Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора [psi+]

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора [psi+]"

Санот-Петербургский государственный университет

I !)

/

на правах рукописи

ДЕРКАЧ Ирина Львовна

ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ ГЕНА 5УР35 ДРОЖЖЕЙ вассЬаготуо» сегеуЫае ИНДУЦИРУЕТ ВОЗНИКНОВЕНИЕ ЭКСТРАХРОМОСОМНОГО ФАКТОРА (р$|*|

03.00.15 "Генеткя"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Т/Н

Санкт-Петербург- 1995

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Чернов Юрий Олегович заведующий кафедрой генетики и селекции СПбГУ, чл.- корр.РАН, доктор биологических наук, профессор Ицге-Вечтомов Сергей Георгиевич

Консультант:

Официальные оппоненты:

чл.- корр.РАН, доктор биологических наук, профессор Б.В.Громов доктор биологических наук Т.Р.Сойдла

Ведущая организация

Санкт-Петербургский институт ядерной физики РАН им.Б.П.Константинова

Защита состоится «¿«с:

и,<у/СЛ 1995г. в /4

часов на

заседании Диссертационного Совета Д.063.57.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в. Санкт-Петербургском государственном университете по адресу г.Санкт-Петербург, Университетская наб. д.Т/9, СПОГУ, кафедра генетики и селекции, ауд.1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотетке СПОГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета

г

кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРЛКГЕ РИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Неменделевский фактор [psi*] дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Сох, 1965) передается через цитоплазму. Несмотря на интенсивные исследования, его не удалось связать ни с какими молекулами ДНК или РНК. Фактор [psi*] снижает точность трансляции, вызывая подавление проявления нонсенс-мутаций - нонсенс-супрессию (см. овэор Сох et al, 1988). К такому же эффекту приводят мутации в гене SUP35 (Инге-Вечтомов, 1964 и 1965; Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970)-, а также, как было показано нами, амплификация гена SUP35 дикого типа (Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). Белок Sup35 является консервативным эукариотическим фактором трансляции, гипотетически функционирующим на этапе терминации.

В данной работе впервые было показано, что увеличение дозы гена SUP3S индуцирует появление [psi*] фактора (Chernoff et al, 1993) . Эти результаты были использованы Р.. Викнером (Wickner, 1994) в его модели, постулирующей, что [psi*] является прионоподобной формой белка Sup35. Прионы - белки необычной конформации, вызывающие нейродегенеративные заболевания у животных и человека, например, скрейпи и спорадическую форму болезни Крейцфельдта-Якоба (см. обзоры Prusiner, 1994 и 1995). Особенностью прионовых заболеваний является то, что в качестве инфекционного агента выступает белок РгР в прионовой конформации (РгР=с), который' при попадании в клетку изменяет конформацию клеточного белка РгР, превращая его в прион. Таким образом, передача заболеванич осуществляется по новому механизму, не требующему участия ДНК (или РНК-)-содержащего инфекционного агента. Вместе с тем, мутации в гене, кодирующем белок РгР, могут вызывать заболевания идентичные прионовым (как, например, в случае семейной формы болезни Крейцфельдта-Якоба).

Дальнейшие эксперименты, представленные в данной работе, подтверждают прионовую модель [psi*] и позволяют локализовать участок белка Sup35 необходимый для индукции [psi*]. Наши результаты демонстрируют перспективность использования модельного генетического объекта - дрожжей Saccharomyces cerevisiae - для изучения закономерностей появления и поддержания прионов, для понимания механизмов эпигеномного наследования и роли наследуемых модификаций белков в регуляции белкового синтеза.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось изучение наследственных изменений, вызванных увеличением дозы гена SUP35. В ходе экспериментов с многокопийными плазмидами, содержащими ген SUP35, нами было обнаружено появление [psi*] факторов. Дальнейшими задачами работы'было :

- сравнить специфичность супрессии, вызванной многокопийньм геном SUP35, со специфичностью супрессии, вызванной (psi*) фактором и мутациями в генах SUP35 и SUP45.

- выяснить, чем вызвана индукция [psi*] - увеличением копийно-сти гена SUP35 или гиперпродукцией соответствующего белка;

- охарактеризовать [psi*] факторы, возникающие при гиперпродукции Sup35;

- выявить участок Sup35 ответственный за индукцию [psi*] »

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые обнаружено, что сверхпродукция всего Оелка Sup35 или его N-концевого фрагмента приводит к возникновению цитоплаэматического прионоподобного фактора [psi*] . Показано, что при гиперпродукции Sup35 в одном и том же штамме дрожжей могут быть индуцированы [psi*] факторы различного проявления.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные данные о возникновении прионоподобного фактора [psi*] при сверхэкспрессии гена SUP35 позволяют использовать модельный генетический объект Saccharomyces cerevisiae для изучения прионов - возбудителей болезней животных и человека. Созданная в ходе работы коллекция штаммов дрожжей исполь-зовгна в молекулярно-генетических исследованиях и в педагогическом процессе на кафедре генетики и селекции СПОГУ.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ. Результаты работы были представлены на XVII Международном Генетическом Конгрессе (Бирмингем, Великобритания, 1993), на XV Международной Конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага, Нидерланды, 1990), на конференции "Синтез рибосом и функция ядрышка" (Колд Спринг Харбор, США, 1994), на семинарах лаборатории физиологической генетики (БиНИИ СПОГУ) кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории молекулярной биологии Университета Иллинойс (Чикаго, США).

ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 2 тезисных сообщения,

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.Диссертационная работа объемом S

страниц состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", содержит /& рисунков, 33 таблиц и список литературы, содержащий <?бГу* наименований работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Основ: !ые штаммы дрожкей использованные в работе: ЗЭГ-Д373 (а pheAlO(UAA) ade2-144,717 his7-l(UAA) lysQ-A21(UAA) trpl-289(UAG) 1еа2-3, Ii2 ura3-52), 74-Д694 (a adel-14(UGA) his3-A200 leu2-3,112 , ПГпУД? Ггр1-?яд<тад) ), ДУ8-3^2-Л2е-гв-П3982 (g dUelr?14 (UUl) his7-l-

(UAA) Iys2-87(UGA) thr4-B15(UGA) leu2-l игаЗ-Д; далее - Л28), 31В-Д543 (a adel-14(UGA) his7-l(UAA) ura3-52 leu2-3,112 trpl-?89(UAG)).

Основные плазмиды использованные в работе любезно предоставлены М.В.Телковым (плазмиды с SUP35 на основе вектора Yepl3 (Телков и др., 1986)), В.В.Кушнировым (плазмиды с SUP35 и его фрагментами на основе pEMBL-yex4 (Кушниров и др.,1990) и плазмида URA3-GAL::SUP35; и С.Линквист (плазмида ER-HIS, использованная для индукции GAL1/GAL10 (GAL) промотора (Louvion et al, 1994)) или сконструированы нами в ходе работы (см.рис.5).

В работе были использованы стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984, Sherman et al, 1988). Мутантов lys2 отбирали на среде с а-аминоадапиновой кислотой (Chattoo et al, 1979). Отбор Ura" клонов проводили на среде с 5-фтороротовой кислотой (Boeke et al, 1984). Для элиминации fpsi'J дрожим пассировгли на среде YPD с 5кй4 гуанидингидрохлорида. Супрессию точковых мутаций анализировали как на стандартных синтетичетских средах, так и на средах с 2% этанола в качестве источника углерода при температуре инкубации 20°С и 30 С. Для индукции GAL промотора использовали среды с 2% галактозы в качестве единственного источника углерода или с р-эстрадиолом (10, 20, 50 или ЮОнМ). В последнем случае в штамме присутствовала также вторая плазмида (ER-HIS), содержавшая гормон-связывапдий домен эстрогенового рецептора человека слитый с ДНК-связывакшим доменом GAL4 и транскрипционным активатором вирусного белка VP16 (Louvion et al, 1993). Эта двухкомпонентная система позволяет регулировать уровень индукции GAL промотора в зависимости от концентрации p-эстрадиола в среде. Трансформацию дрожжей и E.coli проводили по стандартным методикам (Ito et al, 1983 и Hanahan, 1985).

Выделение РНК и ДНК, рестрикцию, выделение фрагментов ДНК, цитирование, электрофорез в агарозных и полиакрилаыидкых гелях, сек-венирование, гибридизацию ДНК-ДНК и РНК-ДНК проводили как описано в руководстве СэмОрука с соавторами (Sambrook et'al, 1989; . При проведении направленного мутагенеза в гене SUP35 руководствовались протоколом фирмы BioRad, при проведении цепной реакции полимеризации - протоколом фирмы Perkin Elmer, при работе с белками - протоколом фирмы Amersham (поликлональные антитела к Sup35 получены С.А. Дидиченкр (Didichenko et al, 1991), предоставлены В.В. Кушнировым).

РЕЗУЛЬТАТЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУПРЕССОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ МНОГО-КОПИЙНОГО ГЕНА SUP35, [pai*] И МУТАЦИЙ sup3S И aup4S. Было получено около 2000 мутаций lys2 индуцированных би-гидроксиламинопурином в штамме 31В-Д543. 82 независимых мутации lys2, локализованные в

BamKI - Xhol фрагменте в центральной части гена LYS2 (рис.1), были клонированы и секвенированы. Результаты анализа супрессии этих мутаций представлены в таблице 1. Мы показали, что наблюдалась супрессия только нонсенс-мутаций, причем, одни и те же мутации супрес-сировались [psi*], шюгокопийным SUP35 и мутациями sup35 и sup45.

LYS2 (4176 п.н.)

Рис.1. Карта гена LYS2. Указаны направление транскрипции и трансляции стрелка).сайты узнавания рестрикцкон.'.ьшк эндонуклеазаыи, размеры гена и фрагмента в парах нуклеотидов, позиции сайтов BamHI и Xhol и позиции нутаций в BamHI-Xhol районе: нижний ряд - супрессируеиые, верхний рял -носупрессируеыые.

ИНДУКЦИЯ fpal*j ФАКТОРА ЬИОГОКРПИЙНЩ геном 8QP3S. Трансформации дрожжей эписомными плазыидами, содержащими ген SUP35 дикого типа, приводит к омнипотентной супрессии, обусловленной увеличением дозы SUP35, как описано нами ранее (Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). В большинстве клонов, потерявших плазмиду с геном SUP35, супрессия исчезала. Тем не менее, некоторые клоны сохраняли супрессии и в отсутствие плазмиды. В штамме ЭЭГ-Д373, у которого впервые было обнаружено это явление, супрессия таких исключительных клонов проявлялась иначе, чем супрессия под действием многокопийного гена SUP35, вследствие чего эти клены были первоначально обозначены Psu* (Phenotypic Suppression) (Тиходеев и др., 1990). Так, супрессия у Psu* клонов значительно усиливалась на несбраживаемых источниках углерода (например, этаноле) . Кроме того, если охр-мутация his7~l супрессировалась многокопийным SUP35 на 3 - 5 день, а охр-мутация Iys9-A21 - на 7 - 9 день, то у клонов Psu* соотношение било обратным. Фенотип Psu* был, как правило, стабилен при митотических делениях на среде YPD, но элиминировался после 3 пассажей на среде с 5мМ гуанидингидрохлорида. Это указывает на то, что Psu* фенотип обусловлел возникновением эксрахромосомного фактора аналогичного tpsi*] фактору,' описанному ранее (для обзора см. Сох et al, 19С8) .

Psu* (обозначаемые далее [psi*] ) клоны не Сыли результатом перестроек плазмиды или амплификации гена SUP35 отдельно от плазмиды, так как они не содержали дополнительных экстрахромосомных копий SUP35, что Вьшо подтверждено гибридизацией по Саузерну ДНК, выделенной из этих клонов, с ДНК гена SUP35.

Эффект индукции [psi*J фактора многокопийным геном SUP35 Оыл воспроизведен также в других штаммах дрожжей (JI28, 31В-Д543, 74-Д694) . Дрожжи трансформировали эписомными плазмидами, содержащими ген SUP35 и дрожжевой маркер LEU2. Трансформантов инкубировали на среде без лейцина, затем субклонировали в неселективных условиях и анализировали супрессию нонсенс-мутаций у клонов, потерявших плаз-миду. Результаты для штаммов ЗЭГ-Д373 и Л28 представлены в таблице 2. Мы не обнаружили [psi*] клонов в митотическом потомстве трансформантов JI28, содержавших контрольную гиазмиду без гена SUP35. Частота [psi*] клонов в митотическом потомстве трансформантов ЗЗГ-Д373, содержавших контрольную плазмиду, составляла приблизительно 0,5%. Этот результат согласуется с нашим наблюдением, что [psi*] клоны могут возникать в штамме ЭЭГ-Д373 и спонтанно, то есть в отсутствие плазмид. В то же время, в митотическом потомстве трансформантов плазмидами, содержащими функциональный SUP35, от 10 до 20% клонов, потеряЕших плазмиду Сели [psi*], причём, [psi*] клоны встречались в потомстве большинства независимо отобранных трансформантов. Различия между контрольной плазмидой и плазмидами с SUP35 являются достоверными (Р<0,05).

Таким образом, увеличение копийности гена SUP35 индуцирует возникновение de novo экстрахромосомного фактора [psi*] .

Ma показали также, что эффективность индукции [psi*] возрастает при ".овышении копийности гена SUP35. Плазмида PEMBL-SUP35, сконструированная на основе pEMBL-yex4, содержит дрожжевые гены 1ГОАЗ и LEU2-d. Плазмиды такой структуры обычно содержатся в количестве порядка 10 копий на клетку на среде без урацкпа, но копийность должна возрасти до 100 копий, чтобы обеспечить рост на среде без лейцина (Parent et al, 1985). Дрожжи трансформировали плазмидой pEMBL-SUP35. Колонии трансформантов одинакового размера отбирали на среде без урацила или без лейцина, субклонировали в неселективных для плазмидных маркеров условиях и анализировали проявление нонсенс-мутаций в клонах, потерявших плазмиду. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. На среде без лейцина, то есть при более высокой копийности плазмида, [psi*] возникает достоверно чаще, чем на среде без урацила. Более низкая частота индукции [psi*] на среде без урацила по сравнению с приведенной в таблице 2 связана с различием в проведении экспериментов: при работе с плазмидой pEMBL-SUP35

Таблица 1.

Специфичность супрессии мутаций lys2 многокопийныы SHP35, фактором [psi*] и рецессивными супрессорами sup35 и sup45.

Положе- Количество Супрессируемость

Мутация ние в независимо ыногоко-

LYS2 отобранных [psi*] пийным sup35 sup45

мутантов SUP35

TTA(Leu)-»TAA 3119 1 + + + +

TQG (Trp) -»TAG 3221 3 + + + +

3164 1 + + + +

TGG (Trp) ->TGA 3034 5 + + + +

3222 4 + + + +

3165 49 + + + +

CGA (Arg ) -+TGA 2865 2 + + + +

GGA(Gly) -»AGA (Arg) 2938 8 - - - -

GGA(Gly) -»GAA(Glu) 2939 3 - - - -

GGT (Gly) -»GAT (Asp) 3206 4 - - - -

GGC (Gly)-»GAC (Asp) 2948 2 - - - -

GCG (Ala) —»GTG (Val ) 3209 1 - - - -

Таблица 2.

Индукция [psi*) ыногокопийным геном SUP35.

Штамм ..... Плазмида Проверено трансформантов Отобрано Leu" клонов

всего [psi*] (%)

ЗЭГ-Д373 [LEU2 SUP35] 35 601 63 (10,5%)

[LEXJ2] 29 414 2 (0,5%)*

Л28 [LEU2 SUP35] 16 239 51 (21,4%)

(LEU2) 15 223 0

* среди 114 проанализированных Leu* субклснов не обнаружено ни одного [psi*]

Таблица 3

Влияние копийности SUP35 на возникновение [psi*] в штамме ЗЭГ-Д373.

Плазклда

Среда

Кспий-ность

Проверено трансфор-ыантое

Отобрано клонов

всего (psi*) (%)

[URA3 LEU2-d SOP35)

(URA3 LEU2-d]

[URA3 LEU2-d SQP35]

[URA3 LEb2-d] _

-Ura -Ura -Leu -Leu

~ 10

~ 10

- 100

- 100

16 14 14

0

159 122 125 172

5 (3,1%) 0

39 (31,2%)

1 (0,6%)

отобранных трансформантов не инкубировали дополнительно на селективной для плазмлды среде, так как трансформанты, содержащие плазмиду pEMBL-SUP35, на среде без лейцина растут очень медленно, а сразу же переносили на неселективную среду. В отдельном опыте (данные приведены в диссертации) показано отсутствие различий в частотах индукции [psi"] плазмидой pEMBL-SUP35 на среде бэз урацила и ранее использованными плазмидами с SUP35 на среде без лейцина при одинаковых условиях эксперимента. В трансформантах центромерной плазмидой с функциональным геном SUP35 (сконструирована Ю.О. Черновым) , содержащейся в количестве 1-2 копии на клетку, [psi*] не индуцируется.

В дальнейшем для анализа индукции [psi*] в различных штаммах плазмидами, содержащими ген SUP3S и ген URA3, использовали также экспресс-тест (рис.2). Дрожжи трансформировали плазмидой с SUP35 ([SUP35 URA3]) и контрольной плазмидой ([URA3J). Трансформантов инкубировали на среде без урацила и затем - на среде с фтороротовой кислотой, вызывающей селективную гибель содержащих плазмиду Ura* клеток. Сохранившиеся клетки, потерявшие плазмиду, переносили на среду для анализа супрессии. Супрессорный эффект многокопийного SUP35 проявлялся в виде супрессии нонсенс-мутаций в трансформантах [SUP35 UFA3], а остаточная супрессия после потери плазмчды была

- (-Ura) О <FOA) О

- (-Ura) О

О

> (-Ade) Q /-Î> ( Ura) О (FOA)O T^ ("Ura) О

[URA3J

► (-Ade) О '-►(-Ade)

Обозначения:

^^ - рост ^ - отсутствие роста

(-Ura) ~ среда без урацила (селективная для плаэмиды)

(-Ade) - среда без аденина (74-Д694 содержит суг.рессируемуо мутацию adel-14) (FOA) - среда с 5'- фтсроротопой кислотой (ддя отбора клонов, потерявших плаэмилу) [URA3 SUP35] - плазмида, содержащая геи URA3 и ген SUP35 дикого типа [URA3] - плазмида, содержащая ген URA3 (контроль)

Рис.2 Схема экспресс-теста для анализа индукции [psi+] плазмидами, содержащими SUP35 и URA3 (на примере штамма 74-Д694).

обусловлена индуцируемым [psi*] и элиминировалась после пассирования на среде с 5ыМ гуанидингидрохлорида.

Амплификация функционального фрагмента гена SUP45 (плазмида сконструирована М.И.Трофимовой) и гиперэкспрессия кДНК гена SUP46 (плазмида предоставлена Г.Ныэнэмом) к индукции [psi*] не приводили.

ХАРАКТЕРИСТИКА. [pai*] ФАКТОРОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ПРИ ПШЕРЭКС-ПРЕССИИ SUP3I. Нами была проведена подробная характеристика [psi*] клонов, индуцированных при гиперэкспрессии SUP35 в различных штаммах дрожжей (33г-д373, 31В-Д543, Л28, 74-Д694). Во всех штаммах индуцируемые [psi*] клоны имели сходные фенотипические проявления с [psi*] клонами, которые изредка возникают в этих штаммах спонтанно.

Для штамма ЗЭГ-Д373 было показано, что [psi*] фактор, индуцированный при увеличении дозы SUP35, способен повышать супрессорный эффект SUP16, тем самым воспроизводя фенотип, на основании которого [psi*] фактор был впервые описан Коксом (Сох, 1965). В этом эксперименте исходный ЗЗГ-Д37Э и [psi*] клоны ЗЭГ-Д373, индуцированные при гиперэкспрессии SUP35, были скрещены с lpsi'1 штаммом, несущим мутацию ade2-l(UAA) и доминантный тРНк"р супрессор SUP16 (SUC5) (штамм ЗЭГ-Д373 содержит несупрессируемую мутацию в гене ADE2). В гибриде, полученном при скрещивании с исходным 33г-д373, SUP16 не был способен супрессировать ade2-l, тогда как в гибридах, полученных при скрещивании с [psi*] клонами, супрессия ade2-l наблюдалась .

В то же время, эффективность супрессии варьировала у [psi*] клонов, индуцированных в одном и том же штамме (33г-д373 или 74-Д694). В таблице 4 представлены данные по индукции [psi*] различного проявления в штамме 74-Д694 под действием UKA3-GAL::SUP35 (см.стр.13). Для детальной характеристики были отобраны 8 [psi'] клонов: 1 высокой эффективности (+++), 4 средней эффективности (++) и 3 низкой эффективности (+). Было показано, что эффективность супрессии является митотически стабильным признаком, так как сохраняется при четырех последовательных субклонированиях.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ УЧАСТКА ГЕНА SUP35 ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА ИНДУКЦИЮ [psi*]. Ген SUP35 кодирует фактор трансляции размером 685 аминокислот. Последовательность белка Sup35 может быть разделена на 2 участка - уникальный N-концевой размером 253 аминокислоты и С-концевой участок, гомологичный фактору элонгации EF-la. С-концевой домен выполняет жизненно-важную функцию и является эволюционно-консервативныы, а N-концевой домен вариабелен у различных организмов и не нужен для компенсации летдпьного эффекта нулевой аллели 1

-PeHa-£WP35-4?er-ftvdiit!avdii4if ài, IbVii Kushnirov et al, 1990).

Для локализации участка гена SUP35, отвечающего за индукцию [psi*], использовали набор плазмид на основе вектора pEMBL-yex4, содержащих различные фрагменты SUP35. Во jcex конструкциях били сохранены собственные промотор и терминатор SUP35 и наблюдалась продукция соответствующего фрагмента белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al, 1993) . Плазмидами трансформировали штаммы дрожжей ЗЗГ-ДЭ73 и 74-Д694, содержащие ген SUP35 дикого типа. Индукцию [psi*) определяли либо в качественном экспресс-тесте (см.рис.2), либо количественно (аналогично тому, как описано на стр.7) . Копийность плазмид регулировали, вьграз(ивая трансформантов на среде без урацила или без лейцина (см.стр.7).Результаты экспериментов представлены на рисунке 3.

Данные по супрессии нонсенс-мутаций при амплификации фрагментов SUP35 в основном соответствуют опубликованным ранее (Кушниров и др., 1990; Ter-Avanesyan et al, 1993), однако, в налих экспериментах ми наблюдали супрессию при амплификации фрагмента ÂBst, а эффективность супрессии при амплификации фрагмента ABstAHind была выше, чем при амплификации всего гена SUP35, что, по-видимому, обусловлено подбором супрессируемых маркеров и различиями в генотипах штаммов. Таким образом, не нарушающая рамку считывания делецля участка между двумя BstEII сайтами, элиминирующая участок между аминокислотными остатками 21 и 69 в Н-концевой части гена SUP35, не препятствует нонсенс-супрессии при амплификации фрагментов 5UP35.

Анализ индукции [psi*] при гиперпродукции фрагментов Sup35 показал, что минимальный фрагмент, достаточный для индукции [psi*] -ДВа12 - включает первые 154 аминокислоты белкового продукта. Этот фрагмент не содержит участков гомологии EF-lo и недостаточен для осуществления функции SUP35 необходимой для жизнедеятельности (Тес-Avanesyan et al, 1993). С другой стороны, гиперпродукция фрагментов SUP35, не содержащих первых 123 (A2ATG) или первых 253 (ДЗАТО аминокислот, не приводила к индукции [psi*], несмотря на наличие в них всего района гомологичного EF-la. Более того, варианты полного гена SUP35 (ABst) или его фрагмента (ABstAHind), содержащие делению участка между двумя BstEII сайтами, не нарушаемую рамку считывания, но элиминирующую участок белка между аминокислотными остатками 21 v 69, не были способны индуцировать [psi*] . Таким образом, гиперпродукция N-концеаого домена размером не более 154 аминокислот доста точна, а участок внутри этого домена мезду позициями 21 и 69 (BstEII район) необходим для эффективной индукции [psi*] .

В отсутствие BstEII района не наблюдается также и ингибирова-ние роста трансформантов при сверхамплификации плазмид с фрагментом гена SUP35 на среде без лейцинз, что указывает на возможную связь этого фенотипа с индукцией [p.si*] .

Таблица 4

Эффективность супрессии в различных [psi*] клонах штамма 74-Д694, индуцированных при увеличении дозы гена SUP35.

Наличие [psi*] Количество клонов Характеристика

цвет (YPD) рост (-Ade)

[psi'l 36 5 розовый +

28 светло-розовый + 4

3 белый + + +

[psi-] 1 (контроль) красный -

Примечания: штамм 74-Д694 содержит супрессируемую мутацию adel-14(UGA), которая проявляется в отсутствии роста на среде без адени-на (-Ade) и накоплении красного пигмента на среде YPD; подавление мутации приводит к менее интенсивному накоплению пигмента и росту на среде без аденина, причем, цвет (розовый, светло-розовый, белый) и скорость роста на среде без аденина (+ - на 4 - 5 день, ++ - на 3 день, +++ - на 1 - 2 день) отражают эффективность супрессии.

m il Bs и п в* iip к» s

^IVIrl' ! '

si;p3s

w

A1G ЛГО ЛТС

—PI—r

Л Bsl

Л Bit A Hind _Q □

л 2atg д 3atg д b»i2 л bel л hpa ASal

—I CE

D—

I

3

Индукция 1И+1 Подашкияе роста при сверхжняшь фыкяцни Супрессия

+ + ++

- - +

- ; +++

+ + +++

+ + +++

+ + ++

+ + +++

Рис.3. Локализация участка SUP35, отвечающего за индукцию [psi*] . С-концевой домен гомологичный EF-la заштрихован. Обозначения сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеаэами (в скобках - позиции сайтов) : Bs-BstEII (58, 202), H-HindIII (98, 433), B-Ball (461, 1175), Вс- Bell (713), Hp-Hpal (751, 1237), S-SalGI (1444). Обозначения в графе "Супрессия": "-"- отсутствие супрессии, "+"- слабая, "++"-средняя, "+++"- сильная супрессия (по скорости роста на среде для

Чтобы проверить необходимость участка BstEII для поддержания [psi*]» хромосомная аллель SUP35 в штамме [psi*] ЗЭГ-Д373, была замешена на аллель, содержащую делецию BstEII района. Замещение привело к потере [psi*] . Этот результат согласуется с данными Тер-Аванесяна с соавторами (Ter-Avanesyan et al, 1994), которые показали, что делеция всего N-концевого домена Sup35 или только его BstEII фрагмента в штамме 5В-Н19 является рецессивной ргш: (psi по more) мутацией, то есть блокирует поддержание [psi*] .

ИНДУКЦИЯ [pai*] ПРИ ГИЛЕРПРОДУКЦИИ ТРАНСКРИПТА SUP35. Индукция [psi*] многокопийным геном SUP3S дикого типа может быть обусловлена либо увеличением количества копий гена SUP35, либо вызванной этим его гипер^кспрессией. Чтобы выбрать верное объяснение, была использована центроыэрная (однокопийная) плазмида, URA3-GAL::SUP35, содержащая ген SUP35 под контролем индуцибельного GAL1/GAL10 (далее GAL) промотора Saccharomyces cerevisiae. Так как большинство штаммов, использованных нами ранее, оказались Gal" (то есть не росли на среде, содержащей галактозу а качестве единственного источника углерода), Gal* штамм 74-Д694 был сконструирован специально для этих экспериментов. Было использовано два способа индукции GAL промотора: 1) на среде с галактозой в качестве единствеш'ого источника углерода, 2) на среде с p-эстрадиолом (см. Материалы и методы). Схема эксперимента представлена на рисунке 4. Дрожжи трансформировали плазмидой URA3-GAL::SUP35 и контрольно?' плазмидой ([URA3]). Трансформантов переносили на среды, на которых GAL промотор был индуцирован. Рост на среде без аденина в результате подавления мутации adel-14(UGA) свидетельствовал о супрессорном эффекте при гиперпродукции транскрипта SUP35. Увеличение количества транскрипта SUP35 в условиях индукции GAL 'промотора бьшо подтверждено в экспериментах по РНК-ДНК гибридизации (см.ниже, табл-5). Затем трансформантов переносили на среду, на которой GAL промотор был репрессирован. Остаточный рост на среде без аденина в условиях репрессии промотора свидетельствовал об инлукции [psi*] и элггчинирозался после инкубации на среде с 5мМ гуанидингидрохлорида. В контрольных экспериментах с исходным вектором, не содержащим SUP35, а также с плаЭ'педой URA3-GAL::SUP35, постоянно находившейся а условиях репрессии GAL промотора, индукции [psi*] не наблюдали.

ГИПЕРПРОДУКЦИЯ БЕЛКА Sup35 НЕОБХОДИМА ДЛЯ ИНДУКЦИИ [paí'1 ■ Индукция [psi*] при гиперпродукции транскрипта SUP35 может быть обусловлена либо увеличением количества копий SUP3S мРНК, либо гиперпродукцией белка Sup35 в результате трансляции этих ml'HK. Для

выясн<>1-':ы гр:ыпни индукции [рзг* 1 в ?0 кодоне гена STÏP35 бьшэ по-

<-Ur«0 О (-Ade) О

F

РЕПРЕССИЯ

GAL ->(-L'ra) ©

'(-Ade) O (-Ura) Q

►(-Adc) O

ИНДУКЦИЯ GAL

► (-Ura) ©

►(-Adc) © -(-Ura) (%

►(-Ade) O

РЕПРЕССИЯ GAL

—► (-Ade) Çj

(-Ade) O

Рис.4. Схема анализа индукции fpsl'j при гиперпродукции транскрипта SUP35. Обозначения см.рис.2.

лучена мутация sup35-f20 сдвига (+1) рамки считывания, приводящая к изменению в последовательности гена SUP35:

ATG TCG GAT ТСА ААС CAA GGC ААС ААГ ÇAG CAA AAÇ TAC CAG CAA Met Sa г Asp Ser Asn Gin Gly Asn Asn Gin Sin Asn Tyr Gln Gln TAC AGC CAS AACiGGT AAC ... Tyr Ser Gln Asn Gly Asn ...

ATG TCG GAT TÇA AAÇ ÇAA GGC AAÇ AAT CAG ÇAA AAÇ TAC CAG CAA Mot Ser Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln TAC AGC CAG AAC GGC* TAA С ... Tyr Ser Gln Asn Gly

Длч получения мутации sup35-£20, Sacl-Xbal фрагмент гена SUP35 из плазмида URA3-GAL::SUP35 был клонирован в фагмиде pID9 (рис.5). Сайт-специфический мутагенез проводили по U-ДНК методу (Kunkel, 1985). Мутантная фагмида pIDIO была идентифицирована по исчезновению сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазой BstEII. сиквенс мутакткого фрагмента подтвердил наличие вставки цитидина в заданной позиции. Затем мутантный Sacl-Xbal фрагмент SUP35 был вырезан из фагмиды pIDIO и вставлен в плазмиду URA3-GAI.: :SUP35 вместо соот-вегсгвуюиего фрагмента дикого типа (плазмида pID12). Результаты эксперимента (табл.5) свидетельствуют, что гиперэкспрессия мутантной

количества белка Sup35 и к индукции (psi'j (так же как и к супрессии нонсенс-мутаций).

«JUÎUM1 |IR.U r.ALnSL'P»)

Y м

5«l

*irMualr>DI2|

4komi|PIOU(

окшичхннл

BBBmSlTM

£ ."PW-

111 W С

(♦l)B

Рис.5. Схема направленного мутагенеза в гене SUP35.

Гиперпродукция мутантной мРНК SUP35 в условиях индукции GAL промотора была подтверждена в экспериментах по РНК-ДНК гибридизации. Сравнивая увеличение количества мутантной МРНК sup35-f20 и мРНК SUP35 дикого типа, мы обнаружили, -íto мутантной мРНК при

одних и тех же условиях индукции было меньше, чем мРНК дикого типа (табл.6). Причиной этого, по-видимому является сниженная стабильность мРНК sup35-f20, в которой в результате мутации сдвига считывания возникает нонсенс-кодон (Leeds et al, 1991) . Однако, регулируя уровень индукции GAL промотора (см. Материалы и методы), мы показали, что увеличения количества мРНК дикого типа в б раз было достаточно для индукции [psi*] , а увеличение количества мутантной мрНК в 19 раз к индукции [psi*] не приводило. Таким образом, именно увеличение количества белка Sup35 необходимо для появления [psi*] фактора, который в дальнейшем сохраняется и в отсутствие гиперпро-дукци'.! j;up35.

Таблица 5

Необходимость гиперпродукции белка Sup35 для индукции [psi*]

Исслелуемл"! Плазмида

показатель [URA31 [ШДЗ GAL: :sup35-f20] [ШАЗ GÄL: :SUP35]

Индукция [psi*] - - +

Шперпродпшия - + • +

SUP35 МРНК i i

Пшерпродукцня - - +

Sup35 белка Ы - '%4г.т

Примечание: схема, использовнная для проверки индукции [psi*], аналогична приведенной на рисунке 4.

Таблица 6

Увеличение количества мРНК sup35-f20 и SUP35 дикого типа в условиях индукции GAL промотора.

Номер опыта Способ 'индукции GAL промотора Увеличение количества мРНК

cup35-f20 SUP35 дикого типа

1 галактоза - в 2 раза -в 6 раза

2 ß-эстрадаол 10 нМ - в 10 раз - в 18 раз

3 p-эсградиол 20нМ - в 19 раз « Е 76 раз

4 р-эстрая::ол 50нМ - в 13 раз - в 22 раз

5 Р-эстрадиол ЮОнМ - в 14 раз - в 15 раз

Примечание : концентрации р-эстрадкола 50 и ЮОнМ ингибировали рост дрожжей в жидких средах; неспеци^ический токсический эффект высоких концентраций p-эстрадиола и снижение эффективности индукции GAL промотора при концентрациях p-эстрадиола выше оптииальной описаны в литературе (Louvion et al, 1993).

обсуждение

Омиипотентную супрессию при увеличении дгзы гена SUP35 дикого типа мы обнаружили в ходе выполнения дипломной работы (Деркач, 1988; Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). Показанное в ходе

ДаННОЙ рябптц г-уптр-пччч ггапи^шчА^ч , i 1||.|"|Дптгппччн|;гп гяна

SUP35 со специфичностью супрессии уже изученных омнипотентных суп-рессоров [psi*] v мутантов sup35 и sup45 позволяет предположить сходство механизмов супрессии и взаимсдействие [psi*], Sup35 и Sup45 в процессе контроля точности трансляции.

Мы показали также, что увеличение копийности гена SUP35 индуцирует возникновение de novo экстрахромосомного фактора [psi*] . Эффект индукции [psi*], по-видимому, геноспсцифичен: при увеличении дозы функционального фрагмента гена SUP45 или кДНК копии гена SUP4 б, мутации в которых приводили к омнипотентной супрессии, индукции [psi*] не наОлюдали. Это позволяет предположить физическую взаимосвязь SUP35 и [psi*] . В то же время, [psi*] не является результатом экстрахромосомной амплификации SUP35. Принимая во внимание то, чго различным исследователям не удалось связать [psi*] ни с одной из известных молекул ДНК или РНК, а также то, что [psi*] передается при цигодукции (см.обзор Сох et al, 1988), можно говорить о сходстве [psi*] с прионами млекопитающих (см.обзор Prusiner et al, 1991). Инфекционным агентом при прионовых заболеваниях является прионовый белок (РгР), кодируемый клеточным геном. В пораженных клетках РгР представлен в необычной протеазо-устойчивой конформации PrPs<!. ПрионоЕая модель постулирует, что при попадании в нормальную клетку РгР:" изменяет конформацию нормального белка РгР, превращая его в РгР". Таким образом, изменение конформации белка воспроизводится без каких-либо изменений s нуклеотидной последовательности гена РгР. существенно, что гиперпродукция нормального Селка РгР индуцирует возникновение прионовых заболеваний (Westawav et. al, 1994): очевидно, при увеличении количества белка увеличивается вероятность конформационных изменений, приводящих к появлению РгР5". Этот оффект аналогичен индукции [psi*] при гиперпродукции Sup35. На основании сопоставления' работы Веставей и соавторов (Westaway et al, 1994) с нашими данными об индукции ¡psi*] многокопийным SUP35 (Chernoff et al, 1993) Р.Викнер (Wickner, 1994) предположил, что [psi*] фактор является конформационным вариантом белка Sup35, аналогичным прионам млекоьитаад.«. Тот факт, что именно гиперпрод/кция белкового продукта Sup35 (а не само по себе увеличение копийности гена или количества транскрипта) приводит к индукции [psi*], д шлет прионовую модель [psi*] феномена еще более убедительной. Возможность индукции [psi*] клонов различного проявления в одном и том же штамме дрожжей, а также показанное О.H.Тиходеевым сохранение различий в проявлении [psi*] факторов при перенесении их методом цито-дукции из одного дрожжевого штамма в другой (Тиходеев, 1990), подчеркивает сходство [psi*] с прионами млекопитающих. Длл прионовь» заОо/.евдшй, таких как спорадическая и наследуемая формы болезни

Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Герштонна-Штросслера-Пейнкера и других, характерна вариабельность инкубационного периода, которая, по ыне.иш Прузинера (Prusiner, 1995), является следствием существования различных прионовых конфорыаций белка РгР, вызывающих одно и то же заболевание. Аналогично, ípsi*] различного проявления, возможно, являются различными прионог.одобными конформациями Sup35.

Мы проанализировали инду::цию [psi*] фактора при увеличении дозы фрагментов гена SUP35 и показали, что сверхпродукиия N-кониевого участка размером в 154 аминокислоты достаточна, а сверхпродукция участка между аминокислотами 21 и ь9 необходима для индукции [psi*] фактора. Эти результаты согласуются также с данными лабораторий Кокса (Doel et al, 1994) и Тер-Аванесяна (Ter-Avanesyan et al, 1994), показавших, что точковая мутация и делеции в этой части гена приводят к потерям [psi*]. Омнипотентная супрессия, наблюдаемая при гиперпродукции Sup35 и некоторых его фрагментов, недостаточна для индукции [psi*! : выявлены фрагменты SUPJ5 (ABst и ABstAHind), которые при амплификации вызывают омнипотентную супрессию, но не индуцируют [psi'J. Причиной возникновения [psi*}, по-видимому, не является общее снижение уровня точности белкового синтеза при гиперпродукции Sup35. Мы предполагаем, что при гиперпродукции Селка, содержащего N-концевой домен Sup35, он накапливается в клетке в нормальной, а возможно и в измененной (альтернативной) конформации, что приводит к омнипотентной супрессии. Однако, для возникновения [psi*) должна произойти стаСилизация альтернативной конформации Sup35, для чего и необходам участок между амнокислртными остатками 21 и 69.

При анализе гена SUP35 был выявлен участок, кодирующий аминокислотные повторы сходные по структуре с аминокислотными повторами в N-концевой части белка PtP (Tuite, 1994; Сох, 1994). Этот участок захватывает кодоны с 56 по 97 и частично перекрывается с BstEII районом необходимым для индукции [psi*] . Как и участок повторов РгР, N-концевая часть Sup35 богата тирозином, глицином, аспараги-но.ч, глутамином и пролином, и состоит почти исключительно из Р" слоев. Существенно, что участок аналогичной структуры обнаружен и в N-конце Sup35 Pichia pinus, несмотря на отсутствие гомологии амно-кислотных последовательностей в остальной части N-концевых доменов Sup35 Saccharomyces cerevisiae и Pichia pinus. Таким образом, есть основания полагать, что этот участок яиОо необходим для стабилизации альтернативной конформации Sup35, либо сам изменяется а ходе "прионизации".и участвует в дальнейшем изменении конформации клеточных белков.

19 ВЫВОДЫ

1. Показано сходство специфичности супрессии ыногокопийного SUP35 дикого типа, [psi'l и мутаций в генах SUP35 и SUP45.

2. Обнаружено, что многокопийный геч SUP35 индуцирует появление чеменделевсксго фактора Ipsi*] .

3. Показано, что в одном и том же штамме дрожжей при гиперэкспрессии гена SUP35 могут индуцироваться [psi") факторы различного проявления.

4. Показано, что индукция [psi*] и супрессия вызваны галерпро-дукцией белка Sup35, а не увеличением копийности гена или его

транскрипта.

5. Выявлены делеционные варианты гена SUP35, которые при сверхэкслрессии супрессируют нонсенс-мутации, но не индуцируют

[рэГ].

6. Показано, что сверхпродукция N-кончевого участка Sup35 размером в 154 аминокислоты достаточна, а сверхпродукция участка между аминокислотами 21 и 69 необходима для индукции tpsi'> фактора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Inge-Vechtomov S.G., Chernoff Y.O., Derkatch I.L., Richter G., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. SUP2 (SUP35) - psi-factor interaction in Saccharomyces cerevisiae1. incompatibility and interdependency // Yeast.1990.v.6.p.121, late submissions (Abstracts of XV Conference on yeast genetics and molecular biology, Haague, Netherlands, 1990).

2. Кутниров В.В., Тер-Авзнесян М.Д., Смирнов В.Н., Чернов Ю.О., Деркач И.П., Новикова О.Н., Инге-Вечтомов С.Г., Нейстат М. А,, Толсторуков И.И. Сравнительный анализ структуры генов SUP2 дрожжей Pichia pinus и Saccharomyces cerevisiae // Молекулярная биология, 1990.Г.24.С.1024-1036.

3.Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Didichenko S.A., Smirnov V.N., Chernoff Y.o., Derkach I.L., Novikova O.N., Inge-Vechtomov S.G., Neistat M.A., Tolstorukov I.I, Divergence and Conservation of SUP2 (SUP35) Gene of" Yeasts Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae // Yeast.1990.V.6.P.461-47?.

4.Chernoff Y.O., Inge-Vechtomov S.G., Derkach T.L., Ptyushkina M.V. ,■ Tarunina O.V., Dagkesamanskaya А.Ч., Ter-Avanesyan M.D. Dosage-Dependent Translation Suppression in Yeast Saccharomyces cerevisiae // Yeast,19?2.V.8.P.489-499.

5. Inge-Vechtomov S.G., Tarunina O.V., Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A R., Ter-Avanesyan M.D. Suppressor mutations and f-induction utilizing SUP2 gene fragments in yeast // The genetic messenger: The daily newspaper of the XVII International Congress of nenetics, Ai-gust 19, 1993 (Abstracts of XVII Congress of Genetics, Pirminghatf., Great Britain, 1993).

S. Chernoff Y.O,, Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy S!JP35 gene induces de novo appearance of psi-Iike factors in yeast Saccharomyces cerevisiae // Current Genetics.1993.V.24.P.268-270,