Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Петрова, Александра Владиленовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи 005002251

ПЕТРОВА Александра Владиленовна

Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей ЗассИаготусех сегехгйае

Специальность 03.02.07 - генетика

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

005002251

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедре генетики и селекции, в лаборатории физиологической генетики.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Галина Анатольевна Журавлева кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Владимир Геннадиевич Королев, зав. отделением молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова

кандидат оиоьогичгских наук Ольга Всево.юдовна Невзглядова ст.н.с. группы генетики митоза Института цитологии РАН

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Пушкин

Защита диссертации состоится Ло// в на заседании

совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9. Санкт-Петербургский государственный университет кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-

Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан Л 8 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

. ----^"П Д-б.н. Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.. Многочисленные исследования процесса терминации трансляции и участвующих в нем белковых факторов, проведенные на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, показали плейотропность проявления мутаций в генах, кодирующих факторы терминации трансляции eRFl и eRF3. У дрожжей S. cerevisiae эти факторы кодируются жизненно важными генами SUP45 и SUP35 (Breining and Piepersberg, 1986; Kushnirov et al., 1988). Мутации в этих генах приводят к считыванию стоп-кодонов как значащих, или омнипотентной нонсенс-супрессии. Мутанты sup45 и sup35 могут также проявлять температуро- и осмочувствителышсть, полную или частичную дыхательную некомпетентность, чувствительность к беномилу и аминогликозидным антибиотикам (Inge-Vechtomov et ah, 2003). В большинстве случаен неизвестно, являются ли эти плейотропные эффекты прямым ' следствием нарушения терминации трансляции, или опосредованы участием белков Sup45 H.Sup35 в клеточных процессах, не связанных непосредственно с термннацией трансляции. Получено множество данных о взаимодействии дрожжевых факторов, терминации трансляции с компонентами различных клеточных структур,. в том числе с системой деградации мРНК с преждевременным стоп-кодоном NMD (Chabelskaya et al., 2007), системой экспорта мРНК из ядра (Gross et al., 2007; Böiger et al., 2008), а также актиновым (Bailleul et al., 1999) и тубулиновым цитоскелетом. Так, недостаток белка Sup35 вызывает дефекты веретена деления, а белок Sup45 прямо взаимодействует с белком Miel, представляющим собой легкую цепь миозина (Valouev et al., 2002, 2004).

У дрожжей S. cerevisiae переход от дрожжевого типа роста к мицелиальному (филаментозному) является ответом на изменение состава среды и сопровождается физиологическими и морфологическими изменениями. При переходе к псевдогифалыюму (у диплоидов) и инвазивному (у гаплоидов) росту происходит изменение характера почкования клеток и врастание колонии в субстрат. Переход к псевдогифалыюму .росту у диплоидов индуцируется в условиях недостатка источника азота при наличии доступного источника углерода и характеризуется образованием ветвящихся цепочек клеток удлиненной формы, или псевдогиф. Внешний сигнал, природа которого в настоящее время неизвестна, запускает сигнальньш каскад, активирующий экспрессию генов семейства FLO. Гены FLO кодируют гликопротеины клеточной стенки, необходимые для межклеточных контактов и адгезии к субстрату. Ген FLOU (MUС!) играет ключевую роль в регуляции псевдогифшгьного роста у диплоидных и инвазивного роста у гаплоидных штаммов (Lambrechts et al., 1996). Его промотор является одним из самых протяженных в геноме дрожжей S. cerevisiae и содержит большое количество сайтов связывания транскрипционных факторов, что отражает многообразие регуляторных механизмов, определяющих форму роста дрожжёй в зависимости от условий внешней среды. В Лаборатории , физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ была получена коллекция мутантных аллелей sup45 (Москаленко и др., 2004), способных поддерживать жизнеспособность штамма в отсутствие аллели гена SUP45 дикого типа. В дальнейшем было обнаружено, что диплоидные штаммы дрожжей, несущие как нонсенс, так и миссенс-аллели sup45 в гомозиготе или гемизиготе, теряют способность к псевдогифальному росту.

Целыо работы являлось изучение новых плейотропных эффектов мутаций в генах SUP45 и SUP35. Задачи исследования:

1. Изучение влияния мутаций в гене SUP45 на псевдогифальный рост диплоидных штаммов и инвазивный рост гаплоидных штаммов дрожжей.

2. Анализ экспрессии гена FLO 11 и других генов, связанных с регуляцией псевдогифального роста в штаммах, мутантных по гену SUP45.

3. Выявление и анализ новых проявлений мутаций в гене SUP45, связанных с нарушением псевдогифального роста.

4. Изучение влияния мутаций в гене SUP35 на псевдогифальный и инвазивный рост.

Научная новизна исследования. Показано, что мутантные аллели гена SUP45, проявляющиеся как сильные супрессоры, приводят к нарушению псевдогифального роста у диплоидных штаммов дрожжей, имеющих различный генотипический фон. Мутации, повышающие эффективность терминации трансляции, а также мутации, приводящие к нарушению фосфорилирования белка Sup45, не влияют на способность дрожжей к псевдогифальному росту. Показано, что к изменению характера почкования приводит присутствие любой из изученных в данной работе мутантных аллелей, при этом эффект менее выражен на фоне аллелей, в меньшей степени затрагивающих эффективность терминации трансляции. Показано, что нонсенс-супрессорные мутации sup45 приводят к снижению стабильности хромосом и потере гетерозиготности по локусу типа спаривания. Впервые количественно оценена частота потери III хромосомы в присутствии аллели sup45-¡02. Также впервые показано, что нонсенс-супрессорные аллели sup45 нарушают способность гаплоидных штаммов к инвазивному росту.

Практическая ценность работы. Псевдогифальный и инвазивный рост у дрожжей находятся под контролем одних и тех же регуляторных путей и являются ответной реакцией на изменение условий окружающей среды. До настоящего времени не было данных о взаимодействии компонентов терминационного комплекса с белками семейства Flo, обеспечивающими способность к псевдогифальному росту, или с белками, отвечающими за регуляцию экспрессии генов, кодирующих поверхностные адгезины клетки. Способность к псевдогифальному и гифальному росту является основой патогенности дрожжей рода Candida, и выявление новых регуляторных механизмов может способствовать созданию антимикозных препаратов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V съезде ВОГиС (Москва, 2009); Международной школе-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 2007); на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005); на II международной конференции «Происхождение биосферы и эволюция» (Греция, Лутраки, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 176 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (185 наименований). Работа содержит 15 таблиц и 35 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей 5. сегеушае, использованных в работе, указаны в таблице 1. В работе использованы штаммы различного происхождения. Часть получена при скрещивании штаммов Петергофских генетических линий с производными штамма 8288С. Для детальной характеристики псевдогифального роста использовали штаммы с генотипическим фоном £1278Ь (Табл.1).

Таблица 1. Основные штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе.

Штамм Генотип штамма Происхождение штамма

1Б-Д1606 МАТа adel-14 his7-l 1еи2-3,112 ura3-52 trpl-289 Iys9-A21 Moskalcnko et al., 2003

1А-Д1628 МАТа adel-14 Ius3 Ieu2 ura3 trpl lys2 SUP45::HIS3 [pRS315/SUP451 (tpRS316/SUP451)

1Б-Д1628 MA Tu adel-14 his3 1еи2 ura3 trpl Ïys2 SUP45::HIS3 [pRS315/SUP45] ([pRS316/SUP45]) C.E. Москаленко, неопубликовано

Д1631 МАТЫМАТа. adel-14//adel-14 his3//his3 Ieu2//leu2 ura3// игаЗ trpl//trpl Iys2//lys2 SUP45::H1S3//SUP45::HIS3 [pRS315/SUP45] ([pRS316/SUP45]) Журавлева, Петрова, 2010

9А-Д1641 Kl A Ta ura3-52 his3::hisG leu2::hisG SUP45::H1S3 [pRS315/SUP45] C.B. Шабельская, неопубликовано, получены на штаммах генотипическим фоном £ 1278b (Guo et al., 2000)

Д1643 MATalMATa ura3-52//ura3-52 his3::hisG//his3::hisG leu2::hisG//leu2::hisG trpI::hisG//TRPl SUP45. . HIS3// SUP45::H1S3 [pRS315/SUP45] ([pRS316/SUP45])

8А-Д1640 MATa ura3-52 his3::hisG leu2::hisG SUP35::HIS3 [pRSUl 1 (fpRSU2])

Д1642 MATa!MATa ura3-52//ura3-52 his3::hisG//his3::hisG leu2::hisG//leu2::hisG trpl::hisG//TRP! SUP35::HIS3// SUP35::H1S3 fpRSUll ([pRSU2D

Д926 MATa/MATa ura3A//ura3A leu2A//leu2A lys2A//lys2A his4A//his4A thr4A//thr4A adel//ADEl Степченкова и др., 2009

2Г-П2345 MATa his5 ПГЛ

78А-П2345 МАТа his5 ПГЛ

Плазмиды. В работе использованы плазмиды, сконструированные на основе pRS315 и pRS316 и несущие аллель гена SUP45 дикого типа или мутантные аллели sup45 (Табл. 2). Плазмиды pRSUl и pRSU2, полученные на основе центромерных векторов pRS315 и pRS316, содержат аллель дикого типа гена SUP35 под собственным промотором (Volkov et al. 2002). Производные плазмиды pRSUl, несущие мутантные аллели гена SUP35, получены ранее (Chabelskaya et al. 2004; Cosson et al. 2002). Мутантные аллели гена SUP35 и конструкции на основе гомологичных ему генов mGSPTMus musculus представлены в таблице 3. Плазмиды на основе вектора pFL44L, несущие антисупрессорные мутантные аллели гена SUP45, описаны ранее (Hatin et al. 2009). Плазмиды серии pDB, несущие мутантные аллели sup45, нарушающие фосфорилирование белка Sup45, являются производными вектора pRS315 и описаны ранее (Kallmeyer et al. 2006). Также использовали мультикопийную плазмиду pYX242 и серию плазмид, созданных на её основе (Le Goff et al. 2002). Плазмида BHUM0668 является производным мультикопийного вектора YEplacl95 и содержит ген FLOI1 под собственным промотором (предоставлена H.-U. Moesch).

Таблица 2. Мутантные аллели гена БЦР45, использованные в работе.

Мутантная аллель Замена аминокислотного остатка Вектор Происхождение

зир45-101 С1и266—> ТАА рЯ8315, рЯ8316 Мовка1епко е/ а1., 2003

яир45-102 Туг53—> ТАА —//—

яир45-104 Ьеи283—» ТАА —//—

$ир45-105 01и385—»ТАА —II —

$ир45-107 Ьеи317—> ТвА —II —

$ир45-103 Ьеи21—*8ег —II — Москаленко и др., 2004

йир45-113 Ме148—»Не —II —

А2 аиЗбО—Уа1 рРЬ44Ь Найп е1 а!., 2009

А8 01и104—»Ьуэ —// —

В1 01п76->А^ —II —

С6 ®п76-»Ьу8 —II —

СИ Азп58—>Ьув —II —

842Ш/8432Б 8ег421—»Авр, 8ег432—»Абр рБВ858 КаПшеуег е! а1., 200(

8421А/8432А 8ег421 —>А1а, 8ег432—>А1а рОВ902

Таблица 3. Мутантные аллели гена БС1Р35 и его гомологи, использованные в работе._

Мутантная аллель/ Название гомолога Замена аминокислотного остатка Вектор Происхождение

яир35-21 С1п422—► ТАА рЯЯШ Соббоп е1 а!., 2002

яирЗ 5-228 Аг§372—>Ьув —II — Шабельская, 2005

шС8РТ2 — рУХ242

СшС8РТ1 — —// —

Сш08РТ2 — —II —

№п08РТ1- —II —

СшС8РТ2 Ье воГГе/ а1., 2002

№п08РТ2- —II —

СшС8РТ1

МтС8РТ1-С-ЯУР55 — —II —

МтС8РТ2-С-5,£//>55 — —И —

Методы. Для индукции псевдогифального роста диплоидные штаммы клонировали на твердой среде 8ЪАО с низким содержанием источника азота (С1тепо е! а/., 1992) или высевали клеточную суспензию из расчета 100-300 колоний на чашку. Штаммы инкубировали в течение 5 дней при 30°С, после чего анализировали наличие псевдогиф под микроскопом.

Анализ способности штаммов к инвазивному росту проводили следующим образом. Гаплоидные штаммы, несущие различные аллели генов 811Р45 и БиР35, высевали на полную среду УАРО и инкубировали в течение 5 дней при 30°С. Чашки с выросшими культурами фотографировали, после чего смывали клетки под несильным напором воды. Чашкам давали подсохнуть, после чего фотографировали

повторно (Roberts and Fink 1994). Культуры, не смывающиеся водой, считали способными к инвазивному росту, неполное смывание культуры рассматривали как частичное нарушение способности к инвазивному росту, полностью смывающиеся культуры считали неинвазивными.

Для анализа характера почкования штаммы, окрашенные калькофлуором, исследовали микроскопически с использованием системы Zeiss Axiolab. В анализируемых культурах выделяли три типа почкования: униполярное, при котором каждая следующая почка образуется непосредственно рядом с предыдущей; биполярное, при котором следующая почка образуется на противоположном полюсе клетки; случайное, при котором сайты почкования распределены по всей поверхности клетки. В анализ брали клетки, имеющие не менее 4-х родовых шрамов. Для каждого штамма учитывали не менее 200 клеток.

Количественный тест на индукцию незаконной гибридизации проводили, как описано ранее (Репневская и др., 1989). Частоту незаконной гибридизации у штамма 1Б-Д1606, несущего мутантную аллель sup45-102 либо аллель SUP45 дикого типа, определяли при помощи скрещивания с контрольным штаммом Д926 и отбора незаконных гибридов на селективной среде. Частоту незаконной гибридизации вычисляли по формуле F=(M-a)/(N-b), где M - число колоний, выросших на селективной среде, N — число колоний, выросших на полной среде, а и b - соответствующие факторы разведения. Для каждого тестируемого штамма использовали шесть независимых культур. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. При определении частоты гибридизации использовали стандартные методы вычисления медиан и доверительных интервалов для медиан (Глотов et al. 1982). Достоверность различий между значениями частоты гибридизации на фоне различных аллелей гена SUP45 определяли с помощью непараметрического критерия Уайта при Р=0,05 и числе наблюдений, равном 6.

Для определения МАТ-статуса штаммов с помощью ПЦР использовали систему из трех олигонуклеотидов и протокол, описанные ранее (Huxley et al. 1990). В качестве матрицы использовали геномную ДНК анализируемого штамма. Продукт размером 544 п.о. соответствует типу спаривания МАТа, продукт размером 404 п.о. соответствует типу спаривания МАТа, и оба продукта образуются в случае штамма типа спаривания MATaJMATa.

Анализ экспрессии генов FLOU, GLN3 и GPI1 проводили с использованием термоциклера MiniOpticon и набора для ПЦР в реальном времени iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Нормализованное соотношение уровня экспрессии генов в штаммах с мутантными аллелями svp45 и в штамме дикого типа вычисляли по методу Ливака (Livak and Schmittgen, 2001). ПЦР, выделение ДНК, электрофорез в агарозном геле, дрожжевую и бактериальную трансформацию проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989; Gietz et al., 1992; Kaiser et al., 1994). CHEF-электрофорез проводили согласно методике, опубликованной ранее (Narayanan et al. 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Мутации в гене SUP45 приводят к нарушению псевдогифального роста у диплоидных штаммов дрожжей. Одним из основных регуляторов экспрессии гена FLOll является транскрипционный фактор Flo8. Многие лабораторные штаммы, включая штамм с секвенированным геномом S288C, содержат нонсенс-мутацию в

гене FL08, что приводит к отсутствию экспрессии гена FLO 11 (Liu et al., 1996). Поэтому на первом этапе работы секвенировали часть гена FL08 из используемых в работе штаммов. Анализ показал, что штаммы не содержат мутации и поэтому могут быть использованы для изучения псевдогифального роста.

В работе использовали штаммы с дизрупцией гена SUP45 на хромосоме, несущие компенсирующую плазмиду с аллелью гена SUP45. Как нонсенс, так и миссенс-аллели sup45 характеризуются нарушением псевдогифального роста (Рис.1 А).

А _ Süll-Ii-КС тр45-103 ÜUPJ> (ножснО {мжленс}

Ж ЖлННкмИ • ДЯЙЬ

Б SUNV Я» SUP45 4HST1 тр4102 .яг,»-М- Ш

• • ##

Рисунок 1. Мутантные аллели зир45 в гемизиготном состоянии приводят к нарушению псевдогифального роста. А - рост штамма Д1631, несущего только мутантную аллель яир45, на среде 8ЬАО. Б - рост штамма Д1631, несущего мутантную аллель ,чир45 в гетерозиготном состоянии, на среде 81.АО.

Для того, чтобы определить, является ли эффект нарушения псевдогифального роста доминантным или рецессивным, диплоидные штаммы, содержащие одновременно плазмиду с аллелью гена SUP45 дикого типа и плазмиду с мутантной аллелью, выращивали на среде SLAD для анализа способности к псевдогифальному росту. В присутствии аллели дикого типа штаммы сохраняют способность к псевдогифальному росту (Рис.1 Б). Таким образом, наблюдаемый фенотип является рецессивным.

Замещение аллели SUP45 дикого типа на мутантные аллели sup45 в диплоидном штамме приводит к изменению типа спаривания. Одним из необходимых условий образования псевдогиф является гетерозиготность штамма по типу спаривания. Потеря одного из гомологов III хромосомы, на которой находится локус МАТ, митотическая рекомбинация, инактивация по тем или иным причинам одной из функциональных аллелей локуса МА Т приводит к изменению типа спаривания штамма и нарушению его способности к псевдогифальному росту. Для проверки гетерозиготное™ диплоидов, содержащих мутантные аллели sup45, по локусу МАТ, анализировали тип спаривания производных штамма Д1631 после замещения аллели SUP45 дикого типа на мутантную аллель на среде, содержащей 5-ФОК (Рис.2А). Оказалось, что все клоны, полученные при замещении аллели дикого типа на какую-либо из понсенс-аллслей, использованных в работе, скрещивались с тестером на тип спаривания МА Та. Среди клонов, полученных при замещении на миссенс-аллели, встречались как скрещивающиеся с тестерами, так и сохранившие тип спаривания МА Та/МА Та.

I la следующем этапе провели аналогичный эксперимент на штамме, содержащем мутантные аллели sup45 на хромосоме. Для этого эксперимента были выбраны нонсенс-аллели sup45-102, 105 и 107 и миссенс-аллель sup45-103. После скрещивания со штаммом, несущим дизрупцию гена SUP45 и аллель дикого типа на плазмиде, полученный диплоид пассировали на среде с 5-ФОК для изгнания плазмиды с аллелью SUP45 дикого типа. У полученных при замещении клонов проверяли тип спаривания. Показано, что в том случае, когда мутантные аллели sup45 содержатся на хромосоме, потеря аллели дикого типа также приводит к изменению типа спаривания у штаммов с мутантной аллелью.

А Тестернме штаммы a a a a о. a а a Б Теетерные шгзммы и ¡i с/ a а a а a

.S7 7V?

illlill:?! ' :lll mp45-¡01

s«p45-¡02 Я ш

flIlÉIP sup4?-104

тр45-10.Ч

<тр45-10~

sup45-J0}

ВПИКА snp45-UÍ

Рисунок 2. Замещение аллели гена Б11Р45 дикого типа на мутантные аллели яир45 в диплоидном штамме приводит к изменению типа спаривания. А — Штамм Д1631, ПГЛ. Б - Штамм Д1643, изогенный 21278Ь.

Аналогичный эксперимент провели на штаммах с генотипическим фоном Х1278Ь, имеющих независимое происхождение. Штамм Д1643 получен при скрещивании двух штаммов с дизрупцией гена Я1>1'45, несущих на плазмиде либо аллель дикого типа, либо мутантную аллель. Эксперимент показал, что изменение типа спаривания после потери аллели дикого типа не является штаммоспецифичным и характерно для штаммов с разным генотипическим фоном (Рис.2Б).

Для того, чтобы определить, на каком этапе происходит изменение типа спаривания у диплоидов, проанализировали тип спаривания у диплоидных штаммов до замещения, когда штаммы содержали как мутантную аллель, так и аллель дикого типа. Мы обнаружили, что до замещения штаммы сохраняют тип спаривания а/а, то есть изменение типа спаривания происходит либо во время, либо после потери плазмиды с аллелью БиР45 дикого типа. Для проверки обратимости изменения типа спаривания трансформировали полученные при замещении клоны с изменившимся типом спаривания плазмидой с аллелью гена БиР45 дикого типа. У трансформантов случайным образом на полной среде теряли либо плазмиду с

аллелью дикого типа, либо плазмиду с мутантной аллелью, и анализировали полученные клоны. Мы показали, что независимо от того, какую аллель содержат анализируемые клоны, они сохраняют тип спаривания, демонстрируемый до трансформации плазмидой с аллелью гена SUP45 дикого типа.

Для проверки предположения о потере одного из гомологов III хромосомы или ее плеча использовали подход, позволяющий определить МАТ-статус штамма при помощи ПЦР. Для анализа использовали геномную ДНК из клонов с изменившимся и не изменившимся типом спаривания. Во всех случаях, когда тип спаривания изменился после замещения, в результате ПЦР образовывался только один продукт, характерный для типа спаривания а (Рис.3). Эти результаты могут свидетельствовать о том, что при замещении плазмид происходит потеря одного из гомологов III хромосомы или ее правого плеча. Аналогичные результаты получены для производных штамма ХЛ 278Ь.

if* iP <Р - 1 1 iV"

<¡¡8 «а«? «, # ЛФ 4х А* я

# # ^ / / /

N f.....J™, г,,л...... .........1............f........., .......„А_, Ч^ \V"\V

Ш ц10(10 ¥

iÜ mk Ä Ml Й» 1Ш 'iil ||| ||| Щ ~ ' ' ' " ! '' '''

• шммм^МаАмММвЯя " 4мьР(А/лг«)

Рисунок 3. Изменение типа спаривания у диплоидов обусловлено потерей гетерозиготности по локусу МАТ. Продукт 404 Ьр соответствует типу спаривания МАТа, продукт 544 Ьр соответствует типу спаривания МЛ7а, присутствие обоих продуктов на гель-электрофорезе соответствует типу спаривания МАТа!МАТа. 1-8 -штамм Д1631. 1 -р!Ш16/8иР45 р1Ш 15/8ЦР45; 2 - рК8316/8ЦР45 рЯ8315/зир45-102; 3-рЯ8316/8иР45 рЯ8315/8ир45-105; 4 - рЯ8316/йиР45 рК8315/зир45-103; 5 -рЯ8315/8ЦР45 (первая дорожка - тип спаривания изменился, вторая дорожка - тип спаривания изменился); 6 — рИЗЗ 15/зир45-102; 7 - рК8315/зир45-105; 8 -рК8315/зир45-103.

Во всех предыдущих экспериментах потерю гетерозиготности по локусу МАТ выявляли на диплоидных штаммах. Можно предположить, что события, приводящие к потере гетерозиготности, можно выявить еще на этапе гаплоидных штаммов, несущих только мутантную аллель яир45. Чтобы проверить это предположение и оценить характер и частоту событий, приводящих к изменению типа спаривания, мы провели тест на незаконное скрещивание для штамма, несущего мутантную аллель зир45-102, и штамма дикого типа. В данном тесте опытный штамм скрещивается со специально сконструированным штаммом Д926 с МАТ-статусом а/а. При этом гибриды могут образовываться только при изменении МАТ-статуса опытного штамма, а анализ фенотипа незаконных гибридов позволяет определить характер событий, приводящих к этому изменению (Степченкова и др., 2009). В штамме дикого типа частота возникновения незаконных гибридов

- и -

составила 6,2-6,5х10"7, в то время как в мутантном штамме - 5,4x10"6, то есть в ~8 раз выше. При этом у него значительно повышена частота потери III хромосомы по сравнению с другими классами событий (Табл. 4).

Таблица 4: Доля классов незаконных гибридов у гаплоидного штамма 1Б-Д1606, несущего либо аллель гена БЦР45 дикого типа, либо мутантную аллель яир45-Ю2.

Аллель гена SUP45 . События, приводящие к незаконной гибридизации, % Общее количество проанализи рованных гибридов

Потеря хромосомы III Потеря правого плеча хромосомы III Рекомбинац ия HMR и МАТ Мутации и предмут. События

SUP45 60,2% 7,1% 9,2% 23,5% 215

sup45-102 87,9% 2,4% 2,4% 7,3% 290

Таким образом, мы показали, что на фоне мутантной аллели snp45-102, характеризующейся сниженным количеством полноразмерного белка Sup45, происходит повышение частоты потери III хромосомы. Полученные результаты говорят в пользу предположения, что причиной потери гетерозиготности по локусу МАТ у диплоидных штаммов, несущих сильные супрессорные аллели sup45, является потеря одного из гомологов III хромосомы.

Оценка наличия хромосомных перестроек в штамме Д1631, несущем мутантные аллели sup45, с помощью СНЕГ-электрофореза. Для проверки предположения о пониженной стабильности хромосом на фоне мутантных аллелей sup45, использовали метод пульс-электрофореза, позволяющий разделять хромосомы дрожжей. Поскольку накопление модификаций, приводящих к снижению стабильности хромосом, может происходить еще на стадии гаплоида, в первом эксперименте проверили наличие хромосомных перестроек у родительских штаммов 1А-Д1628 и 1Б-Д1628, несущих мутантные аллели sup45-102, sup45-105 и sup45-103 (Рис. 4А). Выявлено различие по размеру II и III хромосом в штаммах 1А-Д1628 и 1Б-Д1628, имеющих общее происхождение. Также наблюдали изменение размеров некоторых хромосом в клонах с мутантными аллелями sup45 по сравнению с клонами дикого типа.

Для того, чтобы проверить, обусловлено ли изменение размера некоторых хромосом замещением аллели дикого типа на среде с 5-ФОК, или накопление хромосомных перестроек происходит и при последующем росте штамма, пассировали по 3 клона (включая 2 клона, использованных в предыдущем эксперименте) на полной среде YPD, после чего снова анализировали размер хромосом (Рис. 4Б). Для всех проанализированных аллелей sup45 оказалось характерно появление хромосомных перестроек после замещения аллели дикого типа, а нонсенс-мутантные аллели также приводят к накоплению хромосомных перестроек при дальнейшем росте штамма (хромосомы с изменившимся размером указаны белыми стрелками).

В следующем эксперименте использовали производные диплоидного штамма Д1631, несущие мутантные аллели sup45-102, sup45-105 и sup45-103, для которых было показано изменение типа спаривания с МАТа/МАТа на МАТа или МАТа после

замещения аллели дикого типа. Для получения этих штаммов родительские штаммы скрещивали таким образом, что в первом случае плазмида pRS316/SUP45 содержалась в штамме 1Б-Д1628, а во втором — в штамме 1А-Д1628. Результаты пульс-фореза указывают на отсутствие одного из гомологов III хромосомы, причем

Рисунок 4. CHEF-электрофорез хромосомного материала производных диплоидного штамма Д1631, несущих различные аллели гена SUP45. Римские цифры в левой части рисунка соответствуют номерам хромосом дрожжей S. cerevisiae. Рамкой указано положение хромосомы III, отсутствующей у штаммов с мутантными аллелями sup45\ белыми стрелками указаны некоторые хромосомы, для которых характерно варьирование по размеру. 1 - маркерный штамм, 2 -pRS316/SUP45 pRS315/SUP45, 3-5 - pRS315/SUP45; 6-7, 11-12 - pRS316/SUP45 pRS315/sup45-l02, 8-Ю, 13-15 - pRS315/sup45-102; 16-17, 21-22 - pRS316/SUP45 pRS315/sup45-103, 18-20, 23-25 - pRS315/sup45-103; 26-27, 31-32 - pRS316/SUP45 pRS315/sup45-l05, 28-30, 33-35-pRS315/sup45-105.

XV. VII

XIII, XVI ¡1

XIV

V,VIII

1 i 3 4 5 67 8 9 10 1112131415 läPISiäiO M22 23 24 25 ¡6 2? & » 30 31 32 }3 34 35

Аллель ка t

Ш1а>п!йе ^ oi'P4? l

|)RS315

suptf-102

mp-15-10

sup45-105

происходила хромосомная перестройка (потеря) строго того гомолога, который исходно находился в штамме, несущем плазмиду pRS316/SUP45 (Рис.5). В том же эксперименте наблюдали потерю II хромосомы. Таким образом, мы показали, что замещение аллели гена SUP45 дикого типа на мутантную аллель приводит к нестабильности но крайней мере двух хромосом - II и III. Причиной подобного явления может быть нарушение работы микротрубочек при копуляции и/или митозе, обусловленное присутствием мутантной аллели sup45 и приводящее к неравномерному распределению хромосомного материала. Как и в гаплоидных штаммах, на фоне мутантных аллелей sup45-102 и sup45-105 наблюдали изменение

размера некоторых хромосом. Эти данные свидетельствуют о нарушении стабильности генома в условиях снижения эффективности терминации трансляции.

Рисунок 5. CHEF-электрофорез хромосомного материала производных гаплоидных штаммов 1А-Д1628 и 1Б-Д1628, несущих различные аллели гена SUP45. Римские цифры в левой части рисунка соответствуют номерам хромосом дрожжей S. cerevisiae. Белыми стрелками указаны некоторые хромосомы, для которых характерно варьирование по размеру. А - электрофорез хромосомного материала штаммов непосредственно после замещения плазмиды pRS316/SUP45. 1 - маркерный штамм; 2-3, 10-11 - SUP45; 4-5, 12-13 - sup45-102; 6-7, 14-15 - sup45-103; 8-9, 16-17 - sup45-105. Б - электрофорез хромосомного материала штаммов после 15-ти пассажей на полной среде YPD. 1 - маркерный штамм; 2-4, 14-16 -SUP45; 5-7, 17-19- sup45-l02; 8-10, 20-22 - sup45-103; 11 -13, 23-25 - sup45-l05.

Дефицит источника азота в среде вызывает усиление экспрессии гена FLO 11 в штаммах, несущих мутантные аллели sup45. Для того, чтобы оценить изменения экспрессии генов, которые могут происходить на фоне мутангных аллелей sup45, предприняли транскрипционный анализ штамма Д1631, несущего аллель sup45-l03. На основании данных транскриптомного анализа были выбраны 3 гена для последующей более детальной оценки экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени. Повышение экспрессии генов FLOU и GLN3 указывает на голодание штамма по азоту, а изменение экспрессии гена G/Y/, выявленное в транскриптомном анализе, может оказывать влияние на функционирование белка Floll. Анализ показал, что экспрессия генов GLN3 и GP11 не изменяется в штаммах, несущих мутантные аллели snp45, по сравнению со штаммом дикого типа, а экспрессия гена FLOU повышается ~ в 1,3 раза в штамме с аллелью sup45-102 и ~ в 3 раза в штамме с мутантной аллелью sup45-103 (Табл. 5).

Таблица 5. Анализ экспрессии генов FLOU, GLN3 и GPII в условиях дефицита азота в производных штамма Д1631, несущих мутантные аллели sup45._

Аллель гена SUP45 Соотношение экспрессии гена в штамме с мутантной аллелью и штамме дикого типа

FLOU GLN3 GPI1

sup45-102 1,27±0,085 0,96±0,046 0,94±0,108

sup45-103 2,95±0,326 1,03±0,042 1,15±0,075

Примечание: приведенные цифры отражают изменение экспрессии соответствующих генов в штаммах с мутантными аллелями sup45 относительно штамма дикого типа.

Таким образом, нарушение псевдогифального роста у мутантов по гену SUP45 не связано со снижением или отсутствием экспрессии генов FLOll, GLN3 и GPI1.

Мутации в гене SUP45 нарушают способность к инвазивному росту у гаплоидных штаммов. FLOU является ключевым геном, ответственным за псевдогифальный рост у диплоидов и инвазивный рост у гаплоидов. Каскады, запускающие псевдогифальный и инвазивный рост, в значительной степени перекрываются, для инвазивного роста также характерны изменение характера почкования и поляризация клетки. Можно ожидать, что у мутантов по гену SUP45 также нарушен инвазивный рост, характерный для гаплоидов. Мы показали, что штаммы ПГЛ (по крайней мере, используемые в данной работе) не способны к инвазивному росту независимо от того, какая аллель гена SUP45 присутствует в штамме. Поэтому для проверки влияния некоторых мутантных аллелей sup45 на инвазивный рост использовали гаплоидный штамм 9А-Д1641 с генотипическим фоном 21278b. Мы показали, что все используемые в работе аллели в большей или меньшей степени снижают способность к инвазивному росту (Рис. 6).

Рисунок 6. Анализ способности к инвазивному росту штамма 9А-Д1641, несущего различные аллели гена 5'\JP45.

При этом оказалось возможным частично скомпенсировать наблюдаемый эффект сверхэкспрессией гена FLOU на фоне мутантной аллели sup45-l02, но не аллелей sup45-104 и sup45-1053-m различия, по-видимому, обусловлены разным количеством белка Sup45 и уровнем нонсенс-супрессии на фоне различных мутантных аллелей sup45. Таким образом, нарушения, связанные с изменением

типа роста у дрожжей в присутствии мутантной аллели snp45, опосредованы общим механизмом, предполагающим нормальное функционирование продукта гена FLOU.

Мутации в гене SUP45 приводят к изменению характера почкования у диплоидных и гаплоидных штаммов. При переходе к псевдогифальному росту происходит изменение характера почкования, клетки становятся вытянутыми и образуют цепочки. В норме для гаплоидов характерен униполярный тип почкования, а для диплоидов - биполярный. Основываясь на предположении, что нарушение псевдогифального роста у мутантов по гену SUP45 может быть связано с изменением распределения сайтов почкования, мы проанализировали характер почкования у диплоидных штаммов, несущих различные мутантные аллели sup45 (Рис.7). Полученные результаты свидетельствуют, что в присутствии мутантных аллелей значительно возрастает доля клеток со случайным характером почкования по сравнению со штаммом дикого типа.

Рисунок 7. Анализ характера почкования производных штамма Д1631, несущих мутантные аллели Бир45.

100 90 80 70 60 50 40

; зо 20 10 о

гЗл

m i

^биполярный

□ униполярный

□ случайный

SUP4 5 ÍUP45-102 Sup45-103

Чтобы проверить, является ли этот эффект характерным только для диплоидов, аналогичный анализ провели на гаплоидных штаммах. Эксперимент показал, что у гаплоидов в присутствии мутантных аллелей sир45 также изменяется соотношение типов почкования (Рис.8). По сравнению со штаммом дикого типа, для которого характерен практически исключительно униполярный тип почкования, у штаммов с мутантными аллелями повышается доля клеток со случайным и биполярным почкованием. В наибольшей степени это характерно для аллелей sup45-102, 105 и 103. У штамма, несущего плазмиду с аллелью sup45-105, доля клеток с биполярным характером почкования достигает 18% (1,5% у штамма дикого типа), а у штамма с аллелью snp45-103 доля клеток со случайным характером почкования возрастает до 12% (1,9% у штамма дикого типа).

Проявление изучаемых фенотипических эффектов зависит от тина мутации в гене SUP45. Во всех описанных экспериментах в данной работе проводился анализ мутантных аллелей гена SUP45, являющихся сильными супрессорами. Таким образом, либо количество белка Sup45 в клетках (у нонсенс-мутантов), либо его функция (у миссенс-мутантов) сильно снижены. Мы проверили, будут ли нарушение псевдогифального роста и другие выявленные в данной работе эффекты проявляться на фоне других мутантных аллелей гена SUP45. Для этого использовали мутантные аллели, приводящие к нарушению фосфорилирования

100

<Ы 5 50

411

;

Ш л.

| У

.....................1

- 1 „ 1 . 1 к 1

5иР45 шр45-.101 шр45-102 шр45-105 !ир45-ЮЗ

Рисунок 8. Анализ характера почкования производных штамма 1А-Д1628, несущих мутантные аллели зир45.

белка 8ир45 (кодирующие белок, не способный фосфорштироваться, и гиперфосфорилированный белок), а также ряд миссенс-аллелей, которые повышают эффективность терминации трансляии (Табл.2). Мы показали, что при замещении аллели дикого типа на мутантные аллели, нарушающие фосфорилирование, на среде с 5-ФОК, как и в предыдущих экспериментах, наблюдается потеря гетерозиготности по локусу МАТ. В то же время при случайной потере плазмид на полной среде клоны с изменившимся типом спаривания выявляются с низкой частотой. Поскольку миссенс-аллели, используемые в этом эксперименте, находятся на плазмиде с маркером 11ЯАЗ, замещение ими аллели дикого типа возможно только при потере случайным образом на У РЕ). Тем не менее, в этом случае также выявлялись единичные клоны, потерявшие тип спаривания МАТа/МАТа, причем они могли выявляться как при потере аллели дикого типа, так и мутантной аллели. Клоны, у которых после замещения изменился тип спаривания, были проверены с помощью ПЦР, подтвердившей потерю гетерозиготности по локусу МАТ.

Рисунок 9. Штаммы Д1631 и Д1643, несущие мутантные аллели $ир45, нарушающие характер фосфорилирования белка Бир45, образуют псевдогифы в условиях голодания по азоту.

Также мы проверили, способны ли штаммы, несущие мутантные аллели, не снижающие эффективность терминации трансляции, к псевдогифальному росту. Ни аллели, изменяющие характер фосфорилирования, ни антисупрессорные аллели не приводили к нарушению псевдогифального роста у диплоидов (Рис.9). Анализ характера почкования показал, что исследуемые аллели приводят к повышению доли клеток со случайным типом почкования, хотя и в меньшей степени, чем

аплели, исследуемые на предыдущем этапе работы. Изменение характера почкования у мутантных штаммов, судя по всему, является одним из факторов, снижающих способность к псевдогифальному росту, но не единственной причиной его нарушения.

Изучение влияния мутаций в гене $[1Р35 на способность штаммов к псевдогифальному и инвазивному росту. Белки 8ир45 и БирЗб образуют комплекс в процессе терминации трансляции, их функции тесно связаны. Мутации по этим генам характеризуются сходным фенотипическим проявлением. Можно предположить, что нарушение работы белка Бир35 также будет приводить к нарушению псевдогифального роста и оказывать влияние на характер почкования и стабильность хромосом. Мы провели анализ двух мутантных аллелей гена 511Р35 -$ир35-21 (нонсенс) и .чир35-228 (миссенс). Используя штаммы с генотипическим фоном Е1278Ь, мы показали, что эти мутантные аллели не нарушают инвазивный рост гаплоидных штаммов и псевдогифальный диплоидных штаммов (Рис. 10).

Рисунок 10. Мутантные аллели Бир35 не приводят к нарушению псевдогифального и инвазивного роста у штаммов с генотипическим фоном £1278Ь. А - Рост штамма Д1642, несущего мутантные аллели зир35, на среде ЯЬАО. Б - Инвазивный рост штамма 8А-Д1640, несущего мутантные аллели 8ир35.

пир.)} трзз-21

До смыва После смыва 8А-Д1640

Ё1 ЖГ'ГО-.З.Зб- Щ!>ЗУ2> 1

При замещении аллели гена 5иР35 мутантными аллелями мы также наблюдали у полученных клонов изменение типа спаривания, однако частота появления таких клонов сильно варьировала в разных экспериментах. Можно предположить, что белок 8ир35 играет менее существенную роль в поддержании стабильности хромосом и способности штамма к псевдогифальному росту по сравнению с белком 8ир45.

Ранее в нашей лаборатории были получены плазмиды, содержащие конструкции, гомологичные дрожжевому гену 811Р35. Это гены аНР'П и СБРТ2, кодирующие факторы терминации трансляции еЯРЗ мыши М. тшси1ш, а также химерные гены, созданные на их основе и объединяющие различные домены белков еЯРЗ дрожжей и мыши. В общем случае эти конструкции могут рассматриваться как множественно мутированные аллели гена БиР35. Один из генов, кодирующий белок еИРЗ у мышей, способен компенсировать дизрупцию дрожжевого гена 5иР35. Также это показано для ряда конструкций, созданных на основе генов СБРТ и гена 5иР35 и используемых в данной работе. Мы проанализировали, способны ли 811Р35 поддерживать способность штамма к инвазивному и псевдогифальному росту, а также влияет ли их присутствие на стабильность хромосом. Мы показали, что при замещении гена 8иР35 на гомологичные конструкции не происходит

увеличения частоты потери III хромосомы. Также штаммы, несущие гомологичные конструкции, сохраняют способность к псевдогифальному росту. При этом некоторые из конструкций, а именно химеры NmGSPTl-CmGSPT2, NmGSPT2-CmGSPTl и NmGSPTl-CSUP35, снижают способность штамма к инвазивному росту.

Заключение. На основании полученных дацных можно, сделать вывод, что степень нарушения псевдогифального роста зависит от. типа мутантной аллели sup45 и от уровня наблюдаемой в ее. присутствии нонсенс-супрессии. Мутации в гене SUP45, не снижающие эффективность. терминации . трансляции или повышающие ее, не приводят к нарушению псевдогифального роста, что указывает на зависимость этого процесса от количества функционального белка Sup45 в клетке. Вместе с тем, мутантные аллели sup45, независимо от их природы, приводят к изменению характера почкования, что может быть одной из причин нарушения псевдогифального роста. Мутации в гене SUP35 обладают менее выраженным эффектом, хотя и проявляются аналогичным; образом в изменении характера почкования. Снижение стабильности хромосом на фоне мутаций в генах SUP45 и SUP35, по-видимому, не является непосредственной причиной нарушения псевдогифального роста, но может играть значительную роль за счет изменения дозы каких-либо генов, регулирующих псевдогифальный рост, а также подтверждает важную функцию факторов терминации трансляции в поддержании стабильности генома.

ВЫВОДЫ.,

1. Мутации sup45, снижающие эффективность терминации трансляции, приводят к нарушению псевдогифального роста у динлоидов, гетерозиготных по типу спаривания, в отличие от мутаций, нарушающих фосфорилирование eRFl или повышающих эффективность терминации трансляции.

2. В отсутствие аллели гена SUP45 дикого типа мутантные аллели sup45 приводят к накоплению хромосомных перестроек и потерям хромосом в гаплоидных и диплоидных штаммах с дизрупцией гена SUP45.

3. Потеря гетерозиготности по локусу МАТ у мутантов sup45 обусловлена одним из следующих событий: потерей хромосомы III, потерей правого плеча хромосомы III или транслокацией III хромосомы. ■ ■ .

4. Нарушение псевдогифального роста на фоне мутантных аллелей sup45 не связано со снижением уровня экспрессии гена FL011.

5. Миссенс и нонсенс-мутации sup45 приводят к изменению характера почкования у диплоидных штаммов и нарушению инвазивного роста у гаплоидных штаммов.

6. Мутации sup35 и замещение гена SUP35 S. cerevisiae гомологичными и химерными генами не вызывают нарушения псевдогифального роста.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Журавлева Г.А., Петрова А.В.. Нарушение псевдогифального роста у мутантов по фактору терминации трансляции eRFl дрожжей Saccharomyces cerevisiae!I Доклады Академии Наук. - 2010. - Т.433. - № 5. С. 707-709.

2. Петрова А.В., Дагкесаманская А., Сокол С., Журавлева ГА. Анализ экспрессии генов в штамме, мутантном по жизненно важному гену SUP45, в условиях голодания по азоту// Вестник СПбГУ. Сер. 3. 2009. Вып. 4. С. 105-113.

3. Журавлева Г.А., Землянко О.М., Ле Гофф К., Петрова А.В., Филипп М., Инге-Вечтомов С.Г. Консервативность МС-доменов эукариотического фактора терминации eRF3 // Генетика. - 2007. - Вып. 43(1). С. 1-7.

4. Zhouravleva G., Schepachev V., Petrova A., Tarasov О., Inge-Vechtomov S.. Evolution of translation termination factor eRF3: Is GSPT2 generated by retrotransposition of GSPTl's mRNA? // IUBMB Life. -2006. -V. 58(4). -P.199-202.

5. Петрова A.B., Дагкессаманская А., Сокол С., Журавлева Г.А. Изменение транскрипционного профиля у дрожжей, мутантных по гену SUP45, в условиях дефицита азота. Тезисы докл. V съезда ВОГиС. Москва. 2009. С.77.

6. Petrova А.V., Zhouravleva G.A. Budding pattern analysis of the yeast Saccharomyces cerevisiae strains, carrying mutations in essential SUP45 gene. Abstracts of the international conference -Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", November 9-10, 2009, Saint-Petersburg, Russia.

7. Petrova A., Dagkessamanskaya A., Trouilh L., Labourdette D., Sokol S., Francois J.M., Zhouravleva G.A. Transcriptome analysis of eRFl-mediated nitrogen signaling. Abstracts of the Sixth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. June 22-28,2008, Novosibirsk, Russia. -

8. Петрова A.B., Журавлева Г.А. Нестабильность хромосом у штаммов дрожжей Saccharomyces cerevesiae, несущих мутации в жизненно важном гене SUP45. Тезисы международной конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (К 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева). Санкт-Петербург, 10-13 ноября, 2007, С. 73. "-

9. Zhouravleva GA., Zemlyanko О.М., Petrova A.V. Conservation of the MC Domains in Eukaryotic Release Factor 3. Abstracts of II International conference "Biosphere origin and evolution". October 28 - November 2, 2007, Loutraki, Greece.

10. Zhouravleva G, Tarasov O., Petrova A., Inge-Vechtomov S. Evolution of translation termination factor eRF3. Abstracts of International Workshop. -Biosphere Origin and Evolution". Novosibirsk, Russia. 2005. P. 21.

11. Землянко O.M, Петрова A.B., Тарасов O.B., Журавлева Г.А.. Влияние N-домена eRF3 высших эукариот на способность работы белка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevesiae. Актуальные проблемы генетики. Тезисы научных докладов 2-й научной конференции МОГиС, Москва, 20-21 февраля 2003 г. Стр.78.

Подписано в печать 26.1(1.2011 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ 495

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199048, Санкт-Петербург, В.О., 6-я линия, д. 59 корпус 1, оф. 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Александра Владиленовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Факторы терминации трансляции у дрожжей БасскаготусеБ сегеУ1Я1ае и последствия нарушения их функции.

1.1. Терминация трансляции.

1.1.1. Терминация трансляции у прокариот.

1.1.2. Терминация трансляции у эукариот.

1.2. Факторы терминации трансляции дрожжей Засскаготусез сегеу18гае.

1.2.1. Фактор терминации дрожжей I класса.

1.2.2. Фактор терминации дрожжей II класса.

1.2.3. Взаимодействие факторов еШ71 и еИТ! между собой.

1.2.4. Плейотропные эффекты и взаимодействие факторов еРИ и еКЕЗ с другими белками.

1.2.4.1. Супрессия мутаций сдвига рамки считывания.

1.2.4.2. Взаимодействие с доминантными супрессорами.

1.2.4.3.Взаимодействие с антисупрессорами.

1.2.4.4.Температуро- и осмочувствительность.

1.2.4.5. Влияние мутаций в генах 811Р45 и 811Р35 на митохондриальные функции.

1.2.4.6. Влияние мутаций в генах БиР45 и ££/Р на клеточный цикл.

1.2.4.7. Взаимодействие факторов терминации трансляции с цитоскелетом.

1.2.4.8. Взаимодействие факторов терминации трансляции с другими белками.

1.3. Псевдогифальный рост.

1.3.1. Филаментозный рост у различных видов грибов.

1.3.2. Псевдогифальный рост у дрожжей & сегеугягае.

1.3.2.1.Роль источника азота в индукции псевдогифального роста у дрожжей.

1.3.2.2. Основные пути регуляции псевдогифального и инвазивного роста.

1.3.2.3. Факторы, приводящие к нарушению псевдогифального роста.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы.

2.2. Плазмиды.

2.3. Среды и условия культивирования.

2.4. Генетические методы.

2.4.1. Индукция псевдогифального и инвазивного роста.

2.4.2. Количественный тест на индукцию незаконной гибридизации.

2.5. Молекулярно-генетические и биохимические методы.

2.5.1. ПЦР в реальном времени.

2.5.2. СНЕБ-электрофорез.

2.5.3. Окрашивание культур клеток калькофлуором белым.

2.5.4. Анализ характера почкования.

2.5.5. Транскриптомный анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Диплоидные штаммы, несущие мутантные аллели гена 8иР45, не способны к псевдогифальному росту в условиях голодания по азоту.

3.2. Штамм Д1631 содержит аллель гена ЕЬ08 дикого типа.

3.3. Замещение аллели БиР45 дикого типа на мутантные аллели зир45 в диплоидном штамме.

3.3.1. Замещение плазмиды с геном 311Р45 дикого типа на плазмиды, несущие супрессорные мутантные аллели яир45 в штамме-дизруптанте, приводит к изменению типа спаривания штамма.

3.3.2. Замещение плазмиды с геном БиР45 дикого типа в штамме, несущем супрессорные мутантные аллели Бир45 на хромосоме.

3.3.3. Замещение аллели гена 8иР45 дикого типа на мутантные аллели зир45, не приводящие к повышению уровня нонсенс-супрессии, приводит к изменению типа спаривания в штамме Д1631.

3.4. Диплоидные штаммы, содержащие мутантные аллели

8ир45 в гетерозиготном состоянии, сохраняют тип спаривания МАТа/МАТа.

3.5. Изучение причин изменения типа спаривания у диплоидных штаммов при замещении аллели 51/Р45 дикого на мутантные аллели зир45.

3.5.1. Необратимое изменение типа спаривания у штаммов, гемизиготных по мутациям зир45.

3.5.2. Неслучайность потери одного из гомологов III хромосомы у мутантов Бир45.

3.5.3. Анализ МАТ-статуса диплоидных штаммов с помощью ПЦР.

3.5.4. Штаммы, гемизиготные по мутантным аллелям гена

8иР45, характеризуются потерями хромосом 1-Ш.

3.5.5. Оценка наличия хромосомных перестроек в штамме

Д1631, несущем мутантные аллели $ир45, с помощью пульс-электрофореза.

3.5.6. Оценка характера и частоты событий, приводящих к изменению типа спаривания диплоидов, гемизиготных по мутантным аллелям гена БиР45.

3.6. Анализ влияния повышенного уровня сАМР на способность штаммов, несущих мутантные аллели $ир45, к псевдогифальному росту.

3.7. Анализ экспрессии генов на фоне мутантной аллели 8ир45-103 в условиях недостатка азота.

3.7.1. Гены, экспрессия которых изменилась на фоне обеих аллелей.

3.7.2. Изменение экспрессии генов в штамме с мутантной аллелью sup45-103.

3.7.3. Идентификация генов, экспрессия которых не изменена у мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа.

3.8. Анализ транскрипции генов FLOll, GLN3 и GPI1 в штаммах с мутантными аллелями sup45 в условиях дефицита азота с помощью ПЦР в реальном времени.

3.9. Поиск многокопийных супрессоров, компенсирующих нарушение псевдогифального роста у штаммов, несущих мутантные аллели sup45.

3.10. Мутации в гене SUP45 нарушают способность гаплоидных штаммов к инвазивному росту.

3.11. Анализ характера почкования штаммов, мутантных по гену SUP45.

3.11.1. Изменение характера почкования в диплоидном штамме

Д1631 на фоне мутантных аллелей sup45.

3.11.2. Мутантные аллели sup45 приводят к незначительному изменению характера почкования в гаплоидном штамме 1А-Д1628.

3.11.3. Мутантные аллели sup45, повышающие точность терминации трансляции, приводят к незначительному изменению характера почкования.

3.11.4. Поиск мультикопийных супрессоров, восстанавливающих характер почкования у мутантов sup45-103.

3.12. Изучение влияния мутаций в гене SUP35 на способность штаммов к псевдогифальному и инвазивному росту.

3.12.1. Замещение гена SUP35 на мутантные аллели и гены-гомологи в штамме с генотипическим фоном £1278Ь.

3.12.2. Анализ влияния мутантных аллелей sup35 на тип спаривания диплоидов после замещения аллели дикого типа.

3.12.3. Анализ способности производных штамма D1642 к псевдогифальному росту.Ill

3.12.4. Анализ способности производных штамма D1642 к инвазивному росту.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Основные факторы, влияющие на способность штамма к псевдогифальному росту.

4.2. Повышение хромосомной нестабильности на фоне мутантных аллелей sup45.

4.3. Нарушение псевдогифального роста ассоциировано со нижением точности терминации трансляции.

4.3.1. Накопление аберрантных белков как причина нарушения псевдогифального роста.

4.3.2. Участие белка Sup45 в процессах, регулирующих псевдогифальный рост.

4.4. Влияние на способность к псевдогифальному росту мутантных аллелей гена SUP35 и его гомологов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Трансляция, или синтез белка, является одним из ключевых матричных процессов, идущих в живой клетке. Несмотря на то, что сам по себе процесс синтеза белка изучен достаточно подробно, взаимодействие его компонентов с компонентами других клеточных процессов, а также влияние точности терминации трансляции на жизненно важные функции клетки остается по-прежнему недостаточно охарактеризованным.

Заключительная стадия, или терминация, трансляции исключительно важна для синтеза функциональных белковых молекул. На данном этапе происходит распознавание сигнала окончания синтеза полипептидной цепи и осуществляется процесс освобождения вновь синтезированной белковой молекулы. Участниками терминации трансляции являются мРНК, рибосома и белковые факторы терминации трансляции, обозначенные у эукариотических организмов как еЯЛ и еКРЗ. Многочисленные исследования процесса терминации трансляции и участвующих в нем белковых факторов, проведенные на дрожжах Басскаготусез сегеу181ае, показали плейотропность проявления мутаций в генах, кодирующих факторы терминации трансляции еШ7! и еКРЗ. У дрожжей сегеушяе эти факторы кодируются жизненно важными генами БиР45 и БиР35. Мутации в этих генах приводят к считыванию стоп-кодонов как значащих, или омнипотентной нонсенс-супрессии. Мутанты Бир45 и яир35 могут также проявлять температуро- и осмочувствительность, полную или частичную дыхательную некомпетентность, чувствительность к беномилу и аминогликозидным антибиотикам. В большинстве случаев неизвестно, являются ли эти плейотропные эффекты прямым следствием нарушения терминации трансляции, или опосредованы участием белков 8ир45 и 8ир35 в клеточных процессах, не связанных непосредственно с терминацией трансляции. Значительный объем данных о взаимодействии дрожжевых факторов терминации трансляции с компонентами различных клеточных структур, накопленный к настоящему времени, свидетельствует о существовании дополнительных функций факторов терминации трансляции и указывает на новые уровни регуляции жизнедеятельности дрожжевой клетки.

В Лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ была получена коллекция мутантных аллелей sup45, способных поддерживать жизнеспособность штамма в отсутствие аллели гена SUP45 дикого типа. В дальнейшем было обнаружено, что диплоидные штаммы дрожжей, несущие как нонсенс, так и миссенс-аллели sup45 в гомозиготе или гемизиготе, теряют способность к псевдогифальному росту.

У дрожжей S. cerevisiae переход от дрожжевого типа роста к мицелиальному (филаментозному) является ответом на изменение состава среды и сопровождается физиологическими и морфологическими изменениями. Переход к псевдогифальному росту у диплоидов индуцируется в условиях недостатка источника азота при наличии доступного источника углерода и характеризуется образованием ветвящихся цепочек клеток удлиненной формы, или псевдогиф. Внешний сигнал, природа которого в настоящее время неизвестна, запускает сигнальный каскад, активирующий экспрессию генов семейства FLO. Гены FLO кодируют гликопротеины клеточной стенки, необходимые для межклеточных контактов и адгезии к субстрату. Ген FLO 11 (.MUC1) играет ключевую роль в регуляции псевдогифального роста у диплоидных и инвазивного роста у гаплоидных штаммов.

Целью работы являлось изучение новых плейотропных эффектов мутаций в генах SUP45 и SUP35.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Факторы терминации трансляции у дрожжей БасскаготусеБ сегеуЫ1ае и последствия нарушения их функции.

За последнее десятилетие накоплено огромное количество данных о разнообразных процессах, идущих в живой клетке. Развитие и применение новых методов в генетике и молекулярной биологии позволило объединить и систематизировать большие массивы данных и выйти на новый уровень понимания организации многих клеточных процессов. Механизмы сохранения, передачи и реализации наследственной информации по-прежнему остаются основным объектом изучения и постоянным источником новых данных. Один из фундаментальных процессов, обеспечивающих реализацию генетической информации, - синтез белка - является объектом изучения уже не одно десятилетие, процесс еще далек от завершения.

Данный обзор посвящен анализу механизмов, лежащих в основе терминации трансляции, и влияния ее нарушения на некоторые клеточные процессы. Будет дана характеристика ряда мутантных аллелей фактора терминации трансляции I класса дрожжей сегегшае и описаны их известные проявления. Отдельно будет рассмотрено явление, известное как филаментозный рост, условия его индукции и регулирующие механизмы.

1.1.Терминации трансляции.

Синтез белка, или трансляция, у прокариотических и эукариотических организмов включает в себя три стадии - инициацию, элонгацию и терминацию. Также в качестве дополнительного этапа часто выделяют рециклирование трансляционного аппарата перед очередной инициацией белкового синтеза. Помимо большой и малой субъединиц рибосомы и матричной РНК, в процессе трансляции участвует большое количество белковых факторов, обеспечивающих точный и эффективный синтез белковой цепи, а также переход от одной стадии к другой.

Терминация трансляции (Рис.1) происходит при попадании в аминоацильный сайт (А-сайт) рибосомы одного из трех стоп-кодонов - 11АА, иАв и 1ЮА. Белки, относящиеся к факторам терминации трансляции I класса,

Рисунок 1. Схема терминации трансляции у дрожжей сегмэЕае. 8ир35, Бир45 - факторы терминации трансляции, ро1уА - поли-А хвост матричной отвечают за опознавание стоп-кодона, находящегося в А-сайте рибосомы и осуществляют гидролиз пептидил-тРНК. Факторы терминации трансляции II класса стимулируют работу факторов I класса за счет своей ГТФазной активности. В общих чертах механизм этих процессов сходен у всех живых организмов, однако существует и ряд отличий (КлзБеку еГ а/., 2003).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Петрова, Александра Владиленовна

5. ВЫВОДЫ.

1. Мутации sup45, снижающие эффективность терминации трансляции, приводят к нарушению псевдогифального роста у диплоидов, гетерозиготных по типу спаривания, в отличие от мутаций, нарушающих фосфорилирование eRFl или повышающих эффективность терминации трансляции.

4. Нарушение псевдогифального роста на фоне мутантных аллелей sup45 не связано со снижением уровня экспрессии vonSiFLOll.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Александра Владиленовна, Санкт-Петербург

1. Борхсениус A.C., Инге-Вечтомов С.Г. О роли генов SUP35 и SUP45 в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов // Доклады Академии Наук. 1997. Т.353. С.553-556.

2. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия: Учебное пособие. Л.: ЛГУ, 1982, 264 с.

3. Журавлева Г.А., Землянко О.М., Ле Гофф К., Петрова A.B., Филипп М., Инге-Вечтомов С.Г. Консервативность MC-доменов эукариотического фактора терминации eRF3 // Генетика. 2007а. Т.43. №1. С. 1-7.

4. Журавлева Г.А., Москаленко С.Е., Мурина O.A., Инге-Вечтомов С.Г. Жизнеспособные нонсенс-мутанты по гену SUP45 у дрожжей S. cerevisiae летальны при повышенной температуре // Генетика. 2007b. Т.43. №10. С.1-8.

5. Журавлева Г.А., Петрова A.B. Нарушение псевдогифального роста у мутантов по фактору терминации трансляции eRF 1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Доклады Академии Наук. 2010. Т.433. № 5. С. 707-709.

6. Захаров И.А., С.А. Кожин, Т.Н. Кожина, И.В. Федорова. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984, 143 с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине // Вестник ЛГУ. 1964. Т.2. С. 112-117.

8. Инге-Вечтомов С.Г. Влияние источника углерода и митохондриального генома на рибосомную супрессию в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. II Исслед. Генет. 1986. Т. 10. С.60-65.

9. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей//Генетика. 1970. Т.6. С. 103-116.

10. Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Л.Н., Аленин В.В., Борхсениус A.C. Генетический контроль биосинтеза белка и прионный механизм наследственности. // Вестник ЛГУ. 1999. С.53-71.

11. Куликов В.Н., Тиходеев О.Н., Форафонов Ф.С., Борхсениус A.C., Аленин

12. B.В., Инге-Вечтомов С.Г. Супрессия мутации "сдвиг рамки считывания" в результате частичной инактивации факторов терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 2001. Т.37. С.602-609.

13. Миронова JI.H., Зеленая O.A., Тер-Аванесян М.Д. Ядерно-митохондриальные взаимодействия у дрожжей: митохондриальные мутации, компенсирующие дыхательную недостаточность мутантов supl и sup2 II Генетика. 1986. Т.22. С.200-208.

14. Москаленко С.Е. Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно важном гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Санкт-Петербург, 2003.

15. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Взаимодействие доминантных и рецессивных супрессоров в дрожжах Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1980. Т. 16. С.86-94.

16. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г., Шубочкина Е.А. Экспрессия супрессорных мутаций supl и sup2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 1982. Т. 18. С.215-222.

17. Тихомирова B.JL, Карпова Т.С., Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Genetic analysis of tRNA and ribosome interaction in informational suppression in yeast Saccharomyces. Исслед. Генет. 1986. С.52-60.

18. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975, 296 с.

19. Шабельская С.В. Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Санкт-Петербург, 2005.

20. Шабельская С. В., Журавлева Г. А. Мутации в гене SUP35 нарушают процесс деградации мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны. //Молекулярная биология. 2010. Т.44. №1. С.51-59.

21. Шумов Н.Н., Волков К.В., Миронова J1.H. Взаимодействие гена АТР17 с генами SUP45 и SUP35 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 2000. Т. 36. С. 644-650.

22. Acuña G., Würgler F.E., Sengstag С. Reciprocal mitotic recombination is the predominant mechanism for the loss of a heterozygous gene in Saccharomyces cerevisiae // Environ Mol Mutagen. 1994. V.24. P.307-316.

23. Alkalaeva E.Z., Pisarev A.V., Frolova L.Y., Kisselev L.L., Pestova T.V. In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3 // Cell. 2006. V.125. P.l 125-1136.

24. Andersen M.P., Nelson Z.W., Hetrick E.D., Gottschling D.E. A genetic screen for increased loss of heterozygosity in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2008. V.179. P.l 179-1195.

25. Andjelkovic N., Zolnierowicz S., Van H.C., Goris J., Hemmings B.A. The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor eRFl //EMBOJ. 1996. V.15. P.7156-7167.

26. Angeles de la Torre-Ruiz M., Torres J., Arino J., Herrero E. Sit4 is required for proper modulation of the biological functions mediated by Pkcl and the cell integrity pathway in Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem. 2002. V.277. P.33468-33476.

27. Ansari K., Martin S., Farkasovsky M., Ehbrecht I.M., Kuntzel H. Phospholipase C binds to the receptor-like GPR1 protein and controls pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem. 1999. V.274. P.30052-30058.

28. Baker K.E. and Parker R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. V.16. P.293-299.

29. Bardwell L., Cook J.G., Voora D., Baggott D.M., Martinez A.R., Thorner J. Repression of yeast Stel2 transcription factor by direct binding of unphosphorylated Kssl MAPK and its regulation by the Ste7 MEK // Genes Dev. 1998. V.12. P.2887-2898.

30. Bastidas R.J., Heitman J. Trimorphic stepping stones pave the way to fungal virulence // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2009. V.106. P.351-352.

31. Basu J., Williams B.C., Li Z., Williams E.V., Goldberg M.L. Depletion of a Drosophila homolog of yeast Sup35p disrupts spindle assembly, chromosome segregation, and cytokinesis during male meiosis // Cell Motil.Cytoskeleton. 1998. V.39. P.286-302.

32. Beaudet A.L., Caskey C.T. Mammalian peptide chain termination. Codon specificity and GTPase activity of release factor // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1971. V.68.P.619-624.

33. Beck T., Hall M.N. The TOR signalling pathway controls nuclear localization of nutrient-regulated transcription factors // Nature. 1999. V.402. P.689-692.

34. Bender A. Genetic evidence for the roles of the bud-site-selection genes BUD5 and BUD2 in control of the Rsrlp (Budlp) GTPase in yeast // Proc.Natl .Acad. Sci .U. S.A. 1993. V.90. P.9926-9929.

35. Bender A., Pringle J.R. Multicopy suppression of the cdc24 budding defect in yeast by CDC42 and three newly identified genes including the ras-related gene RSR1 // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1989. V.86. P.9976-9980.

36. Bolger T.A., Folkmann A.W., Tran E.J., Wente S.R. The mRNA export factor Glel and inositol hexakisphosphate regulate distinct stages of translation // Cell. 2008. V.134. P.624-633.

37. Bond A.T., Mangus D.A., He F., Jacobson A. Absence of Dbp2p alters both nonsense-mediated mRNA decay and rRNA processing // Mol Cell Biol. 2001. V.21. P.7366-7379.

38. Bonetti B., Fu L., Moon J., Bedwell D.M. The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae // J. Mol. Biol. 1995. V.251. P.334-345.

39. Borchsenius A.S., Tchourikova A.A., Inge-Vechtomov S.G. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae II Curr.Genet. 2000. V.37. P.285-291.

40. Breining P., Piepersberg W. Yeast omnipotent supressor SUP I (SUP45): nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene // Nucleic Acids Res. 1986. V.14. P.5187-5197.

41. Broach J.R. Ras-regulated signaling processes in Saccharomyces cerevisiae II Curr Opin Genet Dev. 1991. V.l. P.370-377.

42. Cali B.M., Doyle T.C., Botstein D., Fink G.R. Multiple functions for actin during filamentous growth of Saccharomyces cerevisiae II Mol.Biol.Cell. 1998. V.9. P.1873-1889.

43. Campbell D.A., Fogel S., Lusnak K. Mitotic chromosome loss in a disomic haploid of Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1975. V.79. P.383-396.

44. Cannon J.F., Tatchell K. Characterization of Saccharomyces cerevisiae genes encoding subunits of cyclic AMP-dependent protein kinase // Mol.Cell Biol. 1987. V.7. P.2653-2663.

45. Caras I.W., Weddell G.N., Williams S.R. Analysis of the signal for attachment of a glycophospholipid membrane anchor // J.Cell Biol. 1989. V.108. P. 13871396.

46. Carlberg U., Nilsson A., Nygard O. Functional properties of phosphorylated elongation factor 2 // Eur.J.Biochem. 1990. V.191. P.639-645.

47. Carr L.L., Gottschling D.E. Does age influence loss of heterozygosity? // Exp Gerontol. 2008. V. 43. P. 123-129.

48. Chabelskaya S., Gryzina V., Moskalenko S., Le Goff C., Zhouravleva G. Inactivation of NMD increases viability of sup45 nonsense mutants in Saccharomyces cerevisiae II BMC.Mol.Biol. 2007. V.8. P.71.

49. Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are non-lethal // Mol.Genet.Genomics. 2004. V.272. P.297-307.

50. Chant J., Corrado K., Pringle J.R., Herskowitz I. Yeast BUD5, encoding a putative GDP-GTP exchange factor, is necessary for bud site selection and interacts with bud formation gene BEM1II Cell. 1991. V.65. P. 1213-1224.

51. Chant J., Herskowitz I. Genetic control of bud site selection in yeast by a set of gene products that constitute a morphogenetic pathway // Cell. 1991. V.65. P.1203-1212.

52. Chant J., Pringle J.R. Patterns of bud-site selection in the yeast Saccharomyces cerevisiae II J.Cell Biol. 1995. V.129. P.751-765.

53. Chauvin C., Salhi S., Le G.C., Viranaicken W., Diop D., Jean-Jean O. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translationtermination and regulation of the termination complex formation // Mol Cell Biol. 2005. V.25. P.5801-5811.

54. Chen T., Hiroko T., Chaudhuri A., Inose F., Lord M., Tanaka S., Chant J., Fujita A. Multigenerational cortical inheritance of the Rax2 protein in orienting polarity and division in yeast// Science. 2000. V.290. P. 1975-1978.

55. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor psi+. // Science. 1995. V.268. P.880-884.

56. Chernoff Y.O., Uptain S.M., Lindquist S.L. Analysis of prion factors in yeast // Methods Enzymol. 2002. V.351. P.499-538.

57. Coller J.M., Gray N.K., Wickens M.P. mRNA stabilization by poly(A) binding protein is independent of poly(A) and requires translation // Genes Dev. 1998. V.12. P.3226-3235.

58. Conlan R.S., Tzamarias D. Sfll functions via the co-repressor Ssn6-Tupl and the cAMP-dependent protein kinase Tpk2 // J.Mol.Biol. 2001. V.309. P. 10071015.

59. Cook J.G., Bardwell L., Kron S.J., Thorner J. Two novel targets of the MAP kinase Kssl are negative regulators of invasive growth in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev. 1996. V.10. P.2831-2848.

60. Cullen P.J., Sprague G.F., Jr. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. V.97. P. 13619-13624.

61. Cullen P.J., Sprague G.F., Jr. The roles of bud-site-selection proteins during haploid invasive growth in yeast// Mol.Biol.Cell. 2002. V.13. P.2990-3004.

62. Czaplinski K., Majlesi N., Banerjee T., Peltz S.W. Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency // RNA. 2000. V.6. P.730-743.

63. Delahunty M.D., Stafford F.J., Yuan L.C., Shaz D., Bonifacino J.S. Uncleaved signals for glycosylphosphatidylinositol anchoring cause retention of precursor proteins in the endoplasmic reticulum // J.Biol.Chem. 1993. V.268. P.12017-12027.

64. Delley P.A., Hall M.N. Cell wall stress depolarizes cell growth via hyperactivation of RHOl IIJ Biol Cell. 1999. V.147. P. 163-174.

65. Dennis P.B., Fumagalli S., Thomas G. Target of rapamycin (TOR): balancing the opposing forces of protein synthesis and degradation // Curr.Opin.Genet.Dev. 1999. V.9. P.49-54.

66. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of PST. prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. V.144. P. 1375-1386.

67. Doering T.L., Schekman RGPI anchor attachment is required for Gaslp transport from the endoplasmic reticulum in COP II vesicles // EMBO J. 1996. V.15. P.182-191.

68. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol.Rev. 2000. V.24. P.469-486.

69. Fraering P., Imhof I., Meyer U., Strub J.M., van Dorsselaer A., Vionnet C., Conzelmann A. The GPI transamidase complex of Saccharomyces cerevisiae contains Gaalp, Gpi8p, and Gpil6p // Mol.Biol.Cell. 2001. V.12. P.3295-3306.

70. Freistroffer D.V., Pavlov M.Y., MacDougall J., Buckingham R.H., Ehrenberg M. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner // EMBO J. 1997. V.16. P.4126-4133.

71. Frieman M.B., Cormack B.P. The omega-site sequence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in Saccharomyces cerevisiae can determine distribution between the membrane and the cell wall // Mol.Microbiol. 2003. V.50. P.883-896.

72. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA 1996. V.2. P.334-341.

73. Fujita A., Kikuchi Y., Kuhara S., Misumi Y., Matsumoto S., Kobayashi H. Domains of the SFL1 protein of yeasts are homologous to Myc oncoproteins or yeast heat-shock transcription factor // Gene. 1989. V.85. P.321-328.

74. Fujita A., Lord M., Hiroko T., Hiroko F., Chen T., Oka C., Misumi Y., Chant J. Raxl, a protein required for the establishment of the bipolar budding pattern in yeast // Gene. 2004. V.327. P. 161-169.

75. Gagny B., Silar P. Identification of the genes encoding the cytosolic translation release factors from Podospora anserina and analysis of their role during the life cycle//Genetics. 1998. V.149. P.1763-1775.

76. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G., Botstein D., Brown P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes // Mol Biol Cell. 2000. V.ll. P.4241-4257.

77. Gavin A.C., Aloy P., Grandi P., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery //Nature. 2006. V.440. P.631-636.

78. Gerits N., Kostenko S., Shiryaev A., Johannessen M., Moens U. Relations between the mitogen-activated protein kinase and the cAMP-dependent protein kinase pathways: comradeship and hostility // Cell Signal. 2008. V.20. P. 15921607.

79. Gibbs J.B., Schaber M.D., Marshall M.S., Scolnick E.M., Sigal I.S. Identification of guanine nucleotides bound to ras-encoded proteins in growing yeast cells // J.Biol.Chem. 1987. V.262. P. 10426-10429.

80. Gimeno C.J., Fink G.R. Induction of pseudohyphal growth by overexpression of PHD1, a Saccharomyces cerevisiae gene related to transcriptional regulators of fungal development//Mol.Cell Biol. 1994. V.14. P.2100-2112.

81. Gimeno C.J., Ljungdahl P.O., Styles C.A., Fink G.R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS // Cell. 1992. V.68. P.1077-1090.

82. Gietz D., St.Jean A., Woods R.A., Schiestl R.H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells // Nucleic Acids Res. 1992. V.20. P.1425-1431.

83. Gonzalez C.I., Bhattacharya A., Wang W., Peltz S.W. Nonsense-mediated mRNA decay in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 2001. V.274. P. 15-25.

84. Gonzalez T.N., Sidrauski C., Dorfler S., Walter P. Mechanism of non-spliceosomal mRNA splicing in the unfolded protein response pathway // EMBOJ. 1999. V.18.P.3119-3132.

85. Gross T., Siepmann A., Sturm D., Windgassen M., Scarcelli J.J., Seedorf M., Cole C.N., Krebber H. The DEAD-box RNA helicase Dbp5 functions in translation termination // Science. 2007. V.315. P.646-649.

86. Guo B., Styles C.A., Feng Q., Fink G.R. A Saccharomyces gene family involved in invasive growth, cell-cell adhesion, and mating // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. V.97. P.12158-12163.

87. Hamada K., Terashima H., Arisawa M., Kitada K. Amino acid sequence requirement for efficient incorporation of glycosylphosphatidylinositol-associated proteins into the cell wall of Saccharomyces cerevisiae II J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.26946-26953.

88. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // Journal of molecular biology. 1983. P.557-580.

89. Harger J.W. and Dinman J.D. Evidence against a direct role for the Upf proteins in frameshifting or nonsense codon readthrough // RNA. 2004. V.10. P.1721-1729.

90. Harkins H.A., Page N., Schenkman L.R., De Virgilio C., Shaw S., Bussey H., Pringle J.R. Bud8p and Bud9p, proteins that may mark the sites for bipolar budding in yeast// Mol.Biol.Cell. 2001. V.12. P.2497-2518.

91. Hatin I., Fabret C., Rousset J.P., Namy O. Molecular dissection of translation termination mechanism identifies two new critical regions in eRFl // Nucleic Acids Res. 2009. V.37. P.1789-1798.

92. Hawthorne D.C., Leupold U. Suppressors in yeast // Curr Top Microbiol Immunol. 1974. V.64. P. 1-47.

93. Heitman J., Movva N.R., Hall M.N. Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast // Science. 1991. V.253. P.905-909.

94. Helliwell S.B., Howald I., Barbet N., Hall M.N. TOR2 is part of two related signaling pathways coordinating cell growth in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1998. V.148. P.99-112.

95. Himmelfarb H.J., Maicas E., Friesen J.D. Isolation of the SUP45 omnipotent suppressor gene of Saccharomyces cerevisiae and characterization of its gene product // Mol. Cell Biol. 1985. V.5. P.816-822.

96. Hiraoka M., Watanabe K., Umezu K., Maki H. Spontaneous loss of heterozygosity in diploid Saccharomyces cerevisiae cells // Genetics. 2000. V.156. P.1531-1548.

97. Hofman-Bang J. Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae II Mol Biotechnol. 1999. V.12. P.35-73.

98. Hu G.Z., Ronne H. Overexpression of yeast PAM1 gene permits survival without protein phosphatase 2A and induces a filamentous phenotype // J Biol Chem. 1994. V.269. P.3429-3435.

99. Huxley C., Green E.D., Dunham I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR // Trends Genet. 1990. V.6. P.236.

100. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M. Eukaryotic release factors (eRFs) history //Biol.Cell. 2003. V.95. P. 195-209.

101. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V.96. P.23-28.

102. Ivanov M., Aksenova A., Mironova L. Reversible inactivation of TRP5, CYH5 and MET 13 dominate alleles in heterozygous yeast cells. 2003. In: XXIst Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (eds J.M.Cherry, S.Hohmann), p. S89. Yeast.

103. Jakobsen S.G., Segaard T.M., Jean-Jean O., Frolova L., Justesen J. Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo II Mol Biol. 2001. V.35. P.672-681.

104. Jean-Jean O., Le Goff X., Philippe M. Is there a human psi.? // C R Acad Sci III. 1996. V.319. P.487-492.

105. Jiang Y., Davis C., Broach J.R. Efficient transition to growth on fermentable carbon sources in Saccharomyces cerevisiae requires signaling through the Ras pathway // EMBO J. 1998. V.17. P.6942-6951.

106. Jones G.M., Stalker J., Humphray Sv West A., Cox T. Rogers J., Dunham I., Prelich G. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae I I Nat.Methods. 2008. V.5. P.239-241.

107. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1994, 234p.

108. Kang P.J., Angerman E., Nakashima K., Pringle J.R., Park H.O. Interactions among Raxlp, Rax2p, Bud8p, and Bud9p in marking cortical sites for bipolar bud-site selection in yeast//Mol.Biol.Cell. 2004a. V.15. P.5145-5157.

109. Kang P.J., Lee B., Park H.O. Specific residues of the GDP/GTP exchange factor Bud5p are involved in establishment of the cell type-specific budding pattern in yeast // J.Biol.Chem. 2004b. V.279. P.27980-27985.

110. Kataoka T., Powers S., McGill C., Fasano O., Strathern J., Broach J., Wigler M. Genetic analysis of yeast RAS1 and RAS2 genes // Cell. 1984. V.37. P.437-445.

111. Ketela T., Green R., Bussey H. Saccharomyces cerevisiae mid2p is a potential cell wall stress sensor and upstream activator of the PKC1-MPK1 cell integrity pathway // J Bacteriol. 1999. V.181. P.3330-3340.

112. Kielbassa K., Muller H.J., Meyer H.E., Marks F., Gschwendt M. Protein kinase C delta-specific phosphorylation of the elongation factor eEF-alpha and an eEF-1 alpha peptide at threonine 431 // J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.6156-6162.

113. Kiktev D., Vechtomov S.I., Zhouravleva G. Prion-dependent lethality of sup45 mutants in Saccharomyces cerevisiae II Prion. 2007. V. 1. P. 136-143.

114. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain // EMBO J. 1988. V.7. P. 1175-1182.

115. Kimata Y., Kimata Y.I., Shimizu Y., Abe H, Farcasanu IC, Takeuchi M, Rose MD, Kohno K. Genetic evidence for a role of BiP/Kar2 that regulates Irel in response to accumulation of unfolded proteins // Mol.Biol.Cell. 2003. V.14. P.2559-2569.

116. Kisselev L., Ehrenberg M., Frolova L. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? // EMBO J. 2003. V.22. P. 175-182.

117. Kobayashi O., Suda H., Ohtani T., Sone H. Molecular cloning and analysis of the dominant flocculation gene FL08 from Saccharomyces cerevisiae II Mol.Gen.Genet. 1996. V.251. P.707-715.

118. Kobayashi T., Funakoshi Y., Hoshino S., Katada T. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay // J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.45693-45700.

119. Kobayashi O., Yoshimoto H., Sone H. Analysis of the genes activated by the FL08 gene in Saccharomyces cerevisiae // Curr.Genet. 1999. V.36. P.256-261.

120. Kohler T., Wesche S., Taheri N., Braus G.H., Mosch H.-U. Dual role of the Saccharomyces cerevisiae TEA/ATTS family transcription factor Teclp in regulation of gene expression and cellular development // Eukaryot Cell. 2002. V.l. P.673-686.

121. Konecki D.S., Aune K.C., Tate W., Caskey C.T. Characterization of reticulocyte release factor//J.Biol.Chem. 1977. V.252. P.4514-4520.

122. Krappmann A.B., Taheri N., Heinrich M., Mosch H.-U. Distinct domains of yeast cortical tag proteins Bud8p and Bud9p confer polar localization and functionality // Mol.Biol.Cell. 2007. V.l8. P.3323-3339.

123. Kron S.J., Styles C.A., Fink G.R. Symmetric cell division in pseudohyphae of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol.Biol.Cell. 1994. V.5. P.1003-1022.

124. Kurihara L.J., Beh C.T., Latterich M., Schekman R., Rose M.D. Nuclear congression and membrane fusion: two distinct events in the yeast karyogamy pathway // J Cell Biol. 1994. V.126. P.911-923.

125. Kurjan J. The pheromone response pathway in Saccharomyces cerevisiae // Annu Rev Genet. 1993. V.27. P.147-179.

126. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1988. V.66. P.45-54.

127. Lambrechts M.G., Bauer F.F., Marmur J., Pretorius I.S. Mucl, a mucin-like protein that is regulated by MsslO, is critical for pseudohyphal differentiation in yeast// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. V.93. P.8419-8424.

128. Latterich M., Schekman R. The karyogamy gene KAR2 and novel proteins are required for ER-membrane fusion // Cell. 1994. V.78. P.87-98.

129. Leberer E., Thomas D.Y., Whiteway M. Pheromone signalling and polarized morphogenesis in yeast // Curr Opin Genet Dev. 1997. V.7. P.59-66.

130. Le Goff C., Zemlyanko O., Moskalenko S., Berkova N., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo II Genes Cells. 2002. V.7. P. 1043-1057.

131. Leidich S.D., Orlean P. Gpil, a Saccharomyces cerevisiae protein that participates in the first step in glycosylphosphatidylinositol anchor synthesis // J.Biol.Chem. 1996. V.271. P.27829-27837.

132. Lengeler K.B., Davidson R.C., D'Souza C., Harashima T., Shen W.C., Wang P., Pan X., Waugh M., Heitman J. Signal transduction cascades regulating fungal development and virulence // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V.64. P.746-785.

133. Liebman S.W., Cavenagh M.M., Bennett L.N. Isolation and properties of an antisuppressor in Saccharomyces cerevisiae specific for an omnipotent suppressor // J.Bacteriol. 1980. V.143. P. 1527-1529.

134. Liu H., Styles C.A., Fink G.R. Saccharomyces cerevisiae S288C has a mutation in FL08, a gene required for filamentous growth // Genetics. 1996. V.144. P.967-978.

135. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. 2001. V.25. P.402-408.

136. Lorenz M.C., Heitman J. The MEP2 ammonium permease regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae II EMBO J. 1998. V.17. P.1236-1247.

137. Lorenz M.C., Pan X., Harashima T., Cardenas M.E., Xue Y., Hirsch J.P., Heitman J. The G protein-coupled receptor gprl is a nutrient sensor that regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2000. V.154. P.609-622.

138. Lo W.S., Dranginis A.M. FLOll, a yeast gene related to the STA genes, encodes a novel cell surface flocculin // J.Bacteriol. 1996. V.178. P.7144-7151.

139. Lo W.S., Dranginis A.M. The cell surface flocculin Floll is required for pseudohyphae formation and invasion by S. cerevisiae II Mol. Biol. Cell. 1998. V.9. P.161-171.

140. Madhani H.D., Fink G.R. Combinatorial control required for the specificity of yeast MAPK signaling // Science. 1997. V.275. P. 1314-1317.

141. Madhani H.D., Fink G.R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi // Trends Cell Biol. 1998. V.8. P.348-353.

142. Magasanik B., Kaiser C.A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 2002. V.290. P. 1-18.

143. Mangus D.A., Evans M.C., Jacobson A. Poly(A)-binding proteins: multifunctional scaffolds for the post-transcriptional control of gene expression // Genome Biol. 2003. V.4. P.223.

144. Marini A.M., Soussi-Boudekou S., Vissers S., Andre B. A family of ammonium transporters in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1997. V.17. P.4282-4293.

145. Merkulova T.I., Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. Cterminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction // FEBS Lett. 1999. V.443. P.41-47.

146. Merritt G.H., Naemi W.R., Mugnier P., Webb H.M., Tuite M.F., von der H.T. Decoding accuracy in eRFl mutants and its correlation with pleiotropic quantitative traits in yeast // Nucleic Acids Res. 2010. V.38. P.5479-5492.

147. Minato T., Wang J., Akasaka K., Okada T., Suzuki N., Kataoka T. Quantitative analysis of mutually competitive binding of human Raf-1 and yeast adenyly 1 cyclase to Ras proteins // J.Biol.Chem. 1994. V.269. P.20845-20851.

148. Mitchell A.P. Dimorphism and virulence in Candida albicans II Curr Biol. 1998. V.l. P.687-692.

149. Moffat J.G., Tate W.P. A single proteolytic cleavage in release factor 2 stabilizes ribosome binding and abolishes peptidyl-tRNA hydrolysis activity // J Biol Chem. 1994. V.269. P.18899-18903.

150. Mori K., Ogawa N., Kawahara T., Yanagi H., Yura T. Palindrome with spacer of one nucleotide is characteristic of the cis-acting unfolded protein responseelement in Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem. 1998. V.273. P.9912-9920.

151. Mosch H.-U., Fink G.R. Dissection of filamentous growth by transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. V.145. P.671-684.

152. Moskalenko S.E., Chabelskaya S.V., Inge-Vechtomov S.G., Philippe M., Zhouravleva G.A. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae II BMC.Mol.Biol. 2003. V.4. P.2.

153. Namy O., Duchateau-Nguyen G., Rousset J.P. Translational readthrough of the PDE2 stop codon modulates cAMP levels in Saccharomyces cerevisiae II Mol Microbiol. 2002a. V.43. P.641-652.

154. Namy O., Hatin I., Stahl G., Liu H., Barnay S., Bidou L., Rousset J.P. Gene overexpression as a tool for identifying new trans-acting factors involved in translation termination in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2002b. V.161. P.585-594.

155. Narayanan V., Mieczkowski P.A., Kim H.M., Petes T.D., Lobachev K.S. The pattern of gene amplification is determined by the chromosomal location of hairpin-capped breaks // Cell. 2006. V.125. P. 1283-1296.

156. Naviglio S., Caraglia M., Abbruzzese A., Chiosi E., Di Gesto D., Marra M., Romano M., Sorrentino A., Sorvillo L., Spina A., Illiano G. Protein kinase A as a biological target in cancer therapy // Expert Opin Ther Targets. 2009. V.13. P.83-92.

157. Nikawa J., Sass P., Wigler M. Cloning and characterization of the low-affinity cyclic AMP phosphodiesterase gene of Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1987. P.7. P.3629-3636.

158. Ni L., Snyder M. A genomic study of the bipolar bud site selection pattern in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Biol.Cell. 2001. V.12. P.2147-2170.

159. Nishikawa S.I., Fewell S.W., Kato Y., Brodsky J.L., Endo T. Molecular chaperones in the yeast endoplasmic reticulum maintain the solubility of proteins for retrotranslocation and degradation // J Cell Biol. 2001. V.153. P.1061-1070.

160. Normington K., Kohno K., Kozutsumi Y., Gething M.J., Sambrook J. S. cerevisiae encodes an essential protein homologous in sequence and function to mammalian BiP // Cell. 1989. V.57. P. 1223-1236.

161. Oehlen L., Cross F.R. The mating factor response pathway regulates transcription of TEC1, a gene involved in pseudohyphal differentiation of Saccharomyces cerevisiae IIFEBS Lett. 1998. V.429. P.83-88.

162. Oliveira E.M., Martins A.S., Carvajal E., Bon E.P. The role of the GATA factors Gln3p, Nillp, Dal80p and the Ure2p on ASP3 regulation in Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 2003. V.20. P.31-37.

163. Ozcan S., Johnston M. Function and regulation of yeast hexose transporters // Microbiol Mol Biol Rev. 1999. V.63. P.554-569.

164. Pan X., Heitman J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1999. V.19. P.4874-4887.

165. Pan X., Heitman J. Protein kinase A operates a molecular switch that governs yeast pseudohyphal differentiation // Mol.Cell Biol. 2002. V.22. P.3981-3993.

166. Park H.O., Bi E., Pringle J.R., Herskowitz I. Two active states of the Ras-related Budl/Rsrl protein bind to different effectors to determine yeast cell polarity // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997. V.94. P.4463-4468.

167. Park H.O., Chant J., Herskowitz I. BUD2 encodes a GTPase-activating protein for Budl/Rsrl necessary for proper bud-site selection in yeast // Nature. 1993. V.365. P.269-274.

168. Pavlov M.Y., Freistroffer D.V., MacDougall J., Buckingham R.H., Ehrenberg M. Fast recycling of Escherichia coli ribosomes requires both ribosome recycling factor (RRF) and release factor RF3 // EMBO J. 1997. V.16. P.4134-4141.

169. Paushkin S.V., V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov, M.D. Ter-Avanesyan. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2798-2805.

170. Reynolds T.B., Fink G.R. 2001. Baker's yeast, a model for fungal biofilm formation // Science. 2001. V.291. P.878-881.

171. Robertson L.S., Fink G.R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998. V.95. P.13783-13787.

172. Roberts R.L., Fink G.R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth // Genes Dev. 1994. V.8. P.2974-2985.

173. Roncero C., Duran A. Effect of Calcofluor white and Congo red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization // J.Bacteriol. 1985. V.163. P. 1180-1185.

174. Rose M.D., Misra L.M., Vogel J.P. KAR2, a karyogamy gene, is the yeast homolog of the mammalian BiP/GRP78 gene//Cell. 1989. V.57. P.1211-1221.

175. Rose M.D., Fink G.R. KAR1, a gene required for function of both intranuclear and extranuclear microtubules in yeast // Cell. 1987. V.48. P. 1047-1060.

176. Runge K.W., Wellinger R.J., Zakian V.A. Effects of excess centromeres and excess telomeres on chromosome loss rates // Mol.Cell Biol. 1991. V.ll. P.2919-2928.

177. Rupp S., Summers E., Lo H.J., Madhani H., Fink G. MAP kinase and cAMP filamentation signaling pathways converge on the unusually large promoter of the yeast FLOll gene // EMBO J. 1999. V.18. P.1257-1269.

178. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 723p.

179. Santangelo G.M. Glucose signaling in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2006. V.70. P.253-282.

180. Sass P., Field J., Nikawa J., Toda T., Wigler M. Cloning and characterization of the high-affinity cAMP phosphodiesterase of Saccharomyces cerevisiae II Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1986. V.83. P.9303-9307.

181. Schmidt A., Bickle M., Beck T., Hall M.N. The yeast phosphatidylinositol kinase homolog TOR2 activates RHOl and RH02 via the exchange factor ROM2 // Cell. 1997. V.88. P.531-542.

182. Schmidt A., Kunz J., Hall M.N. TOR2 is required for organization of the actin cytoskeleton in yeast//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. V.93. P. 13780-13785.

183. Schroder M., Chang J.S., Kaufman R.J. The unfolded protein response represses nitrogen-starvation induced developmental differentiation in yeast // Genes Dev. 2000. V.14. P.2962-2975.

184. Scolnick E., Tompkins R., Caskey T., Nirenberg M. Release factors differing in specificity for terminator codons // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1968. V.61. P.768-774.

185. Severin F., Habermann B., Huffaker T., Hyman T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase // J.Cell Biol. 2001. V.153. P.435-442.

186. Shamu C.E., Walter P. Oligomerization and phosphorylation of the Irelp kinase during intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the nucleus // EMBO J. 1996. V.15. P.3028-3039.

187. Sherman F., G.R. Fink, J.B. Hincks. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986, 367p.

188. Sidrauski C., Walter P. The transmembrane kinase Irelp is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response // Cell. 1997. V.90. P.1031-1039.

189. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1989. V.122. P.19-27.

190. Smith C.E., Lam A.F., Symington L.S. Aberrant double-strand break repair resulting in half crossovers in mutants defective for Rad51 or the DNA polymerase delta complex // Mol Cell Biol. 2009. V.29. P. 1432-1441.

191. Sonenberg N., Dever T.E. Eukaryotic translation initiation factors and regulators // Curr.Opin.Struct.Biol. 2003. V.13. P.56-63.

192. Song H., Mugnier P., Das A.K., Webb H.M., Evans D.R., Tuite M.F., Hemmings B.A., Barford D. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis//Cell. 2000. V.100. P.311-321.

193. Stansfield I., Akhmaloka, Tuite M.F. A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes // Curr.Genet. 1995a. V.27. P.417-426.

194. Stansfield I., Kushnirov V.V., Jones K.M., Tuite M.F. A conditional-lethal translation termination defect in a sup45 mutant of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Eur.J.Biochem. 1997. V.245. P.557-563.

195. Strittmatter A.W., Fischer C., Kleinschmidt M., Braus G.H. FLO 11 mediated filamentous growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae depends on the expression of the ribosomal RPS26 genes // Mol.Genet.Genomics. 2006. V.276. P.l 13-125.

196. Surosky R.T., Newlon C.S., Tye B.K. The mitotic stability of deletion derivatives of chromosome III in yeast // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1986. V.83. P.414-418.

197. Tachibana C., Yoo J.Y., Tagne J.B., Kacherovsky N., Lee T.I., Young E.T. Combined global localization analysis and transcriptome data identify genes that are directly coregulated by Adrl and Cat8 // Mol Cell Biol. 2005. V.25. P.2138-2146.

198. Taheri N., Kohler T., Braus G.H., Mosch H.-U. Asymmetrically localized Bud8p and Bud9p proteins control yeast cell polarity and development // EMBO J. 2000. V.19. P.6686-6696.

199. Ter-Avanesyan M.D., Zimmermann J., Inge-Vechtomov S.G., Sudarikov A.B., Smirnov V.N., Surguchov A.P. Ribosomal recessive suppressors cause a respiratory deficiency in yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol.Gen.Genet. 1982. V.185. P.319-323.

200. Teunissen A.W., Holub E., van der Hucht J., van den Berg J.A., Steensma H.Y. Sequence of the open reading frame of the FLOl gene from Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1993. V.9. P.423-427.

201. Teunissen A.W., Steensma H.Y. Review: the dominant flocculation genes of Saccharomyces cerevisiae constitute a new subtelomeric gene family // Yeast. 1995. V.ll. P.1001-1013.

202. Thomas G., Hall M.N. TOR signalling and control of cell growth // Curr.Opin.Cell Biol. 1997. V.9. P.782-787.

203. Tikhomirova V.L., Inge-Vechtomov S.G. Sensitivity of sup35 and sup45 suppressor mutants in Saccharomyces cerevisiae to the anti-microtubule drug benomyl // Curr.Genet. 1996. V.30. P.44-49.

204. Toda T., Cameron S., Sass P., Zoller M., Wigler M. Three different genes in S. cerevisiae encode the catalytic subunits of the cAMP-dependent protein kinase // Cell. 1987b. V.50. P.277-287.

205. Travers K.J., Patil C.K., Wodicka L., Lockhart D.J., Weissman J.S., Walter P. Functional and genomic analyses reveal an essential coordination between the unfolded protein response and ER-associated degradation // Cell. 2000. V.101. P.249-258.

206. Uchida N., Hoshino S., Imataka H., Sonenberg N., Katada T. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation // JBiolChem 2002. V.277. P.50286-50292.

207. Udenfriend S., Kodukula K. How glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane proteins are made // Annu.Rev.Biochem. 1995. V.64. P.563-591.

208. Uno I., Mitsuzawa H., Tanaka K., Oshima T., Ishikawa T. Identification of the domain of Saccharomyces cerevisiae adenylate cyclase associated with the regulatory function of RAS products // Mol.Gen.Genet. 1987. V.210. P. 187194.

209. Vallen E.A., Hiller M.A., Scherson T.Y., Rose M.D. Separate domains of KAR1 mediate distinct functions in mitosis and nuclear fusion // J Cell Biol. 1992. V.117. P.1277-1287.

210. Valouev I.A., Kushnirov V.V., Ter Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation // Cell Motil.Cytoskeleton. 2002. V.52. P. 161-173.

211. Vogel J.P., Misra L.M., Rose M.D. Loss of BiP/GRP78 function blocks translocation of secretory proteins in yeast // J Cell Biol. 1990. V.l 10. P. 18851895.

212. Wang P.J., Huffaker T.C. Stu2p: A microtubule-binding protein that is an essential component of the yeast spindle pole body // J.Cell Biol. 1997. V.139. P.1271-1280.

213. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., Peltz S.W. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts // EMBO J. 2001. V.20. P.880-890.

214. Watanabe M., Watanabe D., Nogami S., Morishita S., Ohya Y. Comprehensive and quantitative analysis of yeast deletion mutants defective in apical and isotropic bud growth // Curr.Genet. 2009. V.55. P.365-380.

215. Welihinda A.A., Kaufman R.J. The unfolded protein response pathway in Saccharomyces cerevisiae. Oligomerization and trans-phosphorylation of Irelp (Ernlp) are required for kinase activation // J.Biol.Chem. 1996. V.271. P.18181-18187.

216. Wellington M., Kabir M.A., Rustchenko E. 5-fluoro-orotic acid induces chromosome alterations in genetically manipulated strains of Candida albicans II Mycologia. 2006. V.98. P.393-398.

217. Wells S.E., Hillner P.E., Vale R.D., Sachs A.B. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors // MolCell. 1998. V.2. P.135-140.

218. Wiame J.M., Grenson M., Arst H.N., Jr. Nitrogen catabolite repression in yeasts and filamentous fungi // Adv.Microb.Physiol. 1985. V.26. P.l-88.

219. Wilson P.G., Culbertson M.R. SUF12 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors // J.Mol.Biol. 1988. V.199. P.559-573.

220. Yoshida J., Umezu K., Maki H. Positive and negative roles of homologous recombination in the maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2003. V.164. P.31-46.

221. Zahner J.E., Harkins H.A., Pringle J.R. Genetic analysis of the bipolar pattern of bud site selection in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1996. V.16. P.1857-1870.

222. Zarzov P., Mazzoni C., Mann C. The SLT2(MPK1) MAP kinase is activated during periods of polarized cell growth in yeast // EMBO J. 1996. V.15. P.83-91.

223. Zavialov A.V., Buckingham R.H., Ehrenberg M. A post-termination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3 // Cell. 2001. V.107. P.l 15-124.

224. Zhouravleva G., Alenin V., Inge-Vechtomov S., Chernoff Y. To stick or not to stick: Prion domains from yeast to mammals // 2002. P. 185-218.

Информация о работе

Петрова, Александра Владиленовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы