Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

ЙИ4Ь06698

Г

На правах рукописи

Безсонов Евгений Евгеньевич

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЛЮКАНТРАНСФЕРАЗЫ ВЫ,2Р И СПОСОБ ЕЕ ЗАКРЕПЛЕНИЯ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ БАССНАКОМУСЕБ СЕИЕУШАЕ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004606698

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Кулаев Игорь Степанович;

доктор биологических наук, профессор

Калебина Татьяна Сергеевна.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Добров Евгений Николаевич; Савицкий Александр Павлович.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «_25_» июня 2010 г. в 14:00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, лабораторный корпус «А», ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 24 » мая 2010г.

Ученый секретарь ^ й

диссертационного совета, —1

кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточная стенка (КС) дрожжей состоит из ßl,3- и ßl,6-глюканов, составляющих до 60% массы КС, 40% белков, которые являются маннопротеинами различной степени гликозилирования, и минорного, но очень важного в структурном отношении полисахарида - хитина, на долю которого приходится не более 5% массы этой органеллы. КС покрывает всю поверхность клетки дрожжей и располагается за пределами цитоплазматической мембраны. Она выполняет функцию прочного наружного скелета, определяет форму клетки и защищает ее от внешних воздействий. Вместе с тем, КС является динамичной органеллой, структура которой может быстро и кардинально перестраиваться в зависимости от стадии жизненного цикла дрожжевой клетки и претерпевать постоянные локальные изменения в процессе ее роста и растяжения. На структуру КС оказывают влияние условия окружающей среды. В указанных изменениях ключевую роль играют белки КС, принимающие участие в окончательном формировании ее молекулярного ансамбля.

Можно классифицировать белки КС дрожжей по способу их закрепления. В соответствии с этой классификацией, они подразделяются на связанные и не связанные ковапентно с полисахаридами КС. Белки первой группы (сокращенно CWP - tovalently linked cell wall proteins) могут быть экстрагированы из данной огранеллы с использованием таких гидролаз, как ß-глюканазы, (например, ламинариназа) (Pastor et al., 1984; Van Der Vaart et al., 1995, Shimoi et al., 1998), а также щелочной экстракцией (Mrsa et al., 1997; Mrsa and Tanner, 1999). Белки, обладающие остатком GPI-якоря (GPI-белки), через который они ковалентно связаны с глюканом КС, входят в группу CWP-белков. Роль этих белков в функционировании КС дрожжей активно изучается. Белки второй группы могут быть экстрагированы в буфер, содержащий ДСН, восстанавливающие реагенты (Д L I, ß-меркаптоэтанол) и ЭДТА при нагревании (Chaffin and Stocco, 1983; Valentin et al., 1984). Большинство этих белков (SEP-белков - от англ. sodium dodecyl sulfate gxtractable protein) закреплены с помощью нековалентных взаимодействий. Следует отметить, что некоторые члены данной группы могут быть связаны друг с другом и/или CWP-белками посредством

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотреитол; КС -клеточная стенка; O.E. - оптическая единица; ПААГ - полиакриламидный гель; ЭДТА -этилендиаминтетраацетат натрия; EndoH - эндогликозидаза Н; GPI-белки — белки КС, связанные с глюкановым каркасом посредством остатка гликозилфосфоинозитолыюго якоря; 0D54i> - поглощение при длине волны 540 нм; SEP-белки - ДСH/ß-меркаптоэтанол-экстрагируемые белки КС.

дисульфидных связей, образуемых между остатками цистеинов белковых молекул. В группе SEP-белков есть много ферментов, в том числе обладающих глюканазной и/или глюкантрансферазной активностью.

Глюкантрансферазы - группа ферментов, участвующих в создании и перестройках глюканового каркаса КС. Следует отметить, что данная группа исследована недостаточно. Один из таких белков - глюкантрансфераза Bgl2p - мажорный SEP-белок, обнаруживающийся в большом количестве на всех стадиях роста культуры (45000 молекул на клетку в логарифмической фазе роста - Ghaemmaghami et al., 2003). Bgl2p это небольшой (31.5-34 кДа в зависимости от вида дрожжей), консервативный белок, присутствие которого в КС показано для многих видов дрожжей. Молекула Bgl2p имеет один N-связанный олигоманнозид небольшого размера (приблизительно 2.5 кДа), который, как было опубликовано ранее, присоединен к аспарагину-284 (Mrsaet al., 1993).

По результатам анализа первичной структуры BgI2p может быть отнесен к семейству 17 гликозид гидролаз (ЕС 3.2.1.58). Было показано in vitro, что при низких концентрациях глюкозных олигосахаридов у Bgl2p может наблюдаться эндоглюканазная активность, а при более высоких преобладает глюкозилтрансферазная активность (Goldman et al., 1995). Делеция гена BGL2 не приводит к возникновению выраженного фенотипа при стандартных лабораторных условиях выращивания, за исключением небольшого увеличения содержания в КС хитина и щелочерастворимого (Р1,3-связанного) глюкана - структурных компонентов КС (Mrsa et al., 1993; Laurinavichyute et al., 2000; Sestak et al., 2004).

Bgl2p характеризуется несколькими необычными свойствами, выделяющими его из общей массы белков КС. В нашей лаборатории было показано, что Bgl2p в составе КС устойчив, по сравнению с другими SEP-белками, к гидролизу трипсином, хотя и содержит 19 остатков Lys и Arg в своей молекуле, и протеиназой К (в белке 134 сайта для гидролиза этой протеиназой). Bgl2p характеризуется необычайно прочным закреплением в КС, например, он не может быть экстрагирован из изолированной КС с помощью 1% ДСП при 37°С в отличие от большинства SEP-белков КС. Bgl2p, как уже было сказано, не содержит GPI-якоря. Однако, в штамме дрожжей S. cerevisiac, характеризующемся нарушенным формированием GPI-якорей, он не закрепляется в КС, а секретируется в среду культивирования (Kalebina et al., 2002). Кроме того, известно, что Bgl2p разных видов дрожжей демонстрирует выраженную тенденцию к формированию агрегатов при очистке (Klebl and Tanner, 1989; Hartland et al., 1991; Elorza et al., 1988) Ранее в нашей лаборатории была показана способность Bgl2p, выделенного из КС при нагревании, формировать фибриллярные структуры (Плотникова, 2006).

Jeng и соавторы обнаружили, что у Candida albicans Вц12р выполняет роль адгезина (Jeng et а)., 2005). Авторы предположили, что ключевую роль в данном процессе играют лектин-подобные свойства этого фермента. Bgl2p является термостабильным белком -исследователи выделяли его при температуре 70°С и более, после чего он был способен проявлять ферментативную активность (KJebl and Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993). Bgl2p проявляет высокую аффинность к Р1,3-глюкану и, что достаточно удивительно, к хитину (Klebl andTanner, 1989; Mrsaetal., 1993).

Несмотря на более чем 20-летнюю историю изучения, структура молекулы Bgl2p практически не охарактеризована. Отсутствуют сведения относительно причин, обуславливающих способность данного белка столь прочно закрепляться в КС.

Цели н зтачн исследования. Целью работы являлось исследовать физико-химические свойства, особенности структуры глюкантрансферазы Bgl2p и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей S. cerevisiae. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Установить, присутствует ли в клеточной стенке дрожжей S. ccrcvisiac дикого типа пул молекул Bgl2p, закрепленных при помощи дисульфидных связей.

• Сравнить первичную структуру, ковалентные модификации, а также способность формировать олигомеры и фибриллы Bgl2p, выделенного из клеточных стенок штамма дрожжей S. cerevisiae дикого типа и секретируемого в культуральную жидкость штамма с нарушенным формированием GPI-якорей.

• Исследовать способность глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из клеточной стенки дрожжей S cerevisiae дикого типа, образовывать фибриллы и изучить конформационные изменения ее молекулы в зависимости от температуры.

Научная новизна работы. В данной работе впервые было обнаружено, что способность выделенного из КС дрожжей S. cerevisiae Bgl2p существовать в фибриллярной форме снижается при увеличении температуры. Также впервые изучена температурная зависимость степени экспонированности триптофановых остатков Bgl2p, выделенного из КС, при этом обнаружено, что у данного белка при нагревании происходит ее уменьшение. Показано, что Bgl2p практически весь в КС не закреплен посредством дисульфидных связей. Также было показано отсутствие N-гликозилирования по остатку аспарагина-284 (N-284) по крайней мере у части молекул Bgl2p КС, что свидетельствует о наличии у данных молекул N-гликозилирования по другому сайту. Впервые показано отсутствие различий в первичной

структуре Bgl2p из КС штамма дрожжей дикого типа и Bgl2p из среды культивирования штамма А270, характеризующегося нарушением формирования GPI-якорей.

В процессе выполнения данной работы у дрожжей S.cerevisiae впервые обнаружена способность глкжантрансферазы Bgl2p из среды культивирования формировать структуры фибриллярной морфологии. Показано, что Bgl2p из КС дрожжей A-типа спаривания, так же, как и Bg!2p из КС дрожжей a-типа спаривания, не экстрагируется из КС при обработке 1% ДСН и устойчив в ее составе к обработке трипсином.

Практическая значимость работы. Исследование физико-химических свойств и особенностей закрепления Bgl2p КС дрожжей S. cerevistae помимо несомненного научного интереса имеет и практическую значимость. Полученные в этой работе данные, ввиду наличия амилоидных свойств у Bgl2p и его устойчивости к повышенным температурам, должны учитываться в технике безопасности при производстве и использовании препаратов из дрожжей (например, биологически активных добавок), а также при разработке тест-систем, направленных на выявление потенциальной опасности продуктов, получаемых из дрожжевых микроорганизмов, для здоровья человека и животных.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на семинаре кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ. Результаты работы были представлены на конференциях: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Москва, Россия (2008); «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» Новосибирск, Россия (2008); «27* International Specialized Symposium on Yeasts» Paris, France (2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста, включают 43 рисунка и 17 таблиц, список литературы включает 163 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры микроорганизмов. В работе использовали штаммы дрожжей S. cerevisiac: DBY 746 (генотип МАТа ига3-52 Ieu2-3.I12 trp 1-289 his3-Al)\ DBY 747 (генотип MATA ura3-52 Ieu2-3,II2 trpl-289 his3-A¡) - любезно предоставлены М.Д. Тер-Аванесяном (Российский Кардиологический центр РКНПК, Москва); Abgl2a (МАТа игаЗ-52 1еи2-3,112 trp1-289 his3-Al BGL2::URA3), Abgl2A (MATA ura3-52 leu2-3,112 trpl-289 h¡s3-Al

BGl.2::l!I(A3) - получены в данной работе; А270 (генотип МАТа ura3-52 Icu2 lrpl-2S<J his3-Л! ssu2l) -любезно предоставлен Г.В. Фоминовым.

Генно-инженерные процедуры. В работе использовали методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984). Трансформацию дрожжей проводили по методике (Ito et al., 1983) Манипуляции с ДНК осуществляли согласно соответствующим протоколам (Sambrook et al., 1989).

Получение клеточных стенок дрожжей. Клетки дрожжей разрушали с помощью стеклянных шариков (0.5 мм; Sigma) при охлаждении в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 8.0 в присутствии 5 мМ фенилметилсульфонилфторида и 5 мМ ЭДТА. Центрифугированием (на центрифуге ОПн-8/РУ 180Л) отделяли КС от внутриклеточного содержимого. Далее полученный препарат промывали буфером, 1% сахарозой, IM NaCl, 0.17 М NaCl, водой (каждую промывку делали дважды) Степень чистоты получаемого препарата КС контролировали с помощью светового микроскопа.

Обработка клеточных стенок дрожжей трипсином. При необходимости препарат КС обрабатывали трипсином (Sigma), перемешивая 2 часа при ЗТ'С, из расчета 1 мг трипсина на 10 O.E. (ODsjo) КС в 0.3 мл 50 мМ трис-HCl буфера pH 7.5. Далее КС осаждали центрифугированием, 4 раза промывали 1 М NaCl, трижды промывали водой.

Обработка клеточных стенок дрожжей ДСП. Для последующей очистки препарат КС обрабатывали при перемешивании в течение 1 часа при 37°С 1% ДСН (Amresco), далее КС осаждали центрифугированием, промывали 5 раз 0.2 М натрий-ацетатным буфером pH 5.5 и водой. Затем КС в течение 15 мин инкубировали со смесью бутанол-вода в соотношении 0.7:1 (по объему) и осаждали центрифугированием. Процедуру повторяли три раза. Полученный препарат КС трижды промывали водой.

Экстракцию Bgl2p из клеточных стенок дрожжей проводили по разработанной ранее в нашей лаборатории методике. Препарат КС, обработанный трипсином и ДСН, ресуспендировали в деионизованной воде из расчета 1 O.E. (ODs®) на 10 мкл воды и инкубировали при 53°С в течение 15 мин. КС осаждали центрифугированием на центрифуге MiniSpin (Eppendorf), супернатант удаляли и ресуспендировали КС в таком же объеме деионизованной воды. Затем КС инкубировали при 70°С в течение 15 мин, осаждали центрифугированием на максимальных оборотах в течение 4 мин. Полученный супернатант содержал Bgl2p.

Фильтрование среды культивирования дрожжевых клеток проводили с использованием половолоконных картриджей MidGee Cross Flow (GE Healthcare), внутренний объем 0.5 мл, предел отсечения 100 кДа.

Получение белков из среды культивирования дрожжей. Среду роста отделяли от клеток дрожжей центрифугированием, полученную надосадочную жидкость подвергали фильтрованию, лиофильно высушивали, растворяли в требуемом объеме буфера для нанесения проб и затем использовали для дальнейшего электрофоретического и Вестерн-блот анализа.

Электрофорез белков проводили в ПААГ в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970). Для идентификации белков с антителами проводили Вестерн-блот анализ по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Поликлональные антитела к белку BgI2p были получены в Институте биофизики клетки РАН (Пущино, Россия) О С. Моренковым.

MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ был проведен с использованием масс-спектрометра Bruker Daltonics Ultraflex MALDI TOF/TOF (Bruker Daltonics) при участии P.X. Зиганшина и И.Ю. Торопыгина.

Электронную микроскопию фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Bgl2p, проводили согласно соответствующей методики (Blanchard et al., 2004). Визуализацию фибрилл после контрастирования уранил ацетатом осуществляли в совместных экспериментах с И.О. Селях на электронном микроскопе JEM - 100 В (JEOL) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Визуализация фибриллярных структур, формируемых Вр12о. при помощи антител. Препарат, содержащий глюкактрансферазу Bgl2p, подсушивали на стекле, окрашивали первичными поликлональными антителами к Bgl2p, затем вторичными поликлональными антителами, содержащими флуорофор Alexa-488 (Invitrogen). Фотографии фибриллярных структур, формируемых Bgl2p, были получены с использованием конфокального микроскопа Leica TCS SP2 AOBS (Leica) в Центре визуализации живой клетки Ростокского университета, г. Росток, Германия и с использованием конфокального микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200М LSM 510 META (Zeiss) на Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова.

Изучение собственной флуоресценции глюкантрансферазы Bgl2p. Собственную флуоресценцию препарата Bgl2p измеряли при длине волны возбуждения 297 нм, регистрируя интенсивности флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм. Отношение интенсивности собственной флуоресценции триптофановых остатков белка при длине волны 320 нм к интенсивности флуоресценции при длине волны 365 нм (параметр А) рассчитывали согласно Туроверову (Туроверов и др., 1975). Рассеяние детектировали, измеряя интенсивность флуоресценции при 358 нм при длине волны возбуждения 350 нм. Полученные данные обрабатывали программой Origin 7.0. Измерения флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varian Inc.).

Изучение связывания флуоресцентного красителя тиофлавина Т. Изучение флуоресценции тиофлавина Т (Nilsson, 2004) в экстракте Вц12р проводили с использованием флуоресцентного спектрофотометра Сагу Eclipse (Varían Inc.). В качестве контроля измеряли флуоресценцию указанного красителя в воде Раствор тиофлавина Т перед использованием фильтровали через фильтр (Millipore) с диаметром пор 0.2 мкм.

Измерение динамического лазерного светорассеяния. Динамическое лазерное светорассеяние регистрировали на приборе Zeta Sizer Nano ZS (Malvern Inc.) в НИИ ФХБ им. А Н Белозерского при участии П И. Семенюка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Сравнение В°12р. закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p. секретируемого в среду культивирования дрожжей S. cerevisiae.

Несмотря на способность Bgl2p необычайно прочно закрепляться в КС дрожжей S. cerevisiae, описана мутация, при которой данный белок не встраивается в КС, а в большом количестве обнаруживается в среде культивирования. Эта мутация в гене SSl/21 MCD-I, сопровождается снижением количества GPI-белков вследствие нарушения формирования GPI-якорей (Packeiser et al., 1999; Maneesri et al., 2005). Известно, что у дрожжей некоторые GPI-белки, обладают протеолитической активностью (ICrysan et al., 2005), в то же время у родственного Bgl2p фермента - глюканазы табака, - ранее был обнаружен процессинг, в результате которого отщепляется С-концевой фрагмент полипептидной цепи (Shinshi et al., 1988). Сопоставление перечисленных фактов позволяло с одной стороны предполагать наличие аналогичного С-концевого процессинга у глюкантрансферазы Bgl2p в штамме дикого типа, а с другой - нарушение этого процессинга у штамма с мутацией в гене SSU21/MCD4 и, как следствие, потерю глюкантрансферазой Bgl2p способности закрепляться в КС. Для проверки высказанного предположения мы провели сравнительный анализ глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из КС дрожжей S. cerevisiae родительского штамма дикого типа, в котором данный фермент прочно закреплен в КС, с Bgl2p из культуральной жидкости штамма А270 с мутацией в гене SSU21/MCD4 при помощи MALDI масс-спектрометрии. В качестве дополнительного контроля был проведен анализ глюкантрансферазы Bgl2p из штамма А270 с плазмидой, несушей ген SSU2L%{CD-I дикого типа, в котором Bgl2p встраивался в КС.

В результате проведенного анализа мы обнаружили С-концевой пептид, соответствующий полноразмерной белковой последовательности в составе Bgl2p, во всех

исследованных образцах. Таким образом, высказанное предположение о возможной роли С-концевого процессинга в закреплении данного белка не подтвердилось.

На следующем этапе работы был проведен масс-спектрометрический анализ образцов Bgl2p из КС штамма дрожжей А270, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа, и Bgl2p из среды культивирования штамма А270 (рис. 1). После гидролиза трипсином

.0 20 ":0 40 50 Í0

1-г.ГоГТ1ЛГА ÁIM5T7AS3 V5.-.IGELAFN LGVKNNDGTC KSTSDQETEL OALK3YTSTV

70 .0 .0 ..0 ..0 . 0

KVYAASDCNT LQNLGPAAEA EGFTIFVGVW PTDDSHQAAE KAALQTJJLPK IKS^TVAGFL

.:о 140 о . о :70 . о

VGSEALYRND LTA¡j¡QLSDKI NDVRSWADI SDSDGKSYSG KOVGTVDSWN VLVAGYNSAV

irO -оо ::о :;о :-о

iEASDFVMAN AFSYWOGOTM QNASYSFFDD IMQALOVIOS TKGSTDITFW VGETGWPTDG

150 Z'.Ü j_o :ÍO : o

TNFESSYPSV DNAK2FWKEG ICSMRAWGVN VIVFEAFDED WKPNTSGTSD VEKHWGVFTS

i-0

SDNLKYSLDC DFS

Рисунок 1. Результаты MALD1 масс-спектрометрического анализа глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae А270, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD-I дикого типа, и Bgl2p из среды культивирования штамма А270. На последовательности Bgl2p полужирным шрифтом выделены детектированные при масс-спектрометрии участки молекулы, нижним подчеркиванием и полужирным шрифтом отмечены не детектированные участки молекулы, обычным шрифтом отмечен сигнальный пептид, шрифтом увеличенного размера отмечены потенциальные сайты N-гликозилирования (N-202 и N-284), черным цветом залиты потенциальные сайты фосфорилирования, предсказанные программой KinasePhos.

в исследованных образцах детектировали практически все пептиды и разницы в их наборах между Bgl2p из КС и Bgl2p из среды культивирования обнаружено не было. В обоих случаях не детектировали лишь короткие пептиды 55-61, 145-156 и длинный пептид 162-222 (масса 6771.1792 Да). В этих пептидах можно предположить ковапентные модификации, поскольку они содержат остатки серина и треонина, а пептид 162-222 включает еще и остатки аспарагина.

В ходе анализа было обнаружено, что во всех исследованных образцах детектируется пептид 266-293 (масса 3140.4847 Да), содержащий аспарагин (N-284), который по данным Mrsa (Mrsa et al., 1993) должен быть N-гликозилирован. Последовательность данного пептида подтверждена при помощи MS/MS анализа, следовательно, как минимум у части

молекул Вц12р гликозилирование по остатку N-284 отсутствует. Как уже упоминалось, в последовательности Вц12р присутствует также второй потенциальный сайт М-гликозилирования - N-202 (Мг5а е1 а1, 1993) - однако пептид 162-222, содержащий остаток дайной аминокислоты, не входил в диапазон анализируемых масс при МАЬ01-масс-спектрометрии.

Для дополнительной характеристики Вц12р требовалось проверить наличие К-гликозилированля у В"12р, закрепленного в КС, и этого белка, секретируемого в культуральную среду. Для этого мы провели обработку В§12р, выделенного из КС штамма А270 с восстановленным синтезом вРЬякорей (несущего плазмиду с геном $$'[/21МСО-1 дикого типа), и Bgl2p из среды культивирования штамма А270 ферментом ЕпёоН (эндогликозидазой Н), специфически отщепляющим Ы-связанный полисахаридный компонент гликозилирования. Результаты эксперимента представлены на рис. 2, на котором видно, что Вц12 имеет одинаковое ^гликозилирование как в КС, так и в среде культивирования. Разница молекулярных масс между исходной молекулой Bgl2p и Bgl2p, обработанной Епс1оН, составила приблизительно 3 кДа. Таким образом, у изучаемых молекул никаких различий по размеру Ы-гликозилирования обнаружено не было.

Рисунок 2. Вестерн-блот анализ глюкантрансферазы Вц12р из клеточных стенок штамма НассИаготусех сегеушае с нормальным синтезом ОР1-якорей (1) и культуральной среды штамма с нарушенным синтезом ОР1-якорей (2). ЕпёоН -" - препарат белка не обрабатывали Епс1оН, " EndoH +" - препарат белка обрабатывали ЕпёоН. 2р визуализировали при помощи специфических антител

По-видимому, часть молекул (а возможно и все молекулы) В«12р может быть Ы-гликозилирована по остатку N-202 (второй потенциальный сайт Ы-гликозилировапия в последовательности В«12р), что дополняет данные МгЁа (Мг§а е1 а1., 1993).

Биоинформатический анализ последовательности В§12р с помощью программы КтазеРЬоэ, направленный на поиск сайтов фосфорилирования, показал, что наиболее вероятные сайты фосфорилирования локализуются в детектированных при масс-спектрометрии областях молекулы (рис 1), что с высокой степенью вероятности свидетельствует об отсутствии фосфорилирования данных аминокислотных остатков, как в белке из КС, так и в белке из культуральной жидкости.

Таким образом, по всем исследованным параметрам глюкантрансфераза Ву12р из среды культивирования штамма А270 с нарушенным геном 58С/21МСО-1 не отличается от Bgl2p из

34кДа —►

Ш""** « 31 кДа

ЕпаоН - ЕпйоН +

КС дрожжей дикого типа Это позволяет заключить, что способность встраиваться и прочно связываться с компонентами КС теряет, по-видимому, не в связи с изменением

первичной структуры или же ковалентных модификаций данного белка Причиной отсутствия закрепления Вц12р в штамме А270 может быть измененная структура КС и/или опосредованное этим изменение конформации В»12р. Особенности конформационных изменений В§12р будут обсуждены в следующих разделах работы. Как уже было сказано, в КС штамма с нарушенным геном 881121/МСй4 существенно уменьшено содержание СР1-белков, которые, следовательно, могут являться важными компонентами, необходимыми для закрепления Bgl2p в КС.

2. Формирование ассоииатов Пд12р фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма Ж. сегеутае А270 с нарушенным геном Ц21/МСР4.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в препарате В§12р, полученном из КС путем экстракции при нагревании, детектируются структуры фибриллярной морфологии (Плотникова, 2006). Мы проверили способность BgI2p из среды культивирования дрожжей 5. сегега/'ае формировать фибриллярные структуры. Для этого мы использовали культуральную среду штамма А270 с нарушенным геном 881121/МС.П4, характеризующегося повышенной секрецией В§12р в среду культивирования. Поскольку культуральная среда помимо В§12р содержала другие белки, для их удаления нами был применен метод фильтрации препарата через половолоконный картридж, пропускающий компоненты с молекулярной массой менее 100 кДа (молекулярная масса Bgl2p составляет 34 кДа). Результаты процедуры фильтрования культурапьной среды представлены на рис. ЗА. Видно, что Bgl2p из среды культивирования успешно проходит через фильтр, пропускающий белки с массой менее 100 кДа (рис. ЗА, дорожка 2), что является свидетельством отсутствия крупных ассоциатов Bgl2p (более 2-3 молекул Bgl2p) в культуральной среде и устойчивости Bgl2p при его концентрации в среде культивирования к процессам агрегации/ассоциации. Если бы В§|2р некотролируемо агрегировал, то уже в процессе культивирования дрожжей он весь собрался бы в агрегаты и не смог пройти через используемый фильтр. Данный подход также применим для частичной очистки среды культивирования, содержащей Bgl2p.

На следующем этапе проводили окрашивание препаратов культуральной среды, предварительно инкубировавшихся при температуре 37°С, антителами к Вё12р. В результате при конфокальной микроскопии детектировали структуры с неразличимой данным методом морфологией (средний размер 20-40 мкм), которые специфически окрашивались антителами

к Вё12р (данные не приведены) Нами было выдвинуто предположение, что В§12р в среде культивирования эффективно образовывал фибриллярные структуры, которые затем соединялись в более плотные ассоциаты Чтобы зарегистрировать наличие фибриллярных структур, формируемых данным белком, мы применили подход, заключающийся в добавлении Конго Красного, который обладает способностью ингибировать формирование амилоидных фибрилл (Рпс! е! а!., 2007). Нам удалось подобрать концентрацию Конго Красного (В мкМ), при которой формируются фибриллярные структуры длиной 2-10 мкм в препарате из среды культивирования штамма А270 (данные не приведены). Следует отметить, что при окрашивании препарата Ву12р, получаемого из КС путем экстракции в

■

Рисунок 3. Вестерн-блот анализ с применением антител к Bgl2p лиофильно высушенных препаратов среды культивирования штамма дрожжей Насскаготусех сегехЛйас А270 с нарушенным геном XV1121 МС1)4 (образцы растворяли в буфере для нанесения проб Леммли): 1 - препарат компонентов среды культивирования, не прошедших через фильтр, пропускающий белки с массой менее 100 кДа; 2 4- препараты компонентов среды культивирования, прошедших через фильтр, пропускающий белки с массой менее 100 кДа; I, 2 - препарат сконцентрировали в 10 раз; 3, 4 - препарат сконцентрировали в 100 раз. Жирными стрелками отмечены высокомолекулярные формы В£12р

воду при нагревании, антителами к В«12р с помощью конфокальной микроскопии также регистрируются агрегаты фибриллярной морфологии длиной до 10 мкм (данные не приведены). Таким образом, использованный нами подход, заключающийся в добавлении ингибитора формирования амилоидных фибрилл, позволил детектировать фибриллярные структуры в препарате Bgl2p из культуральной жидкости штамма А270.

Дополнительным подтверждением способности В§12р из культуральной среды эффективно образовывать олигомеры служит эксперимент, заключающийся в концентрировании в 100 раз подвергнутой фильтрованию среды культивирования штамма А270. На полученном Вестерн-блоте (рис. 3, дорожки 3 и 4) видно, что Bgl2p из среды культивирования образует олигомер с массой более 48 кДа (предположительно димер) и олигомеры с молекулярной массой более 117 кДа, устойчивые к кипячению в буфере для нанесения проб Лэммли. Следует отметить, что в данных условиях концентрирования

практически не выявляется наличия мономерной формы В§12р. Этот результат указывает на способность Вц12р с высокой эффективностью ассоциировать при повышении его концентрации в среде культивирования, что подтверждает данные конфокальной микроскопии окрашенных антителами к Вд12р препаратов культуральной среды. При этом нужно отметить, что при экстракции В£12р из КС диметилсульфоксвдом данный белок также образует устойчивые к кипячению в буфере Лэммли олигомеры (Горковский, 2009).

Таким образом, глюкантрансфераза Ве12р из среды культивирования штамма дрожжей 5. сегеушае А270 с нарушенным геном ХУШ/ Д/СО-/ способна образовывать ассоциаты фибриллярной морфологии. Указанная способность характерна также и для белка, выделенного из КС путем экстракции при нагревании, что является дополнительным свидетельством наличия одинаковых свойств как у белка из КС, так и у белка из среды культивирования.

На основании полученных результатов, а также данных, полученных в лаборатории ранее, нами была выдвинута гипотеза о том, что глюкантрансфераза Bgl2p закрепляется в КС посредством образования фибриллярных структур, происходящего при повышении концентрации данного белка в КС. Для проверки гипотезы, мы провели работу по характеристике конформационных особенностей Ву12р при помощи спектроскопических методов. Поскольку мы не обнаружили различий между В§12р из среды культивирования и В$\2р из КС по всем исследованным нами параметрам, а свойство формировать агрегаты фибриллярной морфологии характерно как для белка из культуральной среды, так и для белка из КС, выделенного при нагревании, для дальнейших исследований Bgl2p было решено использовать препарат, полученный экстракцией из КС при нагревании, поскольку в культуральной среде штамма А270 содержится на два порядка меньше Вд12р, чем в водном экстракте, получаемом из КС нагреванием. При этом также учитывалось то, что Bgl2p обладает высокой способностью к ассоциации, ввиду чего при его очистке из среды культивирования хроматографическими методами существует высокая вероятность частичной или полной потери данного белка. Перед работой по характеристике конформационных особенностей В§12р необходимо было проверить, не играют ли дисульфидные связи роли в закреплении Bgl2p.

3. Характеристика поли дисульфидных связей для закрепления глижантрансферазы Вг12р из клеточных стенок.

К началу нашей работы существовали данные о том, что с поверхности клеток В§12р можно экстрагировать при помощи дитиотреитола (СарреПаго а1., 1998). Эти данные

позволяли предполагать, что в КС часть молекул Е^12р может быть связана посредством дисульфидных связен с другими белками КС или между собой. Поэтому необходимо было проверить наличие или отсутствие пула молекул 1^12р, закрепленных в КС при помощи дисульфидных связей. Нами показано, что из КС с помощью дитиогреитола в условиях, аналогичных условиям в эксперименте СарреПаго, Bgl2p не экстрагируется в количестве, сопоставимом с суммарным содержанием данного белка в КС (рис. 4). Это свидетельствует об отсутствии молекул Вц12р, закрепленных в КС посредством дисульфидных связей. По-видимому, при обработке дитиотреитолом интактных клеток (СарреПаго еГ а!., 1998) у авторов работы происходила либо экстракция Вц12р, находящегося в периплазматическом пространстве, либо нарушение целостности цитоплазматической мембраны, приводящее к

Рисунок 4. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях экстрактов из КС дрожжей ЗассИаготусез сегемыае, окрашивание кумасси: 1 - экстракция в буфер для нанесения проб Лэммли при 100°С 5 мин.; 2 - экстракция 2 мМ дитиотреитолом при 37°С 3 часа. Количество используемых для экстракции КС выравнено между собой по СЮяо Белок, указанный на электрофорезе, был идентифицирован как Вц12р при помощи Вестерн-блот анализа

Полученные результаты позволяют заключить, что в КС отсутствует пул молекул В§12р, в закреплении которых непосредственную роль играют дисульфидные связи. Этот тип связей, по-видимому, не играет существенной роли в закреплении Bgl2p в КС дрожжей ¿'. сегеУ!51ае. На следующем этапе работы мы перешли к изучению структурных особенностей данного белка.

4. Изучение конформационнык особенностей В°12р из клеточных стенок дрожжей Ж сегеу'н'ше дикого типа.

Существует два объяснения столь прочного закрепления Bgl2p в КС и высвобождения этого фермента в процессе экстракции при нагревании из состава КС: 1) структура Bgl2p термостабильна и при экстракции белок не претерпевает конформационных изменений. В этом случае удержание его молекулы в большей степени определяется структурой близлежащих компонентов КС, которые меняют свою конформацию при нагреве, что и приводит к высвобождению Вц12р в раствор. 2) Bgl2p меняет конформацию сам или наряду с другими компонентами при повышении температуры, что также приводит к ослаблению его

выходу Bgl2p из дрожжевой клетки.

В?12р 34 кДа —

1 2

связи с КС. В данной части работы мы исследовали температурно-индуцированные конформациониые изменения молекулы Ву12р.

Важно отметить, что Bgl2p не экстрагируется из КС при 37°С за 1 час инкубации даже в присутствии 1% ДСН, однако практически полностью экстрагируется из КС при 55°С в течение 1 часа и при 70°С в течение 15 мин. Таким образом, способность Bgl2p быть закрепленным в КС падает с повышением температуры. Следует отметить, что указанная закономерность продемонстрирована как для Bgl2p из КС дрожжей Л'.сегспу/ас А-типа спаривания так и для BgI2p из КС дрожжей а-типа спаривания. В обоих случаях этот белок устойчив в ее составе к обработке трипсином.

Температурные зависимости флуоресценции тиофлавина Т, светорассеяния и параметра А препарата Bgl2p представлены на рис. 5. От остальных амилоид- специфичных красителей (таких, как, например, Конго Красный) тиофлавин Т отличает способность связываться с фибриллами в процессе их сборки из белка-предшественника, не ингибируя при этом процесса фибриллообразования (№1ззоп, 2004). На рис. 5А видно, что при уменьшении температуры среды инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастает, что может свидетельствовать об увеличении содержания амилоидных фибрилл в препарате Bgl2p. В исследованном диапазоне температур максимальная флуоресценция наблюдается

А Б в

Рисунок 5. Температурно-зависимые конформациониые переходы глюкантрансферазы Bgl2p. А - зависимость интенсивности флуоресценции препарата Bgl2p, содержащего 25 мкМ тиофлавина Т, при длине волны 480 нм (длина волны возбуждения 450 нм) от температуры. Флуоресценцию начали измерять при температуре препарата 69°С. Контроль (флуоресценция самого тиофлавина Т) вычтен. Собственная флуоресценция В§12р при длине волны возбуждения 450 нм отсутствовала; Б - температурная зависимость интенсивности рассеяния света препаратом В§12р при длине волны 350 нм; В - зависимость значений параметра А препарата Вд12р от температуры.

при 20°С, минимальная при 69°С. При 55°С она уже в 4 раза меньше, чем при 20"С, после чего продолжает снижаться и к 69°С детектируется на слабом уровне. Измеренное в этих же условиях рассеяние света (рис. 5Б) падает с увеличением температуры, достигая своего

минимума к 60"С, после чего снова растет в диапазоне от 60 до 65°С, затем остается практически неизменным вплоть до 85°С. Можно предположить, что при увеличении температуры от 20 до 60"С Е^12р в растворе постепенно утрачивает способность формировать амилоидные структуры и не образует агрегаты другого типа, что согласуется с данными по флуоресценции тиофлавина Т и интенсивности светорассеяния. Однако после 60"С (рис. 5Б), возможно, происходит образование агрегатов, по-видимому, неамилоидной природы (увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т после 60 °С не наблюдали, рис. 5А). Следует отметить, что уже при значении температуры 50°С в препарате Вц12р методом электронной микроскопии не обнаружены фибриллярные структуры (данные не приведены), что согласуется с данными по флуоресценции тиофлавина Т (рис. 5А).

Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать, что в препарате В§12р количество фибрилл с кросс-(5-структурой уменьшается с увеличением температуры Эксперименты по изучению динамического лазерного светорассеяния препарата В»12р при 20°С показали наличие в препарате частиц со средним размером 950 нм (рис. 6 А), тогда как в препарате, в котором концентрация белка была в 10 раз меньше, мы детектировали частицы со средним размером 20 нм (рис. 6 Б). Этот результат позволяет предполагать

а 20 10

0

: 20 НМ

м

100

размер частиц, им

^ V - £

И.

' .'¿ЗИМВМОЯ ф

• Ш Л

1000

Мт

Рисунок 6. (. Размерь; частиц, детектируемых методом динамического лазерного светорассеяния в препарате В§12р, выделенном нагреванием из клеточных стенок дрожжей БассИаготусех сеге\п%\ас дикого типа: А - исходном; Б - при концентрации белка в 10 раз меньшей, чем в исходном препарате; II. В - электронная микрофотография исходного препарата Bgl2p

наличие концентрационной зависимости в формировании ассоциатов Вц12р. Электронная микрофотография фибриллярных структур, детектируемых в препарате Вц12р, полученном нагреванием из КС штамма дрожжей 5. се/п-'шае дикого типа, представлена на рис. 6 В Следует отметить, что размер детектированных методом динамического лазерного

светорассеяния частиц сопоставим с размерами фибриллярных структур, детектируемых при конфокальной (данные не приведены) и электронной (рис. 6 В) микроскопии препаратов Bgl2p. Анализ спектров кругового дихроизма препарата Bgl2p в диапазоне от 180 до 260 нм при разных значениях температуры, полученных Горковским A.A., показал, что с повышением температуры происходит уменьшение содержания ß-структуры в препарате Bgl2p (данные не приведены). Возможно, что это уменьшение связано с нарушением как внутримолекулярной, так и межмолекулярной ß-структуры в результате разрушения амилоидных фибрилл, на которое указывают данные по флуоресценции тиофлавина Т и светорассеянию препарата Bgl2p. Интересно, что распад фибриллярной структуры глюкантрансферазы при повышении температуры сопровождается увеличением значений параметра А (рис. 5В) и, следовательно, уменьшением экспонированности триптофановых остатков белка, что может свидетельствовать о большей структурированности их окружения. Этот параметр служит индикатором положения максимума спектра флуоресценции триптофановых остатков и их контакта с водной средой, т.е. степени погружения внутрь белковой глобулы (Туроверов и др., 1975). Можно предположить, что разрушение амилоидных фибрилл не является следствием температурного плавления больших жестко упакованных структурных блоков, а, скорее всего, происходит в результате разрушения множественных слабых межмолекулярных взаимодействий, стабилизирующих фибриллу. То, что такое разрушение приводит к смещению положения максимума на спектре флуоресценции триптофановых остатков в коротковолновую сторону (увеличению параметра А), может свидетельствовать о том, что часть триптофановых остатков меняет свое окружение на менее полярное в результате разрушения межмолекулярных контактов в фибриллах глюкантрансферазы.

Следует отметить, что все температурные зависимости, указанные на рис. 5, носят обратимый характер, то есть при повторной регистрации температурной зависимости флуоресценции тиофлавина Т, светорассеяния и параметра А того же образца, зависимости не отличались от ранее полученных. Это является свидетельством высокой способности Bgl2p к ренатурации и устойчивости данного белка к повышенным температурам.

Для дополнительного подтверждения уменьшения контакта триптофановых остатков Bgl2p с водой при повышении температуры были проведены эксперименты по измерению тушения собственной флуоресценции Bgl2p при разных значениях температур (рис. 7). Видно, что с нагревом эффект тушения уменьшается, что свидетельствует о меньшей доступности остатков триптофана для контакта с тушителем и, следовательно, подтверждает рост параметра A Bgl2p при повышении температуры (рис. 5В). Следует отметить, что среди использованных тушителей наибольшую силу тушения имел акриламид, далее по силе

тушения следовал отрицательно заряженный иодид-ион (К.1) и затем положительно заряженный ион цезия (СэС!). По-видимому, это свидетельствует о наличии смешанного заряда в окружении триптофановьге остатков В^12р, доступных для действия тушителей, с незначительным преобладанием положительно заряженных остатков аминокислот.

35 30 25

о о

г 20

о

т 15 о

~ 10 5 0

гЬ

гБ

|| I

rfi

ш

-I

rfl

■

□ KI

□ АА ■ CsCI

t

30 50 65

температура ,"('

Рисунок 7. Тушение собственной флуоресценции триптофановых остатков Bgl2p в препарате, полученном нагреванием из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа, акриламидом (АА), хлоридом цезия (CsCI) и иодидом калия (KI) при постоянном значении ионной силы. Концентрация тушителей во всех случаях составляла 90 мМ. Ь - интенсивность флуоресценции в отсутствие тушителя, I - интенсивность флуоресценции в присутствии тушителя.

Анализ первичной последовательности Bgl2p, проведенный нами совместно с О.В. Галзитской согласно разработанному в ее лаборатории методу Average Packing Density (Галзитская и др., 2006), указывает на то, что почти все триптофановые остатки белка (7 из 9) либо входят в состав участков, которые могут формировать амилоидные фибриллы, либо находятся в непосредственной близости от них (данные не представлены).

Таким образом, чувствительность флуоресценции триптофановых остатков (в частности, положения максимума на спектре их флуоресценции) к разрушению амилоидных фибрилл и к температурно-индуцированным конформационным изменениям Bgl2p вполне объяснима. Принимая во внимание данные о том, что Bgl2p сохраняет свою активность даже после нагрева до 90°С (Mrsa et.al., 1993), можно предположить, что этот белок не денатурирует необратимо при действии высоких температур, а в процессе охлаждения ренатурирует (это подтверждает также обратимость зависимостей на рис. 5). Здесь уместно отметить также, что штамм дрожжей S. cerevisiae А-типа спаривания (как и исследованный

ранее в нашей лаборатории штамм а-типа спаривания) характеризуется пониженной чувствительностью к нагреву по сравнению со штаммом с нарушенным геном ВСЬ2.

В других экспериментах мы провели анализ изменения параметра А при различных значениях рН, а также при действии солей двухвалентных металлов (данные не приведены). По-видимому, значение рН не играет существенной роли в изменении степени экспонированности триптофановых остатков в водное окружение (по сравнению с действием солей меди и кадмия), следует только отметить, что компоненты буфера, по-видимому, могут оказывать влияние на конформацию белка, поскольку при использовании натрий-ацетатного буфера с рН 5.58 регистрируется более сильное изменение параметра А, чем при использовании буферов с рН 2.96, 6.58 и 9.81.

Совокупность полученных результатов подтверждает гипотезу, согласно которой закрепление Bgl2p в КС дрожжей Ж. сега'гиас связано с образованием данным белком фибриллярных структур при повышении его концентрации в КС, в результате чего он уже не может свободно выходить из КС. При этом структурный компонент КС - СР1-белки - могут способствовать повышению концентрации Bgl2p, задерживая его прохождение через эту органеллу. Согласно выдвинутому предположению, структура глюкантрансферазы Вц12р не является термостабильной и в процессе экстракции из состава КС при нагревании Bgl2p изменяет свою конформацию. При нагревании КС до 55°С и выше структурный элемент в молекуле ответственный за образование фибриллярных структур, претерпевает

обратимые конформационные изменения, при которых фибриллярные структуры деградируют и белок выходит из КС в раствор.

ВЫВОДЫ

1. Сравнение В§12р, который накапливается в культуральной жидкости штамма ЯассИаготусез сегсш/ае с нарушенным формированием ОР1-якорей, и В^12р, закрепленного в клеточной стенке штамма с их нормальным формированием, не выявило различий в первичной структуре и ковалентных модификациях исследуемых белков.

2. В1;12р накапливается в культуральной жидкости штамма ЗассЬаготусез сегеу1$1ае с нарушенным формированием СР1-якорей в мономерной форме, либо в форме ди- или гримеров, неустойчивых в денатурирующих условиях. При концентрировании частично очищенного препарата Bgl2p из культуральной жидкости этого штамма данный белок с высокой эффективностью образует устойчивые к денатурирующим условиям олигомеры, а также способен формировать фибриллярные структуры

3. В экстракте из клеточных стенок дрожжей ЯассИаготусех сегеу1$1ае дикого типа В£12р при низких концентрациях существует в виде олигомеров низкого порядка со средним размером 20 нм, при высоких концентрациях - в виде полимеров со средним размером 950 нм.

4. При повышении температуры происходит постепенная обратимая деполимеризация фибрилл, образованных В§12р из клеточной стенки дрожжей ЗассИаготусея сегсгшае, сопровождающаяся уменьшением степени экспонированности остатков/остатка триптофана. При этом в диапазоне температур 55-65"С наблюдается отчетливо выраженный структурный переход. Предполагается, что деполимеризация может приводить к освобождению Вд12р из клеточной стенки при температуре 55°С и выше.

5. Дисульфидные связи не играют существенной роли в закреплении Вв12р в клеточной стенке дрожжей БассИаготуссз ссгс\1х1ае.

6. Полученные данные, а также сведения из литературы, позволили выдвинуть гипотезу, согласно которой закрепление Вд12р в клеточной стенке дрожжей Засскаготусея сегычз^ае связано с образованием этим белком фибриллярных структур при повышении его концентрации, чему способствуют СР1-белки клеточной стенки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калебина Т.С., Егоров С.Н., Арбатский Н.П., Безсонов Е.Е.. Горковский А.А., Кулаев И.С. О роли высокомолекулярных полифосфатов в активации глюкантрансферазы Bgl2p из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cercvisiac II Доклады Академии Наук. - 2008. - Т. 420. - С. 695-698.

2. Kalebina T.S., Plotnikova Т А., Gorkovskii A.A., Selyakh I.O., Galzitskaya О.V., Bezsonov Е.Е., Gellissen G., and Kulaev I S. Amyloid-like properties of Saccharomyces cerevisiae cell wall glucantransferase Bgl2p // Prion. - 2008. - V. 2. - P. 91-96.

3. Безсонов E.E.. Калебина T.C., Горковский A.A., Кудряшова ЦБ., Семисотнов Г.В., Кулаев И.С. Температурно-индуцированные конформационные переходы глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces ccrevisiae II Молекулярная биология. - 2010, - Т. 44. - С. 551-554.

4. Безсонов Е.Е.. Арбатский Н.П., Калебина Т.С., Кулаев И.С. (2008) Являются ли полифосфаты активаторами глюкантрансферазы Bgl2p клеточной стенки дрожжей Saccharomyces ccrevisiael // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, Россия. Сборник тезисов - С. 487.

5. Безсонов Е.Е.. Горковский А.А., Егоров С.Н., Арбатский Н.П., Калебина Т.С., Кулаев И.С. (2008) Выявление активности глюкантрансферазы Bgl2p клеточной стенки дрожжей in viiro в присутствии высокомолекулярных полифосфатов // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва, Россия. Сборник тезисов. - С. 30-31.

6 Gorkovskii A., Plotnikova Т., Selyakh I., Galzitskaya О., Bezsonov Е. and Kalebina Т. (2009) Bgl2p - an amyloid-like fibril forming protein from Saccharomyces cerevisiae yeast cell wall // 27* International Specialized Symposium on Yeasts. Paris, France. Abstract book. - P. 240.

Подписано в печать 21.05.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 993 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Безсонов, Евгений Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ЗАКРЕПЛЕНИЯ.

Введение.

1. Компоненты клеточной стенки дрожжей.

2. Способы ковалентной модификации белков клеточной стенки.

2.1. N-гликозилирование.

2.2.0-гликозилирование.

2.3. GPI-якорь.

3. Классификация и характеристика белков клеточной стенки по способу экстракции.

3.1. Ковалентно закрепленные белки: GPI и PIR.

3.1.1. GPI-белки клеточной стенки.

3.1.2. ASL-белки клеточной стенки.

3.2. SEP-белки клеточной стенки.

3.2.1. Глюкантрансфераза Bgl2p клеточной стенки дрожжей.

4. Примеры белков, ремоделирующих клеточную стенку дрожжей.

4.1. р-1,3-глюканозилтрансфераза Gaslp.

4.2. Экзо-р-1,3-глюканазы.

4.3. Эндохитиназа.

4.4. Предполагаемые глюкан/хитин кросс-связывающие ферменты.

4.5. Глюканазы Scw4p и ScwlOp.

4.6. Глюкантрансфераза Bgl2p.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности структуры глюкантрансферазы BGL2P и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Клеточная стенка (КС) дрожжей состоит из (31,3- и р1,6-глюканов, составляющих до 60% массы КС, 40% белков, которые являются маннопротеинами различной степени гликозилирования, и минорного, но очень важного в структурном отношении полисахарида - хитина, на долю которого приходится не более 5% массы этой органеллы. КС покрывает всю поверхность клетки дрожжей и располагается за пределами цитоплазматической мембраны. Она выполняет функцию прочного наружного скелета, определяет форму клетки и защищает ее от внешних воздействий. Вместе с тем, КС является динамичной органеллой, структура которой может быстро и кардинально перестраиваться в зависимости от стадии жизненного цикла дрожжевой клетки и претерпевать постоянные локальные изменения в процессе ее роста и растяжения. На структуру КС оказывают влияние условия окружающей среды. В указанных изменениях ключевую роль играют белки КС, принимающие участие в окончательном формировании ее молекулярного ансамбля.

Можно классифицировать белки КС дрожжей по способу их закрепления. В соответствии с этой классификацией, они подразделяются на связанные и не связанные ковалентно с полисахаридами КС. Белки первой группы (сокращенно CWP — covalently. linked cell wall proteins) могут быть экстрагированы из данной огранеллы с использованием таких гидролаз, как р-глюканазы, (например, ламинариназа) (Pastor et al., 1984; Van Der Vaart et al., 1995; Shimoi et al., 1998), а также щелочной экстракцией (Mrsa et al., 1997; Mrsa and Tanner, 1999). Белки, обладающие остатком GPI-якоря (GPI-белки), через который они ковалентно связаны с глюканом КС, входят в группу CWP-белков. Роль этих белков в функционировании КС дрожжей активно изучается. Белки второй группы могут быть экстрагированы в буфер, содержащий ДСН, восстанавливающие реагенты (ДТТ, p-меркаптоэтанол) и ЭДТА при нагревании (Chaffin and Stocco, 1983; Valentin et al., 1984). Большинство этих белков (SEP-белков — от англ. sodium dodecyl sulfate extractable protein) закреплено с помощью нековалентных взаимодействий. Следует ' отметить, что некоторые члены данной группы могут быть связаны друг с другом и/или CWP-белками посредством дисульфидных связей, образуемых между остатками цистеинов белковых молекул. В группе SEP-белков есть много ферментов, в том числе обладающих глюканазной и/или глюкантрансферазной активностью.

Глюкантрансферазы - группа ферментов, участвующих в создании и перестройках глюканового каркаса КС. Следует отметить, что данная группа исследована недостаточно. Один из таких белков - глюкантрансфераза Bgl2p - мажорный SEP-белок, обнаруживающийся в большом количестве на всех стадиях роста культуры (45000 молекул на клетку в логарифмической фазе роста - Ghaemmaghami et al., 2003). Bgl2p это небольшой (31.5-34 кДа в зависимости от вида дрожжей), консервативный белок, присутствие которого в КС показано для многих видов дрожжей. Молекула Bgl2p имеет один N-связанный олигоманнозид небольшого размера (приблизительно 2.5 кДа), который, как было опубликовано ранее, присоединен к аспарагину-284 (Mrsa et al.} 1993).

По результатам анализа первичной структуры Bgl2p может быть отнесен к семейству 17 гликозид гидролаз (ЕС 3.2.1.58). Было показано in vitro, что при низких концентрациях глюкозных олигосахаридов у Bgl2p может наблюдаться эндоглюканазная активность, а при более высоких преобладает глюкозилтрансферазная активность (Goldman et al., 1995). Делеция гена BGL2 не приводит к возникновению выраженного фенотипа при стандартных лабораторных условиях выращивания, за исключением небольшого увеличения содержания в КС хитина и щелочерастворимого ((31,3-связанного) глюкана-структурных компонентов КС (Mrsa et al., 1993; Laurinavichyute et al., 2000; Sestak et al., 2004).

Bgl2p характеризуется несколькими необычными свойствами, выделяющими его из общей массы белков КС. В нашей лаборатории было показано, что Bgl2p в составе КС устойчив, по сравнению с другими SEP-белками, к гидролизу трипсином, хотя и содержит, 19 остатков Lys и Arg в своей молекуле, и протеиназой К (в белке 134 сайта для гидролиза этой протеиназой). Bgl2p характеризуется необычайно прочным закреплением в КС, например, он не может быть экстрагирован из изолированной КС с помощью 1% ДСН при 37°С в отличие от большинства SEP-белков КС. Bgl2p, как уже было сказано, не содержит GPI-якоря. Однако, в штамме дрожжей S. cerevisiae, характеризующемся нарушенным формированием GPI-якорей, он не закрепляется в КС, а секретируется в среду культивирования (Kalebina et al., 2002). Кроме того, известно, что Bgl2p разных видов дрожжей демонстрирует выраженную тенденцию к формированию агрегатов при очистке (Klebl and Tanner, 1989; Hartland et al., 1991; Elorza et al., 1988). Ранее в нашей лаборатории была показана способность Bgl2p, выделенного из КС при нагревании, А формировать фибриллярные структуры (Плотникова, 2006).

Jeng и соавторы обнаружили, что у Candida albicans Bgl2p выполняет роль адгезина (Jeng et al., 2005). Авторы предположили, что ключевую роль в данном процессе играют лектин-подобные свойства этого фермента. Bgl2p является термостабильным белком — исследователи выделяли его при температуре 70°С и более, после чего он был способен проявлять ферментативную активность (Klebl and Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993). Bgl2p проявляет высокую аффинность к (51,3-глюкану и, что достаточно удивительно, к хитину (Klebl and Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993).

Несмотря на более чем 20-летнюю историю изучения, структура молекулы Bgl2p практически не охарактеризована. Отсутствуют сведения относительно причин, обуславливающих способность данного белка столь прочно закрепляться в КС.

Целью настоящей работы являлось исследовать физико-химические свойства, особенности структуры глюкантрансферазы Bgl2p и способ ее закрепления в клеточной стенке дрожжей S. cerevisiae. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Установить, присутствует ли в клеточной стенке дрожжей S. cerevisiae дикого типа пул молекул Bgl2p, закрепленных при помощи дисульфидных связей.

• Сравнить первичную структуру, ковалентные модификации, а также способность формировать олигомеры и фибриллы Bgl2p, выделенного из клеточных стенок штамма дрожжей S. cerevisiae дикого типа и секретируемого в культуральную жидкость штамма с нарушенным формированием GPI-якорей.

• Исследовать способность глюкантрансферазы Bgl2p, выделенной из клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae дикого типа, образовывать фибриллы и изучить конформационные изменения ее молекулы в зависимости от температуры.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ЗАКРЕПЛЕНИЯ.

Введение.

Вегетативные клеточные стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеют слоистую ультраструктуру, наблюдаемую при электронной микроскопии (Osumi et al., 1998), с внутренним слоем глюкана и хитина и наружным слоем маннопротеинов. Заслуживает внимания тот факт, что при электронной микроскопии клетки патогенных дрожжей Candida albicans демонстрируют фибриллярные структуры на своей поверхности (Hazen et al., 1992, Nather and Munro, 2008). Электронная микрофотография клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae, а также электронная микрофотография клеточных стенок дрожжей С. albicans, на которой видны фибриллярные структуры, представлены на рис. 1.

Рисунок 1. А - Электронная микроскопия клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae (XI00000). МПС-маннопротеиновый слой; ГС-глюкановый слой; ЦПМ— цитоплазматическая мембрана; Б - Электронная микрофотография клеток дрожжей Candida albicans, демонстрирующая, что наружный слой клеточной поверхности, обогащенный маннопротеинами, имеет фибриллярную морфологию (отмечено стрелкой). Взято из Nather and Munro, 2008.

Данный обзор литературы будет посвящен в основном компонентам клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae — наиболее изученного на данный момент эукариотического микроорганизма, с привлечением при необходимости данных, полученных для патогенного микроорганизма С. albicans (клеточная поверхность данного вида дрожжей также интенсивно исследуется), а также других дрожжевых микроорганизмов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Безсонов, Евгений Евгеньевич

V. ВЫВОДЫ.

1. Сравнение Bgl2p, который накапливается в культуральной жидкости штамма Saccharomyces cerevisiae с нарушенным формированием GPI-якорей, и Bgl2p, закрепленного в клеточной стенке штамма с их нормальным формированием, не выявило различий в первичной структуре и ковалентных модификациях исследуемых белков.

2. Bgl2p накапливается в культуральной жидкости штамма Saccharomyces cerevisiae с нарушенным формированием GPI-якорей в мономерной форме, либо в форме ди-или тримеров, неустойчивых в денатурирующих условиях. При концентрировании частично очищенного препарата Bgl2p из культуральной жидкости этого штамма данный белок с высокой эффективностью образует устойчивые к денатурирующим условиям олигомеры, а также способен формировать фибриллярные структуры.

3. В экстракте из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа Bgl2p при низких концентрациях существует в виде олигомеров низкого порядка со средним размером 20 нм, при высоких концентрациях — в виде полимеров со средним размером 950 нм.

4. При повышении температуры происходит постепенная обратимая деполимеризация фибрилл, образованных Bgl2p из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сопровождающаяся уменьшением степени экспонированности остатков/остатка триптофана. При этом в диапазоне температур 55-65°С наблюдается отчетливо выраженный структурный переход. Предполагается, что деполимеризация может приводить к освобождению Bgl2p из клеточной стенки при температуре 55°С и выше.

5. Дисульфидные связи не играют существенной роли в закреплении Bgl2p в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

6. Полученные данные, а также сведения из литературы, позволили выдвинуть гипотезу, согласно которой закрепление Bgl2p в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae связано с образованием этим белком фибриллярных структур при повышении его концентрации, чему способствуют GPI-белки клеточной стенки.

7. Заключение.

Совокупность полученных результатов подтверждает гипотезу, согласно которой закрепление Bgl2p в КС дрожжей S. cerevisiae связано с образованием данным белком фибриллярных структур при повышении его концентрации в КС, в результате чего он уже не может свободно выходить из КС. При этом структурный компонент КС — GPI-белки — могут способствовать повышению концентрации Bgl2p, задерживая его прохождение через эту органеллу. Согласно выдвинутому предположению, структура глюкантрансферазы Bgl2p не является термостабильной и в процессе экстракции из состава КС при нагревании Bgl2p изменяет свою конформацию. При нагревании КС до 55°С и выше структурный элемент в молекуле Bgl2p, ответственный за образование фибриллярных структур, претерпевает обратимые конформационные изменения, при которых фибриллярные структуры деградир\ ют и белок выходит из КС в раствор.

99