Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мутаций в прионизующем домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние мутаций в прионизующем домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

Бондарев Станислав Александрович

ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОИИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА вир35 НА СВОЙСТВА ПРИОНА [Р5Г] ДРОЖЖЕЙ Яасскаготусех сегеу'шае

специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 АПР 20

Санкт-Петербург 2014

005547004

005547004

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент

Галина Анатольевна Журавлева, профессор кафедры генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет.

Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН, доктор

биологических наук, профессор Михаил Давидович Тер-Аванесян, заведующий лабораторией в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва).

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник Тыну Рихович Сойдла, ведущий научный сотрудник Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. Ломоносова» (Москва).

Защита диссертации состоится " 5"™ 2014 г. в /У часов на заседании

диссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского государственного университета (http://spbu.ru/). Автореферат разослан " " г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 212.232.12,

доктор биологических наук Людмила Андреевна Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Прионы — это белки, способные существовал, в нескольких км ¡формациях, одна из которых обладает инфекционными свойствами. У млекопитающих известен только один прион РгР, который вызывает различные нейрсдегенерашвные заболевания. У низших эукариот, дрожжей Saccharamyces cerevisiae, известно более десяш различных прионов, и все они, как правило, не приводят к гибели клетки. Это позволяет использовал, дрожжевые прионы в качестве удобной модельной системы для изучения этого феномена. Детерминант [PST] — это прионная изоформа белка Sup35, который является одним из факторов терминации трансляции. Его прионизация приводит к снижению эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессии, те. считыванию преждевременных сгоп-кцдрнов как значащих. Таким образом, его присутствие в клетках дрожжей можно легко дегапировагь по их фенотипу, во многом благодаря этому свойству [PST] является одним из наиболее детально исследованных прионов дрожжей.

В клетках белки в прионной конформации обычно формируют крупные амилоидные агрегаты. Такие комплексы характеризуются высокой устойчивостью к нагреванию, действию протеиназ, обработке денатурирующими агентами и т. д. Эти свойства прионов связаны с особой конформацией белковых молекул. Несмотря на продолжительную историю исследований, вопрос о структурной организации этих агрегатов остается очень актуальным. Изучение этой проблемы осложняется невозможностью использования традиционных методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку такие белки имеют тенденцию к спонтанному образованию крупных агрегатов. При этом данные, полученные в системе in vitro, как правило, не могут быть напрямую экстраполированы на живые системы. In vivo мутационный анализ остается практически единственным подходом, позволяющим получать сведения о структурной организации белков-прионов. Представленная диссертация посвящена изучению влияния мутаций в N-домене белка Sup35 на свойства приона [ЯЛУ1]. Одной из особенностей данной работы является то, что мутации получены не случайным образом, а с помощью сайт-направленного мутагенеза, на основании положений модели суперскладчатой ß-структуры. Эта модель является общепринятой для объяснения основных принципов организации прионных агрегатов Sup35p. В ходе представленной работы удалось описать эффекты мутантных аллелей sup35KK, связаные с изменением свойств фактора [/ОТ]. In vivo две из пяти исследованных мутаций приводят к необратимому исчезновению [AST], две другие — к формированию новых, отличных друг от друга вариантов приона. Полученные данные позволили установить молекулярные механизмы, лежащие в основе обнаруженных эффектов. Удалось уточнить фрагмент белка, необходимый для поддержания структуры исследованного варианта приона. Результаты проведенных in vitro экспериментов показали, что все исследованные мутации влияют на структуру агрегатов Sup35p. Полученные данные являются актуальными, поскольку вносят существенный вклад в понимание фундаментальных механизмов, определяющих свойства и особенности структурной организации дрожжевых прионов.

Целью работы стала идентификация молекулярных механизмов, лежащих в основе влияния мутаций в N-домене Sup35p на свойства приона [AST], В ходе исследования решали следующие задачи: (1) характеристика влияния мутантных аллелей sh/jü** на свойства приона [/ОТ]; (2) изучение влияния комбинаций мутантных аллелей ¡ирЗб^ на стабильность приона [Р5Г]; (3) проверка влияния мутантных аллелей sup35KK на различные варианты приона [/ОТ]; (4) исследование

зависимости эффектов мутантных аллелей 5ир35ш от [/ТЛ^-статуса клеток; (5) характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.

Научная новизна исследования. В представленной работе описано влияние новых мутаций в N-домене белка Sup35 на свойства приона [Р£Г]. В отличие от большинства предшествующих работ, мутации были получены не случайным образом, а с помощью сайт-направленного мутагенеза и на основании теоретической модели супер-складчатой Р-структуры, которая описывает принципы стабилизации прионных агрегатов Sup35p. Исследуемые мутации затрагивают участок белка, в котором раньше не было обнаружено аминокислотных замен, приводящих к потере приона. Важно также отметить, что впервые был обнаружен эффект «усиления» фактора [Р£Г] под действием мутации sup35; ранее в литературе были описаны только аллели, приводящие к потере приона. С помощью сочетания методов классической генетики и молекулярной биологии удалось охарактеризовать молекулярные механизмы действия каждой из аллелей.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная работа является полноценным и законченным исследованием, сочетающим в себе подходы классической генетики и современной молекулярной биологии. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание фундаментальных механизмов, определяющих свойства и особенности структурной организации дрожжевых прионов. В рамках представленной работы определен фрагмент белка, необходимый для поддержания исследованного варианта приона [Р571"]. Также показаны модификации супер-складчатой Р-структуры агрегатов Sup35p под действием мутантных аллелей sup35KK. Кроме этого, описаны изменения свойств приона под действием мутаций и охарактеризованы молекулярные механизмы, лежащие в их основе. Представленная работа вносит вклад в изучение фундаментальных механизмов поддержания структуры прионов. Исследование этих принципов создает предпосылки для разработки подходов к терапии заболеваний, вызываемых накоплением аномально уложенных белков. Полученные данные также могут служить основой для создания методов направленного изменения свойств прионов, а также для создания лекарственных средств против заболеваний, вызываемых накоплением амилоидов.

Результаты работы могут быть использованы при подготовке материалов лекций по курсам «Молекулярная генетика», «Частная генетика дрожжей», «Генетический контроль трансляции» и «Прионы», преподаваемым на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, и аналогичных курсов в других высших учебных учреждениях России.

Положепия, выносимые на защиту. Исследованные мутации влияют на структуру агрегатов Sup35p, что может приводить как к потере фактора [AST], так и к изменению его свойств. Эффекты мутаций, а также молекулярные механизмы, лежащие в их основе, связаны с их положением относительно участков белка, формирующих супер-складчатую-бета структуру. Мутация в первом олигопептидном повторе затрудняет образование гомоагрегатов соответствующего белка. Белок Sup35-M2p при присоединении к прионному агрегату приводит к формированию ненаследуемых амилоидов. Мутация sup35-M4 способствует образованию более «сильного» варианта приона из-за укорочения фрагмента белка, вовлеченного в формирование супер-складчатой Р-структуры. Ослабление приона [PS7f] в клетках, несущих мутацию sup35-M5, связано с уменьшением числа пропагонов в клетке.

Апробация работы. Данные, представленные в диссертации, опубликованы в виде пяти статей, три из которых в рецензируемых высокорейтинговых журналах и изданиях, рекомендованных ВАК. Материалы работы также были представлены на международных и российских конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, 2009), конференции "Yeast: an evergreen model system" (Rome, Italy, 2010), на V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), CNRS-Jacques Monod Conference "Protein misfolding in disease: molecular processes and translational research toward therapy" (RoscofF, France, 2013), 25-26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Olsztyn, Poland, 2011; Frankfurt/Main, Germany, 2013).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, обзор литературы (223 источника). Работа содержит 7 таблиц и 43 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды. В работе использовали центромерные плазмиды pRSUl и pRSU2 (Volkov et al., 2002) и их производные, несущие мутации sup35KK (конструкции с мутацией sup35-Ml получены в данной работе, остальные предоставлены В.В. Щепачевым). В ходе экспериментов по индукции [AST] дрожжевые штаммы трансформировали плазмидой CEN-GAL-SUP35 (pVK71) (Derkatch et al., 1996) и ее производными с мутациями sup35KK. В ходе работы была получена серия плазмид на основе pET21b-SUP35NM для очистки из клеток Е. coli белков Sup35NM-(His)ó, несущих исследуемые замены. Вектор pRS315-SUP35-3HA (Afanasieva et al., 2011) использовали для выявления коагрегации белка Sup35 дикого типа и его вариантов Sup35-Mlp и Sup35-M2p. Конструкции для количественной оценки эффективности нонсенс-супрессии были получены ранее в лаборатории C.B. Пельтца (Wang et al., 2001).

Штаммы. Штаммы 10-7A-D832 и 7A-D832 дрожжей S. cerevisiae были предоставлены A.C. Борхсениусом; их генотипы представлены в таблице 1. На их основе в ходе работы получены штаммы 9-10-7A-D832 и 9-7A-D832 (Табл. 1), несущие делецию гена RNQ1. Штаммы ОТ56([Р£Г]5) и OT55([ASr]w) (изогенные производные от 74-D694 (Chernoff et al., 1995)) были предоставлены Ю.О. Черновым, а субклоны ОТ56 {[PSrT'\[PSrfss2) — A.Y. Матвеенко.

Таблица 1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использовапные в работе.

Штамм Генотип

10-7A-D832 МАТ a adel-14 his7-i 1еи2 lys2 trpl игаЗ SUP35::TRP1 [pYCM-U2-5W5J] [AS7'][/>№]

7A-D832 MAT a adel-14 kis7-l leu2 lys2 trpl игаЗ SUP35::TRP1 [pYCM-U2-Sf/P3J] [pii"] [TW]

9-10-7А-D832 MAT a adel-14 his7-l leu2 lys2 trpl игаЗ SUP35::TRP1 RNQ1 : : KanMX [pYCM-U2-SUP35\ [ra1] [pin ]

9-7A-D832 MAT a adel-14 his7-l leu2 lys2 trpl игаЗ SUP35::TRP1 RNQl::KanMX [pYCM-U2-SUP35] [psf] [/;/« ]

ОТ56 MAT a adel-14 his3A-200 leu2-3,112 trpl-289 ura3-52 [TW]" [Ш'|

ОТ55 MAT a adel-14 his3A-200 Ieu2-3,112 trpl-289 ura3-52 [fiY']'[/W]

Для сверхпродукции гетерологичных белков использовали штамм BL21 Е. coli (ßtuA2 [IonJ ompTgal [dem] AhsdS) (Sambrook et al., 1989).

Генетические методы. В работе использовали стандартные методики генетики дрожжей S. cerevisiae, а также методы работы с бактериальными культурами, описанные в литературе (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994).

При работе с дрожжевыми штаммами использовали стандартные культуральные среды (Kaiser et al., 1994). Присутствие приона [/\S/f] оценивали по способности клеток дрожжей супрессировать мутацию adel-14 (UGA), то есть расти на среде без аденина (-Ade), а также белому цвету колоний на lA YEPD (Eaglestone et al., 2000). Для получения большого количества биомассы Е. coli использовали среду 2TYa (O'Brien and Aitken, 2001).

Оценку эффективности нонсенс-супресии проводили согласно описанным ранее методикам (Guarente, 1983) с незначительными изменениями. Для оценки количества пропагонов клетки высевали на среду с 5 мМ гидрохлоридом гуанидина. Образовавшиеся колонии затем субклонировали на среде V* YEPD и подсчитывали клоны белого или розового цвета. Это число принимали за количество пропагонов (Сох et al., 2003).

Молекулярио-биологические методы. В ходе работы использовали стандартные методы работы с нуклеиновыми кислотами: ПГТР электрофорез ДНК в агарозном геле, рестрикцию, лигирование (Sambrook et al., 1989). При работе с белками применяли как стандартный протокол SDS-PAGE (Laemmli, 1970), так и специализированные методики SDS-PAGE с кипячением геля (сравнение состава белков в агрегированной и мономерной фракциях) (Kushnirov et al., 2006), SDD-AGE (оценка размера агрегатов Sup35p) (Kiyndushkin et al., 2003; Halfmann and Lindquist, 2009). Белки визуализировали либо с помощью окраски Кумасси (Sambrook et al., 1989), либо — гибридизации с антителами (Towbin et al., 1979). Для идентификации Sup35p были использованы поликлональные антитела SE4290 к eRF3 (Chabelskaya et al., 2004).

Очистку рекомбинантных белков из клеток Е. coli проводили на колонках с Ni-NTA Agarose («Invitrogen») согласно описанным методикам (Sambrook et al., 1989), с незначительными модификациями, предложенными для Sup35NMp (Serio et al., 1999).

Просвечивающая электронная микроскопия. Агрегаты Sup35NMp окрашивали 1 % уранил ацетатом согласно методике позитивного контрастирования (Brum and Steward, 2010). Анализировали препараты на электронном микроскопе JEM Jeol-2100 на базе ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Обработку изображений проводили в программе ImageJ 1.47i (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA).

Всю статистическую обработку, а также построение графиков осуществляли с помощью naKeraRv. 2.4.11 (RDevelopment Core Team, 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Характеристика влияния мутантных аллелей «ир35*А на стабильность и свойства приона [Л?/*]

В ходе работы мы исследовали эффекты мутаций ¡ир35кк: зир35-М1 (У(,)46-47КК), яир35-М2 ((Х)61-62КК), Зир35-М3(0ф10-1\КК), яир35-М4 ((К}80-81КК) и 5ир35-М5 (0089-90КК), каждая из них располагается в одном из олигопептидных повторов (ОК) 8ир35р. Ы-домсн 8ир35р необходим для поддержания фактора [/'¿Г/'] (Тег-Ауапеэуап Ы а1., 1994) и имеет супер-складчатую Д-структуру в составе прионпых агрегатов (8Ьс\утаксг с1 а1., 2006, 2011). Согласно теоретическим предположениям, замены полярных незаряженных остатков аминокислот на заряженные будут приводить к локальному расталкиванию молекул белка из-за кулоновских взаимодействий между одноименными зарядами (Юуауа (Д а1., 2004).

Для работы были выбраны два изогенных штамма [РХГ] и \p.si | (10-7А-Б832 и 7А-Б832 соответственно) (Табл. 1). Эти штаммы несут хромосомную делецию гена 5иР35 (811Р35::ТЛР1), компенсируемую его копией, локализованной на центромерной плазмиде. Мутация ас1е1-14 (110А), которая присутствует в этих штаммах, позволяет легко выявлять наличие в клетках фактора |/'Л7] благодаря его нонсенс-супрессорному фенотипу. Штаммы с нрионом могут расти на среде без аденина (фенотип Ас1е+) и имеют белый цвет колоний на среде % УЕРБ. Штаммы [ртГ], наоборот, не могут самостоятельно синтезировать аденин (фенотип А(1е"), а их клетки накапливают красный пигмент на 'Л УЕРП. Штаммы [РБГ] и [/«Г| были трансформированы плазмидами pR.SU 1, несущими мутации аир35кк. Среди полученных трансформантов способность расти па среде без аденина потеряли только клетки, несущие мутации .шр35-М2 или РЫМ2 (Рис. 1).

Сочетание

•1_еи -ига

аллелей 5иР35

1Р$П Ш/Ш

Ш/Р№2

Ш/М1

Ш/М2

Ш/МЗ

Ш/М4

Ш/М5

ш/ш

Рисунок I. Потеря прионного фенотипа в присутствии PNM2 и л'ир35-М2. Клетки высеяны в серии пятикратных разведений. Стрелка отражает градиент концентрации клеток, слева указаны сочетания аллелей ЗиРЗЗ. Мутация РИМ2 была использована в качестве контроля, поскольку она приводит к потере приона (Оое! е1 а1., 1994).

Штаммы, полученные на основе проанализированных трансформантов, которые потеряли аллель дикого типа и сохранили мутации РЫМ2, $ир35-М1 и хир35-М2, не могли расти на среде без аденина (Рис. 2). Исчезновение фактора [Р£Г] в этих случаях было необратимым, поскольку замена плазмид с мутациями на вектор с геном дикого типа не приводила к восстановлению способности расти на среде без аденина (Рис. 2). Мутации ,чир35-М4 — зир35-М5 могли поддерживать прион, при этом первая усиливала, а вторая ослабляла его фенотипическое проявление. Важно также отметить, что фактор [/"5/'] исчезал при замене яир35-М5 на (Рис. 2). Таким

образом, мы предположили, что две из исследуемых мутаций 5ир35кк приводят к потере приона, две другие — к изменению варианта [Р5Г |.

YPD

SC -Ade

suras

Рисунок 2. Мутации supS5KK приводят к потере или изменению свойств приона \PST\.

Клетки, несущие одну из аллелей, высеяны в серии пятикратных разведений. Под фотографиями представлена схема эксперимента по замене аллелей SUP35.

Штаммы \psí], несущие только мутантные аллели SUP35, имеют красный цвет на Va YEPD и не могут расти на среде без аденина. Этот факт позволил нам установить, что аллели sup35KK не имеют собственного нонсенс-супрессорного фенотипа. Кроме этого, эффекты мутаций шрЗЗ™ не связаны с изменением содержания белка Sup35 в клетке. Исследуемые мутации не оказывают влияния на функцию и стабильность белка.

В клетках, несущих фактор [PSt], Sup35p образует амилоидные агрегаты (Patino et al., 1996; Paushkin et al., 1996; Glover et al„ 1997; King et al., 1997). В штаммах, несущих мутации sup35-Ml и sup3S-M2 и потерявших нонсенс-супрессорный фенотип, отсутствуют и агрегаты Sup35p, что еще раз подтверждает потерю приона. Такое заключение мы сделали на основании результатов электрофорезов клеточных лизатов с помощью методов SDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003; Halfmann and Lindquist, 2009) и модифицированного SDS-PAGE (Kushnirov et al., 2006) (Рис. 3).

ШШшШ;

WT М2 МЗ Ш М 5 ш

Агрегаты Sup35p

Мономеры Sup35p

wr М2 из Ш № М1

Агрегаты Sup35p

t=

Мономеры Sup35p

Рисунок 3. Аллели хир35-М1 и \up35-M2 приводят к потере агрегатов 8ир35р. Наличие агрегатов 8ир35р в лизатах клеток, несущих только мутантные аллели яирЗЗ™, проверено с помощью вОО-АОЕ (А) и модифицированного ЗОв-РАвЕ (Б). * - неспецифичный сигнал.

Для проверки способности мутантных белков включаться в прионные агрегаты 8ир35р мы получили штамм [Я57 ], в котором прион поддерживался на фоне химерной конструкции БиР35, слитой с фрагментом, кодирующим гемагглютипин (51/Р35-НА) (А1"апа81еуа е1 а1., 2011). Благодаря различиям мутантных белков и белка дикого типа, слитого с гемаггшотинином, по молекулярной массе, мы могли отличать их по

электрофоретической подвижности. С помощью модифицированного 8 О й-РАСЕ с кипячением геля (КияЬтгоу й а!., 2006) мы показали, что оба мутантных белка способны коагрегировать с белком дикого типа в штамме (Рис. 4).

Агрегаты ЭирЗбр

ч* *» • Эир35-НА ■*• Эир35 ф. ■*• ЭирЗб-НА

Мономеры ЭирЗбр |

811Р35-НА + + + зир35 т М1 М2

■Эир35

Рисунок 4. Мутантные белки вир35 М1 и вир35-М2 могут входить в состав агрегатов 8ир35р. Белки из лизатов штаммов [Р5/1], содержащих 8ир35-НАр в сочетании с 8ир35-М I р или 8ир35-М2р, были разделены с помощью модифицированного 805-РД(|Ь.

Одним из возможных объяснений потери приона [Р5Г] в присутствии зир35-М1 или 5ир35-М2 могла быть неспособность соответствующих белков поддерживать прион. Для проверки этого предположения были сконструированы плазмиды, в которых эти мутации находились под контролем индуцибельного галактозного промотора. Штаммы \рх1~][РШ'\, трансформированные этим конструкциями, приобретали нонсеис-супрессориый фенотип после роста на среде с галактозой. Это подтвердило, что исследуемые мутации могут индуцировать появление приона, а потеря фактора \РЯГ \ в присутствии мутаций зир35-М1 и зир35-М2 не связана с неспособностью этих аллелей поддерживать прион.

Для более детального исследования молекулярных механизмов элиминации приона под действием хир35-М1 и яир35-М2 мы проследили динамику потери [Р5Г] во времени. В присутствии мутации $ир35-М1 не удалось обнаружить дестабилизации приона. Потерю |/'ЛУ ] в клетках 811Р35!хир35-М2 наблюдали только в ходе первых 20 клеточных делений. Затем доля клеток с прионом стабилизировалась на уровне примерно 30 %, и такое соотношение сохранялось вплоть до 50 поколения (Рис. 5А). Клоны, сохранившие прион несмотря на присутствие хир35-А42, имели одинаковую скорость роста на среде без аденина, по немного отличались по размерам агрегатов 8ир35р (Рис. 5Б).

А.

80

си •о

* 60 о

| 40 *

5 20

¿т, »•***-г-*« ■*>■ ■■«»■■■

".о о • • »

• ~М1

О М2

д СиНС1

„ 5

7 « » 7 • о » 0

0 5 10 15 20 25 30 Количество клеточных делений

ОТ 1 2 3 4 5 6 [ р5/*]ааРианты

Рисунок 5. Дестабилизация [РЗ/1] в присутствии ,чир35-М2 зависит от количества клеточных делений. (А) Зависимость доли клеток с прионом от количества клеточных делений в присутствии мутаций яир35-М1 (М1) или яир35-М2 (М2), а также 4 мМ ГГХ (использовали в качестве контроля). (Б) Результаты ЗОО-АвЕ лизатов, полученных из штаммов с которые содержали яир35-М2, в течение более чем 50 клеточных делений. В качестве маркера молекулярного веса использован тироглобулин (670 кДа).

Агрегаты Эир35

Штаммы [.Р£Г], несущие только аллели зир35-М4 или яир35-М5, отличаются от контрольного варианта по своему фенотипу (Рис. 2). С помощью специальной тест-системы на основе конструкций с Р-галактозидазой осуществили количественную оценку эффективности нонсенс-супрессии. Для каждого из штаммов измеряли активность р-галактозидазы и рассчитывали относительную эффективность нонсенс-супрессии. Мы обнаружили значимое увеличение этого параметра для кодонов ТЮА и иАА в штаммах [Р571] с яир35-М4 по сравнению с контрольным вариантом (штамм [РЛУ'"] с 811Р35) (Рис. 6). Важно отметить, что эти отличия сохранились и после замены мутации ¡ир35-М4 на аллель дикого типа. Штаммы [/'67 ] и [ртГ] также достоверно отличались друг от друга по этому параметру. В использованной системе мы не зафиксировали достоверного снижения частоты прочтения стоп-кодонов в штамме с мутацией яир35~М5 (Рис. 6).

§ ЮТ М4 М5 ЮТ \МТ->ЮТ М4-:»ЮТ

ГГ) -_---

[Р5Г 3 [рэп [РБГ]

Рисунок 6. Аллель яир35-М4 приводит к формированию нового варианта приона с более сильной нонсенс-супрессией. Приведены результаты оценки относительной эффективности прочтения стоп-кодонов в штаммах, несущих мутантные аллели ЯиР35, или их производных. Достоверные отличия от штамма [ЛХ/^ с геном дикого типа (либо до, либо после замены плазмид) отмечены «*» (*-р<0,05, **-р<0,01). \УТ -> \УТ и М4 -> — штаммы [РЯГ\, в которых соответствующую аллель ЗИР35 (WT или М4) заменили на ген дикого типа.

Эффективность нонсенс-супрессии в присутствии \P.SP | зависит от количества мономерного 8ир35р, что во многом связано с количеством пропагонов в клетке (Тапака й а1., 2006). Мы обнаружили, что только в клетках с ¡ир35-М5 количество пропагонов достоверно меньше по сравнению с штаммом [Я5/1], несущим аллель дикого типа (Рис. 7). Этот факт хорошо согласуется с ослаблением нонсенс-супрессорного фенотипа этого штамма (Рис. 2).

0) с:

о х

о о.

си т

с о

WT

МЗ

М4

М5

Рисунок 7. Аллель «ир35-М5 приводит к уменьшению числа пропагонов в клетке.

Представлено среднее значение количества пропагонов в клетке для штаммов, несущих мутантную аллель, либо их производных. На графиках отложены среднеквадратичные отклонения. Достоверные отличия от штамма [Р5/1] с аллелью дикого типа отмечены «*» (Р < 0,05).

2. Изучение влияния комбинаций мутантных аллелей яир35кк на стабильность приона |К/']

Для изучения эффектов комбинаций аллелей 5ир35кк использовали штаммы [Р£Г], несущие аллели ¡Ыр35-М3, яир35-М4 и ¡ир35-М5, так как они могли поддерживать прион. Эти штаммы трансформировали серией плазмид р 118112, несущих аллели $ир35-МI — .\up35-M5. У полученных трансформантов проверяли способность расти на среде без аденина. Для каждой из комбинаций аллелей было проверено по 16 трансформантов (Табл. 2). Мутантная аллель ¡ир35-М2 во всех случаях приводила к дестабилизации приона. Такой же эффект был обнаружен для сочетаний хир35-М4 с Зир35-М3, или 5ир35-М4 с зир35-М5, но только у половины трансформантов (Табл. 2). Все остальные комбинации мутаций зир35ш не приводили к дестабилизации приона.

Таблица 2. Дестабилизация приона [Л?/1] при сочетании хир35-М2 или яир35-М4 с другими аллелями. Указано количество трансформаитов с нестабильным Г-Р^/Ч_

Аллель, поддерживающая прион

Вносимая аллель Эир35-М3 эир35-М4 яир35-М5

шр35-М1 0 0 0

вир35-М2 16 15 16

Хир35-М3 0 0 0

яир35-М4 9 0 8

,чир35-М5 0 0 0

3. Проверка влияния мутантных аллелей sup35KK на различные варианты приона [/>&Г]

Эффекты мутаций, влияющих на стабильность [PSt], зачастую являются вариант-специфичными (Derkatch et al., 1999; King, 2001; Lin et al., 2011). В связи с этим мы сравнили влияние мутаций sup35KK на стабильность различных вариантов приона. Для этой части работы были выбраны штаммы дрожжей, несущие варианты приона, отличающиеся от варианта, ранее использованного в работе. Эти штаммы трансформировали плазмидами pRSUl, несущими различные аллели SUP35. Для проверки нонсенс-супрессорного фенотипа полученных трансформантов переносили на среду % YEPD. Влияние мутаций sup35KK на стабильность приона в большой степени зависело от варианта [Л?/1]. При этом какой-либо корреляции выявить не удалось.

4. Проверка эффектов мутантных аллелей sup35KIг в зависимости от статуса клеток

Для того, чтобы проверить, могут ли описанные эффекты мутаций sup35KK быть опосредованы присутствием фактора [PIN1], мы получили производные [ PSI ] и [pif] штаммов с делецией гена RNQ1. У производных этих штаммов, несущих мутации проверяли наличие нонсенс-супрессорного фенотипа. Мы не обнаружили отличий в эффектах исследуемых мутаций между клетками [PIN'] и [pin], это говорит о том, что влияние sup35KK на свойства приона [PSP | не связано с наличием [PIN^].

5. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro

Для получения фибрилл, образованных различными вариантами Sup35NMp, соответствующий белок, слитый с шестью гистидинами, очищали из клеток Е. coli в денатурирующих условиях. В ходе эксперимента белок разводили как минимум в 100 раз в 5мМ фосфатном буфере (pH 7,4) с 150 мМ NaCl до конечной концентрации в 5 мкМ. Полученный раствор инкубировали при 25°С и аккуратном перемешивании. Процесс образования агрегатов Sup35NMp отслеживали по уменьшению количества мономерного белка с помощью SDS-PAGE.

Исследование морфологии агрегатов Sup35NMp проводили с помощью просвечивающей электронной микроскопии (микроскоп JEM Jeol-2100 на базе ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ). Во всех случаях нам удалось обнаружить фибриллы, образованные Sup35NMp. Затем мы сравнили их линейные характеристики: длину и ширину. Оба этих параметра измеряли по микрофотографиям в программе ImageJ. Результаты сравнения ширины фибрилл, образованных мутантными белками, продемонстрировали, что все они достоверно шире контрольного варианта (белка дикого типа) (Рис. 8). Это доказывает, что исследуемые мутации действительно оказывают влияние на структуру агрегатов Sup35p. Фибриллы Sup35NM-Mlp и Sup35NM-M2p короче по сравнению с Sup35NMp, в тоже время белок Sup35NM-M4p образует более длинные фибриллы (Рис. 8)

Ш М1

М2 МЗ

М4 М5

WT

М1

М2

МЗ

М4

У5

Рисунок 8. Сравнение линейных характеристик фибрилл, образованных различными вариантами Sup35NMp. Представлены распределения значений ширин (А) и длин (Б) фибрилл, образованных различными вариантами 8ир35ЫМр. Достоверные отличия по сравнению с белком дикого типа отмечены «*» (* — р < 0,05, *** - р < 0,001).

ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе работы мы описали эффекты пяти мутаций, которые содержат двойные замены соседних полярных незаряженных аминокислотных остатков на заряженные. Каждая из мутаций локализуется в одном из пяти олигопептидных повторов N-домена Sup35p. Разработанная система аллелей позволила нам выделить фрагмент белка, вовлеченный в формирование супер-складчатой р-структуры. Мутации, такие как в этом регионе приводят к дестабилизации всей структуры и потере фактора \PSI'~\. Две из исследованных нами мутаций, sup35-Ml и sup35-M2, обладают таким эффектом при замене аллели SUP35 дикого типа на яирЗЗ™ (Рис. 2). Остальные три мутации способны поддерживать прион, но в разной степени меняют его свойства. Мы предположили, что для варианта \PSf |, исследованного в ходе работы, С-терминальная граница участка, необходимого для поддержания супер-складчатой р-структуры, локализуется между 63 и 69 аминокислотными остатками Sup35p.

Обнаруженные эффекты мутаций sup35KK не связаны с изменением стабильности соответствующего белка или с их собственным фенотипическим проявлением. Потеря приона в присутствии sup35-Ml и sup35-M2 не связана с неспособностью этих аллелей индуцировать [Р5Г\. Кроме этого, мутантные белки могут образовывать агрегаты in vitro. Все эти факты свидетельствуют о том, что эффекты мутаций sup35-Ml и sup35-M2 связаны именно с их влиянием на структуру агрегатов, результатом которого является потеря [ PSI \.

Факторы [га/"] и [PIN*\ связаны друг с другом. Прион [PIN] необходим для появления [.PST] de novo (Derkatch et al., 1997), а точечные мутации или делеции в гене RNQ1 оказывают влияние на поддержание [AS7 ] (Kurahashi et al., 2009, 2011). Тем не менее, влияние sup35KK на свойства \PSI'~[ не связаны с нарушением взаимодействия [га/1] и [PIN1].

Важно отметить, что все описанные эффекты sup35KK характерны для конкретного варианта [ PSIr\. При исследовании других штаммов приона мы обнаружили, что полученные нами мутации оказывают различное влияние на свойства различных вариантов [/W J. Это закономерно, поскольку варианты f/'.SY1] отличаются по структурной организации агрегатов Sup35p (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008). Известно, что многие мутации в SUP35, влияющие на стабильность [PSI'~\, являются «вариант-специфичными» (Derkatch et al., 1999; King, 2001).

1. Влияние мутаций sup35-Ml и sup35-M2 на стабильность [ЛЛУ ]

Полученные данные позволяют предположить несколько причин потери приона [РЖГ] в присутствии мутаций sup35KK. Эти предположения основываются на отличиях в эффектах мутаций sup35-Ml и sup35-M2. Из них только мутация sup35-M2 дестабилизирует прион в присутствии копии гена дикого типа (Рис. 1). С другой стороны, обе эти мутации не могут поддерживать исследованный вариант [PST | (Рис. 2). Об исчезновении приона в этих случаях свидетельствуют необратимая утрата нонсенс-супрессорного фенотипа, которая сохраняется даже после замены мутантной аллели на ген SUP35 дикого типа (Рис. 2), а также отсутствие агрегатов Sup35p (Рис. 3).

Исчезновение [Р5/*"] под действием sup35-Ml, судя по всему, вызвано неспособностью Sup35-Mlp формировать гомоагрегаты, но это характерно только для исследованного варианта приона. В пользу этой гипотезы говорит отсутствие влияния мутации на стабильность [PSP] в присутствии аллели дикого типа (Рис. 1), а также то, что при этом Sup35-Mlp включается в агрегаты белка дикого типа (Рис. 4). Мы

считаем, что ¡ир35-М1 поддерживает прион в присутствии 81Л'35 только потому, что в составе гетероагрегата молекулы 8ир35-М1р чередуются с 8ир35р. Иными словами, 8ир35-М1р может коагрегировать с 8ир35р дикого типа, но не с таким же мутантным белком 8ир35-М1 (Рис. 9).

Гомозиготное состояние

WT

М1

МЗ. М4. М5

Гетерозиготное состояние

WT/M1

'X/Wv ' ■

WT/M3, WT/M4. WT/M5

« Положение мутации Повторы (От-ОР!5) Агрегация белков

* * ^ Блок агрегации белков

. . ] ' Исходная I приемная

суперскладчГой «»Измененная I конфориация

ß-структуры t > Ненаследуемый амилоид

Рисунок 9. Влияние мутаций sup3SKK на свойства лриона [РЖ/*].

Мутация sup35-M2 не может поддерживать исследованный вариант [PS/1] (Рис. 3) и приводит к дестабилизации приона даже в гетерозиготном состоянии (Рис. 1). Потеря приона при сочетании sup35-M2 и SUP35 неполная и составляет порядка 70 %, а эффективность этого процесса зависит от количества клеточных делений (Рис. 5А). Это не связано с ослаблением [PS/1], поскольку сохранившиеся варианты приона не отличаются по силе нонсенс-супрессорного фенотипа. Мы предполагаем, что только часть прион-формирующего участка Sup35-M2p может связываться с агрегатами белка дикого типа и изменять супер-складчатую ß-структуру. Следующая молекула, которая присоединится к такому гетероагрегату, копирует это изменение. Свидетельства таких модификаций удалось выявить при сравнении размеров агрегатов среди клеток [PST], которые потеряли плазмиду с sup35-M2 (Рис. 5Б). Вероятно, в большинстве случаев это приводит к формированию ненаследуемых амилоидов, что и приводит к исчезновению приона.

2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойства приона [PS/1]

Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не приводят к потере \PSI' ] (Рис. 2). Это позволяет предположить, что соответствующие аминокислотные замены расположены за пределами региона, необходимого для поддержания супер-складчатой ß-структуры. Тем не менее, в их присутствии свойства [PS71] изменяются. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 меняют нонсенс-супрессорный фенотип, вызванный прионом \ PSI \. Штамм [/'.S'/'J, несущий sup35-M4, лучше растет на среде без аденина по сравнению с диким типом, а штамм с sup35-M5, наоборот, хуже (Рис. 2). Различия в уровне нонсенс-супрессии в присутствии sup35-M4 также подтверждаются при использовании специализированных методов количественной оценки, в частности, измерения

активности р-галактозидазы (Рис. 6). Мы предположили, что эти две мутации приводят к формированию новых вариантов [AST]. Кроме этого, усиление приона в присутствии sup35-M4 сохраняется даже после замены мутантной аллели на SUP35 (Рис. 2,6). В то же время вариант [РЯГ], который сохранился в присутствии мутации sup35-M5, отличается от остальных по способности передаваться на аллель SUP35 дикого типа, он теряется при замене мутации на SUP35 (Рис. 2).

Количество пропагонов во многом определяет эффективность агрегации Sup35p в клетке [PST], это отражается и на уровне нонсенс-супрессии (Kryndushkin et al., 2003; Tanaka et al., 2006). Среди исследованных нами вариантов |/OTJ количество пропагонов уменьшено только в клетках с мутацией sup35-M5 (Рис. 7). Этот факт позволяет предположить, что Hspl04 хуже разрезает агрегаты Sup35-M5p, поэтому новые пропагоны образуются реже. Важно также отметить, что в присутствии sup35-М4 количество пропагонов не отличается от штамма с аллелью дикого типа (Рис. 7). Поэтому мы считаем, что усиление нонсенс-супрессорного фенотипа в случае этой мутации скорее связано с изменением скорости агрегации Sup35p.

По длине фибрилл, образованных in vitro, мы также смогли косвенно оценить скорость агрегации мутаитных белков, поскольку в этой системе этот процесс ничем не ограничен. Агрегаты Sup35NM-M4p значительно превосходят по длине контрольный вариант (Sup35NMp) (Рис. 8Б). Исходя из перечисленных результатов, мы считаем, что Sup35-M4p формирует фибриллы, которые с большей скоростью присоединяют мономерный белок.

Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 локализуются за пределами участка, необходимого для поддержания супер-складчатой Р-структуры, однако оказывают влияние на свойства приона и, вероятно, приводят к возникновению новых вариантов \PSPl В экспериментах in vitro нам удалось зафиксировать различия в структуре фибрилл, образованных мутантными белками Sup35NM, от агрегатов белка дикого типа: все они были шире (Рис. 8А). Рассматриваемые мутации sup35KK изменяют укладку белковых молекул в составе агрегатов Sup35p, но не дестабилизируют структуру в целом (Рис. 9).

3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона \Р$Г\

Сконструированные нами мутации зирЗЗ**, согласно теоретическим предпосылкам, оказывают влияние на стабильность приона [/ОТ] только если они находятся в регионе, образующем супер-складчатую Р-структуру. Мутации sup35-Ml, sup35-M2, а также sup35-M4 оказывают влияние на стабильность приона [/ОТ ] сами по себе, или в сочетании с другими аллелями ¡ир35ш. Таким образом, мы предполагаем, что в прионных агрегатах белка дикого типа, характерных для исследованного варианта приона, соответствующие повторы участвуют в образовании супер-складчатой p-структуры. При этом только первые два олигопептидных повтора входят в состав региона, необходимого для поддержания супер-складчатой Р-структуры, поскольку только sup35-Ml и sup35-M2 сами по себе приводят к потере [/ОТ1]. Четвертый повтор может участвовать в формировании Р-структуры, но не является необходимым для ее поддержания, поскольку мутация sup35-M4 сама по себе не приводит к потере фактора [AST] и дестабилизирует прион только в сочетании с другими аллелями. Также необходимо уточнить, что в данном случае мы говорим о конформации белка дикого типа, характерной для исходного варианта [/ОТ1], до изменения его свойств под влиянием аллелей sup35KK {Рис. 10). Мутация sup35-M3 не имеет каких-либо эффектов, даже при сочетании с другими аллелями sup35KK.

Поэтому, следуя той же логике, мы предполагаем, что третий повтор не вовлечен в формирование супер-складчатой Р-структуры.

Исследованный вариант приона [РЭП до внесения аллелей $ир35*к

Sup35p

Рисунок 10. Возможные схемы организации р-слоев в исследованных прионных агрегатах. OR — олигопептидные повторы N-домена Sup35p. Стрелками обозначены повторы, предположительно формирующие (3-слои.

Внесение аллели sup35-M4 в штаммы [PST | с sup35-M3 или sup35-M5 приводит к дестабилизации приона (Табл. 2). Эта же мутация усиливает прион, поддерживающийся в присутствии SUP35 дикого типа. Согласно литературным данным, сильные варианты приона [Р57'] характеризуются менее протяженной Р-структурой (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008). Совокупность этих фактов позволяет нам предположить, что четвертый повтор мутантного белка Sup35-M4 не может участвовать в образовании Р-структуры (Рис. 10). Это влечет за собой укорочение фрагмента белка, вовлеченного в формирование супер-складчатой p-структуры, и усиление приона.

4. Заключение

В ходе работы мы описали влияние аллелей sup35KK на свойства \PSI' \ и выявили конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе соответствующих эффектов. В зависимости от своего положения мутации приводят либо к потере приона, либо к формированию его новых вариантов. Аминокислотные замены в Sup35-M3p по нашим данным локализованы за пределами региона, участвующего в формировании супер-складчатой p-структуры, поэтому соответствующая аллель имеет минимальное влияние на свойства [_ftS7' j. Белок Sup35-Ml не может образовывать гомоагрегаты на основе исследованного варианта приона, и в этом случае [PS'/'] сохраняется только благодаря присутствию аллели SUP35 дикого типа. Включение белка Sup35-M2 в агрегаты Sup35p приводит к изменению их структуры, что в большинстве случаев приводит к образованию ненаследуемых амилоидов и потере приона. Аллели sup35-Ml и sup35-M2 располагаются в пределах региона, необходимого для поддержания супер-складчатой p-структуры, поэтому они и приводят к исчезновению

Мутации в четвертом и пятом олигопептидных повторах приводят к появлению новых вариантов приона. [ЛЯГ], сохраняющийся в присутствии sup35-M4, имеет более короткий участок белка, участвующий в образовании p-струюуры, поэтому эффективнее присоединяет мономеры Sup35p. Вариант [ЛЯГ], образованный Sup35-M5p, характеризуется сниженным количеством пропагонов и поэтому более слабым нонсенс-супрессорным фенотипом. Вероятно, Hspl04p хуже фрагментирует соответствующие белковые агрегаты.

ВЫВОДЫ

1. Мутации, которые расположены в пределах фрагмента белка, вовлеченного в формирование супер-складчатой р-структуры (sup35-Ml и sup35-M2), приводят к потере фактора [Р5Г]. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к формированию новых вариантов приона.

2. Первый, второй и четвертый олигопептидные повторы N-домена Sup35p участвуют в образовании супер-складчатой Р-структуры.

3. Эффекты мутаций sup35KK зависят от варианта приона [Д5Г] и не зависят от [7VNf]-статуса клетки.

4. Все исследованные мутации sup35^ влияют на структуру агрегатов Sup35p in vitro.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бондарев С. А., Широколобова Е. Д., Трубицина Н. П., Журавлева Г. А. Изменение свойств приона [P57f] при комбинировании аминокислотных замен в N-домене белка Sup35 //Молекулярная биология. 2014. — Т.48,-№ 2.-С. 314-328.

2. Zhouravleva G.A., Bondarev S.A. Evolution of the translation termination factors // Paleontological Journal. 2013. — Vol. 47, — № 9. — P. 1065-1069.

3. Bondarev S.A., Shchepachev V.V, Kajava A.V, Zhouravleva G.A. Effect of charged residues in the N-domain of Sup35 protein on prion [PST] stability and propagation // Journal of Biological Chemistry. 2013. — Vol. 288, — № 40. — P. 28503-28513.

4. Инге-Вечтомов С.Г., Журавлева ГА., Бондарев С.А. Пространственные матрицы в эволюции и эволюция пространственных, матриц // Проблемы эволюции биосферы. Серия «Гео-биологические системы в прошлом». — г. М.: ПИН РАН. — 2013, —С. 48-65.

5. Zhouravleva G., Bondarev S. Gene duplication and origin of translation factors // Gene Duplication. — Croatia: InTech. 2011. — 400 pp., 151-172 P.

Тезисы:

1. Bondarev S.A., Shirokolobova E.D., Trubitzina N.P., Zhouravleva G.A. Effects of sup35** alleles on propagation and stability of the yeast prion [PS/1] and their molecular mechanisms // 26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Frankfurt/Main, Germany).— 2013. — P. S120.

2. Bondarev S.A., Trubitzina N.P., Shirokolobova E.D., Zhouravleva G.A. Effects of БирЗБ^ alleles on propagation and stability of the yeast prion [P57+] // CNRS - Jacques Monod Conference "Protein misfolding in disease: molecular processes and translational research toward therapy". — 2013. — P. 43.

3. Бондарев C.A., Трубицина Н.П., Журавлева ГА. Изучение молекулярных механизмов потери приона [PiS/1] на фоне мутаций в N-домене белка Sup35 // V школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород). — 2012. — С. 15.

4. Bondarev S., Shepatchev V, Kajava A., Zhouravleva G. Influence of mutations at N-

domain of Sup35p on propagation and stability of the yeast prion [РЛ'Г] // 25th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Olsztyn, Poland). — 2011, —P. S126.

5. Bondarev S.A., Shepatchev V.V., Kajava A.V, Zhouravleva G.A. Influence of cryptic mutations at N-domain of Sup35p on propagation and stability of the yeast prion [I'St] // Сборник тезисов "Conference "Yeast: an evergreen model system. Tribute to P. Slonimski" (Rome, Italy). — 2010. — P. 14.

6. Щепачев B.B., Бондарев C.A., Каява A.B., Инге-Вечтомов С.Г, Журавлева Г.А. Поиск экспериментальных доказательств модели суперскладчатой ji-структуры, описывающей строение амилоидной формы белка Sup35 // Сборник тезисов V съезда ВОГиС (Москва). — 2009. — С. 101

Подписано в печать 14.03.2014 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,25 Тираж 50 экз. Заказ 110

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бондарев, Станислав Александрович, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

п

/,

/

V

/

У

04201460592 „

На правах рукописи

Бондарев Станислав Александрович

ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА 8ир35 НА СВОЙСТВА ПРИОНА |/ЛУ/ | ДРОЖЖЕЙ ЬассЬаготусе* сегеу'шае

Специальность 03.02.07 - генетика.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., профессор, Г.А. Журавлева

Санкт-Петербург 2014

Оглавление

1. Список сокращений.....................................................................................................6

2. Введение.......................................................................................................................8

3. Обзор литературы......................................................................................................10

3.1. Прионы и амилоиды...........................................................................................10

3.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот.....................................................10

3.1.2. Прионы и амилоиды низших эукариот......................................................14

3.1.3. Амилоиды прокариот..................................................................................17

3.2. Краткая история исследований фактора [.РЯТ]................................................18

3.3. [Р5Г] и терминация трансляции.......................................................................19

3.4. «Жизненный цикл» ..................................................................................21

3.5. Варианты приона [Р57+].....................................................................................28

3.6. Структура белка 8ир35.......................................................................................31

3.7. Мутации в гене 811Р35, влияющие на стабильность фактора [Р£Г].............34

3.8. Межвидовой барьер для передачи приона [Р£Г]............................................36

3.9. Модели структурной организации агрегатов Бир35р......................................38

3.10. Заключение........................................................................................................41

4. Цель и задачи.............................................................................................................42

5. Материалы и методы.................................................................................................43

5.1. Плазмиды.............................................................................................................43

5.2. Штаммы...............................................................................................................45

5.3. Среды и условия культивирования...................................................................46

5.4. Генетические методы.........................................................................................47

5.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформация.....................................47

5.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей Я. сегеу1я1ае....................................48

5.4.3. Оценка митотической стабильности приона [Р8Г]..................................48

5.4.4. Оценка передачи и потери приона [РБГ]..................................................49

5.4.5. Подсчет количества пропагонов.................................................................49

5.4.6. Оценка эффективности нонсенс-супрессии..............................................49

5.5. Молекулярно-биологические методы...............................................................50

5.5.1. Сайт-направленный мутагенез...................................................................50

5.5.2. Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делецией гена RNQ1...............................................................................................................52

5.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)............................................................................................................53

5.5.4. Неспецифическая окраска белков..............................................................54

5.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле (SDD-AGE).............................................................................................................54

5.5.6. Вестерн-блот гибридизация........................................................................55

5.5.7. Секвенирование...........................................................................................55

5.6. Очистка белков из культур Е. coli.....................................................................55

5.7. Просвечивающая электронная микроскопия...................................................56

5.8. Цифровая обработка изображений....................................................................57

5.9. Статистическая обработка.................................................................................57

6. Результаты..................................................................................................................58

6.1. Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP35........58

6.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [P-ST]..........60

6.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют [PSГ] даже в присутствии гена SUP35 дикого типа........................................................................................60

6.2.2. При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KK оказвают различное влияние на свойства и поддержание приона [PSF].........................63

6.2.3. Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35p...................65

6.2.4. Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KK....................66

6.2.5. Мутации sup35-Ml и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатов Sup35p.....................................................................................................................67

6.2.6. Белки Sup35-Ml и Sup35-M2 включаются в состав прионных агрегатов [PSF].......................................................................................................................69

6.2.7. Мутации sup35-Ml и sup35-M2 могут индуцировать возникновение

приона [PiST] de novo.............................................................................................70

6.2.8. Дестабилизация [Р£Г] в присутствии sup35-M2 зависит от количества клеточных делений................................................................................................71

6.2.9. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическую стабильность приона [PSI+]..................................................................................73

6.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размера агрегатов Sup35p....................................................................................................74

6.2.11. Все мутантные аллели незначительно увеличивают стабильность агрегатов Sup35p при нагревании........................................................................75

6.2.12. Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, более «сильного» варианта приона [PSF]......................................................................77

6.2.13. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагонов

в клетке...................................................................................................................78

6.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]......80

6.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSI ] при сочетании с другими аллелями sup35KK...............................................................80

6.3.2. Дестабилизация [PSI ] в присутствии сочетаний мутаций sup35KK сопровождается увеличением размера агрегатов Sup35p..................................81

6.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабильность агрегатов Sup35p....................................................................................................82

6.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [PST].............83

6.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [Р/^-статуса клеток....................85

6.6. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.......86

7. Обсуждение................................................................................................................92

7.1. Влияние мутаций sup35-Ml и sup35-M2 на стабильность [Р57+]...................93

7.2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойства

приона [PST]..............................................................................................................96

7.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [Р5Т]......100

7.4. Заключение........................................................................................................102

8. Выводы.....................................................................................................................104

9. Список литературы..................................................................................................105

10. Благодарности........................................................................................................118

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-ФОК — 5-фтороротовая кислота

а.к. — аминокислотный остаток

ГГХ — гидрохлорид гуанидина

ДМСО — диметилсульфоксид

ИПТГ — изопропил-(3-13-1 -тиогалактопиранозид

ОНПГ — орто-нитрофенил-Р-галактозид

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЭГ — полиэтиленгликоль

ФМСФ - фенилметансульфофторид

ЭДГА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР — электронный парамагнитный резонанс

ЯМР — ядерно-магнитный резонанс

CARD — caspase-recruitment domain (домен, участвующий во взаимодействии с каспазами)

eRF — eukaryotic release factor (эукариотический фактор терминации трансляции)

IRF — interferon regulatory factors (факторы, регулирующие синтез интерферонов)

GFP — green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок)

NF-кр — nuclear factor кр (ядерный фактор кр, транскрипционный фактор)

NMD — nonsense mediated mRNA decay (система деградации мРНК с

преждевременными стоп-кодонами в открытой рамке считывания)

OR — oligopeptide repeats (олигопептидные повторы)

PNM— Psi-no-more (мутации, приводящие к потере приона [Р5Т])

PrP - prion protein (прионный белок)

SDD-AGE — semi-denaturating detergent agarose gel electrophoresis (полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле) SDS — sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)

SDS-PAGE — sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis (денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле)

$ир35кк — обозначение аллелей гена БиР35, исследованных в ходе данной работы: $ир35-М1, тр35-М2, Яир35-М3, $ир35-М4, зир35-М5

В работе также использованы стандартные сокращения единиц измерения, общепринятые обозначения нуклеиновых кислот, нуклеотидов, а также культуральных сред. Названия генов и цитоплазматических факторов, а также обозначения фенотипов приведены с учетом правил дрожжевой и бактериальной номенклатуры.

2. ВВЕДЕНИЕ

Прионами называют инфекционные или наследуемые факторы белковой природы, механизм распространения которых основан на их способности индуцировать конформационные изменения определенных полипептидов клетки. Белок в прионной изоформе меняет укладку такого же белка по «своему образу и подобию», иными словами, играет роль пространственной матрицы. Фундаментальный интерес к этому феномену связан с тем, что он представляет собой новый способ копирования информации, «записанной» в трехмерной структуре белка.

Некоторые прионы являются возбудителями инфекционных заболеваний (Куру, болезнь Крейтсфельдта-Якоба — болезни человека и «почесуха овец»), но зачастую вызывают появление наследуемых черт, которые могут быть адаптивны (прионы низших эукариот). Появление приона [РБГ] в клетках дрожжей ЗассЪаготусез сегеу'тае может приводить как к благоприятным, так и патологическим последствиям. Особенности проявления этого фактора преимущественно связаны с отличиями в трехмерной укладке белка БирЗбр в каждом конкретном случае. Исследования структуры прионных агрегатов и механизмов, обеспечивающих их стабилизацию, вызывают большой интерес. С практической точки зрения изучение принципов поддержания прионной конформации может стать основой разработки лекарственных средств для терапии заболеваний, которые на сегодняшний день не поддаются лечению.

Фактор [Р5Г] - это один из наиболее хорошо исследованных прионов дрожжей. Благодаря этому он является удобным «модельным объектом» для исследования фундаментальных свойств таких детерминантов. В ходе нашей работы на основании модели супер-складчатой Р-структуры, описывающей организацию амилоидных агрегатов Бир35р, мы получили набор мутаций яир35кк. Исходя из теоретических предположений, все они должны приводить к потере фактора [Р67+], однако только для двух из пяти аллелей это подтвердилось. Остальные мутации тем или иным образом модифицируют свойства приона или

его агрегатов. Благодаря серии экспериментов in vivo и in vitro мы смогли доказать, что все исследуемые аллели меняют структуру прионных агрегатов и таким образом влияют на свойства [PSP], Также нам удалось выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе описанных явлений.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 3.1. Прионы и амилоиды

3.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот

Впервые термин «прион» был введен для обозначения инфекционных агентов белковой природы, возбудителей целого ряда различных заболеваний млекопитающих, таких как Куру, болезнь Крейтсфельдта-Якоба и «почесуха овец» (Prusiner, 1987). Интерес к этим заболеваниям был вызван общими чертами их патогенеза: гибелью нейронов и отложением амилоидов (Gajdusek et al., 1957; Hadlow, 1959; Klatzo et al., 1976). Долгое время считалось, что причиной «почесухи овец» является вирус, но данная гипотеза была отвергнута после экспериментов, показавших нечувствительность возбудителя к нуклеазам (ферментам, гидролизующими нуклеиновые кислоты) (Diener et al., 1982). Вместе с этим был обнаружен ряд других необычных свойств этого патогена, например, устойчивость к денатурирующим агентам (высокой температуре, SDS, мочевине) или ультрафиолету (Alper et al., 1967; Gibbs et al., 1978; Diener et al., 1982). В это время была высказана гипотеза, согласно которой инфекционным началом является белок, а не нуклеиновая кислота (Griffith, 1967). Это предположение подвердилось, когда стало очевидно, что многие из упомянутых свойств характерны для мембранных белков (Prusiner et al., 1981). Прион является альтернативной конформацией белка, названного РгР (от Prion Protein), а его инфекционные свойства основаны на способности индуцировать конформационный переход белков с такой же аминокислотной последовательностью (Prusiner, 1982). За этим последовала идентификация РгР, а точнее, фрагмента его амино-терминальной последовательности (Prusiner et al., 1984), а после этого был найден соответствующий ген Prnp (Oesch et al., 1985). Карбокси-терминальный участок РгР образует четыре а-спирали и два ß-слоя (Riek et al., 1996). Амино-терминальный фрагмент не обладает определенной вторичной структурой, и именно он вовлечен в формирование приона (Prusiner et al., 1984; Riek et al., 1996). В ходе прионизации белок РгР изменяет свою

и

конформацию, что приводит к формированию большого количества ß-слоев (Pan et al., 1993). Прион формирующий домен РгР содержит олигопептидные повторы (PHGGGWGQ), число которых коррелирует с развитием прионных заболеваний (Laplanche et al., 1990; Owen et al., 1990; Puckett et al., 1991). Клеточная функция этого белка долгое время оставалось неизвестной, и только недавно была выявлена его роль в поддержании миелиновых оболочек отростков нервных клеток (Bremer et al., 2010).

Амилоиды — это крупные белковые агрегаты, формирующие неразветвленные фибриллы. Отдельные молекулы белка в составе таких комплексов образуют многочисленные ß-слои, из-за этого они обладают особыми дифракционными свойствами. В то же время, их коровый регион характеризуется высокой устойчивостью к протеазам и денатурирующим агентам, а также защищен от замещения водорода на дейтерий («H/D exchange») (см. обзор (Ваха, 2008)).

Амилоиды, как и прионы, изначально были описаны в связи с различными заболеваниями: болезнь Альцгеймера (см. обзор (Citron, 2010)), болезнь Паркинсона (см. обзор (Alberio et al., 2012)), болезнь Хантингтона (см. обзор (Bano et al., 2011)), диабет второго типа (см. обзор (Ваха, 2008)) и т.д. Это во многом определило последующее отношение к процессам прионизации и амилоидогенеза. Зачастую их рассматривают как патологические, хотя на данный момент постепенно накапливаются данные, свидетельствующие об обратном. Среди примеров адаптивной агрегации белков в клетках млекопитающих является образование цитоплазматических стресс-гранул. Эти многокомпонентные (рибонуклеопротеиновые) комплексы образуются в ответ на стресс, а главной их функцией является остановка трансляции (см. обзор (Decker et al., 2012)). При этом синтез белков блокируется не полностью: мРНК генов белков теплового шока не входит в состав стресс-гранул (Nover et al., 1983). Благодаря этому механизму клетка получает возможность перенаправить собственные ресурсы на синтез белков, необходимых для преодоления последствий неблагоприятных

воздействий, а также предотвратить деградацию нетранслированных РНК и сохранить их для дальнейшего использования. Кроме этого, предполагается участие стресс-гранул в сортировке мРНК: некоторые молекулы не покидают комплексы в течение всего времени их существования, другие, наоборот, направляются на деградацию или трансляцию (см. обзор (Anderson et al., 2008; Decker et al., 2012)).

Ключевыми белками, участвующими в образовании стресс-гранул, являются TIA-1 (Gilks et al., 2004) и СРЕВ (Wilczynska et al., 2005). Интерес к этим полипептидам связан с тем, что они могут связываться с РНК и способны к прионизации. Последнее, вероятно, необходимо для их участия в образовании стресс-гранул. При удалении прионизующего домена TIA-1 клетка теряет возможность образовывать соответствующие комплексы при стрессе. Эта функция может восстанавливаться в присутствии химерного белка TIA-1, в котором его прионизующий домен заменен на аналогичный домен из белка Sup35 (структурный белок фактора [.PST] Saccharomyces cerevisiae) (Gilks et al., 2004). Этот факт также может служить иллюстрацией сохранения определенной функциональной агрегации белков у неродственных видов, или же, наоборот, независимого ее появления в ходе эволюции. В случае белка TIA-1 биологическое значение его агрегации понятно (образование стресс-гранул), а для Sup35p оно пока неизвестно.

Белок СРЕВ, помимо участия в образовании стресс-гранул, вовлечен в процессы формирования долгосрочной памяти у брюхоногого моллюска Aplysia californica (Si et al., 2010). В нейронах этого организма присутствуют два варианта СРЕВ: мономерный и полимерный. Агрегированная форма этого белка демонстрирует некоторые черты приона и не оказывает какого-либо негативного влияния на функцию СРЕВ, т. е. даже в виде полимеров белок может связывать РНК. Переход белка из мономерной формы в агрегированную контролируется самой клеткой, и это состояние поддерживается более суток за счет прионных свойств СРЕВ. В это время в конкретном нейроне облегчается

синаптическая передача (Si et al., 2010). Аналогичный механизм описан также и у Drosophila melanogaster, в клетках которой белок ОгЬ2 (гомолог СРЕВ) также участвует в процессах формирования долгосрочной памяти (Majumdar et al., 2012). Здесь же стоит отметить, что белок СРЕВ спосо