Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие омнипотентных супрессоров SUP35 и SUP45 с цитоплазматическими детерминантами у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие омнипотентных супрессоров SUP35 и SUP45 с цитоплазматическими детерминантами у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"



V- •"

о ^.Кардиологический научный центр

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

на правах рукописи

Дагкесамдвскяя Лдиля Рустаиовпа

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОМНИПОТЕНТНЫХ СУПРЕССОРОВ

БиР35 И 51!Р45 С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ У ДРОЖЖЕЙ ЗассИаготусез сегеьЫаз.

Специальность 03.00,15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1593

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Кардиологического научного центра РАМН

Научный руководитель доктор биологических наук

Тер-Аванесян М.Д.

Официальные оппомаггы доктор биологических наук

профессор Толсторуков И.И.

кандидат биологических наук Арман И.П.

Ведущая организация кафедра генетики Московского

государственного университета.

Защита состоится "

« г.

в часов на заседании специализированного Ученого Совета Д 098.12.01 в НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов но адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ генетики н селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " " ' "1993 года

8

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение процесса биосинтеза белка входит в число наиболее фундаментальных проблем современной молекулярной биологии. Генетический подход к этой проблеме заключается в мутационном маркировании генов, контролирующих различные этапы трансляции. Выявление таких генов осуществляется путем отбора "супрессорных мутаций, повышающих неоднозначность трансляции, а также мутаций, модифицирующих эффективность супрессии. Эти исследования позволяют идентифицировать новые компоненты аппарата белкового синтеза, трудно обнаруживаемые в силу различных причин с ломощью обычных биохимических подходов, а также изучать функциональную роль этих компонентов in vivo. Возникающие супрессорцые мутации могут быть кодон-специфнческими (мутации в генах т-РНК) к омнилотентныин, су премирующими одновременно ионсенс-кодоны различных типов. Изучаемые в данной работе гены SUP35 к SUP45 относятся к группе омннпотентных супрессоров, способных взаимодействовать со всеми тремя типами нонсенс-кодонов. Такие гены в большинстве случаев кодируют белки, принимающие участие в определении общего уровня точности белкового синтеза. К настоящему времени у дрожжей-сахаромицетов идентифицировано около 10 хромосомных локусов, мутации в которых приводят к омшшотентной супрессии. Кроме того свойствами ошшпотентиого супресс- >ра обладает нехромосомная детерминанта ¡psi+l. Молекулярная природа этой детерминанты, несмотря на довольно обширные сведения о различных ее свойствах и характере наследования, до -сих пор неизвестна.

В предыдущих исследованиях было показано, что мутации в генах SUP35 и SUP45 влияют на функционирование рибосом и приводят к понижению точности трансляции в бесклеточных системах белкового

синтеза (Surguchov et al, 1984). Было также обнаружено, что продукты генов SUP35 и SUP45 способны прочно связываться с цитоплазматичсскими рибосомами (Didichenko, Ter-Avanesyan, 1990). Анализ структуры этих генов и соответствующих им белков позволил предположить, что они кодируют новые факторы трансляции: С-концевая часть белка Sup35 оказалась высоко гомологичной фактору элонгации EF-lct, белок Sup45 содержит область, гомологичную. некоторым т-РНК-скнтетазам (Kushnirov et al, 1988, Breining, Piepersberg,1988). Подробное исследование генов SUP35 и SUP45, кодируемых ими белков и их взаимодействия с нехромосомными детерминантами позволит выяснить роль всех этих компонентов в процессе трансляции, получить новые сведения о механизме контроля точности этого процесса.

Цель и задачи исследования, Целью настоящей работы являлось изучение свойств нулевых аллелей генов SUP45 и SUP35, взаимодействия этих генов с цитоплазматичсскими детерминантами, а также выяснение функций различных доменов гена SUP35: Новизна результатов. Показано, что нулевые аллели генов SUP35 и SUP45 являются рецессивными леталдми. Нулевая аллель гена SUP45 имеет доминантные проявления , зависящие от присутствия детерминанты lpsi+). Обнаружено, что сверхэкспрессия гена SUP35 приводит к подавлению роста штаммов [psi+J. В гене SUP35 выявлено два функциональных домена. Сверхэкспрессия К-концевого домена приводит к омнилотеиткой супрессии, свидетельствующей о повышении уровня неоднозначности трансляции. Наличие этого домена необходимо для существования фактора [psi*]. С-коицевой домен выполняет жизненно-важную функцию. Деления N-концсвого домена вызывает увеличение точности трансляции, проявляющееся в антисупрессии.

Практотескяя ценность работы, Полученные данные о взаимодействии различных хромосомных и цнтоплазматических факторов, влияющих на точность трансляции важны для понимания механизмов контроля точности, для поисков возможностей влиять на ее изменения. Дпррбацня работы. Результаты работы были представлены на XIV Генетическом конгрессе в Торонто, ( Канада , 1988г), XV,XIV Международных конференциях по генетике дрожжей и молекулярной биологии ( Гаага, Нидерланды, 1990г. и Вена, Австрия, 1992г.), на симпозиуме НАТО по белковому синтезу у дрожжей ( Кентербери, Англия , 1992г.), а также на XV Интернациональном Ботаническом конгрессе ( Иокагама, Япония, 1993г.)

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 8 статен и 7 тезисных сообщении.

Структура и объем работы, Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты," "Обсуждение", "Выводы." Работа изложена на 87 страницах, включая 10 рисунков и 2 таблиц и и список литературы, содержащий 112 ссылок.

Обзор литературы

Обзор литературы состоит из двух разделов. Первый посвящен известным к настоящему времени хромосомным локусам, в которых возникают омиилотентные супрессорные мутации. Во втором дается характеристика цнтоплазматических детерминант,' обладающих1 супрессорной активностью и взаимодействующих с хромосомными супрессорами.

Материалы и методы исследования

В работе был» использованы следующие штаммы:

DBY74fi МЛТа his3-Al Ieu2-3,U2 ura3-52 trpl-289 Ipsil

AH216 MATa his3-l 1.15 Ieu2-3.112 pho3 pho5 |psi+l

483-2D MATaSUQ5ade2-l lysl-1 canl-100 |psi )

118' МЛТа/MATa his3-Al/his3-Al Ieu2-3,112/Ieu2-3,112

ura3-52/ura3-52 1ф1-289/1гр1-289 Ipsi4]

2G-DM8* МЛТа pheAtO ade2-144,7l7 his7-1 Iys2-187 ura3-52 trpt-289

5B-II19* MATa SUQ5 ade2-l canl-100 Ieu2-3,1I2 ura3-52 Ipsi+1

tA-lit9* МЛТа SUQ5 ade2-1 Iysl-1 his3-1t,15 Ieu2-3,tt2 [psi+!

SL 578-3A МЛТа met8-1 leu2-l 1ф5-48 hisS-2 lysM [psiiicU4

SL Ш-ЗА MATa met8-1 leu2-l trpl-1 adc3-26 ilvl-1 his5-2 lysl-1 tyr7-l lpsi+}(eta-]

370 MATa met8-t leu2-t 1ф1-1 adc3-26 ilvl-1 his5-2 lysl-1

tyr7-l |psi']|eta ]

10B-H49* MATa leu2-3,112 lysl-1 his3-11,!5 karl-1 ade2-t SUQ5 lpsi+J

J15-3C MATa trp5-2 met4-l ade2-1 lys2-l cant-100 ura3 leul2 SUP4

5-ШЗ* MATa ade2-1* his5-2* ura3-52 SUP2 50-1144* MATa 1ф!-289а his4-580a ura3-52 SUP4-3

штаммы, полученные в данной работе

В работе были использованы стандартные методы генетики дрожжей (Sherman et al, 1988, Захаров н соавт. 1984). Трансформацию^ дрожжей проводили согласно (Ito et al., 1983) трансформацию E.coll по методике (Hanahati, 1985).

Для получения frho"J мутантов штаммы клонировали на среде, содержащей 60 мг/л бромистого зтидия. Выросшие клоны проверяли 115 способность расти на среде с глицерином в качестве единственного

источника углерода. 90% выросших клонов не росли на этой среде, т.е. проявляли дыхательно недостаточный фенотип.

Для проведения цитодукцин штаммы донора цитоплазмы и реципиента смешивали на среде YEPD и инкубировали при температуре 30°С в течении 10 часов. Затеи выросшую культуру перепечатывали на среду, селективную для реципиента, получившего цитоплазму донора. Отдельные клоны полученного цитодуктанта проверяли по маркерам и брали в работу.

Для элиминации детерминанты {psi"*"| штаммы [psi*] выращивали на среде VEPD, содержащей 3 мМ гуаиидннгидрохлорида. Выросшую культуру клонировали на среде YEPD и отбирали клоны, которые приобрели красную окраску и потеряли способность расти на среде без аденина, поскольку белая окраска исходных штаммов была обусловлена супрессией охр-муташш ade2-t геном SUQ5 в присутствии фактора [psi+j.

Выделение ДНК, рестрикцию, лигирование, гибридизацию ДИК-ДИК проводили как описано в руководстве Маннатиса с соавторами (Maniatis et al.,1982). Геномную ДНК дрожжей выделяли согласно руководству Шермана с соавторами (Sherman et al., 1986).

Схема конструирования плазмнд с нулевыми аллелями генов sup45 и sup35 приведена на рис.1. В кодирующую область гена SUP45 .(на плазмиде он обозначен SUP1) по сайгу EcoR! вставлена последовательность гена TRP1, а ген SUP35(SUP2) нарушен вставкой фрагмента HindlII-HindlIl, содержащего ген URA3. Полученные таким образом плазмиды p5supl::TRPl и pt7sup2::URA3 использовали для создания штаммов дрожжей с нулевыми аллелями генов SUP45 и SUP35.

а

pPBMie

YRpT

-4—i-

РХСХЬ- E В p P

p5sup1::TRP1 Ес^ч XeIow

С E

P X С Xb

E В

P

pSTR4

РЕ P X HPH S E В S

pILI

i— P

HPH

p17sup2::URA3

Hmdni^ ^ ницм

7

i—m—щ

PEP X HP H

E В S

Рисунок 1. Конструирование плазмвд, несущих аллели supl::TRPl (нулевая аллель гена SUP45>;(a) к sup2::URA3 (нулевая аллель гена SUP35);(6). Тонкая линия • последовательность бактериальной ДНК; волнистая линия - фрагмент гена LEU2 дрожжей; толстая линия - гены SUPKSUP45) (а] либо SUP2(SUP35) (б] дрожжей; заштрихованная линия - 2-мкм ДНК дрожжей. Рестрнкцнонные сайты: В - BamHI, Н -Hindlll, Р - PstJ, X - Xhol, Xb - Xbai, E - EcoRl, S - Sail, С - Clal.

Результаты к обсуждение.

Получение и изучение свойств нулевых аллелей БЦрЗД и 5ЦР45.В предшествующих нашей работе исследованиях было показано, что в генах БиР45 и БиР35 возникают мутации с условно летальным проявлением. Для выяснения.к каким последствиям приведет полная инактивация этих генов мы сконструировали штаммы, несущие в

S

гетерозиготе нулевые аллели каждого из mix, используя метод, предложенный Ротштейном (Rothstein, 1983). Кодирующие области генов SUP35 и SUP45, находящихся, на плазмндах, разрушались вставками маркерных дрожжевых генов: в случае гена SUP35 использовали маркер URA3, a SUP45 - TRP1, которые в дальнейшем использовались как селективные маркеры при трансформации. Плазмиды, несущие такие ннактивироваииые гены гидролкзоиали рестриктазами, сайты для которых расположены во'фланкирующих гены SUP35 и SUP45 областях. Полученной смесью фрагментов, содержащей ген со вставкой, трансформировали диплоидный штамм 118. Поскольку свободные концы ДНК обладают повышенной рекомбиногенностью, среди трансформаитов с большой вероятностью отбираются клетки, в которых одна из хромосомных копий исследуемого гена заменена на инактнвированный (рис.2).

Б

аСкп

г/t/rj

а

г ¿.т~

АГ 5

( г.гкл ь-

* ?

1/MJ t

-

JUJLZJ—

ä , г

— i.ikt _ — </,ш

~ *.fii . © 0 ~ г, ли

'исунок 2. Получение н анализ дцплоидов, гетерозиготных по ьялелям supl::TRPl (А) и sup2::URA3 (Б).

). Схемы рекомбннациониых событий. Двойная линия - гены SUP35 и IUP45 (SUPt и SUP2), толстая линия - гены TRP1 и URA3. >'). Гибридизация по Саузерну. Хромосомную ДНК гидролизовали естриктаэамн BamHI и HindllI,(A) и Xhol Sali (Б). В качестве зондов спользопалн меченные фрагменты EcoRI-Xbal гена SUP45 и Xbal-Xhol ена SUP35. 1 - ДНК исходного днплоида, 2 - ДНК интегранта, несущего улевую аллель.

Генетический анализ полученных траисформшгтов показал, что нулевые аллели генои SUP35 и SUP45 являются рецессивными лсталямл, слеловатслыю, продукты этих генов необходимы для поддержания жизнеспособности дрожжевой клетки. В нашей работе нулевые аллели были получены у штамма, содержащего цитонллзматнчсскую детерминанту [psi+|. Эта детерминанта обладает способностью повышать эффективность некоторых супрессоров, что в ряде случаев приводит к летальности (Сох, 1971; Gilmore, Stewart, and Sherman, 197t). Можно было ожидать, что летальность нулевых аллелей, обнаруженная нами, также обусловлена присутствием в клетке |psi+l фактора. Однако, при его элиминации жизнеспособность штаммов с нулевыми аллелями не восстанавливалась. В нашей работе были обнаружены некоторые фенотипические проявления, свидетельствующие о взаимодействии продуктов генов SUP45 и SUP35 с цнтоплазматнческнми детерминантами.

Взаимодействие нулевой аллели гена SUP45 с зетермннаитой lpsi+1.

У гетсрозигот по нулевой аллели гена SUP45 мы обнаружили два доминантных эффекта, проявляющихся в lpsi+J штаммах: замедление роста и потерю способности сиорулнровать. Одним из возможных объяснений этого факта может быть токсичность Н-концевого фрагмента белка Sup45, кодируемого нулевой аллелью гена SUP45 и его способность конкурировать с присутствующим п клетке нормальным белком Sup45. Подобная ситуация была описана например для гена RNA1 дрожжей-сахаромицетов ( Atkinson and Hopper, 1987). В нашем случае такое объяснение является маловероятным, поскольку трансформация диплоидного [psi+] штамма автономно реплицирующейся плазмидой, несущей нулевую аллель гена 5UP45 не приводила к заметному ухудшению роста. Сиоруляния у таких трансформантов также не была нарушена. Вторая гипотеза предполагает, что полная

инактивация в динлонде одной из двух аллелей гена SIMMS приводит к уменьшению количества его продукта и изменению вследствие этого физиологического состояния клетки. Эту гипотезу подтверждает тот факт, что трансформация медленно растущих диплоидон. имеющих в гетерозиготе нулевую аллель гена SUP15, илаэмидой с аллелью дикого типа этого гена приводит к снятию описанных эффектов. Оказалось, что элиминация |psi*l приводит к восстановлению нормального роста и споруляцни . Таким образом, доминантные эффекты зависят от присутствия в цитоплазме детерминанты Jpsi+|. Для объяснения этого факта можно предположить, что присутствие | р^Ч-дегсрмннаиты приводит к ннгибнрованию сиитеза или инактивации некоторого количества белка SuplS, недостаток которого ведет к описанным последствиям.

Взаимодействие гена SUP35 с ннтонлалматичеснямн детерминантами.

Продуот гена SUP35, видимо, не взаимодействует с [psi+] фа1стором подобно белку .кодируемому геном SUP45, поскольку между [psi4"] и !psi'] диплондамн, несущими в гетерозиготе нулевую аллель гена SUP35 не было найдено никаких отличий. Тем не менее мы обнаружили другой тип взаимодействия белка Sup35 с цитонлазма-тическими детерминантами. Оказалось, что трансформанты [psi+Ijc-t;r] штамма мультккопийиой илазмидой с геном SUP35 очень медленно растут lia селективной среде и лратспгческн со 100% часто!ой теряют плазмиду в неселектнвных условиях. Наличие в цитоплазме фактора eta также приводит к уменьшению стабильности плазмидм с геном SUР35, однако не настолько заметному как в случае [рз'1+]-фактора. Известно, что присутствие гена SUP35 на мультнкопийнон плаэмиде приводит к супрессии нонсенс-мутаций (Чернов и др., 1988), детерминанта [psi+J усиливает проявление слабых нонсенс-супрессоров (Сох, 1965) а фактор [eta+| несовместим со многими омнинотентными супрессорными

мутациями (Liebman and ЛН-Robyn, 1984). Эти эффекты, наиболее вероятно, во всех'трех случаях связаны со снижением точности белкового синтеза, поэтому несовместимость цнтоплазматических детерминант с амплифициропанным геном SUP35 может объясняться сильным увеличением количества ошибок трансляции, приводящему к ухудшению роста клеток, содержащих плазмиду. Делсшюинмй анализ гена SUP35.

Последовательность белка SUP35 может быть разделена на три участка: уникальные N-конисвой и срединный домены N и М, размером 123 и 130 аминокислот, соответственно, и С-концевой домен, имеющий структурное сходство с факторами элонгации, гомологичными EF-ta (Kushnirov et а1.1988).

Мы исследовали функциональную роль различных участков .гена SUP35 при помощи делециоиного анализа. Все делецнонные конструкции были клонированы в мультикопийных и центромерных векторах. Результаты, полученные при изучении способности различных дслецхонных вариантов обеспечивать жизнеспособность, вызывать супрессию и антнсупрессню представлены в таблице 1. Исследование способности различных делеции гена SUP35 комплементировать летальный эффект нулевой аллели показало, что жизненно-важную функцию выполняет эволюционио консервативный С-концевой домен. Несмотря на сходство С-концевой части с белком EF-la, функции этих белков, безусловно, различны, поскольку присутствие обоих необходимо для выживания клетки. Ранее было выдвинуто предположение о том, что за отличие белка Sup35 от EF-ta ответственен уникальный N-концевой домен (Wilson, Culbertson, 1988). Однако мы показали, что для комплементации нулевой аллели гена SUP35, а следовательно и для жизнеспособности клегки достаточно присутствия лишь С-концевого домена белка, гомологичного F.F-la;

S3 = > =

12

.—Hind _В 3-íJSal_ штгтшлчищртятя 5-üBcl_ з

ВНЖИВАЕМОСГЬ СУПРЕССИЯ' АИТИСУПРЕССИЯ ribosome

м l m l dindino

+ + + +

+ + - + + NT

+ - + ■f +

-t- - + + +

- NT + - NT +

- NT + - NT +

- NT + + - NT +

- NT + - NT +

- NT + - NT +

- NT +/- - NT NT

- NT - - NT +

- NT - - NT -

NT + NT +

Таблица1. Результаты делеционного анализа гена SUP35. Толстыми линиями обозначена кодирующая область гена SUP35, тонкими -некодирующая. На последовательности гена дикого типа обозначены сайты узнавания для рестриктаз и кодоны ATG , соответствующие метионинам, разделяющим белок Sup35 на три района (N, М, С). Способность компенсировать летальный эффект нулевой аллели гена SUP35 изучали у делеционных конструкций, расположенных на мультикопийной плазмиде pEMBLyex4 и центромерной плазмиде pRG416. Мультикошшную супрессию тестировали у штамма 2Г-ДМ8, несущем охр-мутацию his7-l и мутацию неизвестной природы ]ys2-187, супрессируемую омнипотентными супрессорами. Эффективность супрессии оценивали по росту на средах без гистпина либо без лейцина. ++, хороший рост на 2-ые сутки инкубации при зоОс на обеих средах, +, хороший рост на 2-е сутки на среде без лизина и на 5-е на среде без гистидина, +/-, рост на 4-е сутки на среде без лизина , -, отсутствие роста иа 9е сутки на обеих средах.

* - Плазмида SUP35pEMBLyex4 эффективно супрессировала мутацию Iys2-187, но супрессия мутации his7-l наблюдалась только в присутствии в среде бОмкг/мл паромомнцина. Антисупрессорный эффект регистрировали по ингибированига супрессии мутации ade2-l у штамма 5B-H19JPSÍ1"]. Этот иггамм несет слабый супрессор SU05, способный супрессировать охр-мутацию ade2-l только в присутствии фактора [psi*]. +, антисупрессорный фенотип, обуславливающий красную окраску колоний и их неспособность расти на среде без аденина, -, супрессорный фенотип (белый цвет и рост на среде без аденина) , NT, не тестировали.

Все изученные делении, затрагивающие структуру эволюшшшю-консерпатпнного С-кпнцеиого района белка, нарушали его жизненно-важную функцию. Следовательно, целостность этого домена необходима для нормального функционирования белка БирЗЗ.

Результаты нашей работы говорят о том, что мультикопийная супрсссорная активность локализуется в Ы-конкевом домене белка 5ир35. Все делешюнные аллели, кодирующие Ы-конценую часть белка, были способны супресснровать различные нонсенс-мутации, находясь на мультнкоиш'шой плазмиде. Минимальной последовательностью, достаточной для лтой функции оказался дслеционнын вариант ДЕсо, кодирующий 1М Ы-концевых аминокислот. Деления ДВзЬ-Жпс!, удаляющая 44 аминокислоты из середины домена N. приводила к ослаблению, но не к полному отсутствию супрессии. Видимо, супрсссорная функция, присущая этому району белка, не требует наличия строго определенной аминокислотной последовательности. Это подтверждается к данными о способности гена 5Ш'35 из дрожжей РкЫа ртиа вызывать мультикошшную супрессию в дрожжах-сахаромицетах несмотря на отсутствие гомологии между 1Ч-концевым доменом соответствующего белка и Ы-концом белка БирЗБ 5ассНаготусе$ сетшае (КшЬшгоу с1.а1, 1990). Район М оказался не связанным ни с одной из исследуемых функций, и, по-видимому, его можно рассматривать как спенсерный участок, связывающий два функциональных домена ( Тег-Луапевуап е1 а1., 1993). При сравнительном анализе белков, гомологичных Бир35 S.ccrevisiae, дрожжей РгсМв ртиз и человека оказалось, что С-концевой домен эволюциомно консервативен, тогда как М-концевая часть у этих организмов существенно различается но длине и по аминокислотной последовательности (КвзЬшгоу е1 а!., 1990).

Отсутствие гомологии в N-концевой части белка у различных объектов может говорить либо о ее вилоспсцифичиости, либо об отсутствии у нее какой-либо важной для организма функции. Подтверждением второго предположения могут служить результаты делешюнного анализа, проведенного нами для SUP35 дрожжей S.cerevitiae, а также тот факт, что ген SUP35 из дрожжей P.pintis, кодирующий белок с сильно отличающейся N-концсвой частью, способен комплементиропать нулевую аллель SUP35 дрожжей-сахаромицетов (Kushnirov et al., 1990)

Изучение антнсупрессорного эффекта 5'-кониепых делении гена SUP35. Трансформа1ггы штамма 5В-Н19 Ipsi+] , несущие мультикопийные или центромерные плазмиды с делецииями "2ATG", "ЗАТО", "ABst", имеют красную окраску, тогда как все прочие трапсформанты этого штамма, также как и сам исходный штамм, - белые и способны расти на среде без аденина. Красные трансформанты на этой среде не вырастали, однако при клонировании их в неселективных условиях появлялись белые клоны, потерявшие плазииду, у которых восстанавливалась способность супресснровать мутацию ade2-l. Этот факт говорит о том, что отсутствие супрессии у трансформантов связано не с потерей [psi1"] фактора, а с присутствием плазмиды. Поскольку антисупрессориый эффект наблюдался как для мультикопийных плазиид, так и для цеитромлрных ' мы пришли к выводу, что одна копия этих делециошшх аллелей доминирует над хромосомной копией гена дикого типа. Для выяснения супрессорной специфичности антнсупрессорного эффекта мы изучили влияние мультикопийной плазмиды с конструкцией "3ATG" на охр-супрессоры SUP4 и SUP2 у [psi'J штаммов J15-3C и 5-Н43 и амбер-супрессор SUP4-3 у [psi'] штамма 50-Н44. Оказалось, что конструкция "3ATG" заметно ингибирует супрессию охр-мутаций ade2-l и trp5-2 у штамма с охр-супрессором SUP4. Супрессия двух других охр-мутаций

lys2-l и met4-l, присутствующих y него не изменялась. У штамма 5-Н43 наблюдали антисупресию по отношению только к одной из охр-мутаций -ade2-t. Супрессия амбер-мутаций his4-580 к trpl-289 супрессором SUP4-3 в штамме 50-Н44 в присутствии этой- плазмиды не подавлялась. Хотя приведенные результаты явно недостаточны, чтобы делать вывод о сулрессорной специфичности антисулрессорного эффекта, по-видимому, можно утверждать, что антисупрессия не связана с ингнбированием активности детерминанты (psi*), поскольку имеет место и в ее отсутствие. Получение штаммов с делениями SUP35-AN в хромосоме. Идентификация минимального фрагмента белка Sup35. необходимого для существования фактора Ipsi*).

Делеции SUP35-AN, кодирующие белок с полностью или частично делетированным N-концевым доменом, вызывали не только доминантный антисупрессорный эффект, но и обладали способностью элиминировать из клетки цитоплазматическую детерминанту lpsi+]. Это свойство наследовалось как рецесивный признак: у гетерознгот по шггисупрессорным аллелям, 1р51+}-фактор сохранялся, элиминация происходила в случае, когда единственная хромосомная копия этого гена была заменена аллелью SUP35-AN (рис 3.). Полученные данные позволили приюти к выводу, что, белок SUP35 является, по-видимому, транс-действующим фактором, участвующим в поддержании в клетке детерминанты lpsi+J. В экспериментах по переносу цитоплазмы, содержащей ipsi+] фактор в штаммы, лишенные нормальной копии гена SUP3S и несущие различные делеционные варианты этого гена на мультикошпшых плазмидах (рис 4. Схема цнтодукцин), было показано, что для сохранения детерминанты [psi^] на фоне антисупрессорной аллели SUP35 достаточно присутствия в клетке отдельно акенречтируемых укороченных с С-конца вариантов белка Sup35. Минимальный участок белка, "спасающий" 1рз| + |-фак1ор, содержал 114

Ы-концевых аминокислот (табл.2), эта же последовательность (деления ДЕсо) была достаточной для описанного ранее эффекта мультикопийной супрессии (табл. 1).

В лаборатории Б.Кокса ( Оксфорд, Англия) был клонирован ген РЫМ2, мутания в котором приводит к элиминации [р51+1-фактора. Ген РЫМ2 оказался идентичен гену БиР35. Мутация, элиминирующая детерминанту 1р51+|, вызывала замену глицина на аспартат в 58 положении белка 5ир35 ( В.Сох, личное сообщение). Этот результат подтверждает наши предположения о существенной роли Ы-концевого домена белка Бир35 в поддержании [рз1+]-детерминанты.

5 ЦР35 $ир35-№3

зир35-&ка

ато атс дта таа

12 3 4

«

— глкь ф — 2,ЗкЬ

— 2.1йЬ

V — 1,8кЬ

Рисунок 3. (А) Структура антисупрессориых аллелей гена 51!Р35. Толстая линия - кодирующая область гена, тонкая • некодирующая. Штаммы с антисупрессорными аллелями в хромосоме получали, трансформируя штамм 5В-Н19(р51+] фрагментами ХЬо1-ХЬа1, содержащими различные $ир35-ДЫ аллели. Трансформанты, у которых в результате рекомбинации произошла замена гена дикого типа на антисупрессорную аллель, приобретали красную окраску и теряли способность расти на среде без аденина. (Б) Саузерн-акализ ДНК из штаммов с антисупрессорными аллелями. ДНК гидролизовали рестриктазой Всп1 и гибридизовали с меченным одноцепочечным фаг ом М13, содержащим Всп1-ХЬа1 фрагмент гена БЬ'РЗЗ. 1 - штамм с эирЗЗ-ДЫЗ, 2 - 5ир35-ДЫ2, 3 - 5ир35:АМВ, 4 - БиР35.

1 этап 10В-Н49 [ps¡+]|rho+|

<ade2-t SUQ5 kar1-1)

G

Перенос lpsi+j и {rho* j цнтодукцией в

£

Трансформанты штамма 1-5В-Ш9 Ipsi j ¡rho 1 (ade2-l SUQ5 sup35-AN)

Ф

Отбор lrho+¡ цитодуктаитоп

Ф

2 Этап Трансформанты 1-5В-1Ш Ipsi?] [rho+]

(ade2-l SUQ5 kart-l)

О

Перенос [psi*] фактора при цитодукцнн в

&

10В-Н19 [psi"] (ade2-l SUQ5 karl-1)

Ф

Отбор цитодуктантов [psi+l

Рисунок 4. Схема цитодукцнн. На первом этапе [ps¡+] фактор был перенесен при помощи цитодукцнн из [psi+][rho+| штамма 10B-II49 в [rho-] штамм 1-5В-Н19, содержащий в хромосоме делецию sup35-AN3 ¡i трансформированный плаэмидами, несущими различные делецнонные варианты гена SUP35. Прямая селекция { по появлешпо белой окраски) lpsi+] цитодуктантов у таких реципиентов была невозможна нз-за присутствия в них доминантной антисупрессорной аллели, которая обусловливает красную окраску и неспособность расти на среде без адеинна даже для клеток, имеющих цитомлазматнческнй фактор [psi*]. Отбор цитодуктантов вели на среде, где вырастали только клоны, подучившие цитоплазму [rho1"! родителя. Поскольку этот же родитель содержал в цитоплазме и фактор [psi"'}, получившиеся цитодуктанты должны становиться [psi*]. Дыхательно-компетентные колонии, в-остальном фенотипшески не отличающиеся от трансформантов штамма KSB-H19, считали цнтодуктантами. Наличие [psi^l-фактора в таких клетках определяли на втором этапе цнтодукшш, где в качестве реципиента использовали |psi| штамм 10В-Н49. В этом штамме о появлении (psi* | можно судить по изменению его окраски из красной в белую н появлению способности расти на среде без адешша. Отбор вели прямо на среде без адеинна, так как ни получающиеся диплонды, ни один из роди гелей на ней не росли.

В отличие от мутации sup35-AN, полученных в нашей работе, мутация PNM2 не приводила к аитисупрессии и была доминантной - ее способность элиминировать [рм+]-фактор проявлялась и у гетерозиготных гибридов. (Сох et al., 1980). Доминантный фенотип этой мутации можно объяснить, если предположить, что мутантный белок, взаимодействуя с продуктом гена дикого типа или с каким-либо фактором, необходимым для существования детерминанты [psi+l, образует нефункциональный комплекс, что приводит к постепенной элиминации [psi+) при росте гетерозиготного по такой мутации диплоидного штамма. В случае полного делегирования N-концевой части белка, он теряет споособность к такому взаимодействию и Поэтому в присутствии молекул нормального белка не вызывает элиминацию [psi+|. Следует отметить, что присутствие N-концевого домена гена SUP35 является необходимым, но не достаточным условием для существования [р51+]-детерминанты, так как штаммы, несущие ген SUP35 дикого типа, могут иметь и [psi-] фенотип. Тот факт, что клетки, в которых отдельно синтезировались N- и С-концевые домены белка Sup35 имели антисупрессорный феиотип, говорит о том, что нормальная функция этого белка в них не восстанавливалась, тогда как [psi+¡-фактор сохранялся. Таким образом, для выживания клетки достаточно присутствия С-концевого домена белка Sup35, его Ы-ко1цевая часть обеспечивает существование [р51+1-четерминанты, но для нормального функционирования этого белка в процессе трансляции необходима его целостность.

Супрессорный и антисупрессорный эффекты мутаций и делеций а гене SUP35 могут быть связаны с прямым или опосредованным участием белка Sup35 в стадии элонгации или терминации белкового синтеза. Вероятнее всего этой стадией является элонгация трансляции,

лВБ! ,%Нра лВа! лБа! лВс! лВа12 лВ51-Н1пс1 В гАТв-аБа! 2ATG-i.Bc! лЕсо К

Щ В «11« С ? С 4«; а И «, О ^ «В а «5

А10 А!С 41С1

в вааюяшш

СИЛСЫ1КК

+ + +

+ +

Таблица 2. Способность плазмид с различными делеционными вариантами гена БиРЗЗ "спасать" фактор (рзг'*"|. Кодирующая последовательность обозначена толстой линией. "+" - способность и "-" -неспособность "спасать" [рв^-фактор.

поскольку известны мутации в этом гене, приводящие к супрессии мутационных изменений типа сдвига рамки считывания (С«1ЬегЬоп е1 а1, 1982). Об этом же свидетельствует повышение частоты ошибок трансляции е бесклеточиой системе белкового синтеза на поли-и матрице в случае использования экстрактов из штаммов дрожжей, мутантных по гену 5иР35 (Surguchov е! а!., 1984, ЕизНсе е1 а!., 1986). Однако, данные С.Д.Дидиченко о том, что основное количество белка БирЗб в клетке ассоциировано не с элощ-нрующими рибосомами, а со свободными натионымн 40Б субчастнцамн, указывают на возможность его участия в инициации трансляции Шк^сЬепко, Тег-А\'апе5уап,1991). Количественная оцеькл содержания белка ЙирЗЗ (спорит о том, что он присутствует в ооопьчнсчпш меньше чем одна молекула на 20 рибосом, а следовательно

не может непосредственно участвовать в достаточном числе актов элонгации, необходимом для проявления доминантного антисупрессор-ного эффекта. Видимо, его роль сводится к опосредованному участию в процессе трансляции, реалилизукнцемуся через воздействие на рибосомы или другие компоненты аппарата трансляции.

Полученные нами результаты указывают на возможность регуляции точности трансляции у дрожжей-сахаромицетов при изменении экспрессии гена 517Р35. Так, амплификация на плазмиде целого гена или его 5'-концевой части, а также мутации в нем приводят к супрессии нонсенс-мутаций, то есть понижают точность трансляции, делегирование же Ы-концевой части белка повышает точность трансляции, что проявляется как антнсупрессия. Несколькими исследователями независимо было показано наличие в клетке двух транскригггов, соответствующих гену 511Р35: большого, размером 2,3 т.п.н., соответствующего полной открытой рамке считывания, и малого, 1,4 т.п.н., соответствующего С-кониевому домену белка. Количество малого транскрипта в 5-10 раз меньше по-сравнению с количеством большого (Бш^исЬоу е1 а1,1986; ЮкисЫ е1 а1.,1988). Обнаружить продукт малого транскрипта в клетках, содержащих только нормальную копию гена БиР35 до сих пор не удалось, возможно по причине недостаточной чувствительности полученных антител к С-коицевой части белка 5ир35. Однако, если такой продукт существует, го факторы, влияющие на экспрессию гена 51)Р35 и способные изменять »тносительное количество большого и малого продукта этого гена могут зегулировать точность процесса трансляции у дрожжей.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что белки, кодируемые генами SUP35 и SUP45 выполняют в клетке жизненно-важные функции, так как нулевые аллели этих генов являются рецессивными деталями.

2. Нулевая аллель гена SUP45 у гетерозиготных диплоидов имеет доминантные проявления (снижение скорости роста и подаьление споруляции), зависящие от присутствия в клетке цитоплазматической детерминанты [psi+J.

3. Присутствие цитонлазматических детерминант tpsi+) и |eta+j снижает стабильность мультикопийкых плазмид, несущих ген SUP35.

4. Показано, что за жизненно-важную функцию белка Sup35 отвечает его С-концевой домен, гомологичный фактору элонгации EF-ia, поскольку его присутствия достаточно для компенсации летального эффекта нулевой аллели гена SUP35.

5. Сверхэкспрессия N-коицевого домена белка Sup35 приводит к омнипотентной супрессии, а экспрессия его С-коицевого домена - к антисупрессик.

6. Делеция 5-концевой обмети тена SUP35 приводит к элиминации нехромосомной детерминанты [psi+J. Последовательность 114 N-концевых аминокислот белка Sup35 достаточна для поддержания детерминанты [psi+].

Список публикаций во теме диссертации

1. Телков М.В., Сургучев А.П., Дагкесамаиская А.Р., Тер-Аванесяи М.Д., Выделение фрагмента хромосомной ДНК, содержащего ген SUP2 дрожжей-сахаромицетов. Генетика, 1986, 22, 17-24.

2. Сургучев А.П., Телков М.В., Фоминых Е.С., Дагкесамаиская

A.Р., Тер-Аванесяи М.Д. Клонирование супрессорных генов SUP1 и SUP2. Труды V Всесоюзного биохимического съезда, 1986, М,"Наука", т.2, стр.437.

3. Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесамаиская А.Р., Тихомирова

B.Л., Тер-Аванссяи М.Д., Инге-Вечтомов С.Г., Нонсенс-супрессия ■при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции. Доклады Академик наук СССР, 1988, 301, 1227-1229.

4. Chernoff Yu.O.,' Derkaeh I.L., Dagkesamanskaya. A.R., Ter-Avam-syan M.D., Sizonenko G.L., Tichodevv O.N., Inge-Vechtomos' S.G. Translation ambiguity in veast Saccharomyces rerevisiae depends on SUP1(45> and s'UP2{35) gene dosage. 1988, Yeast, v.4,

Special issue, p. 510 (Abstracts of 14 conference on yeast genetics and molecular biology)

5. Тер-Аванесян М.Д., Дагкесаманская A.P. Нулевые аллели генов SUP1 н SUP2: взаимодействие с цитоплазматическнми детерминантами. Доклады Академии Наук СССР, 1989, 308, 14721475.

6. Дидиченко С.А.. Кушниров В.В., Дагкесаманская А.Р., Тер-Аванесян М.Д. Изучение структуры и функции гена SUP2, участвующего в трансляции у дрожжей S.cerevisiae // Школа-конференция "Структура и функция биополимеров", Тезисы докладов, Киев, 1988 (г. Львов, 1989), стр. 20.

7. Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Дагкесаманская А.Р., Чернов Ю.О., Инге-Вечтомов С.Г., Смирнов В.Н., Делеционный анализ гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Молекулярная биология, 1990, т.24, с.1037-1041

8. Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Didichenko S.A., Ter-Avanesyan M.D. Deletion analysis of SUP2(SUP35) gene. // In thesises of XV International conference on yeast genetics and molecular biology, 1990, Yeast, v.6, S 398.

9. Dagkesamanskaya A.R., Ter-Avanesyan M.D., Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUPKSUP45) and SUP2(SUP35) with non-Mendelian factors. Genetics, 1991, 128, 513-520.

10. Chernoff Yu.O., Inge-Vechtomov S.G., Derkach I.L., Ptyushklna M.V.,Tarunina O.V.,Dagkesamanskaya A.R., Ter-Avanesyan M.D., Dosage-dependent translation suppression in yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1992, 8,489-499.

11. Didichenko S.A., Dagkesamanskaya A.R., Trachsel H., Ter-Avanesyan M.D. Interaction of yeast Sup35 and Sup45 proteins with ribosome. In thesises of XVI International conference on yeast genetics and molecular biology, 1992, Yeast, v.8, S 404.

12. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Didichenko S.A, Deletion analysis defines two functional domains in the SUP35 encoded protein of yeast S. cerevisiae. In thesises of XVI International conference on yeast genetics and molecular biology, 1992, Yeast, v.8, S 174.

13. Ter-Avanesyan, M.D., Didichenko, S.A., Kushnirov, V.V., Dagkesamanskaya, A.R. SUP35 and SUP45 genes code for ribosome-bound proteins involved in the control of transtational fidelity in yeast.// 1993, NATO AS1 Series, vol. H71, Protein Synthesis and Targeting in Yeast.

14. Ter-Avanesyan M.D.,Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Didichenko S.A., Cherooff Yu.O., Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.H. Deletion analysis of the SUP35 gene of yeast Saccharomyces cerevislae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein. Mol. Microbiol., 1993, 7, 683-692.

15. Ter-Avanesyan M.D., Didiclienko S.A., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R. Yeast omnipotent suppressors SUP35 and SUP45 and their • gene products. Abstracts of XV International Botanical Congress; p. 176.