Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый прионоподобный детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Новый прионоподобный детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На прй&хфукО|(^Л1

О Л р. ПТГ ' -,

:1 «¡л« ' ;

ВОЛКОВ КИРИЛЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

НОВЫЙ ПРИОНОПОДОБНЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ ДРОЖЖЕЙ ЭАССНА/ЮМУСЕЗ СЕНЕУМАЕ, ВОВЛЕЧЕННЫЙ В КОНТРОЛЬ ТРАНСЛЯЦИИ

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического научно-исследовательского института СПбГУ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Л.Н. Миронова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

М.Д. Тер-Аванесян

доктор биологических наук, Т.Р. Сойдла

Ведущее учреждение:

Институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится "2 S " ine>X<ílp§ 2000 г. на заседании Диссертационного совета' Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, кафедра генетики и селекции.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " 10a октября 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.063.57.21

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Одно из выдающихся событий, произошедших в биологии в последнее десятилетие, заключается в обосновании и быстром развитии концепции прионного наследования. Эта концепция постулирует существование ранее неизвестного способа передачи информации от клетки к клетке, основанного на специфическом изменении конформационного и, как следствие, функционального состояния некоторых белков, и последующем автокаталитическом поддержании этого состояния ("белковая наследственность").

Хотя существование этого механизма наследования доказано пока только для низших эукариот - грибов-аскомицетов - формирование прионной концепции связано с изучением особой группы инфекционных нейродегенеративных заболеваний человека и животных. К ним относятся, в частности, болезнь Крейцфельдта-Якоба и куру у человека, скрепи овец, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота. Возбудителем этих заболеваний является клеточный белок РгР, находящийся в особом конформационном состоянии, называемом прионным (РгиБтег, 1991). Главные особенности этого состояния заключаются в способности прионной формы белка служить своего рода конформационной матрицей для аналогичного превращения нормальных изомеров РгР, а также выраженная склонность к олигомеризации. Следствием первого свойства является способность приона к автокаталитическому поддержанию, следствием второго - образование характерных амилоидных агрегатов в пораженных тканях центральной нервной системы.

Аналогия с прионами млекопитающих была использована для объяснения природы двух нехромосомных наследственных детерминантов дрожжей БассЬаготусез сеге\чпае\ [Р8Г] и [Ш1ЕЗ]. (\Vickner, 1994). Согласно гипотезе Викнера они представляют собой конформационные изомеры белков Бир35 и иге2, сходные по свойствам с прионной формой белка РгР. Эта гипотеза быстро получила генетические и биохимические доказательства. Обнаружение прионов у дрожжей явилось чрезвычайно важным событием, так как свидетельствовало о биологической универсальности этого феномена. Действительно, еще один прионоподобный наследственный детерминант был обнаружен вскоре у плесневого аскомицета Рос1о.^роуа атеппа (Сош^и Й а1., 1997). В настоящее время с точки зрения прионной концепции могут быть объяснены свойства еще нескольких детерминантов дрожжей и плесневых грибов.

Открытие прионов у дрожжей - модельного эукариотического организма - привело к быстрому прогрессу в исследовании прионного

феномена. Исследования дрожжевых прионов вносят существенный вклад в изучение механизмов прионной конверсии белков, позволяют изучать распространение прионов в природе, являются основой для изучения молекулярных механизмов белковой наследственности. Целью исследования явилось изучение ранее неизвестного наследственного детерминанта дрожжей, проявляющего антисупрессорный эффект по отношению к некоторым мутантным аллелям гена 5№35 и имеющего предположительно прионную природу. В задачи работы входило получение доказательств прионоподобной природы детерминанта, сравнение его свойств со свойствами другого дрожжевого приона участвующего в контроле трансляции, фактора [РБ?], выяснение зависимости возникновения и поддержания обнаруженного детерминанта от гена ЗИРЗЗ.

Научная новизна исследования. Обнаружен новый нехромосомный детерминант дрожжей, проявляющий свойства, характерные для наследственных детерминантов белковой природы - прионов. Этот детерминант участвует в контроле точности трансляции на этапе терминации и является пятым по счету генетическим детерминантом дрожжей, прионные свойства которых доказаны или обсуждаются. Обнаружение нового детерминанта дрожжей со свойствами приона может внести важный вклад в происходящее в настоящее время формирование теории белковой наследственности. Практическая ценность. Изучение прионов дрожжей позволяет разрабатывать удобные модели для изучения прионных заболеваний млекопитающих, поскольку считается, что молекулярные механизмы прионного превращения белков универсальны. В связи с этим обнаружение нового прионоподобного детерминанта у дрожжей открывает дополнительные возможности в конструировании таких моделей и в их последующем использовании для разработки методов диагностики и лечения нейродегенеративных заболеваний человека и животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (США, Мадисон, 1996), на XII Симпозиуме по структуре и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, 1996), на Конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (США, Мэриленд 1998), на II Съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисных сообщения.

Слруктура и объем работы. Работа изложена на 125 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 155 наименований. Работа содержит 19 таблиц и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Штаммы. В работе использованы следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae:

д>8-132-Л28-2В-П3982 UMaadel-14his7-I №S7br4-B15 wtûAktû-l (далее 2В-П3982)

10-2В-П3982 MXTaadel-14his7-l fys2-87 Ihr4-Bl 5 una3Aku2-l sup35-10 [TAlf]

25-2В-П3982 Мк1аШ-14Ш7-1 b^-87 6r4-B15iira3Akiû-l sp35-25[TAlt\

110-2В-П3982 MATa ackl-14 his7-l fyû-87 dr4-Bl 5 тиЗЛШ-l sup35-U0

112-2В-П3982 bKîacxlel-14his7-} 1yû-87ir4-B15itm3Aku2-l sip35-112

16А-П5154 MATa his7-l Ы-87Ьг4-В!5 leu2-l meii3-Al

6А-П4475 MATa his7-l fys2-S7 thr4B-l5 Ieu2-1 metl3 игаЗА sup35-25 ф'

12Г-П4468 MATa his7-I Iys2-S7 Ieu2-I metl3 ura3Asup35-25

20-13А-П4439 MATa adel-14 Ш7-1 ¡ys2-87thr4-B15ku2-I metl3-Al c)Hr

5-16 А-П5154 MATa his7-l /}-s2S7 tv4-Bl5 ktû-1 metl3-Al фг

2Б-П4475 MATa adel-14 his7-l Iys2-S7 leu2-l игаЗА metl3 sup35-25

16A-D1608 MATa ackl-14 Ш-1 fys2-87fo4-B15ian3Aleu2-3,U2 bpl-289

SVP35::TRP1 o^[pRSU2 PIN*] 4-25-2В-П3982 MATaadel-14his7-l I}s2-S7Ш-В15iim3Aku2-lstp35-2SSATG

Плазмиды. Плазмида pYS-GAL104, несущая ген HSP104 под галактозным промотором, предоставлена Ю.О.Черновым (Georgia Institute of Technology, USA). Плазмида pFL44s-3ATG, несущая делегированный с 5'-конца вариант гена SUP35, и плазмида pBC-HSP104::URA3, несущая дизруптированную аллель гена HSP104, предоставлены В.В. Кушнировым (НИИЭК РКНПК МЗ России, Москва). Плазмиды серии pRSU сконструированы в ходе работы и несут фрагмент дрожжевой ДНК, содержащий полноразмерную аллель гена SUP35 или ее ЛЗАТС-вариант под собственным промотором.

Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Элиминацию детерминантов [PS/*] и [TAU''] проводили путем трех- или пятикратного пересева штаммов на среде с 5мМ гидрохлоридом гуанидина (GuHCI). Цитодуктантов получали путем инкубации смеси клеток штамма-донора и штамма-реципиента на среде YAPD в течение 6-8 часов, и последующей селекции цитодуктантов на среде YPGly с циклогексимидом.

Рестрикционный анализ, гель-электорофорез, выделение плазмидной ДНК, ПЦР, секвенирование ДНК и трансформацию дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989; Sanger and Coulson, 1975; Gietz, et al, 1992).

Оценку значимости различий частот в опыте и контроле проводили с помощью u-критерия (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Идентификация антисупрессорного детерминанта, элиминируемого в присутствии GuHCI. Известно, что прионное превращение белка Sup35 (фактора терминации трансляции eRF3) приводит к появлению в клетках дрожжей функционально-неактивной формы этого белка, обозначаемой как [PSf ]. Вследствие этого в клетках [/\S7r] имеет место частичное нарушение терминации белкового синтеза, с чем связано фенотипическое проявление детерминанта [PSI j как омнипотентного супрессора нонсенс-мутаций. Сходным фенотипическим проявлением обладают и мутации в гене SUP3S. В некоторых случаях супрессорный фенотип штамма может обеспечиваться, по-видимому, кумулятивным эффектом мутации sitp35 и фактора [/W"] - продукта мутантной аллели.

Характерной особенностью дрожжевых прионов является их чувствительность к низким концентрациям (1-5мМ) GuHCI, агента, денатурирующего белки при высоких концентрациях. Элиминация фактора [PSt\ в присутствии GuHCI приводит к исчезновению эффекта супрессии, что легко тестируется при использовании маркированных соответствующим образом штаммов.

В ходе проведенного на предварительном этапе работы скрининга коллекции мутантов sup35, полученных у штамма 2В-П3982, направленного на выявление мутантов, фенотипическое проявление которых модифицируется в присутствии GuHCI, мы обнаружили двух мутантов, фенотип которых при воздействии GuHCI менялся нехарактерным для [Л5'/ ]-штаммов образом. У исходных мутантов было подавлено проявление только нонсенс-мутации ade 1-14 (UGA), а у их производных, обработанных GuHCI (далее - GuHCI-варианты), были супрессированы также мутации his7-I(\JАА) и Iys2-87(UGA) (рис. 1). Из этого следовало, что исходные штаммы содержат элиминируемый в присутствии GuHCI детерминант, подавляющий проявление мутаций sup35-10 и sup35-25 (далее тестерные мутации). Исследованию этого детерминанта, обозначенного как [TAlf], и посвящена настоящая работа.

1

_ Рисунок 1. Рост штаммов 10-2В-П3982 (sup35-10) и 25-2В-П3982 (sup35-25) (штрихи 1 и 3) и их GuHCI-

3 вариантов (штрихи 2 и 4) на среде без гистидина и

4 лизина.

Было высказано две гипотезы относительно природы [ТА LT],

Согласно первой из них, {ТА If} может представлять собой особую форму фактора [PSt], возникающую в результате прионного превращения мутантного белка Sup35, поскольку его проявление связано с мутациями sup35. Согласно второй гипотезе [7Ж/] - это продукт прионного превращения какого-то другого белка, вовлеченного в контроль точности трансляции и взаимодействующего прямо или косвенно с Sup35p.

Проверка этих гипотез требовала более весомых доказательств прионной природы обнаруженного детерминанта, сравнения его свойств со свойствами фактора [PSf], изучения зависимости его индукции и поддержания от гена SUP35 и от участка этого гена, отвечающего за прионные свойства белка Sup35p.

Гибридологический анализ детерминанта \TAlf|. Существенным этапом в характеристике [TAU*] явилось изучение его наследования. Тетрадный анализ гибридов от скрещивания штаммов [TAU*] и [tau] показал отсутствие расщепления по эффекту супрессии мутаций his7-l и lys2-87, что соответствовало фенотипической характеристике исходных мутантов. После пассирования тетрад на среде с GuHCI при гетерозиготности гибрида по тестерным супрессорным мутациям во всех тетрадах появлялось расщепление 2Sup+:2Sup", а при гомозиготности гибрида все четыре сегреганта приобретали фенотип Sup+ (рис. 2). Эти данные говорят о нехромосомном наследовании [ГАС/*].

Подтверждение нехромосомной природы [TAU*] было получено в экспериментах по цитодукции, где в качестве донора цитоплазмы использовали штамм [TAU*г ho], а в качестве реципиента - штамм sup35-25 cyhr [tau rho0]. Оба штамма содержали в своем генотипе тестерную мутацию sup35-25, поэтому штамм-реципиент имел фенотип His+Lys+. В контрольном эксперименте использовали [Мг/]-вариант штамма-донора. Среди отобранных цитодуктантов как в опыте, так и в контроле были обнаружены клоны His'Lys", однако их частоты достоверно различались (табл. 1). Из этого следует, что [TAU*] может быть перенесен от штамма к штамму при цитодукции.

Появление клонов [TAU*] в контрольном эксперименте мы объяснили его спонтанной индукцией в клетках штамма-реципиента.

2

Рисунок 2. Расщепление по

Г

эффекту супрессии мутации his7-l (среда -His) в потомстве гибридов, гетерозиготных (1) и гомозиготных (2) по мутации sup35-25. Нечетные ряды -исходные тетрады; четные ряды - тетрады, обработанные GuHCI.

Высокая частота спонтанной индукции [TAU'] в клетках, несущих тестерные мутации sup35, позже была показана в специальных экспериментах.

Таблица 1. Частота клонов [TAU ] среди цитодуктантов штамма 6А-П4475

Донор цитоплазмы Всего цитодуктантов Из них [TAI/] Частота клонов [ТА U ] (%)

[TAU] 71 12 16,9 ±4,45

[taii] 106 1 0,9±0,91

Важно отметить, что изучение проявления [TAU'] у гомозиготных по тестерным мутациям sap35 гибридов от скрещивания штаммов [TAI/] и [tau] показало его доминантность, поскольку такие гибриды имеют фенотип His'Lys' (рис. 3).

1 .....2

*. Рисунок 3. Рост гибридов, гомоаллельных по мутации sup35-10 на среде без гиствдина и лизина. 1 - гибрид, полученный от скрещивания [ТА (У ]- и [гам"]-штаммов, 2 - контрольный гибрид, полученный при скрещивании [tau'] штаммов.

Свойства [TAI/], выявленные в ходе гибридологического анализа (нехромосомное наследование в мейозе, способность к переносу при цитодукции, доминантное проявление при скрещивании со штаммами [tau]) не отличаются от свойств, характерных для прионов дрожжей, и не противоречат исходной гипотезе о прионной природе исследуемого детерминанта.

Способность \TAl/\ к повторному возникновению в штаммах \tuu\.

Основополагающим свойством дрожжевых прионов является их способность к повторному возникновению после элиминации на среде с GuHCI. Мы обнаружили, что оно характерно и для [TAI/]. Штаммы [tau'], полученные при воздействии GuHCI, нестабильны и через несколько пересевов приобретают фенотип [TAI/]. Частота спонтанного возникновения [ТА U*], оцененная с помощью флуктуационного теста, составила величину около 1х10"4 на клетку на генерацию, что примерно на два порядка превышает частоту спонтанного возникновения [Р5Г].

Обратимость элиминации [TAI/] после воздействия GuHCI явилась серьезным аргументом в пользу предположения о его прионной природе. Вместе с тем, уже на первых этапах работы было отмечено, что исследуемый детерминант отличается по свойствам от [Р£Г]. В частности, перенос его при цитодукции менее эффективен, чем перенос [PS/^]. Существенное отличие [TAU*] от [PS/] заключается и в том, что

его повторное возникновение, по-видимому, не зависит от прионоподобного детерминанта [Я/Л*4], необходимого для индукции [PST], Детерминант [PIN*], подобно другим прионам дрожжей, элиминируется при выращивании дрожжей на среде с GuHCI. В наших экспериментах повторное возникновение [TAU*] наблюдалось у штаммов, многократно обработанных GuHCI, т.е. имеющих, очевидно, статус [pin].

На следующем этапе мы провели направленное сравнение еще нескольких свойств детерминантов [TAU*] и [PSt], Эффективность элиминации [TAlf\ при воздействии GuHCI. Как отмечено выше, [PS/] почти со 100% эффективностью элиминируется на среде, содержащей l-5mM GuHCI. Мы провели количественное исследование митотической стабильности {TAU } в присутствии этого агента. Поскольку элиминация [TAU*] приводит к появлению супрессорного фенотипа, ее частоту вычисляли как отношение числа клонов с фенотипом His+Lys+ к общему числу клонов. При трехкратном пассировании на среде с GuHCI эта величина составила 55,5 ± 4,39% дня штамма с мутацией snp35—10, и 63,3 ± 4,26% для штамма с sup35-25. Пятикратное пассирование на среде с GuHCI приводило к увеличению частоты элиминации [TAU*] до 71,1 ± 4,01% и до 96,7 ± 1,59%, соответственно.

Таким образом, детерминант [TALT] значительно более устойчив к воздействию GuHCI, чем [PS/].

Зависимость [TAI/'] от уровня экспрессии Hspl04p. Оценка этой зависимости необходима потому, что уровень экспрессии шаперона Hspl04p, играет критическую роль в поддержании фактора [PSI]: как сверхэкспрессия Hspl04p, так и полное отсутствие его, приводят к элиминации этого детерминанта.

Для изучения стабильности [TAU*] при сверхэкспрессии Hspl04p штаммы [TAU*], несущие тестерные мутации sup35, трансформировали ллазмидой pYS-GAL104. Три трансформанта каждого штамма пять раз пассировали на синтетической среде с галактозой, а в контроле - с глюкозой. Затем трансформантов рассевали на полной среде и анализировали фенотипы колоний. Частоту потери [TAU+] оценивали как частоту клонов His+Lys+. Частоты таких клонов в митотическом потомстве трех трансформантов в каждом варианте опыта статистически достоверно не отличались, поэтому они были объединены.

Как следует из полученных данных (табл. 2), частоты элиминации [ТА1Г] в контроле и опыте статистически достоверно не отличаются. Таким образом, сверхэкспрессия Hspl04p не приводит к элиминации

[TAUV],

Для оценки стабильности [TAlT] в отсутствие шаперона Hspl04p у [7М6'г]-штамма 25-2В-П3982 инактивировали с помощью дизрупции ген HSP104. Элиминация [ТАU' ] у дизруптантов должна была приводить к появлению у них супрессорного фенотипа, однако отличий в фенотипах исходного штамма и трех штаммов, несущих дизрупцию, обнаружено не было (рис. 4). Из этого следует, что отсутствие шаперона Hspl04p также не приводит к элиминации [ТА1Г].

Таблица 2. Частоты элиминации [TAU*] при сверхэкспрессии Hspl04p.

Мутант Среда Изучено клонов Частота потерн [TAIT] (%)

всего Из них [tau]

sup35-I0 с глюкозой 3321 42 1,3 +0,03

с галактозой 3110 56 1,8 + 0,03

sup35-25 с глюкозой 1925 4 0,2 + 0,05

с галактозой 758 2 0,3 + 0,13

Рисунок 4. Рост штаммов 25-2В-П3982 [taü] (1), 25-2В-П3982 [TAlf] (2) и полученных на его основе дизрутпантов по гену HSP104 (3-5) на синтетической среде без гистидина.

Обнаруженные отличия в свойствах [TAIT] и [PSI ] делали актуальной высказанную изначально гипотезу, согласно которой [TAU ] является не разновидностью [f5/+], а продуктом прионного превращения какого-то другого белка, взаимодействующего с Sup35p. Для доказательства этой гипотезы необходимо было исследовать различные аспекты зависимости индукции и поддержания [TAU ] от гена SUP35. Поддержание | ТА lf\ на фоне аллели дикого типа SUP35. Один из вопросов, возникших при исследовании [ТА IT ], состоял в том, необходимы ли для его поддержания тестерные аллели sup35, или они представляют собой лишь генотипический фон для его проявления. Для ответа на этот вопрос осуществляли с помощью цитодукции перенос [ТА1Г] из штаммов, несущих мутации sup35-10 и sup35-25, в клетки [г/ге>°]-производных штаммов 20-13А-П4439 и 5-16А-П5154, несущих аллель дикого типа SUP35. Поскольку в клетках дикого типа присутствие [TAUr] не проявляется фенотипически, для идентификации [7Ж/']-статуса цитодуктантов их подвергали гибридологическому анализу путем

скрещивания со штаммом [tau], несущим тестерную мутацию sup35-25. В потомстве полученных гибридов анализировали расщепление по эффекту супрессии. В общей сложности было исследовано 15 гибридов, в потомстве семи из них были обнаружены тетрады с расщеплением по эффекту супрессии 3Sup":lSup+ и 4Sup':0Sup+, что характерно для присутствия [TAU*]. После их пассирования на среде с GuHCI появлялось расщепление 2Sup+:2Sup", свидетельствующее об элиминации [ТАU*]. Расщепление 2Sup+:2Sup" наблюдалось и в 25 тетрадах контрольного гибрида, полученного от скрещивания штамма-реципиента с [taiï]-вариантом штамма-донора. Эти данные говорят о том, что перенос [TAU*] из штаммов, несущих тестерные мутации sup35, в штаммы дикого типа возможен и что [TAU ] может стабильно поддерживаться на фоне аллели дикого типа гена SUP35.

Аллельная специфичность [TAU*]. Детерминант [TAU*] был обнаружен благодаря антисупрессорному эффекту, который он проявляет по отношению к мутациям sup35-25 и snp35-I0. Специфичен ли его антисупрессорный эффект для этих мутаций, или он подавляет проявление и других мутантных аллелей sup3S?

Было исследовано взаимодействие [TAU*] с двумя другими мутациями в гене SUP35, sup35-!J0 и sap35-I12. Анализ расщепления в потомстве гибридов [TAU*], гетерозиготных по этим мутациям, не выявил тетрад с отклонением от соотношения 2Sup+:2Sup' (было изучено по 8 тетрад у обоих гибридов). Это говорит о том, что антисупрессорный эффект, проявляемый [TAU*], специфичен по отношению к определенным мутациям SUP35.

Этот вывод подтвердился и при анализе фенотипа гибридов [TAU*], гетероаллельных по мутациям sup 35 (sup35-110/sup35-25 и sitp35-l 12/sup35-25). В отличие от гомоаллельных по тестерным мутациям гибридов, имеющих фенотип His Lys" (см. рис. 3), эти гибриды были прототрофны по гистидину и лизину.

Первичная структура использованных в работе аллелей SUP35 и кодируемого ими белка Sup35p. Все четыре мутантные аллели sup35, взаимодействие которых с [TAU*] изучено в работе, были секвенированы. Поскольку мутанты были получены у штамма дрожжей, принадлежащего к Петергофским Генетическим Линиям (ПГЛ), имеющим независимое происхождение от штаммов, используемых в других лабораториях, предварительно была секвенирована аллель дикого типа SUP35 из исходного штамма 2В-П3982. Это позволило выявить полиморфизм первичной структуры гена SUP35. Оказалось, что последовательность SUP35 у штаммов ПГЛ отличается от последовательностей SUP35, представленных в GeneBank 10-ю нуклеотидами, при этом в шести

случаях этот полиморфизм проявляется и на уровне белка Sup35. Интересно, что значащие замены не затрагивают ни участок Sup35, отвечающий за жизненно-важную функцию белка (С-домен), ни участок N-домена, отвечающий за прионные свойства Sup35p. Пять полиморфных сайтов локализуются в домене М, функциональное значение которого неизвестно, один - на границе N- и М-доменов (рис. 5).

N GDPTH 1025 112 110

i i 11 a i " Y ?

SDEAKD J-ti 1

NIL H

Рисунок 5. Локализация полиморфных сайтов и мутационных замен аминокислот в белке Sup35. Пояснения в тексте.

Характеристика гена SUP35 из исходного штамма позволила провести корректный анализ мутантных аллелей sup35. Было обнаружено, что все они содержат единичные нуклеотидные замены, приводящие к заменам аминокислот в С-домене белка (см. рис. 5).

Анализ распределения мутантных сайтов показал, что они не затрагивают выявленные в других работах функционально-активные участки Sup35p. Компьютерный анализ вторичной и третичной структур Sup35p, предсказанных на основании первичной структуры белка дикого типа и мутантных белков, не выявил достоверных отличий между всеми формами Sup35p. Таким образом, вопрос о структурных и функциональных последствиях изменения первичной структуры белка Sup35 у исследованных мутантов и о связи специфичности [TAU*] с характером этих изменений пока остается открытым. Изучение возможности индукции [TAU*] при сверхэкспрессии тестерных аллелей sup35. Еще одним основополагающим свойством [PSt] является увеличение частоты его индукции при сверхэкспрессии белка Sup35. Если [TAU] является прионной формой Sup35p, кодируемого мутантными аллелями, то частота его индукции должна зависеть от уровня экспрессии этих аллелей.

Мы изучали индукцию [TAU*] у штамма [tau], несущего sup35-25, путем его трансформации мультикопийной плазмидой pRSU4-25, содержащей sup35-25. Контрольной плазмидой служила плазмида pRS426, не содержащая SUP35. Штамм-реципиент [tau] имел фенотип His+Lys+. Частота появления ¡TAU' ] анализировалась в потомстве трех независимых трансформантов каждой из плазмид. Поскольку достоверных отличий между трансформантами в каждом варианте опыта обнаружено не было, полученные данные были объединены (табл. 3).

N

м

С

Статистический анализ показал, что достоверные отличия в частотах клонов [TAU*] в контроле и в опыте также отсутствуют. Таким образом, увеличение копийности мутантной аллели sitp35 не влияет на частоту индукции [ГА1Г].

Таблица 3. Частота возникновения [TAU ] у штамма 25-2В-П3982 [fa«], трансформированного мультикопийными плазмидами pRSU4-25 и pRS426.

Плаз м н да Изучено клонов Из них [TAU*] Колоний [TAU] (%)

PRSU4-25 1759 211 12,0±0,77

pRS426 2031 231 11,4+0,70

Независимость поддержания и индукции [TAU*] от мутантных аллелей sup35, послужили для нас еще одним аргументом в пользу предположения о том, что [TAU*] не является продуктом прионного превращения белка Sup35p. Это предположение подтвердилось и в последующих экспериментах.

Зависимость поддержания [TAU*\ от прионогеиного домена белка

Sup35. Индукция и поддержание фактора [PS/] зависят от участка белка Sup35, локализующегося в N-терминальной части молекулы. Вследствие этого у штаммов с замещением нормальной аллели SUP35 на последовательность, соответствующую участку гена после третьего кодона ATG (далее ДЗАТО-варианты аллелей гена SUP35), невозможны ни индукция, ни поддержание [.AS71"]. Мы исследовали возможность поддержания [TAUT] в отсутствие прионогенного домена Sup35p. Если такая зависимость существует, то в клетках, содержащих ДЗАТО-варианты тестерных аллелей SUP35, должна происходить элиминация [TAL/], сопровождающаяся изменением фенотипа штаммов с His Lys' на His+Lys+. В случае независимости фактора [TAU*] от N-домена белка Sup35p замещение полноразмерной аллели на "укороченную" не будет приводить к потере [TAU*] и, соответственно, к появлению супрессорного фенотипа.

В экспериментах по замещению полноразмерной аллели sap35 на ее АЗАТС-вариант использовался [TAU*] штамм 25-2В-П3982, несущий мутацию sup35-25. Замещение контролировали ПЦР и блот-гибридизацией с зондом SUP35. Было отобрано три штамма, у которых произошло замещение полноразмерной аллели на A3 ATG-вариант.

Сравнение их фенотипов с фенотипом исходного штамма показало отсутствие различий между ними, что могло быть истолковано как указание на сохранение [TAU*] в клетках штаммов, несущих A3 ATG-вариант sup35-25. Вместе с тем, мы обнаружили, что фенотип штаммов, содержащих sup35-25A3ATG, не меняется после пассирования на среде с

ОиНС1. Это обстоятельство не позволяло однозначно интерпретировать природу фенотипа этих штаммов.

Мы предположили, что независимо от [ГЛ£/]-статуса штамма, несущего ДЗ АТС-вариант мутантной аллели, супрессорный эффект такой аллели может быть ослаблен по сравнению с полноразмерной аллелью.

Было исследовано самостоятельное фенотипическое проявление аллелей ¡ирЗЗ-ЮЛЗАТС и яир35-25АЗАЮ на фоне дизрупции хромосомной копии гена 811Р35. Этот анализ показал, что эффективность супрессии мутаций Ы$7-1 и 1)^2-87 у трансформантов плазмидами, несущими ДЗАТО-варианты тестерных аллелей яирЗЗ, значительно снижена по сравнению с трансформантами, несущими полноразмерные мутантные аллели ьирЗЗ (рис. 6). Из этого следует, что элиминация М-терминальной части белка Бир35 может приводить к нейтрализации проявления супрессорных мутаций, локализующихся в С-домене. Этот факт представляет несомненный самостоятельный интерес, так как является первым указанием на роль Ы-терминальной части белка 8ир35 в регуляции функции, осуществляемой его С-терминальной частью. В то же время, обнаружение этого эффекта говорит о том, что по фенотипу штаммов, несущих ДЗАТО-варианты мутантных аллелей, нельзя судить о сохранении или потере \TALT].

Рисунок 6. Рост штамма 16А-01608, ЙЭМВйКШвЗЕЯ трансформированного плазмидами, содержащими ' **- тестерные аллели аир35 (1,2) и их ДЗАТС-вариангы

3 (3,4).

4

Ответ на вопрос о возможности поддержания [TAIT] в отсутствие прионогенного домена Sup35p был получен путем анализа фенотипа гибрида от скрещивания штамма 4-25-2В-П3982, несущего sup35-2 5 A3 А ТС], со штаммом 2Б-П4475 (sup35-25 [tau]). Если в скрещивании использовался непосредственно штамм 4-25-2В-П3982, исходно содержавший [ТА Ur], то гибрид имел генотип His'Lys", что могло говорить как о присутствии [TAU*], так и о доминировании антисупрессорного эффекта аллели sup35-25A3ATG. Если же штамм 4-25-2В-П3982 перед скрещиванием пассировали на среде с GuHCI, то гибрид был прототрофен по гистидину и лизину (рис. 7). Этот факт доказывает присутствие [TAU*] у исходного варианта штамма 4-25-2В-П3982.

Таким образом [TAU*] может поддерживаться на фоне укороченной с 5'-конца аллели гена SUP35, что свидетельствует о его независимости от прионогениого домена белка Sup35.

2 Рисунок 7. Рост [ГАС/*] (1) и [tau] (2) гибридов генотипа

иир35 - 25 АЗ АТв _ г —-на синтетической среде без гиствдина.

мр35-25

Дополнительное подтверждение этого вывода было получено в экспериментах по цитодукции, где в качестве донора цитоплазмы использовали штамм 4-25-2В-П3982, а в качестве реципиента штамм 6А-П4475 ($ир35-25 {ТАИ']). В контроле донором цитоплазмы служил ОиНС1-вариант штамма донора. Частота цитодуктантов, изменивших свой фенотип от супрессорного (№з+Ьуэ+) к антисупрессорному (Шэ'Ьуз"), была низкой, но она достоверно превышала частоту таких цитодуктантов в контрольном эксперименте (табл. 4).

Таблица 4. Частота клонов [ТЛИ*] среди цитодуктантов штамма 6А-П4475.

Донор цитоплазмы Всего Из них Клонов

цитодуктантов [ТАХГ} [ТА1Г](%)

4-25-2В-П3982 53 6 11,3+4,35

СиНС1-4-25-2В-П3982 81 1 1,2+1,23

Заключение. Полученные в ходе работы данные позволяют считать, что обнаруженный детерминант имеет прионоподобную природу. Хотя проявление этого детерминанта специфическим образом связано с геном БиР35, он отличается по свойствам от фактора [РЬТ ] - продукта прионного превращения белка БирЗбр, а его индукция и поддержание не связаны с прионогенным доменом Бир35р.

Какова молекулярная природа детерминанта \ТА11*\ и механизм, за счет которого в присутствии [ТА11*] происходит восстановление точности трансляции у мутантов по гену Ответ на эти вопросы может быть

получен после клонирования хромосомного гена, кодирующего белок, прионной формой которого является \ТА1Г\, и последующих биохимических экспериментов, доказывающих возможность прионного превращения этого белка. Пока можно высказать лишь предварительное предположение о том, что этот белок представляет собой негативный модулятор функции 8ир35р. Инактивация этого белка, связанная с прионным превращением, может приводить к частичному восстановлению эффективности терминации у мутантов по гену БиРЗЗ.

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружен доминантный цитоплазматически наследуемый детерминант, обозначенный как [ТА1Г], проявляющий антисупрессорный эффект по отношению к некоторым аллелям гена 811Р35.

2. Получены данные, указывающие на прионоподобную природу [TAU*], а именно: возможность его элиминации на среде, содержащей GuHCl, агент, специфически изгоняющий прионы из дрожжевой клетки, и возможность его возникновения de novo после элиминации.

3. По всем исследованным свойствам (эффективности элиминации в присутствии GuHCl, частоте повторного возникновения, независимости возникновения от детерминанта независимости поддержания от уровня экспрессии шаперона Hspl04p) детерминант [TAlt\ отличается от другого дрожжевого приона - продукта гена SUP35 фактора [PS/].

4. Детерминант [ТА1Г] не индуцируется при сверхэкепрессин мутантных аллелей гена sup35, может поддерживаться в их отсутствие, а также в отсутствие прионогенного домена белка Sup35p.

5. Установлена молекулярная природа использованных в работе аллелей гена SUP35, показано существование естественного полиморфизма гена SUP35 и кодируемого им белка.

6. Полученные данные позволяют считать, что обнаруженный детерминант представляет собой ранее неизвестный прионоподобный наследственный элемент, вовлеченный в контроль трансляции у дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Volkov К.V., Ilmov Е.А., Pashina О.В., Mironova L.N. The [Psi] factor, a prion like element of yeast can be recessive and can show the antisuppressor effect // Yeast Genet, a. Mol.Biol. Meeting, Wisconsin, 1996. - p,271.

2. Волков K.B., Ильмов E.A., Миронова JI.H., Инге-Вечтомов С.Г. Свойство мутантного фактора [P.S7]- прионоподобного элемента дрожжей // Докл. Акад. Наук. - 1997. - Т.357. - №1. — С.123-125.

3. Волков К.В., Ильмов Е.А., Пашина О.Б., Миронова JI.H. Новые свойства прионоподобного фактора [#S7] дрожжей // XII. Симп. По Структуре и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, 1996) - Цитология. - 1997. - Т.39. - №1. - С.48.

4. Inge-Vechtoraov S.G., Zadorsky S.P., Ilmov Е.А., Mironova L.N., Tikchomirova V.L., Volkov K.V. Yeast approach to protein "prionidation": SUP35 - [PS/] system // In: NATO ASI SERIES VOLUME: Prions and Brain Diseases in Animals and Humans / Ed.by D.R.O.Morrison a. J.Collings. - Plenum Publishing Corporation, 1998. - P.99-109.

5. Volkov K.V., Kurishko C., Franzl E., Hinnen A., Inge-Vechtomov S.G., Mironova L.N. Nucleotide sequence of sup35 mutant allele generating the antisupressor form of [P-ST] factor // Yeast Genet, a Mol.Biol. Meeting., Maryland, 1998 - P. 330.

6. Волков K.B., Куришко К., Инге-Вечтомов С.Г., Миронова JI.H. Полиморфизм гена SUP35 и его продукта у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 11 Генетика. - 2000. -T.36. - №2. - С.155-158.

7. Миронова Л.Н., Аксенова А.Ю., Волков К.В., Озил М., Терентьев Я.Ю. Характеристика прионоподобного детерминанта дрожжей, проявляющего антисупрессорный эффект по отношению к мутантным аллелям гена SUP35 // II съезд ВОГиС. - Санкт-Петербург, 2000 - С. 86-87.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волков, Кирилл Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФЕНОМЕН ПРИОННОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ БЕЛКОВ И ЕГО ПРОЯВЛЕНИЕ У РАЗНЫХ ОРГАНИЗМОВ.

1.1. Прионные болезни млекопитающих и их молекулярные механизмы.

1.2. Прионы дрожжей и явление "белковой наследственности".

1.2.1. Характеристика детерминантов [I'Sf] и [IIR1<3\.

1.2.2. Прионная гипотеза Р.Викнера.

1.2.3. Система Sup35p - [PSf].

1.2.4. Система Ure2p - [URE3].

1.2.5. Существуют ли у дрожжей другие прионы?.

1.3. Прионы мицелиал ьных грибов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новый прионоподобный детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции"

Одно из наиболее выдающихся событий, произошедших в биологии в последнее десятилетие, состоит в обосновании и быстром развитии концепции прионного наследования. Суть этой концепции состоит в том, что она постулирует существование ранее неизвестного способа передачи информации от клетки к клетке, основанного на специфическом изменении конформационного и, как следствие, функционального состояния некоторых белков и последующем автокаталитическом поддержании этого состояния. Таким образом, прионная концепция обосновывает существование "белковой наследственности", не связанной с мутационным изменением нуклеиновых кислот, кодирующих измененные белки.

Хотя существование этого механизма наследственной передачи признаков доказано пока только для низших эукариот - грибов-аскомицетов -изначально формирование прионной концепции связано с изучением инфекционных нейродегенеративных заболеваний человека и животных, таких, например, как болезнь Крейцфельдта-Якоба и куру у человека, скрепи (почесуха) у овец, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота. Все они приводят к летальному исходу в результате накопления в тканях центральной нервной системы так называемых амилоидных бляшек, представляющих собой в данном случае отложения высоко-агрегированной, протеазоустойчивой формы клеточного белка РгР. На этом основании перечисленные заболевания относят к группе инфекционных амилоидозов, в отличие от считающихся неинфекционными амилоидозов, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона, также связанных с поражением мозга в результате образования агрегатов специфических белков.

Природа агента, вызывающего инфекционные амилоидозы, долгое время оставалась неизвестной. Однако постепенно накапливающиеся экспериментальные данные позволили высказать гипотезу, согласно которой этим агентом является сам белок РгР, образующий характерные амилоидные образования в пораженных тканях. Инфекционная форма белка была названа прионом, а связанные с ним болезни получили название прионных. Доказательство белковой природы возбудителя инфекционных амилоидозов было получено, когда удалось показать, что инфекционная форма белка катализирует in vitro переход нормальных молекул белка РгР в инфекционную форму, проявляющую высокую склонность к агрегации (см. Prusiner, 1991; 1994; 1998; Prusiner and Scott, 1997).

При всей важности выяснения природы переносчика инфекционных амилоидозов млекопитающих, это событие имело гораздо более далеко идущие последствия. Оказалось, что белок РгР млекопитающих представляет собой не единственный белок, способный превращаться в форму, далее поддерживаемую автокаталитически. Аналогия с прионами млекопитающих была использована для объяснения природы двух нехромосомных наследственных детерминантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae: [/\S7~] и [IIКПЗ] (Сох, 1965; Lacroute, 1971). В 1994г. Р. Викнер (Wickner, 1994) предположил, что эти детерминанты представляют собой конформационные изомеры белков Sup35p и Ure2p, сходные по свойствам с прионной формой белка РгР. Это предположение, изначально базировавшееся на генетических данных, очень быстро было доказано биохимическими методами.

Обнаружение прионов у дрожжей указывало на возможность широкого распространения этого феномена в природе. Вскоре еще один прионоподобный детерминант был найден у плесневого гриба-аскомицета Podospora anserina (Coustou et al., 1997). Кроме того, у дрожжей и плесневых грибов описан в настоящее время еще целый ряд наследственных детерминантов, свойства которых могут быть объяснены исходя из прионной гипотезы (Derkatch et al., 1997; 2000; Talloczy et al., 1998; Silar and Daboussi, 1999).

Необходимо отметить, что открытие прионов у дрожжей привело к быстрому прогрессу в изучении прионного феномена. Этот прогресс 6 предопределен использованием чрезвычайно простых модельных систем у наиболее изученного генетически и молекулярно-биологически эукариотического организма. Исследования дрожжевых прионов вносят существенный вклад в изучение молекулярных механизмов прионной конверсии белков, позволяют изучать распространение прионов в природе, являются основой для изучения молекулярных механизмов эпигенетического (белкового) наследования.

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению феномена прионного наследования и связана с обнаружением и характеристикой нового прионоподобного детерминанта у дрожжей S. cerevisiae.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Волков, Кирилл Владимирович

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружен доминантный цитоплазматически наследуемый детерминант, обозначенный как [TAlf], проявляющий антисупрессорный эффект по отношению к некоторым аллелям гена SUP35.

2. Получены данные, указывающие на прионоподобную природу [TAlf], а именно: возможность его элиминации на среде, содержащей GuHCI, агент, специфически изгоняющий прионы из дрожжевой клетки, и возможность его возникновения de novo после элиминации.

3. По всем исследованным свойствам (эффективности элиминации в присутствии GuHCI, частоте повторного возникновения, независимости возникновения от детерминанта [P/iV4], независимости поддержания от уровня экспрессии шаперона Hspl04p) детерминант [TAlf] отличается от другого дрожжевого приона - продукта гена SUP35 фактора [PSf].

4. Детерминант [TAlf] не индуцируется при сверхэкспрессии мутантных аллелей гена sup35, может поддерживаться в их отсутствие, а также в отсутствие прионогенного домена белка Sup35p.

5. Установлена молекулярная природа использованных в работе аллелей гена SUP35, показано существование естественного полиморфизма гена Л7//>?5 и кодируемого им белка.

6. Полученные данные позволяют считать, что обнаруженный детерминант представляет собой ранее неизвестный прионоподобный наследственный элемент, вовлеченный в контроль трансляции у дрожжей.

1.4. Заключение.

Подводя итог, необходимо отметить, что за несколько лет, прошедших с момента выдвижения Р.Викнером гипотезы о прионной природе двух цитоплазматических детерминантов дрожжей, [/^ST^] и [UPE3], были получены не только доказательства справедливости этой гипотезы, но и найдены новые наследственные детерминанты прионной, или предположительно прионной, природы. При этом круг объектов, у которых выявлены такие детерминанты, также расширился. Эти факты имеют важное теоретическое значение, поскольку доказывают существование механизма наследования, основанного на передаче от клетки к клетке белков с измененной, автокаталитически поддерживаемой конформацией.

Дальнейшее изучение феномена "белковой наследственности", по-видимому, существенно расширит современные представления о явлении наследственности в целом. Особо следует подчеркнуть, что изучение прионов низших эукариот имеет и медицинские аспекты, поскольку позволяет разрабатывать простые экспериментальные модели для изучения закономерностей прионного превращения белков. Эта проблема стала в последние годы чрезвычайно актуальной в связи с эпидемией губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота в Англии и возможностью инфицирования ее возбудителем, PrPs\ большого числа людей.

В изучении проблемы прионов можно выделить два наиболее существенных аспекта: (а) причины и механизмы прионной конверсии белков, (б) распространение этого явления в природе.

Как было отмечено выше (см. раздел 1.2.3), на молекулярном уровне подробно изучено взаимодействие [PSf'] и мутации PNM2, влияющей на индукцию и (или) поддержание детерминанта [PSt]. В то же время ранее в нашей лаборатории было показано, что в некоторых случаях возможно совмещение в одной клетке супрессорных мутаций в гене SUP35 и детерминанта [PST4"] (Инге-Вечтомов и др., 1988; Тиходеев, 1990). В такой ситуации фактор [AST4"] должен представлять собой продукт прионного превращения мутантного белка, что в свою очередь, открывает перспективы в изучении свойств "мутантного" [.PS7 ]-фактора.

В наших предварительных исследованиях был проведен скрининг коллекции мутантов sup35 с целью выявления мутантов, фенотип которых модифицируется при воздействии GuHCI - агента, специфически элиминирующего дрожжевые прионы. Было обнаружено два мутанта, у которых наблюдалось индуцированное GuHCI изменение фенотипа. Однако оно проявлялось в расширении спектра супрессируемых мутаций, что нехарактерно для штаммов, содержащих фактор [PSI+] (как упоминалось выше,

37 элиминация [Р574"] приводит к ослаблению или исчезновению эффекта супрессии). Именно поэтому эти мутанты стали предметом для дальнейшего анализа.

Связь обнаруженного эффекта с проявлением мутаций sup35, его зависимость от GuHCI, позволили высказать предположение, что

- либо в клетках этих мутантов возникает особая форма фактора [PS7 ], более эффективно обеспечивающая терминацию, чем нормальный изомер,

- либо он связан с присутствием детерминанта, представляющего собой продукт прионного превращения другого белка, взаимодействующего с фактором eRF3 и нейтрализующего последствия мутаций sup35.

В связи с этим целью исследования явилось изучение ранее неизвестного наследственного детерминанта дрожжей, проявляющего антисупрессорный эффект по отношению к некоторым мутантным аллелям гена SUP35 и имеющего предположительно прионную природу.

В задачи работы входило получение доказательств прионоподобной природы детерминанта, сравнение его свойств со свойствами другого дрожжевого приона, участвующего в контроле трансляции, фактора [PST'], выяснение зависимости возникновения и поддержания обнаруженного детерминанта от гена SUP35 и прионогенного домена белка Sup35.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы

В работе использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий (ПГЛ), а также сегреганты диплоидов -продуктов гибридизации штаммов ПГЛ со штаммами, полученными из других лабораторий. Генотипы штаммов приведены в таблице 1.

В работе использовали штамм Echerichia coli JM109 генотипа - recAl supE44 endAl hsdRll gyrA96 relAl thi A(lac-proAB) lr [traD36 proAB+ lacP lacZAM15] (Yanisch-Perron etal., 1985).

2.2. Плазмиды

Для количественного изучения эффективности супрессии нонсенс-мутаций использовали плазмиды pUKC815, pUKC817-pUKC819, любезно предоставленные М.Ф. Туйтом (Research School of Biosciences, University of Kent, United Kingdom). Плазмида pUKC815 содержит фрагмент ДНК с промоторной областью и частью кодирующей последовательности гена фосфоглицерат киназы (PGK) и слитый с ним в одной рамке считывания репортерный ген lacZ (рисунок 2). Плазмиды pUKC817, pUKC817, pUKC819 содержат ту же конструкцию, что и плазмида pUKC815, но между кодирующей последовательностью гена PGK и lacZ встроен синтетический олигонуклеотид, содержащий нонсенс-кодоны UAA, UAG, UGA, соответственно (см. рис. 2).

Плазмида pYS-GAL104 (Sanchez et al, 1992), содержащая ген ESP 104 под контролем галактозного промотора (рисунок 3), предоставлена Ю.О.Черновым (Georgia Institute of Technology, USA). Плазмида pBC-HSP104::URA3, содержащая ген HSP104, дизруптированный геном URA3, предоставлена В.В.Кушнировым (НИИ экспериментальной кардиологии РКНПК Министерства здравоохранения РФ, Москва) (см. рис. 3).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волков, Кирилл Владимирович, Санкт-Петербург

1. Задорский С.П., Сопова Ю.В., Инге-Вечтомов С.Г. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 2000. - №9. - 00-0Ос. (в печати).

2. Захаров И.А., Юрченко JI.B., Яровой Б.Ф. Цитодукция -автономный перенос цитоплазматических наследственных факторов при спаривании клеток дрожжей // Генетика. 1969. - Т.5. -№9. - С.136-141.

3. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. JL: Наука., 1984. - 143с.

4. Инге-Вечтомов С.Г. Новые генетические линии дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник ЛГУ. 1963. - Т.21. - С. 117-125.

5. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине // Вестник ЛГУ. -1964. №2. - С. 112-115.

6. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супрессоры у дрожжей//Генетика. 1970. -Т.6. -№11. - С.103-115.

7. Инге-Вечтомов С.Г., Тиходеев О.Н., Тихомирова В.Л. Нонсенс-супрессия у дрожжей при смене источников углерода и понижении температуры, опосредованная нехромосомными генетическими детерминантами // Генетика. 1988. - Т.24. - С.2110-2120.

8. Инге-Вечтомов С.Г. Прионы дрожжей и центральная догма молекулярной биологии // Вестник РАН. 2000. - Т.70. - № 4. - С.299-306.

9. Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Дагкесаманская А.Р., Чернов Ю.О., Инге-Вечтомов С.Г., Смирнов В.Н. Делеционный анализ гена SUP35 дрожжей // Молекулярная биология 1990. - Т.24. - №4. С.1037-1041.

10. Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Смирнов В.Н. Структурное и функциональное сходство белков Sup35p и Ure2p дрожжей и прионов млекопитающих// Молекулярная биология. 1995. - V.29. - Р.750-755.

11. Телков М.В., Сургучев А.П., Дагкесаманская А.Р., Тер-Аванесян М.Д. Выделение фрагмента ДНК, содержащего ген SUP35 дрожжей-сахаромицетов // Генетика. 1986. - Т.22. -№1. - С.17-25.

12. Тиходеев О. Н. Генетические характеристики нехромосомных супрессорных детерминант у дрожжей-сахаромицетов: Диссертация на соискание уч. степ, кандидата биол. наук. Д., 1990. -216 с.

13. Тиходеев О. Н., Гетманова Е. В., Тихомирова В. Д., Инге-Вечтомов С. Г. Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М., 1990.-С. 218-228.

14. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 296 с.

15. Холлендер М., Вулф Д. Непараметрические методы статистики. -М.: Финансы и статистика, 1983. 518 с.

16. Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесаманская А.Р., Тихомирова В.Л., Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Докл. АН СССР. 1988. -Т.301. -№5.-С.1227-1229.

17. Aigle М., Lacroute F. Genetical aspects of URE3., a non-Mendelian cytoplasmically inherited mutation in yeast // Mol. Gen. Genet. 1975. - V.136. -P.327-335.

18. Alper Т., Haig D.A., Clarke M.C. The exceptionally small size of the scrapie agent //Biochem.Biophys.Res.Commun. 1966. - V.22. -P.278-284.

19. Alper Т., Cramp W.A., Haig D.A., Clarke M.C. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? // Nature. 1967. - V.214. - P.764-766.

20. Bessen R.A., Kocisko D.A., Raymond G.J., Nandan S., Lansbury P.Т., Caughey B. Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein // Nature. 1995. - V.375. - P.698-700.

21. Bessen R.A., Marsh R.F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent // J.Virol. 1992. - V.66. - P.2096-2101.

22. Bessen R.A., Marsh R.F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy // J.Virol. 1994. -V.68. - P.7859-7868.

23. Brown D.R., Qin K., Herms J.W., Madlung A., Manson J., Strome R., Fraser P.E., Kruck Т., von Bohlen A., Schulz-Schaeffer W., Giese A., Westaway D., Kretzschmar H. The cellular prion protein binds copper in vivo II Nature. 1997. -V.390. - P.684-687.

24. Bueler H., Aguzzi A., Sailer A., Greiner R.A., Autenried P., Aguet M., Weissmann C. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie // Cell. 1993. - V.73. -P.1339-1347.

25. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of /ш-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr.Genet. 1993. - V.24. - P.268-270.

26. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein // Mol.Microbiol. 2000. - V.35. - P.865-876.

27. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono В., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor \psi+. // Science. 1995. - V.268. - P.880-884.

28. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PSI. prion // Mol.Cell Biol. 1999. - V.19. - P.8103-8112.

29. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog// Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.9773-9778.

30. Coustou V., Deleu C., Saupe S.J., Begueret J. Mutational analysis of the Het-s. prion analog of Podospora anserina. A short N-terminal peptide allows prion propagation // Genetics 1999. - V.153. - P.1629-1640.

31. Cox B.S. A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and otherpsi phenomena // Heredity. -1971. V.26. - P.211-232.

32. Cox B.S. Psi, a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast //I

33. Heredity. 1965. - V.20. - P. 505-521.i

34. Cox B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The psi factor of yeast: a problem in inheritance // Yeast. 1988. - V.4. - P.159-178.

35. Cox B.S., Tuite M.F., Mundy C.J. Reversion from suppression to nonsuppression in SUQ5 psi+. strains of yeast: the classificaion of mutations // Genetics. 1980. - V.95. - P.589-609.

36. Deleage G., Roux B. An algorithm for protein secondary structure prediction based on class prediction // Protein Eng. 1987. - V.l. - P.289-294.

37. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-tenninal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion // Cell 1998. - V.93. - P.1241-1252.

38. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kuslmirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae И Genetics. 1996. - V.144. - P.1375-1386.

39. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the /'SI' . prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. - V.147. - P.507-519.

40. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Liebman S.W. The PNM2 mutation in the prion protein domain of SUP35 has distinct effects on different variants of the PSI+. prion in yeast // Curr.Genet. 1999. - V.35. - P.59-67.

41. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PSf. and [PIN"]: a two-prion system in yeast? // EMBO J. 2000. - V.19. - P.1942-1952.

42. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. - V.137. - P.659-670.

43. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B.S., Tuite M.F. Guamdine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PS/". of Saccharomyces cerevisiae I/ Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. - V.97. -P.240-244.

44. Edskes H.K., Wickner R.B. A protein required for prion generation: URE3. induction requires the Ras-regulated Mksl protein // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. - V.97. - P.6625-6629.

45. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A., Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast // Biochem.J. 1999. - V.338. - P.403-407.

46. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Cullin C. The yeast prion URE3. can be greatly induced by a functional mutated URE2 allele // EMBO J. 2000. - V.19. -P.3215-3222.

47. Firoozan M., Grant C.M., Duarte J.A., Tuite M.F. Quantitation of readthrough of termination codons in yeast using a novel gene fusion assay // Yeast. -1991. V.7. - P.173-183.

48. Frishman D., Argos P. Incorporation of non-local interactions in protein secondary structure prediction from the amino acid sequence // Protein Eng. 1996. -V.9. - P.133-142.

49. Jung G., Jones G., Wegrzyn R.D., Masison D.C. A Role for Cytosolic Hsp70 in Yeast PSI . Prion Propagation and [PSI1 ] as a Cellular Stress // Genetics. -2000,- V. 156. -P.559-570.

50. Gajdusek D.C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post- translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations // J.Neuroimmunol. 1988. - V.20. - P.95-110.

51. Gamier J., Gibrat J.F., Robson B. GOR method for predicting protein secondary stmcture from amino acid sequence // Methods Enzymol. 1996. - V.266. - P.540-553.

52. Garvik В., Haber J.E. New cytoplasmic genetic element that controls 20S RNA synthesis during sporulation in yeast // J.Bacteriol. 1978. - V.134. -P.261-269.

53. Geourjon C., Deleage G. SOPM: a self-optimized method for protein secondary structure prediction // Protein Eng. 1994. - V.7. - P.157-164.

54. Gietz D., St.Jean A., Woods R.A., Schiestl R.H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells // Nucleic Acids Res. 1992. -V.20. - P.1425-1431.

55. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of AST*., a heritable prion-like factor of cerevisiae // Cell. 1997. - V.89. - P.811-819.

56. Goldring E.S., Grossman L.I., Krupnick D., Cryer D.R., Marmur J. The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxyribonucleic acid during induction of petites with ethidium bromide // J.Mol.Biol. 1970. - V.52. - P.323-335.

57. Griffith J.S. Self-replication and scrapie // Nature. 1967. - V.215. -P.1043-1044.

58. Guarente L. Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast // Methods Enzymol. 1983. - V.101. - P. 181191.

59. Hill A.F., Antoniou M., Collinge J. Protease-resistant prion protein produced in vitro lacks detectable infectivity // J.Gen. Virol. 1999. - V.80. - P.11-14.

60. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transforaiation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. - V.96. - P.23-28.

61. Jarrett J.Т., Lansbury P.Т., Jr. Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? // Cell. -1993. V.73. - P.1055-1058.

62. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1994. - 234 p.

63. Kelly J.W. Alternative conformations of amyloidogenic proteins govern their behavior// Curr.Opin.Struct.Biol. 1996. - V.6. - P.ll-17.

64. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain // EMBO J. 1988. - V.7. - P.l 175-1182.

65. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M., Wuthrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.6618-6622.

66. Kjeldgaard M., Nissen P., Thirup S., Nyborg J. The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation // Structure. 1993. - V.l. - P.35-50.

67. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation // J.Histochem.Cytochem. 1989. - V.37. - P. 1273-1281.

68. Kocisko D.A., Come J.H., Priola S.A., Chesebro В., Raymond G.J., Lansbury P.Т., Caughey B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein // Nature. 1994. - V.370. - P.471-474.

69. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP 2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae И Gene. 1988. - V.66. - P.45-54.

70. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions // Cell. 1998. - V.94. - P.13-16.

71. Kushnirov V.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Frolova N.S., Ter-Avanesyan M.D. Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica // EMBO J. 2000. - V.19. - P.324-331.

72. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast // J.Bacteriol. 1971. - V. 106. - P.519-522.

73. Latarjet R., Muel В., Haig D.A., Clarke M.C., Alper T. Inactivation of the scrapie agent by near monochromatic ultraviolet light // Nature. 1970. - V.227. -P.1341-1343.

74. Liebman S.W., Derkatch I.L. The yeast {PSI. prion: making sense of nonsense//J.Biol.Chem. 1999. - V.274. - P.l 181-1184.

75. Liebman S.W., Sherman F. Extrachromosomal psi determinant suppresses nonsense mutations in yeast// J.Bacteriol. 1979. - V.139. - P. 1068-1071.

76. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast // Nature. 1999. - V.400. - P.573-576.

77. Lund P.M., Cox B.S. Reversion analysis of psi'. mutations in Saccharomyces cerevisiae II Genet.Res. 1981. - V.37. - P.173-182.

78. Maddelein M.L., Wickner R.B. Two prion-inducing regions of Ure2p are nonoverlapping // Mol.Cell Biol. 1999. - V.19. - P.4516-4524.

79. Masison D.C., Maddelein M.L., Wickner R.B. The prion model for IJRE3. of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.12503-12508.

80. Masison D.C., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells // Science. 1995. - V.270. -P.93-95.

81. McCready S.J., McLaughlin C.S. A comparison of small circular DNA molecules in pst and psf strains of Saccharomyces cerevisiae II Biochim.Biophys.Acta. 1977. - V.479. - P.l 19-121.

82. McReady S.J., Cox B.S. Antisuppressors in yeast // Mol.Gen.Genet. -1973 V.124. - P.305-320.

83. Mortimer R.K., Johnston J.R. Genealogy of principal strains of the yeast genetic stock center// Genetics. 1986. - V.113. - P.35-43.

84. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing//Mol.Cell Biol. 1999. - V.19. - P.1325-1333.

85. Nissen P., Thirup S., Kjeldgaard M., Nyborg J. The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA // Structure.Fold.Des. 1999. - V.7. - P. 143-156.

86. Oesch В., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent S.B., Aebersold R., Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein // Cell. 1985. - V.40. - P.735-746.

87. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. - V.273. -P.622-626.

88. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like pst. determinant is mediated by oligomerization of the STTPiJ-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. 1996. - V.15. -P.3127-3134.

89. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. 1997a. -У.211. - P.381-383.

90. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion- dependent regulation // Mol.Cell Biol. -1997b. V. 17. - P.2798-2805.

91. Polekhina G., Thirup S., Kjeldgaard M., Nissen P., Lippmann C., Nyborg J. Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP // Structure. 1996. - V.4. - P. 1141-1151.

92. Priola S.A., Chesebro B. Abnormal properties of prion protein with insertional mutations in different cell types // J.Biol.Chem. 1998. - V.273. -P.l 1980-11985.

93. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie // Science. 1982. - V.216. - P.136-144.

94. Prusiner S.B. Scrapie prions // Annu.Rev.Microbiol. 1989. - V.43. -P.345-374.

95. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases // Science. 1991. -V.252. - P.1515-1522.

96. Prusiner S.B. Inherited prion diseases // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1994.-V.91.-P.4611-4614.

97. Prusiner S.B. Molecular biology and pathogenesis of prion diseases // Trends.Biochem.Sci. 1996. - V.21. - P.482-487.

98. Prusiner S.B., McKinley M.P., Bowman K.A., Bolton D.C., Bendheim P.E., Groth D.F., Glenner G.G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods // Cell. 1983. - V.35. - P.349-358.

99. Prusiner S.B., Groth D.F., Bolton D.C., Kent S.B., Hood L.E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein // Cell. 1984. -V.38. - P.127-134.

100. Prusiner S.B., Scott M.R. Genetics of prions // Annu.Rev.Genet. 1997. - V.31. -P.139-175.

101. Prusiner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E. Prion protein biology // Cell. 1998. - V.93. - P.337-348.

102. Riek R., Hornemann S„ Wider G., Billeter M., Glockshuber R., Wuthrich K. NMR stmcture of the mouse prion protein domain PrP(121-321) // Nature. 1996. - V.382. - P. 180-182.

103. Rogers M., Yehiely F., Scott M., Prusiner S.B. Conversion of truncated and elongated prion proteins into the scrapie isofonn in cultured cells // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1993. - V.90. - P.3182-3186.

104. Rosche W.A., Foster PL. Determining mutation rates in bacterial populations // Methods. 2000. - V.20. - P.4-17.

105. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 723 p.

106. Samsonova M.G., Inge-Vechtomov S.G., Taylor P. Stmcture comparison and evolutionary relations between elongation factors EF-Tu (EF-la) and SUP 2 proteins // Genetica. 1991. - V.85. - P.35-44.

107. Samsonova M.G., Inge-Vechtomov S.G. SUP 2 proteins: the relation to elongation factors EF-Tu (EF-la) and the role of N-terminal extension // Int. J. Genome Res. 1994. - V.l. - P.279-295.

108. Sanchez Y., Taulien J., Borkovich K.A., Lindquist S. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress // EMBO J. 1992. - V.l 1. - P.2357-2364.

109. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase // J.Mol.Biol. 1975. - V.94. -P.441-448.

110. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier // Cell. 2000. - V. 100. - P.277-288.

111. Schatzl H.M., Da Costa M., Taylor L., Cohen F.E., Prusiner S.B. Prion protein gene variation among primates // J.Mol.Biol. 1995. - V.245. - P.362-374.

112. Schirmer E.C., Lindquist S. Interactions of the chaperone Hspl04 with yeast Sup35 and mammalian PrP // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. -P.13932-13937.

113. Sherman F., Fink, G.R. Hincks, J.B. Methods in yeast genetics New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1986. - 367p.

114. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1989. - V.122. -P.19-27.

115. Silar P., Daboussi M.J. Non-conventional infectious elements in filamentous fungi // Trends.Genet. 1999. - V.15. - P.141-145.

116. Silar P., Haedens V., Rossignol M., Lalucque H. Propagation of a novel cytoplasmic, infectious and deleterious determinant is controlled by translational accuracy in Podospora anserina И Genetics. 1999. - V.151. - P.87-95.

117. Singh A., Ursic D., Davies J. Phenotypic suppression and misreading Saccharomyces cerevisiae II Nature. 1979. - V.277. - P. 146-148.

118. Sondheimer N., Lindquist S. Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast //Mol. Cell- 2000. V.5. - P. 163-172.

119. Sparrer H.E., Santoso A., Szoka F.C., Jr., Weissman J.S. Evidence for the prion hypothesis: induction of the yeast ASY J factor by in vitro-converted Sup35 protein // Science. 2000. - V.289. - P.595-599.

120. Stahl N., Baldwin M.A., Teplow D.B., Hood L., Gibson B.W., Burlingame A.L., Prusiner S.B. Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing // Biochemistry. 1993. - V.32. -P.1991-2002.

121. Stockel J., Safar J., Wallace A.C., Cohen F.E., Prusiner S.B. Prion protein selectively binds copper(II) ions // Biochemistry. 1998. - V.37. - P.7185-7193.

122. Szostak J.W., Orr-Weaver T.L., Rothstein R.J., Stahl F.W. The double-strand-break repair model for recombination // Cell. 1983. - V.33. - P.25-35.

123. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. -1999. V.283. - P.1339-1343.

124. Talloczy Z., Menon S., Neigeborn L., Leibowitz M.J. The KIL-d. cytoplasmic genetic element of yeast results in epigenetic regulation of viral M double-stranded RNA gene expression // Genetics. 1998. - V.150. - P.21-30.

125. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic. Acids. Res. -1994. -V.22. P.4673-4680.

126. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic. Acids. Res. 1997. - V.25. - P.4876-82.

127. Thual C., Komar A.A., Bousset L., Fernandez-Bellot E., Cullin C., Melki R. Structural characterization of Saccharomyces cerevisiae prion-like protein Ure2 // J.Biol.Chem. 1999. - V.274. - P.13666-13674.

128. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi'] in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1981. -V.98. - P.691-711.

129. Tuite M.F., Lund P.M., Futcher A.B., Dobson M.J., Cox B.S., McLaughlin C.S. Relationship of the psi. factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae II Plasmid. 1982. - V.8. - P. 103-111.

130. Weissmann C. PrP effects clarified // Curr.Biol. 1996. - V.6. - P.1359.

131. Whittal R.M., Ball H.L., Cohen F.E., Burlmgame A.L., Prusiner S.B., Baldwin M.A. Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry // Protein Sci. 2000. - V.9. - P.332-343.

132. Wickner R.B. Mutants of the killer plasmid of Saccharomyces cerevisiae dependent on chromosomal diploidy for expression and maintenance // Genetics. -1976. V.82. - P.273-285.

133. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae II Science. 1994. - V.264. - P.566-569.

134. Wickner R.B. Prions of yeast and heat-shock protein 104: 'coprion' and cure // Trends Microbiol. 1995. - V.3. - P.367-369.

135. Wickner R.B. Prions and RNA viruses of Saccharomyces cerevisiae II Annu.Rev.Genet. 1996. - V.30. - P.l 09-139.124

136. Wickner R.B. A new prion controls fungal cell fusion incompatibility // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.l0012-10014.

137. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K., Maddelein M.L. Prions of yeast, PSI. and [URE3], as models for neurodegenerative diseases // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1996. - V.61. - P.541-550.

138. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. 1985. - V.33. - P.103-119.

139. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. I. A nuclear genes controlling the inheritance of extrachromosomal elements // Heredity. 1971. - V.26. - P.413-422.

140. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. II. Relations with other extrachromosomal elements // Heredity. 1972. - V.28. - P.l89-199.

141. Zhou P., Derkatch I.L., Uptain S.M., Patino M.M., Lindquist S., Liebman S.W. The yeast non-Mendelian factor ETA+. is a variant of [P574"], a prion-likefonn of release factor eRF3//EMBO J. 1999. - V. 18. - P. 1182-1191.