Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyses cerevisiae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора (psi+)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyses cerevisiae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора (psi+)"

РГ6 ОД 2 9 МКЛ

Сшет-Петербфгсшй государственный университет

на правах рукописи

ДЕРКАЧ Ирина Львовна

ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ ГЕНА 811Р35 ДРОЖЖЕЙ ВяссЬаготусеа сетМае ИНДУЦИРУЕТ ВОЗНИКНОВЕНИЕ ЭКСТРАХРОМОСОМНОГО ФАКТОРА |ря!*|

03.00.15 "Генеппса"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1995

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: Консультант:

кандидат биологических наук Чернов Юрий Олегович заведующий кафедрой генетики и селекции СПСГУ, чл.- корр.РАН, доктор Сиологических наук, профессор Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич

Официальные оппоненты:

чл,- корр.РАН, доктор биологических наук, профессор Б.В.Громов доктор биологических наук Т.Р.Сойдла

Ведущая организация

Санкт-Петербургский институт ядерной физики РАН им.Б.П.Константинова

Защита состоится '¿^Р" 1995г. в часов на

заседании диссэртвционного Совета Д.063.57.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора Сиологических наук В Санкт-Петербургском государственном университете по адресу г.Санкт-Петербург, Университетская наб. д.7/9, СПбГУ, кафедра генетики и селекции, ауд.1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотетке СПбГУ.

Автореферат разослан

•/9" ^ССиЯ.-

1995г.

Ученый секретари специализированного Совета, кандидат Сиологических наук

Л.А.Мамон

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Неменделевский фактор (psi*J дрожжей Saccharomyces cerevislae (Сох, 1965) перелается через цитоплазму. Несмотря на интенсивные исследования, его не удалось связать ни с какими молекулами ДНК или РНК. Фактор (psi*) снижает точность трансляции, вызывая подавление проявления нонсенс-мутаций - нонсенс-супрессию (см. оОзор Сох et al, 1988). К такому же эффекту приводят мутации в гене SUP35 (Инге-Вечтомов, 1964 и 1965; Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970)-, а также, как было показано нами, амплификация гена SUP35 дикого типа (Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). Белок Sup35 является консервативным эукариотическим фактором трансляции, гипотетически функционирующим на этапе терминации.

В данной работе впервые было показано, что увеличение дозы гена SUP35 индуцирует появление [psi*] ¿актора (Chernoff et al, 1993). Эти результаты были использованы Р., Викнером (Wickner, 1994) в его модели, постулирующей, что Ipsi*) является прионоподобной формой белка Sup35. Прионы - белки необычной конфорыации, вызывающие нейродегенеративные заболевания у животных и человека, например, скрейпи и спорадическою форму болезни Крейцфельдта-Якойа (см. обзоры Prusiner, 1994 и 1995). Особенностью прионовых заболеваний является то, что в качестве инфекционного агента выступает белок РгР в прионовой конформации (PrPSc), который при попадании в клетку изменяет конформацию клеточного белка РгР, превращая его в прион. Таким образом, передача заболевание осуществляется по новому механизму, не требующему участия ДНК (или РНК-)-содержащего инфекционного агента. Вместе с тем, мутации в гене, кодирующем белок РгР, могут вызывать заболевания идентичные прионовым (как, например, в случае семейной формы болезни Крейцфельдта-Якоба).

Дальнейшие эксперименты, представленные в данной работе, подтверждают прионовую модель [psi*] и позволяют локализовать участок белка Sup35 необходимый для индукции tpsi*]. Наши результаты демонстрируют перспективность использования модельного генетического объекта - дрожжей Saccharomyces cerevisiae - для изучения закономерностей появления и поддержания лрионов, для понимания механизмов эпигеномного наследования и роли наследуемых модификаций белков в регуляции белкового синтеза.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось изучение наследственных изменений, вызванных увеличением дозы гена SUP35. В ходе экспериментов с многокопийными плазмидами, содержащими ген SUP35, нами Сыло обнаружено появление [psi*] факторов. Дальнейшими задачами работы было: • .

- сравнить специфичность супрессии, вызванной многокопийным геном SUP35, со специфичностью супрессии, вызванной [psi'i фактором и мутациями в генах SUP35 и SUP45.

- выяснить, чем вызвана индукция [psi*] - увеличением копийно-сти гена SUP35 или гиперпродукцией соответствующего белка;

- охарактеризовать [psi*] факторы, возникающие при гиперпродукции Sup35;

- выявить участок Sup35 ответственный за индукцию [psi*]«

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые обнаружено, что сверхпродукция всего белка Sup35 или его N-концевого фрагмента приводит к возникновению цитоплазматического прионоподобного фактора [psi*]. Показано, что при гиперпродукции Sup35 в одном и том же штамме дрожжей могут быть индуцированы [psi*] факторы различного проявления.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные данные о возникновении прионоподобного фактора [psi*] при сверхэкспрессии гена SUP35 позволяют использовать модельный генетический объект Saccharomyces cerevisiae для изучения прионов - возбудителей болезней животных и человека. Созданная в ходе работы коллекция штаммов дрожжей исполь-зовгна в молекулярно-генетических исследованиях и в педагогическом процессе на кафедре генетики и селекции СЛОГУ.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ. Результаты работы были представлены на XVII Международном Генетическом Конгрессе (Бирмингем, Великобритания, 1993), на XV Международной Конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага, Нидерланды, 1990), на конференции "Синтез рибосом и функция ядрышка" (Колд Спринг Харбор, СШД, 1994), на семинарах лаборатории физиологической генетики (БиНИИ СПбГУ) кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории молекулярной биологии Университета Иллинойс (Чикаго, США).

ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 2 тезисных сообщения.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.Диссертационная работа объемом_

страниц состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы",. "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", содержит _ рисунков, __ таблиц и список литературы, содержащий__

наименований работ. •

•

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Основные штаммы дрожжей использованные в работе: ЗЗГ-ДО73 (а pheAlO(UAA) ade2-144,717 his7-l(UAA) lysQ-A21(UAA) trpl-289(UAGÎ 1еа2-3, li2 ura3-52), 74-Д694 (a adel-14(UGA) his3-A200 leu2-3,112 ura3-52 trpl-289(UAG)), ДУ8-132-Л28-2В-П3932 (a adelr.J4 (UGA) his7-l

(UAA) Iys2-87(UGA) thr4-B15(UGA) leu2-l игаЗ-Д; далее - Л28), 31В-Д543 (a adel-14(UGA) his7-l(UAA) ura3-52 leu2-3,112 trpl-?89(UAG)).

Основные плазмиды использованные в работе любезно предоставлены М.В.Телковьм (плазмиды с SUP35 на основе вектора '/ер13 (Телков и др., 1986)), В.В.Кушнировым (плазмиды с SUP35 и его фрагментами на основе pEMBL-yex4 (Кушниров и др.,1990) и плазмида URA3-GAL::SUP35) и С.Линквист (плазмида ER-HIS, использованная для индукции GAL1/GAL10 (GAL) промотора (Louvion et al, 1994)) или сконструированы нами в ходе работы (см.рис.5).

В работе были использованы стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984, Sherman et al, 1988). Мутантов lys2 отбирали на среде с а-аминоадапиновой кислотой (Chattoo et al, 1979). Отбор Ura" клонов проводили на среде с 5-фтороротовой кислотой (Boeke et al, 1984). Для элиминации [psi*] дрожжи пассировали на среде YPD с гуанидингидрохлорида. Супрессию точковых мутаций анализировали как на стандартных синтетичегских средах, так и на средах с 2% этанола в качестве источника углерода npi: температуре инкубации 20°С и ЗО'с.Для индукции GAL промотора использовали среды с 2% галактозы в качестве единственного источника углерода или с р-эстрадиолом (10, 20, 50 или ЮОнМ) . В последнем случае в штамме присутствовала также вторая плазмида (ER-HIS), содержавшая гормон-связываидий домен эстрогенового рецептора человека слитый с ДНК-связывающиы доменом GAL4. и транскрипционным активатором вирусного белка VP16 (Louvion et al, 1993). Эта двухкомпонентная система позволяет регулировать уровень индукции GAL промотора в зависимости от концентрации (5-зстрадиола в среде. Трансформацию дрожжей и Е.coli проводили по стандартным методикам (Ito et al, 1983 и Hanahan, 1985).

Выделение РНК и ДНК, рестрикцию, выделение фрагментов ДНК, ли-гирование, электрофорез в агарозных и полиакриламидных гелях, сек-венирование, гибридизацию ДНК-ДНК и РНК-ДНК проводили как описано в руководстве Сэмбрука с соавторами (Saabrook et'al, 1989). При проведении направленного мутагенеза в гене SUP35 руководствовались протоколом фирмы BioRad, при проведении цепной реакции полимеризации - протоколом фирмы Perkin Elmer, при работе с белками - протоколом фирмы Amersham (поликлональные антитела к Sup35 получены С.А. Дидиченкр (Didichenko et al, 1991), предоставлены В.В. Кутнировым).

РЕЗУЛЬТАТЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУПРЕССОРНСЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ МНОГО-КОПИЙНОГО ГЕНА SUP35, [psi*] И МУТАЦИЙ вирЗБ И sup45. Было получено около 2000 мутаций lys2 индуцированных би-гидроксиламинопурином в штаные 31В-Д543. 82 независимых мутации lys2, локализованные в

BamKI - Xhol фрагменте в центральной части гена LYS2 (рис.1), были клонированы и секвенированы. Результаты анализа супрессии этих мутаций представлены в таОлице 1. Мы показали, что наблюдалась супрессия только нонсенс-мутаций, причем, одни и те же мутации супрес-сироЕались [psi*], иногокопийным SUP35 и мутациями sup35 и sup45.

LYS2 (4176 п.и.)

Рис.1. Карта гена LYS2. Указаны направление транскрипции и трансляции (стрелка),сайты узнавания рестрикцконлыии эндонуклеазаии, размеры гена и фрагмента в парах нуклеотидоь, позиции сайтов BarcHI и xhol и позиции мутаций в BamHI-XhoI районе: нижний ряд - супрессируеыые, верхний ряд -носупрессируеыые.

ИНДУКЦИЯ [psi*] ФАКТОРА МНОГОКОГЛЙНЩ ГЕНОМ SUP3S ■ Трансформа-цил дрожжей эписоыными плазмидаыи, содержащими ген SUP35 дикого типа, приводит к омнипотентной супрессии, обусловленной увеличением дозы SUP35, как описано нами ранее (Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). В большинстве клонов, потерявших плазмиду с геном SUP35, супрессия исчезала. Тем не менее, некоторые клоны сохраняли супрессии и в отсутствие плазмиды. В штамме ЭЗГ-Д373, у которого впервые было обнаружено это явление, супрессия таких исключительных клонов проявлялась иначе, чем супрессия под действием мкогокопийного гена SUP35, вследствие чего эти клены были первоначально обозначены Psu* (phenotypic Suppression) (Тиходеев и др., 1990). Так, супрессия у Psu* клонов значительно усиливалась на несбраживаемых источниках углерода (например, этаноле) . Кроме того, если охр-мутация hisl-l супрессировалась иногокопийным SUP35 на 3-5 день, а охр-мутация Iys9-A21 - на 7 - 9 день, то У клонов Psu* соотношение было обратным. Фенотип Psu* был, как правило, стабилен при митотических делениях на среде YPD, но элиминировался после 3 пассажей на среде с 5мМ гуанидингидрохлорида. Это указывает на то, что Psu* фенотип обусловлел возникновением экс.рахромосомного фактора аналогичного (psi*] фактору/ описанному ранее (для обзора см. Сох et al, 19С8).

Psu' (обозначаемые далее [psi*]) клоны не Сыти результатом перестроек плазмиды или амплификации гена SUP35 отдельно от плазмиды, так как они не содержали дополнительных экстрахромосомных копий SUP35, что было подтверждено гибридизацией по Сауэерну ДНК, выделенной из этих клонов, с ДНК гена SUP35.

Эффект индукции [psi4] фактора многокопийным генам SUP35 был воспроизведен также в других штаммах дрожжей (Л28, 31В-Д543, 74-Д694) . Дрожжи трансформировали эписомными плазмидами, содержащими ген SUP35 и дрожжевой маркер LEU2. Трансформэнтов инкубировали на среде без лейцина, затем субклонировали а неселективных условиях и анализировали супрессию нонсенс-мутаций у клонов, потерявших плаз-миду. Результаты для штаммов ЭЗГ-Д373 и JJZ8 представлены в таблице 2. Мы не обнаружили [psi*] клонов в митотическом потомстве трансформантов JI28, содержавших контрольную плазмиду без гена SUP35. Частота [psi*] клонов в митотическом потомстве трансформантов ЗЗГ-Д373, содержавших контрольную плазмиду, составляла приблизительно 0,5%. Этот результат согласуется с нашим наблюдением, что [psi*] клоны могут возникать в штамме ЭЗГ-Д373 и спонтанно, то есть в отсутствие плазшд. В то же время, в митотическом потомстве трансформантов плазмидами, содержащими функциональный SUP35, от 10 до 20% клонов, потеряЕших плазмиду были [psi*J, причём, [psi*] клоны встречались в потомстве большинства независимо отобранных трансформантов. Различия между контрольной плазмидой и плазмидами с SUP35 являются достоверными (Р<0,05).

Таким образом, увеличение копийности гена БОРЗ5 индуцирует возникновение de novo экстрахромосомного фактора [psi*] .

Ми показали также, что эффективность индукции [psi*] возрастает при повышении копийности гена SUP35. Плазмида pEMBL-SUP35, сконструированная на основе pEMBL-yex4, содержит дрожжевые гены UHA3 и LEU2-d. Плазмиды такой структуры обычно содержатся в количестве порядка 10 копий на клетку на среде без урацкпа, но копийность должна возрасти до 100 копий, чтобы обеспечить рост на среде без лейцина (Parent et al, 1985). Дрожжи трансформировали плазмидой pEMBL-SUP35. Колонии трансформантов одинакового размера отбирали на среде без урацила или без лейцина, субклонировали в неселективных для плазмидных маркеров условиях и анализировали проявление нонсенс-мутаций в клонах, потерявших плазмиду. Результата эксперимента представлены в таблице 3. Нэ среде без лейцина, то есть при более высокой копийности плазмиды, [psi*] возникает достоверно чаще, чем на среде без урацила. Более низкая частота индукции [psi*] на среде без урацила по сравнению с приведенном в таблице 2 связана с различием в проведении экспериментов: при работе с плазмидой pEMEL-SUP35

Таблица 1.

Специфичность супрессии мутаций lys2 многокопийным SUP35, фактором (psi*) и рецессивными супрессорами sup35 и sup45.

Положе- Количество Супрессируемость

Мутация ние в независимо многоко-

LYS2 отобранных Ipsi*] пийным sup35 sup45

мутантов SUP35

TTA(Leu)-»TAA 3119 1 + + + +

TGG (Trp) ->TAG 3221 3 + + + +

3164 1 + + + +

TGG(Trp) -+TGA 3034 5 + + + +

3222 4 + + + +

31 65 49 + + + +

CGA(Arg) -»TGA 2865 2 + + + +

GGA(Gly) -»AGA(Arg) 2938 6 - - - -

GGA(Gly) -XjAA(GIu) 2939 3 - - - -

GGT (Gly) -KàAT (Asp) 3206 4 - - - -

GGC(Gly) -»GAC(Asp) 2948 2 - - - -

GCG(Ala) ->GTG(Val) 3209 1 - - - -

Таблица 2.

Индукция [psi*] многокопийным геном SUP35.

Штамм Плазмида Проверено трансформантов Отобрано Leu" клонов

всего [psi*](%)

ЗЭГ-Д373 (LEU2 SUP3S] 35 601 63 (10,5%)

ÎLEU2) 29 414 2 (0, 51)*

Л28 [LEU2 SUP35] 16 239 51 (21,4%)

(LEU2) 15 223 0

* среди 114 проанализированных Leu* субклонов не обнаружено ни одного [psi*]

Таблица 3

Влияние кспийности SUP35 на возникновение [psi*] в штамме ЭЗГ-Д373.

Плазмида Среда Кспий-ность Проверено трансфор-мантое Отобрано клонов

всего [psi*] (%)

[URA3 LEU2-d SOP35] -Ura ~ 10 16 159 5 (3,1%)

[URA3 LEU2-d] -U га ~ 10 14 122 0

[URA3 LEU2-d SUP35] -Leu ~ 100 14 125 39 (31,2%)

[URA3 LEb2-d] -Leu - 100 3 172 1 (0,6%)

отобранных трансформантов не инкубировали дополнительно на селективной для плазмиды среде, так как трансформанты, содержащие плазмиду pEMBL-SUP35, на среде без лейцина растут очень медленно, а сразу же переносили на неселективную среду. В отдельном опыте (данные приведены в диссертации) показано отсутствие различий в частотах индукции [psi*] плаэмидой pEMBL-SUP3S на среде баз урацила и ранее использованными плазмидами с SUP35 на среде без лейцина при одинаковых условиях эксперимента. В трансформантах центромерной плазмидой с функциональным геном SUP35 (сконструирована Ю.О. Черновым) , содержащейся в количестве 1-2 копии на клетку, [psi*] не индуцируется.

В дальнейшем для анализа индукции [psi4] в различных штаммах плазмидами, содержащими ген SUP35 и ген URA3, использовали также экспресс-тест (рис.2). Дрожжи трансформировали плазмидой с SUP35 ([SUP35 URA3J) и контрольной плазмидой ([URA3J). Трансформантов инкубировали на среде без урацила и затем - на среде с фтороротовой кислотой, вызывающей селективную гибель содержащих плазмиду Ura' клеток. Сохранившиеся клетки, потерявшие плазмиду, переносили на среду для анализа супрессии. Супрессорный эффект многокопийного SUP35 проявлялся в виде супрессии нонсенс-мутаций в трансформантах [SUP35 URA3], а остаточная супрессия после потери плазмиды была

г-Ъ>- (-Ut.) © (FÔA) ©

>№>) О

[URA3]

I- (-Adc) Q <->(-Ade)

Г> (-Un) О (FOA)© -j->(-lTr») О

-X-Ade) О

М-АЛс) О

Обозначения:

^^ - рост ^ - отсутствие роста

(-ига) ~ среда без ураиила (селективная для плазмиды)

(-А«1с) - среда без адекина (74-Д694 содержит суг.рессируемую мутацию асЗе!-14) (ГОЛ) - среда с 5'- фтсроротовоЯ кислотой (для отбора клонов, потерявших ллаэмилу) [иИЛЗ 5иР35] - плаэмида, содержащая ген таАЗ и ген ЕОР35 дикого типа [( КА3] - плазм^да, содержащая ген иЯАЭ (контроль)

Рис.2 Схема экспресс-теста для анализа индукции [рэ1+] плазмидами, содержащими БОТ35 и 1ЖАЗ (на примере штамма 74-Д694).

обусловлена индуцируемым [psi*] и элиминировалась после пассирования на среде с 5ыМ гуанидингидрохлорида.

Амплификация функционального фрагмента гена SUP45 (плазмида сконструирована М.И.Трофимовой) и гиперэкспрессия кДНК гена SUP46 (плазмида предоставлена Г.Ныэнэмоы) к индукции [psi*] не приводили.

ХАРАКТЕРИСТИКА [pai*] ФАКТОРОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ПРИ ГИПЕРЭКСПРЕССИИ SUP3S. Нами бьша проведена подробная характеристика [psi*] клонов, индуцированных при гиперэкспрессии SUP35 в различных штаммах дрожжей (53Г-Д373, 31В-Д543, Л28, 74-Д694) . Во всех штаммах индуцируемые [psi*} клоны имели сходные фенотипические проявления с [psi'J клонами, которые изредка возникают в этих штаммах спонтанно.

Для штамма ЗЭГ-Д373 было показано, что [psi*] фактор, индуцированный при увеличении дозы SUP35, способен повышать супрессорный эффект SUP16, тем самым воспроизводя фенотип, на основании которого [psi*] фактор был впервые описан Коксом (Сох, 1965). В этом эксперименте исходный ЗЭГ-Д373 и [psi*] клоны ЗЭГ-Д373, индуцированные при гиперэкспрессии SUP35, были скрещены с [psi"] штаммом, несущим мутацию ade2-l(UAA) и доминантный тРНК/*р супрессор SUP16 (SUC5) (штамм ЭЗГ-Д373 содержит несупрессируемую мутацию в гене ADE2). В гибриде, полученном при скреииЕании с исходным ЗЭГ-Д373, SUP16 не был способен супрессировать ade2-l, тогда как в гибридах, полученных при скрещивании с [psi*] клонами, супрессия ade2-l наблюдалась .

В то же время, эффективность супррссии варьировала у [psi*] клонов, индуцированных в одном и том же штамме (ЗЭГ-Д373 или 74-Д694) . Б таблице 4 представлены данные по индукции [psi*] различного проявления в штамме 74-Д694 под действием URA3-GAL::SUP35 (см.стр.13). Для детальной характеристики были отобраны 8 [psi'] клонов: 1 высокой эффективности (+++), 4 средней эффективности (++) и 3 низкой эффективности (+). Было показано, что эффективность супрессии является ыитотически стабильным признаком, так как сохраняется при четырех последовательных субклонированиях.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ УЧАСТКА ГЕНА SUP35 ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА ИНДУКЦИЮ [psi*l ■ Ген SUP35 кодирует фактор трансляции размером 685 аминокислот. Последовательность белка Sup3S может быть разделена на 2 участка - уникальный N-концевой размером 253 аминокислоты и С-концевой участок, гомологичный фактору элонгации EF-la, С-концевой домен выполняет жизненно-важную функцию и является эволюционно-консервативным, а N-концевой домен вариабелен у различных организмов и не нужен для компенсации летдльного эффекта нулевой аллели гена SUP35 (Ïer-Avanesyan et al, 1Ь93; Kushnirov et al, 1990).

Для локализации участка гена SUP35, отвечающего за индукцию (psi*], использовали набор гшазмид на основе вектора pEMBL-yex4, содержащих различные фрагменты SUP35. Во асех конструкциях были сохранены собственные промотор и терминатор SUP35 и наблюдалась продукция соответствующего фрагмента Оелка Sup35 (Ter-Avanesyan et al, 1993) . Плазмидами трансформировали штаммы дрожжей ЗЭГ-Д373 и 74-Д694, содержащие ген SUP35 дикого типа. Индукцию Ipsi*] определяли либо в качественном экспресс-тесте (см.рис.2) , лиОо количественно (аналогично току, как описано на стр.7). Копийность плазмид регулировали, выращивая трансформантов на среде без урацила или без лейцина (и.1.стр.7) .Результаты экспериментов представлены на рисунке 3.

Данные по супрессии нонсенс-мутаций при амплификации фрагментов SUP35 в основном соответствуют опубликованным ранее (Кушниров и др., 1990; Ter-Avanesyan et al, 1993), однако, в натмх экспериментах mli наблюдзли супрессию при амплификации фрагмента ABst, а эффективность супрессии при амплификации фрагмента ABstAHind была выше, чем при амплификации всего гена SUpjb, что, по-видимому, обусловлено подбором супрессируемых маркеров и различиями в генотипах штаммов. Таким образом, не нарушающая рамку считывания делеция участка ые-гду дв>-мя BstEII сайтами, элиминирующая участок между аминокислотными остатками 21 и 69 в N-концевой части гена SUP35, не препятствует нонсенс-супрессии при амплификации фрагментов SUP35.

Анализ индукции Ipsi*] при гиперпродукции фрагментов Sup35 показал, что минимальный фрагмент, достаточный для индукции Ipsi*] -ДВа12 - включает первые 154 аминокислоты белкового продукта. Этот фрагмент не содержит участков гомологии EF-la и недостаточен для осуществления функции SUP35 необходимой для жизнедеятельности (Тег-Avanesyan et al, 1993). С другой стороны, гиперпродукция фрагментов SUP35, не содержащих первых 123 (Д2АТО или первых 253 (ДЗАТО аминокислот, не приводила к индукции [psi*], несмотря на наличие в них всего района гомологичного EF-la. Более того, варианты полного гена SUP35 (ABst) или его фрагмента (ABstAHind), содержащие делецию участка между двумя BstEII сайтами, не нарушающую рамку считывание, но элиминирующую участок белка между аминокислотными остатками 21 и 69, не были способны индуцировать [psi*]. Таким образом, гиперпродукция N-концевого домена размером не более 154 аминокислот доста точна, а участок внутри этого домена между позициями 21 и 69 (BstEII район) необходим для эффективной индукции (psi*] .

В отсутствие BstEII района не наблюдается также и ингибирова-ние роста трансформантов при сверхамплификации плазмид с фрагментом гена SUP35 на среде без лейцина, что указывает на возможную связь этого фенотипа с индукцией [p.3i*].

Таблица 4

Эффективность супрессии в различных [psi*] клонах штамма 74-Д694, индуцированных при увеличении дозы гена SUP35.

Наличие [psi*] Количество клоноп Характеристика

цвет (YPD) рост (-Ade)

[psi*] 36 5 розовый +

28 светло-розовый ++

3 белый +++

[psi"] 1 (контроль) красный -

Примечания: штамм 74-Д694 содержит супрессируемую мутацию adel-14(UGA), которая проявляется в отсутствии роста на среде без адени-на (-Ade! и накоплении красного пигмента на среде YPD; подавление мутации приводит к менее интенсивному накоплению пигмента и росту на среде без аденина, причем, цвет (розовый, светло-розовый, белый) и скорость роста на среде без аденина (+ - на 4 - 5 день, ++ - на 3 день, +■++ - на 1 - 2 день) отражают эффективность супрессии.

Bs M Bs II R Rc Tip llp S

чг ! [

л Bu

АТС A TG AT G

ЛВЧЛНЫ _Q □

—I С

Л 2ATG A 3ATG

A BaLZ | |

Л Bel А При ASal

Рис.3. Локализация участка SUP35, отвечающего за индукцию [psi*] . С-концевой домен гомологичный EF-la заштрихован. Обозначения сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами (в скобках - позиции сайтов) : Bs-BstEII (58, 202), H-HindIII (98, 433), B-Ball (461, 1175), Вс- Bell (713), Hp-Hpal (751, 1237), S-SalGI (1444). Обозначения в графе "Супрессия": "-"- отсутствие супрессии, "+"- слабая, "++"-средняя, "+++"- сильная супрессия (по скорости роста на среде для анализа проявления нонсенс-мутаций)

Индукция Подаалеияс роста при саерхячлл)». фнкяцни Сулрессяя

+ + ++

- - +

т +++

+ + +++

+ + +++

+ + ++

+ + +++

Чтобы проверить необходимость участка BstEII для поддержания (psi*"], хромосомнач аллель SUP35 в штамме ¡psi*] ЗЗГ-ДЗТЗ, была замещена на аллель, содержащую яелецию BstEII района. Замещение привело к потере [psi*]. Этот результат согласуется с данными Тер-Аванескна с соавторами (Ter-Avanesyan et al, 1994), которые показали, что делеция всего N-концевого домена Sup35 или только его BstEII фрагмента в штамме 5В-Н19 является рецессивной рпп; (psi по more) мутацией, то есть блокирует поддержание [psi*] .

ИНДУКЦИЯ [psi*] ПРИ ГУШЕРПРОДУКЦИИ ТРАНСКРИПТА SUP35. Индукция [psi*] многокопийным геном SUP35 дикого типа может быть обусловлена либо увеличением количества копий гена SUP35, либо вызванной этим его гипер-жспрессией. Чтобы выбрать верное объяснение, бьша использована центромгрная (однокопийная) плазмида, URA3-GAL::SUP35, содержащая ген SUP35 под контролем индуцибельного GAL1/GAL10 (далее GAL) промотора Saccharomyces cerevisiae. Так как большинство штаммов, использованных нами ранее, оказались Gal" (то есть не росли на среде, содержащей галактозу а качестве единственного источника углерода) , Gal* штамм 74-Д694 был сконструирован специально для этих экспериментов. Было использовано два способа индукции GAL промотора: 1) на среде с галактозой в качестве единствеш-ого источника углерода, 2) на среде с ß-эстрадиолом (см. Материалы и методы). Схема эксперимента представлена на рисунке 4. Дрожжи трансформировали плаэмидой URA3-GAL: : SUP35 и контрольной плазмидой (.[URA3]). Трансформантов переносили на среды, на которых GAL промотор был индуцирован. Рост на среде без аденина в результате подавления мутации adel-14(UGA) свидетельствовал о супрессорном эффекте при гиперпродукции транскрипта SUP35. Увеличение количества транскрипта SUP35 в условиях индукции GAL 'промотора было подтверждено в экспериментах по РНК-ДНК гибридизации (см.ниже, табл.5). Затем трансформантов переносили на среду, на которой GAL лромотор был репрессирован. Остаточный рост на среде без аденина в условиях репрессии промотора свидетельствовал об ин,яукции [psi*] и элиминировался после инкубации на среде с 5мМ гуанидингидрохлорида. В контрольных экспериментах с исходным вектором, не содержащим SUP35, а также с плазчидой URA3-GAL::SUP35, постоянно находившейся в условиях репрессии GAL промотора, индукции [psi*) не наблюдали.

ГИПЕРПРОДУКЦИЯ БЕЛКА Бир35 НЕОБХОДИМА ДНЯ ИНДУКЦИИ [psi*] ■ Индукция [psi*] при гиперпродукции транскрипта SUP35 может быть обусловлена либо увеличением количества копий SUP35 мРНК, либо гиперпродукцией белка Sup35 в результате трансляции этих mí'HK. Для выяснения пр:ынни индукции [psi4] в ?0 колене гена STJP35 била по-

РЕПРЕССИЯ ИНДУКЦИЯ РЕПРЕССИЯ GAL GAL GAL •(-Lira) 0 (-Ura) © -^ (-Ade) С

" (-Ade) О • (-fra) ©

►(-Adc) О

►(-Ade) © ■ (-Ura) ©

►(-Ade) О

(-Ade) О

Рис.4. Схема анализа индукции {psi*} при гиперпродукции транскрипта SUP35. Обозначения см.рис.2.

лучена мутация sup35-£20 сдвига (+1) рамки считывания, приводящая к изменению в последовательности гена SUP35;

ATG TCG GAT ТСА ААС CAA GGC ЛАС ДАТ CAG CAA ААС TAC CAS CAA Met Ser Asp 8er Asn Gin Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr Gln Gln TAC AGC CAG AAС iGGT AAC ... Tyr Ser Gln Asn Gly Asn ...

ATG TCG GAT TCA AAC CAA GGC ААС ДАТ CAG CAA AAC TAC CAG CAA Mot Ser Asp Ser Asn Gln Gly Asn Aan Gln Gln Asn Tyr Gln Gln TAC AGC CAG AAC GGC* TAA С . .. Tyr Ser Gln Asn Gly

Для получения мутации sup35-f20, Sacl-Xbal фрагмент гена SÜP35 из плазмиды URA3-GAL::SUP35 был клонирован в фагыиде pID9 (рис.5). Сайт-специфический мутагенез проводили по U-ДНК методу (Kunkel, 1985). Мутантная фагмида pIDlO была идентифицирована по исчезновению сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазой BstEII. Сиквенс мутантного фрагмента подтвердил наличие вставки цитидина в заданной позиции. Затем ыутантный Sael-Xbal фрагмент SUP35 был вырезан из фагмиды pIDlO и вставлен в плазмиду URA3-GAL::SUP35 вместо соответствующего фрагмента дикого типа (плазмида pID12) . Результаты эксперимента (табл.5) свидетельствуют, что гиперэкспрессия мутантной аллели sup35-f20 не приводит к увеличению количества белка Sup35 и к индукции [psi*) (так же как и к супрессии нонсенс-мутаций) .

UIUUI |! RU OALrSl.T»! ' ♦•«wulfaSISïH

Рис.5. Схема направленного мутагенеза в гене SUP35.

Гиперпродукция мутантной мРНК SUP35 в условиях индукции GAL промотора была подтверждена в экспериментах по РНК-ДНК гибридизации. Сравнивая увеличение количества мутантной мРНК sup35-f20 и мРНК SUP35 дикого типа, мы обнаружили, что мутантной мРНК при

одних и тех же условиях индукции было меньше, чем мРНК дикого типа (таОл.6). Причиной этого, по-видимому является сниженная стабильность мРНК sup35-f20, в которой в результате мутации сдвига считывания возникает нонсекс-кодон (Leeds et al, 1991). Однако, регулируя уровень индукции GAL промотора (см. Материалы и методы), мы показали, что увеличения количества мРНК дикого типа в 6 раз было достаточно для индукции [psi*] , а увеличение количества мутантной мРНК в 19 раз к индукции [psi*] не приводило. Таким образом, именно увеличение количества белка Sup35 необходимо для появления [psi*] фактора, который в дальнейшем сохраняется и в отсутствие гиперпродукции í;tip35.

Таблица 5

Необходимость гиперпродукции белка Sup35 для индукции [psi*]

liconeaiyenjH Плазмида

указатель [ШАЗ] [ТОАЗ GñL::sup35-f20] [URA3 GAL::SUP35]

Индукция [psi*] - - +

1\терпрод/кдая - + • +

SUP35 мРНК в i

ГЪтерпродукция - - ' +

Sup35 белка

Примечание: схема, использовнная для проверки индукции [psi*], аналогична приведенной на рисунке 4.

Таблица 6

Увеличение количества мРНК sup35-f20 и SUP35 дикого типа в условиях индукции GAL промотора.

Номер опыта Способ индукции GAL промотора Увеличение количества мРНК

sup35-f20 SUP35 дикого типа

1 галактоза. ~ в 2 раза - в 6 раза

2 р-эстрадиол 10 нм ~ в 10 раз ~ в 18 раз

3 ; Р-эстрадпол 20нМ - е 19 раз - Е 76 раз

4 р-эстрал;:ол 50нМ - в 13 раз . ~ в 22 раз

5 Р-эстрада:ол ЮОнМ ~ в 14 раз ~ в 15 раз

Примечание: концентрации ($-эстрадиола 50 и ЮОнМ ингибировали рост дрожжей в жидких средах; неспецифический токсический эффект высоких концентраций р-эстрадиола и снижение эффективности индукции САЬ промотора при концентрациях р-эстрадиола выше оптимальной описаны в литературе (Ьошг1оп ей а1, 1993).

ОБСУЖДЕНИЕ

Омнипотентную супрессию при увеличении дезы гена зир35 дикого типа мы обнаружили в ходе выполнения дипломной работы (Деркач, 1988; Чернов и др., 1988; СЬегш^ et а1, 1992). Показанное в ходе данной работы сходство специфичности супрессии многокопийного гена

SUP35 со специфичностью супрессии уже изученных омнипотентных суп-рессоров [psi*] V мутантов sup35 и sup45 позволяет предположить сходство механизмов супрессии и взаимсдействие [psi*], Sup35 и Sup45 в процессе контроля точности трансляции.

Мы показали также, что увеличение копийности гена SUP35 индуцирует возникновение de novo экстрахромосомного фактора [psi*] . Эффект индукции [psi*], по-видимому, геноспсцифичен: при увеличении дозы функционального фрагмента гена SUP45 или кДНК копии гена SUP4 6, мутации в которых приводили к омнипотентной супрессии, индукции [psi*] не наблюдали. Это позволяет предположить физическую взаимосвязь SUP35 и [psi*]. В то же время, [psi*J не является результатом экстрахромосомной амплификации SUP35. Принимая во внимание то, чго различным исследователям не удалось связать [psi*] ни с одной из извёсгных молекул ,ДНК или РНК, а также то, что [psi*] передается при цитодукиии (см.обзор Сох et al, 1988), можно говорить о сходстве [psi*] с прионами млекспитадаих (см.обзор Prusiner et al, 1991). Инфекционным агентом при прионовых заболеваниях является приоНовый белок (РгР), колируемый клеточным геном. В пораженных клетках РгР представлен в необычной протеазо-устойчивой конфор-лации PrPSc. ГрионоЕая модель постулирует, что при попадании в нормальную клетку PrPi;" изменяет конформацию нормального белка РгР, превращая его в PtPs". Таким образом, изменение конформации белка воспроизводится без каких-либо изменений в нуклеотидной последовательности гена РгР. Существенно, что гиперпродукция нормального Селка РгР индуцирует возникновение прионовых заболеваний [Westawav eL al, 1994): очевидно, при увеличении количества белка увеличивается вероятность конформационных изменений, приводящих к появлению PrPs,:. Этот пффект аналогичен индукции [psi*] при гиперпродукции Sup35. На основании сопоставления' работы Веставей и соавторов (Westaway et al, 1994) с нашими данными об индукции ¡psi*] многокопийным SUP35 (Chernoff et al, 1993) Р.Викнер (Wickner, 1994) предположил, что [psi*] фактор является конформационным вариантом белка 5ир35, аналогичным ■ прионам млекоьитающлх. Тот факт, что именно гиперпрод/кция белкового продукта Sup35 (а не само по себе увеличение копийности гена или количества транскрипта) приводит к индукции [psi*], л :лдет прионовую модель [psi*] феномена еще более убедительной. Возможность индукции [psi*] клонов различного проявления в одном и том же штамме дрожжей, а также показанное О.H.Тиходеевым сохранение различий в проявлении [psi*] факторов при перенесении их методом цито-дукции из одного дрожжевого штамма в другой (Тиходеев, 1990), подчеркивает сходство [psi*] с прионами млекопитающих. Длл прионовых заболеваний, таких как спорадическая и наследуемая формы болезни

Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Герштонна-Штросслера-Иейнкера и других, характерна вариабельность инкубационного периода, которая, по ине.иц Прузинера (Prusiner, 1995), является следствием существования различных прионовых конформаций белка РгР, вызывающих одно и то же заболевание. Аналогично, (psi*) различного проявления, возможно, являются различными лрионоподобными конформацияыи Sup35.

■ Мы проанализировали инду:;цию [psi*] ¿актора при увеличении дозы фрагментов гена SUP3S и показали, что сверхпродукция N-хонцевого участка размером в 154 аминокислоты достаточна, а сверхпродукция участка между аминокислотами 21 и ь9 необходима для индукции [psi*] фактора. Эти результаты согласуются также с данными лабораторий Кокса (Doel et al, 1994) и Тер-Аванесяна (Ter-Avanesyan et al, 1994), показавших, что точковая мутация и делеции в этой части гена приводят к потерям [psi*]. Смнипотентная супрессия, наблюдаемая при гиперпродукции Sup35 и некоторых его фрагментов, недостаточна для индукции [psi*]: выявлены фрагменты SUP35 (ABst и ABstAHind), которые при амплификации вызывают омнипотектную супрессию, но не индуцируют [psi*]. Причиной возникновения [psi*], по-видимому, не является общее снижение уровня точности белкового синтеза при гиперпродукции Sup35. Мы предполагаем, что при гиперпродукции белка, содержащего N-концевой домен Sup35, он накапливается в клетке в нормальной, а возможно( и в измененной (альтернативной) конформации, что приводит к омнипотентной супрессии. Однако, для возникновения [psi*] должна произойти стабилизация альтернативной конформации Sup35, для чего и. необходим участок между амнокислотными остатками 21 и 69. '

При анализе гена SUP35 был выявлен участок, кодирующий аминокислотные повторы сходные по структуре с аминокислотными повторами в N-концевой части белка РгР (Tuite, 1994; Сох,у.1994). Этот участок захватывает ; кодоны с 56 по 97 и частично перекрывается с BstEII районом необходимым для индукции [psi*] . Как и участок повторов РгР, N-концевая часть Sup35 богата тирозином, глицином, аспараги-HO.S4, глутамином и яродином и состоит почти исключительно из р. слоев. Существенно, что участок аналогичной : структуры обнаружен и в. N-конце Sup35 Pichia pinus, несмотря на отсутствие гомологии аыно-кислотных последовательностей в остальной части N-концевых доменов Sup35 Saccharomyces cerevisiaé и Pichia pinus. Таким образом, есть основания полагать, что этот участок Либо необходим для стабилизации альтернативной конформации Sup35, либо сам изменяется в ходе "прионизации" и участвует в дальнейшем изменении конформации клеточных белков.

19 ВЫВОДЫ

1. Показано сходство специфичности супрессии ыногокопийного SUP35 дикого типа, [psi'l и мутаций в генах SUP35 и SUP4S. .

2. Обнаружено, что многокопийный гем SUP35 индуцирует появление неменделевсксго фактора [psi*] .

3. Показано, что в одном и том же штамме дрожжей при гиперэкспрессии гена SUP35 .могут индуцироваться [psi*] факторы различного проявления.

4. Показано, что индукция [psi*] и супрессия вызваны гиперпродукцией белка Sup35, а не увеличением копийности гена или его транскрипта. .

5. Выявлены делеционные варианты гена SUP35, которые при сверхэкспрессии супрессируют нонсенс-мутации, но не индуцируют [рэП .

6. Показано, что сверхпродукция N-концевого участка Sup35 размером в 154 аминокислоты достаточна, а сверхпродукция участка между аминокислотами 21 и 69 необходима для индукции tpsi'} фактора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО TEKS ДИССЕРТАЦИИ

1. Inge-Vechtomov S.G., Chernoff У.О., Derkatch X.L., Richter G., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. SUP2 (SUP35) - psi-factor interaction in Saccharomyces cerevisiaa: incompatibility and interdependency // Yeast.1990.v.6.p.121, late submissions (Abstracts of XV Conference on yeast qenetios and molecular biology, Haague, Netherlands, 1990).

2. Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Смирнов В.Н., Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Новикова О.Н., Инге-Вечтомов С.Г., Нейстат М.А., Толсторуков И.И. Сравнительный анализ структуры генов SUP2 дрожжей Pichia pinus и Sacchuromyces. cerevisiae // Молекулярная биология. 1990. Т. 24 .С. 1024-1036.

3.Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Didichenko S.A., Smirnov V.N., Chernoff Y.o., Derkach I.L., Novikova O.N., Inge-Vechtomov S.G., Neistat M.A., Tolstorukov I.I. Divergence and Conservation o-SUP2 (SUP35) Gene of' Yeasts Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae // Yeast.1990.V.6.P.461-47?.

4.Chernoff Y.O., Inge-Vechtorov S.G., Derkach T.L., Ptyushkina M.V... Tarunina O.V., Dagkesamanskaya А.Ч., Ter-Avanesyan M.D. Dosage-Dependent Translation Suppression in Yeast Saccharomyces cerevisiae // Yeast.19?2.V.8.P.489-499.

5. Inge-Vechtomov S.G., Tarunina O.V., Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A R., Ter-Avanesyan M.D. Suppressor mutations and ^-induction utilizing SUP2 gene fragments in yeast // The genetic messenger: The daily newspaper of the XVII International Concjress of Genetics, Ai-gust 19, 1993 (Abstracts of XVII Congress of Genetics, Pirmingham, Great Britain, 1993).

6. Chernoff "i.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy ЕПР35 gene induces de novo appearance of psi-lika factors in yeast Saccharomyces cerevisiae // Current Genetics.1993.V.24.P.268-273,

Подписано к печати 15.05.95 Заказ 210 Тираж 100 Объем I п.л. ГШ СПГУ. 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова,6.