Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
Шабельская Светлана Васильевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУПРЕССОРНЫХ МУТАНТОВ ПО ГЕНУ БЦР35 ДРОЖЖЕЙ 5АССНАКОМУСЕЗ СЕИЕШЫЕ
Специальность 03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2005
Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного Университета, Россия, и в лаборатории генетики развития Университета г. Ренн, Франция
Научные руководители: доцент,
кандидат биологических наук Журавлева Галина Анатольевна (Россия)
Профессор, доктор Филипп Мишель (Франция)
Официальные оппоненты:
профессор,
доктор биологических наук Тер-Аванесян Михаил Давидович
доктор биологических наук Королев Владимир Геннадьевич
Ведущее учреждение:
Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится " 12 " мая 2005 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9., кафедра генетики и селекции.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.
Автореферат разослан " Ы "йи/ааЛ2005 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук
Л. А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Трансляция мРНК включает три стадии: инициацию, элонгацию if терминацию. Нормальное течение процесса элонгации трансляции прекращается, когда один из стоп-кодонов UAA, UAG или UGA попадает в А-сайт рибосомы, в результате чего происходит гидролиз связи между тРНК и полипептидом и освобождение белка. Изучение процесса терминации трансляции является одной из сложных и интересных задач современной генетики. К настоящему моменту, когда многие компоненты аппарата белкового синтеза установлены, исследования в большей степени направлены на изучение механизмов этого процесса. Объектами, у которых лучше всего исследован генетический контроль биосинтеза белка, до сих пор остаются бактерии и дрожжи. Использование для изучения контроля терминации трансляции дрожжей как модельного организма определяется развитием для данного объекта методов классической генетики и современных молекулярно-биологических методов. Изучение нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae позволило выявить гены SUP45 и SUP35 (Инге-Вечтомов, 1964; Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970), которые, как выяснилось позже, кодируют факторы терминации трансляции eRFl и eRF3 (Frolova et al, 1994; Zhouravleva et al., 1995). eRFl ответственен за узнавание всех трех стоп-кодонов UAA, UAG и UGA. Известно, что eRF3 - ГТФ-связывающий белок, влияющий на эффективность трансляции, однако его роль в терминации трансляции еще не до конца ясна. Данные, полученные- для ряда организмов, свидетельствуют о том, что функция eRFl и eRF3 не ограничивается исключительно обеспечением терминации трансляции. Открытия последних лет свидетельствуют о том, что белки семейств eRFl и eRF3 являются консервативными многофункциональными белками, принимающими участие в различных процессах, протекающих в клетке, что подтверждается тем фактом, что они вовлечены в ряд белок-белковых взаимодействий. Кроме того, исследования, связанные с геном SUP35, вызывают пристальный интерес, поскольку известно, что этот ген необходим для поддержания одного из наиболее изученных на сегодня дрожжевых прионов -детерминанта [Р£Г] (Wickner et al, 1995).
Мутации в генах SUP35 и SUP45 активно используются при анализе механизмов терминации трансляции у дрожжей S. cerevisiae Мутации в этих генах приводят к нарушению терминации трансляции, что выражается в омнипотентной нонсенс-супрессии. Помимо этого мутации в этих генах приводят к различным плейотропным эффектам. Это свойство позволяет использовать мутации sup35 и sup45 в изучении не только механизма терминации трансляции и генетического контроля считывания стоп-кодонов, но и исследовать связь между трансляцией и другими клеточными процессами.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена получению и молекулярно-генетической характеристике мутаций в гене SUP35 дрожжей S. cerevisiae, а также изучению эффектов, вызываемых этими мутациями. В ходе работы решались следующие задачи:
1. Получение штаммов дрожжей S cerevisiae, несущих супрессорные мутации в гене SUP35, и выяснение молекулярной природы полученных мутаций.
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БКЬЗИОТСКА {¡¡Петербург
20#М»К
2. Изучение влияния миссенс- и нонсенс-мутаций в гене SUP35 на содержание белков eRF3 и eRFl и на уровень мРНК SUP35.
3. Изучение возможных механизмов, обеспечивающих жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP35.
4. Изучение влияния миссенс- и нонсенс-мутаций в гене SUP35 на процесс NMD (Nonsense mediated mRNA decay), обеспечивающий деградацию аберрантных мРНК.
Научная новизна и практическая ценность исследования. В работе получены и охарактеризованы супрессорные миссенс- и нонсенс-мутации в гене SUP35. Показано, что нонсенс-мутации составляют значительную долю от выявляемых мутаций в гене SUP35. Таким образом, удалось получить нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP35 в отсутствие супрессорных мутаций в генах тРНК В работе исследованы механизмы, обеспечивающие жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации sup35. Показано, что штаммы, содержащие мутации sup35 или sup45, характеризуются нарушениями процесса NMD. Таким образом, проведенные исследования вносят вклад в изучение механизмов терминации трансляции и в изучение связи трансляции с другими клеточными процессами. Изучение механизма терминации трансляции и процессов, влияющих на точность данного процесса, может иметь также и практическое значение, поскольку известно, что ряд наследственных и онкологических заболеваний связан с возникновением нонсенс-мутаций. Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIX и XXI Конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Италия, Римини, 1999 и Швеция, Гетеборг, 2003), на II и III Съездах ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000 и Москва, 2004) и на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисных сообщений. Структура и объем работы. Работа изложена на 140 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 206 наименований. Работа содержит 8 таблиц и 28 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.
Таблица 1 Использованные в работе штаммы_
Штамм Генотип1
ЗЭГ-Д373 MAT a pheAlO ade2-144,71 his7-l Iys9-A21 ura3-512 leu2-3,112 trpl-289
42Б-П3990 MATa adel-14 hts7-l Iys2-A12
1Б-Д1606 MATa pheAlO adel-14 hs7-l Iys9-A21 ura3-512 Ieu2-3,1I2 trpl-289
29В-П2156 MATa adel-14 his7-l metl3-Al
1-29В-П2156 MATa adel-14 his7-l metl3-Al sup45
5-29В-П2156 MATa adel-14 his7-l metl3-Al sup35
16А-Д1608 MATa adel-14 his7-l lys2-87 metl3-Al ihr4-B15irpl ura3-52 leu2-3,l 12 SUP35 TRP1
Y23530 MATa/a his3äl/his3Al leu2A0/leu2A0 lys2A0/LYS2 metl5A0/MET15 игаЗАО/игаЗАО SUP35 kanMX4
1A-Y23530 МАТ a his3Alleu2A0 игаЗАО SUP 35 капМХ4
18С-Н7с MATa ade-J 1еи2-3,112 his3A ura3-52 trpl-289 SUP35 TRP1 SUQ5
Y06214 MATa his3Al игаЗАО leu2A0 met 15AO UPF1 kanMX4
5Б-Д1645 MATa adel-14 his7-l trpl игаЗ UPF1 kanMX4
Примечания. 'Штаммы несли следующие нонсенс-мутации: adel-I4 (UGA), his7-l (UAA), Iys9-A2¡
(UAA), trpl-289 (UAG), lys2-87 (UGA) и thr4-B15 (UGA).
Плазмиды. Плазмиды pRSUl и pRSU2 (Volkov et al, 2002), содержащие аллель дикого типа SUP35 под контролем собственного промотора, получены на основе центромерных векторов pRS315 и pRS316 (Sikorski and Hieter, 1989). На основе плазмдиды pRSUl были сконструированы плазмиды, несущие мутантные копии гена , SUP35. Плазмида pRS316/UPF1 содержит аллель дикого типа UPF1 под контролем собственного промотора (Atkin et al., 1997).
Генетические методы и получение мутантов sup35. В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Kaiser et al, 1994). Мутанты sup35 получены у штамма 1Б-Д1606 при отборе ревертантов к прототрофности одновременно по двум признакам, обусловленным нонсенс-мутациями разного типа: adel-14 (UGA) и his7-l (UAA) (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970). Для выявления штаммов, содержащих мутации в генах SUP35 и SUP45, а также для определения доминантности или рецессивности мутаций полученных ревертантов скрещивали стестерными штаммами 5-29В-П2156, 1-29В-П2156 и 29В-П2156. Молекулярно-генетические методы. В работе применяли стандартные методы работы с ДНК и РНК (Sambrook et al., 1989), а также другие методики, описание которых приводится в работе. Транскрипты SUP35, SUP45, АСТ1, ADE1, HIS7 и CYH2 выявляли при помощи специфичных проб, меченных радиоактивным фосфором 32Р при помощи нуклеотида fa-32P]dCTP. Для экспериментов по оценке содержания тРНК олигонуклеотиды, последовательности которых приведены в работе, метили [у-32Р]АТФ с помощью киназы Т4 (BioLabs). Общая РНК была проанализирована при помощи проб, специфически детектирующих тРНКТуг, тРНК01", тРНКТгр и 5S РНК. Радиоактивные сигналы детектировали и количественно оценивали при помощи STORM 840 Phosphor-Imager (Molecular dynamics) и программы ImageQuantNT 5.2. Для статистической обработки полученных результатов использовали стандартные биометрические методы (Урбах, 1975).
Методы работы с белками. Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; Вестерн-блотинг проводили как описано , ранее (Laemmli, 1970; Towbin et al., 1979). Экспрессию и выделение белка eRF3 и его N-концевого домена из Е. coli проводили согласно методике, описанной ранее (Frolova et al, 1998), с использованием плазмид pET2\/SUP35 и рЕТ21/5L'P55-N, кодирующих eRF3-His6 и eRF3-N-His6. С использованием данных белков были получены поликлональные антитела, специфичные к полноразмерному eRF3 и его N-концевому домену, соответственно. Также были получены антитела против смеси пептидов, входящих в состав N-конца eRF3 (SDSNQGNNQQNYQQYC и FNPQGGRGNYKNFNY), очищенные с помощью аффинной хроматографии против первого пептида.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение мутантов sup35 н анализ молекулярной природы мутаций
1) Получение и фенотипическая характеристика мутантов по гену SUP3S.
Нонсенс-супрессорные мутации в генах SUP35 и SUP45 в отличие от супрессорных мутаций в генах, кодирующих тРНК, являются рецессивными и приводят к омнипотентной нонсенс-супрессии. В нашей работе на штамме 1Б-Д1606 получены ревертанты к прототрофности одновременно по двум признакам, обусловленным нонсенс-мутациями adel-14 (UGA) и his7-l (UAA). Среди полученных ревертантов при помощи функционального теста на аллелизм выявлено 48 мутантов sup35 и 13 мутантов sup45 Штаммы, несущие мутации sup35, обозначены 201-1Б-Д1606, 202-1Б-Д1606 и. т. д.
Анализ эффективности нонсенс-супрессии показал способность супрессировать не только мутации adel-14 и his7-l, которые мы использовали при отборе мутантов, но также способность супрессировать мутации Iys9-A21 и trpl-289. Неожиданным оказалось отсутствие у некоторых мутантов супрессии нонсенс-мутации his7-l, которая вместе с мутацией adel-14 была использована для отбора ревертантов. Эффективность супрессии нонсенс-мутаций отличалась у разных мутантов, что позволило разделить их на группы согласно этому критерию (рисунок 1). Для исходного штамма 1Б-Д1606 было показано отсутствие супрессии исследуемых нонсенс-мутаций (рисунок 1, WT).
Рисунок 1. Анализ нонсенс-супрессии у мутантов sup35 Представлен рост мутантов на селективных средах SC-Ade, SC-His, SC-Lys, SC-Trp, не содержащих аденин, гистидин, лизин и триптофан, соответственно. 48 мутантов sup35 были разделены на семь групп, согласно их фенотипу. На рисунке показаны репрезентативные представители и число мутантов в каждой группе.
2) Оценка содержания белка eRF3 у мутантов sup35. У полученных мутантов sup35 с помощью иммуноблот-анализа был оценен уровень белка eRF3. Все 48 изученных мутантов содержали белок eRF3, из них у 32 мутантов количество eRF3 не отличалось от штамма дикого типа, в то время как 16 мутантов характеризовались пониженным содержанием белка eRF3. Удалось выявить корреляцию между эффективностью супрессии и количеством eRF3. Так, мутанты, уровень белка eRF3 у которых не отличался от штамма дикого типа, различались по эффективности супрессии различных нонсенс-мутаций (рисунок 1, группы II-VII). В то же время для большинства мутантов, характеризующихся пониженным уровнем eRF3, была показана повышенная эффективность нонсенс-супрессии и способность супрессировать все четыре нонсенс-мутации (рисунок 1, группа I).
Для дальнейших исследований были использованы 15 мутантов sup35: 10 мутантов, характеризующихся пониженным количеством белка eRF3 (рисунок 2А) и 5 мутантов, уровень eRF3 у которых не отличался от исходного штамма (рисунок 2Б).
sup3S•
sup35-
SUP3S -201 -244 ■203 -213 -215 -214 -231 -240 -260 -222
~ Wimi "т»*-« Ш Mt - . - .-г
SUP35 -207 -209 -217 -22S -233
eRF3 *
eRF1 ► ?»!
тубулин
Рисунок 2. Содержание белков еЯРЗ и eR.Fl у мутантов $ир35 Представлен иммуноблот-анализ экстрактов исходного штамма 1Б-Д1606 (5Т/М5) и его мутантных производных с использованием поликлональных антител к eRFЗ и еЯП Антитела к тубулину были использованы как контроль. Номера соответствуют обозначениям мутаций $ир35. (А) Мутанты с пониженным содержанием еЯРЗ, (Б) мутанты, количество е11РЗ у которых не отличалось от штамма дикого типа.
Известно, что еИРЗ формирует комплекс с белком еШЧ фатбеМ е/ а!., 1995; 2Ьоигау1еуа е/ а1., 1995). Анализ содержания белка еЯЛ не выявил значительных изменений в уровне еИЛ как у мутантов с пониженным содержанием еИРЗ (Рисунок 2А), так и случае мутантов, содержание еКИЗ у которых было таким же, как у штамма дикого типа (Рисунок 2Б). Исключение составил мутант 222-1Б-Д1606, который характеризовался пониженным количеством белка еШЧ (Рисунок 2А). 3) Молекулярная природа полученных мутантных аллелей гена 51/Р35. Для определения молекулярной природы мутаций аллели гена 811Р35 были секвенированы. Секвенирование аллели дикого типа гена БиР35 у штамма 1Б-Д1606 не выявило нуклеотидных замен по сравнению с последовательностью, представленной в йепеВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.htmn.
Таблица 2 Мутантные
аллели зир35, полученные в данной работе.
Мутантная аллель Нуклеотидная позиция Замена Аминокислотная позиция Замена
sup35-201 1546 ААО^ТАО 516 Lys->(TAG)
sup35-203 214 САО->ТАО 72 Gin-> (TAG)
sup35-213, sup35-215 304 ААА-»ТАА 102 Lys-»(TAA)
sup35-218 541 ОАА-»ТАА 181 Glu-»(TAA)
sup35-23l 1984 САА-»ТАА 662 Gln^(TAA)
sup35-240 166 £АА-»1АА 56 Gln-»(TAA)
sup35-244 586 £АО-»ТАО 197 Glu-»(TAG)
sup35-260 724 САО->ТАО 242 Gln->(TAG)
sup35-207 1697 вет^аАТ 566 GIy-»Asp
sup35-209 1808 АТС-»ААС 603 Met-»Lys
sup35-2I7 1217 повтор 18 п.о. 412 повтор 6 ак
sup35-228 1115 АОА-»ААА 372 Arg->Lys
sup35-233 1094 1675 оет^огг ОАА-»ААА 365 559 GIy-»Val Glu->Lys
Секвенирование мутантных аллелей 5ир35 и сравнение их нуклеотидных последовательностей с последовательностью БиР35 дикого типа показало, что из пяти мутантов, содержание еИРЗ у которых не отличалось от штамма дикого типа, четыре
содержат миссенс-мутации (Таблица 2). В случае аллелей .чир35-207, -209, -228 выявлены одиночные нуклеотидные замены, в то время как в случае аллели ¡ир35-233 показана двойная нуклеотидная замена (Таблица 2). Мутант 217-1Б-Д1606 содержал повтор 18 нуклеотидов, который приводит к повтору 6 аминокислот ЫКМОБР в ГТФ-связывающем участке С-домена еЯРЗ (Таблица 2, рисунок 3).
Из 10 мутантов с пониженным уровнем белка еИРЗ девять содержали нонсенс-мутации, ведущие к появлению стоп-кодона в кодирующей последовательности 5№35 (аллели ¡ир35-201, -203, -213, -215, -218, -231, -240, -244 и -260) (Таблица 2). В случае мутантов 213- и 215-1Б-Д1606 были выявлены идентичные нуклеотидные замены. В случае мутанта 222-1Б-Д1606, характеризующегося пониженным уровнем белка еИРЗ, молекулярную природу мутации установить не удалось. Секвенирование не выявило нуклеотидных замен ни в кодирующей области гена, ни в пределах 600 и 700 п.о. в 5' и 3' некодирующих областях гена 5'11Р35, соответственно.
Миссенс-мутации зир35
В случае миссенс-мутаций все полученные в работе нуклеотидные замены являются значащими и приводят к заменам аминокислот в С-домене белка еКРЗ (таблица 2, рисунок 3).
$ир35-233 -228 -217 -233 -207 -209 Рисунок 3. Локализация миссенс-
мутаций 5ир35 N. М и С - домены белка е!УРЗ Сверху обозначены номера мутаций внизу -
аминокислотные замены, вызываемые данными мутациями. 1,2,3,4 - ГТФ-связывающие сайты еЯРЗ
ЕЕЖЕНЕ
411 12| 131 Ы С
(> И повтор
ЕС + +
КО
м *
к
Полученные в работе миссенс-мутации Бир35 (а также в случае мутации .чир35-217 - дупликация 18 нуклеотидов) не влияют на содержание белка еЮ*! в клетке (рисунок 2Б). Следовательно, супрессорный фенотип полученных миссенс-мутантов вир35 не может объясняться изменением уровня белка еКРЗ в клетке.
Изучено влияние полученных в работе миссенс-мутаций в гене БиР35 на взаимодействие с фактором терминации трансляции еКР 1. Для этого использовали метод ко-иммунопреципитации белков еЮ-З и еЮЧ в штамме дикого типа и его мутантных производных. Во всех случаях вместе с белком еИРЗ был выявлен ко-преципитировавшийся белок еИР1 (рисунок 4).
эир35-
5иР35 -207-209 -217 -228 -233 к
Рисунок 4. Ко-иммунопреципитация еШЧ и еИРЗ в штамме дикого типа (5№35) и его мутантных производных Номера соответствуют мутациям $ир35 Клеточные лизаты были преципитированы антителами, специфичными к еЯРЗ Как контроль (К) использовали инкубацию лизата исходного штамма 1Б-Д1606 с преиммунной сывороткой, не Иммуноблотинг преципитированных белков, а также
содержащей антител, специфичных к еКРЗ
экстракта (Э) штамма 1Б-Д1606 проводили с антителами, специфичными к eR.Fl и еЯРЗ
Из этих результатов следует, что полученные миссенс-мутации зир35 не нарушают взаимодействия еКР1 и еКРЗ. Таким образом, супрессорный фенотип миссенс-мутантов вир35, не связан с нарушением взаимодействия между факторами еШЧ и еИРЗ.
Нонсенс-мутации sup3S
1) Характеристика нонсенс-мутаций sup35. Нонсенс-мутации sup35, полученные в нашей работе, приводят к возникновению стоп-кодонов в различных частях гена (рисунок 5).
sup35-240 -203 -21S -218 -244 -260 -201 -231
-213
ТА А ТА А ТА А ТА A TAG TAG TAC TAA
CAA CAA CAA CAA GAG CAG AAG , CAA
SUP35
' *
76 «Да 'м' 4............ . "' 1 . 1 ."""-"I
7 кДа -*■ _ ■
8 кДа -*■
11 кДа -
20 кДа ->■
22 кДа -
27 кДа -►
58 кДа -
75 кДа -
Рисунок 5. Локализация нонсенс-мутаций sup35 Над геном SUP35 обозначены номера мутаций и нуклеотидные замены, вызванные данными мутациями N, М и С - домены белка eRF3. Внизу стрелками схематически представлены короткие белки eRF3 (и их молекулярная масса (кДа), предсказанная с помощью программы httpV/npsa-pbil ibcp.fr/cgi-
bin/npsa automat pl'?page=/NPSA/npsa compo html'). которые соответствуют белкам, синтезирующимся в случае терминации трансляции на стоп-кодонах, возникших в результате мутаций.
Из восьми нонсенс-мутаций sup35 шесть локализованы в первой трети гена SUP35, соответствующей NM домену eRF3 (рисунок 5). Такое расположение нонсенс-мутаций, может объясняться неравномерным распределением в гене SUP35 кодонов, одна нуклеотидная замена в которых приводит к нонсенс-мутации. Так, в участке гена SUP35, который соответствует NM-домену eRF3, содержится 48% таких кодонов по сравнению с 33% в участке гена SUP35, который кодирует С-домен eRF3. Среди полученных нонсенс-мутаций четыре несли стоп-кодон UAA и четыре - нонсенс-кодон UAG (Таблица 2). Отсутствие нонсенс-мутаций UGA также может объясняться недостатком в гене SUP35 кодонов, одиночная замена в которых будет приводить к возникновению кодона UGA. Так, из кодонов, одна нуклеотидная замена в которых будет приводить к нонсенс-мутациям, в SUP35 содержится 51% «потенциальных» UAG, 33% - UAA и только 10% «потенциальных» кодонов UGA, что согласуется с типом полученных в данной работе нонсенс-мутаций sup35. Также, возможно, что неравномерность распределения нонсенс-мутаций sup35 вызвана тем, что некоторые аминокислотные замены в С-домене eRF3, возникающие в результате "прочитывания" нонсенс-кодона, могут приводить к летальности. Данное предположение подтверждается необходимостью С-концевого домена eRF3 для жизнеспособности, а также летальным эффектом ряда миссенс-мутаций, полученных в данном домене (Тег-Avanesyan eí al, 1993; Salas-Marco and Bedwell, 2004).
Штаммы, несущие нонсенс-мутации sup35, содержат полноразмерный белок eRF3, однако его содержание снижено по сравнению со штаммом дикого типа. Таким образом, в отличие от миссенс-мутаций, нонсенс-мутации в гене SUP35 приводят к
понижению уровня полноразмерного eRF3 в клетке (рисунок 2А). Присутствие в штаммах, содержащих нонсенс-мутации sup35, полноразмерного белка eRF3 может объясняться пропитыванием как значащего стоп-кодона, возникшего в результате мутации. В случае терминации трансляции на таком стоп-кодоне, будет синтезироваться короткий белок (рисунок 5). Для выявления таких «укороченных» белков использовали антитела, специфичные к пептиду на N-конце eRF3. В экстрактах мутантов 201-1Б-Д1606, 218-1Б-Д1606, 260-1Б-Д1606 и 244-1Б-Д1606 обнаружены короткие белки eRF3, которые соответствовали по размеру белкам, синтезированным с данных мутантных аллелей sup35 в системе in vitro. В экстрактах мутантов 203-1Б-Д1606, 213-1Б-Д1606, 215-1Б-Д1606 и 240-1Б-Д1606 таких "укороченных" фрагментов eRF3 обнаружить не удалось. Возможно, что это связано с повышенной нестабильностью коротких белков с предсказанной молекулярной массой 8, 11, И и 7 кДа, соответственно.
2) Изучение механизмов, обеспечивающих "прочтение" нонсенс-мутаций в гене SUP35. Ген SUP35 является жизненно-важным, его делеция или делеция участка, кодирующего С-концевой домен eRF3, летальна (Ter-Avanesyan et al., 1993). Жизнеспособность мутантов, несущих нонсенс-мутации в гене SUP35, может объясняться присутствием полноразмерного белка eRF3, который синтезируется в результате прочтения нонсенс-кодона как значащего. Мы изучили механизмы, обеспечивающие прочтение стоп-кодона, и, следовательно, обеспечивающие жизнеспособность нонсенс-мутантов sup35. Известно, что эффективность терминации трансляции определяется рядом параметров, в частности, такими как активность факторов терминации трансляции, контекст стоп-кодона и присутствие потенциальных супрессорных тРНК (см. Bertram et al., 2001).
а) Нуклеотидный контекст нонсенс-мутаций sup35. При анализе нуклеотидного контекста нонсенс-мутаций sup35 обнаружены элементы, способствующие "прочтению" стоп-кодона (Таблица 3).
Таблица 3. Нуклеотидный контекст нонсснс-мутаций sup35, полученных в данной работе
Мутация Нуклеотидное окружение нонсенс-кодона. 5' стоп 3'
шр35-201 GGT CAT АТС aaa TAG GGT CAA ТСС АСС
sup35-260 TTG АТС AAG gaa TAG GAA GAA GAA GTG
sup35-244 CCA GTT AAA aag TAG GAG AAA CCA GTC
sup35-203 GGT TAC CAG caa TAG TAT AAT CCT CAA
sup35-240 GGT TCT GGG TAC TAA CAA GGT GGC CAA
sup35-2¡8 GCT GAA ACC aaa TAA CCA ACT AAA GAG
sup35-213,215 CGT GGA AAT TAC TAA AAC TTC AAC TAC
sup35-231 CAA GAT TAC CCT TAA TTA GGT AGA TTC
Кодоны CAA подчеркнуты, аденины, предшествующие нонсеис-мутациям, выделены жирным шрифтом.
Известно, что присутствие двух аденинов непосредственно перед нонсенс-кодоном или триплета CAA в непосредственной близости от стоп-кодона вызывает высокий уровень супрессии данного нонсенс-кодона (Tork et al., 2004; см. Beier and Grimm, 2001). В случае четырех мутантных аллелей sup35 было показано присутствие аденина в положении -1 от нонсенс-кодона, в восьми случаях в положении -2 и в четырех случаях в обоих позициях. Для мутаций sup35-203 и sup35-240 было показано
наличие кодона САА непосредственно перед и после стоп-кодона (Таблица 3). Известно, что существует также зависимость между эффективностью терминации трансляции и нуклеотидом в четвертом положении нонсенс-кодона (нуклеотид, следующий за нонсенс-кодоном) (Bonetti et al., 1995). Так, для нонсенс-кодона UAG эффективность терминации трансляции снижается в зависимости от следующего нуклеотида в четвертом положении A, U > С > G, а для нонсенс-кодона UAA - G > А, U > С (от наиболее эффективной к наименее эффективной терминации трансляции). Из четырех нонсенс-мутаций sup35, несущих кодон UAG, три содержат в четвертом положении нуклеотид G, в то время как из четырех мутаций UAA, в двух случаях за нонсенс-кодоном следует нуклеотид С (Таблица 3), что соответстует нуклеотидному контексту, отвечающему за наименее эффективную терминацию трансляции. Таким образом, большинство нонсенс-мутаций sup35, полученных в работе, находятся в нуклеотидном контексте, облегчающем "прочтение" нонсенс-кодона. б) Нонсенс-мутации sup35 способны поддерживать жизнеспособность штаммов в отсутствие мутантных супрессорных тРНК. Для того чтобы доказать, что жизнеспособность штаммов, несущих sup35-n (нонсенс-мутации, "п"- от "nonsense"), не связана с присутствием в этих штаммах мутантных супрессорных тРНК, мы изучили способность полученных мутаций поддерживать жизнеспособность штаммов на другом генотипическом фоне. Исследованы следующие мутации sup35, которые отличались типом нонсенс-мутации, а также нуклеотидом, следующим непосредственно за стоп-кодоном: sup35-203 (UAGT), sup35-260 ((JAGG), sup35-218 (UAAC), sup35-240 (UAAC), а также мутации sup35-21 (UAAA) и sup35-74 (UAAT), которые были получены и клонированы ранее. Мутации sup35-21 и sup35-74 ведут к нуклеотидным заменам 1264С->Т и 378С->Т, приводящим к возникновению стоп-кодонов в 422 и 129 аминокислотных положенииях, соответственно (Cosson et al, 2002). Мы изучили способность аллелей sup35-n компенсировать летальный эффект дизрупции гена SUP35 с использованием метода замещения плазмид (Boeke et al., 1984). Для этого использовали штаммы 16А-Д1608 и 1A-Y23530, содержащие дизрупцию гена SUP35 и плазмиду pRSU2 [SUP35 URA3], несущую маркер URA3 и аллель SUP35 дикого типа. Штамм 1A-Y23530 является изогенным производным штамма S288C, в полностью секвенированном геноме которого отсутствуют супрессорные мутации в генах, кодирующих тРНК (Percudani et al, 1997). Штаммы 16А-Д1608 и 1A-Y23530 трансформировали плазмидами pRSUl-n [sup35-n LEU2], содержащими мутантные аллели sup35-n, плазмидой pRSUl [SUP35 LEU2] и вектором pRS316 в качестве контроля. Для того чтобы изучить способность мутантных аллелей sup35-n компенсировать дизрупцию гена SUP35, у полученных трансформантов индуцировали потерю плазмиды pRSU2 [SUP35 URA3] на среде, содержащей 5-ФОК. Как следует из рисунков 6А и 6Б, все трансформанты штаммов 16А-Д1608 и 1А-Y23530 (за исключением содержащих вектор pRS316) способны терять плазмиду pRSU2 [SUP35 URA3] в отсутствие мутаций в генах, кодирующих тРНК (рисунок 6, А Б).
вектор
Бир35 ■21В
вир35-260
Рисунок 6. Компенсация летального эффекта дизрупции гена БЦРЗЗ мутантными аллелями ¡ир35-п, в штаммах 16А-Д1608 (А), 1А-У23530 (Б) и штамме 18С-Н7с, содержащем SUQ5 (В). Представлен рост штаммов, ^трансформированных плазмидой рГ^БШ [81!Р35 и РАЗ] и одной из плазмид рКвШ [5С/Р55 ЬЕ112], pR.SU! [¡ир35-п ЬЕШ] или вектором рК8316 ("вектор") на среде, содержащей 5-ФОК.
Штаммы, несущие различные мутантные аллели тр35, отличались по характеру роста на среде, содержащей 5-ФОК, что говорит о том, что аллели $ир35-п различаются по эффективности замещения аллели Б11Р35 (рисунок 6, А Б), Для того чтобы проверить данное предположение, мы оценили количественно частоту потери плазмиды рЯБШ [БиР35 ШАЗ] на фоне различных аллелей хир35-п в штамме 1Б-Д1608 (Таблица 4).
Таблица 4. Количественный анализ частоты потери плазмиды, несущей аллель дикого типа гена 8иР35, у штамма 16А-Д1608 и штамма 18С-Н7с, содержащего в присутствии мутантных аллелей¡ир35___
Трансформанты, несущие плазмиду рЯвШ [8ЦР35 иЯАЗ] и плазмид рЯБШ [ЬЕШ] с Частота потери плазмиды рЯБШ [8иР35 и ПАЗ] Полноразмерный еИРЗ, % по отношению к штамму, несущему аллель 5С/Р35 дикого типа
Штамм Штамм
16А-Д1608 (БиР35Д) 18С-Н7с (8ирз5Азидз) 16А-Д1608 (5№ЛД) 18С-Н7с (5№35Д 51705)
БиР35 27 4 ± 0.64 26.5 ±3.11 100 100
5ир35-203 (иАв) 9.3 ± 1.05 1.2 ± 0.16 9 0.5
зир35-260 (Шв) 1 9 ± 0.18 2.0 ±0.15 1 1
тр35-218 (иАА) 5 3 ± 0.48 31.8 ±2.74 6 20
йир35-240 (ША) 6 5 ±039 22.3 ± 3.04 1 11
зир35-21 (иАА)* 0б±0 10 20 1 ± 4.44 05 3
зир35-74 (иАА)* 0 05 ± 0.027 13.2 ± 1.99 0.5 4
* Мутаци, полученные ранее (Соввоп е? а/, 2002)
Как следует из таблицы 4, частота потери плазмиды рЯБШ [БС!Р35 111143} зависит от присутствия различных мутантных аллелей ¡ир35-п (Таблица 4). Таким образом, мы показали, что мутантные аллели $ир35-п способны поддерживать жизнеспособность штаммов в отсутствие мутаций в генах тРНК, однако аллели яир35-п различаются по способности компенсировать дизрупцию гена 81!Р35.
Мы также изучили влияние супрессорной мутации в гене тРНК на жизнеспособность штаммов, несущих мутантные аллели ¡ир35-п. Для этого мы использовали штамм 18С-Н7с, содержащий дизрупцию Б11Р35 и плазмиду рЯБШ
[SUP35 URA3], Этот штамм несет супрессорную мутацию SUQ5 в гене, кодирующем сериновую тРНК, что позволяет последней с низкой эффективностью прочитывать стоп-кодон UAA как кодон для серина (Waldron et al, 1981). Все мутантные аллели sup35-n способны поддерживать жизнеспособность штамма 'в присутствии супрессорной мутации SUQ5 (Рисунок 6В) При сопоставлении частот потери плазмиды pRSU2 [SUP35 URA3] в штаммах 16А-Д1608 и 18С-Н7с, несущих мутантные аллели sup35-n, оказалось, что присутствие SUQ5 приводит к повышению частоты формирования жизнеспособных колоний, содержащих нонсенс-мутации UAA в гене SUP35 (Таблица 4).
При сравнении содержания eRF3 в присутствии различных мутантных аллелей sup35 в штаммах 16А-Д1608 и 18С-Н7с показано, что повышение жизнеспособности штаммов, содержащих нонсенс-мутации UAA в гене SUP35, в присутствии мутации SUQ5 происходит за счет повышения уровня полноразмерного белка eRF3 (Таблица 4). Таким образом, удалось продемонстрировать корреляцию между уровнем полноразмерного белка eRF3 в клетке и способностью мутантной аллели поддерживать жизнеспособность клеток.
в) Изучение содержания эндогенных тРНК у мутантов sup35. Кроме мутантных супрессорных тРНК, прочитывание нонсенс-кодонов могут осуществлять также и некоторые "естественные" (немутантные) тРНК, благодаря неканоническому спариванию нуклеотидов кодона и антикодона. Известно, что сверхэкспрессии таких тРНК как тРНКТуг, тРНК01", тРНКТгр может приводить к супрессиии нонсенс-мутаций UAA и UAG у эукариот (см. Beier and Grimm, 2001). Ранее при изучении штаммов, несущих нонсенс-мутации sup45, было показано, что уровень большинства изученных тРНК в таких штаммах повышен по сравнению со штаммом дикого типа (Москаленко, 2003). В нашей работе мы оценили содержание некоторых эндогенных тРНК у мутантов sup35: тРНК тРНК01", тРНКТуг и тРНКТгр.
Рисунок 7. Содержание некоторых тРНК в штамме 1Б-Д1606 и его производных, несущих мутантные аллели sup3S Общая РНК была проанализирована при помощи проб, специфически детектирующих тРНК01", тРНК , тРНКТгр и 5S РНК 5S РНК была использована как контроль Представлены усредненные результаты трех независимых экспериментов по определению количества тРНК с помощью Нозерн-гибридизации Количество тРНК у ) тРНКС1п штамма 1Б-Д1606 условно принято за 1 ' тРНК1^ Приведены мутанты, у которых количество одной из изученных тРНК достоверно отличалось от штамма дикого типа У мутантов 260-1Б-Д1606 и 260-1Б-Д1606 содержание тРНК0|"не изучали
тРНК1^
SUP3S
Из рисунка 7 следует, что уровень изученных тРНК увеличен неравномерно в различных мутантах вир35 по сравнению со штаммом дикого типа. Повышение содержания различных тРНК, по-видимому, не связано с количеством
полноразмерного белка eRF3, так как данная особенность была показана как для
нонсенс, так и для миссенс-мутантов sup35
***
Таким образом, в случае нонсенс-мутаций sup35, полученных в работе, прочтение стоп-кодона в кодирующей последовательности SUP35 и, следовательно, жизнеспособность нонсенс-мутантов sup35, видимо, определяется совокупностью следующих факторов: понижение уровня фактора терминации трансляции eRF3, слабый контекст нонсенс-мутаций, а также повышение содержания некоторых эндогенных тРНК.
Процесс деградации мРНК, содержащих нонсенс-мутации (NMD), нарушен у мутантов sup3S и sup45
1) Нонсенс-мутации в гене SUP35 не влияют на уровень мРНК SUP35. Известно, что значительная часть мРНК, содержащих нонсенс-мутации, узнается в клетке и деградирует при помощи процесса NMD. Возможно, что понижение уровня белка eRF3 в штаммах, несущих нонсенс-мутации sup35, связано с деградацией мРНК SUP35. Для того, чтобы проверить данное предположение, мы оценили ее содержание у мутантов sup35 (Рисунок 8).
sup35- Рисунок 8. Нозерн-блот - анализ мРНК SUP35 и
SUP3S -201 -244 -203 -213 -215 -218 -231 -240 -260 -20? -228 -222* ,г „,
^гтя чр- « та ИГ*КВ вгдаж зсзг кг SUP45 в штамме 1Б-Д1606
SUP45
^Р35 ф -т тЩ-Щт «ГЦЦ^тГО^ И его производных, яш Лия>- л», '! леи. лея. Лак Ыё-'иФШ'. несущих мутантные
1 07 09 1 1 07 08 09 1 7 08 06 09 1 1 02 ' ,, „
аллели ¡ирЗЗ Общая РНК была проанализирована при помощи проб, специфически
АСТ1 ^ ЙЙ Ш ЖЙ ЗД М ^ ШЛ Шл Ы ^ ЫА детектирующих 5£/Р35, ж шщ от от ^ от- V Щ М Щ ■ Ш м зиР45 и АСТ1 мРНК
АСТ1 была использована
в качестве контроля Номера сверху соответствуют обозначениям мутаций, миссенс-мутации зир35 подчеркнуты, мутант 222-1Б-Д1606 отмечен (*) Цифры между двумя верхними панелями отражают количество мРНК 51!Р35 в штаммах, содержащих мутации $ир35 по отношению к штамму дикого типа (обозначен как 5иР35), содержание мРНК 81!Р35 в котором принято за единицу
Мы показали, что нонсенс-мутации зир35, также как и миссенс-мутации, не приводят к значительному снижению количества мРНК 5С/Р55 (а также мРНК 81)Р45). Исключение составил мутант 222-1Б-Д1606, для которого мутация не была локализована. Оказалось, что содержание мРНК 811Р35 у данного мутанта значительно снижено по сравнению с исходным штаммом и составляет около 20% от уровня мРНК 511Р35 у штамма дикого типа. Поскольку уровень мРНК 811Р45 у данного мутанта не изменен (Рисунок 8), эта мутация специфически влияет на уровень мРНК 5'/7Р35. Возможно, мутация затрагивает элементы, регулирующие транскрипцию гена 8ЦР35. Видимо, снижение количества полноразмерного белка еИТЗ у данного мутанта является следствием пониженого уровня мРНК БиР35.
Таким образом, понижение полноразмерного белка еИРЗ у нонсенс-мутантов яир35 не связано с деградацией соответствующей мРНК. Так как нонсенс-мутации яир35 не приводят к существенному снижению уровня мРНК БиР35, эта мРНК,
несущая нонсенс-мутации, не подвергается деградации при помощи процесса NMD в штаммах, несущих мутации sup35. Ранее было показано, что мутация sup35, обозначенная gstl-1, может приводить к нарушениям в процессе деградации мРНК, содержащих преждевременные нонсенс-кодоны (Hosoda et al., 2003). В ходе следующих экспериментов мы проанализировали влияние нонсенс- и миссенс-мутаций в гене SUP35, полученных в данной работе, на протекание процесса NMD. 2) Секвенирование мутантных аллелей his7-l, Iys9-A21 и trpl-289. Исходный штамм 1Б-Д1606 содержит нонсенс-мутации adel-14, his7-l, Iys9-A21 и trpl-289. Мутация adel-14 была секвенирована ранее (Bertram et al, 2000). В нашей работе были секвенированы аллели, несущие мутации his7-l, Iys9-A21 и trpl-289. Секвенирование показало наличие нонсенс-кодонов ТАА, ТАА и TAG в кодирующих последовательностях генов HIS7, LYS9 и TRP1, соответственно (Таблица 5).
Таблица 5. Молекулярная природа ауксотрофных нонсенс-мутаций в штамме 1B-D1606
Мутантная аллель Нуклео-тидная позиция Размер открытой рамки считывания, п.о. Замена" DSE элементы'
adel-14 732 921 TGG->TGA ' -
his7-ib 229 1659 ААА->ТАА 3"caTTGATtTTaagttgtccaggtTCGATGaTTCa
Iys9-A21b 605 1341 ТТА->ТАА -
trpl-289b 403 678 CAG-»IAG 436gtTTGATtCagaagcaagtgggacaggtgaact TtTgGATtggaacTCGATtTCTgactgggttjzgaags
данной работе 'Выделены возможные DSE элементы, соответствующие последовательности TGYYGATGYYYYY (Zhang et al, 1995) «-» - в данных случаях такие элементы не были обнаружены
Известно, что положение нонсенс-мутации в кодирующей последовательности гена является одним из существенных факторов, определяющих является ли данный транскрипт субстратом для процесса NMD Так, мРНК, содержащие нонсенс-мутации в последних 20-30% открытой рамки считывания не подвергаются деградации при помощи процесса NMD (Peltz et al., 1993, Hagan et al., 1995). Другим необходимым элементом для запуска процесса NMD у дрожжей, является наличие в мРНК мотива DSE (от "downstream element"), находящегося в 3' направлении от стоп-кодона (Peltz et al, 1993; Zhang et al, 1995). В мРНК his7-l в 3' направлении от нонсенс-мутации была обнаружена последовательность, подобная последовательности, описанной для DSE элемента (Таблица 5). Данный факт, а также локализация нонсенс-мутации в начале кодирующей последовательности гена свидетельствует о том, что мРНК his7-l является потенциальным кандидатом для деградации при помощи процесса NMD. 3) мРНК his7-l является субстратом для деградации при помощи процесса NMD. Для того, чтобы изучить, являются ли транскрипты his7- 1 и adel-14 субстратами для деградации при помощи процесса NMD, был получен штамм 5Б-Д1645, несущий мутантные аллели adel-14 и his7-l и дизрупцию гена UPF1. Как известно, инактивация гена UPF1 приводит к нарушениям процесса NMD, что в свою очередь ведет к селективной стабилизации мРНК, являющихся субстратами для деградации при помощи системы NMD (см. Baker and Parker, 2004). Данный штамм был
трансформирован плазмидой pRS316/UPF1, содержащей ген UPF1, или вектором pRS316. В качестве контроля у полученных трансформантов оценили содержание транскрипта CYH2 (рисунок 9), т. к. ранее было показано, что предшественник CYH2 является субстратом для процесса NMD и накапливается у штаммов с нарушением данного процесса (Не et al, 1993). У трансформантов штамма 5Б-Д1645 оценили также содержание мРНК adel-14 и his7-l. Транскрипт АСТ1 был использован в качестве контроля, так как известно, что его деградация не зависит от процесса NMD (Leeds et al, 1991; Parker et al, 1990).
Рисунок 9. Анализ мРНК hts7-l, adel-14 и CYH2 в штамме 5Б-Д] 645, содержащем дизрупцию гена UPF1
Общая РНК получена из штамма 5Б-Д1645, трансформированного вектором pRS316 (upflA) или pRS316/WF7 (UPF1) Нозерн-блот анализ был выполнен с использованием проб, специфичных к HIS7, ADE1, ACT1 и CYH2. Последняя проба детектирует как предшественник CYH2 (верхняя полоса, pre-CYH2) так и зрелую мРНК CYH2 (нижняя полоса, CYH2) Цифры между двумя верхними панелями отражают относительное содержание транскрипта his7-l по сравнению со штаммом, содержащем аллель UPF1 дикого типа (в данном штамме уровень мРНК his7-l принят за единицу) АСТ1 был использован как контроль
Было показано, что содержание мРНК his 7-1 повышено в случае штамма, несущего дизрупцию гена UPF1 по сравнению со штаммом, экспрессирующем аллель гена UPF1 дикого типа (рисунок 9), следовательно данная мРНК является субстратом для деградации при помощи процесса NMD. Содержание мРНК adel-14 не зависело от экспрессии гена UPF1 (рисунок 9), что говорит о том, данная мРНК не подвергается деградации при помощи системы NMD.
4) мРНК Ыь7-1 и CYH2, содержащие нонсенс-мутации, накапливаются у мутантов sup35 и sup45. Таким образом, мы показали, что транскрипт his7-l является субстратом для процесса NMD. Это позволило использовать данный транскрипт в качестве маркера для изучения нарушений данного процесса. Для того чтобы изучить влияние мутаций в гене SUP35 на процесс NMD, мы проанализировали содержание транскриптов his7-l и CYH2 в исходном штамме 1Б-Д1606 и его мутантных производных (рисунок 10А).
Транскрипт his7-l накапливался у штаммов, несущих нонсенс- и миссенс-мутации sup35, а также у штамма 222-1Б-Д1606 по сравнению со штаммом, несущим аллель SUP35 дикого типа (рисунок 10А). Для транскрипта CYH2 также было показано, чго предшественник мРНК CYH2 накапливается в штаммах, несущих мутантные аллели чир35 (рисунок 10А), однако, как и в случае his7-I, его содержание значительно варьировало между мутантами. У мутанта, несущего миссенс-мутацию sup35-228 уровень предшественника CYH2 был увеличен в меньшей степени по сравнению со штаммом дикого типа, чем у мутантов, несущих нонсенс-мутации sup35 (Рисунок 10А). Значительного изменения уровня транскриптов adel-14 и Iys9-A21 у
upflA UPF1
штаммов, несущих мутации ¡ир35, по сравнению со штаммом дикого типа показано не было.
CYH2
aup3S-
SUP3S ■228 -240 -203 -244 ■201
1 0 42 40 42 54 46
Aon mí Ш 44
sup4S•
SUP4S -J03 -J13 ■102 -104 ■105 -107
10 18 21 18 28 28 26 ACT1 feg ЛШЛ^и-^
ШЩШ/р ЧИ^Вг ^^^^ ^^^^
РЖ.
2 1
CYH2
Рисунок 10. Анализ мРНК кн7-1 и СУЮ в штамме 1Б-Д1606 и его производных, несущих мутантные аллели зир35 (А) и ¡ир45 (Б) Номера соответствуют обозначениям мутаций Миссенс-мутации .чир35 и тр45 подчеркнуты. Остальные обозначения как на рисунке 9
Подобный анализ был проведен также для штаммов, несущих мутации в гене SUP45, полученных как и мутанты sup35, на штамме 1Б-Д1606. Мутации sup45-102, sup45-104, sup45-105, snp45-107 приводят к нуклеотидным заменам 159Т->А, 848Т->А, 1153G->T и 950T->G, которые ведут к возникновению стоп-кодона ТАА в 53, 283 или 385 аминокислотном положении белка eRFl в случае первых трех мутаций и стоп-кодона TGA в 317 аминокислотном положении в случае мутации sup45-107 (Moskalenko et al, 2003). Миссенс-мутации sup45-I03 и sup45-II3 приводят к нуклеотидным заменам 62Т->С и 144G->T, ведущим к заменам аминокислот Leu21Ser и Met48Ile, соответственно (Москаленко и др., 2004). Как и в случае мутантов sup35, в штаммах, несущих миссенс и нонсенс-мутации sup45, содержание транскрипта his7-l было повышено по сравнению с исходным штаммом (Рисунок 10Б). В случае мРНК CYH2 предшественник CYH2 накапливался в штаммах, несущих нонсенс-мутации миссенс-мутацию sup45-103, в то время как в штамме, несущем миссенс-мутацию sup45-113, его содержание практически не отличалось от штамма дикого типа. Наши данные свидетельствуют о том, что факторы терминации трансляции eRFl и eRF3 необходимы для нормального протекания процесса NMD.
ВЫВОДЫ
1. Охарактеризованы супрессорные мутации в гене БиР35 дрожжей БассЪаготусе^ сегеу«'/ае, среди которых были выявлены нонсенс и миссенс-мутации вир35 (а также в случае мутации ¿ирЗ 5-217 - повтор 18 нуклеотидов).
2. Штаммы, несущие нонсенс-мутации ¡ир35, содержат полноразмерный белок еИРЗ, однако его содержание снижено по сравнению со штаммом дикого типа. Нонсенс-мутации в гене БиР35 не приводят к снижению количества белка еШ7!.
3. Нонсенс-мутации sup35 локализованы в "слабом" нуклеотидном контексте. Такие мутации способны поддерживать жизнеспособность клеток дрожжей на различном генотипическом фоне в отсутствие мутантных супрессорных тРНК.
4 Миссенс-мутации sup35 (а также в случае мутации sup35-2J7 - повтор 18 нуклеотидов) локализованы в С-домене белка eRF3 и не нарушают взаимодействие белков eRF3 и eRFl. В отличие от нонсенс-мутаций, миссенс-мутации sup35 не влияют на содержание белка eRF3 в клетке.
5 Штаммы, несущие нонсенс- и миссенс-мутации в гене SUP35, характеризуются повышенным содержанием некоторых тРНК по сравнению со штаммом, несущим аллель дикого типа гена SUP35.
6 Определена молекулярная природа нонсенс-мутаций his7-l, Iys9-A21 и trpl-289 Показано, что мРНК his7-l является субстратом для деградации при помощи процесса NMD.
7. Процесс деградации мРНК, содержащих нонсенс-мутации (NMD), нарушен в штаммах, несущих мутации в генах SUP35 и SUP45.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Zhouravleva G , Zemljanko О , Chabelskaja S , Philippe M. Functional analysis of mutations in genes encoding yeast translation termination factors (1999) Current Genetics. XIX international conference on yeast genetics and Molecular biology, Rimini, Italy, 25-30 May, V 35 (3-4), P.217.
2 Шабельская С. Функциональный анализ мутаций в генах, кодирующих факторы терминации трансляции у дрожжей 5 cerevisiae (2000) II съезд ВОГиС, Россия, С Петербург, Т 2, С 97
3 Шабельская С., Кикгев Д, Филипп М, Журавлева Г Изучение взаимодействия фактора терминации трансляции eRF3 с белком Pablp (2002) III съезд биохимического общества, Россия, С Петербург, Т 1, С 24
4 Cosson В , Couturier А , Cbabelskaya S., Kiktev D, Inge-Vechtomov S., Philippe M and Zhouravleva G Poly(A)-Binding Protein acts in translation termination via eRF3 interaction and does not influence [Р5Г] propagation (2002) Molecular and Cellular Biology, V 22, N 10, P. 3301-15
5 Moskalenko S . Chabelskaya S., Inge-Vechtomov S , Philippe M, Zhouravleva G Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae (2003) BMC Molecular Biology, V4,N2,P 1-15
6 Москаленко С E , Журавлева Г A , Соом M Я, Шабельская С.В., Волков К.В , Землянко О.М., Филипп М , Миронова JI Н., Инге-Вечтомов С Г. Характеристика миссенс-мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кодирующем фактор терминации трансляции eRFl (2004) Генетика, Т 40(5), С.478-484
7 Cliabelskaia S, Philippe М, Zhouravleva G Nonsense mutations in the essential gene SUP35 Sacchai omyces cerevisiae (2003) XXI international conference on yeast genetics and Molecular biology, Gothenburg, Sweden, July, V 20 (S10), SI39
8 Шабельская С., Максимова E., Филип M, Журавлева Г Нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP35 Saccharomyces cerevisiae (2004) III съезд ВОГиС, Россия, Москва, июнь, т.2, с 374
9 Chabelskaya, S., Kiktev D A., Inge-Vechtomov, S , Philippe, M. & Zhouravleva, G Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are non-lethal (2004) Mol Genet Genomics, V.272(3), P 297-307.
4
i «
РНБ Русский фонд
2005-4 45259
Подписано в печать 28.03.05. Тираж 80 экз. * . %
Заказ № 70-138/2005 ' Г -г '»
Отпечатано в издательско-полиграфическом отделе СП6ТП11 •' * л л л
¿01
2 2 АЛР 2005
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шабельская, Светлана Васильевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ.
1.1. Факторы терминации трансляции у прокариот.
1.2. Эукариотические факторы терминации трансляции.
1.2.1. Факторы терминации трансляции первого класса (еШ7!).
1.2.2. Факторы терминации трансляции второго класса (еКРЗ).
1.2.3. Белок БирЗб - дрожжевой фактор еКРЗ.
1.2.4. [РбТ4"] - прионная форма еЯРЗ £ сегеушде.
1.3. Супрессия нонсенс-кодонов или принцип неоднозначности терминации трансляции.
1.3.1. Факторы, влияющие на эффективность нонсенс-супрессии.
1.3.2. Частичная инактивация факторов терминации трансляции.
1.4. Белки, взаимодействующие с факторами терминации трансляции
1.4.1. Комплекс еШЛ и еЯРЗ.
1.4.2. Взаимодействие факторов терминации трансляции с белками ирП, 1даиирВ.
1.4.3. Взаимодействие еИРЗ с РаЫ.
1.4.4. Взаимодействие еЯР1 и еЯРЗ с другими белками.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
Трансляция мРНК включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Нормальное течение процесса элонгации прекращается, когда один из стоп-кодонов иАА, ИАС или 1ЮА попадает в А-сайт рибосомы, в результате чего происходит гидролиз связи между тРНК и полипептидом и освобождение белка. На сегодняшний день изучение процесса терминации трансляции представляет собой одну из сложных и интересных задач современной генетики. В течение последних сорока лет делались попытки описать данный процесс, но, несмотря на это, основные механизмы его до настоящего времени остаются неясными.
Удобной моделью для изучения терминации трансляции у эукариот являются дрожжи ЗасскаготусеБ сегеУ1$1ае. Изучение нонсенс-супрессии у данного организма позволило выявить гены БиР45 и 311Р35 (Инге-Вечтомов, 1964; Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970), которые, как выяснилось позже, кодируют факторы терминации трансляции еШЧ и еКРЗ (Рго1оуа е/ а1., 1994; Е1юигау1еуа е/ а1, 1995). еШЛ ответственен за узнавание всех трех стоп-кодонов иАА, V.АО и 1ЮА. Известно, что еИРЗ - ГТФ-связывающий белок, влияющий на эффективность трансляции, однако его роль в терминации трансляции остается до конца не выясненной. Открытия последних лет заставляют посмотреть на факторы семейств еШЛ и еИРЗ как на многофункциональные белки, принимающие участие в различных процессах, протекающих в клетке. Это подтверждается также тем, что факторы еШЛ и еКРЗ задействованы в ряде белок-белковых взаимодействий. Кроме того, в последнее время исследования, связанные с геном 5С/Р35, вызывают пристальный интерес, поскольку ген 5С/Р35 необходим для поддержания одного из наиболее изученных на сегодня дрожжевых прионов -детерминанта
Мутанты по генам БИРЗЗ и ЗиР45 активно используются при анализе механизмов терминации трансляции у дрожжей Я. сегеу1'яше. Мутации в этих генах приводят к понижению точности терминации трансляции и к омнипотентной нонсенс-супрессии, а также к различным плейотропным эффектам. Данное свойство позволяет использовать мутации Бир45 и $ир35 в изучении не только механизма терминации трансляции и явления неоднозначности трансляции, но и исследовать связь между трансляцией и другими клеточными процессами. В настоящей работе была проведена молекулярно-генетическая характеристика мутаций в гене БиР35 дрожжей & сегеу1Я1ае, кодирующем фактор терминации трансляции еКРЗ.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шабельская, Светлана Васильевна
выводы
Охарактеризованы супрессорные мутации в гене SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, среди которых были выявлены нонсенс и миссенс-мутации sup35 (а также в случае мутации sup35-217 - повтор 18 нуклеотидов).
Штаммы, несущие нонсенс-мутации sup35, содержат полноразмерный белок eRF3, однако его содержание снижено по сравнению со штаммом дикого типа. Нонсенс-мутации в гене SUP35 не приводят к снижению количества белка eRFl.
Нонсенс-мутации sup35 локализованы в "слабом" нуклеотидном контексте. Такие мутации способны поддерживать жизнеспособность клеток дрожжей на различном генотипическом фоне в отсутствие мутантных супрессорных тРНК.
Миссенс-мутации sup35 (а также в случае мутации sup35-217 - повтор 18 нуклеотидов) локализованы в С-домене белка eRF3 и не нарушают взаимодействие белков eRF3 и eRFl. В отличие от нонсенс-мутаций, миссенс-мутации sup35 не влияют на содержание белка eRF3 в клетке.
Штаммы, несущие нонсенс- и миссенс-мутации в гене SUP35, характеризуются повышенным содержанием некоторых тРНК по сравнению со штаммом, несущим аллель дикого типа гена SUP35.
Определена молекулярная природа нонсенс-мутаций his7-l, Iys9-A21 и trp1-289. Показано, что мРНК his7-l является субстратом для деградации при помощи процесса NMD.
Процесс деградации мРНК, содержащих нонсенс-мутации (NMD), нарушен в штаммах, несущих мутации в генах SUP35 и SUP45.
Заключение
Таким образом, факторы eRFl и eRF3 являются белками, играющими основную роль в процессе терминации трансляции и контролирующими точность данного процесса. В то время как функция eRFl в данном процессе в настоящий момент определена, роль фактора eRF3 остается неопределенной. Кроме того, исследования последних лет позволяют рассматривать белки семейств eRFl и eRF3 как на многофункциональные факторы, принимающие участие в различных процессах, протекающих в клетке.
Одним из возможных подходов, использующихся для характеристики структурно-функциональной организации гена SUP35 и кодируемого им белка, является изучение мутаций sup35. Мутации в этом гене приводят к понижению точности терминации трансляции и к омнипотентной нонсенс-супрессии, а также к различным плейотропным эффектам. Поэтому мутации sup35 позволяют изучать не только роль eRF3 в процессе терминации трансляции, но и исследовать функциональные связи между трансляцией и другими клеточными процессами.
Данная работа посвящена получению и молекулярно-генетической характеристике мутаций в гене SUP35 дрожжей S. cerevisiae и изучению эффектов, вызываемых этими мутациями.
В ходе работы решались следующие задачи:
1. Получение штаммов дрожжей S. cerevisiae, несущих супрессорные мутации в гене SUP35, и выяснение молекулярной природы полученных мутаций.
2. Изучение влияния миссенс и нонсенс-мутаций в гене SUP35 на содержание белков eRF3 и eRFl в клетке и на уровень мРНК SUP35.
3. Изучение возможных механизмов, обеспечивающих жизнеспособность штаммов, несущих нонсенс-мутации в жизненно-важном гене SUP35.
4. Изучение влияния миссенс и нонсенс-мутаций в гене SUP35 на процесс NMD, обеспечивающий деградацию аберрантных мРНК.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы
В работе использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий (ПГЛ), а также сегреганты диплоидов -продуктов гибридизации штаммов ПГЛ со штаммами, полученными из других лабораторий. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.
Штамм 1Б-Д1606 является сегрегантом диплоида, полученного при скрещивании штаммов ЗЭГ-Д373 и 42Б-П3990. Штамм 5Б-Д1645 получен в результате тетрадного анализа диплоида, полученного при скрещивании штаммов Y06214 и 16А-Д1608. Все использованные в работе штаммы не содержат эпигенетического наследственного детерминанта [PSI*]. Производные штамма 1Б-Д1606, несущие мутации в гене SUP45, были описаны ранее (Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004).
Также был использован штамм Е. coli JM109 {г ее А1 supE44 endAl hsdRl7 gyrA96 relAl thi Aflac-proAB) F'[traD36proAB+ lacF lacZAM15]). Для экспрессии и выделения белка eRF3 был использован штамм Е. coli BL21(DE3)pLyS (F ompThsdSB(rB"mB) gal dem (DE3) pLysS (CmR)) (Novagen).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шабельская, Светлана Васильевна, Санкт-Петербург
1. Борхсениус A.C., С.Г. Инге-Вечтомов. О роли генов SUP35 и SUP45 в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов (1997) Молекул, биология, Т.353, С.553-556.
2. Захаров И.А., С.А. Кожин, Т.Н. Кожина, И.В. Федорова. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. JL: Наука, 1984, 143С.
3. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине (1964) Вестник ЛГУ, Сер. 2, Вып. 9, С.112117.
4. Инге-Вечтомов С.Г. Точность реализации генетической информации (1969) Вестник АН СССР, Т.8, С.25-30.
5. Инге-Вечтомов С.Г., В.М. Андрианова. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей (1970) Генетика, Т.6, С.103-115.
6. Инге-Вечтомов С.Г., О.Н. Тиходеев, Т.С. Карпова. Селективная система для получения рецессивных рибосомных супрессоров у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (1988) Генетика, Т.24, С.1159-1165.
7. Инге-Вечтомов С.Г., JI.H. Миронова, М.Д. Тер-Аванесян. Неоднозначность трансляции: версия эукариот? (1994) Генетика, Т.30, С.1022-1035.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Пер. с англ. Мир. -1984.
9. Миронова JI.H. Генетический и эпигенетический контроль считывания стоп-кодонов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Автореферат докт. дисс., Санкт-Петербург, 2002.f
10. Москаленко С.Е. Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей S. cerevisiae. Автореферат канд. дисс., Санкт-Петербург, 2003.
11. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975, 296С.
12. Amrani N., R. Ganesan, S. Kervestin, D. A. Mangus, S. Ghosh and A. Jacobson. A faux 3-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay (2004) Nature, V.432, P. 112-8.
13. Andjelkovic N., S. Zolnierowicz, C. Van Hoof, J. Goris and B. A. Hemmings. The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor eRFl (1996) EMBO J, V.15, P.7156-67.
14. Atkin A. L., L. R. Schenkman, M. Eastham, J. N. Dahlseid, M. J. Lelivelt and M. R. Culbertson. Relationship between yeast polyribosomes and Upf proteins required for nonsense mRNA decay (1997) J Biol Chem, V.272, P.22163-72.
15. Baker К. E. and R. Parker. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression (2004) Curr Opin Cell Biol, V.16, P.293-9.
16. Basu J., В. C. Williams, Z. Li, E. V. Williams and M. L. Goldberg. Depletion of a Drosophila homolog of yeast Sup35p disrupts spindleassembly, chromosome segregation, and cytokinesis during male meiosis (1998) Cell Motil Cytoskeleton, V.39, P.286-302.
17. Beier H. and M. Grimm. Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs (2001) Nucleic Acids Res, V.29, P.4767-82.
18. Benzer S. and S. P. Champe. A change from nonsense to sense in the genetic code (1962) Proc Natl Acad Sci USA, V.48, P.l 114-21.
19. Bernstein P. and J. Ross. Poly(A), poly(A) binding protein and the regulation ofmRNA stability (1989) Trends Biochem Sci, V.14, P.373-7.
20. Bertram G., S. Innes, O. Minella, J. Richardson and I. Stansfield. Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition (2001) Microbiology, V.147, P.255-69.
21. Bjornsson A., S. Mottagui-Tabar, L.A. Isaksson. Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination (1996) EMBO J. V.15, P.1696-1704.
22. Boeck R., B. Lapeyre, C. E. Brown and A. B. Sachs. Capped mRNA degradation intermediates accumulate in the yeast spb8-2 mutant (1998) Mol Cell Biol, V.18, P.5062-72.
23. Bonetti B., L. Fu, J. Moon and D. M. Bedwell. The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae (1995) J Mol Biol, V.251, P.334-45.
24. Borchsenius A. S., A. A. Tchourikova and S. G. Inge-Vechtomov. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae (2000) Curr Genet, V.37, P.285-91.
25. Bradley M. E., S. Bagriantsev, N. Vishveshwara and S. W. Liebman. Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45 (2003) Yeast, V.20, P.625-32.
26. Buckingham R.H., G. Grentzmann, L. Kisselev. Polypeptide chain release factors (1997) Mol. Microbiol., V.24, P.449-456.
27. Cai T., T. R. Reilly, M. Cerio and M. E. Schmitt. Mutagenesis of SNM1, which encodes a protein component of the yeast RNase MRP, reveals a role for this ribonucleoprotein endoribonuclease in plasmid segregation (1999) Mol Cell Biol, V.19, P.7857-69.
28. Capecchi M.R., G.N. Gussin. Supression in vitro: Identification of a serin s-RNA as a "nonsense" suppressor (1965) Science, V.149, P.417-422.
29. Carnes J., M. Jacobson, L. Leinwand and M. Yarns. Stop codon suppression via inhibition of eRFl expression (2003) RNA, V.9, P.648-53.
30. Carr-Schmid A, Durko N, Cavallius J, Merrick WC, Kinzy TG. Mutations in a GTP-binding motif of eukaryotic elongation factor 1A reduce both translational .delity and the requirement for nucleotide exchange (1999) J Biol Chem, V.274,P.30297-30302.
31. Caskey C.T., W.C. Forrester, W. Tate, C.D. Ward. Cloning of the Escherichia coli release factor 2 gene (1984) J. Bacteriol., V.158, P.365-368.
32. Chao A. T., H. A. Dierick, T. M. Addy and A. Bejsovec. Mutations in eukaryotic release factors 1 and 3 act as general nonsense suppressors in Drosophila (2003) Genetics, V.165, P.601-12.
33. Chavatte L., A. Seit-Nebi, V. Dubovaya and A. Favre. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome (2002) EMBO J, V.21, P.5302-11.
34. Chernoff Y. O., I. L. Derkach and S. G. Inge-Vechtomov. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae (1993) Curr Genet, V.24, P.268-70.
35. Cosson B., A. Couturier, R. Le Guellec, J. Moreau, S. Chabelskaya, G. Zhouravleva and M. Philippe. Characterization of the poly(A) binding proteins expressed during oogenesis and early development of Xenopus laevis (2002c) Biol Cell, V.94, P.217-31.
36. Cosson B., N. Berkova, A. Couturier, S. Chabelskaya, M. Philippe and G. Zhouravleva. Poly(A)-binding protein and eRF3 are associated in vivo in human and Xenopus cells (2002a) Biol Cell, V.94, P.205-16.
37. Cox B.S. Psi, a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast (1965) Heredity, V.20, P.505-521.
38. Craig A. W., A. Haghighat, A. T. Yu and N. Sonenberg. Interaction of polyadenylate-binding protein with the eIF4G homologue PAIP enhances translation (1998) Nature, V.392, P.520-3.
39. Cui Y., K. W. Hagan, S. Zhang and S. W. Peltz. Identification and characterization of genes that are required for the accelerated degradation of mRNAs containing a premature translational termination codon (1995) Genes Dev, V.9, P.423-36.
40. Culbertson M. R., K. M. Underbrink and G. R. Fink. Frameshift suppression Saccharomyces cerevisiae. II. Genetic properties of group II suppressors (1980) Genetics, V.95, P.833-53.
41. Czaplinski K., Y. Weng, K. W. Hagan and S. W. Peltz. Purification and characterization of the Upfl protein: a factor involved in translation and mRNA degradation (1995) RNA, V.l, P.610-23.
42. Czaplinski K., N. Majlesi, T. Banerjee and S. W. Peltz. Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency (2000) RNA, V.6, P.730-43.
43. Dagkesamanskaia A. R., Ter-Avanesian, M. D., Mager W.H. Nranscriptional regulation of SUP35 and SUP45 in Saccharomyces cerevisiae (1997) Yeast, V.13, P.1265-12745.
44. Dayhoff, M . O., R. V. Eck, M . A. Chang & M. R. Sochard (1965) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Maryland.
45. Deo R. C., J. B. Bonanno, N. Sonenberg and S. K. Burley. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein (1999) Cell, V.98, P.835-45.
46. DePace A., Santoso A., Hillner P., Weissman J. S. A Critical Role for Amino-Terminal Glutamine/AsparagineRepeatrs in the Formation and Propagation of a Yeast Prion. (1998) Cell, V.93, P. 1241-1252.
47. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of PS/*. prion factors in Saccharomyces cerevisiae (1996) Genetics, V.144, P.1375-1386.
48. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2-mutation which eliminates the PSI*. factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene (1994) Genetics, V.137, P.659-670.
49. Dontsova M., L. Frolova, J. Vassilieva, W. Piendl, L. Kisselev and M. Garber. Translation termination factor aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes (2000) FEBS Lett, V.472, P.213-6.
50. Ebihara K. and Y. Nakamura. C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids (1999) RNA, V.5, P.739-50.
51. Eurwilaichitr L., F. M. Graves, I. Stansfield and M. F. Tuite. The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae (1999) Mol Microbiol, V.32, P.485-96.
52. Farabaugh P. J. and G. R. Bjork. How translational accuracy influences reading frame maintenance (1999) EMBO J, V.18, P. 1427-34.
53. Feral C., M. G. Mattei, A. Pawlak and G. Guellaen. Chromosomallocalization of three human poly(A)-binding protein genes and four related pseudogenes (1999) Hum Genet, V.105, P.347-53.
54. Fortes P., T. Inada, T. Preiss, M. W. Hentze, I. W.Mattaj, A. B. Sachs. The yeast nuclear cap binding complex can interact with translation factor eIF4G and mediate translation initiation (2000) Mol Cell, V.6, P. 191-196.
55. Freistroffer D.V., M.Y. Pavlov, J. McDougall, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Release factor RF3 in E. coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner (1997) EMBO J., V.16, P.4126-4133.
56. Frolova L., X. Le Goff, G. Zhouravleva, E. Davydova, M. Philippe and L. Kisselev. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase (1996) RNA, V.2, P.334-41.
57. Frolova L. Y., J. L. Simonsen, T. I. Merkulova, D. Y. Litvinov, P. M.
58. Frolova L., A. Seit-Nebi and L. Kisselev. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaiyotic translation termination factor eRFl (2002) RNA, V.8, P.129-36.
59. Gietz D., A. St Jean, R. A. Woods and R. H. Schiestl. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells (1992) Nucleic Acids Res, V.20, P. 1425.
60. Goldstein J., Caskey C. Peptide chain termination: effect of proteins S on ribosome binding of release factors (1970) NAS, V.67, P.537-543.
61. Guthrie, C. and G. R. Fink, Guide to yeast genetics and molecular biology. San Diego etc., Academic Press, 1991.
62. Gonzalez C. I., M. J. Ruiz-Echevarria, S. Vasudevan, M. F. Henry and S. W. Peltz. The yeast hnRNP-like protein Hrpl/Nab4 marks a transcript for nonsense-mediated mRNA decay (2000) Mol Cell, V.5, P.489-99.
63. Grenett H. E., P. Bounelis and G. M. Fuller. Identification of a human cDNA with high homology to yeast omnipotent suppressor 45 (1992) Gene, V.110, P.239-43.
64. Grentzmann G., D. Brechemier-Baey, V. Heurgue, L. Mora and R.H Buckingham. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia (1994) PNAS, V.91, P.5848-58-52.
65. Grentzmann G., P.J. Kelly, S. Laalami, M. Shuda, M.A. Firpo, Y. Cenatiempo, A. Kaji. Release factor RF-3 GTPase activity acts in disassembly of the ribosome termination complex (1998) RNA, V.8, P.973-983.
66. Hagan, K. W., M. J. Ruiz-Echevarria, Y.Quan, S. W.Peltz. Characterization of cis-acting sequences and decay intermediates involved in nonsensemediated mRNA turnover (1995) Mol Cell Biol, V.15, P. 809-23.
67. Harger J. W. and J. D. Dinman. Evidence against a direct role for the Upf # proteins in frameshifting or nonsense codon readthrough (2004) RNA, V. 10,1. P.1721-9.
68. Harrison P., A. Kumar, N. Lan, N. Echols, M. Snyder, M. Gerstein. A small reservoir of disabled ORFs in the yeast genome and its implications for the dynamics of proteome evolution (2002) J. Mol. Biol., V.316. P. 409-419.
69. He F., S. W. Peltz, J. L. Donahue, M. Rosbash and A. Jacobson. Stabilization and ribosome association of unspliced pre-mRNAs in a yeast upfl- mutant (1993) Proc Natl Acad Sci USA, V.90, P.7034-8.
70. He F. and A. Jacobson. Identification of a novel component of the nonsensemediated mRNA decay pathway by use of an interacting protein screen (1995) Genes Dev, V.9, P.437-54.
71. He F. and A. Jacobson. Upflp, Nmd2p, and Upf3p regulate the decapping and exonucleolytic degradation of both nonsense-containing mRNAs and wild-type mRNAs (2001) Mol Cell Biol, V.21, P. 1515-30.
72. He F., X. Li, P. Spatrick, R. Casillo, S. Dong and A. Jacobson. Genome-wide analysis of mRNAs regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mRNA decay pathways in yeast (2003) Mol Cell, V.12, P.1439-52.
73. Himmelfarb H.J., E. Maicas, J.D. Friesen. Isolation of the SUP45 omnipotent suppressor gene of Saccharomyces cerevisiae and characterization of its gene product (1985) Mol. Cell. Biol., V.5, P.816-822.
74. Hoshino S., Imai M., Kobayashi T., Uchida N., Katada T. The eukaryotic polypeptide chain Releasing factor (eRF3/GSPT) carrying the translation signal to the 3'-poly(A) tail of mRNA (1999) The Journal of Biological Chemistry, V.274, P.16677-16680.
75. Hosoda N., T. Kobayashi, N. Uchida, Y. Funakoshi, Y. Kikuchi, S. Hoshino and T. Katada. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation (2003) J Biol Chem, V.278, P.38287-91.
76. Inge-Vechtomov S., G. Zhouravleva and M. Philippe. Eukaryotic release factors (eRFs) history (2003) Biol Cell, V.95, P. 195-209.
77. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids (1990) Gene, V.96, P.23-28.
78. Ito K., K. Ebihara, M. Uno, M. Nakamura. Conserved motifs in prokaryiotic and eukaryiotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.93, P.5453-5448.
79. Ito K., K. Ebihara and Y. Nakamura. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast (1998) RNA, V.4, P.958-72.
80. Ito-Harashima S., P. E. Hartzog, H. Sinha and J. H. McCusker. The tRNA-Tyr gene family of Saccharomyces cerevisiae: agents of phenotypicvariation and position effects on mutation frequency (2002) Genetics, V.161, P.1395-410.
81. Jacobson A. and S. W. Peltz. Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells (1996) Annu Rev Biochem, V.65, P.693-739.
82. Jakobsen C. G., T. M. Segaard, O. Jean-Jean, L. Frolova and J. Justesen. Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo (2001) Mol Biol (Mosk), V.35, P.672-81.
83. Janosi L., R. Ricker and A. Kaji. Dual functions of ribosome recycling factor in protein biosynthesis: disassembling the termination complex and preventing translational errors (1996) Biochimie, V.78, P.959-69.
84. Janzen D. M. and A. P. Geballe. The effect of eukaryotic release factor depletion on translation termination in human cell lines (2004) Nucleic Acids Res, V.32, P.4491-502.
85. Jean-Jean O., X. Le Goff and M. Philippe. Is there a human \psiY> (1996) C R Acad Sci III, V.319, P.487-92.
86. Kaiser C., S. Michaelis, A. Mitchell. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994,234P.
87. Keeling K. M., J. Lanier, M. Du, J. Salas-Marco, L. Gao, A. Kaenjak-Angeletti and D. M. Bedwell. Leaky termination at premature stop codons antagonizes nonsense-mediated mRNA decay in S. cerevisiae (2004) RNA, V.10, P.691-703.
88. Khaleghpour K., A. Kahvejian, G. De Crescenzo, G. Roy, Y. V. Svitkin, H. Imataka, M. O'Connor-McCourt and N. Sonenberg. Dual interactions of the translational repressor Paip2 with poly(A) binding protein (2001) Mol Cell Biol, V.21, P.5200-13.
89. Kikuchi Y., K. Shimatake, A. Kikuchi. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain (1988) EMBO J., V.7, P. 1175-1182.
90. King C.-Y. Supporting the Structural Basis of Prion Starins: Induction and Identification on of P.S7+. Variants (2001) J. Mol. Biol., V. 307, P.1247-1260.
91. Kisselev L. L. and R. H. Buckingham. Translational termination comes of age (2000) Trends Biochem Sci, V.25, P.561-6.
92. Kisselev L., M. Ehrenberg and L. Frolova. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? (2003) EMBO J, V.22, P.175-82.
93. Klaholz B.P., T. Pape, A.V. Zavialov, A.G. Myasnikov, E.V. Orlova, B. Vestergaard, M. Ehrenberg, M. van Heel. Structure of the E.coli ribosomal termination complex with release factor 2 (2003) Nature, V.421, P.90-94.
94. Kobayashi T., Y. Funakoshi, S. I. Hoshino and T. Katada. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay (2004) J Biol Chem.
95. Kokoska R. J., L. Stefanovic, A. B. Buermeyer, R. M. Liskay and T. D. Petes. A mutation of the yeast gene encoding PCNA destabilizes bothmicrosatellite and minisatellite DNA sequences (1999) Genetics, V.151, P.511-9.
96. Konecki D., K. Aune, W. Tate, C Caskei. Characterisation of reticulocyte release factor (1977) J. Biol. Chem., V.252, P.4514-4520.
97. Kong C., K. I to, M. A. Walsh, M. Wada, Y. Liu, S. Kumar, D. Barford, Y. Nakamura and H. Song. Crystal Structure and Functional Analysis of the Eukaryotic Class II Release Factor eRF3 from S. pombe (2004) Mol Cell, V.14, P.233-45.
98. Kopczynski J. B., A. C. Raff and J. J. Bonner. Translational readthrough at nonsense mutations in the HSF1 gene of Saccharomyces cerevisiae (1992) Mol Gen Genet, V.234, P.369-78.
99. Kozak, M, Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems (1989) Mol Cell Biol, V. 9, P. 507380.
100. Kozlov G., Trempe J.-F., Khaleghpour K., Kahvejian A., Ekiel I., Gehring K. Structure and function of the C-terminal PABC domain of human poly(A)-binding protein (2001) PNAS, V.98, P.4409-4413.
101. Kushnirov V. V., M. D. Ter-Avanesyan, M. V. Telckov, A. P. Surguchov, V. N. Smirnov and S. G. Inge-Vechtomov. Nucleotide sequence of the SUP2 (iSUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae (1988) Gene, V.66, P.45-54.
102. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (1970) Nature, V.227, P.680-5.
103. Le Goff C., O. Zemlyanko, S. Moskalenko, N. Berkova, S. Inge-Vechtomov, M. Philippe and G. Zhouravleva. Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo (2002) Genes Cells, V.7, P.1043-57.
104. Le Goff X., M. Philippe and O. Jean-Jean. Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells (1997) Mol Cell Biol, V. 17, P.3164-72.
105. Lee B. S. and M. R. Culbertson. Identification of an additional gene required for eukaryotic nonsense mRNA turnover (1995) Proc Natl Acad Sci USA, V.92, P. 10354-8.
106. Leeds P., J. M. Wood, B. S. Lee and M. R. Culbertson. Gene products that promote mRNA turnover in Saccharomyces cerevisiae (1992) Mol Cell Biol, V.12, P.2165-77.
107. Leeds P., S. W. Peltz, A. Jacobson and M. R. Culbertson. The product of the yeast UPF1 gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon (1991) Genes Dev, V.5, P.2303-14.
108. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast (1999) Nature, V.400, P.573-576.
109. Loftfield R. B. and D. Vanderjagt. The frequency of errors in protein biosynthesis (1972) Biochem J, V.128, P.1353-6.
110. Lykke-Andersen J., M. D. Shu and J. A. Steitz. Human Upf proteins target an mRNA for nonsense-mediated decay when bound downstream of a termination codon (2000) Cell, V. 103, P. 1121 -31.
111. Ma B. and R. Nussinov. Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes (2004) J Biol Chem, V.279, P.53875-85.
112. Maderazo A. B., F. He, D. A. Mangus and A. Jacobson. Upflp control of nonsense mRNA translation is regulated by Nmd2p and Upf3p (2000) Mol Cell Biol, V.20, P.4591-603.
113. Mangus D. A., N. Amrani and A. Jacobson. Pbplp, a factor interacting with Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein, regulates polyadenylation (1998) Mol Cell Biol, V.18, P.73 83-96.
114. Mendell J. T., S. M. Medghalchi, R. G. Lake, E. N. Noensie and H. C. Dietz. Novel Upf2p orthologues suggest a functional link between translation initiation and nonsense surveillance complexes (2000) Mol Cell Biol, V.20, P.8944-57.
115. Mikuni O., K. Ito, J. Moffat, K. Matsumura, K. McCaughan, T. Nobukuni, W. Tate, Y. Nakamura. Identification of the prfC gene of Escherichia coli (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.91, P.5798-5802.
116. Mitchell P. and D. Tollervey. An NMD pathway in yeast involving accelerated deadenylation and exosome-mediated 3'->5' degradation (2003) Mol Cell, V.ll, P.1405-13.
117. Mori N., Y. Funatsu, K. Hiruta and S. Goto. Analysis of translational fidelity of ribosomes with protamine messenger RNA as a template (1985) Biochemistry, V.24, P. 1231-9.
118. Moskalenko S. E., S. V. Chabelskaya, S. G. Inge-Vechtomov, M. Philippe and G. A. Zhouravleva. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae (2003) BMC Mol Biol, V.4, P.2.
119. Mottagui-Tabar S., M.F. Tuite, L.A. Isaksson. The influence of 5' codon context on translation termination in Saccharomyces cerevisiae (1998) Eur. J. Biochem., V.257, P.249-254.
120. Murgola E.J. tRNA, suppression, and the code (1985) Annu. Rev. Genet., V.19.,P. 57-80.
121. Nagy E. and L. E. Maquat. A rule for termination-codon position within intron-containing genes: when nonsense affects RNA abundance (1998) Trends Biochem Sci, V.23, P. 198-9.
122. Nakamura Y., K. Ito, L.A. Isaksson. Emerging understanding of translation termination (1996) Cell, V.87, P.147-150.
123. Nakamura Y., K. Ito and M. Ehrenberg. Mimicry grasps reality in translation termination (2000) Cell, V.101, P.349-52.
124. Namy O., I. Hatin, G. Stahl, H. Liu, S. Barnay, L. Bidou and J. P. Rousset. Gene overexpression as a tool for identifying new trans-acting factors involved in translation termination in Saccharomyces cerevisiae (2002) Genetics, V.161, P.585-94.
125. Namy O., G. Duchateau-Nguyen, I. Hatin, S. Hermann-Le Denmat, M. Termier and J. P. Rousset. Identification of stop codon readthrough genes in Saccharomyces cerevisiae (2003) Nucleic Acids Res, V.31, P.2289-96.
126. Nissen P., M. Kjeldgaard, S. Thirup, G. Polekhina, L. Reshetnikova, B.F. Clark, J. Nyborg. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNA, EF-Tu, and a GTP analog (1995) Science, V.270. P.1464-1472.
127. Olaffson O., J.U. Ericson, R. VanBogelen, G.R. Bjork. Mutation in the structural gene for release factor 1 (RF-1) of Salmonella typhimurium inhibits cell division (1996) J.Bacteriol., V.178, P.3829-3839.
128. Parham S., Resende C., Tuite M. Oligopeptide repeats in the yeast protein Sup35p stabilize intermolecular prion interactions (2001) EMBO J, V.20, P.2111-2119.
129. Paris J. and M. Philippe. Poly(A) metabolism and polysomal recruitment of maternal mRNAs during early Xenopus development (1990) Dev Biol, V.140, P.221-4.
130. Patino M.M., J.J. Liu, J.R. Glover, S. Lindquist. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast (1996) Science, V.273. P.622-626.
131. Paushkin S.V., V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov, M.D. Ter-Avanesyan. Propagation of the yeast prion-like p.si+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-Qncoded polypeptide chain release factor (1996) EMBO J., V.15. P.3127-3134.
132. Paushkin S. V., V. V. Kushnirov, V. N. Smirnov and M. D. Ter-Avanesyan. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation (1997) Mol Cell Biol, V.17, P.2798-805.
133. Pavlov M.Y., D.V. Freistriffer, J. MacDougall, R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. Fast recycling of Escherichia coli ribosomes requires both ribosome recycling factor (RRF) and release factor RF3 (1997) EMBO J., V.16, P.4134-4141.
134. Pel H.J. Escherichia coli release factor 3: resolving of a typical G protein structure and atypical function with guanine nucleotides (1998) RNA, V.4, P.47-54.
135. Peltz S. W., A. H. Brown and A. Jacobson. mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting sequence elements and one trans-acting factor (1993) Genes Dev, V.7, P. 1737-54.
136. Pluta K., O. Lefebvre, N.C. Martin, W.J. Smagowicz, D.R. Stanford, S.R. Ellis, A.K. Hopper, A. Sentenac, M. Bogute. Maflp, a negative effector of
137. RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae (2001) Mol. Cell. Biol., V.21, P.5031-5040.
138. Poole E.S., R. Brimacombe, W.P. Tate. Decoding the translational termination signal: the polypeptide chain release factor in Escherichia coli crosslinks to the base following the stop codon (1997) RNA, V.3, P.974-982.
139. Poole E.S, W.P. Tate. Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis (2000) Bioch. Bioph. Acta, V.1493, P.l-11.
140. Pulak R. and P. Anderson. mRNA surveillance by the Caenorhabditis elegans smg genes (1993) Genes Dev, V.7, P.1885-97.
141. Pure G.A., G.W. Robinson, L. Naumovski, E.C. Friedberg. Partial suppression of an ochre mutation in Saccharomyces cerevisiae by multicopy plasmids containing a normal yeast transfer RNA-Gln gene (1985) J. Mol. Biol., V.183,P.31-42.
142. Resende C. G., T. F. Outeiro, L. Sands, S. Lindquist and M. F. Tuite. Prion protein gene polymorphisms in Saccharomyces cerevisiae (2003) Mol Microbiol, V.49, P. 1005-17.
143. Riles L. and M. V. Olson. Nonsense mutations in essential genes of Saccharomyces cerevisiae (1988) Genetics, V.l 18, P.601-7.
144. Ruiz-Echevarria M. J., C. I. Gonzalez and S. W. Peltz. Identifying the right stop: determining how the surveillance complex recognizes and degrades an aberrant mRNA (1998) EMBO J, V.17, P.575-89.
145. Sachs A. B., M. W. Bond and R. D. Kornberg. A single gene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins: domain structure and expression (1986) Cell, V.45, P.827-35.
146. Salas-Marco J. and D. M. Bedwell. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination (2004) Mol Cell Biol, V.24, P.7769-78.
147. Sambrook J., E.F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 723P.
148. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier (2000) Cell, V.100, P.277-288.
149. Scolnick E., R. Tompkins, T. Caskey, M. Nirenberg. Release factors differing in specificity for terminator codons (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.61, P.768-774.
150. Seit-Nebi A., L. Frolova and L. Kisselev. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl (2002) EMBO Rep, V.3, P.881-6.
151. Serin G., A. Gersappe, J. D. Black, R. Aronoff and L. E. Maquat. Identification and characterization of human orthologues to Saccharomyces cerevisiae Upf2 protein and Upf3 protein (Caenorhabditis elegans SMG-4) (2001) Mol Cell Biol, V.21, P.209-23.
152. Serio T. R. and S. L. Lindquist. PSI+.: an epigenetic modulator of translation termination efficiency (1999) Annu Rev Cell Dev Biol, V.15, P.661-703.
153. Sherman F. Suppression in yeast Saccharomyces cerevisiae II In: Molecular Biology of the yeast Saccharomyces'. Metabolism and Gene Expression. Ed. by J.N. Strathern et al., Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1982, P.463 -486.
154. Sherman, F., G. R. Fink, B. Hicks. Laboratory course manual for methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, 186P.
155. Sikorski R. S. and P. Hieter. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae (1989) Genetics, V.122, P. 19-27.
156. Song H., P. Mugnier, A.K. Das, H.M. Webb, D.R. Evans, M.F. Tuite, B.A. Hemmings, D. Barford. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl-mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis (2000) Cell, V.100, P.311-321.
157. Stansfield I. and M. F. Tuite. Polypeptide chain termination in Saccharomyces cerevisiae (1994) Curr Genet, V.25, P.385-95.
158. Stansfield I., L. Eurwilaichitr, Akhmaloka and M. F. Tuite. Depletion in the levels of the release factor eRFl causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast (1996) Mol Microbiol, V.20, P. 1135-43.
159. Stansfield I., K. M. Jones, P. Herbert, A. Lewendon, W. V. Shaw and M. F. Tuite. Missense translation errors in Saccharomyces cerevisiae (1998) J Mol Biol, V.282, P. 13-24.
160. Stretton A. O. and S. Brenner. Molecular Consequences of the Amber Mutation and Its Suppression (1965) J Mol Biol, V.12, P.456-65.
161. Thompson J. D., T. J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin and D. G. Higgins. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools (1997) Nucleic Acids Res, V.25, P.4876-82.
162. Tikhomirova V. L. and S. G. Inge-Vechtomov. Sensitivity of sup35 and sup45 suppressor mutants in Saccharomyces cerevisiae to the anti-microtubule drug benomyl (1996) Curr Genet, V.30, P.44-9.
163. Tuite M. F. Yeast prions and their prion-forming domain (2000) Cell, V. 100, P.289-292.
164. Uchida N., S. Hoshino, H. Imataka, N. Sonenberg and T. Katada. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation (2002) J Biol Chem, V.277, P.50286-92.
165. Urakov V. N., I. A. Valouev, E. I. Lewitin, S. V. Paushkin, V. S. Kosorukov, V. V. Kushnirov, V. N. Smirnov and M. D. Ter-Avanesyan. Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae (2001) BMC Mol Biol, V.2, P.9.
166. Valente L. and T. G. Kinzy. Yeast as a sensor of factors affecting the accuracy of protein synthesis (2003) Cell Mol Life Sci, V.60, P.2115-30.
167. Valouev I. A., V. V. Kushnirov and M. D. Ter-Avanesyan. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation (2002) Cell Motil Cytoskeleton, V.52, P. 161-73.
168. Vestergaard B., L.B. Van, G.R. Andersen, J. Nyborg, R.H. Buckingham, M. Kjeldgaard. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl (2001) Mol. Cell, V.8, P.1375-1382.
169. Waldron C., B.S. Cox, N. Wills, R.F. Gesteland, P.W. Piper, D. Colby, C. Guthrie. Yeast ochre suppressor SUQ5-0 is an altered tRNAUCASer (1981) Nucl. Acids Res., V.9, P.3077-3088.
170. Wang W., K. Czaplinski, Y. Rao and S. W. Peltz. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts (2001) EMBO J, V.20, P.880-90.
171. Weiss W.A., I. Edelman, M.R. Culbertson, E.C. Friedberg. Physiological levels of normal tRNA(CAGGln) can effect partial suppression of amber mutations in the yeast S. cerevisiae (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.84,P.8031-8034.
172. Wells S. E., P. E. Hillner, R. D. Vale and A. B. Sachs. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors (1998) Mol Cell, V.2, P.135-40.
173. Weng Y., K. Czaplinski and S. W. Peltz. Identification and characterization of mutations in the UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not mRNA turnover (1996 a) Mol Cell Biol, V.16, P.5491-506.
174. Weng Y., K. Czaplinski and S. W. Peltz. Genetic and biochemical characterization of mutations in the ATPase and helicase regions of the Upfl protein (1996 6) Mol Cell Biol, V.16, P.5477-90.
175. Wickner R. B., D. C. Masison and H. K. Edskes. PSI. and [URE3] as yeast prions (1995) Yeast, V.l 1, P.1671-85.
176. Wilson P. G. and M. R. Culbertson. SUFI2 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors (1988) J Mol Biol, V.199, P.559-73.
177. Woods A., T. Sherwin, R. Sasse, T. H. MacRae, A. J. Baines and K. Gull. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies (1989) J Cell Sci, V.93 ( Pt 3), P.491-500.
178. Zavialov A.V., R.H. Buckingham, M. Ehrenberg. A post-termination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide factor RF3 (2001) Cell, V.107, P.l 15-124.
179. Zhang S., M. J. Ruiz-Echevarria, Y. Quan and S. W. Peltz. Identification and characterization of a sequence motif involved in nonsense-mediated mRNA decay (1995) Mol Cell Biol, V.15, P.2231-44.
180. Zhang S., M. Ryden-Aulin, Isaksson L.A. Functional interaction between release factor one and P-site peptidil-tRNA on the ribosome (1996) J.Mol.Biol., V.261, P.98-107.
181. Zhao J., Hyman L., Moore C. Formation of mRNA 3' Ends in eukaryotes: mecanism, regulation, and Interrelationship with other step in mRNA synthesis (1999) Microbiology and Molecular biology Reviews, June, P.405-445.
182. Zhou P., I. L. Derkatch, S. M. Uptain, M. M. Patino, S. Lindquist and S. W. Liebman. The yeast non-Mendelian factor ETA+\ is a variant of [P57+., a prion-like form of release factor eRF3 (1999) EMBO J, V.18, P. 1182-91.
-
Шабельская, Светлана Васильевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2005
-
ВАК 03.00.15
- Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора [psi+]
- Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyses cerevisiae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора (psi+)
- Взаимодействие омнипотентных супрессоров SUP35 и SUP45 с цитоплазматическими детерминантами у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Новый прионоподобный детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции
