Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прионный детерминант (PSI + ) дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кочнева-Первухова, Наталья Владимировна

Результаты исследования эффективности индукции [PSf] при сверхэкспрессии белков, кодируемых различными аллелями SUP35, показывают, что их прионогенная способность сильно зависит от структуры используемого для индукции белка. Из данных Табл. 5 следует, что короткие N-концевые фрагменты Sup35p обладают более высокой внутренней способностью к прионному конформационному переходу, чем содержащие хотя бы часть С-концевой последовательности. Эта способность, очевидно, столь высока, что сверхэкспрессия как таковая для эффективной индукции не нужна. Уровень белка, в 15 раз меньший хромосомно-кодируемого, в случае аллели sup35-Nl достаточен для высокоэффективной индукции \PSf\ de novo. Центромерная плазмида, кодирующая белок Sup35N2p, уровень экспрессии которого ничтожен, тем не менее с некоторой частотой индуцирует [PSf].

Учитывая низкие уровни экспрессии белков Sup35Nlp и Sup35N2p, можно заключить, что их способность к прионной конверсии в [Р5/] форму гораздо выше по сравнению с более длинными белками Sup35p, чем следует из простого подсчета числа [PSf] цитодуктантов - с учетом нормировки на уровень белка эффективность индукции [PS1/] de novo для белка Sup35pNlp превышает эффективность индукции [PSf] полным белком Sup35p в 20 тысяч раз (Табл. 5). При этом следует учитывать и то, что белки Sup35Nlp и Sup35N2p даже в [pin] штамме способны к прионному переходу, а значит, до известной степени накапливаются в клетке. Следовательно, их реальные уровни в трансформантах штамма 5V-H19 [pin] еще ниже, а эффективность индукции [Р5/] de novo в сравнении с полным белком - еще выше.

Процесс образования [Pi/] состоит, очевидно, из двух стадий: (а) образование [PSf] зерен и (б) дальнейшая конверсия основной части Sup35p, ведущая к инактивации белка вследствие его агрегации, и, соответственно, к супрессорному фенотипу. Ранее было показано, что при конверсии in vitro фрагменты Sup35p, лишенные частично или полностью С-концевой последовательности, конвертируют белок Sup35p в \PSf} форму менее эффективно, нежели полный белок (Paushkin et al., 1997b). Следовательно, сверхэффективное образование [Р5/] под влиянием коротких N-концевых фрагментов Sup35p должно объясняться их повышенной способностью к образованию [PSf] зерен. По-видимому, С-концевая часть молекулы Sup35p стабилизирует N-концевую в нормальном неприонном состоянии и препятствует ее спонтанному переходу в прионную конформацию либо мешает взаимодействию N-доменов, возможно, необходимому для инициации прионного перехода. Сходным образом, для Ure2p при делеции лишь нескольких аминокислот с С-конца белка образование de novo детерминанта \URE3\ при трансформации мультикопийными плазмидами, несущими соответствующую аллель гена URE2, резко увеличивается (Masison and Wickner, 1995).

Основываясь на вышеизложенном, можно предложить гипотезу о том, что образование детерминанта [PSf] de novo в норме инициируется малыми количествами коротких N-концевых фрагментов Sup35p вследствие протеолитической деградации белка Sup35p дикого типа. Сходным образом при болезни Альцхеймера образование амилоида р 1 -40, схожего с амилоидом PrPSc, может быть стимулировано малыми количествами очень быстро агрегирующих вариантов pi-42 или Р1 -43, которые образуются в следовых количествах при анормальном С-терминальном протеолизе (Jarret and Lansbury, 1993).

Факторы, влияющие на процесс протеолитической деградации Sup35p, могут влиять на частоту появления [PSf] de novo в дрожжах. Таким фактором может являться, например, детерминант природа которого к настоящему моменту пока не установлена.

2. Sup35p и Sup45p: взаимодействие белков в свете прионной конверсии

Сверхэкспрессия Sup35p или тех его вариантов, что вызывают образование [PSf \ de novo при сверхэкспрессии в [psi] клетках, в [PST] клетках ведет к угнетению роста (Dagkessamanskaya and Ter-Avanesyan, 1991; Chemoff et al, 1993; Ter-Avanesyan et al., 1993). В [PSf] клетках Sup35p накапливается в виде высокомолекулярных агрегатов (Paushkin et al., 1996; Patino et al., 1996), и уровень его функционально активной растворимой формы при этом сильно снижается. Для роста клеток может быть вредно либо накопление агрегатов Sup35p само по себе, либо истощение функционально активного Sup35p в результате агрегации. Предположению о токсичности для клетки агрегатов Sup35p противоречит, однако, то, что в штамме 1-5V-H19 как Sup35p, так и его производные, укороченные с С-конца, при сверхэкспрессии переходят в [PSf] форму и накапливаются в виде агрегатов, но никакого угнетения роста не наблюдается.

Но существует и еще одна возможность. Sup35p образует комплексы с другим фактором терминации трансляции - Sup45p (Stansfield et al., 1995). Sup45p - это дрожжевой аналог eRPl, в то время как Sup35p - аналог eRF3 (Zhouravleva et al., 1995). Угнетение роста [PSf] клеток в случае избытка Sup35p может объясняться не истощением его самого, а истощением Sup45p, который вследствие связывания с ним переходит из раствора в агрегированную форму (Paushkin et al., 1997а) и, таким образом, перестает быть функциональным.

Эксперименты показывают, что увеличение количества белка Sup45p снимает токсический эффект избытка Sup35p. Результат этот может быть оценен двояко - как восполнение нехватки Sup45p за счет увеличения его количества; либо как восполнение нехватки Sup35p (если следовать модели угнетения при истощении функционально активного Sup35p) за счет перехода его в растворимую форму вследствие связывания с избытком Sup45p.

В предыдущем разделе обсуждалось, что длина белкового фрагмента, подвергающегося прионной конверсии, может сама по себе быть существенным фактором, влияющим на эффективность процесса. Предположение о стабилизации прионного домена остальной частью молекулы в неприонном состоянии высказывалось как для Sup35p, так и для Ure2p. Но стабилизация Sup35p в неприонной форме может быть связана также с влиянием других белков, связывающихся с Sup35p и препятствующих его переходу в прионное состояние. При этом эффект от делеций в С-концевой части молекулы Sup35p может быть обусловлен (по крайней мере частично) потерей расположенных там сайтов взаимодействия с такими белками.

Одним из таких стабилизаторов, вероятно, является Sup45p. Сверхэкспрессия Sup45p ингибирует процесс образования [PS/] de novo под воздействием аллели, кодирующей белок, обладающий сайтом связывания с Sup45p (Sup35NMp), но очень мало влияет на прионообразование в случае белка, лишенного такого сайта (Sup35Nlp) (Derkatch et al, 1998; раздел 2.2. Результатов).

Sup45p может либо стабилизировать нормальную [psf] конформацию Sup35p (прионообразующий участок Sup35p может перекрываться с одним из сайтов связывания с Sup45p, расположенном в N-концевой части белка (Paushkin et al, 1997а)), либо служить пространственной помехой Sup35p-Sup35p взаимодействиям, требующимся для инициации процесса конверсии.

Следует заметить, что связывание с Sup45p лишь ингибирует процесс прионного перехода Sup35p, но не останавливает его совершенно, поскольку Sup45p включается в [PSf'\ клетках в агрегаты, образованные белком Sup35NMp, имеющим N-концевой сайт для связывания Sup45p (Paushkin et al., 1997a). Вероятнее всего, Sup45p оказывает ингибирующее влияние на стадии образования первичного «зерна» агрегации, но мало влияет на процесс дальнейшей репликации детерминанта [PSf], поскольку в противном случае сверхэкспрессия Sup45p в [Р5/] клетках приводила бы с некоторой частотой к появлению [psi~\ клеток, чего никогда не наблюдается.

3. Механизм элиминации [PSf] детерминанта под влиянием точечной мутации в гене SUP35.

Аллели SUP35 с 5'-концевыми делециями рецессивны в отношении элиминации [PSf] детерминанта (Ter-Avanesyan et al., 1994). Это свойство связано с неспособностью молекул Sup35p, лишенных N-концевой части, взаимодействовать с Sup35pPSI+ молекулами и препятствовать образованию прионных агрегатов (Paushkin etal., 1996).

Мутация SUP35P2, вызывающая аминокислотную замену Gly на Asp в 58 положении в N-концевой части Sup35p (Doel et al., 1994), является доминантной в отношении изгнания [PSf]; диплоиды, гетерозиготные по этой мутации постепенно теряют способность образовывать [PSf] споры в ходе клеточных делений (Doel et al., 1994). Это позволяет предположить, что мутантный белок Sup35P2p обладает противоположными свойствами -способен включаться в Sup35pPSH агрегаты и блокировать либо замедлять их дальнейшее образование.

Сверхэкспрессия Sup35P2p приводит к появлению [PSf ] детерминанта, обладающего всеми основными свойствами, присущими прионам дрожжей, и способного передавать свои свойства в прионном состоянии нормальному белку Sup35p как In vivo (Табл. 13, 14), так и in vitro. Различия в свойствах между Sup35pPSI+ и Sup35P2pPSI+ скорее количественные, нежели качественные. Эффективность индукции аллелями 8иР35Р2щ>ш1ещо вдвое ниже, чем соответствующими аллелями SUP35. В экспериментах по конверсии in vitro (выполненных С.В. Паушкиным), также наблюдалась двукратная разница в скорости конверсии нормального и мутантного белка. Эти данные говорят о том, что мутация SUP35P2siишь снижает эффективность прионного перехода белка Sup35p, но не останавливает его совсем - иначе индукция [PSf] под влиянием сверхэкспрессии Sup35P2p была бы невозможна. В то же время, Sup35P2p включается в Sup35pPSI+ агрегаты с той же эффективностью, что и Sup35p, что доказывает его способность эффективно конкурировать с Sup35p дикого типа за связывание с растущим прионным агрегатом. Очевидно, связавшись с ним, белок Sup35P2p замедляет дальнейшую полимеризацию

Sup35p. Критическим шагом при этом может быть либо конформационная перестройка Sup35P2p, либо присоединение следующей Sup35p (или Sup35P2p) молекулы, а возможно, и то, и другое.

Поддержание [PSf] детерминанта зависит от многих факторов, в том числе от соотношения между скоростью полимеризации Sup35p и растворением образующихся агрегатов под влиянием HSP104p. В некоторых случаях для элиминации [PSf ] достаточно всего лишь двукратного избытка шаперона HSP104p (Chernoff et al, 1995). Таким образом, двукратного уменьшения скорости конверсии Sup35p (которое наблюдалось т vitro и косвенно подтверждается данными индукции in vivo) может быть достаточно для того, чтобы HSP104p в состоянии был растворить все Sup35pPSI+ агрегаты.

Увеличение уровня экспрессии Sup35P2p должно заметно увеличивать скорость его прионной конверсии (скорость конверсии Sup35p пропорциональна концентрациям как прионной, так и нормальной формы белка), и, таким образом, компенсировать пониженную конверсионную способность, что позволяет детерминанту [PSf] поддерживаться.

С пониженной скоростью полимеризации Sup35P2p согласуется также совместимость сверхэкспрессированного белка Sup35P2p с [PSf] состоянием. Сверхэкспрессия в [PSf] штаммах Sup35p дикого типа сильно угнетает рост клеток (по-видимому, из-за снижения уровня растворимого функционального Sup35p и ассоциированного с ним Sup45p до критического уровня). Поскольку аналогичные штаммы, содержащие SUP3SP2 аллель, обладают нормальной жизнеспособностью, у таких штаммов большая порция Sup35p, по-видимому, благодаря замедленной полимеризации находится в растворимой форме.

4. Штаммы [PSf] - индукция и свойства

Известно, что у прионов млекопитающих существуют различные «штаммы» (Prusiner, 1994). У дрожжей S. cerevisiae тоже показано существование различных вариантов цитоплазматического детерминанта [PSf] (Derkatch etal, 1996).

Изоляты [PSf], полученные на одном штамме дрожжей в одинаковых условиях индукции, отличаются по эффективности супрессии нонсенс-мутаций.

Как показывают данные количественных измерений, разница в эффективности супрессии для разных форм \PSf~] весьма велика, в зависимости от стоп-кодона она составляет от 7 до 20 раз. Отличия в супрессии не зависят от генотипического фона штамма-хозяина, а являются свойством самого детерминанта. Выраженность фенотипа штаммов [PSf] коррелирует с их митотической стабильностью: более эффективно супрессирующие нонсенс-мутации штаммы [PSf] более стабильно наследуются.

Исходя из «полимеризационной» модели прионоподобного превращения белка Sup35p, можно предположить, что соотношение между мономерами и агрегированной формой белка Sup35p зависит от скорости конверсии нормальной формы в прионное состояние. Белок Sup35p может образовывать агрегаты, отличающиеся по укладке белка внутри агрегата. В зависимости от их структуры сродство мономеров Sup35p к таким агрегатам может быть разным. Более высокое сродство ведет к более активной сорбции молекул Sup35p, к уменьшению количества растворимого белка и значит, к более эффективной супрессии. В то же время при высоком сродстве молекул Sup35p к [PSf] агрегатам прионный переход должен происходить более эффективно и приводить к более стабильному наследованию [Р571"] фенотипа.

С этими рассуждениями согласуется и то, что «слабый» \PSf] лучше совместим с мультикопийными плазмидами, содержащими SUP35, чем «сильный». Менее эффективный переход [Р*?/] с такой конформацией из раствора в агрегаты, по-видимому, оставляет в растворимом состоянии количество белка, достаточное для нормального существования клетки. Повышенная агрегация Sup35pPSI+ «сильного» типа приводит к тому, что он плохо совместим даже с небольшим избытком Sup35p, как демонстрируют данные по поведению в различных штаммах [Pi1/] центромерных плазмид с SUP35 vi sup35-N2.

С существованием штаммов лучше согласуется «полимеризационная» модель, нежели «гетеродимерная», поскольку последняя предполагает стабильное поддержание мономеров Sup35p в различных конформациях в течение многих циклов прионообразования; а в рамках «полимеризационной» различные конформации белка существуют внутри агрегата, где могут быть стабилизированы межмолекулярными взаимодействиями. Вероятно, могут существовать множественные формы пространственной укладки молекул в [PSf] агрегатах - предполагается наличие по меньшей мере трех различных форм, поскольку [PSf] штамма 5V-H19 отличается от полученных de novo [-PaS/] изолятов как с высокой, так и с низкой эффективностью супрессии.

Биохимические данные подтверждают различия между «штаммами» [PSf] - «слабые» [PSf] демонстрируют пониженную степень агрегации (данные получены М.Б. Чеченовой; аналогичные данные получены Zhou etal.,( 1998)).

В зависимости от условий индукции [PSf] соотношение [PSf] производных разного типа может быть различным. Стоит заметить, что в условиях, когда индукция [Р5/] протекает легко и дает высокий процент {PSf ] -содержащих клеток, образуются преимущественно [Р5/] изоляты с низкой эффективностью супрессии. Сверхэкспрессия N-концевых фрагментов Sup35p приводит преимущественно к появлению [PSf] «слабого» типа, индукция полным белком или его вариантами, лишь незначительно укороченными с С-конца, дает гораздо большее количество «сильных» [PSf]. Соотношение вновь образующихся [Р5/] производных различного типа зависит также от наличия еще одного цитоплазматического детерминанта - [PUf], влияющего на способность зарождения детерминанта [PSf]. Присутствие [PJlf] детерминанта, по всей видимости, облегчающего процесс перехода молекул Sup35p в прионную форму, способствует образованию преимущественно [PS/] со слабой супрессией.

Возможно, что для белков Sup35p с разной структурой предпочтительные конформации в прионном состоянии могут различаться. Прионный переход может быть для одних белков более выгоден энергетически при образовании [PSf] формы со слабыми супрессорными свойствами, а для других - с сильными. При этом облегчать, или наоборот, затруднять процесс перехода в ту или иную пространственную конформацию может связывание белков Sup35p с другими белками. Наличие или отсутствие у различных белков Sup35p, используемых для индукции [PSf], таких сайтов может существенным образом влиять на спектр образующихся de novo [Z^/] вариантов.

Количество различных форм [PSf] детерминанта, как и количество разных штаммов PrPSc, может быть, по-видимому, достаточно велико. Возможности используемых нами систем детекции ограничены, и это, вероятнее всего, ведет к тому, что часть штаммов не попадает в наше поле зрения. Но даже система, использующая два [ PSf] - с у пресс ируемых маркера -ade2-l и lysl - позволяет обнаружить несколько различных эффективности и специфичности супрессии видов [ЛУ/]. Группа [PSf] производных, объединенных под именем «слабых» [Р5/], также очевидно гетерогенна - об этом говорят данные по их стабильности и уровню супрессии, свидетельствующие о наличии по крайней мере трех подклассов.

Один из таких подклассов обладает особенно интересными свойствами, и ранее не был описан. Он свидетельствует о том, что некоторые конформации Sup35pPS1+ могут быть нестабильными. На это указывает появление при индукции de novo [PSf] изолятов со слабой супрессией, склонных к самопроизвольному переходу в форму с сильной супрессией. Вероятно, [jRS"/] агрегаты, образующиеся в этом случае, энергетически неустойчивы, а потому склонны к переходу в более выгодную энергетически и стабильную форму. При индукции de novo N-концевыми фрагментами Sup35p, учитывая очень высокие уровни индукции [PSf] N-концевыми фрагментами вообще, можно предположить, что часть образующихся «слабых» [PSf] представляет собой нестабильную форму, постепенно переходящую в [Р5/] «сильного» типа, и та небольшая доля «сильных» [PSf], которые образуются при индукции N-концевыми фрагментами Sup35p, получается из нестабильных «слабых» [PSf].

5. [PSf] P. methanolica и S. cerevisiae: сходство и различие.

N-концевые последовательности генов SUP35 P. methanolica и S. cerevisiae сильно различаются между собой (Kushnirov et al, 1990). Тем не менее, N-домен Sup35p P. methanolica также, как и S. cerevisiae, способен к прионному переходу. Таким образом, у дрожжей обнаружена еще одна прионогенная последовательность и показана эволюционная консервативность прионных свойств белка Sup35p у дрожжей - что свидетельствует в пользу биологического значения [PSI^.

PSf] P. methanolica обладает основными свойствами обычного детерминанта [PSf]: он цитоплазматически наследуется, излечивается низкими концентрациями GuHCl, его образование связано с агрегацией белка Sup35p и ухудшением терминации трансляции, ведущим к супрессии нонсенс-мутаций. [PSf] P. methanolica присуща также еще одна черта, характеризующая обычный [PSf]: наличие разных штаммов. Эта особенность, найденная первоначально у РгР, является, возможно, общим свойством всех белков с прионными свойствами и отражает их способность существовать в различных альтернативных конформациях.

Однако искусственный химерный вариант [PSf], исследованный нами ([P5/ps]), обладает рядом существенных отличий от обычного [PSI}. Прежде всего, обращает на себя внимание то, что разные штаммы \PSf\ S. cerevisiae распадаются на несколько четко очерченных классов (см. раздел 4 Обсуждения), и стабильность детерминанта коррелирует с присущей ему эффективностью супрессии нонсенс-мутаций. Однако у [PST^s] эти две характеристики совпадают не всегда. Исследованный нами изолят #4 обладает низким уровнем супрессии, но его митотическая стабильность даже выше, чем у клона #1, обладающего гораздо более высоким уровнем супрессии (Табл. 19).

Другой особенностью [Z'.S'/ps] является его пониженная стабильность вообще. Даже наиболее стабильные из [ilS'/ps], изученных нами, постепенно терялись в процессе клеточных делений; штаммов с митотической стабильностью, близкой к 100% (подобно «сильным» [PSF] S. cerevisiae) у них не наблюдалось вовсе. Еще выше митотическая нестабильность [PS/^\ у диплоидов, гетерозиготных по химерному гену SUP35PS - у различных диплоидов она составляет от 20 до 85%.

Эти особенности [jP5/ps] могут отражать индивидуальные особенности N-домена Sup35Pp. Возможно также, что высокая стабильность прионного состояния зависит не только от прионных свойств данного белка, но и от существования каких-то высокоспецифичных механизмов, влияющих на образование и стабильность обычного [PSf~\, но не [PS/ps]. Показано, к примеру, что N-домен Sup35p S. cerevisiae, но не P. methanolica взаимодействует с одним из белков цитоскелета, Slalp, что увеличивает стабильность [Pi*/] S. cerevisiae(Bailleul etal., 1999).

Еще одно отличие [P^/ps] от обычного [PSf] - белок Hspl04p, шаперон, связанный с поддержанием [PSf] детерминанта, влияет на них по-разному.

Делеция HSP104 в случае [AS/psL так же как и в случае [PSf] S. cerevisiae, приводит к утрате детерминанта. Аналогично, сверхэкспрессия Hspl04p [i^/ps] штаммах, как и в случае [PSf] S. cerevisiae, приводит к постепенной потере детерминанта. Однако в случае [i^/ps] есть два важных отличия. Во-первых, потеря происходит с заметной скоростью лишь в случае «слабых» [PIS/ps] штаммов. Во-вторых, в противоположность [PSf] S. cerevisiae, это не сопровождается появлением антисупрессорного эффекта.

Согласно одной из моделей действия Hsp 104р на [PSf] детерминант, он вызывает дробление Sup35pPSI+ агрегатов на более мелкие, что обеспечивает стабильное наследование их при передаче в дочерние клетки. Слишком малое количество Hspl04p приводит к тому, что Sup35pPSI+ образует малое количество крупных агрегатов, которые не попадают в дочерние клетки (что объясняет известный эффект излечивания [ЛУ/] детерминанта в результате делеции гена Hspl04), а при слишком высоких растворение агрегатов идет столь интенсивно, что Sup35pPSI+ в клетках становится недостаточно для эффективного наследования. Первой стадией действия Hspl04p является переход части Sup35p в растворимую форму, что ведет к улучшению терминации трансляции и, как следствие, антисупрессорному эффекту.

Неизвестно, однако, каков должен быть размер агрегата Sup35pPSI+, чтобы он обеспечивал эффективную конверсию Sup35p в [PSt\ форму. Возможно, результатом действия Hspl04p на Sup35ppsl+ 5. cerevisiae являются мономеры, активные функционально в отношении терминации, результатом действия на Sup35PSpPSI+ - более крупные образования, неспособные служить затравкой прионоподобной конверсии, но неспособные также и эффективно терминировать трансляцию.

Другое возможное предположение - участие в процессе растворения Sup35pPSI+ двух различных шаперонов - Hspl04p и какого-то другого белка, функция которого - дробить до мономеров Sup35p сравнительно крупные образования, получающиеся в результате действия Hspl04p, либо реактивировать получающиеся под действием Hspl04p мономеры. Показано, что Hspl04p сам по себе неспособен реактивировать денатурированные агрегированные белки - для этого требуется участие шаперонов Hsp70 и Hsp40

Glover and Lindquist, 1998). Это же может быть справедливо и в отношении прионных агрегатов. Hsp70 и Hsp40 могут хуже узнавать [PSfp$], чем [PSf],

Еще одним отличием между обычным [PSf] и [PSfps] является то, что последний не подвержен влиянию [.PZV1"] детерминанта, поскольку индукция [.PSfps\ при сверхэкспрессии соответствующего белка происходит как в [PlPf], так и {pin] штаммах. Правда, эффективность этой индукции в случае [PIH] штаммов выше, однако подобный же эффект наблюдается при индукции [PSf\ N-концевыми фрагментами белка Sup35p (которые, как известно, способны индуцировать [PSf] и в [PJlf], и в [pin] штаммах).

6. Преодолим ли межвидовой барьер между [PSf] P. mcthanoliса и S. cerevisiae?

Может ли понятие «межвидовой барьер», используемое для обозначения затрудненной передачи прионных заболеваний между разными видами, применено к прионам низших эукариот? Сходство последовательностей между N-концевыми доменами Sup35p у S. cerevisiae и Р. methanolica значительно ниже (меньше 40%) (Kushnirov et al, 1990), чем сходство последовательностей в семействе РгР, что должно уменьшить вероятность межвидовой прионной конверсии.

В нашей работе изучался гибридный белок Sup35PSp, содержащий С-концевой домен белка из S. cerevisiae, и N-концевой домен белка из Р. methanolica. Многие данные свидетельствуют о том, что между Sup35p и Sup35PSp невозможен перенос прионных свойств ни в том, ни в другом направлении. Гетерозиготные SUP35/SUP35PS диплоиды, содержащие как [PSf], так и [PSfps], проявляют антисупрессорный фенотип. Это указывает на то, что прионная форма одного белка не может индуцировать конверсию другого белка в прионное состояние. Это подтвердил биохимический анализ путем центрифугирования клеточных лизатов: в агрегированной форме в обоих случаях находился только белок Sup35p, соответствующий содержащемуся в диплоиде [PSf]. К тому же выводу приводит изучение конверсии in vitro: перекрестной конверсии между прионной и не-прионной формами Sup35p и Sup35PSp не наблюдалось (данные получены М.Б. Чеченовой).

С другой стороны, репликация как [.PS1/], гак и \PSf ps] не ингибируется в присутствии гетерологичного белка и, следовательно, протекает независимо друг от друга. Эти белки при совместной экспрессии в одной клетке способны независимо поддерживать каждый свое прионное состояние. Независимость [Л5/>5'] и [Р5Г] друг от друга была также продемонстрирована при изучении гетерозиготного SUP35/SUP35PS диплоида, содержащего оба детерминанта. Антисупрессорный фенотип такого диплоида можно объяснить именно независимостью прионной конверсии обоих Sup35p белков. В [PSt\ клетках должно поддерживаться равновесие между растворимой и агрегированной формой Sup35p, которое зависит от различных факторов (скорость синтеза Sup35p, способ укладки белковых мономеров в агрегатах, уровень факторов, влияющих на растворение этих агрегатов (Paushkin et al, 1996; Patino et al., 1996)). В диплоидах, содержащих два белка Sup35p, конверсия которых в [PSf~[ форму протекает независимо друг от друга, суммарное количество белков в растворимой (а следовательно, функционально активной) форме может быть даже в [/$/"] клетках достаточным, чтобы эффективно осуществлять терминацию трансляции, что приводит к антисупрессорному фенотипу.

Однако в другой серии экспериментов (раздел 6.4. Результатов) было показано, что сверхэкспрессия Sup35Pp (полного белка P. methanolica) может вызывать индукцию de novo [.PSt] S. cerevisiae. Таким образом, эти данные противоречат друг другу. Следует, однако, подчеркнуть, что данные раздела 6.2., говорящие об отсутствии переноса прионного состояния, получены для гибридного белка Sup35PSp, а данные раздела 6.3.- для белка Sup35Pp. При сверхэкспрессии гибридного белка Sup35PSp индукции [PSf] не наблюдалось. Более того, индукцию не вызывала и сверхэкспрессия N-домена белка Sup35Pp, взятого отдельно - только сверхэкспрессия полноразмерного белка.

Чтобы объяснить возможность индукции [PSf] при сверхэкспрессии Sup35p P. methanolica, требуются специальные предположения. Например, Sup35p P. methanolica может, находясь в избытке, титровать какие-то белки, в норме связанные с Sup35p и предотвращающие его конверсию в [PSf] форму. Поскольку ни N-концевая часть Sup35Pp, ни Sup35PSp не способны вызвать при сверхэкспрессии появление [PSf] формы Sup35p, связывание Sup35p с белками, ингибирующими его прионную конверсию, вероятно, осуществляется через Сдомен. Сверхэкспрессия Sup35p в штамме с хромосомно кодируемым Sup35PSp не приводит к появлению [PSf ps[, поэтому можно предположить, что эти ингибиторы обладают большим сродством к С-домену Sup35p P. methanolica, чем S. cerevisiae.

Природа подобных ингибиторов в настоящее время неизвестна, но в разделе 2 Обсуждения уже рассматривался один кандидат на эту роль - Sup45p, избыток которого ингибирует индукцию [iV/] de novo. Известны и другие дрожжевые белки, взаимодействующие с Sup35p: к примеру, Upflp (Czaplinski etal., 1998) и Slalp (Bailleulef а/., 1999).

Вывод о существовании ингибиторов прионного перехода, взаимодействующих с С-доменом Sup35p, хорошо согласуется с тем, что вероятность возникновения [PSf] существенно повышается в присутствии коротких N-концевых фрагментов Sup35p, неспособных взаимодействовать с белками, стабилизирующими полноразмерный Sup35p в неприонной форме (см. Раздел 1 Обсуждения).

7. Заключение

В ходе работы были исследованы факторы, влияющие на индукцию детерминанта [PSf] de novo, а также на его поддержание в клетках дрожжей. Было показано, что С-концевая часть белка Sup35p, отвечающая за его участие в терминации трансляции, одновременно является ингибитором перехода N-концевой части белка в прионную форму, и высказано предположение, что процесс прионного перехода инициируется появлением коротких N-концевых фрагментов белка вследствие его протеолитической деградации. Продемонстрировано, что один из белков, участвующих в терминации трансляции и образующий комплекс с Sup35p, Sup45p, при сверхэкспрессии ингибирует индукцию [PSf] de novo, хотя не его репликацию в дрожжевых клетках. Впервые показано, что влияние на индукцию детерминанта [PSf] de novo другого цитоплазматического фактора дрожжей, \PIlf], является не только качественным, но и количественным, а также, что два эти фенотипа можно разделить. Исследовано поведение мутантного белка Sup35P2p, имеющего другую кинетику перехода в прионную форму, и показано, что различия между

Sup35p и Sup35P2p являются скорее количественными, нежели качественными. Подобная система может служить удобной экспериментальной моделью для изучения кинетики прионного перехода с целью разработки возможных терапевтических подходов к лечению прионных заболеваний. Изучены свойства различных изолятов [PS/], возникающих при индукции de novo («штаммов») и показано, что соотношение их зависит от условий индукции: на него влияет наличие С-концевой части в белке Sup35p, с помощью которого осуществляется индукция, и наличие либо отсутствие цитоплазматического детерминанта [Р/ДА]. Показано существование прионных свойств у N-концевого домена белка Sup35p дрожжей P. methanolica, таксономически далеких от S. cerevisiae, что может свидетельствовать о том, что детерминант [PS/] имеет адаптивную ценность. Показано, что гибридный детерминант [PS/ps] обладает всеми свойствами дрожжевого приона, но по ряду параметров отличается от [PSf]. Продемонстрировано также наличие межвидового барьера между S. cerevisiae и P. methanolica - белки Sup35p обоих этих видов в прионной форме не могут передавать свои свойства гетерологичному белку.

Дрожжи S. cerevisiae могут быть использованы в качестве модельного объекта для изучения общих механизмов, присущих прионам как явлению, что значительно облегчает исследование прионов, поскольку дрожжи представляют собой наиболее удобный для генетического анализа эукариотический организм. Работа посвящена исследованию закономерностей, лежащих в основе появления в клетке и размножения дрожжевого приона [Р5У1"]. Эти закономерности могут прояснить и механизмы, лежащие в основе возникновения и репликации прионов высших эукариот. Работа открывает также перспективы изучения некоторых механизмов эпигенетической наследственности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочнева-Первухова, Наталья Владимировна, Москва

1. З.Захаров, И.А., Кожин, С.А., Кожина, Т.Н. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. JI., Наука. - 1984. - 144с.

2. Инге-Вечтомов, С. Г., Андрианова, В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. // Генетика. 1970. - Т. 6. - С. 103-115.

3. Покровский, В.И., Киселев, О.И. Молекулярные основы прионных болезней. // Вестник РАМН. 1998. - Т. 10. - С. 45-55.

4. Aguzzi, A., and Weissmann, С. Prion research: the next frontiers. //Nature. -1997. -V. 389. P. 795 -798.

5. Bessen, M.A., and Marsh, R.F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 7859-7868.

6. Bessen, M.A., Kocisko, D.A., Raymond, G.J., Nandan, S., Lansbury, P.T., and Caughey, B. Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein. //Nature. 1995. - V. 375. - P. 698-700.

7. Broach, J.R., Strathern, J.N., Hicks, J.B. Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of CAN I gene. И Gene. 1979. -V. 8. - P. 121-127.

8. Bueler, H., Fischer, M., Lang, Y., Bluethmann, H., Lipp, H.-P., DeArmond, S.J., Prusiner, S.B., Aguet, M., and Weissmann, C. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. //Nature. 1992. - V. 356. - P. 577-582.

9. Casabadan, M.J., Martinez-Arias, A., Shapira, S.K., Chou, J. (3-galactosidase gene fusions for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. // Methods. Enzymol. 1983. - Y. 100. - P. 293-308.

10. Caughey, В., Kocisko, D.A., Raymond, G.J., and Lansbury, P.T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. // Chem. Biol. 1995. -V. 2. - P. 807-817.

11. Cesareni, G., Murray, A.H. Plasmid vectors carrying the replication origin of filamentous single-stranded phages. In Setlow, J.K. (ed.), Genetic Engineering: Principles and Methods. 1987. Vol. 4. Plenum Press, New York, NY, pp. 135-154.

12. Chernoff, Y.O., Derkach, I.L., Inge-Vechtomov, S.G. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of /«/-like factors in the yeast Saccharornyces cerevisiae. // Curr. Genet. 1993. - V. 24. - P. 268-270.

13. Chernoff, Y.O., Lindquist, S., Ono, B.-I., Inge-Vechtomov, S.G., Liebman, S.W. Role of chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSf. // Science. 1995. - V. 268. - P. 880-884.

14. Chernoff, Y.O., Newnam, G.P., Kumar, J., Allen, K., Zink, A.D. Evidence for a «protein mutator» in yeast: Role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability and toxicity of the PS/. prion. // Mol. Cell Biol. 1999. - V. 19. -P. 8103-3112.

15. Cohen, F.E., Pan, K.-M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R.J., and Prusiner, S.B. Structural clues to prion replication. It Science. 1994. - V. 264. - P. 530-531.

16. Collinge, J., Sidle, K.C.L., Meads, J., Ironside, J., and Hill, A.F. Molecular analysis of prion strain variation and the aethiology of «new variant» of CJD. // Nature. 1996. - V. 383. - P. 685-690.

17. Conde, J., Fink, G.R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. - P. 3651-3655.

18. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterocaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.//Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1997. - V.94. - P.9773-9778.

19. Cox, B.S. T, a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. // Heredity. 1965. - V. 20. - P. 505-521.

20. Cox, B.S., Tuite, M.F., McLaughlin, C.S. The ¥ factor of Yeast: a problem in inheritance.// Yeast. 1988. - V. 4. - P. 159-178.

21. Dagkessamanskaya, A.R., Ter-Avanesyan, M.D. Interaction of yeast omnipotent suppressors SUP1(SUP45) and SUP2(SUP35) with non-Mendelian factors.// Genetics. -1991. V. 128. - P. 513-520.

22. Dai, H., Tsay, S.-H., Lund, P.M., Cox, B.S. Transformation of psf. S. cerevisiae to [PS*/] with DNA co-purified with 3 pm circles. // Curr. Genet. 1986. -V. 11. - P. 79-82.

23. DebBurman, S.K., Raymond, G.J., Caughey, В., Lindquist, S. Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. - 94. - P. 13938-13943.

24. DePace, A.H., Santoso, A., Hillner, P., Weissman, J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion. //Cell. 1998. - V. 93.-P. 1241-1252.

25. Derkach, I.L., Chernoff, Y.O., Kushnirov, V.V., Inge-Vechtomov, S.G., Liebman, S.W. Genesis and variability of PS1/. prion factors in S. cerevisiae. H Genetics. 1996. -V. 144. - P. 1375-1386.

26. Derkatch, I.L., Bradley, M. E., Zhou, P., Chernoff, Y.O., Liebman, S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PS1/. prion in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1997. - V. 147. - P. 507-519.

27. Derkatch, I.L., Bradley, M.E., Liebman, S.W. Overexpression of the SUP45gene encoding a Sup35p binding protein inhibits the induction of the de novoappearance of the PS"/. prion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 2400-2405.

28. Doel, S.M., McCready, S.J.,Nierras, C.R., Cox, B.S. The dominant PNM2" mutation which eliminates the lF factor of S. cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP3Sgene. // Genetics. 1994. - V. 137. - P. 659-670.

29. Firoozan, M., Grant, C.M., Duarte, J.A., Tuite, M.F. An in vivo assay for readthrough of chain termination codons in Saccharomyces cerevisiae. // Yeast. -1991. -V. 7. P. 173-183.

30. Frazer, H., and Dickinson, A.G. Scrapie in mice. Agent-strain differences in the distribution and intensity of grey matter vacuolation. // J. Сотр. Pathol. 1973. -V. 83.-P. 29-40.

31. Gajdusek D.C. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru. // Science. 1977. - V. - 197. - P. 943-960.

32. Gajdusek, D.C., Gibbs, C.J., Alpers, M. Experimental transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees.// Nature. 1966. - V.209. - P.794-796/

33. Gibbs, C.J., Gajdusek, D.C., Asher, D.M., Alpers, M.P., Beck, E., Daniel, P.M., Matthews, W.B. Creutzfeldt-Jakob disease (spongiform encephalopathy): transmission to the chimpanzee. // Science. -1968. Y. - 161. - P. 388-389.

34. Gietz R.D., Schiestl, R.H., Willems, A.R., Woods, R.A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. // Yeast. -1995.-V. 11.-P. 355-360.

35. Glover, J.R., Lindquist, S. Hspl04, Hsp70 and Hsp40: a novel protein system that rescues previously aggregated proteins. // Cell. 1998. - V.94. - P.74-82.

36. Glover, J.R., Kowal, A.S., Schirmer, E.C., Patino, M.M., Liu, J.-J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35p, the protein determinant of PS71"., a heritable prion-like factor of 5. cerevisiae. // Cell. 1997. - V. 89. - P. 811-819.

37. Goldring, E.S., Grossman, L.J., Krupnick, D., Cryer, D.R., Marmur, J. The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxycarbolic acid during induction of petites with ethidium bromide. // J. Mol. Biol. 1970. - V. 52. - P. 323-335.

38. Griffith, J.S. Self-replication and scrapie. // Nature. 1967. - V. 215. - P. Ю43-1044.

39. Harrison, P. M., Bamborough, P., Doggett, V., Prusiner, S. В., Cohen, F. E. The prion folding problem. // Curr. Opin. Struc. Biol. 1997. - V. 7. - P. 53 -59.

40. Hill, A.F., Antoniou, M., Collinge, J. Protease-resistant prion protein produced in vitro lacks detectable infectivity.// J. Gen. Virol. 1999. - V. 80. - P. 1114.

41. Horwich, A.L., and Weissman, J.S. Deadly conformations protein misfolding in prion disease. // Cell. - 1997. - V. 89. - P. 499-510.

42. Hsiao, К. K., Scott, ML, Foster, D., Groth, D.F., DeArmond, S.J., and Prusiner, S.B. Spontaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prion protein. // Science. 1990. - V. 250. - P. 1587-1590.

43. Jarret, J.Т., and Lansbury, P.T. Seeding «one-dimentional crystallization of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer s disease and scrapie? // Cell. 1993. -V. 73.-P. 1055-1058.

44. Jones, J., Prakash, L. Yeast Saccharomyces cerevisiae selectable markers in pUC18 poly linkers. // Yeast. 1990. - V. 6. - P. 363-366.

45. Kellershohn, N., Laurent, M. Species barrier in prion diseases: a kinetic interpretation based on the conformational adaptation of the prion protein. // Biochem. J. 1998. - V. 334.-P. 539-545.

46. Kellings, K., Meyer, N., Mirenda, C., Prusiner, S.B., and Reisner. Further analysis of nucleic acids in purified scrapie prion preparation by improved return refocusing gel electrophoresis. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 1025-1029.

47. King, C.-Y., Tittmann, P.,Gross, H., Gebert, R., Aebi, M., Wutrich, K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35p transforms in vitro into amyloid-like filaments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94 - P. - 6618 - 6622.

48. Kocisko, D.A., Come, H.J., Priola, S.A., Chesebro, В., Raymond, G.J., Lansbury, P.T., and Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. //Nature. 1994. - V. 370. - P. 471-474.

49. Korth, C., Stierli, В., Streit, P., Moser, M. Schaller, 0., Fischer, R„ Schulz-Schaeffer, W., Kretzschmar, H., Raeber, A., Braun, U., et al. Prion (PrPSc)-speciific epitope defined by a monoclonal antibody. //Nature. 1997. - V. 389. - P. 74 -77.

50. Kushnirov, V.V., Ter-Avanesyan, M.D., Surguchov, A.P., Smirnov, Y.N. Inge-Vechtomov, S.G. Localisation of possible functional domains in the SUP2 gene product of the yeast 5. cerevisiae. IIFEBS Lett. 1987. - V. 215. - P. 257-260.

51. Kushnirov, V.V., Ter-Avanesyan, M.D., Telcov, M.V., Surguchov, A.P., Smirnov, V.N. Inge-Vechtomov, S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of cerevisiae. 11 Gene. 1988. - V. 66. - P. 45-54.

52. Kushnirov, V.V., Ter-Avanesyan, M.D. Structure and replication of yeast prions. //Cell. 1998. - V. 94. - P. 13-16.

53. Lacroute, F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast. // J. Bacteriol. 1971. - V. 106. - P. 519-522.

54. Laemmli, U. K. cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-689.

55. Lasmezas, C.I., Deslys, D.-J., Demaimay, R., Adjou, K.T., Lamoury, F., Dormont, D., Robain, O., Ornside, J., Hauw, J.-J. BSE transmission to macaques. // Nature. 1996. - V. 381. - P. 743-744.

56. Liebman, S.W., All-Robyn, J.A. A non-Mendelian factor, eta+., causes lethality of yeast omnipotent-suppressor strains.// Curr. Genet. 1984. - V.8. - P.567-573.

57. Lindquist, S. Mad cows meet psi-chotic yeast: the expansion of the prion hypothesis.// Cell. 1997. - V.89. - P.495-498.

58. Manuelidis, L., Sclaviadis, Т., Akowitz, A., and Fritch, W. Viral particles are required for infection in neurodegenerative Creutzfeldt-Jacob disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - У. 92. - P. 5124-5128.

59. Masison, D.C., Wickner, R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of the Ure2p in prion-containing cells. // Science. 1995. - V. 270. - P. 93-95.

60. Meyer, R.K., McKinley, M.P., Bowman, K.A., Braunfeld, M.B., Barry, R.A., and Prusiner, S.B. Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 2310-2314.

61. Palmer, M.S., Dryden, A.J., Hughes, J.T., and Collinge, J. Homozygous prion protein genotype predisposes to sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. // Nature. -1991.-V. 352.-P. 340-342.

62. Patino, M.M., Liu, J.-J., Glover, J.R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. // Science. 1996. - V. 273. -P. 622-625.

63. Paushkin, S.V., Kushnirov, V. V., Smirnov, V.N., Ter-Avanesyan, M.D. Propagation of the yeast prion-like PSf. determinant is mediated by oligomerization of the 5ZZPJ.5'-encoded polypeptide chain release factor. // EMBO J. 1996. - V. 15. -P. 3127-3134.

64. Paushkin, S.V., Kushnirov, V. V., Smirnov, V.N., Ter-Avanesyan, M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. // Science. 1997. - V. 277. -P. 381-383.(a)

65. Priola, S.A., Chesebro, B. A single hamster PrP amino acid blocks conversion to protease-resistant PrP in scrapie-infected mouse neuroblastoma cells. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 7754-7758.

66. Prusiner, S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. // Science. 1982. - V.216. - P. 136-144.

67. Prusiner S.B. Biology and genetics of prion diseases. // Annu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 655-686.

68. Prusiner, S.B., Bolton, D.C., Groth, D.G., Bowman, K.A., Cochran, S.P., McKinley, M.R. Further purification and characterisation of scrapie prions. // Biochemistry. 1982. - V.21. - P. 6942-6950.

69. Reik, R., Hornemann, S., Wider, G., Billeter, M., Glockshuber, R., Wutrich, K. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-321).//Nature. 1996. - V.382. - P. 180-182.

70. Roberts, G.W., and James, S. Prion diseases: transmission from mad cows? // Curr. Biol. 1996. - V. 6. - P. 1248-1249.

71. Safar, J., Wille, H., Itri, V., Groth, D., Serban, H., Torchia, M., Cohen, F.E., Prusiner, S.B. Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations. //Nat. Med. 1998. - V. 4. - P. 1157-1165.

72. Sambrook, J., Fritch, E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. In three vols. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. 1626 pp.

73. Santoso, A., Chien, P., Osherovich, L.Z., Weismann, J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier. // Cell. 2000. - V. 100. - P. 277-288.

74. Schirmer, E.C., Lindquist, S. Interactions of the chaperone Hspl04 with yeast Sup35 and mammalian PrP. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -V. 94. - P. 13932-13937.

75. Scott, M., Groth, D., Foster, D, Torchia, M., Yang, S.-L., DeArmond, S.J., and Prusiner, S.B. Propagation of prions with artificial properties in transgenic mice expressing chimeric PrP genes. // Cell. 1993. - V. 73. - P. 979-988.

76. Sikorski, R.S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1989. -V. 122.-P. 19-27.

77. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnql: an epigenetic modifier of protein fubction in yeast. Molecular Cell. - 2000. - Y. 5. - P. 163-172.

78. Stahl, N., Baldwin, M.A., Teplow, D.B., Hood, L., Gibson, B.W., Burlingame, A.L., and Prusiner, S.B. Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. // Biochemistry. 1993. - V. 32. -P. 1991-2002.

79. Stansfield, I., Eurwilaichitr, L., Tuite, M.F. Depletion in the levels of the release factor eRFl causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast.//Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 1135-1143.

80. Tamm, I., Eggers, H.J. Specific inhibition of replication of animal viruses. //Science. 1963. -V. 142. - P. 24-33.

81. Taylor, K.L., Cheng, N„ Williams, R.W., Steven, A.C., Wickner, R.B. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p.// Science. -1999.-V. 283.-P. 1339-1343.

82. Ter-Avanesyan, M.D., Dagkesamanskaya, A.R., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N. The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-mendelian determinant PS*/. in the yeast S. cerevisiae. И Genetics. 1994. - V. 137. - P. 671-676.

83. ЮЗ.Тотра, P., Friedrich, P. Prion proteins as memory molecules: an hypothesis. //Neuroscience. 1998. -V. 86. - P. 1037-1043.

84. Towbin, H., Staehelin, Т., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

85. Tuite, M.F., Mundy, C.R., Cox, B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from PSf. to [psf] in S. cerevisiae. H Genetics. 1981. - V. 98. -P. 691-711.

86. Tuite, M.F., Lund, P.M., Futcher, A.B., Dobson, M.J., Cox, B.S., McLaughlin, C.S. Relationship of the PSf. factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae. // Plasmid. 1982. - V. 8. - P. 103-111.

87. Weissman, С. A «unified theory» of prion propagation. // Nature. 1991. -V. 352. - P. 679 -683.

88. Weissmann, C. Molecular biology of transmissible spongiform encephalopathies. // FEBS Letters. 1996. - V. 389. - P. 3-11.

89. Westaway, D., Cooper, C., Turner, S., Da Costa, M., Carlson, G. A., Prusiner, S. B. Structure and polymorphism of the mouse prion protein gene.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 6418 - 6422.

90. Wickner, R.B. Evidence for a prion analog in S. cerevisiae-. the URE3. non-Mendelian genetic element as an altered URE2 protein. // Science. 1994. - V. 264.-P. 566 -569.

91. Wickner, R.B., Masison, D.C., Edskes, H.K. PSI. and [URE] as yeast prions. // Yeast. 1995. - V. 11. - P. 1671-1685.

92. Will, R.G., Ironside, J.W., Zeidler, M., Cousens, S.N., Estibeiro, K., Alperovitch, A., Poser, S., Pocchiari, M., Hofman, A., and Smith, P.G. A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the United Kingdom. // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 921-925.

93. Young, C.S.H., Cox, B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. 1. A nuclear gene controlling the inheritance of the extrachromosomal elements. // Heredity. 1971. - V. 26. - P. 413-422.

94. Zhou, P., Derkatch, I.L., Patino, M.M., Lindquist, S., Liebman, S.W. The non-Mendelian factor, ETA., like [PSI]/ is a prion-like form of Sup35p.// Abstracts of conference in Maryland, 1998.

95. Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Михаилу Давидовичу Тер-Аванесяну за неизменный интерес к моей работе, множество полезных советов и практическую помощь при проведении работы.

96. Я хочу поблагодарить также В.В. Кушнирова, А.И. Позняковского и А.И. Богданову за предоставленные ими плазмиды.

97. Я очень благодарна С.В. Паушкину, И.А Валуеву и М.Б. Чеченовой за помощь в экспериментах и часть представленных материалов.

98. Хочу выразить свою благодарность М.О. Агафонову за полезные советы по оформлению работы и М.Ю. Жданович за помощь при подготовке иллюстративного материала.

99. Хочу также поблагодарить всех сотрудников лаборатории молекулярной генетики ИЭК РК НПК, которые помогали мне методическими советами и участвовали в обсуждении результатов работы.1.i