Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания

Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания"

на правах рукописи

УДК 533.9

I КРЫНДУШКИН ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ПРИОННЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ ДРОЖЖЕЙ БАССНАЯОМУСЕБ СЕКЕУШАЕ: СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ.

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии РКНГТК МЗ РФ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Михаил Давидович Тер-Аванесяи Официальные оппоненты: доктор химических наук Андрей Борисович Вартапетян кандидат физико-математических наук Роберт Шавлович Бнбилашвилн

Ведущая организация-

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук В.Е. Братин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение. Актуальность проблемы. Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы, таких как скрейпи овец, "болезнь бешенства" коров и болезнь Крейцфельда-Якоба человека. Интерес к изучению данных заболеваний сильно возрос в последние годы из-за участившихся случаев заражений людей при потреблении внутрь мяса больных животных. Несмотря на то, что у животных эти заболевания описаны около двухсот лет назад, а у человека в начале этого века, их природа оставалась непонятной вплоть до последнего времени. Необычна этиология этих заболеваний: они могут возникать спорадически, могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. В 1967 была предложена «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент (получивший название "прион") представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподдержанию при помощи автокаталитического механизма. Эта революционная гипотеза получила в настоящее время солидное экспериментальное подтверждение.

В 1994 году появилась работа (Wickner, Science, 1994), предсказывающая существование прионов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). В дальнейшем эта гипотеза получила многочисленные генетические и биохимические подтверждения. В частности, было показано, что генетический детерминант дрожжей [ЛХГ] представляет собой прионную форму белка Sup35. Был создан гибридный прионный .-детерминант [PStps] на основе прионного состояния белка Sup35 из дрожжей Pichia methanolica (P. methanolica). Это позволило доказать консервативность прионных свойств белка Sup35. Однако по-прежнему остается невыясненной структурная организация прионных частиц, а также клеточные механизмы, контролирующие репликацию прионов в клетках дрожжей

Цели и задачи исследования. Предлагаемая работа посвящена разработке дрожжевой модели для исследования репликации прионов на молекулярном уровне и использованию ее для изучения механизмов элиминации детерминантов [Я57*] и [PSI*ps]-В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Идентифицировать белки, существенные для поддержания детерминантов [PSI*] и [PS!*ps] в клетках S. cerevisiae, и выяснить механизмы их участия в этом процессе.

2) Разработать биохимические подходы, позволяющие определить структурную организацию прионных частиц в клетках S. cerevisiae и оценить влияние различных воздействий на структуру прионных агрегатовлехерминантов^?^] и [PSfps].

1 рос НАЦИОНАЛЬНА»-V

Научная новизна. В работе был I впервга^дадояКА систематический поиск белков, участвующих в поддержании прионных ^¡^^М^уов^^'/*] и [PSfps] У

дрожжей S cerevisiae. Было выявлено несколько эволюционно-консервативных белков-шаперонов из семейств Hsp70 и Hsp40, присутствующих как у дрожжей, так и у млекопитающих, что позволяет предполагать возможность использования регуляции экспрессии этих белков для лечения прионных болезней человека. Кроме того, было обнаружено, что другие идентифицированные белки влияют на стабильность детерминантов опосредованно, регулируя экспрессию шаперонов на уровне транскрипции.

Разработан оригинальный метод очистки и анализа дрожжевых прионов, который позволил получить новые данные о структурной организации прионных агрегатов и установить их размер, а также позволил обнаружить различия между штаммами прионного детерминанта на молекулярном уровне. Данный метод был применен для анализа механизмов действия различных факторов, вызывающих элиминацию прионных детерминантов [PS/*] и [W/%s], таких как уменьшение количества шаперона Hspl04, добавление в среду для роста дрожжей низких концентраций гидрохлорида гуанидина (GuHCl), сверхэкспрессия шаперона Sisl.

Практическое значение работы. Изучение прионных заболеваний на моделях трансгенных животных встречает ряд технических трудностей. Использование дрожжей S cerevisiae в качестве модельного объекта значительно облегчает изучение общих механизмов, присущих явлению прионов, так как дрожжи представляют собой наиболее удобный для молекулярно-генетического анализа эукариотический организм. Полученные результаты могут быть использованы в будущем для разработки стратегии лечения прионных заболеваний человека и животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (2004), XXI Международной конференции по дрожжевой генетике и молекулярной биологии (Gothenburg, 2003), III Конгрессе Российского Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), 2Л Международной конференции по прионам дрожжей (Calistoga, 2002), XLIII Научной Конференции МФТИ (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисных сообщений.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 126 страницах и включает 24 рисунка, 8 таблиц и список литературы, содержащий 156 ссылок.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из трех разделов. Первый посвящен прионам млекопитающих, во втором рассмотрены прионы низших эукариот, в третьем были проанализированы результаты исследований клеточных факторов, влияющих на поддержание прионного состояния белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: 5V-H19 (МАТа ade2-l SUQ5 canJ-JOO leu2-3,112 игаЗ-52, состояние [PSf] или \psí]\ PS-5V-H19 (был получен из 5V-H19 замещением гена SUP35 гибридным геном SUP35-PS, который кодирует белок Sup35-PS, содержащий 1-186 аминокислот белка Sup35 дрожжей Р. methanolica и 124-686 аминокислот белка Sup35 дрожжей S. cerevisiae; состояние [PSI*ps] или [ря'и]). В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (метод селективных сред, трансформация), а также стандартные молекулярно-биологические методы (конструирование плазмид, гибридизация по Саузерну, экспрессия белков в Е coli, SDS-PAGE электрофорез и иммуноблоттинг, ультрацентрифугирование, ДНК-белковое связывание). Часть биохимических методов была разработана в данной работе (очистка прионных полимеров Sup35, SDD-AGE). Часть дрожжевых плазмид, использованных в работе, были любезно предоставлены В.В. Кушнировым, M. Tuite, H. Ruis, остальные сконструированы автором. Антитела к шаперонам были любезно предоставлены Е. Craig, на RppO - J. Ballesta. Часть работы по разработке метода SDD-AGE была выполнена совместно с И.А. Александровым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сверхэкспрессия дрожжевых шапероиов из семейства Hsp70/Hsp40 приводит к элиминации некоторых штаммов прионных детерминантов \PSI*\ и \PSI* .

Генетическая система, основанная на супрессии нонсенс-мутацию ade2-I, позволяет визуально определять наличие детерминантов [PSt] и [PS/Vs] в клетках дрожжей по белому цвету колоний, при этом красный цвет указывает на отсутствие детерминантов, а розовый - на ослабление их фенотипа. Эта система была использована для изучения генов, продукты которых могли бы вызывать элиминацию [PSI*] или [PSI*ps\. Единственный известный по литературным данным белок с антиприонными свойствами - шаперон Hspl04 - вызывал элиминацию только детерминанта [W/*], но не [PSI*ps]- Мы предположили, что сверхэкспрессия генов других шаперонов дрожжей (SSA1, SSB¡ и YDJ1) может повлиять на стабильность детерминанта [PSI*k[. Для

проверки этой гипотезы несколько штаммов [PS7*] и [PS/Vs], охарактеризованных по уровню нонсенс-супресии ade2-l (цвету колоний), были трансформированы многокопийными дрожжевыми плазмидами, содержащими гены SSA1, или S SB! или YDJ1, и контрольной плазмидой, не содержащей дополнительных генов. Эффективность элиминации [PSt\ и [PS/*и] представлена в Таблице 1.

Систематический поиск белков, способных при свешэкспресии приводить к элиминации детерминанта \PSf*r*\.

После обнаружения влияния сверхэкспресии трех шаперонов на стабильность [PSf*ps] мы предприняли попытку систематического поиска новых белков, способных элиминировать [W/Vs] и, возможно, [Я5/*]. Для этого были использованы 2 независимо полученные библиотеки дрожжевых генов, каждая из них представляла собой набор многокопийных плазмид, содержащих случайные фрагменты дрожжевого генома Клетки дрожжей, содержащие штамм [PSJ*ps] №1, были трансформированы этими библиотеками. В результате трансформации было обнаружено появление некоторого количества клонов красного цвета, при этом >99% трансформантов оставались белого цвета, как и исходный штамм [W/*ps] №1. Изменение цвета некоторых колоний было также зафиксировано после трансформации этого штамма "контрольной" плазмидой, что свидетельствовало о спонтанной потере прионного детерминанта в процессе трансформации Чтобы исключить подобные случаи, мы производили скрещивание всех трансформантов красного цвета со штаммом дрожжей, содержащим тот же самый детерминант [PSf*ps] №1 После скрещивания мы брали для дальнейшего анализа только те плазмиды, которые вызывали изменение цвета дрожжей как в гаплоидном, так и в диплоидном состоянии, что говорило о "неслучайности" наблюдаемого эффекта Всего было проанализировано около 300 тыс. трансформантов [PSfps] №1, из них в конце отобрано около 40 "результативных" клонов Из этих клонов была выделена плазмидная ДНК, которой затем трансформировали клетки E.coli. Изолированные таким образом индивидуальные плазмиды были еще раз проверены на наличие эффекта элиминации, затем секвенированы по концам вставок. При необходимости идентификацию гена, ответственного за наблюдаемый эффект, производили путем делеционного анализа вставки и сравнения с последовательностью дрожжевого генома. В этом эксперименте были найдены следующие белки: Sisl, Ynl077w, Stil - дрожжевые шапероны, участвующие в фолдинге белков; Ssn8, Sfll - регуляторы транскрипции некоторых белков; RppO - рибосомный белок (структурный компонент рибосомы). Мы проверили действие этих белков на другие штаммы [PSt] и [PS/^ra] (Таблица 1). Потерю прионных детерминантов характеризовали по 3

критериям: ослаблению супрессии нонсенс-мутации ас!е2-1, что соответствует изменению цвета колоний (ослаб, супрессии); появлению красных секторов у белых колоний; и относительному количеству появившихся клеток без детерминантов по отношению к общему количеству клеток за время роста дрожжевой колонии (частота потерь).

Таблица 1. Аитиприонные эффекты идентифицированных белков.

штамм Эффекты Sisl Adjl Ydjl» Ssal* Ssbl* Stil Sfll Ssn8 RppO Контроль

[«/ps] №1 ослабл. супрессии +++ ++ + - - ++ + + + -

секторная потеря ± ± ± ± - - - - ++ -

частота потерь 9 11 15 5 0 12 3 0 25 0

[Wfs] №2 ослабл. супрессии ++ + ± - ++ - ++ ++ - -

секторная потеря - ± - - + - - - - -

частота потерь 10 22 5 0 12 2 5 2 0 0

[PSt] "сильный" ослабл.супрессии - - - - - - + - -

секторная потеря - - - - - - - - - -

частота потерь 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0

[PSt] "слабый" ослабл. супрессии - - - - ++ + ++ ++ - -

секторная потеря - - - - - - + - - -

частота потерь 0 0 0 0 30 2 15 3 0 0

*- соответствует белкам, идентифицированным ранее

Избыток транскрипционные регуляторов Ssn8 и Sfll. делеции соответствующих генов, i также избыток RppO могут влиять на профиль экспрессии шаперонов в дрожжевой клетке.

Для исследования эффектов белков Ssn8 и Sfll мы сконструировали штаммы с делеционными аллелями генов SSN8 или SFL1 у штамма PS-5V-H19, содержащие [PS/*ps] №1, а также аналогичные штаммы без прионного детерминанта. Делеции этих генов были сконструированы при помощи гомологичной рекомбинации фрагмента гена вместе со вставленным внутрь этого фрагмента геном URA3 в геном штамма дрожжей PS-5V-H19 №1. в результате интеграции этого фрагмента ДНК полученный штамм дрожжей приобретал способность расти на среде, не содержащей урацил, что позволило легко отобрать нужные колонии. Правильность сконструированных делеций была проверена с помощью гибридизации по Саузерну.

Наиболее вероятным механизмом действия идентифицированных транскрипционных факторов является их участие в регуляции экспрессии шаперонов, на что указывают некоторые литературные данные. В частности, Sfll является гомологом Hsfl - ключевого транскрипционного фактора, который связывается с промоторной последовательностью HSE (Heat Shock Element) и регулирует реакцию дрожжей на

тепловой шок и, соответственно, синтез многих шаперонов. Это означает, что и Sfll может связываться с HSE и изменять экспрессию шаперонов в дрожжевой клетке. В свою очередь, Ssn8 является транскрипционным репрессором некоторых генов и, в частности, гена, кодирующего шаперон Ssal. Известно, что Ssn8 быстро деградирует под воздействием разнообразных стрессов (теплового, окислительного и при голодании). Можно предполагать, что избыток Ssn8 может изменять профиль экспрессии шаперонов в дрожжевой клетке и таким образом приводить к дестабилизации прионного детерминанта.

Для проверки этой гипотезы мы сконструировали несколько плазмид, несущих ген LacZ (бактериальная ß-галактозидаза) под контролем промоторов генов HSP104, SUP3S и SSA4 (представитель Hsp70), а также промоторных элементов HSE и STRE (STress Response Element), любезно предоставленных нам Н. Ruis. Промотор HSP104 был взят ввиду исключительной важности этого белка для поддержания прионов в дрожжевой клетке. Экспрессия SSA4 легко активируется в ответ на разнообразные стрессовые условия, поэтому этот ген может служить чувствительным сенсором изменений вызванных стрессом, также как и элементы HSE и STRE, присутствующие в промоторах практически всех шаперонов. Об изменении уровня транскрипции генов шаперонов можно судить по изменению уровня экспрессии ß-галактозидазы в этой модельной системе. Исходя из этого, мы измеряли активность ß-галактозидазы в клетках дрожжей 5V-H19 \psip,] в зависимости от присутствия многокопийных плазмид с SSN8, SFLI и RPP0, а также делеций SSN8 и SFLI (Табл. 2).

Отметим, что полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными- избыток Sfll увеличивает транскрипцию с HSE-элемента, а избыток Ssn8 во многих случаях приводил к снижению уровня ß-галакгозидазной активности (вероятно, негативно регулирует экспрессию шаперонов).

Возвращаясь к данным Таблицы 1, отметим, что шапероны из семейств Hsp70/Hsp40 (к ним относятся большинство найденных в нашей работе шаперонов) и HsplOO (Hspl04 эффективно элиминирует [Я5/*]) , вероятно, являются основными белками, влияющими на поддержание прионного детерминанта в клетках дрожжей Действительно, действие трех других найденных в работе белков - Ssn8, Sfll, RppO -сводится, по-видимому, к модуляции профиля экспрессии шаперонов, что дестабилизирует прионный детерминант. Избыток этих белков эффективно действовал только на один штамм [PS/Vs] №1, и очень слабо действовал на другие штаммы приона (это подтверждает гипотезу о том, что разные штаммы прионного детерминанта отличаются друг от друга конформацией прионного белка)

Таблица 2. Влияние делеций 5ЖМУ и 5ТЫ и сверхэкспрессии БП! и ЛР/'О на

промоторную активность указанных элементов в модельной системе: промоторный элемент - ген ЬасХ.

Состояние исследуемых генов SUP35fm-LacZm, HSP104fro -LacZon SSA4vn-LacZco, HSE- LacZccn STRE- LacZco,

Контроль 6,77 ±0,13 20,5 ±0,5 5,16± 1,14 1,41 ±0,12 4,73 ±0,51

мультикопийный SSN8 6,49 ±0,52 18,0 ±1,1 2,31 ±0,61 1,52 ±0,21 3,22 ±0,35

делеция SSN8 4,75 ±0,36 26,6 ± 3,1 12,72 ±1,74 1,54 + 0,11 7,47 ±0,24

мультикопийный SFL1 8,07 ±0,27 43,1 ±1,9 12,41 ±1,31 4,10 ±0,17 7,18 ±0,17

делеция SFL1 6,17 ±0,08 21,0 ±0,2 13,13 ±1,05 1,72 ±0,15 5,23 ±0,32

мультикопийный RPP0 11,58 ±0,77 24,5 ±3,1 14,02 ±2,53 3,45 ±0,21 5,21 ±0,44

(жирным курсивом отмечены значительные изменения активности, каждое значение соответствует измерению 3 независимых трансформантов; "pro" - означает промотор, "int" - интегративная конструкция, "сел" - центромерная конструкция).

Sfll связывается с промоторной последовательностью HSE.

Для проверки непосредственного взаимодействия Sfll с HSE-элементом был

»Й»

проведен стандартный эксперимент по ДНК-белковому связыванию (gel mobility shiñ assay). Мы экспрессировали гибридный белок 6His-Sfll в клетках Е. coli, при этом последовательность из 6 расположенных подряд гистидинов, пришитая с N-конца белка, обеспечивает связывание белка с аффинной смолой TALON™ (CLONTECH) и предположительно не влияет на функциональные свойства белка Sfll. Затем белок 6His-Sfll был очищен при помощи указанной аффинной хроматографии, степень очистки и определение концентрации белка производили элеюрофоретическим методом После этого мы произвели связывание 6His-Sfll с синтетическим ДНК-дуплексом HSE, мечеными радиоактивным фосфором P3Í при помощи фермента Кленова. ДНК-белковый комплекс отделяли от несвязавшихся дуплексов, используя неденатурирую щий (нативный) электрофорез. Кроме этого, мы провели связывание синтетического ДНК-дуплекса HSE с дрожжевыми белками из лизатов клеток, которые различались уровнем экспрессии гена SFL1. Всего было изучено 3 штамма дрожжей: контрольный штамм SV-HI 9, этот же штамм с делецией гена SFLI, либо с многокопийной плазмидой, несущей ген SFL1. Оказалось, что Sfll связывается с элементом HSE (Рис.1), причем как в очищенном

виде, так и в лизате (поскольку эффективность связывания дуплекса с белками трех лизатов зависела от уровня экспрессии 57-Х/) и, более того, позитивно регулирует экспрессию с этого элемента (см. Табл. 2).

Связывание промоторной последовательности HSE с белком Sfll

0 Sfll Sfll ml К L

РИС. 1. Sfll связывается in vitro с последовательностью HSE Очищенный белок Sfll (левая панель), либо лизат дрожжей (правая панель) были инкубированы с меченым фрагментом HSE. ДНК-белковые комплексы (помечены стрелками) разделяли с помощью гель-электрофореза в неденатурирующих условиях Обозначения: 0 - HSE без белка, Sfl - HSE с очищенным белком Sfl 1, ML - HSE с лизатом клеток, содержащих многокопийкый SFL1, К-HSE с контрольным лизатом, L - HSE с лизатом, содержащим делецию SFL1.

Сверюкспрессня гена RPP0 приводит к накоплении) белка RppO во внерибосомных комплексах.

Идентифицированный нами белок RppO входит в группу кислых рибосомных белков, образующих на большой субъединице рибосомы структуру, называемую "stalk", т е. стержень. Биологическая роль этой структуры до конца не ясна, однако известно, что отсутствие кислых рибосомных белков на рибосоме приводит к изменению профиля экспрессии синтезируемых белков, при этом спектр синтезируемых белков сдвигается в сторону белков, характерных для стационарной фазы роста (Remacha et al, 1995).

Внутриклеточный избыток RppO вероятнее всего не приводит к образованию рибосом с двумя копиями этого белка. Наиболее вероятным кажется образование этим белком альтернативных (внерибосомных) комплексов, которые, однако, вполне могут содержать другие кислые рибосомные белки, взаимодействующие с RppO, что будет приводить к их недостатку в рибосоме и, соответственно, изменению профиля синтезируемых белков (возможно, шаперонов). Для обнаружения этих комплексов мы предприняли фракционирование лизатов клеток, несущих многокопийную плазмиду с RPP0, при помощи ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы 7%-40% (35 ООО об/мин в течение 6 часов). После окончания процедуры были отобраны 14 фракций по всей длине градиента, и в каждой фракции было определено содержание RppO при помощи иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител (Рис 2А). После

этого мы оценили содержание 235 рРНК (и, следовательно, рибосом) в каждой из этих фракций с помощью агарозного электрофореза с бромистым этидием (Рис. 2Б). Оказалось, что избыток ЯррО обнаруживается, в основном, во внерибосомных фракциях (с 3 по 7), что может объяснять биологические эффекты, возникающие при его сверхэкспрессии.

Таким образом, избыточный ИррО способен к образованию комплексов, которые могут каким-либо образом приводить к изменению экспрессии шаперонов и потере прионного детерминанта. Указанием на это служат данные Таблицы 2, из которых следует, что сверхэкспрессия ЛРРО повышает уровень транскрипции генов и 53'А4,

а также, вероятно, других генов, промоторы которых содержат последовательность Н5Е.

контроль ^

увеличение молекулярной массы -►

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13*- Н0Мер , фракции

сверхэкспрессия RppO _

12 3 4 5 6 7*8 9 l6 1 2 3 4 5 6 78 9 l6

фракции, I содержащие рибосомы

23 SрРНК 18 S рРНК тРНК

контроль

сверхэкспрессия RppO

Рис. 2 А. Сверхэкспрессированный ЯррО накапливается во внерибосомных фракциях Центрифугирование в градиенте сахарозы контрольного лизата \psipi] и лизата клеток, несущих многокопийную плазм иду с ИРРО. В отобранных фракциях определяли содержание ЯррО при помощи иммуноблоттинга.Уровень ЯррО возрастает по сравнению с контролем во внерибосомных фракциях 2-7. Б. Определение фракций, содержащих рибосомы. Те же фракции были разделены на агарозном геле и окрашены бромистым этидием. 23 $ рРНК и 18 в рРНК представлены, начиная с 8 фракции и выше, то есть фракции 2-7 не содержат рибосом.

Разработка электрофоретического метода анализа прионных агрегатов (SDD-AGE).

Согласно литературным данным, прионное состояние белка Sup35 (проявляющееся как цитоплазматически-наследуемый детерминант [PS/*]) характеризуется накоплением в дрожжевой клетке крупных агрегатов этого белка, в то время как в неприонном состоянии Sup35 находится в растворимом виде. Существующие молекулярно-биологические подходы к анализу структуры прионных частиц Sup35 включают в себя ультрацентрифугирование и визуализацию агрегатов в клетках при помощи зеленого флуоресцентного белка (GFP). Эти методы не дают достаточной информации о структуре прионных агрегатов in vivo. Для того чтобы оценить размер и структуру прионных агрегатов, необходимо было найти условия, при которых разрушались бы все макромолекулярные комплексы, кроме прионных, и не разрушались бы прионные агрегаты Мы проанализировали ряд химических соединений [мочевина, КС1, гидрохлорид гуанидина, ряд нейтральных детергентов, а также додецил сульфат натрия (SDS)] по их способности очищать прионные агрегаты. Лизат, полученный из клеток дрожжей штамма 5V-H19 [Р5У*]> ультрацентрифугировали при 150000g в течение 1 часа. Полученный в этих условиях осадок содержал существенную долю прионных агрегатов Sup35 вместе с другими клеточными комплексами (включая рибосомы и пр.). Этот осадок был растворен в буфере, содержащем вышеперечисленные вещества; после чего такое же ультрацентрифугирование проводили еще раз. Содержание в осадке белка Sup35 определяли окрашиванием Кумасси голубым (подтверждали иммуноблоттингом). Мы отбирали вещества, дающие максимальную пропорцию Sup35 в осадке по отношению ко всем остальным белкам. Наилучшую степень очистки показал SDS: обработка дрожжевого лизата 2% SDS при температуре 37° разрушает большинство макромолекулярных комплексов, однако, по-видимому, не разрушает прионные агрегаты (Рис. 3). Лизат клеток штамма 5V-H19 [PSf] был ультрацентрифугирован при 150000g в течение 1 часа. Полученный осадок, содержащий агрегаты Sup35, был обработан 2% SDS при различных температурах от 20 до 100°С. Эти образцы были анализированы электрофоретически при помощи SDS-PAGE с двумя отличиями: "концентрирующий" гель состоял из 1% агарозы вместо акриламида, и образцы перед нанесением не подвергались кипячению, что позволило анализировать в эксперименте агрегированную форму Sup35, которая мигрировала в "концентрирующем" геле, но задерживалась на старте "разделяющего" геля (Рис. 3). В образцах, обработанных SDS при температурах до 42°С или меньше, мы наблюдали лишь небольшое количество мономерной формы Sup35, которая вероятно представляет фракцию Sup35, диссоциированного с рибосом. Это означает, что прионные частицы Sup35 устойчивы к SDS при этих температурах. Они

начинают распадаться при 50°С и почти полностью растворяются при температурах выше 70°С.

Дня прозгрки гомогенности препарата, мы анализировали электрофоретически белки, застрявшие на границе двух гелей в предыдущем эксперименте. Эти белки представляли собой фракцию ЗОЭ-устойчивых клеточных агрегатов. Мы вырезали тонкую полоску "разделяющего" геля, содержащую эти агрегаты, прокипятили ее в присутствии ЗОЗ и переложили ее поверх нового акриламидного геля. При включении электрического поля белки входили в новый гель и мигрировали в нем в соответствии со своими молекулярными массами. Единственная отчетливо детектируемая полоса в геле относится к белку Эир35 (Рис. 4), что было подтверждено иммуноокрашиванием белка Эир35. Следовательно, вОЭ растворяет большинство дрожжевых неприонных белковых комплексов и убирает большинство белков, ассоциированных с прионными агрегатами в дрожжевой клетке. В виду того, что каждая молекула ЭБЭ несет в себе отрицательный заряд, обработка этим веществом позволяет использовать электрофорез для дальнейшего исследования свойств прионных полимеров. Здесь и далее мы будем использовать термин "прионный полимер" для обозначения прионного вещества, полученного в результате обработки в то время как "прионные агрегаты" будут обозначать агрегаты, не

обработанные 8Э8 и находящиеся в дрожжевой клетке или в лизате дрожжей.

0°С 25°С 37°С ЪТС 42°С 50°С 70°С 100°С

\psh\lPSI*] [РЭ/+] к0а ЭирЗбТ

_230

-БирЗб

. 58

Рисунок 3. Полимерная форма Бир35 устойчива к действию БЭБ при низких температурах. Агрегированная фракция лизата клеток штамма 5У-Н19 [/»$/*] была инкубирована с 2% или 5% БЭЗ в течение 10 минут при указанных температурах и анализирована при помощи вОЗ-РАвЕ. Иммуноокрашивание белка ЭирЗб.

полимерная форма 8ир35

- мономерная форма Эир35

— 33

Рисунок 4. Агрегированные фракции лизатов клеток 5У-Н19 \psi~], [ЯЖЛ] и [Я5/*] со сверхэкспрессией гена 811Р35 были инкубированы с ЗЭБ при 37°С и анализированы методом вОЗ-РАСЕ. Верхние 3 мм разделяющего геля были отрезаны, затем их прокипятили с 808 и поместили на верх другого ЗОЗ-РАвЕ геля. После электрофореза, этот гель был покрашен белковым красителем Кумасси голубым. Обнаруженная полоса была идентифицирована как 8ир35 при помощи иммуноблоттинга (не приведено).

Для отделения прионных полимеров от большинства клеточных белков мы использовали электрофоретическую систему, обычно применяемую для разделения ДНК, и состоящую из буфера ТАЕ и агарозного геля. Для проверки работы метода нами были взяты лизаты клеток [PSt] и [psf] штамма дрожжей 5V-H19, обработанные 2% SDS в буфере ТАЕ в течение 10 минут при температуре 37°С. После обработки, лизаты были нанесены на 1,8% агарозный гель; электрофорез проводили в течение 1,5 часов при напряжении 80V. После электрофореза, белки были перенесены на мембрану, а затем окрашены антителами к Sup35 (Рис. 5). Мы показали четкое различие между образцами [Д5/*] и |/от]: в клетках [/от] Sup35 находится в мономерной форме, тогда как в клетках [PSI*] Sup35 присутствует в агрегированной форме, т.е. в форме прионных полимеров. Данный метод анализа прионных агрегатов мы назвали SDD-AGE (Semi-Denaturing Detergent - Agarose Gel Electrophoresis), по аналогии с SDS-PAGE.

Прионные агрегаты состоят из полимеров белка 8ир35.

Для того чтобы сопоставить размер полимеров белка 8ир35 с размером его агрегатов, наблюдаемых при фракционировании в неденатурирующих условиях мы провели ультрацентрифугирование лизата клеток дрожжей штамма 5\МП9 [Р$1*] в присутствии 2% БОв и в его отсутствие. Сравнение профилей центрифугирования по содержанию белка 8ир35 (Рис. 6А) показало, что обработка БРв существенно уменьшает размер прионных комплексов. В среднем, масса прионных агрегатов 5ир35 была примерно в 30 раз меньше, чем масса прионных полимеров этого белка. Столь значительная разница в

. А * Старт> Б Рисунок 5.

(Б) Для оценки молекулярной массы прионных полимеров мы использовали препарат миофибрилл кролика, который содержит в больших количествах гигантские цитоскелетные белки титин (4200 кДа) и небулин (740 кДа). Эти белки состоят одной полипептидной цепи,' и поэтому, мигрируют в нашей системе в соответствии со своими молекулярными массами (окрашивание белковым красителем Понсо красным).

кДа •+4200*-

(А) Сравнение [ЛУ/+] и \psi-] лизатов штамма 5V-H19 методом SDD-AGE

(иммуноокрашивание белка Sup33).

размерах может быть обусловлена двумя причинами: ассоциацией полимеров Бир35 с агрегатами других белков и макромолекулярными структурами (такими как рибосомы), а также тем, что в одном агрегате может находиться несколько полимеров. Из Рисунка 6А следует, что прионные агрегаты Бир35 существенно различаются по размеру. Наименьшие среди них сравнимы с прнонными полимерами, наибольшие превосходят их более чем в 100 раз. Для того чтобы оценить, насколько различаются прионные полимеры, составляющие эти агрегаты, фракции, отобранные после ультрацентрифугирования, проведенного в отсутствие 505, были проанализированы при помощи ЗОО-АвЕ (Рис.бБ). Средний размер полимеров 5ир35 из "верхних" фракций равнялся приблизительно 900 кДа, а "нижних" фракций - примерно 1500 кДа, что составляет разницу в 1,7 раза (для агрегатов разница в размерах составила порядка 100 раз). Таким образом, можно заключить, что все прионные агрегаты состоят из полимеров примерно одинакового небольшого размера, однако более тяжелые агрегаты содержат соответственно чуть более тяжелые полимеры. Этот факт можно объяснить, предположив, что полимеры взаимодействуют друг с другом при помощи бокового слипания, образуя при этом агрегат. При этом сила взаимодействия коррелирует с площадью соприкасающихся поверхностей, то есть более крупные полимеры лучше взаимодействуют друг с другом, их среднее количество в одном агрегате больше. Поэтому даже небольшая разница в размере полимеров может приводить в большой разнице в размере агрегатов.

SDS

А [PStji SDS Б < Старт

кДа 4200

фракции I 23456 7 89 10 Осадок -►

верх

Рисунок 6. (A) SDS разбирает прионные

агрегаты Sup35 до SDS-устойчивых частиц.__

Лизаты [PSI1] и [psi] клеток штамма 5V-H19 ^Ш^Я^Ё 740

были фракционированы при помощи ультрацентрифугирования при 170 000g в отсутствие (-) или в присутствии (+) SDS. Фракции были анализированы при помощи SDS-

PAGE. (Б) Отобранные после центрифугирования 205

в отсутствие SDS фракции [/"5/*] лизата (из А), + Sup35

были смешаны как указано и проанализированы Фрак- мономеры

методом SDD-AGE. Иммуноокрашивание белка ции: 1-3 4-6 7-10 оса-Sup35. Док

Различным штаммам детерминантов IPSf*] и \PSÎ*^] соответствует приоииые полимеры разного размера.

Штаммы прионных детерминантов [AS/*] и [PStps] различаются генетически по силе нонсенс-супрессорного фенотипа Общепринятой считается гипотеза о том, что штаммовое разнообразие прионов основано на разнице в конформации прионного белка и, соответственно, в структуре прионных агрегатов. Для проверки этого предположения мы сравнили размер полимеров Sup35 в клетках с несколькими разными штаммами [PSt] и [PS1*«] (Рис. 7), и нашли существенную разницу в размерах. При этом оказалось, что размер прионных полимеров обратно коррелирует с силой [Я57*], а именно, "сильным" штаммам [PS/*], как правило, соответствуют меньшие полимеры, чем "слабым".

штамм

приона, №: 2

1 3 4 4 3 2

Старт

КДа "4200

■740

Рисунок 7. Сравнение размера прионных полимеров различных штаммов [/>57*] и [ЯХТ«] методом БОО-АОЕ (иммуноокрашивание белка ЭирЗб). Представленные на рисунке штаммы [РХГга] 1 и 2 соответствуют штаммам [га/%5] #1 и #2 Таблицы 1. Штаммы [ЛУ/+] 1 и 2 соответствуют штаммам [ЯЗУ*] "сильный" и [/"£/*] "слабый" Таблицы 1.

[PS/*]

[PsrPS\

"*"205 Ч-

1 Sup35 мономеры

Уменьшение количества Н$р104 приводит к увеличению размера прионных полимеров.

Согласно литературным данным, делеция гена шаперона Н$рЮ4 элиминирует все известные дрожжевые прионы, в том числе и [га/4]. Для выяснения механизмов этого явления мы попытались установить, каким образом уменьшение экспрессии Няр 104 влияет на размер прионных полимеров. Для постепенного уменьшения экспрессии мы заменили в геноме дрожжей промотор гена Н8Р104 на регулируемый тетрациклином ТЕТ промотор. Это позволило ингибировать синтез Нвр104 путем добавления антибиотика доксициклина (аналог тетрациклина) в культуральную среду. В отсутствие антибиотика

происходит индукция ТЕТ промотора, а в его присутствии (5 мкг/мл) - репрессия промотора, которая приводит к медленному уменьшению уровня белка №р104, поскольку этот шаперон деградирует очень медленно и его количество уменьшается только в результате разведения в клеточных делениях. Клетки дрожжей штамма 5У-Н19 [РЯГ] росли в жидкой среде в присутствии доксициклина в течение 6 клеточных поколений, при этом после каждого удвоения плотности культуры часть клеток отбирали для дальнейшего анализа методом ЭОО-АОЕ, так что плотность культуры оставалась на примерно постоянном уровне. Было обнаружено, что размер прионных полимеров Бир35 начал возрастать через два клеточных поколения от момента добавления в среду антибиотика; через 6 поколений размер полимеров увеличился в 4 раза (Рис. 8А). При этом частичную потерю [РХ/*] наблюдали уже после пятого деления (не показано). Потеря [Я5/*] была обусловлена увеличенным размером прионных полимеров. Полученные данные свидетельствуют о том, что Нэр 104 является белком, фрагментирующим прионные полимеры, и таким образом осуществляющим наследование Значительное уменьшение уровня этого белка приводит к прекращению фрагментации полимеров, что сопровождается их ростом и уменьшением их количества

Добавление к растущим клеткам дрожжей виНС! полностью блокирует репликацию прионного детерминанта.

виНС! является единственным на сегодняшний день низкомолекулярным веществом, эффективно элиминирующим все известные дрожжевые прионы. Согласно имеющимся в литературе данным, СиНС! влияет на поддержание прионов, инактивируя НзрКМ. Это позволяет предположить, что добавление СиНС! в культуральную среду должно приводить к росту прионных полимеров 8ир35 Штамм дрожжей 5У-Н19 [-РЗ/*] был выращен в течение нескольких клеточных поколений в жидкой среде, содержащем _> мМ СиНС1, при этом после каждого удвоения плотности культуры часть клеток отбирали для анализа методом ЯОО-АОЕ, как и в предыдущем эксперименте. Было обнаружено, что в присутствие СиНС! средний размер полимеров 5ир35 возрастал в 2 раза за одно клеточное деление (Рис 8Б), что соответствует теоретическому максимуму роста, достигаемому в условиях, когда все мономеры 8ир35 включаются в полимеры, которые в свою очередь не подвергаются фрагментации. Действительно, в этом случае общее количество прионных полимеров 8ир35 на клетку остается постоянным, а число клеток за поколение удваивается, и, следовательно, число прионных полимеров 8ир35 в среднем на клетку уменьшается вдвое. Так как количество 8ир35 в клетках остается постоянным, и этот белок находится преимущественно в полимерной форме, количество молекул Эир35 в

одном полимере должно возрасти вдвое. Таким образом, подобный рост полимеров возможен только в условиях полного блокирования их фрагментации. После удаления (ЗиНС! из среды размер прионных полимеров возвращается к своей обычной величине (не показано).

Избыток шаперон« 8151 приводит к уменьшению размер» прионных полимеров.

Проведенный в работе поиск антиприонных факторов выявил несколько белков, способных элиминировать [Р5ГК] №1. Для выявления молекулярных механизмов действия этих факторов мы воспользовались методом ЗОЭ-АОЕ. Разработанный метод позволяет отслеживать только сильные воздействия на структуру полимеров, приводящие к существенному изменению их размера. Сильным антиприонным действием на [Я57*лг]№1 обладал шаперон $¡$1 (см. Табл. 1). Как оказалось, сверхэкспрессия гена 575/ приводит к уменьшению размера прионных полимеров (Рис. 8В). Можно предположить, что шапероны семейства Нвр40, к которому относится белок 5181, ингибируют процесс прионного перехода, стабилизируя неприонную (функциональную) конформацию мономеров 8ир35-Р8 и замедляя, таким образом, процесс полимеризации. Это приводит к уменьшению среднего размера прионных полимеров и некоторому накоплению в клетке функционального 8ир35-Р8, что часто выражается в отсутствие супрессорного эффекта, вызываемого прионным детерминантом.

Разработка метода препаративного выделения прионных полимеров. Анализ структуры полимеров методом электронной микроскопии.

Для исследования тонкой структуры прионных полимеров мы разработали метод препаративного выделения полимеров, основанный на их устойчивости к действию 2% вОв при 37°С. Этот детергент разрушает практически все белковые комплексы в дрожжевых клетках, поэтому большинство белков после обработки вОБ присутствуют в растворе в виде мономеров. В то же время, прионные полимеры устойчивы к ЭБЭ и имеют достаточно большой молекулярный вес (более 0,5 МДа), что позволяет эффективно отделять их от белковых мономеров при помощи процедуры ультрацентрифугирования (Рис. 9). Лизат клеток [Р5/] ультрацентрифугировали (42000 об/мин, 1 час) через "столбик" 30% сахарозы, после чего отбирали фракцию осадка, содержащую помимо прионных агрегатов множество других клеточных комплексов и высокомолекулярных соединений (полирибосомы, нуклеиновые кислоты и другие соединения). Осадок интенсивно растворяли в 2-3% БОБ при температуре 40*С; полученный раствор повторно ультрацентрифугировали уже более долгое время (42000 об/мин, 5-12 часов в зависимости

от объема раствора), после чего опять отбирали фракцию осадка (Рис. 9) На этом этапе осадок уже практически не содержал иных белков, кроме Sup35 (данные не приведены). Процедуру очистки при необходимости повторяли несколько раз и обычно завершали диализом материала против воды или разбавленного буферного раствора для устранения остатков сахарозы и детергента; полученный препарат состоял преимущественно из белка Sup35 в форме полимеров. Далее в работе был проведен первичный электронно-микроскопический анализ очищенных дрожжевых полимеров Sup35 (Рис. 10). Эта работа была выполнена В.Я. Стельмащуком и H.A. Киселевым в Институте Кристаллографии РАН. Наблюдаемые на рисунках фибриллярные структуры состоят из Sup35, так как контрольный препарат, очищенный из [psf] клеток, не содержит этих структур, кроме того, чистоту препарата подтверждали электрофоретически Полученные снимки являются первыми фотографиями прионных агрегатов, очищенных из дрожжевых клеток. Полученная информация подтверждает фибриллярную (амилоидную) природу прионных агрегатов; их более тонкие структурные характеристики требуют дальнейшего изучения.

^Стар^.

кДа

" 4200Н

740+.

205-». ^ Sup35_» мономеры

- Старт

кДа

■4200

■740

205

210 100 55

8 % Hspl04

12 3 4

Поколения

5 б

1.0 1.9 3.9 7.W 0 12. Поколения с GuHCI

относительный размер полимеров Sup35

Sis К [PSI'ps] №1

Рис. 8. SDD-AGE анализ полимеров Sup35. Иммуноокрашивание белка Sup35. (А) Влияние ингибирования транскрипции HSPI04 (при добавлении доксициклина) на размер прионных полимеров Sup35 (описание в тексте). Цифрами указан уровень белка Hspl04, определенный относительно штамма 5V-H19 при помощи SDS-PAGE анализа и иммуноокрашивания белка Hspl04. (Б) 5V-H19 [PS/] клетки были выращены в течение 3 поколений в присутствии 3 мМ GuHCI. Цифрами указан средний размер прионных полимеров Sup35, нормированный на первую точку. (В) Сверхэкспрессия шалерона Sisl приводит к уменьшению размера прионных полимеров Sup35-PS в штамме PS-5V-H19 [/>£/+«]№ I (К-контроль, Sis - сверхэкспресия Sisl).

ультра ценри-

фугирование -|

лизата ■ 30% сахароза-

обработка 2% SDS

ультра ценрифугирование

полимеров • 30% сахароза

после 2-3 раундов очистки

ДИАЛИЗ, МИКРОСКОПИЯ

Рисунок 9. Схема очистки прионных полимеров БирЗб из штамма 5У-Н19 [Р5/*]. Обозначения: -ЗОБ,«233» - полимер 8ир35

Рис.10. Фотофафии очищенных полимеров Sup3S, выделенных из штамма 5V-H19 [ЙУ*]. Изображения получены при помощи электронного микроскопа В Я. Стельмащуком и H.A. Киселевым (Институт Кристаллографии РАН). Черный прямоугольник в углу каждой фотографии соответствует 30 им.

выводы

(1) Сверхэкспрессия шаперонов из семейств Hsp70 и Hsp40, а также транскрипционных

факторов Ssn8 и Sfll и рибосомного белка RppO элиминируетприонный детерминант [PStrs].

(2) Белки Ssn8, Sfll и RppO регулируют экспрессию шаперонов, при этом Sfll связывается

с последовательностью HSE, характерной для промоторов генов шаперонов, и активирует транскрипцию, опосредованную этим элементом. Такая регуляция может объяснять антиприонные эффекты сверхэкспрессии этих белков

(3) Разработаны новые методы выделения прионных частиц и оценки их размера,

основанные на устойчивости этих частиц к додецил сульфату натрия Показано, что прионные частицы [PS7*] имеют сложную структурную организацию, представляя собой агрегаты небольших полимеров белка Sup35.

(4) Штаммы прионного детерминанта [Я57*] различаются друг от друга по размеру

полимеров.

(5) Сверхэкспрессия шаперона Sisl приводит к уменьшению размера прионных

полимеров Sup35, в то время как снижение активности шаперона Hspl04, напротив, приводит к увеличению их размера. На основании этих результатов высказаны гипотезы об участии этих шаперонов в поддержании детерминанта [PS/*] в клетках дрожжей.

Список публикаций

1) V.V. Kushnirov, D.S. Kryndushkin, M. Boguta, V.N. Smimov and M.D. Ter-Avanesyan Chaperones that cure yeast artificial [PSt] and their prion-specific effects

Current Biology, 2000,10:22:1443-1446.

2) D.S. Kryndushkin, V.N. Smimov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov Increased expression of Hsp40 chaperones, transcriptional factors and ribosomal protein RppO can cure yeast prions J Biol Chem, 2002, Jun 28; 277(26): 23702-8.

3) D.S. Kryndushkin, I. Alexandrov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov

Yeast [PSt] Prion Aggregates Are Formed by Small Sup35 Polymers Fragmented by Hspl04 J Biol Chem, 2003, Dec 5; 278(49): 49636-43.

4) Крындушкин Д, Кушниров В. Клонирование и характеризация дрожжевых генов, вызывающих изгнание прионного состояния белка Sup35 ХЫП Научная Конференция МФТИ, Секция VI, стр. 17, Москва, 2000.

5) Kushnirov W, Kryndushkin DS, Boguta M, Ter-Avanesyan MD

Novel chaperones that cure yeast prions International symposium on prion diseases and related processes, p. 113, Annecy, France, 2000.

6) D.S. Kryndushkin, V.V. Kushnirov, Michael D. Ter-Avanesyan A screen for yeast prion-curingfactors

XXth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, 2001. Опубликовано: Yeast, 2001, Vol.18, No.Sl, p.S31.

7) Д.С. Крындушкин, И.М. Александров, М.Д. Тер-Аванесян, В.В. Кушниров. Новый метод анализа структуры прионных агрегатов в дрожжах Saccaromyces cerevisiae III Конгресс Российского Биохимического Общества, Симпозиум XI, стр. 496, Санкт-Петербург, Россия, 2002.

8). Kushnirov W, Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesjan MD.

Sup35 prion aggregates are composed of small sup35 oligomers fragmented by hspl04 2nd International Yeast Prion Meeting, p.43, Calistoga, CA, USA, 2002.

9) D.S. Kryndushkin, I.M. Alexandrov, V.V. Kushnirov and M.D. Ter-Avanesyan Two-level structure of the [PSt] prion particles

XXIя International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gothenburg, Sweden, 2003. Опубликовано: Yeast, 2003; Vol.20, No.Sl, p.S390.

Крындушкин Дмитрий Сергеевич

ПРИОННЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ |ЛУА*| ДРОЖЖЕЙ £4ССНЛЯОМГС£У СЕКЕУШАЕ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ

Подписано в печать 25 03 04 Формат 60 х 84 1/16 Печать офсетная Усл. печ. л. 1,3 Уч - из л, Л. 1,3 Тираж 60 экз Заказ № ф- (80

Государственное образовательное учереждение Высшего профессионального образования Московский Физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем «ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ» 141700, Моек обл, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9

р-97 9 t

РНБ Русский фонд

2005-4 4478

! *

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Молекулярные механизмы белковой наследственности.

Феномен прионов".

1. Прионы млекопитающих.

1.1. Прионы - новый класс инфекционных агентов.

1.2. Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР80.

1.3. Доказательства прионной гипотезы.

1.3.1. Использование экспериментальных животных для исследования инфекционностн прионов. Существование межвидового барьера.

1.3.2. Изучение прионов млекопитающих с помощью трансгенных животных.

1.3.3. Взаимодействие РгР& и РгРс. Изучение прионного превращения белка РгР in vitro. Штаммы прионов.

1.4. Молекулярные модели прионного перехода.

1.5. Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект PrPSc объясняться инактивацией белка?.

1.5.1. Структура белка РгР. Си2+-связывающая активность РгР.

1.5.2. Роль белка РгР в защите клеток нервной системы.

2. Прионы низших эукариот.

2.1. Нехромосомные детерминанты [PSJ*] и [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Цнтоплазматический детерминант [Het-s] гриба Podospora anserina.

2.2. Молекулярная природа детерминанта [PSf J: прионный переход белка Sup35. 24 2.2.1. Структура и функция белка Sup35. Роль N- концевого домена в возникновении и поддержании детерминанта [PSf].

2.2.2. Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35.

2.2.3. Мутации в гене SUP35, приводящие к потере прионного детерминанта [PSt], Штаммы прионного детерминанта [PSf].

2.3. Создание гибридного приона на основе N- концевого домена ортолога Sup из дрожжей Pichia methanolica.

2.4. Сходство прионной формы белков Sup35 и Ure2 с амилоидами млекопитающих. Структура амилоидных фибрилл.

2.5. Биологическое значение прионов низших эукариот.

3. Клеточные факторы, влияющие на поддержание прионного состояния белков.

3.1. Шапероны: классификация и функциональное значение. ^

3.2. Влияние шаперонов на лрионный переход РгР in vitro и in vivo.

3.3. Роль шаперона HsplQ4 в поддержании детерминанта [PS/1"]. Действие GuHCl на обусловлено инактивацией Hsp 104.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания"

Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы с неизвестной этнологией, таких как скрейпи овец и болезнь Крейцфельда-Якоба человека. Несмотря на то, что эти болезни, особенно у животных, известны довольно давно, природа их оставалась неизвестной вплоть до последнего времени. Медленный прогресс в исследовании этих болезней был связан как с необычно долгим инкубационным периодом при развитии заболевания, так и со способом их возникновения: они могут возникать спорадически и в то же время могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Разнообразие путей возникновения ставило в тупик большинство исследователей. В 1967 была предложена «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент (получивший название "прион") представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподцержанию при помощи автокаталитического механизма. На сегодняшний день эту гипотезу можно считать доказанной. Ее подтверждают практически все экспериментальные данные, а также тот факт, что до сих пор не удалось найти какую-либо нуклеиновую кислоту, связанную с передачей этих инфекционных заболеваний.

За последние десять лет появились работы, показывающие существование прионных белков не только у млекопитающих, но и у дрожжей 5. сегешше и гриба Роёоярога атеппа. Если у млекопитающих существование прионов во всех известных случаях связано с патологией, то у низших эукариот данное явление может иметь адаптивное значение. У дрожжей прионоподобные свойства белков лежат в основе механизмов эпигенетической наследственности и регуляции экспрессии генов на постгрансляционном уровне.

Изучение прионов у дрожжей открывает новые перспективы в понимании сущности этого явления. Возможно, феномен прионов гораздо шире распространен в природе и играет существенно большее значение у различных организмов, чем это известно на сегодняшний день. Поиск в геномных базах выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей. Это наводит на мысль о том, что белки со способностью приобретать альтернативную самоподдерживающуюся кон формацию широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке. Кроме того, до сих пор остается открытой проблема диагностики и лечения прионных болезней у человека. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку при употреблении в пищу мяса больных животных. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, изучение механизмов образования и элиминации прионов у дрожжей позволит глубже понять патогенез прионных заболеваний и разработать подходы к их терапии.

Таким образом, на сегодняшний день актуальной представляется задача поиска белков, критичных для поддержания прионного детерминанта у дрожжей. Подобные белки могли бы в перспективе быть использованы как "молекулярное лекарство" для лечения прионных заболеваний человека и животных. Регуляция экспрессии таких белков в клетке также может представлять интерес как для биологии, так и для медицины. Данная диссертационная работа включает в себя попытку реализации этого замысла с использованием дрожжевого прионного детерминанта.

Несмотря на наличие доказательств прионный гипотезы для ряда белков млекопитающих и низших эукариот, на сегодняшний день получено очень мало данных о структурной организации прионов. Практически все имеющиеся данные получены в экспериментах, проводимых с прионными белками in vitro. Отсутствие структурных данных существенно затрудняет понимание процессов, происходящих в клетке на молекулярном уровне. Поэтому одной из задач нашей работы явилось создание нового методического подхода, дающего информацию о структуре прионов дрожжей, а также использование этого метода для изучения механизмов их репликации. Подобный методический подход может быть использован в будущем и для анализа других прионных белков.

Обзор литературы

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВОЙ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. ФЕНОМЕН

ПРИОНОВ"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

выводы

1) Сверхэкспрессия шаперонов из семейств Нэр70 и Нзр40, а также транскрипционных факторов ввпв н вШ и рибосомного белка ИррО элиминирует прионный детерминант [Р81УР5].

2) Белки 8зп8, 5Ш и 1£рр0 регулируют экспрессию шаперонов, при этом связывается с последовательностью НЭЕ, характерной для промоторов генов шаперонов, и активирует транскрипцию, опосредованную этим элементом. Такая регуляция может объяснять антиприонные эффекты сверхэкспрессии этих белков.

3) Разработаны новые методы выделения прионных частиц и оценки их размера, основанные на устойчивости этих частиц к додецил сульфату натрия. Показано, что прионные частицы имеют сложную структурную организацию, представляя собой агрегаты небольших полимеров белка 8ир35.

4) Штаммы прионного детерминанта [Р51*~\ различаются друг от друга по размеру полимеров.

5) Сверхэкспрессия шаперона приводит к уменьшению размера прионных полимеров ЭирЗЗ, в то время как снижение активности шаперона НэрКМ, напротив, приводит к увеличению их размера. На основании этих результатов высказаны гипотезы об участии этих шаперонов в поддержании детерминанта [Р5!/4] в клетках дрожжей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был впервые предпринят систематический анализ факторов, влияющих на поддержание прионных детерминантов [РЗ/*] и [РЗ/4^] дрожжей 3. сегеушае. Проведенный поиск позволил обнаружить ряд белков 3. сегеутае, которые могут оказывать влияние на процесс прионного перехода белков 8ир35 и 8ир35-Р8, среди которых основную роль играют шапероны семейств №р70 и Нзр40, Остальные найденные в работе белки, по-видимому, действуют на прионный детерминант опосредованно, регулируя экспрессию шаперонов. Так, было установлено, что транскрипционный фактор Звпв может репрессировать многие гены шаперонов семейства №р70; транскрипционный фактор ЭШ может связываться с промоторной последовательностью НЭЕ, присутствующей во многих генах шаперонов, и активировать экспрессию с нее. Рибосомный белок ЯррО при сверхэкспресии может накапливаться во внерибосомных комплексах и также влиять на экспрессию шаперонов. Все эти факты могут представлять интерес при исследовании функций найденных белков в дрожжевой клетке.

Подобный поиск "антиприонных" факторов у дрожжей 3. сегеушае может иметь важное биомедицинское значение для лечения прионных и амилоидных заболеваний человека и животных. Согласно имеющимся литературным данным, дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих. Кроме того, многие из найденных белков (особенно шапероны) консервативны и присутствуют у всех эукариот от дрожжей до человека, что позволяет предполагать их возможное использование в будущем как "молекулярное лекарство" от различных прионных болезней.

Для проведения более углубленного исследования молекулярных механизмов, приводящих к элиминации прионных детерминантов, нами был разработан новый подход, включающий в себя метод очистки прионных агрегатов из дрожжей 3. сегеш^ае, а также электрофоретический метод анализа прионных агрегатов, позволяющий оценивать их размер. Применение этого метода позволило получить новую информацию о структурной организации прионных агрегатов в дрожжевой клетке и впервые получить электронно-микроскопические фотографии этих агрегатов. Кроме того, было проведено исследование влияния различных "антиприонных" воздействий на размер прионных полимеров, что позволило затем предложить молекулярные механизмы, лежащие в основе этих воздействий. Так, мы проанализировали влияние уменьшения и увеличения Нэр104 на размер прионных полимеров, и нашли доказательства "фрагментирующей" модели действия этого белка на детерминант [РЗГ*]. Кроме того, мы предложили механизм действия найденного в скрининге шаперона семейства Нвр40 $1в1, а также низкомолекулярного вещества виНС! на прионный детерминант.

Разработанный метод универсален и может быть применен для других типов дрожжевых прионов, а также использован для установления механизмов действия других "антипрнонных" факторов. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, данный метод может быть полезен и при изучении прионных болезней человека и животных.

110

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Крындушкин, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Инге-Вечтомов С.Г. и Адрианова В.М. (1970). Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. Генетика, 11,103-115.

2. Aigle,M.L.F. (1975). Genetical aspects of URE3., a non-Mendelian, cytoplasmically inherited mutation in yeast. Mol. Gen. Genet, 136, 327-336.

3. Bach,S., Talarek,N., Andrieu,T., VierfondJ.M., Mettey.Y., Galons,H., Dormont,D., Meijer,L., Cullin,C,, and Blondel,M. (2003). Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nat. Biotechnol., 21, 1075-1081.

4. Becker,!, Walter,W., Yan,W., and Craig,E.A. (1996). Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydjlp, in protein translocation in vivo. Mol. Cell Biol., 16, 4378-4386.

5. Belli,G., Gari,E., Piedrafita,L., Aldea,M., and Heuero.E. (1998). An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Res., 26,942-947.

6. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1992). Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol., 73, 329-334.

7. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1994). Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol., 68, 7859-7868.

8. Boeke.J.D., LaCroute,F,, and Fink,G.R. (1984). A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol. Gen. Genet, 197, 345-346.

9. Bounhar,Y., Zhang,Y., Goodyer.C.G., and LeBlanc.A (2001). Prion protein protects human neurons against Bax-mediated apoptosis. J. Biol. Chem., 19; 276, 39145-39149.

10. Bradford,M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72,248254.

11. Bradley,M.E., Bagriantsev.S., Vishveshwara,N., and Liebman,S.W. (2003). Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45. Yeast, 20,625-632.

12. Brown,D.R. (2001). Copper and prion disease. Brain Res. Bull., 55, 165-173.

13. Brown,D.R., Nicholas,R.S., and Canevari,L. (2002). Lack of prion protein expression results in a neuronal phenotype sensitive to stress. J. Neurosci, Res., 67, 211-224.

14. Brown,D.R., Qin,K., Herms,J.W., Madlung,A., Manson,J., Strome.R., Fraser,P.E., Kruck,T., von Bohlen,A., Schulz-Schaeffer,W., Giese.A., Westaway,D., and Kretzschmar,H. (1997). The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature, 390, 684687.

15. Brown,D.R., Wong,B.S., Hafiz,F., Clive.C., Haswell,S.J., and Jones,I.M. (1999). Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochem. J., 344 Pt 1:1-5., 1-5.

16. Bueler,H., Fischer,M., Lang,Y., Bluethmann,H., Lipp,H.P., DeArmond,S.J., Prusiner,S.B., Aguet,M., and Weissmann.C. (1992). Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature, 356, 577-582.

17. Bukau,B. and Horwich,A.L. (1998). The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92, 351-366.

18. Caughey,B., Kocisko,D.A., Raymond,G.J., and Lansbury.P.T., Jr. (1995). Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem. Biol., 2, 807-817.

19. Caughey,B., Raymond,G.J., and Bessen,R.A. (1998). Strain-dependent differences in betasheet conformations of abnormal prion protein. J. Biol. Chem., 273,32230-32235.

20. Chabry.J., Caughey.B., and Chesebio,B. (1998). Specific inhibition of in vitro formation of protease-resistant prion protein by synthetic peptides. J. Biol. Chem., ITS, 13203-13207.

21. Chai,Y., Koppenhafer.S.L., Bonini,N.M., and Paulson,H.L. (1999). Analysis of the role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine disease. J. Neurosci, 19, 10338-10347.

22. Chang,H.C. and Lindquist,S. (1994). Conservation of Hsp90 macromolecular complexes in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 269, 24983-24988.

23. Chemoff,Y.O., Derkach,LL., and Inge-Vechtomov,S.G. (1993). Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet., 24,268-270.

24. Chernofif,Y.O., Galkin,A.P., Lewitin,E., Chernova,T.A., Newnam,G.P., and Belenkiy,S.M. (2000). Evolutionary c onservation o f prion-forming a bilities of the yeast Sup35 protein. Mol Microbiol, 35, 865-876.

25. ChemoffjY.O., Lindquist,S.L., Ono,B., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1995). Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion- like factor PSf). Science, 268, 880-884.

26. Chernoff.Y.O., Newnam,G.P„ Kumar,J., Allen,K., and Zink,A.D. (1999). Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PST\ prion. Mol. Cell Biol., 19, 8103-8112.

27. Chiarini,L.B., Freitas,A.R., Zanata,S.M., Brentani,R.R., Martins,V.R., and Linden,R. (2002). Cellular prion protein transduces neuroprotective signals. EMBO J., 21, 33173326.

28. Cohen,F.E., Pan,K.M., Huang,Z., Baldwin,M., Fletterick,R.J., and Prusiner,S.B. (1994). Structural clues to prion replication. Science, 264, 530-531.

29. Cooper,K.F., Mallory,MJ., Smith,J.B., and Strich,R. (1997). Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p (Srbl Ip/Ssn8p). EMBO J., 16,4665-4675.

30. Cooper,K.F., Mallory,M.J., and Strich.R. (1999). Oxidative stress-induced destruction of the yeast C-type cyclin Ume3p requires phosphatidylinositol-specific phospholipase C and the 26S proteasome. Mol. Cell Biol, 19, 3338-3348.

31. Coschigano,P.W. and Magasanik,B. (1991). The URE2 gene product of Saccharomyces cerevisiae plays an important role in the cellular response to the nitrogen source and has homology to glutathione s-transferases. Mol Cell Biol, 11, 822-832.

32. Coustou,V., Deleu.C., Saupe,S., and Begueret,J. (1997). The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 9773-9778.

33. Cox,B.S. (1965), Psi, a cytoplasmic supressor of super-supressor in yeast. Heredity, 20, 505-521.

34. Cox,B.S., Tuite.MF., and McLaughlin,C.S. (1988). The psi factor of yeast: a problem in inheritance. Yeast, 4, 159-178.

35. DebBurman,S.K., Raymond,GJ., Caughey,B-, and Lindquist.S. (1997). Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 13938-13943.

36. DePace,A.H., Santoso,A., Hillner.P., and Weissman,J.S. (1998). A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion. Cell, 93, 1241-1252.

37. DePace,A.H. and Weissman.J.S. (2002). Origins and kinetic consequences of diversity in Sup35 yeast prion fibers. Nat. Struct. Biol., 9, 389-396.

38. Derkatch,I.L., Chernoff,Y.O., Kushnirov,V.V., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1996). Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 144, 1375-1386.

39. Doel,S.M., McCready,S.J., Nierras,C.R., and Cox,B.S. (1994). The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene. Genetics, 137, 659-670.

40. Eaglestone,S.S., Cox,B.S., and Tuite,M.F. (1999). Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism. EMBO J., 18, 1974-1981.

41. Eaglestone,S.S., Ruddock,L.W., Cox,B.S„ and Tuite,M.F. (2000). Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PSI(+). of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,240-244.

42. Edenhofer.F., Rieger,R., Famulok,M., Wendler,W., Weiss,S., and Winnacker,E.L. (1996). Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family. J. Virol., 70, 4724-4728.

43. Elghetany,M.T. and Saleem,A. (1988). Methods for staining amyloid in tissues: a review. Stain Technol, 63,201-212.

44. Ferreira.P.C., Ness,F., Edwards,S.R., Cox,B.S., and Tuite,M.F. (2001). The elimination of the yeast PS?. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation. Mol. Microbiol, 40, 1357-1369.

45. Fritz,J.D,, Wolff,J.A., and Greaser,M.L. (1993). Partial titin cDNA sequence isolated from rabbit cardiac muscle RNA. J. Muscle Res. CellMotil., 14, 347-350.

46. Gabizon.R., McKinley,M.P., Groth,D., and Prusiner,S.B. (1988). Immunoaffinity purification and neutralization of scrapie prion infectivity. Proc, Natl. Acad. Sci. U. S. A, 85, 6617-6621.

47. Gajdusek,D.C., Gibbs,C.J., and Alpers,M. (1966). Experimental transmission of a Kuru-like syndrome to chimpanzees. Nature, 19;209, 794-796.

48. Gerlach,W.L. (1975). Genetic properties of some amber-ochre supersuppressors in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet., 138, 53-63.

49. Ghaemmaghami,S., Huh,W.K., Bower,K., Howson.R.W., Belle,A., Dephoure.N., 0'Shea,E.K,, and Weissman,J.S. (2003). Global analysis of protein expression in yeast. Nature, 425, 737-741.

50. Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure. Yeast, 11, 355360.

51. Gietz,R.D. and Sugino,A. (1988), New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene, 74, 527534.

52. Glover,J.R., Kowal,A.S., Schirmer.E.C., Patino,M,M., Liu,JJ„ and Lindquist,S. (1997). Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of -PS/1"., a heritable prion-like factor of 5. cerevisiae. Cell, 89, 811-819.

53. Glover,J.R. and Lindquist,S. (1998). Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell, 94, 73-82.

54. Grantcharova,V., Alm,E.J., Baker,D., and Horwich,A.L. (2001). Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol, 11, 70-82.

55. GriffithJ.S. (1967). Self-replication and scrapie. Nature, 215, 1043-1044.

56. Grimminger,V., Richter,K., Imhof,A., Buchner,J., and Walter,S. (2003). The prion curing agent guanidinium chloride specifically inhibits ATP hydrolysis by. Hspl04. J. Biol. Chem., (в печати).

57. Hetz,C., Maundrell.K., and Soto,C. (2003). Is loss of function of the prion protein the cause of prion disorders? Trends Mol. Med., 9, 237-243.

58. Houry,W.A. (2001). Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr. Protein Pept. Sci., 2,227-244.

59. Hsiao,K.K., Scott,M., Foster,D., Groth,D.F., DeArmond,S.J., and Prusiner,S.B. (1990). Spontaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prion protein. Science, 250, 1587-1590.

60. Inoue.H., Nojima,H., and Okayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96,23-28.

61. JarrettJ.T. and Lansbury,P.T., Jr. (1993). Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell, 73, 1055-1058.

62. JonesJ.S. and Prakash,L- (1990). Yeast Saccharomyces cerevisiae selectable markers in pUC18 polylinkers. Yeast, 6, 363-366.

63. Jung,G., Jones,G., and Masison,D.C. (2002). Amino acid residue 184 of yeast Hspl04 chaperone is critical for prion-curing by guanidine, prion propagation, and thermotolerance. Proc. Natl, Acad. Sci. U. S. A, 99, 9936-9941.

64. Jung,G. and Masison,D.C. (2001). Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions. Curr. Microbiol, 43, 7-10.

65. Kascsak,R.J., Rubenstein,R., and Carp,R.I. (1991). Evidence for biological and structural diversity among scrapie strains. Curr. Top. Microbiol. Immunol, 172:139-52., 139-152.

66. Kimura,Y., Koitabashi,S., and Fujita,T. (2003). Analysis of yeast prion aggregates with amyloid-staining compound in vivo. Cell Struct. Funct., 28, 187-193.

67. King,C.Y. (2002). Supporting the structural basis of prion strains: induction and identification of PS/. variants. J. Mol Biol. 307, 1247-1260.

68. Kochneva-Pervukhova,N.V., Chechenova,M.B., Valouev,I.A., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (2001). PSI *. prion generation in yeast: characterization of the "strain" difference. Yeast, 18,489-497.

69. Kocisko,D.A., ComeJ.H., Priola,S.A., Chesebro,B-, Raymond,G.J., Lansbury,P.T., and Caughey,B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature, 370, 471-474.

70. Kopito,R.R. (2000). Aggresomes, inclusion bodies and protein a ggregation. Trends Cell Biol., 10, 524-530.

71. Kushnirov,V.V., Kochneva-Pervukhova.N.V., Chechenova,M.B., Fiolova,N.S., and Ter-Avanesyan,M.D. (2000). Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica. EMBO J., 19,324-331.

72. Kushnirov,V.V. and Ter-Avanesyan,M.D. (1998). Structure and replication of yeast prions. Cell, 94, 13-16.

73. Kushnirov,V.V., Ter-Avanesyan,M.D., Telckov,M.V., Surguchov,A.P., Smirnov,V.N., and Inge-Vechtomov,S.G. (1988). Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene, 66,45-54.

74. Kuwahara,C., Takeuchi,A.M., Nishimura,T., Haraguchi.K., Kubosaki,A., Matsumoto.Y., Saeki,K., Matsumoto,Y., Yokoyama,T., Itohara,S., and Onodera,T. (1999). Prions prevent neuronal cell-line death. Nature, 400, 225-226.

75. Laemmli.U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

76. Laue.T.M. and Rhodes,D.G. (1990). Determination of size, molecular weight, and presence of subunits. Methods Enzy/nol., 182:566-87., 566-587.

77. Lindquist,S., Patino,M.M., Chemoff,Y.O., Kowal,A.S., Singer,M.A., Liebman,S.W., Lee,K.H., and Blake,T. (1995). The role of Hspl04 in stress tolerance and PSt. propagation in Saccharomyces cerevisiae. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol, 60, 451460.

78. Lowndes,N.F., Johnson,A.L., and Johnston,L.H. (1991). Coordination of expression of DNA synthesis genes in budding yeast by a cell-cycle regulated trans factor. Nature, 350, 247-250.

79. Masison,D.C. and Wickner,R.B. (1995). Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells. Science, 270, 93-95.

80. McMahon,H.E., Mange,A., Nishida,N., Creminon,C., Casanova,D., and Lehmann,S. (2001). Cleavage of the amino terminus of the prion protein by reactive oxygen species. J. Biol. Chem. 19;276, 2286-2291.

81. Miller JH (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 352-354.

82. Myers,A.M., Tzagoloff,A., Kinney,D.M., and Lusty,C.J. (1986). Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions. Gene, 45, 299-310.

83. Narayanan,S., Bosl,B., Walter,S., and Reif,B. (2003). Importance of low-oligomeric-weight species for prion propagation in the yeast prion system Sup35/Hspl04. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 100, 9286-9291.

84. Newnam,G.P., Wegrzyn,R.D., Lindquist,S.L., and Chernoff,Y.O. (1999). Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell Biol., 19, 1325-1333.

85. Nicolet,C.M. and Craig,E.A. (1989). Isolation and characterization of 577/, a stress-inducible gene from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol., 9, 3638-3646.

86. Oesch,B., Westaway,D., Walchli.M., McKinley,M.P., Kent,S.B., Aebersold,R., Bany,R.A., Tempst,P., Teplow.D.B., Hood,L.E., and . (1985). A cellular gene encodes scrapie PrP 2730 protein. Cell, 40, 735-746.

87. Osherovich,L.Z. and Weissman,J.S. (2001). Multiple GIn/Asn-rich prion domains confer susceptibility to induction of the yeast PS/(+). prion. Cell, 106, 183-194.

88. Parsell,D.A., Kowal,A.S., Singer,M.A., and Lindquist,S. (1994). Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature, 372,475-478.

89. Patino,M.M., Liu,J.J., Glover,J.R., and Lindquist,S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science, 273,622-626.

90. Paushkin.S.V., Kushnirov,V.V., Smimov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1996). Propagation of the yeast prion-like /357+. determinant is mediated by oligomerization of the Si/P35-encoded polypeptide chain release factor. EMBOJ., 15, 3127-3134.

91. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1997a). In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science, 277,381-383.

92. Paushkin.S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1997b). Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell Biol., 17,2798-2805.

93. Perutz,M.F., Finch,J.T., BerrimanJ,, and Lesk,A. (2002a). Amyloid fibers are water-filled nanotubes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99, 5591-5595.

94. Prusiner,S.B. (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216, 136-144.

95. Prusiner.S.B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science, 252, 1515-1522.

96. Prusiner,S.B., Bolton,D.C., Groth,D.F., Bowman,K.A., Cochran,S.P., and McKinley.M.P. (1982). Further purification and characterization of scrapie prions. Biochemistry, 21, 69426950.

97. Prusiner,S.B., Hadlow,W.J., Garfin,D.E., Cochran,S.P., Baringer,J.R., Race,R.E., and Eklund.C.M. (1978). Partial purification and evidence for multiple molecular forms of the scrapie agent. Biochemistry, 17, 4993-4999.

98. Prusiner.S.B., McKinley,M.P., Bowman,K.A., Bolton,D.C., Bendheim,P.E., Groth,D.F., and Glenner,G.G. (1983). Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell, 35, 349-358.

99. Rose.A.B. and Broach,J.R. (1990). Propagation and expression of cloned genes in yeast: 2-micions circle-based vectors. Methods Enzymol, 185:234-79., 234-279.

100. Safar.J., Wille,H., Itri,V., Groth,D., Serban,H., Torchia,M., Cohen,F.E., and Prusiner,S.B. (1998). Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med., 4, 1157-1165.

101. Sambrook.J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989a). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

102. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis.T. (1989b), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

103. Sanger,F., Nicklen,S., and Coulson,A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 74, 5463-5467.

104. Santos,C. and Ballesta,J.P. (1994). Ribosomal protein PO, contrary to phosphoproteins PI and P2, is required for ribosome activity and Saccharomyces cerevisiae viability. J. Biol. Chem., 269,15689-15696.

105. Santoso,A., Chien,P., Osherovich,L.Z., and WeissmanJ.S. (2000), Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell, 100,277-288.

106. Sarokin,L, and Carlson,M. (1986). Short repeated elements in the upstream regulatory region of the SUC2 gene of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol., 6, 2324-2333.

107. Scott,M., Groth,D., Foster,D., Torchia,M., Yang,S.L., DeArmond,S.J., and Piusiner,S.B. (1993). Propagation of prions with artificial properties in transgenic mice expressing chimeric PrP genes. Cell, 73, 979-988.

108. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

109. Sigurdsson,E.M., Wisniewski,T., and Frangione.B. (2002). Infectivity of amyloid diseases. Trends Mol. Med., 8, 411-413.

110. Simons.K. and Ehehalt,R. (2002). Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest, 110, 597-603.

111. Song,W. and Carlson,M. (1998). Srb/mediator proteins interact functionally and physically with transcriptional repressor Sfll. EMBOJ., 17,5757-5765.

112. Song,W„ Treich,I., Qian,N„ Kuchin,S., and Carlson,M. (1996). SSN genes that affect transcriptional repression in Saccharomyces cerevisiae encode SIN4, ROX3, and SRB proteins associated with RNA polymerase II. Mol. Cell Biol., 16,115-120.

113. Soti.C. and Csermely,P. (2003). Aging and molecular chaperones. Exp. Gerontol., 38, 1037-1040.

114. Sparrer,H.E., Santoso,A., Szoka,F.C., Jr., and WeissmanJ.S. (2000). Evidence for the prion hypothesis: induction of the yeast PSf~\ factor by in vitro- converted Sup35 protein. Science, 289, 595-599.

115. StansfieId,I., Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1995a). A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes. Curr. Genet., 27,417-426.

116. Tanaka M., Chien P. and Weissman J. (2004). Conformational Variations in an Infectious Protein Determine Prion Strain Differences. Nature, (в печати).

117. TatzeltJ., Prusiner,S.B., and Welch,W.J. (1996). Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein. EMBO J., 15,6363-6373.

118. Taylor,K.L., Cheng,N., Williams,R.W., Steven,A.C., and Wickner,R.B. (1999). Prion domain inidation о f amyloid formation in vitro from native Ure2p. Science, 283, 13391343.

119. Ter-Avanesyan,M.D., Dagkesamanskaya,A.R., Kushnirov,V.V., and Smimov,V.N. (1994). The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant PSt. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 137, 671676.

120. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc, Natl. Acad. Set. U. S. A, 76, 4350-4354.

121. True,H.L. and Lindquist,S.L. (2000). A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature, 407,477-483.

122. Tuite,M.F., Lund,P.M., Futcher,A.B., Dobson,M.J., Cox,B.S., and McLaughlin,C.S. (1982). Relationship of the \psi\ factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae. Plasmid, 8,103-111.

123. Tuite,M.F., Mundy,C,R., and Cox,B.S. (1981). Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-J in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 98, 691-711.

124. Urakov.V.N., Valouev,I.A., Lewitin,E.I., Paushkin,S.V., Kosorukov,V.S., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (2001). Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC. Mol. Biol., 2, 9.

125. WaIsh,D.M., Klyubin,I., FadeevaJ.V., Rowan,M.J., and Selkoe.D.J. (2002). Amyloid-beta oligomers: their production, toxicity and therapeutic inhibition. Biochem. Soc. Trans., 30, 552-557.

126. Wang,K. (1982). Purification of titin and nebulin. Methods Enzymol., 85 Pt B:264-74., 264-274.

127. Warner,J.R., Vilardell,J., and Sohn,J.H. (2001). Economics of ribosome biosynthesis. Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol., 66:567-74., 567-574.

128. WarrickJ.M., Chan,H.Y., Gray-Board, Chai,Y., Paulson,H.L., and Bonini,N.M. (1999). Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet., 23,425-428.

129. Wegrzyn,R.D., Bapat,K„ Newnam,G.P., Zink,A.D., and Chernoff,Y.O. (2001). Mechanism. of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast. Mol. Cell Biol., 21,4656-4669.

130. Welch,W.J. and Gambetti,P. (1998). Chaperoning brain diseases. Nature, 392,23-24.

131. Wickner,R.B. (1994), URE3. as an altered URE2 protein; evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science, 264, 566-569.

132. Yan,W. and Craig,E.A. (1999). The glycine-phenylalanine-rich region determines the specificity of the yeast Hsp40 Sisl. Mol. Cell Biol, 19, 7751-7758.

133. Yeh,L.C., Horowitz,P.M., and Lee.J.C. (1988). Studies of RNA-protein interactions in the yeast 5 S ribonucleoprotein particles by fluorescence and tritium exchange. Implications forribosomal assembly. J. Biol. Chem., 263, 17412-17417.

134. Yoo,B.C., Kim,S.H., Cairns,N., Fountoulakis,M., and Lubec,G. (2001). Deranged expression of molecular chaperones in brains of patients with Alzheimer's disease. Biochem. Biophys. Res. Commutt., 280, 249-258.

135. Young,J.C., Barral,J.M., and Ulrich,H.F. (2003). More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem. Sci., 28, 541-547.

136. Я выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Михаилу Давидовичу Тер-Аванесяну за неизменный интерес к моей работе, множество полезных советов, а также практическую помощь при проведении некоторых экспериментов.

137. Искренне благодарен Виталию Владимировичу Кушнирову за помощь в планировании и проведении экспериментов, доброжелательность и дружеское участие.

138. Очень благодарен М.О. Агафонову за множество советов при выполнении работы, а также ценные критические замечания.

139. Благодарен И.М. Александрову за участие в выполнении экспериментов, описанных в Главе 4.1. Хочу поблагодарить также

140. Н.В. Кочневу-Первухову за советы по постановке генетических экспериментов

141. A.B. Воротникова за помощь в выборе маркеров для электрофоретического метода, атакже при получении фотографий с флуоресцентного микроскопа

142. А.Б. Сальникову и О.В. Миткевич за помощь в проведении некоторых экспериментов

143. H.A. Киселева и В.Я. Стельмащука за получение электронно-микроскопических снимков

144. Е. Craig, J.P. Ballesta, Н. Ruis, M.F. Tuite за предоставление некоторых антител и плазмид

145. Г.В. Фоминова, В.Н. Уракова, И.А. Валуева, И.С. Шкундину, М.Б. Чеченову, Н.В. Романову, А.Н. Пакайзер, Т.А. Аверину и С.С. Соколова за полезные советы и обсуждение результатов работы.

Информация о работе

Крындушкин, Дмитрий Сергеевич
кандидата физико-математических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы