переходу в форму [PS/].

Sup35P2pps" способен передавать свою fPS/] конформащпо на молекулы белка Sup35ppsl"

Поскольку белок Sup35P2p способен существовать в форме [PS/], было решено проверить его способность передавать свою конформацию [PS/] молекулам Sup35ppsi". Было установлено, что Sup35pps'~ превращается в агрегированную форму после инкубации с агрегатами Sup35ASp и Sup35P2ASp, полученными в результате дифференциального центрифугирования лизатов клеток штамма 1-5V-H19 [PS/], трансформированного соответствующими многокопийными плазмидами. Переход Sup35ppsl" в состояние [PS/] регистрировали по переходу цитозольной формы Sup35ppsl" в осадок, полученный в результате дифференциального центрифугирования. Эффективность превращения Sup35pps'" в форму [PS/] была несколько выше в случае затравки Sup35ASppsl+. Агрегаты, полученные в результате реакции, были использованы для инициации новой реакции. Такие циклы были последовательно повторены 4 раза. В последнем цикле в качестве белка [/мГ] был использован Sup35NMp из штамма 5V-H19 [psi], трансформированного многокопийной плазмидой, кодирующей данный белок. Sup35ASppslH и Sup35P2ASppsl', которые были использованы для инициации реакции первого цикла, практически не обнаруживались в [PS/] осадке, полученном в результате третьего цикла. Стоит отметить, что уменьшение количества Sup35P2ASppsl+ в последовательных циклах реакций сопровождалось увеличением эффективности этих реакций, в связи с чем, разница в скоростях реакций отсутствовала, начиная с третьего цикла, где бело к Sup35P2ASpPSl+ не детектировался.

Таким образом, скорость прионоподобного превращения уменьшалась, когда Sup35P2p был использован в качестве затравки [PS/] или в качестве белка [psi], С другой стороны, доминантность аллели SUP35-P2 предполагает, что белок Sup35P2p связывается с агрегатами Sup35ppsl+ с той же эффективностью, что и нормальный Sup35p. Это предположение было подтверждено тем, что Sup35P2p и Sup35p связывались с агрегатами Sup35pPSI+ с равной эффективностью. Поэтому Sup35P2p успешно конкурирует с Sup35p за связывание с растущим Sup35ppsi4 агрегатом в [PS/] диплоиде, гетерозиготном по аллели SUP35-P2. Таким образом, не связывание с прионным полимером, а последующие этапы

ирионного превращения, такие как изменение конформашш или присоединение новой молекулы, затруднены в случаеSup35P2p.

Важно подчеркнуть, что дрожжи - это быстро делящиеся одноклеточные организмы и поддержание детерминанта [PSf] требует, чтобы время его «репликации» было меньше времени клеточной генерации. Поскольку степень полимеризации снижена в присутствии Sup35P2p, это приводит к «самостсрилизащш» растущей культуры от детерминанта [PSf],

С-концевой домен Sup35p вовлечен во взаимодействие с Sup45p.

Белок Sup45p гомологичен фактору терминации трансляции высших эукариот eRFl, узнающему в системе ш vitro все три типа нонсенс-кодонов (Frolova et а!., 1994), a Sup35p гомологичен GTP-зависимому стимулирующему фактору eRF3 (Zhouravleva et al., 1995). Результаты генетических исследований подтвердили роль этих белков в терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Как было показано выше, приблизительно 70% белка Sup35p во время хроматографии лизата клеток [psf] было найдено во фракции, молекулярный вес которой соответствует 140 кДа. Пик выхода Sup45p приходился на ту же фракцию, что, возможно, является свидетельством существования стабильного комплекса белка Sup35p С белком Sup45, который принимает участие в терминации трансляции. Нами также в системе in vitro было показано взаимодействие между белками Sup35p и Sup45p (Stansfield et al., 1995). Поэтому было решено локализовать участок Sup35p, участвующий во взаимодействии с Sup45p. Для этого белок Sup45p был экспрессироваи в E.coli в виде гибридного белка с глютатион S-трансферазой и иммобилизован на глютатион сефарозе 4В. Глютатион сефароза с иммобилизованным GST-Sup45p была проинкубирована с лнзатами клеток дрожжей, содержащих различные делеционные варианты белка Sup35p. В качестве отрицательного контроля была использована глютатион S-трансфераза (GST), иммоболизованная на том же носителе. Связавшиеся белки были эяюированы и проанализированы при помощи иммуноблоттинга с поликлональными антителами к Sup35p. GST-Sup45p взаимодействовал с Sup35p как из [PSf] так и из [ртГ] лизатов. Это еще раз доказывало, что взаимодействие Sup35p с Sup45p не зависит от [рл'] статуса молекул Sup35p. Для изучения взаимодействия Sup45p с С-коицевым доменом Sup35p были использованы три штамма, несущие различные 5'-коицевые делешш в последовательности гена SUP35. Клетки этих штаммов содержали белок Sup35p с частичной или полной делецией N и М доменов Sup35p. Бьшо обнаружено, что все эти белки взаимодействуют с GST-Sup45p. Это свидетельствовало о том, что С

домен Sup35p, гомологичный EF-la, содержит сайт для связывания белка Sup45p. Можно было предположить, что такое взаимодействие опосредуется другими белками, содержащимися в клеточных лизатах. Для того, чтобы исключить такую возможность была проверена способность очищенного белка Sup35Cp взаимодействовать с GST-Sup45p. Sup35Cp был получен в результате экспрессии в Е. coli гибридного белка GST-Sup35Cp с последующим протеолитическим отщеплением Sup35Cp от GST при помощи фактора Ха. Таким образом, было зафиксировано связывание белком GST-Sup45p домена С белка Sup35p, что доказывало прямое взаимодействие этих двух белков. Для более точной локализации участка связывания Sup45p в домене С белка Sup35p штамм [Р&Г] был трансформирован плазмидой, кодирующей белок Sup35MCASp, который содержал домен М и первые 230 аминокислот домена С. Данный белок был способен связываться с GST-Sup45p. Сходный результат был получен для штамма [/«Г], трансформированного той же плазмидой. Это взаимодействие не было опосредовано полноразмерным белком Sup35p, который не может взаимодействовать с Sup35MCASp, поскольку в последнем отсутствует домен N. Домен М белка Sup35p не был способен связываться с GST-Sup45p (см. следующий раздел), из чего можно бьшо заключить, что С-концсвой сайт для взаимодействия с Sup45p локализован в первой половине домена С белка Sup35p.

NM фрагмент Sup35p также взаимодействует с Sup45p.

Следующим этапом данной работы была проверка способности N-концевых фрагментов Sup35p взаимодействовать с Sup45p. Для этого носитель с иммобилизованным GST-Sup45p инкубировали с лизатом клеток штамма 5V-H19 [pi/"], трансформированного многокопийной плазмидой, кодирующей Sup35NMp. В результате было показано, что белки Sup35p и Sup35NMp взаимодействуют с GST-Sup45p. Способность белка Sup35NMp к взаимодействию с Sup45p не зависела от его [ps/] конформации, так как GST-Sup45p связывался с Sup35NMpPS1+ из лизата клеток штамма 1-5V-H19 [W-T], трансформированного многокопийной плазмидой pYex4-SUP35NM. Для того чтобы проверить, является ли взаимодействие NM фрагмента Sup35p прямым, то есть не опосредуется ли оно какими-либо другими молекулами, Sup35NMp был выделен из клеточного экстракта этого трансформанта. Очистка белка Sup35NMp повысила эффективность его взаимодействия с GST-Sup45p. Таким образом, взаимодействие между Sup45p и Sup35NMp является прямым.

Для локализации N-концевого сайта связывания был использован штамм [PS/], трансформированный плазмидами, кодирующими белки Sup35Nlp, Sup35Mp, Sup35N2p, которые содержали либо N, либо M домены, либо домен N с первыми 30 аминокислотами домена М, соответственно. Взаимодействие было обнаружено только в случае белка Sup35N2p. Сходные результаты были получены для трансформантов штамма \psï\. Таким образом, сайт для взаимодействия с Sup45p локализован в первой половине NM фрагмента Sup35p, на границе между N и M доменами.

Sup45p агрегирует в клетках [PS/].

В ходе данной работы было показано, что Sup35p формирует высокомолекулярные протеазоустойчивые агрегаты в клетках [PS/]. Поскольку Sup45p взаимодействует с Sup35p, возникло предположение, что [PS/] статус клетки может влиять на распределение белка Sup45p. Чтобы проверить это, экстракты клеток штамма 5V-H19 [PS/] и [psi], были проанализированы методом дифференциального центрифугирования, как описано выше. Полученные фракции анализировали методом иммуноблоттинга с поликлональными антителами к Sup45 и Sup35p. Оба белка имели сходное распределение (рнс.5А): в лпзатах [/«("] большая часть этих белков была обнаружена в цитозольной и рибосомной фракциях, в то время как в клетках [PS/] эти белки были найдены в рибосомной фракции и в осадке. Эти данные указывали на то, что молекулы Sup45p могут включаться в состав агрегатов [PSf], образованных полноразмерным Sup35p, имеющим 2 сайта связывания с Sup45p. Обработка этих комплексов 1М КС1, 1М LiCl , РНКазой А или 1% Triton Х-100 также не привела к существенному перераспределению белка Sup35p и Sup45p, при том, что другие белки переходили в более низкомолекулярную форму и не обнаруживались в [PS/] осадках.

Так как в ходе данной работы было показано, что N-концевые фрагменты Sup35p формируют протеазоустойчивые агрегаты в клетках [PSI ], а белок Sup45p может взаимодействовать с N-концевыми фрагментами белка Sup35p, было решено проверить, может ли белок Sup45p включаться в состав этих агрегатов. Для этого экстракты клеток [PS/] штамма 3-5V-H19 и клеток [psf] штамма 5V-H19, трасформированные плазмидами, кодирующими Sup35"Nlp, Sup35N2p, Sup35NMp, были проанализированы методом дифференциального центрифугирования с дальнейшим выявлением белков методом иммуноблоттинга с поликлональными антителами к Sup45 и Sup35p. Было обнаружено, что в клетках, экспрессирующих Sup35NMp, белок Sup45p оказывался в тех же фракциях, что и Sup35NMpPSIf (рис.5Б). По всей видимости это является результатом взаимодействия

8ир45р с 8ир35ЫМр. Небольшая порция белка 8ир45р, обнаруженная в цитозольной фракции, возможно ассоциированна с молекулами белка 8ир35ДВр. Распределение 8ир45р практически не менялось в случае 8ир35К1р и 8ир35Щр, так как данные белки не образуют достаточно больших агрегатов, способных уходить в осадок при дифференциальном центрифугировании (рис.5В,Г). Тем не менее, было замечено уменьшение количества белка 8ир45р в цитозольной фракции в случае 8ир35№р, что соответствовало распределению 8ир35Шр в клетках [■Р57+]. Отсутствие изменений в распределение Бир45р в случае 8ир35Шр могло быть результатом отсутствия взаимодействия белка 8ир45р с 8ир35Шр.

Несмотря на то, что Бир45р был найден в агрегатах 8ир35рР51+, он не обладал повышенной устойчивостью к действию протеиназы К, В пользу этого также свидетельствует тот факт, что не было выявлено различий в количестве белка 8ир45р в клетках [РБГ] и [/а?Г]. Таким образом, агрегация не всегда приводит к повышению устойчивости к действию протеаз.

Поскольку белок 8ир45р ассоциирован с агрегатами 8ир35рге1+, сверхэкспрессия шапсрона Нзр104р, разрушающая эти агрегаты, приводит к появлению белка 8ир45р в растворимой форме (рис.5Д). Таким образом, оба белка Эир35р и Бир45р одновременно освобождаются из [/^/^-специфических агрегатов под действием Нзр104р. Появление 8ир45р в растворимой функционально активной форме может представлять дополнительную причину антисупрессорного фенотипа, вызванного сверхэкспрессией Нзр104р.

ВЫВОДЫ

1. Молекулы белка 8ир35р могут существовать в двух изоформах: [РЗГ] (8ир35ргек) и [/иГ] (8ир35рр51'). В отличие от 8ир35рр51', белок 8ир35рге1+ накапливается в клетках в виде протеазоустойчивых высокомолекулярных агрегатов.

2. Молекула белка 8ир35р содержит два участка для связывания с белком 8ир45р. Это приводит к вкточеншо 8ир45р в состав агрегатов 8ир35рры+ и к уменьшению количества молекул белков 8ир35р и 8ир45р, активно участвующих в терминации трансляции, тем самым, по-видимому, повышая уровень сквозного прочтения нонсенс-кодонов и вызывая [Р$Г] нонсенс-супрессорный фенотип.

3. Шаперон Нзр104р растворяет агрегаты 8ир35рга+.

4. Sup35pPSI+ достаточен для прионоподобного превращения белка Sup35ppsl* в форму [PS/*] в системе in vitro. Способность осуществлять ирионоиодобное превращение присуща только [ЛУ/^-завнсимым агрегатам Sup35p, что согласуется с полимеризациониой моделью прионоподобного превращения белка Sup35p.

5. Мутация в гене SUP35, вызывающая замену глицина на аспарагиновую кислоту в 58 положении соответствующего белка, приводит к снижению скорости прионоподобного превращения и, как следствие, к потере детерминанта [PS/] в процессе клеточных делений.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Stansfield, I., Jones, К.М., Kushnirov, V.V., Dagkesamaskaya, A.R., Poznyakovski, A.I., Paushkin, S.V., Nierras, C.R., Cox, B.S., Ter-Avanesyan, M.D., and Tuite, M.F. The products of tlie SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces ccrevisiae // The EMBO J. - 1995 -V. 17 -P. 4365-4373.

2. Ter-Avanesyan, M.D., Dagkesamanskaya, A.R., Poznyakovsky, A.I., Paushkin, S.V., and Kushnirov V.V. Translational and transcriptional functions of the Sup35p and Sup45p proteins in Saccharomyces cerevisiae // Abstracts of 17th Int. Conf. on Yeast Genetics and Molecular Biology, Lisboa, Portugal, 1995.

3. Paushkin, S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N., and Ter-Avanesyan, M.D. Propagation of the yeast prion-like [PS74] determinant is mediated by oligomerization of Si/WJ-encoded polypeptide chain release factor//The EMBO J. - 1996 -V. 12-P. 3127-3134.

4. Paushkin, S.V., Kushnirov, V.V., and Ter-Avanesyan, M.D. Yeast prion-like polypeptide chain release factor: posttranslational regulation of translation termination // Abstracts of Cold Spring Harbor Conf. «Translational Control», Cold Spring Harbor, New York, 1996.

5. Дагкесаманская A.P., Кушниров В.В., Паушкин С.В., Тер-Аванесян М.Д. Слияние глготатион S-трансферазы с N-концом белка Sup35p дрожжей ингибирует его прионоподобные свойства // Генетика - 1997 -Т.5. -С. 610-615

6. Paushkin, S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N., and Ter-Avanesyan, M.D. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation // Molecular and Cellular Biology - 1997 -V. 5 -P. 2798-2805.

7. Paushkin, S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N., and Ter-Avanesyan, M.D. In vivo propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science - 1997 -V. 277 -P. 381-383.

8. Тер-Аванесян М.Д., Паушкин C.B., Кушниров B.B., Кочнева-Первухова Н.В. Молекулярные механизмы "белковой" наследственности: прионы дрожжей // Молекулярная биология - 1998 -Т. 1 -С. 36-46.

Отпечатано в фотомножительной мастерской Геологического ф-та МГУ Тираж 100 экз. Заказ № $$