Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Общий генетический контроль терминации трансляции и клеточного цикла у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Общий генетический контроль терминации трансляции и клеточного цикла у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РГБ ОД

~ и. ДНК 2303

БОРХСЕНИУС Андрей Сергеевич

Общий генетический контроль терминации трансляции и клеточного цикла у дрожжей Басскаготусех сеге\ч$1ае.

специальность: 03.00.15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургско государственного Университета.

Научный руководитель: Чл.-корр. РАН, профессор,

доктор биологических наук С.Г. Инге-Вечтомов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор К.В. Квитко

доктор биологических паук Т.Р. Сойдла

Ведущее учреждение: Институт сельскохозяйственной

микробиологии РАСХН

Защита состоится 2000 г, в ^' часов на заседани

Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискапи ученой степени доктора биологических наук в Саикт-Петербургско: Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедр генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

НолЬря, 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.063.57.21 кандидат биологических наук

Л.А. Мамо!

с VI/о . /Ы. /)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Клеточный цикл - это совокупность строго торядоченных процессов, ведущих к удвоению клетки. В ходе цикла 50ЛСХ0ДНТ дупликация всех компонентов клетки и их сегрегация в две дочерние 1етки. Точное воспроизведение информации в ряду клеточных поколений )ебует временной и пространственной координации отдельных событий, штролиругощихся относительно независимыми ферментативными змплексами (репликация ДНК, конденсация хромосом, удвоение центросом и зразование веретена деления и т.д.) и интеграции этих событий с процессами, эстоянно протекающими в клетке, в частности, метаболизмом питательных ;ществ. синтезом РНК и белка. В последнее десятилетие интеграция ¡петического контроля синтеза белка и клеточного цикла является предметом стивного изучения. Показано, что многие компоненты аппарата трансляции, в мутности, факторы инициации трансляции вовлечены в контроль клеточного икла на стадии G]. Для фактора элонгации трансляции EF-la, показано тимодействие с белками актинового и тубулинового цитоскелета, что, эзможно, обеспечивает компартментализацшо синтеза белка в ходе клеточного икла. Факторы терминации трансляции, по-видимому, также взаимодействуют системами контроля клеточного цикла. Так, у дрожжей Sciccharomyces zrevisiae мутация gstl, блокирующая переход от стадии Gi к стадии S, артирована в гене SUP35 (Kikuchi et а1.,1988). Этот ген кодирует фактор грминации трансляции eRF3 (Zhouravleva et al., 1995). Многие рецессивные утации в этом гене и в гене SUP45, кодирующем фактор eRFl, наряду со нижеиием точности трансляции (супрессии нонсенс-мутаций) приводят к увсгвительности к беномилу (Tikhomirova and Inge-Vechtomov, 1995) - агенту, еполимеризующему микротрубочки и, как следствие, нарушающему асхождение хромосом в митозе и мейозе и слияние ядер (кариогамию) при ябридизации клеток. О возможном взаимодействии eRF3 и тубулинового итоскелета говорит и то, что некоторые мутации, нарушающие кариогамию, одавляют супрессорный эффект [PSIJ-фактора — модифицированной (прионной) юрмы eRF3. К снижению митотической стабильности [PSIj-фактора приводит и елеция гена SLAI, кодирующего один из компонентов актинового цитоскелега. ^ля белков eRF3 и Slal показано физическое взаимодействие, для которого еобходим С-концевой домен Slal и участок от 22ой до 69ой аминокислот eRF3 Bailleul et al., 1999). Все эти факты свидетельствуют о тесной интеграции онтроля терминации трансляции и клеточных делений. Однако механизмы того взаимодействия требуют дальнейшего изучения, что и было предметом аших исследований.

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики биологического НИИ СПбГУ. Отдельные эксперименты выполнены в аборатории микологии ин-та им. Ханса-Кнолля (Иена, ФРГ) и в лаборатории Э. Чернова Технологического ин-та Джорджии (Атланта, США).

Цель и задачи исследования. Целыо данной работы являлось генетическое изучение роли факторов терминации трансляции eRF3 и eRFl в контрол< клеточного цикла дрожжей S. cerevisiae и взаимодействия eRF3 и eRFl < компонентами аппарата клеточных делений в контроле терминации трансляции В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние полной инактивации (дизрупции) генов SUP35 ил1 SUP45 на клеточный цикл.

2. Оценить влияние супрессорных мутаций sup35 или sup45 ш митотическую стабильность хромосом.

3. Исследовать взаимодействие мутаций snp35 и sup45 иш модифицированного (прионизированного) eRF3 с мутациями, приводящими i повышенной частоте цитодукции (мутациями Hfc~):

4. Исследовать влияние делеции 220г0-69сг0 кодонов SUP35, нарушающей взаимодействие eRF3 и Slalp, на индукцию и поддержание [PSIJ-фактора.

Научная новизна работы. Получены прямые доказательства участи;: факторов терминации трансляции eRF3 и eRFl в контроле инициации клеточного цикла и трансмиссии хромосом в митотических делениях. Впервые описаны мутации Hfc Asu , одновременно нарушающие кариогамию и подавляющие супрессорный эффект sup35 и/или sup45. Впервые показано, что мутации в структурном гене SUP35 могут подавлять способность прионных форм кодируемого им белка к сегрегации в ряду клеточных делений.

Практическая ценность. Получены данные об участии эволюционно консервативных факторов терминации трансляции в контроле трансмиссии хромосом. Эти данные могут иметь значение при изучении молекулярной природы аномалий развития, связанных с нерасхождением хромосом. Выявление мутаций, подавляющих фенотипическое проявление дрожжевого приона [PS1] или его поддержание в ходе клеточных делений, может служить модельной системой для разработки методов лечения пейродегеперативпых заболеваний прионной природы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на I съезде ВОГиС (Саратов, 1994), на конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Медисоп, США, 1996), на XVIII (Кейптаун, ЮАР, 1997) и XIX (Римини, Италия, 1999) международных конференциях но генетике и молекулярной биологии дрожжей и на семинарах лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ, лаборатории микологии ин-та им. Ханса Кнолля (Йена, ФРГ) и лаборатории Ю. Чернова Технологического ин-та Джорджии (Атланта, США).

Объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и выводов. Работа содержит 15 таблиц, 15 рисунков, список литературы из наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы S. cerevisiae и Е. coli. Основные штаммы дрожжей, пользованные в работе, приведены в таблице 1. Первые пять штаммов :пользовали при определении стадии клеточного цикла, блокируемой [зрупцией SUP35 или SUP45. Штаммы № 6-11 - для изучения влияния мутаций р35 или snp45 на стабильность хромосом. Штаммы № 12-17 при исследовании [тисупрессорного эффекта у мутантов Ufe . Штаммы 18 и 19 - для изучения тонизации продукта sup35A22/69.

Для поддержания и выделения челночных плазмид и в качестве реципиента ш трансформации использовали штаммы бактерии Е. coli DH5a и HB 101 ambrooket al., 1989).

Плазмиды. В работе использовали челночные плазмиды, способные одерживаться в клетках S. cerevisiae и Е. coli. Для изучения стабильности штромерных плазмид у мутантов sup35 использовали плазмиду pRS415. {СEN EU2) (Sikorski and Hieter, 1989). Для анализа компенсации плейотропных появлений мутаций snp35 аллелью дикого типа использовали плазмиды: pFL36 ZEN LEVI) (Bonneaud et al., 1991) и полученную на ее основе pASB2 (CEN ETJ2 SUP35). Плазмиду pXS (2pmDNA URA3 SLT3) (Сизоненко и др., 1990), гсущуго доминантную супрессорную мутацию SLT3 в гене глутаминовой тРНК JUG—>UUA), использовали при изучении антисупрессорного эффекта у утантов Hfc+. Для получения штаммов, содержащих алелль гена SUP35 -ip35A22/69 использовали плазмиду pRS315-sup35ABstEII (CEN LEU2 ip35Á22/69), полученную па основе pRS315 (Sikorski and Hieter, 1989). Для идущий [PSIJ-фактора использовали плазмиды pRS316GAL-SUP35N (CEN 'RA3 GALpt-SUP35N) и pFL39-GALSUP35N (CEN TRP1 GALpr-SUP35N), <опструированные на основе pRS316GAL (Liu et al., 1992) или pFL39 (Bonneaud : al., 1991). Эти плазмиды содержат 5'-концевой участок SUP35 (SUP35N), эдирующий прионизующий домен eRF3, слитый с индуцибельпым промотором 'ALp,.. В качестве контроля использовали плазмиды pRS316GAL (CEN URA3 'ALpt) и pFL39GAL (CEN TRP1 GALpr). Плазмиды pRS316-SpNM-GFP (CEN JRA3 SUP35NM-GFP), pRS316-SpNMAB-GFP (CEN URA3 SUP35NMA22/69-:FP), сконструированные на основе pRS316, использовали для цитологического нализа агрегации химерного белка, содержащего прионизующий домен eRF3, питый с зеленым флуорисцирующим белком Aeqiiorea victoria (GFP).

Генетические методы. В работе использовали стандартные методы зиетики дрожжей (Захаров и др. ¡984; Rose et al, 1990). Мутантов sup35 и sup45 олучали, отбирая ревертантов к прототрофности одновременно по двум ризпакам, обусловленным нонсенс-мутациями разного типа: adel-14 (UGA) — is7-1 (UAA) (Инге-Вечтомов и др., 1988). Миготическую стабильность ромосом оценивали у дисомика по хромосоме III, гетерозиготного по локусу

Таблица!. Штаммы дрожжей S.cerevisiae, использованные в работе

№ Штамм Генотип

1 Д781 MATallMATa ade2-144,791//+ trpl//trpl ura3-52//ura3-52 Iys9-A21//+ leu2-3,112//leu2-3,112 his7-l/+; his3//+ sup45::TRPl//+

2 Д782 MATallMATa leu2-3,112//leu2-2 trpl/Ztrpl his7-l//+ lys2:insE//+ Iys9-A21//+ nra3-52//nra3-52 sup35::TRPl//+

3 185-3-4 MATü adel ade2 ural his7 lys2 tyrl gall cdc28-l

4 STX422 MAT a adelgal2cdc4-l

5 183-Д791 MATa adel-14 metl3-Al trpl-Al

6 ЗБ-П5216 LEU2 MATa THR4llleu2-l MATa thr4-B15 adel-14 his7-l metl3-Al

7 14А-П4415 MATa adel-14 his7-l nra3-52 thr4-B15 leu2-l

8 25Б-П4415 MATa adel-14 his7-l ura3-52 thr4-B15 leu2-l

9 ЗД-801 MATa adel-14 his7-l lys9-A21ura3-52 leu2-3,112 trpl-289

10 ЗЗГ-Д373 MATapheAlO ade2-l 14,717 his7-l Iys9-A2l ura3-52 Ieu2-3,112 trpl-289

11 Э1-ЗБ-П5216 leu2-l MATa thr4-B15 adel-14 his7-l metl3-Al

12 ду8-132-л28-2В-П3982* len2-l MATa thr4-B15 adel-14 Us7-1 metl3-Al

13 7-1-90-Д201 MATaphel-AlO ade2-144,717 his7-l Iys9-A21 Ieu2-3,U2

14 223-П5213 MATa adel-14 his7-l metl3-Al игаЗА leu2-l [PSt]

15 88Г-Д737 MATa adel-14 his7-l metl3-Al

16 29В-П5216 MATa adel-14 his7-l metl3-Al

17 р12-7А-П185 MATa adel-14 his7-l metl3-Al sup4f

18 GT247-1C MATa adel-14 his3 lys2 ura3-52 Ieu2-3,112 trplA snp35::HIS3 [CEN LEU2 sap35A22/69]

19 GT255-2D MATa adel-14 his3 lys2 ura3-52 leu2-3,112 trplA sup35::HIS3 [CEN LEU2 SUP35]

Мутации adel-14, Ivs2-S7. thr4-B15-VG\\pheA10, his7-l, Iys9-A21 -UAA; trpl-289 -UAG. * Далее в тексте -132-л28

una спаривания MAT (Kouprina et al., 1988). В работе использовали одификацию селективной системы цитодукции, предложенной Инге-ечтомовым и Карповой (Инге-Вечтомов и Карпова, 1984). Оригинальные гнетические методы приведены в диссертационной работе.

Молекулярно-биологические методы. В работе использовали стандартные етоды получения и анализа рекомбинантных ДНК и гибридизации ДНК-РНК Sambrook et al, 1989). Выделение РНК проводили по методу Шмидта с оавторами (Schmidt et al, 1990). Выделение и фракционирование белков роводили, как описано у Патино с соавторами и Ныонама с соавторами (Patino t al., 1996; Newnam et al., 1999). Детекцию гибридизации белков с антителами, пецифичными для NM-Sup35p, проводили с использованием набора фирмы Ainersliam" (Австрия).

Методы микроскопирования. Терминальный фенотип клеток дрожжей пределяли с использованием светового микроскопа "Jenavar" ("Carl Zeiss", ермапия) при увеличении 640х. Агрегацию химерных белков, содержащих GFP, иализировали с использованием флуорисцентного микроскопа «Люмам-12» «ЛОМО», Россия) и видеоприставки «Видео-тест Фиш» («ИСТА», Россия) при величении 1440х и длине волны 400-460 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение стадии клеточного цикла, блокируемой при инактивации 'UP35 или SUP45. Классический метод выявления мутаций в генах, онтролирующих клеточный цикл у дрожжей S. cerevisiae, - отбор условно-етальных, обычно температурочувствительных (ts), мутантов и анализ их )енотипа при непермиссивных условиях. При переносе в рестриктивные условия ультур мутантов по клеточному циклу (мутантов cdc) клетки останавливают вое развитие на одной и той же стадии, приобретая определенную морфологию «терминальный фенотип»). Проявление легального эффекта дизрупции SUP35 [ли SUP45 анализировали по терминальному фенотипу летальных (не >бразующих колоний) аскоспор — сегрегантов гибридов, гетерозиготных по щзрупции SUP35 (Д782) или SUP45 (Д781). Прежде, чем исследовать таким ¡бразом влияние на клеточный цикл дизрупции генов SUP35 и SUP45, следовало 'бедиться в том, что проявление хорошо изученных мутаций по клеточному щклу одинаково при вегетативном росте - почковании клеток и при прорастании [скоспор. Для этого мы сравнили проявление мутаций cdc28 и cdc4 при 1епермиссивпой температуре - 36°С у клеток гаплоидов 185-3-4 (cdc28) и ГГХ422 (cdc4), а также при прорастании аскоспор гибридов, гетерозиготных по >дной из этих мутаций. Терминальный фенотип каждого мутанта оказался )динаковым и у вегетативных клеток, и у летальных аскоспор и соответствовал штературным данным (Pringle and Hartwell, 1981).

При тетрадном анализе диплоидов, гетерозиготных по дизрупции STJP35 ши SUP45, проведенном при 30°С, наблюдали преимущественно расщепление

2:2 по жизнеспособности аскоспор. Все жизнеспособные аскоспоры бьип неспособны к росту на среде без триптофана, то есть, несли ген SUP35 (дл; сегрегантов Д782) или SUP45 (для сегрегантов Д781) дикого типа. В тетрадах, l которых были жизнеспособны две аскоспоры, микроскопировали летальные. У обоих гибридов все летальные аскоспоры останавливались на стадии отдельной клетки, содержащей иногда (5 из 68 исследованных) зачаток почки (рис.1 в, г), Подобная картина характерна для точки START стадии Gi клеточного цикла.

а) б)..........в) г)

Рис. 1. Летальные аскоспоры гибридов, гетерозиготных по мутациям: а) а1с28, б) сйс4, в) дизрупции $17Р35, г) дизрупции $иР45. Изолированные аскоспоры инкубировали двое суток при температуре 36°С (а, б) или 30°С (в, г) на полноценной среде УРй.

Влияние супрессорных мутаций sup35 и sup45 на стабильность хромосом. Чувствительность супрессорных мутаций snp35 и sup45 к беномилу, деполяризующему микротрубочки (Tikhomirova and Inge-Vechtomov, 1996),

одтверждает гипотезу о роли eRF3 и eRFl в процессах, контролируемых ппаратом цитоскелета. Это подтверждает и то, что дизрупция гомолога SUP35 у ). melanogaster приводит к аномалиям цитоскелета, нарушениям расхождения ромосом в мейозе и стерильности самцов (Basu et al., 1998). Следовательно, южно предполагать участие факторов терминации трансляции S. cerevisiae в онтроле трансмиссии хромосом в ходе клеточных делений. Для проверки этой ипотезы мы оцепили стабильность добавочной копии хромосомы III у упрессорных мутантов sup35 и sup45, полученных на гаплоиде-дисомике ЗБ-15216, гетерозиготном по типу спаривания. Установить факт потери одной из опий хромосомы III можно по способности к скрещиванию с одним из тестеров ипа спаривания: 22Б-П4415 (МАТа) или 14А-П4415 {МАТа). Комбинация гаркеров дает возможность отличить потерю хромосомы (в случае потери омолога, несущего МАТа) от других событий, приводящих к скрещиванию: омозиготизации локуса МАТ в результате митотической рекомбинации или ютери правого плеча хромосомы III. Частота остаточного («незаконного») крещивания дисомика ЗБ-П5216 составила 0,5 - 1x10 s и в большинстве случаев 96±2,7%) была вызвана потерей копии хромосомы III.

Определение стабильности хромосомы III у мутантов sup35 и sup45, побранных как ревертанты Ade+His+, проводили в качественном тесте (рис. 2). )ценивали способность к скрещиванию с тестерами у четырех субклонов :аждого мутанта. Считали стабильность хромосомы III нормальной, если все [етыре субклона проявляли фенотип незаконного скрещивания с обоими естерами (отдельные колонии гибридов па перекрестьях, количество колоний [римерно одинаково для опытного и контрольного скрещиваний). Считали табилыюсть хромосомы III сниженной (фенотип Lern; от Low chromosome naintenance), если хотя бы один из четырех субклонов: а) проявлял фенотип акотшого скрещивания с одним из тестеров (газон на перекрестье), не влягощийся результатом митотической рекомбинации или потери правого плеча ;ромосомы III; б) фенотип незаконного скрещивания с обоими тестерами, но с :оличеством колоний на перекрестьях примерно в 10 раз превышающим .оличество колоний в контрольном скрещивании.

Рисунок 2. Тест на миготическую стабильность хромосомы III.

Горизонтальные штрихи — спонтанные супрсссорныс мутанты (четыре субклона для каждого мутанта): 1-4 — sup35-19, 5-»-sup35-25, 9-12 - sup45-9, 13-16 - sup35-10, 17 - исходный штамм дикого типа ЗБ-П5216 (контроль). Вертикальные штрихи - тестеры типов спаривания: а - 25Б-П4415 (МАТл), a - 014А-П4415 (МАТп). Клоны 3,6,8-16 проявляют фенотип Lcm+

Стабильность хромосомы III у мутантов sup35 и sup45, индуцировании* УФ-облучением, была достоверно ниже по сравнению с контрольной выборкой однако, воздействие УФ-светом само по себе индуцировало потерю хромосомь (табл. 2.). Чтобы избежать эффекта воздействия УФ-излучения мы изучила выборку спонтанных мутантов sup35 и sup45 и убедились, что и у них падает стабильность хромосомы III (табл. 2.)

Таблица 2.

Стабильность хромосомы III у мутантов sup35 и sup45, полученных спонтанно и под воздействием УФ-излучения._

Мутанты Стабильность хромосомы III snp35 sup45 контрольная выборка (без супрессорной мутации)

индуциро- пониженная 20 18 19

ванные нормальная 16 29 71

ультра- сумма 36 47 90

фиолетом доля с пониженной 56± 38± 21±

стабильностью 8.2% 7.1% 5.3%

пониженная 108 24 3

спонтанные нормальная 38 19 197

сумма 146 43 200

доля с пониженной 74± 56± 2±

стабильностью 3.8% 7.6% 0.9%

Стабильность хромосомы III у мутантов sup35 и sup45 достоверно ниже по сравнению с контрольной выборкой (Р<0.05).

По времени появления колоний ревертантов на среде C-Ade,His мы разделили спонтанных мутантов на две группы: «ранние» — отобранные па 8-15 день инкубации, и «поздние» - отобранные на 20-25 день инкубации. Между этими двумя группами различия как по соотношению мутантов sup35 и snp45 (подавляющее большинство «поздних» ревертантов - мутанты sup35), так и по стабильности хромосомы III (все «поздние» мутанты проявляют сниженную стабильность хромосомы) (табл. 3.).

Мы не обнаружили различий по жизнеспособности и эффективности супрессии между «ранними» и «поздними» мутантами sup35 и sup45. Потеря одной из копий хромосомы III у всех «поздних» ревертантов позволяет предположить, что соответствующие мутации sup35 или sup45 приводят к критическому уровню дестабилизации хромосом и, следовательно, обладают летальным (сублетальным) эффектом. В этом случае, появление колоний «поздних» ревертатов может происходить благодаря отбору клеток, несущих мутации в генах-модификаторах, восстанавливающие жизнеспособность за счет (частичной) стабилизации трансмиссии хромосом в ходе клеточных делений.

Таблица 3.

Стабильность хромосомы III у «ранних» и «поздних» спонтанных

супрессо рных ревертантов.

День отбора количество ревертантов sup35 Стабильность хромосомы Ш Sup45 Стабильность хромосомы III

Нормальная пониженная Нормальная пониженная

8-15 146 38 68 19 21

20-25 43 0 40 0 3

сумма 189 38 108 19 24

Это подтверждается и отсутствием снижения стабильности центромерной члазмиды pRS415 у трансформантов пяти исследованных «поздних» мутантов тр35 по сравнению с трансформантами штамма дикого типа э1-ЗБ-П5216

У 16 мутантов Lern и 11 мутантов Lern" мы проанализировали в спот-тесте рис. 3) чувствительность к беномилу - агенту, деполимеризующему ликротрубочки и нарушающему расхождение хромосом в анафазе митоза. Все лутанты Lern проявляли повышенную чувствительность к беномилу, мутанты хт' - ту же чувствительность к беномилу, что и штаммы дикого типа. Говместпое проявление фенотипов «пониженная стабильность хромосом» и (повышенная чувствительность к беномилу» позволяет сделать вывод, что это [ва плейотроппых проявления одной мутации и потеря хромосомы III у lyraiiTOB sup35 и sup45 связана с их нерасхождением в анафазе митоза.

ЗВ-Р5216

$ир35-37

Рисунок 3. Спот-тест на чувствительность к беномилу. 200 мкг беномила на каждом фильтре.

Для доказательства того, что чувствительность к беномилу и супрессия вляются плейотропными проявлениями одной мутации, мы изучили озможность компенсации обоих признаков у мутантов зир35 аллелью гена 11Р35 дикого типа при трансформации центромерной плазмидой рАБВ2. У эансформантов пяти исследованных мутантов исчезала нонсенс супрессия и эсстанавливалась устойчивость к беномилу. Компенсация супрессорного })фекта и чувствительности к беномилу у мутантов .чир35 аллелыо БиР35

дикого типа доказывает, что оба эти эффекта - плейотропные проявления мутации (ий) sup35, и подтверждает, что дестабилизация хромосомы III в коллекции полученных мутантов вызвана супресорными мутациями sup35 или sup45.

Чувствительность к беномилу и дестабилизация хромосом у мутантов sup35 или sup45 может объясняться как специфичным эффектом частичной инактивации факторов терминации eRF3 и eR.Fl, так и неспецифичным эффектом снижения точности трансляции. Для разрешения этой альтернативы мы исследовали стабильность хромосомы III и чувствительность к беномилу у спонтанных доминантных кодон-специфичных супрессоров мутации his7-l (UAA). Все 23 исследованных супрессора проявляли нормальную стабильность хромосомы III. Таким образом, снижение точности трансляции у доминантных супрессоров не приводит к снижению стабильности хромосом. С этим согласуется и то, что воздействие паромомицином - агентом, снижающим точность трансляции, не приводило к увеличению частоты потери хромосомы Ш у штамма ЗБ-П5216. Оба эти факта указывают на то, что снижение стабильности хромосом у мутантов sitp35 или snp45 вызвано специфичным эффектом частичной инактивации факторов терминации eRF3 и eRFl. А одинаковая эффективность супрессии у мутантов Lcm+ и Lern" (см. выше) - на то, что дестабилизация хромосом не является следствием нарушения функции терминации трансляции, а связано с дефектом иных функций eRF3 и/или eRFl.

Характеристика мутаций, нарушающих кариогамию и взаимодействующих с мутациями sut>35. sup45 и [Р5Т|-фак"гопом. В предыдущих исследованиях на штамме 132-л28 было получено 68 мутантов Hfc' (Борхсениус, дипломная работа, 1995). Девять из них проявили антисупрессорный эффект (Asu'), идентифицированный хотя бы в одном из трех тестов: а) в экспресс-тесте па антисупрессию по подавлению отбора мутантов snp35 и sup45 (ревертаитов Ade+His+); б) по подавлению супрессии у двойных мутантов Hfc+ sup35 (sup45)\ в) по подавлению супрессии, вызванной [PSIJ-фактором, у гибридов мутантов Hfc+ и тестера [PS1*] - 223-П5213 (рис.4 и табл.4).

а) б) в)

Рисунок 4. Фенотипы Н&+ и А5и" у мутанта IТГс 12-2.

а) Качественный тест на цитодукцию. Скрещивание с реципиентом цитоплазмы 7-1-90-Д201: среда, селективная для отбора цитодуктантов.

б) Экспресс-тест на антисупрессию. Среда С-А(Зе,Ш8 для отбора мутантов зир35 и зыр45.

в) Подавление супрессии, вызванной [РБЦ-фактором. Скрещивание с тестером [Р57+] - 223-П5213. Среда С-Аёе для оценки супрессии а<1е1-14.

Таблица 4

Аптисупрессориые эффекты у мутантов ШУ.____

Мутанты Аптисупрессорный эффект:

НГс+. по снижению по отношению по отношению Доминантный

частоты отбора к яирЗ5 к Бир45 по отношению

ревертантов Ade+ Н1в+ к [РБЦ

132-л28 - - - -

контроль)

НГс 12-2 + ++ ++ ++

НГс45-5 + + + +

НГс54-5 + + + +

НГс 12-3 + + + -

НГс63-4 + + + -

НГс35-5 + + - -

НГс46-5 + - - +

Шс5-2 + - - -

НГс21-4 - - - +

«!» - наличие, «-» - отсутствие антисупрессорного эффекта.

Косегрегацшо признаков НРс+ и Ази проверяли в качественном тесте на игодукцию и экспресс-тесте па антисупрессию. Анализировали сегреганты ибридон мутантов НГс и тестера 88Г-Д737 (НГс" Ази"), полученные в случайной ыборке аскоспор. Во всех случаях наблюдали варьирование в качественном есте па цитодукциго: часть сегрегантов проявляла фенотип НБг+ или НГс", часть -ромежуточный фенотип. В тесте на антисупрессию сегреганты мутантов Шс12-, НГс 12-3 и НГс5-2 проявляли четкий Ази' или Аз и" фенотип, причем, все ггреганты фенотипа НГс" были и Абиь, а НГс" - и Ази" (табл. 5). Это дает гповаиия полагать, что у штаммов НГс 12-2, НГс 12-3 и Шс5-2 признаки НГс+ и зи - результат проявления одной мутации. В остальных случаях проявление ризнака Ази также варьировало, что не дает возможности однозначно феделить характер наследования.

Таблица 5

Косегрегация признаков НГс+ и Ази"1".

лбриды от Число сегрегантов:

:рещивания НГс+ Шс* Шс" 2

>Г-Д737 и: Ави+ Ави" Ази* Ази" Ави+ Ази"

Гс5-2 29 0 13 17 0 35 94

Гс12-2 33 0 24 9 0 30 96

Рс12-3 32 0 15 17 0 34 98

Подавление супресеорного эффекта мутаций sup35 и/или sup45, у мутантов Hfc+ может объясняться как «исправлением» функции терминации у белков eRF3 и/или eRFl, так и нарушением взаимодействия нонсенс-кодона с тРНК, способными его транслировать. Мы не обнаружили различий в эффективности супрессии, вызванной доминантной мутацией SLT3 в гене глутаминовой тРНК (UUG—>UUA), у мутантов Hfc+Asu+ по сравнению с штаммом дикого типа. Таким образом, исследованые мутации Asu , по-видимому, специфически действуют па работу факторов терминации.

Фенотип Asu+ у мутантов НГс' может быть следствием изменения регуляции транскрипции SUP35. Ранее при гибридизации ДНК SUP35 с тотальной РНК, выделенной из клеток дрожжей, было обнаружено два транскрипта: основной (2,3 т.п.о.), соответствующий всему гену SUP35, и минорный (1,4 т.п.о.), соответствующий его З'-концевому участку (Surguchev et al., 1986), амплификация которого обладает антисупрессорным эффектом (Тег-Avanesyan et al., 1993). Следовательно, Asu'-фенотпп мутантов Hfc+ может быть вызван увеличением экспрессии минорного транскрипта SUP35. Для проверки этой гипотезы провели анализ экспрессии гена SUP35 методом нозерн-блот гибридизации. Результаты гибридизации не показали различий в содержании двух фракций мРНК у мутантов HfcTAsu по сравнению с изогенным штаммом дикого типа. Таким образом, аптисупрессорпый фенотип мутантов Hfc+Asu+ не связан с изменением соотношения выявляемых транскриптов. *

Взаимодействие мутации HFC12-2 и прионных форм Sup35p. Мутант Hfcl2-2 проявлял доминантный эффект подавления супрессорной активности [PSIj-фактора, что может объясняться как компенсаторным изменением в аппарате терминации трансляции, так и элиминацией [PSIj-фактора. При тетрадном анализе гибрида П5214 (Hfcl2-2 х 223-П5213: HFC12-2//+ adel-14//adel-l4 [PSJ ]) наблюдали моногенное расщепление по супрессии adel-14, что говорит о присутствии [PSIj-фактора в клетках гибрида. Сегреганты П5214 фенотипа Ade" также содержат [PSIj-фактор, так как при их скрещивании со штаммом 29В-П2156 (adel-14 [psfj) и последующем анализе сегрегантов полученных гибридов также наблюдается моногенное расщепление по потребности в аденине. Таким образом, мутация HFC12-2 обладает доминантным антисупрессорным эффектом, но не обладает ни доминантным, ни рецессивным эффектом элиминации [PSij-фактора.

Кроме того, в штамме Hfcl2-2 может возникать de novo другая прионная форма Sup35p - [ЕТА]-фактор, не имеющая у многих штаммов собственного фенотипического проявления на фоне аллелей SUP35 или SUP45 дикого типа, не обладающая летальным эффектом при взаимодействии с рецессивными супрессорами sup35 и sup45. При тетрадном анализе гибрида П52П скрещивании (Hfcl2-2 х р12-7А-П185: adel-14//adel-14 BFC12-2//+ +//sup45,s] все аскоспоры, несущие sup45" были нежизнеспособными, что можст объясняться возникновением в штамме Hfcl2-2 [ETA]-подобного фактора

Обработка гибрида П5217 гидрохлоридом гуаиидииа, элиминирующим [ЕТА]-фактор, приводила к восстановлению фертильности. В полных тетрадах два из четырех сегрегантов проявляли чувствительность к повышенной температуре, то есть, несли мутацию snp45'\ причем ts-фенотип не подавлялся мутацией HFC12-2, в отличие от супрессорного фенотипа: дигибридное расщепление по потребности в аденине указывало на взаимодействие мутаций HFC12-2 и sup45is.

Таким образом, мутация HFC12-2 не влияет на поддержание [PSIJ-фактора в клетках дрожжей и не запрещает конверсию Sup35p в прионпую форму, то есть не затрагивает «онтогенез» приона. Антисупрессорный эффект мутации HFC12-2 не сопровождается компенсацией других эффектов мутационной или кодификационной инактивации eRF3 и eRFl (ts-фенотип sup45 и летальное взаимодействие [ЕТА]-подобного фактора и sup45). Это указывает на то, что шрушение терминации трансляции само по себе не является причиной дополнительных плейотропных проявлений инактивации eRF3 и eRFl, и тодтверждает, что эти проявления являются результатом нарушения разных функций этих белков.

Изучение прионизации продукта мутантной аллели SUP35 - sup35A22-69. Мутация HFC12-2, предположительно затрагивающая тубулиповый цитоскелет, юдавляет проявление [PSI], по не его поддержание в клетках. В то же время, ттисупрессорпый эффект делеции гена S LA 1, кодирующего один из юмпонентов актинового цитоскелета, объясняется снижением митотической табильности [PSIJ-фактора. Для взаимодействия eRF3 и Slalp необходим гчасток от 22°" до 69ой аминокислот eRF3 (Bailleul et al., 1999), что может называть на необходимость этого участка eRF3 для трансмиссии приона в ходе леточных делений. Для проверки этой гипотезы мы изучили влияние делеции 2ОГО-69ОГО кодонов SUP35 (sup35A22-69) на индукцию и поддержание [PSI]-¡актора.

Для индукции [PSIJ-фактора при сверхпродукции прионизующего домена up35p (Sup35N) штаммы GT247-1C (sup35A22/69) и GT255-2D (SUP35) рансформировали плазмидой pRS316GAL-SUP35N, инкубировали на среде с алактозой и затем печатали на среду C-Ade, содержащую глюкозу в качестве сточника углерода и, следовательно, репрессирующую GALpr. Появление [PSIJ-|актора тестировали по способности супрессировать мутацию adel-14. Колонии de наблюдали как у штамма, содержащего аллель SUP35 дикого типа, так и эдержащего sup35A22/69, что указывает на возможность конверсии ир35Д22/69р в приоиную форму - [PSIA22/64] (рис. 5а). Однако в отличие от 'SIJ-фактора - приоиной формы продукта SUP35 дикого типа, [PSIA22/69] крайне гстабилен: суточная инкубация в неселективных условиях, предшествующая греносу культуры на среду C-Ade, приводила к резкому снижению появления элоиий Ade+ (рис.56).

SUP35 sup35A22/69 Реципиенты

Рисунок 5. Индукция [PSIA22/®J.

Трансформанты штаммов 255-20 (5иР35) и 247-1С (.чир35А22/69) плазмидой рК53160АЬ-8иР35М {САЬрг-8иР35Ы).

а) 3 дня инкубации на Содь-иКА —> 10 дней инкубации на С-А(1е.

б) 3 дня инкубации на Содь-иЛА —» один день на УРО -»10 дней инкубации на С-Ас1е.

Одним из критериев присутствия [PSFJ-фактора в клетках дрожжей наряду с их фенотипической характеристикой (супрессия нонсенс-мутаций) служит наличие агрегатов, содержащих Sup35p. Мы оценили агрегацию Sup35A22/69p до и после индукции [PSIÄ22/69] иммунохимически с использованием антител, специфичных к N-домену Sup35p, и цитологически по образованию агрегатов ("зерен") продукта химерного гена SUP35NMA22/69-GFP. Прионная форма Sup35A22/69p, также как и Sup35p образует агрегаты: белок Sup35A22/69p, выделенный из клеток колоний Ade*, детектируется в нерастворимой фракции, а Sup35NMA22/69-GFP образует «зерна» свечения (рис.6). Однако после инкубации клеток колоний Ade+ в неселективных условиях наблюдается равномерное свечение Sup35NMA22/69-GFP как и до индукции [PSIA22/69] (рис. 6). Таким образом, делеция 22-69 кодонов не препятствует конверсии eRF3 в прионную форму, но подавляет передачу приона в клеточных делениях. Наиболее вероятным объяснением этого факта является нарушение взаимодействия [PSIA22/69] с актиновым цитоскелетом.

GT255-2D (SUP35) + SUP35NM-GFP

ОТ247-1С (эир35022/69) +SUP35NM 022/69-СРР

0) О в)

Рис.6 Агрегация химерных белков, содержащих прионизующий пептид сЯИЗ (8ир35ЫМ или 8ир35ЫМД22/69), слитый с ОРР.

а) клетки до индукции [Р51]-фактора. б) клетки после индукции [Р81]-фактора (клетки колоний Ас1е+). в) клетки после индукции [Р51]-фактора (клетки колоний Ade+ инкубированы 2 сутоь на полной среде УРО).

ÉÉÉHlflk

Заключение. Полученные в работе данные доказывают участие факторов герминации трансляции в контроле инициации клеточного цикла и их взаимодействие с компонентами аппарата цитоскелета. Плейотропные проявления мутаций яир35 и яир45, их взаимодействие с мутациями ///с' указывают на то, что эффекты полной или частичной инактивации еЯРЗ и еЯР1 тевозможно объяснить исключительно нарушением функции термипации трансляции. Мы предполагаем, что взаимодействие еИРЗ и е!1Р1 (или, по файпей мере, еИРЗ) с белками цитоскелета необходимо для сомпартментализации трансляции в клетке и пространственного контроля слеточпого цикла. В этом случае, нарушение белок-белковых взаимодействий ;ЯРЗ с элементами цитоскелета может приводить к дестабилизации аппарата рансляции с одной стороны, и цитоскелетных структур, с другой. Кроме того, южно предположить, что появление [РОД-фактора представляет собой юбочный результат нормального процесса олигомеризации элементов щтоскелета, вызванное изменением баланса молекул еРРЗ и цитоскелетных !елков и/или ошибками их взаимодействия.

ВЫВОДЫ.

. Полная инактивация генов БиР35 или Б1)Р45 приводит к блоку инициации клеточного цикла.

. Рецессивные супрессорные мутации $ир35 или яир45 снижают митотическую

стабильность хромосом. . У мутантов Шс5-2, НГс12-2 и Н1с12-3 признаки «повышенная частота цитодукции» и «аитисупрессия» являются плейотропными проявлениями одной мутации.

, Мутация НРС12-2, приводящая к повышению частоты цитодукции, восстанавливает эффективность термипации трансляции, сниженную при частичной инактивации 8ир35р (еКРЗ) или Бир45р (еЯР1), но не компенсирует другие проявления этой инактивации.

Деления 22-69 кодонов гена БиР35 подавляет трансмиссию [РБЦ-фактора -прионной формы Бир35р в клеточных делениях.

На основании полученных данных выдвинута гипотеза о необходимости взаимодействия еЯРЗ и сРР1 с элементами цитоскелета для компартментализации трансляции в клетке и пространственного контроля клеточного цикла.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Борхсениус А.С. (1994) Определение стадии клеточного цикла, блокируемой при инактивации генов SUP35 и SUP45 в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. (Тезисы 1-го съезда ВОГИС). Генетика. 30: 38.

2. Борхсениус А.С., Тихомирова B.JI., Инге-Вечтомов С.Г. (1996) Трансляционный контроль клеточного цикла. Модельная система дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 4-я международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 21-25 мая 1996. Программа и тезисы, стр. 167.

3. Borchsenius A.S., Repnevskaya M.V., Kurischko С., Inge-Vechtomov S.G. (1996). Antisuppressor effect of mutants with impaired karyogamy in Saccharomyces cerevisiae. (Abstr.) Yeast Genetics and molecular biology meeting. University of Wisconsin, August 6-11.1996. Program and abstracts volume, p. 266.

4. Борхсениус A.C., Инге-Вечтомов С.Г. (1997) О роли генов SUP35 и SUP45 в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов. Докл. Акад. Наук. 353: 553-556.

5. Borchsenius A.S., Inge-Vechtomov S.G. (1997) Mutation which neutrlizes [PSI] is inneficient toward [ЕТА]. (Abstr.of 18th International conference on yeast genetics and molecular biology) Yeast. 13: 63.

6. Tchourikova A.A., Borchsenius A.S., Inge-Vechtomov S.G. (1999) Translation termination factors eRF3 and eRFl are involved in chromosome segregation at mitotic anaphase in yeast. (Abstr.of 19th International conference on yeast genetics and molecular biology) Curr. Genet. 35(3-4): 189.

7. Borchsenius A.S., Tchourikova A.A., Inge-Vechtomov S.G. (2000) Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 37: 285-291

8. Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Jl.H., Аленин B.B., Борхсениус А.С. Прионы. синтез белка и клеточный цикл. Вестник СПбГУ (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борхсениус, Андрей Сергеевич

Обозначения и сокращения.

Введение.

1. Интеграция контроля трансляции и клеточного цикла у эукариот (обзор литературы).

1.1. Общая характеристика контроля клеточного цикла.

1.2. Трансляция и инициация клеточного цикла.

1.3. Трансляция и цитоскелет.

1.4. Факторы терминации трансляции eRF3 и eRFl: роль в контроле трансляции и других клеточных процессов.

1.5. Постановка задачи.

2. Материалы и методы.

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.1.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерии Escherichia coli.

2.1.2. Плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3 Генетические методы.

2.3.1. Стандартные генетические методы.

2.3.2. Тест-система оценки митотической стабильности хромосом.

2.3.3. Получение и анализ рецессивных супрессоров sup35 и sup45 и доминантных ко дон-специфичных супрессоров.

2.3.4. Анализ митотической стабильности плазмиды pRS415.

Селективная система цитодукции. Качественный тест на цитодукцию.

Молекулярно-биологические методы.

Методы микроскопирования.

Статистическая обработка результатов.

Результаты.

Определение стадии клеточного цикла, блокируемой при инактивации SUP35 или SUP45.

Определение терминального фенотипа.

Оценка возможности гибридизации летальных аскоспор с клетками противоположного типа спаривания.

Влияние супрессорных мутаций sup35 и sup45 на стабильность хромосом.

Стабильность добавочной копии хромосомы III у мутантов sup и sup45.

Стабильность центромерной плазмиды у «поздних» мутантов sup35.

Чувствительность к беномилу у мутантов с нормальной или пониженной стабильностью хромосом.

Супрессия и чувствительность к беномилу как плейотропные проявления мутаций в гене SUP35.

Влияние доминантных супрессоров на стабильность добавочной копии хромосомы III и чувствительность к беномилу.

Характеристика мутаций, нарушающих кариогамию и взаимодействующих с мутациями sup35, sup45 и [PSI]-фактором.

3.3.1. Антисупрессорный эффект у мутантов Шс+. Анализ косегрегации признаков Шс+ и Аэи+.

3.3.2. Нонсенс-супрессия у мутантов Шс+А8и+, обусловленная мутацией БЬТЗ.

3.3.3. Экспрессия ХОР35 у мутантов Шс+Ази+.

3.3 .4. Взаимодействие мутации НРС12-2 и прионных форм БирЗ 5.

3.3.4.1 Взаимодействие мутации НРС12-2 и [РБЦ-фактора.

3.3.4.2. Взаимодействие мутации НРС12-2 и [ЕТА]-фактора.

3.4. Изучение прионизации продукта мутантной аллели ЯС/Р35 шр35Л22-69.

3.4.1. Получение штаммов, содержащих аллель зир35Л22/69.

3.4.2. Индукция [РБЦ-фактора в реципиенте яир35А22/69.

3.4.3. Нестабильность р^2769].

3.4.4. Агрегация [РБГ^69].

4. Обсуждение.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Общий генетический контроль терминации трансляции и клеточного цикла у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Клеточный цикл - это совокупность строго упорядоченных процессов, ведущих к удвоению клетки. Контроль клеточного цикла реализуется через регуляцию экспрессии генов на самых разных стадиях, в частности, на стадии трансляции. Показано, что многие компоненты аппарата трансляции, в частности, факторы инициации трансляции вовлечены в контроль клеточного цикла на стадии Gi. Для фактора элонгации трансляции EF-la показано взаимодействие с белками актинового и тубулинового цитоскелета, что обеспечивает компартментализацию синтеза белка и модулирует динамику цитоскелета в ходе клеточного цикла. Факторы терминации трансляции, по-видимому, также взаимодействуют с системами контроля клеточного цикла. Так, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae мутация gstl, блокирующая переход от стадии Gi к стадии S, картирована в гене SUP35 (Kikuchi et а1.,1988). Этот ген кодирует фактор терминации трансляции eRF3 (Zhouravleva et al., 1995). Многие рецессивные мутации в этом гене и в гене SUP45, кодирующем фактор eRFl, наряду со снижением точности трансляции (супрессии нонсенс-мутаций) приводят к чувствительности к беномилу (Tikhomirova and Inge-Vechtomov, 1995) - агенту, деполимеризующему микротрубочки и, как следствие, нарушающему расхождение хромосом в митозе и мейозе и слияние ядер (кариогамию) при гибридизации клеток. О возможном взаимодействии Sup35 и тубулинового цитоскелета говорит и то, что некоторые мутации, нарушающие кариогамию, подавляют супрессорный эффект [PSIJ-фактора -модифицированной (прионной) формы Sup35. К снижению митотической стабильности [PSIJ-фактора приводит и делеция гена SLA1, кодирующего один из компонентов актинового цитоскелета. Для белков Sup35 и Slal показано 7 физическое взаимодействие, для которого необходим С-концевой домен 81а 1 и участок от 22ой до 69ой аминокислот 8ир35 (ВаШеи1 е1 а1., 1999). Все эти факты свидетельствуют о тесной интеграции контроля терминации трансляции и клеточных делений. Однако механизмы этого взаимодействия требуют дальнейшего изучения, что и было предметом наших исследований.

Целью данной работы являлось генетическое изучение роли факторов терминации трансляции еКРЗ (8ир35) и еМЛ (8ир45) в контроле клеточного цикла дрожжей 51 сегехпягае и взаимодействия 8ир35 и 8ир45 с компонентами аппарата клеточных делений в контроле терминации трансляции.

В настоящей работе мы изучили влияние полной инактивации (дизрупции) генов 811Р35 или $1ТР45 на клеточный цикл и показали, что дизрупция этих генов приводит к блоку инициации клеточного цикла. Также мы показали, что рецессивные супрессорные мутации тр35 или $ир45 снижают митотическую стабильность хромосом, по-видимому, нарушая их расхождение в анафазе митоза. Мы исследовали взаимодействие мутаций хир35 и тр45 или модифицированного (прионизированного) 8ир35 с мутациями, приводящими к повышенной частоте цитодукции (мутациями Н/с+). В результате, нами впервые выявлены мутации Щс+А$и , одновременно нарушающие кариогамию и подавляющие супрессорный эффект яирЗЗ и/или ьир45. Мы изучили влияние делеции 22ОГО-69ОГО ко донов 511Р35, нарушающей взаимодействие 8ир35 и 81а 1, на индукцию и поддержание [Р81]-фактора и показали, что эта делеция подавляет способность прионной формы Бир35 к сегрегации в ряду клеточных делений.

Полученные в работе данные доказывают участие факторов терминации трансляции в контроле инициации клеточного цикла и их взаимодействие с 8 компонентами аппарата цитоскелета. Мы предполагаем, что взаимодействие Бир35 и 8ир45 (или, по крайней мере, 8ир35) с белками цитоскелета необходимо для компартментализации трансляции в клетке и пространственного контроля клеточного цикла. В этом случае, нарушение белок-белковых взаимодействий Бир35 с элементами цитоскелета может приводить к дестабилизации аппарата трансляции с одной стороны, и цитоскелетных структур, с другой. Кроме того, можно предположить, что появление [Р.57]-фактора представляет собой побочный результат нормального процесса олигомеризации элементов цитоскелета, вызванное изменением баланса молекул 8ир35 и цитоскелетных белков и/или ошибками их взаимодействия.

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ. Отдельные эксперименты выполнены в лаборатории микологии ин-та им. Ханса-Кнолля (Йена, ФРГ) и в лаборатории Ю. Чернова Технологического ин-та Джорджии (Атланта, США). 9

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Борхсениус, Андрей Сергеевич

Выводы.

Полная инактивация генов SUP35 или SUP45 приводит к блоку инициации клеточного цикла.

Рецессивные супрессорные мутации sup35 или sup45 снижают митотическую стабильность хромосом.

У мутантов Hfc5-2, Hfcl2-2 и Hfcl2-3 признаки «повышенная частота цитодукции» и «антисупрессия» являются плейотропными проявлениями одной мутации.

Мутация HFC12-2, приводящая к повышению частоты цитодукции, восстанавливает эффективность терминации трансляции, сниженную при частичной инактивации Sup35p (eRF3) или Sup45p (eRFl), но не компенсирует другие проявления этой инактивации.

Делеция 22-69 кодонов гена SUP35 подавляет трансмиссию [PSIJ-фактора -прионной формы Sup35p в клеточных делениях.

На основании полученных данных выдвинута гипотеза о необходимости взаимодействия eRF3 и eRFl с элементами цитоскелета для компартментализации трансляции в клетке и пространственного контроля клеточного цикла.

Благодарности.

В заключение хочу выразить благодарность своему научному руководителю Сергею Георгиевичу Инге-Вечтомову за внимание, помощь, поддержку и терпение. Я благодарю Анну Александровну Чурикову, Елену Сергеевну Голованову и Марину Викторовну Репневскую за участие в постановке ряда экпериментов; Ирину Львовну Деркач, Алексея Петровича Галкина, Рольфа Свободу и Рени Вегржин за помощь в освоении некоторых методик; Юрия Олеговича Чернова и Корнелию Куришко за предоставленную возможность сотрудничества; Наталью Анатольевну Рябинкову, Елену Александровну Андрееву и Анатолия Кирилловича Жукова за помощь в оформлении рукописи.

Огромное спасибо сотрудникам и студентам кафедры генетики и селекции СПбГУ за дружескую и творческую атмосферу и моральную поддержку на всех этапах работы.

113

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борхсениус, Андрей Сергеевич, Санкт-Петербург

1. Банникова М.А., (1986). Генетическое изучение цитодукции у дрожжей $ассЪаготусе8 сеге\nsicie. Канд. дисс.~Л: 1986. 146 с.

2. Борхсениус А.С. (1995). Взаимодействие омнипотентных супрессоров и мутаций, нарушающих кариогамию, у дрожжей йасскаготусея сегеугзгае. Дипл. работа.- СПб: 1995. 71с.

3. Волков К.В., Куришко К, Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Л.Н. (2000). Полиморфизм гена $1.Р35 и его продукта у дрожжей БассИаготусев сегеУ1$1ае. Генетика. 35: 1-4.

4. Глотов Н.В., Животовский Н А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. (1982). Биометрия. Л. : Изд-воЛГУ. 264 с.

5. Захаров И.А., Юрченко Л.В., Яровой Б.Ф. (1969). Цитодукция автономный перенос цитоплазматических наследственных факторов при спаривании клеток дрожжей. Генетика 5: 136-141.

6. Захаров И.А., Кожина Т.Н., Кожин С.А., Федорова И.В. (1984). Сборник методик по генетики дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 144 с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. (1964). Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине. Вест. ЛГУ: Сер. Биол. 2: 112-116.

8. Инге-Вечтомов С. Г. (1971). Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей. Генетика. 7: 113-124.

9. Инге-Вечтомов С.Г. и Андрианова В.М. (1972). Новый тип супрессоров у дрожжей (в сб.: Молекулярные механизмы клеточных процессов). М, Наука. 189-195.114

10. Инге-Вечтомов С.Г. и Андрианова В.М. (1988) Каталог (указатель) Петергофской генетической коллекции дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Л., Изд-воЛГУ. 53 с.

11. Инге-Вечтомов С.Г. и Карпова Т.С. (1984). Селективная система цитодукции с использованием рецессивных супрессоров у дрожжей-сахаромицетов. Генетика. 20: 398-407.

12. Инге-Вечтомов С.Г. и Карпова Т.С. (1993) Частная генетика дрожжей сахаромицетов. Л., Изд-во СПбГУ. 252 с.

13. Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Л.Н., Тер-Аванесян М.Д. (1994). Неоднозначность трансляции: версия эукариот? Генетика. 30: 1022-1035.

14. Инге-Вечтомов С.Г., Тиходеев О.Н., Карпова Т.С. (1988). Селективные системы для получения рецессивных рибосомных супрессоров у дрожжей-сахаромицетов. Генетика. 24: 1159-1165.

15. Куприна Н.Ю. (1997). Изучение трансмиссии природных и искусственных хромосом (YAC) у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Док. дисс.- СПб: 1997. 48 с.

16. Ларионов В.Л. (1986). Репликация и сегрегация экстрахромосомных элементов у дрожжей-сахаромицетов. Док-, дисс,-Л: 1986. 351 с.

17. Телков М.В., Сургучев А.П., Дагкесаманская А.Р., Тер-Аванесян М.Д. (1986). Выделение фрагмента ДНК, содержащего ген SUP35. Генетика. 22: 17-25.115

18. Тиходеев О.Н., Гетманова Е.В., Тихомирова В.Л., Инге-Вечтомов С.Г. (1990). Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации (В сб.: Молекулярные механизмы генетических процессов). М.: Наука. 218-228.

19. Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесаманская А.Р., Тихомирова В.Л., Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. (1988). Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Докл. АН СССР. 301: 1227-1229.

20. Alberts В., Bray D.,Lewis J., Raff М, Roberts К., Watson J.D. (1994) Molecular biology of the cell. (The 3rd edt) NY: Garland Publishing.

21. Barbarese E., Koppel D.E., Deutscher M P. Smith C.L., Ainger K., Morgan F., Carson J.H. (1995). Protein translation components are colocolized in granules in oligodendrocytes. J. Cell Sei. 108: 2781-2790.

22. Barbet N.C., Schneider U., Helliwell S.B., Stansfield I., Tuite M.F., Hall M. (1996). TOR controls translation initiation and early Gl progression in yeast. Mol Cell Biol. 7: 25-42.

23. Basseil G.J., Powers C.M., Taneja K.L., Singer RH. (1994). Single mRNAs visualized by ultrastructural in situ hybridization are principally localized at actin filament intersections in fibroblasts. J. Cell Biol. 126: 863-876.

24. Basseil G., Singer R.H. (1997). mRNA and cytoskeletal filaments. Curr. Opin.Cell.Biol. 9: 109-115.116

25. Basu J., Williams B.C., Li Z., Williams E.V., Goldberg M L. (1998). Depletion of a Drosophila homolog of yeast Sup35p disrupts spindle assembly, chromosome segregation, and cytokinesis during male meyosis. Cell Motil. Cytoskeleton. 39: 286-302.

26. Berset C., Trachsel H., Altmann M. (1998). The TOR (target of rapamycin) signal transduction pathway regulates the stability of translation initiation factor eIF4G in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci. 95: 4264-4269

27. Bonneaud N., Ozier-Kalogeropolous O., Li G.Y., Labouesse M., Minvielle-Sebastia L. (1991). A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae!E. coli shuttle vectors. Yeast 7: 609-615.

28. Breining P. and Pipersberg W. (1986). Yeast omnipotent suppressor SUP I (SUP45) nucleotide sequence of the wild type and a mutant gene. Nucl. Acid Res. 14: 5187-5197.

29. Brenner C., Nakayama N., Goebl M., Tanaka K., Toh-e A., Matsumoto K. (1988). CDC33 encodes mRNA cap-binding protein eIF-4E of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 8: 3556-3559.

30. Burke D.J. (2000) Complexity in the spindle checkpoint. Curr. Opin. Gen. Dev. 10: 26-31.117

31. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. (1993) Multi-copy SUP35 gene induses de-novo appearance of psi-like factors in yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 34: 268-270.

32. Chernoff Y.O., Galkin A. P., Lewitin E., Chemova T. A., Newnam G. P., Belenkiy S. M. (2000). Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein. Mol. Microbiol. 35: 865-876.

33. Chernoff Y.O., Newnam G.P, Kumar J., Allen K., Zink A.D.(1999) Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PSI. prion. Mol. Cell. Biol. 19: 8103-8112.

34. Chernoff Y.O., Lindquist S., Ono B.I., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. (1995). Role of the chaperrone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSI., Science. 268: 880-884.

35. Cerutti L. and Simanis V. (2000). Controlling the end of the cell cycle. Curr. Opin. Gen. Devel. 9: 65-69.

36. Conde J., Fink G.A. (1976). A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73: 3651-3655.

37. Condeelis J. (1995). Elongation factor la, translation and cytoskeleton. TIBS. 20: 169-170.

38. Cox B.S. (1965). \|/, cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. Heredety. 20: 505-521.

39. DePace A. H., Santoso A., Miner P., Weissman J. S. (1998) A critical role for aminoterminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion Cell. 93: 1241-1252.

40. Derkatch I.L., Chernov Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. (1996). Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 144: 1375-1383.

41. Derkatch I.L., Bradley ME., Liebman S.W. (1998). Overexpression of the SUP45 gene encoding a Sup35p-binding protein inhibits the induction of the de novo appearance of the PSI+. prion. Proc. Natl Acad. Sci. 95: 2400-2405

42. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. (1997) Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSI+. prion in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 147: 507-519.

43. Dirick L., Bohm T., Nasmyth K. (1995). Rales and regulation of Cln-Cdc28 kinases at the start of the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14: 4803-4813.

44. Eaglestone S.S., Ruddok L.W., Nierras C.R., Cox B.S., Tuite M.F. (2000). Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PSI . of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 240-244.

45. Ellege S. (1996). Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science. 274: 1664-1672.

46. Erdelyi M. Michon A.-M., Guichet A., Glotzar J.B., Ephrussi A. (1995) requirement for Drosophila cytoplasmic tropomyosinin oskar mRNA localization. Nature, 'ill: 524-526.119

47. Feldman R.M.R., Correll C.C., Kaplan K.B., Deshaies R.J. (1997). A complex of Cdc4p, Skp lp, and Cdc53p/cullin catalizes ubiquitinization of the phosphorylated CDK inhibitor Siclp. Cell 91: 221-230.

48. Frolova L., Le-Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. (1996). Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA. 2: 334-341.

49. Grant C M , Firoozan M., Tuite M.F. (1989). Mistranslation induces the heat-shock responce in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 3: 215220.

50. Hanic-Joyce P.J., Singer R.A., Johnston G.C. (1987). Molecular characterization of the yeast PRT1 gene in which mutations affect translation initiation and regulation of cell proliferation. J Biol Chem 262: 2845-51

51. Hartwell L.H. and Weinert T.A. (1989). Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246: 629-634.

52. Heitman J., Mowa NR., Hall N R. (1991). Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast. Science. 253: 905-909.

53. Himmelfarb H., Maicas E., Friesen J. (1985). Isolation of the SUP45 omnipotent suppressor gene of Saccharomyces cerevisiae and characterization of its gene product. Mol Cell Biol 5:816-822.120

54. Hoshino S.,Imai M., Kabayashi T. Uchida., Katada T. (1999). The eukaryotic polypeptide chain releaseing factors (eRF3/ GSTP)carrying the translation termination signal to 3'-poly(A) tail of mRNA. J. BioLChem. 274: 16677-16680.

55. Hoyt M.A., Totis L., Roberts B.T. (1991). S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to lost of microtubule function. Cell. 66: 507-518

56. Johnston L.H. and Lowndres N.F. (1992). Cell cycle control of DNA synthesis in budding yeast. Nucl. Acid Res. 20: 2403-2410.

57. Kikuchi Y., H. Shimatake H., A. Kikuchi A. (1988). A yeast gene recuired for Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTP-ase domain. EMBO J. 7: 1175-1182.

58. Kislauskis E.H. Zhu X., Singer R.H. (1997). p-Actin messenger RNA localization and protein synthesis augment cell motility. J. Cell Biol. 136: 1263-1270.

59. Knowels R.B., Sabry J.H., Martone M.E. Deerink T.J., Ellisman M.H., Bassel G.J., Kosik K.S. (1996). Translocation of RNA granules in living neurons. J. Neuroscience. 16: 7812-7820.

60. Kouprina N., Pashina O., Nikolaishvili N., Tzouladze A., Larionov V. (1988). Genetic control of chromosome stability in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast 4: 257-269.

61. Kozak M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene. 234: 187-208.121

62. Kuntzel H W., Rottjakob H.W., Schwed A., Zwerschke W. (1994). START control in Saccharomyces cerevisiae cells. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 48: 128.

63. Kushnirov V.V. and Ter-Avanesyan M.D. (1998). Structure and Replication of Yeast Prions. Ce//.94: 13-16.

64. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. (1987). Localization of possible functional domains in SUP2 gene product of yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 215: 257-260.

65. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. (1988). Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene. 66: 45-54.

66. Li R. (1999) Bifurcation of the mitotic checkpoint pathway in budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 4989-4994.

67. Li R. and Murray A.W. (1991). Feedback control of mitosis in budding yeast. Cell. 66: 519-531

68. Liu H., Krizek J., Bretscher A. (1992). Construction of a /-regulated yeast cDNA expression library and its application to the identification of genes whose overexpression causes lethality in yeast. Genetics. 132: 451-460.

69. MarchesiV.T. and NgoN. (1993). In vitro assembly of multiprotein complexes containing a, 3, y tubulin, heat shock protein HSP70, and elongation factor la. Proc. Natl.Acad. Sci. 90:3028-3032.

70. Marx J. (1994). How cells cycle toward cancer. Science. 263: 319-321.

71. McNally F. J. (1996). Modulation of microtubule dynamics during the cell cycle. Cur.Opin. Cell. Biol. 8: 23-29.

72. Mikuni O, Ito K, Moffat J, Matsumura K, McCaughan K, Nobukuni T, Tate W, Nakamura Y (1994) Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5798-5802.

73. Moore R.C. and Cyr R.J. (2000) Association between elongation factor-lalpha and microtubules in vivo is domain dependent and conditional. Cell Motil Cytoskeleton. 45: 279-92.

74. Morgan D O. (1995). Principles ofCDK regulation. Nature. 374: 131-134

75. Morley S.J., Curtis P.S., Pain Y.M. (1997) eIF4G: Translation's mystery factor begins to yield its secrets. RNA. 3: 1085-1104.

76. Nasmyth K. (1993). Control of the yeast cell cycle by the Cdc28 protein kinase. Curr. Opin. Cell Biol 5: 166-179.123

77. Nasmyth K. (1996a) Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science. 274: 1643-1645

78. Nasmyth K. (1996b). At the heart of the budding yeast cell cycle. Trends Genet. 12: 405-412.

79. Newnam G. P., Wegrzyn R. D., Lindquist S. L., Chernoff, Y. O. (1999). Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing. Mo/. Cell. Biol. 19: 1325-1333.

80. Nigg E.A. (1995). Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eucaryotic cell cycle. BioEssays. 17: 471-480.

81. Nurse P., Thuriaux P., Nasmith K. (1976). Genetic control of the cell division cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. MoT. Gen. Genet. 146: 167-178

82. Ohta K., Totiyama M., Miyazaki M. (1990). The mitotic apparatus-associated 51-kDa protein from see urchin eggs is a GTP-binding protein and is immunologically related to yeast polypeptide elongation factor la. J. Biol. Chem. 265: 3240-3247.

83. Pain V.M. (1996). Initiation of protein synthesis in eucaryotic cells. Eur. J. Biochem. 236: 747-771.

84. Patino M. M., Liu J. J., Glover J. R., Lindquist S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science 273: 622-626.

85. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (1996).

86. Propagation of the yeast prion-like psi+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. EMBO J. 15: 3127-3137.124

87. Paulovich A.L., Toczuski DP., Hartwell L.H. (1997). When checkpoints fail. Cell 88: 315-321.

88. Polimenis M. and Schmidt E. V. (1997) Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Dens and Dev. 11:25222531.

89. Polimenis M. and Schmidt E. V. (1999). Coordination of cell growth with cell division. Cur. Opin. Gen. Dev. 9:76-80.

90. Rose M.D., Winston F., Hieter P. (1990). Methods in yeast genetics. NY: CSHL Press. 198p.

91. Rowley A. and JonstonG.C. (1990). G1 cyclins regulate proliferation of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Cell Biol. 70: 946-953.

92. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning. NY: Cold Spring Harbor Laboratory press. 3V.

93. Samsonova M.G. and Inge-Vechtomov S.G. (1994). Sup2 proteins: the relation to elongation factors EF-Tu (EF-la) and the role of N-terminal extention. J. Gen. Res. 1: 279-295.

94. Schmelzle T. and Hall M.N. (2000). TOR, a central controller of cell growth. Cell. 103: 253-262.

95. Schmidt M.E., Brown T.A., Trumpower B.L. (1990). A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 18: 3091-3092.125

96. Schmidt A., Kunz J., Hall M.N. (1996). TOR2 is required for organization of actin cytoskeleton in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 13780-13785.

97. Sherr C.J. (1996). Cancer cell cycles. Sciense. 274: 1672-1677.

98. Shiina N., Gotoh Y., Kubomura N., Iwamatatsu A., Nishida E. (1994). Microtubule severing by elongation factor la. Science. 266: 283-286.

99. Sikorski R.S., Hieter P. (1989). A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122: 19-27.

100. Skowyra D., Craig K.L., Tyers M., Elledge S.J., Harper J.W. (1997). F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex. Cell. 91: 209-219.

101. Sonenberg N. (1993). Translation factors as effectors of cell growth and tumorigenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 955-960.

102. Sonenberg N. and Gingras A.C.(1998). The mRNA 5' cap-binding protein eIF4E and control of cell growth. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 268-75.

103. Surguchov A.P., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D., Inge-Vechtomov S.G. (1984). Ribosomal suppression in eukaryotes. Phis. Chem. Biol. 4: 147-205.

104. Surguchov A.P., Telkov M.V., Smirnov V.N. (1986). Absence of strutural homology between SUP1 and SUP2 genes of Saccharomyces cerevisiae and identification of their transcripts. FEBSLett. 206: 147-150.

105. Takizawa P.A., Sil A., Swedlow JR., Herskowitz I., Vale R.D. (1997). Actin-dependent localization of an RNA encoding a cell-fate determinant in yeast. Nature. 389: 90-93.

106. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. (1994) The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant psi+. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 137: 671-676.

107. J.M. Thevelein (1992). The RAS-adenylate cyclase pathway and cell cycle control in Saccharomyces cerevisiae. A. van Leeuwenhoek. 6: 109-130.

108. Tiers M.G., Tokiwa G., Futcher B. (1993). Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Clnl, Cln2, and other cyclins. EMBOJ. 12: 1955-1968.

109. Tikhomirova V.L., Inge-Vechtomov S.G. (1996). Sensitivity of sup35 and sup45 mutants in Saccharomyces cerevisiae to antimicrotubule drug benomyl. Curr. Genet. 30: 44-49.

110. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.R. (1981). Agents that cause a high frequency og genetic change from p.sv ' . to [/«/"] in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 98: 691-711.

111. Verlhac M.-H., Chen R.-H., Hanachi P., Hershey J.W.B., Derynck R. (1997). Identification of partners of TIF34, a component of the yeast eIF3 comlex, required for cell proliferation and translation initiation. EMBOJ. 16: 6812-6822.

112. Wilson P.G. and Culbertson M.R. (1988). SUFI2 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EFla family of elongation factors. J. Mol. Biol 199:559-573