Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие между N- и C-доменами белка Sup35 в процессе прионизации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие между N- и C-доменами белка Sup35 в процессе прионизации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

СОПОВА Юлия Викторовна

Взаимодействие между К- и С-доменами белка 8ир35 в процессе прионизации в дрожжахгЗассИаготусея сегеггягае

специальность: 03.02.07. — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕК 2010

Санкт-Петербург 2010

004616376

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Научный руководитель: академик РАН, профессор,

доктор биологических наук Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич Кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Сойдла Тыну Рихович Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич Кафедра микробиологии Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Петербургский институт ядерной физики

им. Б.П.Константинова РАН

Защита состоится " /<> '¿¿¿^¿¿^ 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите доктор/ких и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан " " /вд/л^ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Прионы - наследуемые формы клеточных белков с модифицированной структурой, поддерживающиеся автокатапитически. Фактор [PSI] S. cerevisiae — прионная форма фактора терминации трансляции eRF3 (Sup35), один из наиболее изученных дрожжевых прионов. В экспериментах И. Л. Деркач с соавторами было показано, что возможность индукции фактора [PS/1"] в штаммах [ps/~] зависит от другого прионоподобного элемента - [PIN*] ([RS7 ] inducible). Ключевую роль в прионизации белка Sup35 S. cerevisiae играет его N-терминальный домен (Ter-Avanesyan et al., 1994; Derkatch et al., 1996), тогда как С-домен необходим для поддержания жизнеспособности клетки и выполнения функции eRF3 в терминации трансляции. Первичная структура N-домена значительно варьирует у различных эукариотических организмов, хотя особенности аминокислотного состава и вторичной структуры сохранены по крайней мере у низших эукариот. Изучение химерных белков, включающих прионизующий домен Sup35, - перспективное направление биологии прионов, позволяющее исследовать механизмы возникновения и воспроизведения приона [PSt], а также изучать влияние взаимодействия между различными доменами как на эффективность процесса прионизации, так и на способность к преодолению межвидового барьера. В лаборатории физиологической генетики СПбГУ был сконструирован химерный белок Sup35SP, объединяющий NM-домен белка Sup35 S. cerevisiae и С-домен белка Sup35 дрожжей Pichia methanolica.

Настоящая работа посвящена характеристике прионной формы белка Sup35SP и его мутантного варианта Sup35SP-275, несущего замену Т275А в первом сайте связывания гуаниновых нуклеотидов.

В работе показано, что рекомбинантный белок Sup35SP-275 не может эффективно выполнять функции терминации трансляции в дрожжах S. cerevisiae, при этом жизнеспособность трансгенных штаммов дрожжей, несущих ген sup35SP-275, снижена по сравнению с трансгенными штаммами, несущих ген SUP35SP.

Результаты работы свидетельствуют о способности белков Sup35SP и Sup35SP-275 образовывать по меньшей мере два типа агрегатов: неприонные агрегаты, возникающие [Р/Л^-независимо, и прионные агрегаты, возникающие в штаммах [PIN*]. Прионизация белка Sup35SP-275, по видимому, приводит к гибели клетки из-за нарушений, связанных с инактивацией этого белка.

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование процесса прионизации eRF3 при экспрессии химерного гена SUP35SP и его мутантного варианта sup35SP-275.

Перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить фенотипическое проявление химерного гена SUP35SP и его мутантного варианта sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae

2. Изучить возможность прионизации химерного белка Sup35SP и его мутантного варианта Sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae

3. Изучить влияние С-домена на прионизующие свойства N-домена белка Sup35

Научная новизна работы. Получены жизнеспособные штаммы, содержащие мутацию в консервативном участке белка Sup35 - первом ГТФ-связывающем домене белка Sup35 Р. methanolica. Показан нонсенс-супрессорный эффект замещения гена SUP35 химерными генами SUP35SP и sup35SP-275. В данной работе нами впервые была охарактеризована мутация в первом ГТФ-связывающем участке белка Sup35 Р.methanolica, приводящая к частичной инактивации химерного белка Sup35SP-275 и как следствие, к пониженной эффективности терминации трансляции. Белок Sup35SP-275, несмотря на аминокислотную замену, критичную для его функционирования в качестве фактора терминации трансляции, обладает такой же повышенной способностью к агрегации, как и белок Sup35SP.

Практическая ценность. Трансгенные штаммы S. cerevisiae с замещением SUP35 на химерные гены могут быть использованы в качестве модели для изучения прионных заболеваний человека и животных. Использование данной системы оправдано принципиальным сходством прионов дрожжей и млекопитающих. Изучение гомологичной и гетерологичной прионизации белков eRF3 Р. methanolica и S. cerevisiae и гибридных белков, сконструированных на их основе, позволяет моделировать межвидовой перенос прионов, исследование которого приобрело большую актуальность в связи с эпизоотией «коровьего бешенства» в Европе и данными о возможности заражения человека через мясо больных животных (см. Ghani et al., 2000).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIX (Римини, Италия, 1999), XX (Прага, Чехия, 2001), XXI (Гетеборг, Швеция, 2003), XXII (Братислава, Словакия, 2005) международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей, на II (С-Петербург, 2000) и III (Москва, 2004) съездах ВОГиС, на 2-й конференции МОГиС (Москва, 2003), на международной конференции «Химические и биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004) и на семинарах лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ.

Объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 159 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Выводы». Работа содержит 9 таблиц, 39 рисунков, список литературы из 141 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Обозначения и сокращения. Использованные в работе варианты генов SUP35 обозначали следующим образом: SUP35S - ген SUP35 S. cerevisiae; SUP35SP - гибридный ген, состоящий из 5'-части SUP35S и 3'-части SUP35P (кодируемый этим геном белок объединяет NM-домен Sup35p S. cerevisiae и С-домен Sup35p Р. methanolicä), sup35SP-275 - мутантная аллель гена SUP35SP, кодирующая белок с заменой Т275А (рис.1.).

Gl

S. cerevisiae (254) MFGGKDHVSLIFMGHVDAGKSTMGGNLLYLTGSVDKRTIEKYEREAKDAGRQGWYLS Р. methanolica (312) MFGGKDHMS11FMGHVDAGKS rMGGNLLFLTGAVDKRTVEKYEREAKDAGRQGWYLS

Рисунок 1. Аминокислотные последовательности С-доменов белков Sup35S и Sup35P в районе первого участка связывания с ГТФ. Г - треонин, замененный на аланин в мутантном белке sup35SP-275; Gl - первый участок связывания с ГТФ

Трансгенные интегранты S. cerevisiae с замещением SUP35 в хромосоме обозначали следующим образом: перед названием исходного нетрансгенного штамма указывали номер полученного на его основе трансгенного интегранта и один из символов "SP" или "sp", обозначающий, что ген SUP35S в хромосоме этого штамма заменен на ген SUP35SP или sup35SP-275, соответственно. Например, название 178Р-74-Д694 обозначает 17-й по счету трансгенный интегрант с геном SUP35SP в хромосоме на месте SUP35S, полученный на основе штамма 74-Д694.

Штаммы S. cerevisiae и Е. coli. Основные штаммы дрожжей, использованные в работе, приведены в таблице 1. Все использованные штаммы принадлежат к Петергофской генетической коллекции.

Для поддержания и выделения плазмид и в качестве реципиента для трансформации использовали штамм бактерии Е. coli XLl-Blue (Stratagene).

Таблица 1. Генотипы штаммов дрожжей S. cerevisiae, использованных в работе.

Обозначение Генотип Происхождение

74-Д694 МАТ а adel-14 his3A200 ura3-52 leu2-3,l 12 trpl-289 Петергофская генетическая коллекция ШегкайЬ а а1, 1996)

rnql-A 74-Д694 MÄTa adel-14 his3A200 ura3-52 leu2-3,112 trpl-289 rnqlA Любезно предоставлен И.Л.Деркач (МшЬе1е ею!., 2010)

2Б-П3933 MÄTa hisS Петергофские генетические линии (У.М.АпсИапоуа е/ а!., 2003)

78А-П2393 MATahisS Петергофские генетические линии (У.М.АпсИапоуа еЛ а1„ 2003)

GT81-1D MATa adel-14 his3A200 lys2 ura3-52 leu2-3,l 12 trpl-289 Любезно предоставлен А.С.Борхсениусом (СЬепк^еГ а/., 1993)

GT12 MATa adel-14 his3A200 ura3-52 leu2-3,112 trpl-289 ANMSUP35 Любезно предоставлен А.С.Борхсениусом

Примечания:

Мутации adel-14- UGA; trpl-289 - UAG.

Плазмиды. В работе использовали челночные плазмиды, способные поддерживаться в клетках S. cerevisiae и Е. coli: pFL38 (CEN URA3), pFL44 (2p.mDNA URA3) (Bonneaud et al., 1991), pRS316 (CEN URA3) (Sikorski and Hieter, 1989) pRS415 (CEN LEU2) (Simons et al., 1987) и ряд плазмид, полученных на их основе. Использовали серию плазмид на основе pFL38 и pFL44, несущих гены SUP35S, SUP35SP и sup35SP-275. Плазмиды pSPZ3 и pSPZ3-275 использовали для замещения гена SUP35S в хромосоме генами SUP35SP и sup35SP-275, соответственно. Плазмиду pYS-GAL104 (Sanches et al., 1992) использовали для сверхэкспрессии гена HSP104, плазмиду pYS104 (Sanchez and Lindquist, 1990) - для умеренной экспрессии гена HSP104, плазмиду рКТ218 (Patino et al., 1996) - для инактивации белка Hsp 104.

Плазмиды pCUP-GFP и pSUP35-GFP (Patino et al., 1996), pSP-GFP, pSP-275-GFP использовали для цитологического анализа агрегации белков Sup35, слитых с зеленым флуоресцирующим белком Aequorea victoria (GFP). Плазмиды plD129 и pRS316-RNQl несут ген RNQ1 с собственными промоторной и терминаторной областями.

Генетические методы. В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (Инге-Вечтомов, 1971; Захаров и др. 1984; Sherman et al, 1986). Трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990). Супрессорный фенотип трансгенных штаммов определяли по способности к росту на синтетических средах, не содержащих аминокислот или азотистых оснований, потребность в которых обусловлена нонсенс-мутацией. Супрессорный эффект [PSf] или [/^/^-подобных факторов определяли по наличию и эффективности подавления мутации adel-14. Для элиминации [PSÍ] и [ЛУУ^-подобных факторов инкубировали штаммы на среде YAPD, содержащей 5 мМ хлорида гуанидина (ГГХ), или трансформировали штаммы плазмидой pYS-GAL104 и индуцировали у трансформантов сверхэкспрессию гена HSP104 на среде с галактозой (20 г/л).

Индукция экспрессии генов под контролем промотора CUPL Для индукции экспрессии гена GFP, а также химерных генов SUP35S-GFP, SUP35SP-GFP, SUP35S-CFP и SUP35SP-YFP мы выращивали трансформантов в жидкой среде, селективной для поддержания плазмиды, с добавлением CuS04 в концентрации 50цмоль до оптической плотности OD600 ~ 2. Далее клетки отмывали от среды и микроскопировали.

Молекулярно-биологические методы. В работе использовали стандартные методы получения и анализа рекомбинантных ДНК (Sambrook et al, 1989). Выделение тотальной ДНК из дрожжей проводили по методу Полайны и Адам (Polaina, Adam, 1991). Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Sambrook et al., 1989) при помощи термоциклера PCR Express (Thermo Hybaid, UK).

Методы микроскопирования. Флуоресцентный анализ белков, слитых с GFP, проводили с использованием микроскопа Leica DM6000B (Leica

Microsystems GmBH, Germany), используя систему компьютерного анализа изображения Leica QWin Standart V3.2.0. Флуоресценцию анализировали, используя комплект «GFP» (Leica Microsystems GmBH, Germany) с запирающим фильтром 525 нм и возбуждающим фильтром 470 нм.

Получение белковых экстрактов для электрофореза в полиакриламидном геле. Для получения дрожжевых экстрактов штаммы выращивали в жидкой среде до оптической плотности OD600=0.5-0.8, затем в среду добавляли циклогексимид до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали в течение 15 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 4°С, 3000 об/мин. Осадки промывали 3 мл водного раствора циклогексимида (200 мкг/мл), затем центрифугировали при 4°С, 3000 об/мин, промывали 0,5 мл лизирующего буфера, затем центрифугировали при 4°С, 3000 об/мин. Осадок растворяли в 300 лизирующего буфера (50 мМ Tris, pH 7,5; 0,1 mM EDTA; 1 тМ бензамидин; 2 ng/ml пепстатин; 5 mM MgCl2; 0,1 тМ DTT; 2 тМ PMSF; 100 pg/ml РНКаза А; 10 тМ KCl; 100 jag/m 1 циклогексимид; 10 pg/ml леупептин), добавляли равный объем стеклянных шариков (Sigma-Aldrich Со) и разрушали клетки встряхиванием на вортексе. После центрифугирования при 4°С, 3000 об/мин полученный супернатант делили на две части, одну (180 ц1) в дальнейшем использовали для оценки общего количества белка в пробе, а вторую центрифугировали при 4°С (13500 об/мин) 15 мин. После центрифугирования супернатант (180 ц1) помещали в отдельную пробирку, а осадок растворяли в 180 ц! лизирующего буфера. Для нанесения на форез пробы смешивали с 4Х буфером для нанесения (100 мМ Tris, pH 6,8; 10% SDS; 40% глицерин; 0,2% бромфеноловый синий; 20% ß-меркаптоэтанол).

Получение белковых экстрактов для электрофореза в агарозном геле. Для получения дрожжевых экстрактов штаммы выращивали в жидкой среде до оптической плотности OD6oo=0.5-0.8, клетки осаждали центрифугированием при 4°С, 3000 g. Начиная с данного момента, все последующие процедуры проводили при 4°С. Осадки промывали 0,5 мл лизирующего буфера (50 мМ Tris, pH 7,5; 50 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM PMSF; 1 таблетка Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (F. Hoffmann-La Roche Ltd)), затем центрифугировали при 4°C, 3000 g. Осадок растворяли в 300 ц1 лизирующего буфера, добавляли равный объем стеклянных шариков (Sigma-Aldrich Со) и разрушали клетки встряхиванием на вортексе. После центрифугирования при 4°С, 3000 g мы измеряли концентрацию белка в полученном супернатанте по методике Бредфорд (Bradford, 1976) и брали для дальнейшей работы по 150 |ig белка из каждой пробы. Перед нанесением на гель пробы смешивали с 2Х буфером для нанесения (50 мМ Tris, pH 6,8; 2% SDS; 5% глицерин; 0,0025% бромфеноловый синий) и инкубировали при комнатной температуре в течение 7 минут.

Иммуноблотинг. Белки разделяли при помощи электрофореза в 10% полиакриламидном геле в присутствии SDS (Laemmli, 1970), или в 1,5% агарозном геле (Bagriantsev et al., 2006). Белки переносили иммерсионным

методом на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot (Bio-Rad, USA) или на мембрану ПВДФ (Amersham Biosciences, USA) при плотности тока 2 мА на 1 см2 мембраны (Bjerrum and Schafer-Nielsen, 1986). Для идентификации белков Sup35S и Sup35SP использовали кроличьи поликлональные антитела SE4292, специфичные к N-концевому домену белка Sup35S, любезно предоставленные Шабельской C.B. (Université de Rennes, Rennes, France). В качестве вторичных антител были использованы ослиные антикроличьи антитела, связанные с пероксидазой (Amersham Biosciences, USA). Взаимодействие первичных и вторичных антител детектировали с помощью хемилюминесцентной системы ECL (Amersham Biosciences, USA) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение трансгенных штаммов S. cerevisiae с замещением SUP35 в хромосоме генами SUP35SP и siip35SP-275.

Для получения штаммов с замещением SUP35 в хромосоме исходные изогенные варианты [PIN'} и [pin] штамма 74-Д694 трансформировали фрагментами BamHI-Xhol плазмид pSPZ3 и pSPZ3-275. Данные фрагменты содержали последовательности, фланкирующие SUP35S в хромосоме S. cerevisiae, между которыми находились ген LEU2 S. cerevisiae и ген SUP35SP или sup35SP-275. Замещение аллели SUP35 в хромосоме происходило за счет гомологичной рекомбинации (рис.2). Отбирали клоны Leu+, у которых проверяли наличие замещенной копии SUP35 в хромосоме с помощью ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов. В реакциях ПЦР использовали хромосомную ДНК исследованных клонов как матрицу и праймеры, специфичные к 5' и З'-концевым участкам SUP35S и SUP35P. Для дальнейшего анализа нами были взяты штаммы 178Р-74-Д694 [PIN' | и 4SP-74-Д694 [pin].

__BamHI

тШШИИМШМ^» • / Т.FTP, h— I rsi.nss I

Рисунок 2. Схема замещения хромосомной копии гена SUP35S рекомбинантным геном SUP35SP, тесно сцепленным с геном LEU2.

Фенотипическое проявление рекомбинантных генов SUP35SP и snp35SP-275 в дрожжах S. cerevisiae.

Мы исследовали эффективность супрессии нонсенс-мутации adel-14 у полученных трансгенных штаммов (рис.3). Для штамма с химерным геном SUP35SP в хромосоме была характерна слабая нонсенс-супрессия (рост на среде без аденина в 20°С на 7-10 день), тогда как для штамма с мутантной аллелью sup35SP-275 в хромосоме была характерна повышенная эффективность нонсенс-

супрессии (рост на среде без аденина в 20°С на 2 день). В целом для С-доменов белков Sup35S и Sup35P характерна высокая степень сходства - 75,9% аминокислот идентичны. Выравнивание их аминокислотных последовательностей показало, что большинство (61%) различий аминокислотных последовательностей сосредоточено в участке связывания с белком Sup45 и белками Upf2 и Upf3 (а.к. 465-685 белка Sup35S), тогда как в участке связывания с гуаниновыми нуклеотидами и белком Upfl (а.к. 254-465 белка Sup35S) изменено только 20% аминокислот. Отличия в аминокислотных последовательностях С-доменов белков Sup35S и Sup35P могут объяснять сниженную эффективность взаимодействия белка Sup35SP с другими компонентами аппарата трансляции (в частности, с eRFl), и, как следствие, сниженную эффективность терминации трансляции. Замена треонина на аланин в консервативном участке связывания с ГТФ белка Sup35SP-275 приводит к нарушению терминации трансляции, при этом мутация sup35SP-275 не является летальной. Вероятно, у мутантного белка Sup35SP-275 частично инактивирована функция связывания и/или гидролиза ГТФ, что приводит в свою очередь к неэффективной терминации трансляции.

74-Д694 [PIN*] ИНН 74-Д694 [pin]

1Р-74-Д694 [PIN*] 1Р-74-Д694 [pin]

17SP-74-fl694 [PIN*] 4SP-74-fl694 [pin]

1зр-74-Д694 [PIN*] : lsP"74"^694

Рисунок 3. Эффективность супрессии мутации adel-14 у трансгенных штаммов, полученных на основе штаммов 74-Д694 [PIN*] и 74-Д694 [pin]. Среда без аденина с глюкозой, 7 дней инкубации при 30°

Введение дополнительных копий гена SUP35 на центромерной или многокопийной плазмиде в штамм 17БР-74-Д694 [PIN] приводило к повышению эффективности нонсенс-супрессии по сравнению с исходным штаммом. Причиной этого может быть повышение эффективности перехода белка Sup35 в прионную конформацию в штамме [PIN], вызванное повышением количества этого белка в клетке.

Введение дополнительных копий гена SUP35 на центромерной или многокопийной плазмиде в штамм 48Р-74-Д694 [pin ] приводило к понижению эффективности нонсенс-супрессии. Причиной этого может быть то, что в штамме [pin] прионизация белка Sup35 не происходит, поэтому за счет дополнительных молекул белка происходит более эффективная терминация трансляции. У трансформантов штамма 4БР-74-Д694 \piri] центромерной плазмидой с геном sup35SP-275 нонсенс-супрессия остается на уровне исходного штамма, поскольку белок Sup35SP-275 не может эффективно участвовать в терминации трансляции и конкурировать с белком Sup35SP дикого типа.

J

После потери многокопийных плазмид с геном SUP35S, SUP35SP или sup35SP-275 у трансформантов штамма 178Р-74-Д694 [PIN*] выщеплялось большое количество клонов, растущих на среде без аденина на 3-4 день. Инкубация таких клонов на среде с хлоридом гуанидина - универсальным антиприонным агентом, также как и сверхэкспрессия или инактивация гена HSP104, приводила к снижению нонсенс-супрессии до уровня штамма 4SP-74-Д694 [pin]. Таким образом, у этих клонов произошел переход белка Sup35SP в стабильную прионную конформацию, в дальнейшем обозначаемую [PSf]sr.

Агрегация белков Sup35SP и Sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae

Во всех исследованных трансгенных штаммах с геном SUP35SP или sup35SP-275 в хромосоме белки Sup35SP и Sup35SP-275 присутствовали как растворимой, так и в осадочной фракции независимо от [/YjV]-статус а штамма (рис.4). В нетрансгенных штаммах 74-Д694 [PIbt] и [pin] белок Sup35 был выявлен только в надосадочной фракции, тогда как в штамме 74-Д694 [PSf] он присутствовал как в надосадочной, так и в осадочной фракциях. Таким образом, химерные белки Sup35SP и Sup35SP-275 обладают повышенной способностью к [Р/Д^-независимой спонтанной агрегации. При этом у трансформантов штамма 178Р-74-Д694 многокопийными и центромерными плазмидами с генами SUP35SP и sup35SP-275 большая часть белка Sup35 была выявлена в осадочной фракции. У трансформантов штамма 178Р-74-Д694 многокопийными и центромерными плазмидами с геном SUP35S белок Sup35 был выявлен как в осадочной, так и в надосадочной фракциях.

Для дополнительной характеристики агрегатов, образующихся в трансгенных штаммах с химерными генами SUP35SP и sup35SP-275, мы проанализировали белковые экстракты, выделенные из трансгенных и нетрансгенных штаммов, при помощи полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле. Перед нанесением на гель нативный белок был подвергнут действию 1% SDS. Результаты представлены на рис. 5.

В присутствии 1% SDS высокомолекулярные агрегаты белка Sup35 были выявлены в штаммах 74-Д694 [PIN1] [PSf] и ШР-74-Д694 [PIN"] [PSl'f, тогда как во всех остальных исследованных штаммах (74-Д694 [PIN*] [/ш], 17SP-74-Д694 [PIN1], 17SP-74-fl694 [pin], 1зр-74-Д694 [PIN1] и lsp-74-fl694 [pin]) белок Sup35 присутствовал только во фракции мономеров. Таким образом, агрегаты, образующиеся в трансгенных штаммах с генами SUP35SP или sup35SP-275 в хромосоме, могут быть по меньшей мере двух типов.

Во-первых, это прионные агрегаты, выявляемые в штамме 178Р-74-Д694 [PSf]sp с помощью дифференциального центрифугирования и на полуденатурирующем форезе, устойчивые к действию SDS.

Во-вторых, это агрегаты, выявляемые в трансгенных штаммах [PIN*] [psí] и [pin] [psC] с помощью дифференциального центрифугирования и не выявляемые на полуденатурирующем форезе в присутствии 1% SDS. Вероятнее всего, это неприонные аморфные агрегаты, чувствительные к действию SDS.

Рисунок 5 Анализ агрегации белков БирЗЗБР и 8ир358Р-275 в трансгенных штаммах с помощью полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле. Представлен результат иммуногибридизации белковых экстрактов с использованием антител, специфичных к М-домену белка Бир35

Отметим, что мы не выявили отличий по размерам агрегатов между нетрансгенными штаммами [РБ1* ] и трансгенными штаммами что

может говорить о принципиальном сходстве прионных агрегатов белков 8ир358 и 8ир358Р.

Одним из методов выявления внутриклеточной локализации белка является ^пользование химерных конструкций, в которых исследуемый белок объединен

74-Я694

\РМ1 ГраП Н О

Рисунок 4. Анализ агрегации белков 8ир358Р и 8ир358Р-275 в трансгенных штаммах с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Представлен результат иммуногибридизации белковых экстрактов с использованием антител, специфичных к Ы-домену белка 8ир35 О - осадочная фракция, Н - надосадочная фракция.

агрегаты белка 8ир35

74-Д694 \Plrf] [/ш ] 74-Д694 \PIhT] [га/*] 178Р-74-Д694 [РИ^] [га/,4:р] 178Р-74-Д694 [Р1ЬГ] 178Р-74-Д694 |рт] 1 зр-74-Д694 \Plft] ]5р-74-Д694 \piri]

мономеры белка 8ир35

1 -

2 -345 -67-

с белком-репортером. В нашей работе в качестве таких белков-репортеров мы использовали белок GFP, дающий при облучении ультрафиолетом зеленое свечение.

Мы наблюдали агрегаты белка Sup35S-GFP только в трансгенных штаммах [PIN*], но не в [pin], что согласуется с литературными данными (Zhou et al., 2001), при этом форма агрегатов была различной - встречались точечные и кольцевые варианты. Агрегаты белков Sup35SP-GFP и Sup35SP-275-GFP мы зафиксировали в трансгенных штаммах [PIN*] и [pin], при этом нами были обнаружены только мелкие точечные агрегаты, тогда как кольцевых агрегатов зафиксировано не было. Отличий между трансгенными штаммами [PIN*] и [pin ] по форме, размеру и количеству агрегатов белков Sup35SP-GFP и Sup35SP-275-GFP в клетке мы не зафиксировали. В штамме 178Р-74-Д694 [PIN"] [P,S7']sp белки Sup35SP-GFP, Sup35SP-275-GFP и Sup35S-GFP наряду с мелкими агрегатами образовывали крупные точечные агрегаты. Полученные нами результаты согласуются с данными Вестерн-блот гибридизации, согласно которым белок Sup35SP образует агрегаты как в штаммах [PLV]. так и в штаммах [pin].

[PIN*] [pin]

[PSI*SF] [PIN*]

[pin]

[PSI*SP]

Sup35S-GFP Sup35SP-GFP

Рисунок 4.9. Локализация химерных белков Sup35S-GFP и Sup35SP-GFP в штаммах 17SP-7<-

Д694 [PIN*], 17SP-74-fl694 [pin] и ШР-74-Д694 [PIN*] [PStf.

Прионизация белков Sup35S и Sup35SP в штаммах, несущих гены SUP35S и SUP35SP.

Введение дополнительных копий гена SUP35SP или sup35SP-275 н центромерной плазмиде в штамм 74-Д694 [PIN*], но не 74-Д694 [pin], вызывал появление нонсенс-супрессии, исчезающей после инкубации трансформантов н среде с ГГХ. У трансформантов штамма 74-Д694 [PIN*] центромерно: плазмидой с геном SUP35S мы не зафиксировали нонсенс-супрессии. Поел потери центромерных плазмид, индуцирующих нонсенс-супрессию, в результат инкубации на среде с 5-FOA нонсенс-супрессия исчезала. Таким образов

супрессия, вызываемая 1-2 копиями гена SUP35SP или sup35SP-275 в нетрансгенном штамме 74-Д694, является [PIN' ]-зависимой и, по всей вероятности, является результатом прионизации продуктов SUP35S и SUP35SP (sup35SP-275). Такой прионоподобный фактор, способный поддерживаться только в присутствии индуцировавшей его центромерной плазмиды, был обозначен нами [.PS/']'"' 5.

Одним из возможных объяснений возникновения фактора [PSt]sps может быть повышенная способность белка Sup35SP к переходу в прионизованное состояние. Экспрессия гена SUP35SP, находящегося на центромерной плазмиде, приводит к синтезу дополнительных молекул белка Sup35SP, что повышает вероятность перехода белков Sup35S и Sup35SP в прионную конформацию. Белок Sup35S при небольшом повышении его концентрации в клетке за счет экспрессии гена на центромерной плазмиде в прионную конформацию не переходит. Потеря прионизованного состояния после потери центромерных плазмид может быть связана с тем, что присоединение новых белковых молекул Sup35S к уже имеющемуся агрегату происходит менее эффективно, чем дробление агрегатов за счет действия шаперонов, что приводит в итоге к исчезновению агрегатов белка Sup35.

Сверхэкспрессия HSP104 эффективно элиминировала фактор [PSf]s''s, что указывает на его прионную природу и принципиальное сходство с обычным [PS/]. При этом фактор [PSÍ]s/ 'v был более чувствителен к уровню экспрессии гена HSP104, чем фактор [PS/4], поскольку даже небольшое увеличение продукции белка Hspl04 приводило к дестабилизации фактора [PSíf 's .Это может быть связано в том числе и с повышенной эффективностью дробления агрегатов [PStf s.

Прион [Р/А^] не является необходимым для поддержания установившегося фактора [PSI ]'sv s, так как фактор [PSt]sl's сохраняется после элиминации гена RNQ1. При этом наличие [PIN*] или RNQ1 в клетке не влияет на эффективность супрессии, вызываемой фактором [PSt]sp's и сохранение супрессорного эффекта после потери индуцирующей плазмиды с SUP35SP.

Индукция и поддержание фактора [AS,/']s/''v у диплоидных штаммов -гетерозигот по гену SUP35. несущих одну копию гена SUP35S и одну копию гена SUP35SP.

Мы исследовали возможность индукции фактора [PSf]sl s в том случае, когда обе аллели (и SUP35S, и SUP35SP) находятся в хромосоме. Были получены гибриды Д912 (GT81-1D х 17SP-74-fl694 [PIN'] [/ш]) и Д927 (GT81-1D х 17SP-74-Д694 [pin] [psf]), являющиеся гетерозиготами по SUP35SP-LEU2 //SUP35 и гомозиготами по adel-14 // adel-14. Мы провели анализ окраски колоний митотического потомства клонов гибридов Д912 и Д927 (Таблица 2). Предполагалось, что возникновение белых колоний может быть обусловлено появлением [Р5/+]-подобного фактора. Ни одна из выявленных белых колоний

не изменила окраску и эффективность супрессии после инкубации на YAPD с ГГХ, что говорит об отсутствии в них фактора [PS/].

Полученные данные говорят о том, что эффективной индукции [PSI] в гетерозиготных диплоидах SUP35S / SUP35SP не происходит. Таким образом, само по себе присутствие в клетке генов SUP35S и SUP35SP одновременно не приводит к индукции [Р£Г]-подобного фактора. По-видимому, для эффективной индукции приона необходимо повышение концентрации белков Sup35SP и/или Sup35S, как это происходит в случае трансформантов гаплоидных штаммов с геном SUP35S или SUP35SP в хромосоме.

Таблица 2. Окраска колоний гибридов GT81-1D х 178Р-74-Д694 [PIN'] [psf] и GT81 -1D х 178Р-74-Д694 [pin] [psf] на среде С ± Ade. __

Гибрид Число красных колоний Число белых колоний Число клонов r/Wl Частота клонов [PSÍ]

GT81-1DX 17SP-74-fl694 [PIN*] ГртП1 9607 14 0 0(0-МО"4)

GT81-1Dх 178Р-74-Д694 [pin] [/ш]' 48600 4 0 0(0-Ы0"4)

GT81-1D х 17БР-74-Д694 [PIN1] [psíf 6538 0 0 0(0 - 2»10"4)

GT81-1Dх 17SP-74-fl694 [pin] [psíf 35258 3 0 0(0- 1*10"4)

Примечание. 1 - Отдельные клоны гибридов GT81-1D х 17SP-74-fl694 [PIN' ] [psf] и GT81-1D х 178Р-74-Д694 [pin] \psí\ были высеяны на среду С ± Ade сразу после инокуляции в жидкую YAPD. 2-Отдельные клоны гибридов GT81-1D х ШР-74-Д694 [PIN'] ¡psf] и GT81-1D х 178Р-74-Д694 \piri] были высеяны на среду С ± Ade через 24 часа после инокуляции в жидкую YAPD. Для значений частоты клонов [PÍY1] указан 95% доверительный интервал.

Мы исследовали возможность поддержания фактора [PSf]sp"s и фактора [PS/] у диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SP/SUP35S. Мы трансформировали трансгенный штамм 178Р-74-Д694 [PIN ] центромерной плазмидой pFL38-SUP35S и у полученных трансформантов отобрали клоны с повышенной эффективностью супрессии. Инкубация таких клонов на среде с ГТХ приводила к исчезновению нонсенс-супрессии, поэтому мы считали, что у этих клонов был индуцирован фактор [PSP]sp/s. Мы скрестили полученный штамм ШР-74-Д694 [P/Nf] [PSff*, несущий плазмиду pFL38-SUP35S, и исходный штамм 178Р-74-Д694 [PIN ] со штаммом GT81-1D [pin ] [psí]. Мы зафиксировали эффективную супрессию нонсенс-мутации adel-14 в случае диплоида, несущего фактор [P<S7'],s vs, тогда как изогенный диплоид, не несущий фактора [PSl']sl' s, не рос на среде без аденина. Инкубация диплоида [PSffs на среде с ГГХ приводила к исчезновению нонсенс-супрессии. На основании этого можно сделать вывод, что, хотя у диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SP, эффективной индукции фактора [PSffs не происходит, но поддержание его возможно.

Мы провели тетрадный анализ гибридов, гетерозиготных по генам SUP35S/SUP35SP или SUP35S/sup35SP-275 и несущих фактор [PSI] или [PSffs. Для этого мы использовали гибридов Д912 от скрещивания GT81-1D

frwf] X 178Р-74-Д694, гибридов Д914 от скрещивания GT81-1D [PSI' ] х 17SP-74-Д694, гибридов Д928 от скрещивания GT81-1D [PSP] х Ьр-74-Д694, гибрида Д929 от скрещивания GT81-1D \psf] х 1 sp-74-fl694 и гибрида Д930 от скрещивания GT81-1D [/иГ] х lsp-74-fl694 [/,5/']'S7/'v. Для получения гибрида Д930 мы трансформировали трансгенный штамм 1 Бр-74-Д694 [PIN' ] центромерной плазмидой pFL38-SUP35S и скрестили полученный штамм lsp-74-Д694 [PIN'] [PSPf'/s, несущий плазмиду pFL38-SUP35S, со штаммом GT81-1D [pin ] [pi/-]. Результаты тетрадного анализа представлены в таблице 3. Поскольку гены SUP35SP и sup35SP-275 тесно сцеплены с геном LEU2 и в обоих родительских штаммах присутствует мутантный ген 1еи2, сегреганты Leu+ несут ген SUP35SP или sup35SP-275, а сегреганты Leu" - ген SUP35S дикого типа. Тетрадный анализ диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SP, показал, что выживаемость аскоспор с геном SUP35SP не зависит от наличия в диплоиде фактора [PSI ). Соотношение между аскоспорами, несущими ген SUP35S или SUP35SP, не отличалось от 1:1 статистически значимо ни в случае диплоида, несущего фактор [PS/], ни в случае диплоида, не несущего этот фактор.

В случае диплоида Д929, не несущего ни фактора [/"5/], ни фактора [7,S/t]'svvs, и гетерозиготного по мутантному гену sup35SP-275, в большинстве тетрад мы наблюдали 3 или 4 выживших аскоспоры. При этом соотношение аскоспор, несущих ген SUP35S или sup35SP-275, не отличалось статистически значимо от 1:1. В случае диплоида Д928 [PS1/], мы наблюдали статистически значимо неслучайную (%2=19 Р>0,95) гибель аскоспор с геном sup35SP-275, и большинство тетрад имело расщепление по выживаемости 2V:2L. Микроскопирование показало, что все сегреганты, не образовавшие колоний, представляли собой 1 или 2 клетки.

Пониженную выживаемость аскоспор мы наблюдали и в мейотическом потомстве диплоида Д930 [PSl']s''/s. Однако в этом случае гибель Leu+ и Leu-аскоспор была случайной (х2=0,39; 0,01<Р<0,05). Соотношение Leu+/Leu" у выживших сегрегантов достоверно не отличалось от 1:1 (х2=1,46; 0,5<Р<0,9). Все i сегрегантов Leu+ имели фенотип Ade" Lys" и нормально скрещивались с естерами типа спаривания, поэтому мы предположили, что это гаплоиды, гесущие наряду с геном SUP35S ген sup35SP-275, сцепленный с геном LEU2. У icex 6 проверенных сегрегантов мы выявили с помощью ПЦР-анализа наличие :ак гена SUP35S, так и гена sup35SP-275. На основании этих данных мы сделали 1Ывод, что наличие у диплоида фактора [PSf]sp/s и мутантного гена sup35SP-275 фиводит к нарушениям в расхождении хромосом в мейозе, в частности, ромосомы IV, в которой локализован ген SUP35. Одним из вариантов |бразования таких гаплоидов является нерасхождение IV хромосомы в мейозе, фи этом сегрегант - нуллисомик по IV хромосоме будет нежизнеспособен.

Поскольку использованные в работе диплоиды гомозиготны по большинству тркеров, мы смогли проследить только за расхождением хромосомы III, в оторой локализован локус МАТ. Из 17 выживших сегрегантов гибрида SUP35S

\psi-] х я11р358Р-275 [PSf)SP/s два были некопулирующими, при этом их клетки имели типичную для гаплоидов округлую форму. Таким образом, присутствие в клетке мутантной аллели $ир358Р-275 и фактора [Р57+]5т приводит к нарушениям не только в процессе терминации трансляции, но и в работе цитоскелета.

Таблица 3. Тетрадный анализ диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35S/SUP35SP или SUP35S/sup35SP-275.

Диплоид Соотношение типов тетрад V-.L Соотношение выживших/ погибших аскоспор Соотношение фенотипов аскоспор Общее количество тетрад

4:0 3:1 2:2 1:3 0:4

Д912 SUP35S [psi-] x SUP35SP 7 3 0 0 0 37/3 19 Leu+/18 Leu" 19 МАТа/ 18 МАТа 10

Д914 SUP35S [PSi] x SUP35SP 4 4 2 0 0 32/8 12 Leu+/20 Leu" 15 МАТа/ 17 МАТа 10

Д928 SUP35S [PSf] x sup35SP-275 0 0 21 6 3 48/72 0 Leu+/48 Leu 20 МАТа/ 28 МАТа 30

Д929 SUP35S &Ш-] x sup35SP-275 18 14 7 0 1 128/32 61 Leu+/67 Leu" 63 МАТа/ 65 МАТа 40

Д930 SUP35S [psi-] x sup35SP-275 [PStfp/s 0 1 3 8 5 17/51 Leu'^l 1 Leu" 6 МАТа/ 9 МАТа/ 2 NM 17

Примечание: V- выжившие аскоспоры, L- погибшие аскоспоры; р_щелень} аскоспоры Leu+ Sup' Генотип диплоидов:

MATaleu2 adel-N his3A200 игаЗ-52 LYS2 trpI-289 SUP35SP(suv35SP-275)-LEU2

MATaleu2 adel-14 his3A200 ura3-52 lys2 trpl-289 SUP35S

ВЫВОДЫ.

1. Химерный белок Sup35SP, объединяющий NM- домен белка Sup35 S. cerevisiae и С- домен белка Sup35 P. methanolica, способен эффективно выполнять функции терминации трансляции в дрожжах S.cerevisiae.

2. Мутация sup35SP-275, представляющая собой замену треонина на апанин в консервативном участке связывания с ГТФ, приводит к частичной инактивации химерного фактора терминации трансляции, и, как следствие, к повышенной эффективности нонсенс-супрессии в штаммах S.cerevisiae с геном sup35SP-275 в хромосоме.

3. Химерный белок Sup35SP способен образовывать два типа агрегатов -неприонные агрегаты возникающие спонтанно и [PWI-независимо и прионные агрегаты, индуцируемые сверхэкспрессией гена SUP35SP в штаммах [Р1!\Г ].

4. Экспрессия гена SUP35SP с центромерной плазмиды в штаммах [PIN*] индуцирует появление гетероприона [Pst]si's, при этом после потери индуцирующей плазмиды с геном SUP35SP не происходит конверсии [PSrf 's в гомоприон [PSI ].

5. Сочетание в диплоиде химерного гена SUP35SP и фактора [PStsp/s] или [PSI ] вызывает нарушение расхождения хромосом в мейозе и повышенную частоту гибели аскоспор.

6. Взаимодействие между прионизующим и функциональным доменами белка Sup35, прямое или опосредованное другими белками, влияет на прионогенные свойства этого белка, в том числе на его способность к образованию агрегатов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. С.П.Задорский, Ю.В.Сопова. С.Г.Инге-Вечтомов. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.ll Генетика, 2000, Т.36, N 10, с Л 122 - 1139.

2. Задорский С.П., Борхсениус A.C., СоповаЮ.В., Старцев В.А., Инге-Вечтомов С.Г. Супрессия нонсенс-мутаций и мутаций сдвига рамки считывания при различных способах инактивации фактора терминации трансляции eRF3 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. //Генетика, 2003, 39: 395-399.

3. Рябинкова H.A., Сопова Ю.В.. Полозков Г.В., Савелова М.В., Инге-Вечтомов С.Г. Супрессия сдвига рамки считывания при подавлении терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Значение "локального" контекста.//Генетика, 2004, №7, 885-892

4. S.P.Zadorsky, J.V.Sopova. S.G.Inge-Vechtomov. Nonsense supression through expression of SUP35 of Pihia methanolica in Saccharomyces cerevisiae XIX

International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Rimini, Italy, 25-30 May, 1999

5. С.П.Задорский, Ю.В. Сопова. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. 2-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. С-Петербург, 1 - 5 февраля 2000 г. Т.2, с.78

6. S.P. Zadorsky, J.V.Sopova, S.G. Inge-Vechtomov. Induction of [PtS7]-like factor in Saccharomyces cerevisiae strains with substitution of SUP35 for its homologue from Pichia is in part P/N-independent. XX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, Czech Republic, 26-31 August, 2001

7. S.G. Inge-Vechtomov, A.S. Borchsenius, S.P. Zadorsky, J.V.Sopova G. Polozkov, V.V. Alenin, A.S. Zekhnov, I.Tribunskih.Nonsense and frameshift suppression by natural and genetically reconstructed yeast prions. XX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, Czech Republic, 26-31 August, 2001 .

8. Задорский С.П., Ю.В. Сопова, Инге-Вечтомов С.Г.Прион-формирующие свойства рекомбинантного белка Sup35SP Тезисы 2-й конференции МОГиС "Актуальные проблемы генетики" 20-21 февраля 2003 г

9. Zadorskiy, S.P., J.V.Sopova, Inge-Vechtomov, S.G. Prion forming abilities of interspecies recombinant Sup35p Abstracts of the XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular biology 2003 Yeast. 20 (SI): 290

10. Задорский С.П., Ю.В. Сопова. Инге-Вечтомов С.Г Прион-формирующие свойства рекомбинантного белка Sup35SP Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. Материалы III съезда ВОГиС. Москва, 6-12 июня 2004 г. С.315

11. S.P.Zadorsky, A.S.Borchsenius, S.V.Zharkevich, J.V.Sopova, V.V.Alenin, Y.O.Chernoff, S.G.Inge- Vechtomov. Induction of a heteroprion by the chimeric Sup35N-Ade2 protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae International conference "Chemical and biological problems of proteomics". July 5-9, 2004. Novosibirsk Abstract book and program, p.52.

12. J.V.Sopova. D. Akhmedov, S. Zadorsky, S. Inge-Vechtomov. Chimeric Sup35SP protein forms aggregates [PIN +] - independently in Saccharomyces cerevisiae. XXII International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. August 7-12th, 2005. Yeast. 22(S1): 131

Подписано в печать 14.10.2010. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 501

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сопова, Юлия Викторовна

Обозначения и сокращения.

Введение.

1. Прионы низших эукариот (обзор литературы).

1.1. Общие свойства.

1.2. Прионы мицелиальных грибов.

1.3. Фактор [URE3].

1.4. Факторы [ZSP+], [SWt], [МОТЗ+], [OST"] и [MCA].

1.5. Фактор [PSf].

1.6 Фактор [Р/Л^].

1.7. Зависимость проявления и поддержания [PST*] от различных белков.

1.8. Изгнание [PSГ1] под действием хлорида гуанидина и его механизмы.

1.9. «Жизненный цикл» прионов.

1.10. Изменения в структуре Sup35, влияющие на разные стадии «жизненного цикла» [PST"].

1.10.1. Изменения, влияющие на стадию инициации.

1.10.2. Изменения, влияющие на стадию конверсии (передачи прионной конформации).

1.10.3. Изменения, влияющие на стадию образования прионных «семян».

1.11. Прионизация гомологов белка Sup35 в дрожжах S. cerevisiae.

1.12. Химерные конструкции, включающие различные домены белка Sup35.

2. Постановка задачи работы.

3. Материалы и методы.

3.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.2. Штаммы Esherichia coli.

3.3. Плазмиды.

3.4. Среды и условия культивирования.

3.5. Учет фенотипов.

3.6. Стандартные генетические методы.

3.7. Элиминация [РЗ/*] и [РбТ^-подобных факторов.

3.8. Индукция экспрессии генов под контролем промотора СиР1.

3.9. Молекулярно-генетические методы.

3.10. Методы микроскопирования.

3.11. Получение белковых экстрактов для электрофореза в полиакриламидном геле.

3.12. Получение белковых экстрактов для электрофореза в агарозном геле.

3.13. Иммуноблотинг.

4. Результаты.

4.1. Получение трансгенных штаммов, несущих в хромосоме ген БиРЗЗБР или 8ир358Р-215.

4.2. Фенотипическое проявление рекомбинантных генов БиРЗЗБР и $ир358Р-275 в дрожжах ^.сегеушае.:.

4.3. Нонсенс-супрессия у трансформантов трансгенных штаммов с геном БиРЗЗБР в хромосоме.

4.4. Нонсенс-супрессия у трансформантов трансгенных штаммов с геном зир358Р-275 в хромосоме.

4.5. Нонсенс-супрессия у трансформантов нетрансгенных штаммов

4.6. Агрегация белков 8ир358Р и 8ир358Р-275 в дрожжах $.сегел>151ае.

4.6.1.Иммунологическое исследование агрегации.

4.6.2.Цитологическое исследование агрегации белков 8ир358Р и 8ир358Р-275.

4.7. Влияние изменения экспрессии гена Н8Р104 на эффективность супрессии и агрегации белка 8ир358Р у трансгенных штаммов с генами 8иР35БР и 5мр555Р-275 в хромосоме.

4.8. Изучение агрегации белка Sup35SP-GFP и состава агрегатов, возникающих в клетках с полноразмерным SUP35 при экспрессии SUP35SP.

4.8.1. Визуализация агрегатов с помощью флуоресцентной микроскопии.

4.8.2. Оценка супрессии у трансформантов штамма 74-Д694 плазмидами, содержащими химерные гены SUP35S-GFP, SUP35SP-GFP и sup35SP-275-GFP.

4.8.3. Изучение состава агрегатов, образующихся при экспрессии гена SUP35SP в нетрансгенных штаммах, с помощью Вестерн-блот гибридизации.

4.8.4. Конструирование штаммов, несущих ген SUP35-HA в хромосоме, и изучение состава агрегатов, образующихся при экспрессии гена SUP35SP в таких штаммах.

4.9. Изучение влияния экспрессии гена HSPI04 на поддержание [Р£/+]5/УЛ.

4.9.1. Эффект сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание [Р£7+]5т.

4.9.2. Эффект умеренной сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание [PSffP/s.

4.10. Оценка зависимости поддержания [Р6Т+]57У5 от приона [PIN^].

4.11. Индукция и поддержание фактора [PSIí~]sp/s у диплоидных штаммов.

4.12. Летальное взаимодействие факторов [PSf~\ и [Р57+]5/У5 с мутантной аллелью sup35SP-2 75.

5. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие между N- и C-доменами белка Sup35 в процессе прионизации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae"

Белки-прионы и их необычные свойства стали в последнее время объектом пристального изучения. Первоначально обнаруженные у млекопитающих, у которых они вызывают тяжелые нейродегенеративные заболевания, белки со свойствами прионов были найдены у низших эукариот - дрожжей и нитчатого гриба Ро^эрога. Особую важность приобрели исследования прионов в связи с фактами переноса заболеваний от животных (коров) к человеку. Прионы — наследуемые формы клеточных белков с модифицированной третичной структурой, поддерживающиеся автокаталитически. Белки с прионными свойствами дрожжей Басскаготусея сегеугягае — одна из популярных областей генетических исследований. Фактор & сегегаше - прионная форма фактора терминации трансляции еКРЗ (БирЗб), один из наиболее изученных дрожжевых прионов. Для многих белков с прионными свойствами характерно разделение на прионизующий домен и функциональный домен. Изучение химерных конструкций, включающих прионизующий домен 8ир35, - перспективное направление биологии прионов, позволяющее исследовать механизмы их возникновения и воспроизведения в клетке. Использование трансгенных дрожжей с химерными генами позволяет изучать влияние взаимодействия между различными, доменами как на эффективность процесса прионизации, так и на способность преодолевать межвидовой^ барьер. В лаборатории физиологической генетики были показаны необычные прионизующие свойства химерного белка ЗирЗбЭР, объединяющего КМ-домен белка Бир35 & сегеушяе и С-домен белка 8ир35 дрожжей Р1сЫа теМапоИса.

ГЛАВА 1. ПРИОНЫ НИЗШИХ ЭУКАРИОТ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие свойства.

Прионы - формы клеточных белков с измененной третичной структурой, поддерживающиеся автокаталитически. Впервые обнаруженные у млекопитающих, у которых они вызывают тяжелые поражения нервной системы, белки с прионными. свойствами впоследствии были охарактеризованы у микроорганизмов (детерминанты [URE3] (Lacroute, 1971; Wickner, 1994), [PSf] (Сох, 1965, Derkatch et al., 1996), [P/A^] (Derkatch et al., 1997, 2001), [/SP+] (Volkov, et al., 2002), [SWf] (Du et al., 2008), [MOT3-] (Alberti et al., 2009), [OST*] (Patel et al., 2009), [MCA] (Nemecek et al., 2009) дрожжей- S. cerevisiae и [Het-s] (Coustou et al., 1997) гриба Podospora anserina). Для идентификации прионов низших эукариот был сформулирован ряд критериев (Wickner, 1994; Wickner et al., 2000; Wickner et al., 2006):

I. Неменделевский характер наследования, что свойственно также вирусам, плазмидам, цитоплазматическиморганеллам.

II. Возможность обратимого изгнания — потери прионного фенотипа и спонтанного его появления с некоторой частотой. Для изгнания чаще всего используют среду с 1-5 мМ гидрохлоридом гуанидина (ГГХ), который изгоняет большинство прионов S. cerevisiae, но- не влияет на [Het-s] (см. Uptain and Lindquist, 2002) и [MCA] (Nemecek et al., 2009).

III. Сверхпродукция белка увеличивает частоту, с которой прион. возникает de novo. Появление приона de novo — вероятностный процесс, и увеличение концентрации белка, способного к переходу в прионную форму, приводит к увеличению вероятности возникновения приона.

IV. Сходство прионного фенотипа и фенотипа мутации в гене, кодирующем белок приона, приводящей к нарушению функции белка. Этот критерий справедлив в тех случаях, когда прионная форма белка функционально не активна. Этому критерию отвечают прионные детерминанты [PS/1"], [URE3], [SWt], [МОТЗ+], [OSrb] и [МСА].

Характерная особенность белков, способных к прионизации, - наличие аминокислотных последовательностей, обогащенных Gln/Asn, склонных к образованию |3-слоёв (Osherovich and Weissman, 2001). Исключением являются белки РгР (есть последовательности, обогащенные Pro/Gly) и Het-s. Наличие участков, обогащённых Gln/Asn - диагностический признак, позволяющий выявлять белки, потенциально способные к прионизации (Michelitsch and Weissman, 2000).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сопова, Юлия Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Химерный белок 8ир358Р, объединяющий КМ- домен белка БирЗб сегеушае и С- домен белка БирЗб Р. теЬкапоНса, способен эффективно выполнять функции терминации трансляции в дрожжах З.сегетягае.

2. Мутация 8ир358Р-275, представляющая собой замену треонина на аланин в консервативном участке связывания с ГТФ, приводит к частичной инактивации химерного фактора терминации трансляции, и, как следствие, к повышенной эффективности нонсенс-супрессии в штаммах сегеушае с геном зир358Р-275 в хромосоме.

3. Химерный белок 8ир358Р способен образовывать два типа агрегатов — неприонные агрегаты, возникающие спонтанно и [Р/М]-независимо и прионные агрегаты, индуцируемые сверхэкспрессией гена 81/Р358Р в штаммах [РШ1].

4. Экспрессия гена 8С/Р358Р с центромерной плазмиды в штаммах [Р/А^] индуцирует появление гетероприона [РЗТ*]57'75, при этом после потери индуцирующей плазмиды с геном 811Р358Р не происходит конверсии в гомоприон [Р^].

5. Сочетание в диплоиде химерного гена 811Р358Р и фактора [Р81*5Р/5] или [Р57*] вызывает нарушение расхождения хромосом в мейозе и повышенную частоту гибели аскоспор.

6. Взаимодействие между прионизующим и функциональным доменами белка 8ир35, прямое или опосредованное другими белками, влияет на прионогенные свойства этого белка, в том числе на его способность к образованию агрегатов.

144

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сопова, Юлия Викторовна, Санкт-Петербург

1. Борхсениус A.C., Саснаускас К., Гедвилайте А., Инге-Вечтомов С.Г. Химерные прионы дрожжей с нестабильным наследованием // Генетика. 2002. -Т.38. - С.300-305.

2. Волков К. В. Новый прионоподобный.детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции: Диссертация на соискание уч. степ, кандидата биол. наук. С-Пб., 2000. — 125с.

3. Задорский С.П. Фенотипическое проявление гена SUP35 Pichia methanolica и прионизация его продукта в дрожжах Saccharomyces cerevisiae: Диссертация на соискание уч. степ, кандидата биол. наук. С-Пб., 2002 - 179с.

4. Задорский С.П. И Инге-Вечтомов С.Г. Ген SUP35 Pichia methanolica является рецессивным супрессором в дрожжах Saccharomyces cerevisiae II Докл. Акад. Наук. 1998. - Т.361. - №6. - С.825-829.

5. Задорский С.П., Сопова Ю.В., Инге-Вечтомов С.Г. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae II Генетика. -2000. Т.36. - С.1322-1329

6. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.:Наука, 1984. - 144с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей. // Генетика. 1971. - Т.7. - С.113-124.

8. Тиходеев О.Н., Гетманова Е.В., Тихомирова B.JL, Инге-Вечтомов С.Г. Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. Сборник. - М.: Наука, 1990. -С.218-228.

9. Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесаманская А.Р., Тихомирова B.JL, Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Докл. АН СССР. 1988. - Т.301. -№5. - С.1227.

10. Шабельская С.В. Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Диссертация на соискание уч. степ, кандидата биол. наук. С-Пб., 2005. - 140с.

11. Alberti S., Halfmann R., King О., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. // Cell. -2009. V.137. -N.l. - P.146-58.

12. Andrianova V.M, Inge-Vechtomov S.G. The Petergof genetic collection of microorganisms. S-Pb. 2003

13. Bagriantsev S.N., Kushnirov V.V., Liebman S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis // Methods Enzymol. 2006. - V.412. - P.33-48.

14. Bai M., Zhou J.M., Perrett S. The yeast prion protein Ure2 shows glutathione peroxidase activity in both native and fibrillar forms // J. Biol. Chem. 2004. - V.279 -N.48. - P.50025-50030.

15. Baudin-Baillieu A., Fernandez-Bellot E., Reine F., Coissac E., Cullin C. Conservation of the prion properties of Ure2p through evolution. // Mol. Biol. Cell. -2003. V.14. -N.8. -P.3449-58

16. Birnboim H.C. and Doly Y. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P. 1513-1524.

17. Bonneaud N., Ozier-Kalogeropoulos O., Li G.Y., Labouesse M., Minvielle-Sebastia L., Lacroute F. A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae/E. coli shuttle vectors // Yeast. 1991. - V.7. - N.6. - P.609-615.

18. Borchsenius A.S., Wegrzyn R.D., Newnam G.P., Inge-Vechtomov S.G., Chernoff Y.O. Yeast prion protein derivative defective in aggregate shearing and production of new 'seeds' // EMBO J. 2001. - V.20. - P.6683-6691.

19. Borchsenius A.S., Muller S., Newnam G.P., Inge-Vechtomov S.G., Chernoff Y.O. Prion variant maintained only at high levels of the Hspl04 disaggregase // Curr Genet. -2006. -V.49. -P.21-29.

20. Bousset L., Belrhali H., Melki R., Morera S. Crystal structures of the yeast prion Ure2p functional region in complex with glutathione and related compounds // Biochemistry. -2001. V.40 - N.45. - P.13564-13573.

21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. // Anal. Biochem. -1976. V.72. - P.248-54.

22. Bradley M.E., Edskes H.K., Hong J.Y., Wickner R.B., Liebman S.W. Interactions among prions and prion "strains" in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -Suppl. 4. - P.16392-16399.

23. Chernoff Y.O. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back? // Mutat. Res. -2001. V.488. - N.l. - P.39-64.

24. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1993. - V.24. - N.3. - P.268-270.

25. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor P5Y*. // Science. 1995. - V.268. - P. 880-884.

26. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PS7. prion. // Mol. Cell. Biol. 1999. - V.19. - N.l 2. -P.8103-12

27. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein. // Mol. Microbiol. 2000. - V.35. - N.4. - P.865-76

28. Cipollina C, Alberghina L, Porro D, Vai M. SFP1 is involved in cell size modulation in respiro-fermentative growth conditions // Yeast. 2005 Apr 15;22(5):385-99

29. Cohen F.E. and Prusiner S.B. Pathologic conformations of prion proteins // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67. - P. 793-819.

30. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P. 9773-9778.

31. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. Mutational analysis of the Het-s. prion analog of Podospora anserina. A short N-terminal peptide allows prion propagation // Genetics. 1999. - V.153. - P. 1629-1640.

32. Coustou-Linares V., Maddelein M.L., Begueret J., Saupe S.J. In vivo aggregation of the HET-s prion protein of the fungus Podospora anserina. II Mol Microbiol. 2001. -V.42. —N.5. —P.1325-35

33. Cox B. S. a cytoplasmic suppressor of super-suppression in yeast // Heredity. -1965.-V.20.-P.505-521.

34. Cox B. S., Ness F., Tuite M. F. Analysis of the generation and segregation of propagons: Entities that propagate the PS7. prion in yeast // Genetics. 2003. - V.165. -P.23-33.

35. Crapeau M, Marchal C, Cullin C, Maillet L. The cellular concentration of the yeast Ure2p prion protein affects its propagation as a prion. // Mol. Biol. Cell. 2009. - V.20. -N.8. - P.2286-96.

36. Crist C.G., Nakayashiki T., Kurahashi H., Nakamura Y. PHf., a novel Sup35-prion variant propagated with non-Gln/Asn oligopeptide repeats in the absence of the chaperone proteinHspl04 // Genes. Cells. -2003. V.8. - N.7. - P.603-618.

37. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion // Cell. 1998. - V.93. - P.1241-1252.

38. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of /?S7+. prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. - V.144. - P.1375-1386.

39. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PST4. prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. - V.147. - P.507-519.

40. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S., Zadorsky S.P., Polozkov G.I., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PS7*. and [PIN ]: a two-prion system in yeast? // EMBO. J. 2000. - V.19. - P. 1942-1952.

41. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of P/A^. // Cell. 2001. - V. 106. - P. 171 -182.

42. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant iWM2-mutation which eliminates the factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. - V.137. - P.659-670.

43. Dos Reis S., Coulary-Salin B., Forge V., Lascu I., Bégueret J., Saupe S J. The HET-s prion protein of the filamentous fungus Podospora anserina aggregates in vitro into amyloid-like fibrils // J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - N.8. - P.5703-5706.

44. Drillien R., Aigle M., Lacroute F. Yeast mutants pleiotropically impaired in the regulation of the two glutamate dehydrogenases // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1973. V.53 - N.2. - P.367-372.

45. Du Z., Park K.W., Yu H., Fan Q., Li L. Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae II Nat Genet. — 2008. -V.40. N.4. — P.460-5.

46. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B. ., Tuite M.F. Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PS/*. of Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - P.240-244.

47. Edskes H.K. Protein-based inheritance in Saccharomyces cerevisiae: \URE3~\ as a prion form of the nitrogen regulatory protein Ure2 // Res. Microbiol. 2001. - V.152. -N.7. - P.605-612.

48. Edskes H.K. and Wickner R.B. Conservation of a portion of the S. cerevisiae Ure2p prion domain that interacts with the full-length protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. V.99. - Suppl. 4. - P.16384-16391.

49. Edskes H.K., Gray V.T., Wickner R.B. The URE3. prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999a. - V.96. - P.1498-1503.

50. Edskes H.K., Hanover J.A., Wickner R.B. Mkslp is a regulator of nitrogen catabolism upstream of Ure2p in Saccharomyces cerevisiaen II Genetics. 1999b. -V.153. - N.2. - P.585-594.

51. Fernandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gaumer S., Komar A.A., Cullin C. Characterization of the interaction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast // Biochem. J. 1999. - V.338. - P.403-407.

52. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination of the yeast PSf. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation // Mol. Microbiol. 2001. - V.40. - N.6. - P.1357-1369.

53. Gagny B., Silar P. Identification of the genes encoding the cytosolic translation release factors from Podospora anserina and analysis of their role during the life cycle. // Genetics. 1998. - V. 149. -N.4. - P. 1763-75

54. Glover J.R. and Lindquist S. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins // Cell. 1998. - V.94. - N.l. - P.73-82.

55. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PS7., a heritable prion -like factor of S.cerevisiae II Cell. 1997. - V.89. - P.811-819.

56. Grishin A.V., Rothenberg M., Downs M.A., Blumer KJ. Mot3, a Zn finger transcription factor that modulates gene expression and attenuates mating pheromone signaling in Saccharomyces cerevisiae. II Genetics. 1998. - V.149. - N.2. - P.879-92.

57. Grimminger V., Richter K., Imhof A., Buchner J., Walter S. The prion curing agent guanidinium chloride specifically inhibits ATP hydrolysis by Hspl04 // J. Biol. Chem. -2004. V.279. - N.9. - P.7378-7383.

58. Hara H., Nakayashiki T., Crist C.G., Nakamura Y. Prion domain interaction responsible for species discrimination in yeast PS/1". transmission. // Genes. Cells. -2003. V.8. - N. 12. - P.925-39

59. Ishiwata M, Kurahashi H, Nakamura Y. A G-protein gamma subunit mimic is a general antagonist of prion propagation in Saccharomyces cerevisiae. II Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -2009. V.106. -N.3. -P.791-6.

60. Jung G. and Masison D.S. Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions // Curr. Microbiol. 2001. -V.43. - N.l. - P.7-10.

61. Kadnar M.L., Articov G., Derkatch I.L. Distinct type of transmission barrier revealed by study of multiple prion determinants of Rnql. // PLoS Genet. 2010. - V.6. -N.l. - P.1-18.

62. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M., Wuthrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P. 6618-6622.

63. Kong C., Ito K., Walsh M.A., Wada M., Liu Y., Kumar S., Barford D., Nakamura Y., Song H. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. II Mol. Cell. 2004. - V.14. - N.2. P.233-45.

64. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast PST. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 // J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P. 49636-49643.

65. Kurahashi H., Ishiwata M., Shibata S., Nakamura Y. A regulatory role of the Rnql nonprion domain for prion propagation and polyglutamine aggregates. // Mol. Cell. Biol. 2008. - V.28. - N. 10. - P.3313-23

66. Kurahashi H., Shibata S., Ishiwata M., Nakamura Y. Selfish prion of Rnql mutant in yeast. // Genes Cells. 2009. - V.14. - P.659-668

67. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1988. - V.66. - N.l. - P.45-54.

68. Kushnirov V.V. and Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions // Cell. 1998. - V.94. - N.l. - P.13-16.

69. Kushnirov V.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Frolova N.S., Ter-Avanesyan M.D. Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica IIEMBO. J. -2000. V.19. - N.3. - P.324-331.

70. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Didichenko S.A., Smirnov V.N., Chernoff Y.O., Derkach I.L., Novikova O.N., Inge-Vechtomov S.G., Neistat M.A., Tolstorukov

71. I. Divergence and conservation of SUP2 (SUP35) gene of yeast Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1990. - V.6. - N.6. - P.461-472.

72. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast // J. Bacteriol. 1971. - V. 106. - N.2. - P.519-522.

73. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V.227. - N.5259. - P.680-685.

74. Li L. and Lindquist S. Creating a protein-based element of inheritance // Science. -2000. V.287. - N.5453. - P.661-664.

75. Liebman S.W. and Sherman F. Extrachromosomal psi+ determinant suppresses nonsense mutations in yeast //J. Bacteriol. 1979. - V.139. - N.3. - P.1068-1071.

76. Lindquist S. and Kim G. Heat-shock protein 104 expression is sufficient for thermotolerance in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - N.l 1. - P.5301-5306.

77. Maddelein M.L., Dos Reis S., Duvezin-Caubet S., Coulary-Salin B., Saupe S.J. Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002. V.99. - N. 11. P.7402-7.

78. Malato L., Dos Reis S., Benkemoun L., Sabate R., Saupe S.J. Role of Hspl04 in the propagation and inheritance of the Het-s. prion. // Mol. Biol. Cell. 2007. - V.18. -N.12. - P.4803-12.

79. Marion R.M., Regev A., Segal E., Barash Y., Roller D., Friedman N., O'Shea E.K. Sfpl is a stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -2004. V.101. N.40. - P. 14315-22

80. Masison D.C. and Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells // Science. 1995. - V.270. -N.5233. - P.93-95.

81. Masison D.C, Maddelein M.L., Wickner R.B. The prion model for URE3. of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - N.23. - P.12503-12508.

82. Michelitsch M.D. and Weissman J.S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - N.22. - P.l 1910-11915.94.

83. Mitchell A.P, Magasanik B Three regulatory systems control production of glutamine synthetase in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. — 1984. V.4. -N.12.-P.2767-2773.

84. Moriyama H, Edskes H.K., Wickner R.B. URE3~\ prion propagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone Ydjlp // Mol. Cell. Biol. 2000. - V.20. - N.23. - P.8916-8922.

85. Nakayashiki T, Ebihara K., Bannai H., Nakamura Y. Yeast PST*. "prions" that are crosstransmissible and susceptible beyond a species barrier through a quasi-prion state // Mol. Cell. -2001. V.7. - N.6. - P.l 121-1130.

86. Nemecek J, Nakayashiki T., Wickner R.B. A prion of yeast metacaspase homolog (Mcalp) detected by a genetic screen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V.106. -N.6. — P.1892-6.

87. Parsell DA, Kowal AS, Singer MA, Lindquist S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04 // Nature. 1994. - V.372. - N.6505. - P.475-478.

88. Patel B.K. and Liebman S.W "Prion-proof' for PIN'.: infection with in vitro-made amyloid aggregates of Rnqlp-(132-405) induces [PIN*] II J. Mol. Biol. 2007. - V.365. - N.3. - P.773-782.

89. Patel B.K., Gavin-Smyth J., Liebman S.W. The yeast global transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion. // Nat Cell Biol. 2009. - V.ll. -N.3. -P.344-9

90. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. - V.273. - N.5275. - P.622-626.

91. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. 1997. - V.277. -P.381-383.

92. Pfister T. and Wimmer E. Characterization of the nucleoside triphosphatase activity of poliovirus protein 2C reveals a mechanism by which guanidine inhibits poliovirus replication // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - N.l 1. - P.6992-7001.

93. Roberts B.T., Moriyama H., Wickner R.B. URE3. prion propagation is abolished by a mutation of the primary cytosolic Hsp70 of budding yeast // Yeast. 2004. - Y.21. -N.2. - P.107-117.

94. Rose M.D., Winston F., Hieter P. Methods in yeast genetics. NY: CSHL Press. -1990.- 198 p.

95. Salas-Marco J., Bedwell D.M. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. // Mol. Cell. Biol. 2004. - V.24. -N.17. - P.7769-78.

96. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. - 2001. - 2344p.

97. Sanchez Y. and Lindquist S.L. HSP104 required for induced thermotolerance // Science. 1990. - V.248. - N.4959. - P.l 112-1115.

98. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier // Cell. 2000. - V.100. - N.2. - P.277-288.

99. Sherman, F., Fink, G.R., Hick J.B. Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. - 1986. - 200p.

100. Sikorski R.S. and Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. -1989. V.122. - N.l. - P.19-27.

101. Speransky V.V., Taylor K.L., Edskes H.K., Wickner R.B., Steven A.C. Prion filament networks in URE3. cells of Saccharomyces cerevisiae II J. Cell. Biol. — 2001. -V.153. N.6. - P.1327-1336.

102. Strawn L.A., Lin C.A., Tank E.M., Osman M.M., Simpson S.A., True H.L. Mutants of the Pafl complex alter phenotypic expression of the yeast prion PSI*. II Mol. Biol. Cell. 2009. - V.20. - N.8. - P.2229-41

103. Tanaka M, Chien P, Yonekura K, Weissman JS. Mechanism of cross-species prion transmission: an infectious conformation compatible with two highly divergent yeast prion proteins. // Cell. 2005. - V.121. -N.l. -P.49-62

104. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p // Science. 1999. - V.283. -N.5406. - P.1339-1343.

105. Thual C., Komar A.A., Bousset L., Fernandez-Bellot E., Cullin C., Melki R. Structural characterization of Saccharomyces cerevisiae prion-like protein Ure2 // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - N.19. - P. 13666-13674.

106. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1981. - V.98. -N.4. - P.691-711.

107. Uptain S.M. and Lindquist S. Prions as protein-based genetic elements // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V.56. - P.703-741.

108. Wegrzyn R.D., Bapat K., Newnam G.P., Zink A.D., Chernoff Y.O. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast // Mol. Cell. Biol. 2001. - V.21. - N.14. -P.4656-4669.

109. Wickner R.B. URE3. as an altered Ure2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae II Science. 1994. - V.264. - N.5158. - P.566-569.

110. Wickner R.B., Taylor K.L., Edskes H.K., Maddelein M.L. Prions: Portable prion domains // Curr. Biol. -2000. V.10. - N.9. - P.335-337.

111. Wickner R.B., Edskes H.K., Ross E.D., Pierce M.M., Baxa U., Brachmann A., Shewmaker F. Prion genetics: new rules for a new kind of gene // Annu. Rev. Genet. -2004.-V.38.-P.681-707.

112. Wickner R.B., Edskes H.K., Shewmaker F. How to find a prion: URE3., [PS/] and [beta] //Methods. -2006. V.39. - N.l. - P.3-8.

113. Wu Y.X., Greene L.E., Masison D.C, Eisenberg E. Curing of yeast PST4. prion by guanidine inactivation of Hspl04 does not require cell division // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V.102. - N.36. - P. 12789-12794.

114. Xu Z, Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae regulates G2/M transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage response. // Genetics. -1998. V.150. -N.4. — P.1419-28

115. Young C.S.H. and Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. I. A nuclear gene controlling the inheritance of the extrachromosomal elements // Heredity. 1971. - V.26. - P.413^122.

116. Zhang Z.R., Perrett S. Novel glutaredoxin activity of the yeast prion protein Ure2 reveals a native-like dimer within fibrils. // J. Biol. Chem. 2009. - V.284. - N.21. -P.14058-67.