Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств

Зайцева, Марина Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств"

На правах рукописи

□□3491954

ЗАЙЦЕВА МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА

Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств.

03.01.04. -Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з ФЕЗ

Москва-2010

003491954

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательском институте физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Научные руководитель:

доктор химических наук, доцент Позмогова Галина Евгеньевна

(ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Панасенко Олег Михайлович

профессор

(ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России)

доктор медицинских наук Штиль Александр Альбертович

(Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина РАМН)

Ведущая организация: «Московская государственная

академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова»

Защита состоится «/¿Р »

2010 года в г СУ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.057.01 при ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, 1А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России

Автореферат разослан 9 »

2010 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук Мурина М.А.

Актуальность работы. Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами - одна из перспективных задач биоорганической химии. Создание новых модифицированных олигонуклеотидов необходимо для проведения молекулярно-биологических и медико-биологических фундаментальных исследований, для развития и совершенствования методов ДНК-диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, разработки новых высокоизбирательных лекарств. В настоящее время описан широкий круг производных ДНК, модифицированных по гетероциклическим основаниям, сахаро-фосфатному остову, несущих в своем составе метки и ненуклеотидные звенья (Kurreck, 2003; Sacca, 2005).

Особенностью настоящей работы является конструирование потенциально биосовместимых функциональных производных олигомеров с заданными свойствами, к ним относятся: способность встраиваться в мембрану живой клетки, и стабильность в плазме крови и др.

Согласно литературным данным в ряде случаев дополнительные свойства олигонуклеотидам можно придавать введением в структуру молекулы концевых заместителей, например, меток или функциональных групп. В настоящей работе такой прием был использован для получения аминоалкильных и флуоресцентных олигомеров. Кроме того, были синтезированы новые, амфифильные производные олигомеров для создания универсального метода нековалентной фиксации олигонуклеотидов на внешней мембране живых клеток.

Перспективность использования ДНК-мечения поверхности клеток для их направленной иммобилизации на твердом носителе была показана в работе (Chandra, 2006). Однако реализация этой идеи ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью процедуры ДНК-модификации клеток. Поэтому для создания нового способа быстрой и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной в настоящей работе были сконструированы и получены производные олигонуклеотидов, содержащие концевые остатки стеариновой и пальмитиновой кислот.

Наиболее перспективными для дальнейшего применения в молекулярно-

медицинских исследованиях свойствами обладают олигонуклеотиды, содержащие

G-квадруплексы - структуры ДНК, состоящие из сложенной вчетверо (вследствие

взаимодействия четырех гуанинов), одной молекулы или четырех нитей различных

молекул. Чрезвычайно высока биологическая роль G-квадруплексов, так более 40%

промоторов в человеческом геноме содержит по крайней мере один квадруплекс

(Huppert, 2005; Todd, 2007) а у онкогенов же 69% имеют такие мотивы (Huppert,

2008). Также найдены G-квадруплексные биологически активные аптамеры

(олигонуклеотиды, отобранные по сродству к молекулярным или иным мишеням),

однако их применение in vivo также ограничено низкой устойчивостью к

нуклеазному гидролизу. В настоящей работе для поиска структуры более

стабильного функционального G-квадруплексного олигомера была выбрана

стратегия введения в его состав локальных тиофосфорильных связей. В работе был

исследован ТВА (Thrombin binding aptamer -тромбинсвязывающего ДНК-аптамера состава GGTTGGTGTGGTTGG, Griffin, 1993; Padmanabhan, 1996) и его тиоаналоги. Проведение системного анализа влияния тиофосфорильных замен в составе ДНК G-квадруплексов на их конформацию и биологические свойства необходимо при создании новых эффективных лекарств нуклеотидной природы. В связи с этим, нами был проведен анализ термодинамических и биологических свойств тиогомологов ТВА, синтезированных с помощью разработанного нами метода, что позволило выявить ряд закономерностей и найти оптимальные структуры. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состоит в разработке методов конструирования потенциально биосовместимых модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами на примере жирнокислотных конъюгатов олигомеров и локально тиофосфорилированных аналогов ДНК. При выполнении данной работы решались следующие задачи: -оптимизация методов синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых олигомеров, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы; -разработка дизайна и наработка частичных тиоаналогов ТВА; -сравнительное исследование ТВА и его тиоаналогов по физико-химическим (конформация, термодинамика и др.) и биологическим (антитромбиновые свойства и стабильность в плазме крови, кинетика нуклеазного гидролиза) параметрам.

Научная новизна и практическая значимость.

Оптимизированы методы синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы. Использование полученных модифицированных олигонуклеотидов стало основой для проведения таких работ, как исследование ДНК-комплексов с

наночастицами никеля. Конъюгаты олигонуклеотидов с остатками стеариновой и пальмитиновой кислот, полученные в настоящей работе, использовались при разработке нового способа нековалентной иммобилизации фрагментов ДНК на поверхности живых клеток.

Для создания эффективных терапевтически значимых структур олигонуклеотидного типа впервые получен ряд аналогов ТВА, содержащих тиофосфорильные замены. Оценены антикоагуляционные свойства полученных аналогов ТВА, изучено влияние локальных тио-модификаций на их структурно-функциональные свойства, в том числе на стабильность в плазме крови и в отношении действия ДНК-нуклеаз. В результате исследования термодинамических параметров олигомеров получена зависимость устойчивости конформации структуры от локализации тиофосфорильной связи. Обнаружено, что модификация в «петлях» стабилизирует конформацию, а в «плоскостях» G-квадруплекса снижает его стабильность. Найден перспективный модифицированный олигонуклеотид (LL11), структура которого изменена только в Т-Т-петлях. Он сохраняет антитромбиновые свойства ТВА, и в то же время обладает большей устойчивостью к биодеградации.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации автором в соавторстве с коллективом лабораторий опубликовано 6 печатных работ, статьи, каждая из них в рецензируемых отечественных и международных журналах, рекомендованных ВАК.

Материалы, включенные в диссертацию, докладывались на всероссийских и международных конференциях и школах: на «III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине", Новосибирск; на «XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии», Москва; на «XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва; на «XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва; на «Second International Meeting on Quadruplex DNA», Louisville; на «Первой международной научной школе Нано-2009», Москва; на

конференции молодых ученых НИИ ФХМ, Москва.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы из 136 наименований. Диссертация изложена на 102 страницах, содержит 30 рисунка и 2 таблицы.

Материалы и методы.

Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали твердофазным

амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800 с использованием стандартных коммерческих реагентов: амидофосфитных производных нуклеозидов, нуклеозид-компонентов на твердом носителе - CPG и растворителей, в условиях модифицированных нами программ реакционных циклов. MALDI MS проводили на времяпролетном МАЛДИ масс-спектрометре Microflex в линейном режиме.

Для получения N-гидроксисукцинимидных производных жирных кислот смесь 1 ммоль пальмитиновой или стеариновой кислоты, 2 ммоль N-гидроксисукцинимида и 1 ммоль ДМАП высушивали упариванием с сухим пиридином, растворяли в 3 мл смеси диоксан-пиридин (3:1), затем при перемешивании вносили раствор 2 ммоль ДЦК в 1 мл диоксана. Через 5 ч к реакционной массе добавили 200 мкл воды, перемешивали 45 мин;, осадок отфильтровывали. Маточник высушивали в вакууме досуха, остаток растворяли в 10 мл эфира. Раствор промывали 3x5 мл 5% NaHC03, 3x5 мл воды, сушили Na2S04, органическую фазу удаляли в вакууме. Продукты перекристаллизовывали из гексана и сушили в вакууме. Выходы составили 87-92% на исходные кислоты. З'-Аминоалкил-олигонуклеотид (5-7 мкм) и 100 мкм N-гидроксисукцинимидного производного жирной кислоты растворяли в 40-60 мкл DMSO, встряхивали и оставляли в темноте, затем добавляли 500 мкл воды и 1 мл эфира, встряхивали, эфирный слой отбрасывали. Конъюгаты выделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ, состав подтверждали MALDI MS.

Флуоресцентные микрофотографии клеток получены с помощью

эпифлуоресцентного микроскопа ECLIPSE Е-800. Зеленую флуоресценцию FAM-

меченых олигонуклеотидов регистрировали при 488 нм и фильтре эмиссии 535/50

нм. Выживаемость клеток определяли проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией с помощью пропидий йодида (PI). Клетки промывали PBS или бессывороточной средой RPMI 1640 и выдерживали в тех же растворах с PI при его итоговой концентрации 5 мкМ, 5 мин. при комнатной температуре.

Для определения эффективности фиксации жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности клеток Jurkat их центрифугировали, промывали и ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI. Сток-растворы олигонуклеотидов FT18NPal или FT18NSte добавляли к бессывороточной среде RPMI до концентрации 0,2 мкМ и содержания этанола 5%. Клетки (106 клеток/20 мкл) выдерживали в полученных растворах 15 мин. при 37°С и затем отмывали бессывороточной средой RPMI. Макрофаги J774 высевали на плашки с покровными стеклами и культивировали в течение ночи. После всех манипуляций клетки выдерживали с 0,5 мкМ раствором реагента CellTrace Far Red DDAO-SE в PBS, 10 мин. при комнатной температуре, промывали и исследовали флуоресцентной микроскопией.

Спектры УФ поглощения и кривые плавления по поглощению получены на спектрофотометре Jasco 715. Термодинамические параметры были рассчитаны в рамках нелинейного приближения в двухфазной модели состояний для мономолекулярного плавления. Спектры эмиссии флуоресценции, спектры возбуждения, кривые плавления по флуоресценции и поляризация флуоресценции получены на спектрофлуориметре PTI. Спектры кругового дихроизма получены на спектрофотометре Jasco720. Длительность флуоресценции (т) этидия, адсорбированного на олигонуклеотидах, измеряли на лабораторном фазовом флуориметре Easy Life V. Величину поляризации флуоресценции молекул бромида этидия (Р) определяли на спектрофлуориметре Сагу Eclipse. Получение внутримолекулярных структур производилось методом быстрого отжига. Олигонуклеотиды нагревались в буфере до температуры 95°С, затем быстро охлаждались. Кривые плавления были зарегистрированы в X =295 нм в диапазоне температур от 15 до 90°С.

Для исследования нуклеазного гидролиза растворы олигонуклеотидов в

буфере выдерживали 3 мин при 95°С и резко охлаждали во льду. После добавления нуклеазы Ш}1 КпаБе-Ргее Опазе смесь инкубировали при 37СС. Пробы обессоливали и анализировали методом МА1Л)1 МБ.

Тромбиновое время определяли в соответствии со стандартной процедурой и протоколом набора Тромбин-тест Ренам с помощью коагуометра Минилаб-701. Для соотнесения зарегистрированных значений ТВ с активностью тромбина был построен калибровочный график зависимости активности тромбина (в интервале концентраций от 0,1 до 6,0 ед.) от времени свертывания.

Для исследования стабильности олигонуклеотидов в плазме крови смесь олигонуклеотидов добавляли к 0,2 мл стабилизированной цитратом плазмы крови и оставляли при 37°С. После инкубации в плазму вносили раствор олигонуклеотида-антидота АТСА (5'-ССААССАСАССААСС) в РВБ до результирующей концентрации 4-6 нмоль/мл. Через 30 секунд к смеси добавляли 1,5 мл ацетона, встряхивали и оставляли на 2 ч при -20°С. Отделенный центрифугированием осадок суспендировали в 0,2 мл воды. Супернатант концентрировали в вакууме и анализировали методом МА1ЛЭ1 МБ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Оптимизация методов получения модифицированных олигонуклеотидов 1.1 Жирпокислотные производные олигонуклеотидов. 1.1.1 Выбор структуры жирнокислотных конъюгатов олигонуклеотидов.

Разработка метода нековалентной фиксации ДНК на внешней мембране живой клетки включала выбор оптимальной структуры амфифильных конъюгатов олигонуклеотидов, способных самопроизвольно ассоциироваться с липидным бислоем плазматической мембраны. Выбор проводили с учетом следующих основных факторов:

1. Обеспечение минимального влияния фрагментов чужеродной ДНК на жизнедеятельность клетки, в частности, сведение к минимуму вероятности интернализации олигонуклеотида. Фрагменты ДНК природного строения, как

правило, практически не способны преодолевать клеточные мембраны, поэтому их применение предпочтительнее в сравнении с мембранотропными тиофосфорильными аналогами или пептидными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, известно, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды неиммуногенны и нетоксичны.

2. Известно о проблеме быстрой биодеградации олигонуклеотидов, препятствующей их терапевтическому применению. Достаточное для манипуляций время жизни комплекса "клетка-олигонуклеотид" может составлять десятки минут, во всяком случае, быть менее или соизмеримо со временем цикла клеточного деления.

3. Существуют ограничения и при выборе структуры липофильной составляющей конъюгата. Так, стероидные производные олигонуклеотидов эффективно встраиваются в липосомы, оставляя олигонуклеотид снаружи. Вместе с тем, холестерил-олигонуклеотиды способствуют транслокации конъюгатов через клеточную мембрану, как полагают, по рецептор-опосредованному механизму (Биченков 1988, Zarytova 1990, Krieg 1993). Заметим также, что липидные производные ДНК, которые успешно используются в составе липосом для усиления флуоресцентного сигнала в микрочипах (Yoshina-Ishii, 2003, 2005) в водных растворах самоагрегируют с образованием мембранотропных везикул. Важно отметить, что жирные кислоты, обладая сходными гидрофобными свойствами, в микромолярных концентрациях не оказывают заметного влияния на стабильность клеточной мембраны. Литературные данные о свойствах амфифильных производных олигомеров довольно противоречивы (Mishra,1995, Djojosubroto 2005), на их основе трудно предсказать заранее результаты взаимодействия жирнокислотных производных олигонуклеотидов с живыми клетками. Таким образом, можно предположить, что требованиям, необходимым для эффективной фиксации во внешней мембране живой клетки за счет гидрофобных взаимодействий наиболее полно соответствуют жирнокислотные (стеариновые и пальмитиновые) производные фосфодиэфирных олигонуклеотидов.

Для того чтобы снизить влияние стерической доступности нуклеотидов, сближенных с мембраной клетки, на гибридизацию, в модельных экспериментах

использовались

гомопоследовательности Т|8 и Т25, не образующие сложных третичных структур.

Жирнокислотные дериваты флуоресцентномеченых (6-FAM, 6-carboxyfluorescein (англ) (6-

карбоксифлуоресцеин) олигонуклеотидов применялись нами для визуализации связывания олигонуклеотидов с клетками, а немеченые

Схема взаимодействия жирнокислотного производные - для выявления

производного олигонуклеотида с мембраной клетки, и ВОЗМожности гибридизации с его гибридизации с флуоресцентно-меченным комплементарным фрагментом ДНК.

Рис.1

после такого связывания. На рис.1 приведена предполагаемая схема

жирнокислотного производного олигонуклеотида с мембраной клетки и его гибридизации с флуоресцентномеченым комплементарным фрагментом ДНК.

комплементарными пробами

взаимодействия !^x-CH2-CH(CH2OHMCH2)4-NH2-3' + YON^j

5'-Z-TX-CH2-CH(CH2OH)-(CH2)4-NHY-3'

Рис.2 Схема получения аминоалкильных производных олигонуклеотидов. Z=H= флуоресцентная метка, Y =стеароил=пальмитоил.

1.1.2 Синтез олигонуклеотидных производных жирных кислот. Олигонуклеотиды синтезировали в виде 3'- или 5-аминоалкильных производных, которые после

очистки конденсировали с N-оксисукцинимидными производными жирных кислот

(NOS) (см. схему на рис.2),

"FLD1 А. Ех=470, Em=520 (PAL-QLf T18NPAL.D) FT1g№a|

60-

20 H 0

FT18N

I-r

20 min

Рис.3 ВЭЖХ анализ хода реакции олигонукпеотида FT18N с N-оксисукцинимидным эфиром пальмитиновой кислоты. А) FT18N Б) FT18Pal

которые либо получали реакцией кислот с ТЧ-оксисукцинимидом в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и нуклеофильного катализатора (диметиламинопиридина), либо использовали коммерческие Ж)8-производные:

На рис.3 приведен хроматографический профиль ВЭЖХ-анализа реакции олигонуклеотида FT18N с активированным производным стеариновой кислоты (пик А соответствует исходному олигомеру FT18N, а пик Б - аддукту FT18NPal). Выходы конъюгатов составляли 50-66% от исходного олигомера. Все полученные

1300 1000 300

- 1300 л н

§ 1000

л 1000 300 100

5500 6000 6500 7000 7500 m/z

Рис.4 Масс-спектры олигонуклеотидов FT18N, FT18NPal и FT18NSte.

FT18N

FT18NPal I MAWKBS

FTISNSte N^,«= 6427 к—,. - —, ____________

олигонуклеотиды характеризовали УФ-спектрофотометрией, масс-спектроскопией, аналитической ВЭЖХ и электрофорезом в ПААГ. Чистота используемых олигонуклеотидов по данным ВЭЖХ составляла не менее 97%. Найденные МАЛДИ МС молекулярные массы олигомеров с точностью 0,3% соответствовали расчетным. На рис.4 в качестве примера приведены масс-спектры РТ18М$1е и РТ18ЫРа1.

1.1.3 Взаимодействие производных с клеточной мембраной.

Дальнейшие испытания полученных жирнокислотных производных в экспериментах с различными линиями клеток методами проточной цитометрии, конфокальной флуоресцентной микроскопии а также токсикологические

РТ18М5,е контроль ™5{е

Рис.5 Флуоресцентные микроскопии клеток .(игка^А) и макрофагов .1744 (В), инкубированных в присутствии конъгогата РТ18№1е и клеток (Лигка!), обработанных олигомером РТ18№

исследования (данные приведены в диссертации) показали, что полученные

конъюгаты олигонуклеотидов, содержащие как пальмитиновые, так и стеариновые остатки эффективно фиксировались на внешней мембране живых клеток (см. рис.5).

1.2 Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации.

1.2.1 Конструирование тиоаналогов ТВА.

Для поиска более стабильной к нуклеазному гидролизу структуры по сравнению с фосфодиэфирными олигонуклеотидами функциональных аналогов й-квадруплексных олигомеров, была выбрана стратегия введения в состав ДНК

локальных тиофосфорильных связей (рис.бБ). В качестве модели исследовалась известная структура ТВА. На рис.бВ представлена схема его стерической организации. Симметричная молекула этого олигомера образует два гуаниновых квартета, связанных ТСТ петлей и двумя малыми ТТ петлями.

Рис.6 Структура межнуклеотидной связи (А) фосфодиэфирной (Б) тиофосфорильной и схема строения G-квадруплекса тромбинсвязывающего ДНК-аптамера ТВА (В).

В работе был разработан набор из 13 тиоанапогов, содержащих локальные тиофосфорильные связи в составе фосфодиэфирных олигомеров. Модификации располагались либо между квартетами, либо в петлях. Также исследовались полностью модифицированный олигомер SATR и аналоги, несущие иные положения областей модификации. Последовательности аналогов ТВА приведены в табл.1.

1.2.2 Синтез модифицированных локально тиофосфоршированных олигонуклеотидов.

Синтез тиоаналогов ТВА осуществляли с помощью оптимизированного нами параллельного автоматического синтеза частично модифицированных олигонуклеотидов. Одновременная сборка полностью модифицированных олигонуклеотидов или последовательностей, сочетающих один фосфодиэфирный и один 3'- или 5'-концевой тиофосфорильный блоки, не вызывает технических или программных затруднений. Чередование фосфотриэфирных и тиофосфотриэфирных межнуклеотидных связей в заданной последовательности, различной для синтезируемых параллельно олигомеров, требует другой организации реакционных циклов твердофазного амидофосфитного синтеза.

A v.

Примеры спектров тиоаналогов ТВА (LL11, Р4 и SATR), несущих разное количество модификаций приведены на рис.7. Результаты расчетов по формуле (1) с высокой точностью подтверждают состав синтезированных последовательностей.

Таким образом, были синтезированы и охарактеризованы все разработанные тиоаналоги.

2. Структурно-функциональные свойства тиоаналогов ТВА.

2.1 Стерическая организация олигомеров.

Сохранение стерической организации - важный параметр при оптимизации структуры аптамеров (Ikebukuro, 2005). Известно, что тиомодификация может привести к изменению конформации структуры, чтобы определить ее влияние для исследуемых нами олигонуклеотидов мы получили их КД спектры и сравнили с немодифицированным фосфодиэфирным олигонуклеотидом ТВА. КД спектры всех

исследованных олигонуклеотидов при 15 °С приведены на рис.8. Нами было установлено, что все олигонуклеотиды имеют КД-спектры

одинаковой формы.

Положительная ветвь при 295 нм и отрицательная при 265 отражают образование антипараллельных квадруплексов, как в ТВА, показанном пунктирной линией, так и во всех

воо

Б00

200 О

1250 750

250

о;

1000 еоо

200

N=6 4823 LL11 J

N=4 Í 4790 Р4 ,i/L

N=14 , I....... i 4950 Satr

2000

M/Z

Рнс.7 Масс-спектры тиофосфорильных аналогов ТВА (1X11, Р4 и 8АТЯ). Число атомов серы (Ы) в молекуле рассчитано с точностью до целых по формуле: [Мнайд.- Мрассч.]/16 (1), где Мнайд. - молекулярная масса, найденная масс-спектрометрически; Мрассч. -расчетная молекулярная масса ТВА (4726 Да); 16 -разница в атомных весах серы и кислорода.

остальных модифицированных олигонуклеотидах. Форма спектра полностью

Рис.8 КД- спектры ТВА ( —) и его тиоаналогов, 15 °С. А) олигонуклеотиды с модификациями "в плоскостях" между GG; Б) олигонуклеотиды с модификациями "в петлях"; В) олигонуклеотиды со смешанным расположением модификаций.

тиомодифицированного олигонуклеотида Satr (кривая с треугольниками) немного

отличалась от других спектров, но все же содержала характерные полосы. Это

может быть объяснено искажением структуры квадруплекса.

При помощи КД-спектроскопии было установлено, что все синтезированные

аналоги ТВА обладали тем же структурным мотивом, что и немодифицированный

олигомер, т.е. содержали внутримолекулярный антипараллельный G-квадруплекс.

Один из известных подходов к установлению вторичной структуры олигомеров

состоит в изучении изменения параметров флуоресценции интеркаляторов (в

настоящей работе - этидий бромида, EtBr) в составе комплексов с ДНК (Борисова

1998). Метод поляризованной флуоресценции EtBr был использован для

определения молярности структур, образованных из ТВА и его частичных и

полного тиоаналогов. Величину поляризации флуоресценции молекул (Р)

определяли при 3 °С и она была равна 0,13 ± 0,005 для всех исследованных

олигонуклеотидов.

р = Зт(1/Ро- 1/3)/(1/Р-1/Ро) (2), где Р это наблюдаемая поляризация, Ро = 41±1% предельная величина степени поляризации флуоресценции EtBr в бесконечно вязкой среде, т - длительность флуоресценции EtBr в комплексе с олигонуклеотидом;

Из уравнения (2) вращательной релаксации было получено, р = 17,6 ± 2,3 не для ТВА, SATP и Р4 олигонуклеотидов. Вычисленные р для всех модифицированных олигонуклеотидов были равны значениям для ТВА. Время жизни флуоресценции т комплекса EtBnTBA было равно 14.0 ±0.5 не. Наши замеры флуоресцентной поляризации комплексов с EtBr подтверждают гипотезу о мономолекулярном сворачивании не модифицированных и полностью модифицированных олигонуклеотидов.

2.2 Термодинамические характеристики тиоапалогов ТВА.

На рис.9 приведены кривые плавления (295нм) для тиомодифицированных ТВА-олигонуклеотидов.

Б 1 ! I —ТВ». --11 — L1I •-LI2J л LL

~т ~Т Г '

! Г

ж "А"

___ |

! ^х! !

i ^ ^^ 1 1 VjN. ;

------ —_4—|—

^ Температура, °С

Рис.9 Кривые УФ плавления олигонуклеотидов, 295нм. А) Олигонуклеотиды с модификациями "в плоскостях" между СО; Б) Олигонуклеотиды с модификациями "в петлях"; В) Олигонуклеотиды со смешанным составом.

A j 1 -•-TEA --РШ11 — Р4 • - PI 415 твгРШ -»-PSII ;

------р-^ i dr ч......

1 г — V \— — Чх

30 40 so w

Температура, "С

Температура, С

Термодинамические параметры - Т^, (температура плавления), ДН (энтальпия

образования), ДБ (энтропия) -для всех изученных олигонуклеотидов - были

рассчитаны в рамках нелинейного приближения в двухфазной модели состояний

(табл.1). Значения энергетических характеристик для плавления

немодифицированного олигонуклеотида ТВА (табл.1, первая строка), находятся в

Название Последовательность Локализа ция замен Кол-во замен АН, Ы/шо1 Т плавления Тш, °С ДЭ, ,1/то1 А037 С, Ы/тоНС

ТВА Р1011 ссгтсстстссттсо Нет 0 -160 52 -492 -7,7

соттастстдсттсо Замены между | квартетами 1 -166 49 -517 -6,3

Р4 дСТТдСТСТдСТТдО 4 -200 40 -639 -2,1

Р1415 сеттсстстсаттда 1 -180 50 -558 -7,4

РШ даттаатвтдаттаа 2 -166 47 -520 -5,6

Р511 ССТТдйТСТдаТТСО 2 -174 46 -545 -5,4

Ы СаТТССТаТСССТСа Замены в петлях 1 -152 55 -464 -8,7

Ы1 GGtTGGTGTGGtTGG 2 -163 55 -497 -9,4

П21 GGtTGGtgTGGtTGG 4 -154 56 -467 -9,2

Ш1 GgttGGTGTGgttGG б -104 54 -320 -5,6

IX GgttGgtgtGgttGG 10 -163 55 -497 -9,4

1343 GGttgGtgtggttgG Смешанн ые замены И -130 46 -407 -3,7

ЬЗ GGttgGTGTGGTTGG 3 -154 52 -475 -7,5

БАТЯ ддЬЬддЬдЬдд^дС Полная 14 -161 45 -506 -4,4

Прописными буквами обозначены З'-тиофосфорильные звенья

Таблица 1. Последовательности и термодинамические параметры тиоалалогов ТВА.

Влияние локализации тиофосфорильных замен на термодинамическую стабильность олигомеров.

В результате исследования полученных термодинамических данных, мы смогли выявить новую зависимость устойчивости олигонуклеотидов от числа и положения тиомодификаций, представленную на рис.10. В результате мы смогли выяснить, как сказывается на свободной энергии и температуре плавления количество и качество тиофосфорильных замен. Так, например, количество

модификаций между двумя гуаниновыми звеньями в олигонуклеотидах PI, Pill и Р4 (на рис.Ю -кружки) линейно сказывается на потере стабильности. С другой стороны, тиозамены между Т и G, G и Т или Т и Т сказываются незначительно, а чтобы оценить влияние смешанных модификаций на стабильность

и о 50

р 45

о.

с 40

L121 Г А ■

ftti ( * ! 1

\ ! , sAtl i А

- \ \ \ ♦ Р4 i

U .10

О <

-15

—> '".....— Р4 / / • Atr У ...... Б А sAtr А.

...................ГШ 1

0 5 10 15 0 5 10

Число тнофосфорильных замен Число тнофосфорильных замен

Рис.Ю Зависимость термодинамических параметров от числа тиомодификаций олигонуклеотиды, модифицированные между вв связями отмечены кружками, модифицированные только в петлях - квадратами, смешанные модификации -треугольниками. А) температура плавления Б) свободная энергия Гиббса при 37°С

олигонуклеотидов, следует перемножить вклады отдельных модификаций. Тиофосфорильная модификация интернуклеотидной Ов связи уменьшает структурную стабильность (рис.Ю). Предположительно, замещение серой кислорода в фосфатной группе приводит к изменению длин связей и углов между связями. Напротив, модификация межнуклеотидных связей в районе петель на устойчивости структуры сказывается незначительно. В то же время модификация между вв в олигонуклеотидах Р1, Р111 и Р4 приводит к потере стабильности. Крайне важно, что число модифицированных вв связей имеет линейный эффект на устойчивость. С другой стороны модификация между ТС, Тв или ТТ дает незначительный эффект на стабильность олигонуклеотида. При смешанной модификации вклады в стабильность складываются.

В результате работы показано, что все синтезированные олигонуклеотиды имеют в-квадруплексную структуру, однако отличаются стабильностью.

Выведены закономерности влияния локализации модификации на стабильность структуры. Показано, что модификация в петлях практически не влияет на стабильность структуры, а между квартетами, напротив, ее ослабляет. 2.3 Исследование биологических свойств полученных тиоаналогов. 2.3.1 Влияние тиоаналогов ТВ А на скорость свертываемости крови.

Наиболее важным при скрининге оптимальных структур модифицированных аптамеров ТВА является сравнение их антитромбиновых свойств. Механизм антикоагуляционной активности ТВА основан на его способности образовывать прочный комплекс с тромбином, что приводит к блокированию всего каскада свертывания (Griffin, 1993). Влияние введения в плазму крови ТВА и синтезированных олигомеров на коагуляцию исследовали, определяя тромбиновое время (ТВ, стандартный медицинский показатель).

Олигомеры добавляли в плазму в интервале концентраций от 0,1 до 0,8 нмоль/мл. Активность тромбина при данной концентрации олигонуклеотида получали методом интерполяции из калибровочной кривой зависимости тромбинового

времени от концентрации тромбина. Оказалось, что полностью

модифицированный тиоаналог ТВА (SATR), не только не замедлял свертываемость крови, а напротив, способствовал более быстрому, чем в отсутствии олигонуклеотида

образованию сгустка. Это объясняется известными гидрофобными свойствами тиоолигомеров и их способностью неспецифически связываться с различными белками. Только некоторые

Рис.11 Мигрирование активности из ИССПедованных олигомеров были тромбина (6.0 Ш/мл), внесенного в

плазму крови, олигонуклеотидами: близки ПО величинам ТВ к исходному

1 -ТВА; 2 -LL11; 3 -LL; 4 -Р4

аптамеру ТВА. Остальные аналоги проявляли относительно низкую антикоагуляционную активность, например, содержащий 10 тиофосфорильных групп олигомер LL, и обладающий нестабильной конформацией олигомер Р4. Исследованные олигонуклеотиды можно расположить по степени возрастания антитромбновой активности в виде следующего ряда: SATR «P4<L11<LL11=TBA. На рис.11 приведены типичные концентрационные зависимости действия ингибиторов Lll, Р4, LL11 и ТВА на активность тромбина, внесенного в плазму. Как видно, наиболее близкими свойствами к исходному ТВА обладает олигомер LL11, модифицированный только по ТТ -петлям квартета. 2.3.2 Исследование кинетики нукпеазного гидролиза ТВА и его тиоаналогов. Для выбора наиболее стабильных к биодеградации, и в то же время сохраняющих ингибиторные свойства тиоаналогов ТВА, среди синтезированных олигомеров для дальнейших исследований были отобраны олигомеры, обладающие максимальными значениями температуры плавления внутримолекулярных структур: L3, LL11, Ll, Lll, LL, L121 (табл.1).

Устойчивость выбранных аналогов ТВА в отношении действия нуклеаз оценивали

методом ферментативного гидролиза с ДНКазой RQ1. Для анализа состава

гидролитических смесей наиболее информативным оказался метод MALDI MS. Из

масс-спектрометрического анализа продуктов гидролиза видно (рис. 12А), что

наиболее уязвимой для расщепления оказалась область петель G- квадруплекса.

Самые интенсивные сигналы в спектре продуктов гидролиза LL (рис.12Б)

соответствуют фрагментам 5'(3')-GGTTG (1582Да) и 5'(3')-GGTTGGTGTG

(3242Да), а также их фосфорилированным производным (1662 Да и 3322Да

соответственно). Присутствие последних обусловлено симметрией структуры

квадруплекса и тем, что расщепление нуклеазой идет как с 3', так и с 5' конца. В

результате образуется пара фрагментов одного и того же состава, один из которых

содержит концевую фосфатную группу. Сходные пары фрагментов,

различающиеся на одну и ту же величину 80Да (фосфатная группа),

наблюдаются и для аналога LL11 (рис.12А), также обладающего симметрией.

Олигомер LL, в котором все петли защищены тиогруппами, расщеплялся только по

Масса/заряд (m/z)

Рис.12 MALDI масс-спектры продуктов гидролиза тиоаналогов ТВА, LL (А) и LL11(Б), под действием эндонуклеазы RQ1, 12 часов, 37 °С.

межнуклеотидным связям в составе плоскостей квартета.

На момент окончания гидролиза (12 часов) значительная часть исходного олигонуклеотида (4887Да, [М+Н]+) оставалась интактной (рис. 12А). За это же время расщепление аналога LL11 (рис.12Б), в котором большая петля (TGT) не модифицирована, прошло полностью (исходный сигнал исчез). При этом можно преимущественно наблюдать характерные продукты гидролиза по большой петле (1912Да, 2216Да, 2545Да, 2850Да) и их фосфорилированные пары. Эти данные подчеркивают перспективность введения модификаций в область петель G-квартетов при конструировании биологически активных аналогов.

2.3.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови. Модельные исследования ферментативного расщепления аптамеров, приведенные выше, дали представление о наиболее уязвимых для гидролиза позициях в структуре ТВА-квартета. Поэтому далее было проведено сравнение скоростей гидролиза

тиоаналогов и ТВА в плазме крови. Для этой цели были разработаны специальные методы выделения и анализа олигомеров из плазмы крови, совместимые с требованиями МАЬБГ МБ.

При их оптимизации использовали

флуоресцентно-меченные

олигонуклеотиды из 14-26 звеньев, что

позволило визуализировать все шаги

выделения. Для наиболее полного

разрушения комплекса аптамер-

тромбин применяли : избыток

олигомера-антидота,

комплементарного к ТВА. Этот прием

по данным ВЭЖХ-анализа (данные не

приведены) позволяет на 20-30%

увеличить степень извлечения

олигонуклеотидов из плазмы крови и,

следовательно, повысить достоверность и чувствительность метода. Выделенные

после инкубации в плазме смеси олигомеров обессоливали и анализировали с

помощью МАЬ01 МБ. На рис.13 приведены масс-спектры смеси олигомеров ТВА

(4627 Да, [М+Н]+) и 1X1 1 (4823 Да, [М+Н]+), инкубированных с плазмой крови

человека; выделение проведено немедленно (0 минут, рис.1 ЗА), после выдержки

при 37 °С в течение одной минуты (рис.13Б) и пяти минут (рис.13В). Исходное

соотношение величин сигналов ТВА/1Х11 составляло -1,5:1 (рисЛЗА), а уже через

2500 2000 1500 1000

I н-

1200-1СЮ0-900 600 400

А ТВА 0 мин § LL11 и____

Б 1 мин

В S мин

4500 4600 4700 4300 4900 5000

Масса/заряд (m/z)

Рис.13 Масс-спектры смеси

олигонуклеотидов ТВА и LL11,

выделенных из плазмы крови немедленно после смешивания (А) и после инкубации при 37 С в течение 1 (Б) и 5 СВ1 минут.

5 мин снизилось до -0,4:1 (рисЛЗВ). Эти данные свидетельствуют о заметно меньшей скорости гидролиза модифицированного олигомера 1X11 в плазме крови в сравнении с ТВА. Следует отметить, что разработанный метод определения стабильности олигонуклеотидов к плазме крови может стать в дальнейшем основой для фармакокинетических исследований.

Данные, полученные в результате работы, позволяют предположить, что наиболее перспективными для дальнейшего исследования свойствами обладает олигомер ЫЛ1, в котором модифицированы лишь малые петли в-квадруплекса. Важно подчеркнуть, что полученный олигонуклеотид IX11 не отличается от ТВА по антикоагуляционной активности, но характеризуется большей устойчивостью в плазме крови. Обнаруженные в работе закономерности влияния тиофосфорильных замен на свойства олигомеров представляют интерес для направленного конструирования других терапевтически значимых олигонуклеотидов, в частности, в-квадруплексной конформации. Выводы

1. Впервые разработан подход к конструированию производных фрагментов ДНК, способных самопроизвольно фиксироваться на внешней мембране клеток. ДНК-маркирование живых клеток продемонстрировано на примере синтезированных в работе пальмитиновых и стеариновых конъюгатов олигонуклеотидов.

2. Для поиска терапевтически значимых структур олигонукпеотидной природы впервые осуществлен синтез ряда тиоаналогов тромбинсвязывающего ДНК-аптамера (ТВА, состава СОТТССТОТСОТТСС,), с различным количеством и локализацией межнуклеотидных тиофосфорильных связей (13 олигонуклеотидов).

3. Проведено сравнительное структурно-функциональное исследование ТВА и его тиоаналогов:

3.1 Показаны условия образования мономолекулярных структур тиоаналогов ТВА и установлена их конформация и стабильность.

3.2 Найдена зависимость между локализацией тиофосфорильных замен и термодинамической устойчивостью олигонуклеотидов.

3.3 На основе антикоагуляционных свойств и данных о кинетике нуклеазного гидролиза в плазме крови, полученных для наиболее термодинамически стабильных олигомеров (Satr, LL, LL11, L3), выявлен перспективный аналог тромбин-связывающего аптамера (LL11, имеющий тифосфорильные замены в малых петлях), сочетающий высокую антикоагуляционную активность с большей в сравнении с ТВА устойчивостью к биодеградации.

Список основных публикаций по теме:

1. Zaitseva М.А., Kaluzhny D.N., Shchyolkina А.К., Borisova O.F., Pozmogova G.E. The influence of different local thiophosphoryl internucleotide bonds on the d(GGTGGTTGTGGTGGT) conformation. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. V. 24. P. 830831.

2. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Смирнов И.П., Зайцева М.А., Татаринова О.Н., Говорун В.М. Получение и свойства ассоциатов наночастиц никеля с ss-ДНК и белками. // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №5-6. С. 148-154.

3. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Веремеев К.Ю., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Петрунин Д.Д., Позмогова Г.Е. Влияние способов- очистки олигодезоксирибонуклеотидных зондов на эффективность генодиагностики методом PCR в режиме реального времени. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008. Т. 145. №3. С. 275-280.

4. Лукьянова Т.А., Зайцева М.А., Карпов В.А., Позмогова Г.Е. Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации. // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. №1. С. 83-88.

5. Borisenko G.G., Zaitseva М.А., Chuvilin A.N., Pozmogova G.E. DNA modification of live cell surface. //Nucleic Acids Res. 2009. T. 37. №4. C. e28.

6. Zaitseva M.A., Kaluzhny D.N., Shchyolkina A.K., Borisova O.F., Smirnov I.P.,

Pozmogova G.E. Conformation and thermostability of oligonucleotide

d(GGTTGGTGTGGTTGG) containing thiophosphoryl internucleotide bonds at different

positions. // Biophysical Chemistry. 2010. V. 146, № 1, P.l-6.

7. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Позмогова Г.Е. Специфика обращено-фазовой ВЭЖХ олигодезоксирибонуклеотидных зондов для Real-Time PCR генодиагностики. // Тез. докл. III Межд. конф. "Фундаментальные науки - медицине". 2 - 8 сент. 2007. Новосибирск. С. 143.

8. Зайцева М.А., Калюжный Д.И., Лукьянова Т.А., Щелкина А.К., Борисова О.Ф., Позмогова Г.Е. Структурные исследования локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов d(GGTGGTTGTGGTGGT), аналогов антитромбинового аптамера. XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва. 2007. Т. 4. С. 535.

9. М. A. Zaitseva, D. N. Kaluzhny, А. К. Shchyolkina, О. F. Borisova, G. Е. Pozmogova Thiophosphoryl modifications in loops conserve the G-quadruplex conformations of d(TTAGGG)4 and d(GGTTGGTGTGGTTGG) oligonucleotides. // "Program and book of abstracts» «Second International Meeting on Quadruplex DNA» 18-21 april, Louisville, KY. 2009. P. 86.

10. Зайцева M.A., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е. Структурно-функциональные свойства тиофосфорильных аналогов антитромбинового ДНК аптамера. // Тез. докл. 1-й межд. науч. шк. Нано-2009. 29июня-4июля. Москва. 2009. С. 230.

Заказ № 67-а/01/10 Подписано в печать 29.01.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцева, Марина Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. «БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА G-КВАДРУПЛЕКСОВ» (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

2.1 Введение.

2.2 G-квадруплексы.

2.3 Структура G-квадруплекса.

2.4 Биологическая значимость G-квадруплексов.

2.4.1 Взаимодействие с белками.

2.4.2 Роль G-квадруплексов в нерасшифрованных участках генома.

2.4.3 Теломеры и теломераза.

2.5. G-квадруплексные аптамеры.

2.5.1 Тромбиновый аптамер.

2.5.2 Биологическая активность тромбинового аптамера.

2.5.3 Методы повышения стабильности тромбинового аптамера.

2.5.3.1 Изменение состава квадруплексного мотива.

2.5.3.2. Добавление к структуре дополнительных элементов.

2.5.3.3. Модификация оснований, входящих в структуру.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Синтез олигонуклеотидов.

3.2 Синтез жирнокислотных производных олигонуклеотидов.

3.3 Конфокальная флуоресцентная микроскопия.

3.4 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток.

3.4.1 Проточная цитометрия.

3.4.2 Тест на выживание клеток.

3.4.3 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности клеток Jurkat и макрофагов J774.

3.4.4 Жизнеспособность клеток в присутствии жирнокислотных производных.

3.5 Исследование физико-химических параметров олигонуклеотидов.

3.5.1 Измерение спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма.

3.5.2 Метод поляризованной флуоресценции EtBr.

3.6 Исследование биологических свойств полученных олигонуклеотидов.

3.6.1 Нуклеазный гидролиз.

3.6.2 Влияние олигонуклеотидов на скорость свертываемости крови (определение тромбинового времени).

3.6.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови.

3.7 МАЛДИмасс-спектрометрия олигонуклеотидов.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Оптимизация методов получения модифицированных олигонуклеотидов.

4.1.1 Жирнокислотные производные олигонуклеотидов.

4.1.1.1 Выбор структуры жирнокислотных конъюгатов олигонуклеотидов.

4.1.1.2 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток.

4.1.2. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации.

4.1.2.1 Конструирование тиоаналогов ТВА.

4.1.2.2 Синтез модифицированных локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов.

4.2 Структурно-функциональные свойства тиоаналогов ТВА.

4.2.1 Стерическая организация олигомеров.

4.2.2 Термодинамические характеристики тиоаналогов ТВА.

4.2.3 Влияние локализации тиофосфорильных замен на стабильность олигомеров.

4.3 Биологические свойства олигонуклеотидов.

4.3.1 Влияние тиоаналогов ТВА на скорость свертываемости крови.

4.3.2 Исследование кинетики нуклеазного гидролиза ТВА и его тиоаналогов.

4.3.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств"

Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами - одна из перспективных задач в области биоорганической химии. Создание новых модифицированных олигонуклеотидов необходимо для проведения молекулярно-биологических и медико-биологических фундаментальных исследований, для развития и совершенствования методов ДНК-диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, разработки новых высокоизбирательных лекарств. Изучение особенностей строения и синтеза модифицированных олигонуклеотидов - активно развивающаяся область науки. В настоящее время описан широкий круг производных ДНК, модифицированных по гетероциклическим основаниям, сахаро-фосфатному остову, несущих в своем составе метки и ненуклеотидные звенья [3, 4]. Особенностью настоящей работы является конструирование потенциально биосовместимых функциональных производных олигомеров с заданными свойствами, в частности, такими, как способность встраиваться в мембрану живой клетки, стабильность в плазме крови и др.

Согласно литературным данным, в ряде случаев дополнительные свойства олигонуклеотидам можно придавать введением в структуру молекулы концевых заместителей, например, меток или функциональны групп. В настоящей работе такой прием был использован для получения, в соответствии с известным методами, аминоалкильных и флуоресцентных олигомеров. Кроме того, были синтезированы новые, амфифильные производные олигомеров для создания универсального метода нековалентной фиксации олигонуклеотидов на внешней мембране живых клеток. Перспективность использования ДНК-мечения поверхности клеток для их направленной иммобилизации на твердом носителе была показана в работе [5]. Однако реализация этой идеи ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью процедуры ДНК-модификации клеток. Поэтому для создания нового способа быстрой и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной в настоящей работе были сконструированы и получены производные олигонуклеотидов, содержащие концевые остатки стеариновой и пальмитиновой кислот.

Выбор стратегии введения модификаций в состав олигомеров определяется на основе анализа структуры олигонуклеотидов. В области поиска эффективных ДНК-лекарств актуальной остается проблема быстрой биодеградации фосфодиэфирных фрагментов полинуклеотидов in vivo. Поэтому для антисмысловых олигомеров, действие которых основано на комплементарных взаимодействиях с полинуклеотидной мишенью, был предложен ряд эффективных решений, основанных на введении стабилизирующих модификаций сахаро-фосфатного остова олигомеров. Сегодня одним из наиболее изученных приемов является замена фосфодиэфирных межнуклеотидных связей на тиофосфорильные [6-8]. Такие тиоолигомеры, хотя и обладают заметной системной токсичностью [6, 7], однако уже применяются в современной медицине. При конструировании биологически активных олигомеров, функциональность которых опосредована их стерической организацией, важно учитывать, что введение модификаций может приводить к конформационным искажениям исходной структуры ДНК [9-13, 5]. Поэтому наиболее перспективными для дальнейшего применения в молекулярно-медицинских исследованиях свойствами обладают олигонуклеотиды, содержащие G-квадруплексы структуры ДНК, состоящие из сложенной вчетверо (вследствие взаимодействия четырех гуанинов), одной молекулы или четырех нитей различных молекул. Более 40% промоторов в человеческом геноме содержит по крайней мере один квадруплекс [14, 15]. G-богатые участки ДНК найдены в центромерах, в повторах синдрома Мартина-Белла (т.н. «синдром ломкой хромосомы») [16], в теломерах на концах линейных хромосом [17], участвуют в работе теломеразы [18]. Обнаружены G-квадруплексные биологически активные аптамеры (олигонуклеотиды, отобранные по сродству к молекулярным или иным мишеням), однако их применение in vivo тоже ограничено низкой устойчивостью к нуклеазному гидролизу. В настоящей работе для поиска структуры более стабильного функционального

G-квадруплексного олигомера была выбрана стратегия введения в его состав локальных тиофосфорильных связей. В работе был исследован ТВА

Thrombin binding aptamer -тромбинсвязывающий ДНК-аптамер состава

GGTTGGTGTGGTTGG) [19, 20]. Проведение системного анализа влияния 7 тиофосфорильных замен в составе ДНК G-квадруплексов на их конформацию и биологические свойства необходимо при создании новых эффективных лекарств нуклеотидной природы. В связи с этим, нами был проведен анализ термодинамических и биологических свойств тиогомологов ТВА, синтезированных с помощью разработанного нами метода, что позволило выявить ряд закономерностей и найти оптимальные структуры.

Цели и задачи исследования

При выполнении данной работы решались следующие задачи:

- оптимизация методов синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых олигомеров, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, и олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы;

- разработка дизайна и наработка частичных тиоаналогов ТВА;

-сравнительное исследование ТВА и его тиоаналогов по физикохимическим (конформация, термодинамика и др.) и биологическим (антитромбиновые свойства и стабильность в плазме крови, кинетика нуклеазного гидролиза) параметрам.

Научная новизна и практическая значимость

Оптимизированы методы синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, и олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы. Использование полученных модифицированных олигонуклеотидов стало основой для проведения таких работ, как исследование ДНК-комплексов с наночастицами никеля. Конъюгаты олигонуклеотидов с остатками стеариновой и пальмитиновой кислот, полученные в настоящей работе, использовались при разработке способа нековалентной иммобилизации фрагментов ДНК на поверхности живых клеток.

Обнаружено, что модификация в петлях стабилизирует конформацию, а в плоскостях G-квадруплекса снижает его стабильность. Найден перспективный модифицированный олигонуклеотид (LL11), структура которого изменена только в Т-Т-петлях. Он сохраняет антитромбиновые 9 свойства ТВА, и в то же время обладает большей устойчивостью к биодеградации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зайцева, Марина Алексеевна

5. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

2. Для поиска терапевтически значимых структур олигонуклеотидной природы впервые осуществлен синтез ряда тиоаналогов тромбинсвязывающего ДНК-аптамера (ТВА, состава GGTTGGTGTGGTTGG,), с различным количеством и локализацией межнуклеотидных тиофосфорильных связей (13 олигонуклеотидов).

3. Проведено сравнительное структурно-функциональное исследование ТВА и его тиоаналогов:

LL11, имеющий тифосфорильные замены в малых петлях), сочетающий высокую антикоагуляционную активность с большей в сравнении с ТВА устойчивостью к биодеградации. Благодарности

Приношу благодарность за помощь, сотрудничество, консультации, научные дискуссии коллективу лаборатории искусственного антителогенеза, ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА, а также коллективу лабораторий института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцева, Марина Алексеевна, Москва

1. Jayapal P., Mayer G., Heckel A., Wennmohs F. Structure-activity relationshipsof a caged thrombin binding DNA aptamer: insight gained from molecular dynamics simulation studies. // J Struct Biol. 2009. V. 166, №3, P. 241-250.

2. Huppert J.L. Hunting G-quadruplexes. // Biochimie. 2008. V. 90, №8, P. 11401148.

3. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. // Eur J Biochem. 2003. V. 270, №8, P. 1628-1644.

4. Sacca В., Lacroix L., Mergny J.L. The effect of chemical modifications on the thermal stability of different G-quadruplex-forming oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №4, P. 1182-1192.

5. Chandra R.A., Douglas E.S., Mathies R.A., Bertozzi C.R., Francis M.B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. V. 45, №6, P. 896-901.

6. Han S., Mahato R.I., Sung Y.K., Kim S.W. Development of biomaterials for gene therapy. // Mol Ther. 2000. V. 2, №4, P. 302-317.

7. Dias N., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol Cancer Ther. 2002. V. 1, №5, P. 347-355.

8. Herbert B.S., Pongracz K., Shay J.W., Gryaznov S.M. Oligonucleotide N3'-->P5' phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors. // Oncogene. 2002. V. 21, №4, P. 638-642.

9. Smirnov I., Shafer R.H. Effect of loop sequence and size on DNA aptamer stability. // Biochemistry. 2000. V. 39, №6, P. 1462-1468.

10. Meyers L.A., Lee J.F., Cowperthwaite M., Ellington A.D. The robustness of naturally and artificially selected nucleic acid secondary structures. // J Mol Evol. 2004. V. 58, №6, P. 681-691.

11. Huppert J.L., Balasubramanian S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №9, P. 2908-2916.

12. Todd A.K., Haider S.M., Parkinson G.N., Neidle S. Sequence occurrence and structural uniqueness of a G-quadruplex in the human c-kit promoter. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №17, P. 5799-5808.

13. Usdin K. NGG-triplet repeats form similar intrastrand structures: implications for the triplet expansion diseases. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, №17, P. 4078-4085.

14. Wright W.E., Tesmer V.M., Huffman K.E., Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. // Genes Dev. 1997. V. 11, №21, P. 2801-2809.

15. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. // Cell. 1999. V. 97, №4, P. 503-514.

16. Padmanabhan К., Tulinsky A. An ambiguous structure of a DNA 15-mer thrombin complex. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996. V. 52, № 2, P. 272-282.

17. Gusfield D.: Algorithms on Strings, Trees, and Sequences: Computer Science and Computational Biology: Cambridge University Press; 1997.

18. Kypr J., Kejnovska I., Renciuk D., Vorlickova M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №6, P. 1713-1725.

19. Gellert M., Lipsett M.N., Davies D.R. Helix formation by guanylic acid. // Proc Natl Acad SciUS A. 1962. V. 48, P. 2013-2018.

20. Sen D., Gilbert W. Formation of parallel four-stranded complexes by guanine-rich motifs in DNA and its implications for meiosis. // Nature. 1988. V. 334, №6180, P. 364-366.

21. Sundquist W.I., Klug A. Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetrads between hairpin loops. //Nature. 1989. V. 342, №6251, P. 825-829.

22. Rawal P., Kummarasetti V.B., Ravindran J., Kumar N., Haider K., Sharma R., Mukerji M., Das S.K., Chowdhury S. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: role in Escherichia coli global regulation. // Genome Res. 2006. V. 16, №5, P. 644-655.

23. Hershman S.G., Chen Q., Lee J.Y., Kozak M.L., Yue P., Wang L.S., Johnson F.B. Genomic distribution and functional analyses of potential G-quadrupIexforming sequences in Saccharomyces cerevisiae. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, №1, P. 144-156.

24. Schaffitzel C., Berger I., Postberg J., Hanes J., Lipps H.J., Pluckthun A. In vitro generated antibodies specific for telomeric guanine-quadruplex DNA react with Stylonychia lemnae macronuclei. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98, №15, P. 8572-8577.

25. Paeschke K., Simonsson Т., Postberg J., Rhodes D., Lipps HJ. Telomere end-binding proteins control the formation of G-quadruplex DNA structures in vivo. // Nat Struct Mol Biol. 2005. V. 12, №10, P. 847-854.

26. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. // Nature. 1991. V. 350, №6319, P. 569-573.

27. Wellinger R.J., Wolf A.J., Zakian V.A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. // Cell. 1993. V. 72, №1, P. 51-60.

28. Cech T.R. Life at the End of the Chromosome: Telomeres and Telomerase. // Angew Chem Int Ed Engl. 2000. V. 39, №1, P. 34-43.

29. Zhao Y., Du Z., Li N. Extensive selection for the enrichment of G4 DNA motifs in transcriptional regulatory regions of warm blooded animals. // FEBS Lett. 2007. V. 581, №10, P. 1951-1956.

30. Lipps H.J., Rhodes D. G-quadruplex structures: in vivo evidence and function. // Trends Cell Biol. 2009. V. 19, №8, P. 414-422.

31. Yadav V.K., Abraham J.K., Mani P., Kulshrestha R., Chowdhury S. QuadBase: genome-wide database of G4 DNA—occurrence and conservation inhuman, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, P. 381-385.

32. Todd A.K., Johnston M., Neidle S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №9, P. 29012907.

33. Huppert J.L., Balasubramanian S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №2, P. 406-413.

34. Maizels N. Dynamic roles for G4 DNA in the biology of eukaryotic cells. // Nat Struct Mol Biol. 2006. V. 13, №12, P. 1055-1059.

35. Huppert J.L., Bugaut A., Kumari S., Balasubramanian S. G-quadruplexes: the beginning and end of UTRs. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, №19, P. 62606268.

36. Johnson J.E., Smith J.S., Kozak M.L., Johnson F.B. In vivo Veritas: using yeast to probe the biological functions of G-quadruplexes. // Biochimie. 2008. V. 90, №8, P. 1250-1263.

37. Fry M., Loeb L.A. Human werner syndrome DNA helicase unwinds tetrahelical structures of the fragile X syndrome repeat sequence d(CGG)n. // J Biol Chem. 1999. V. 274, №18, P. 12797-12802.

38. Saha Т., Usdin K. Tetraplex formation by the progressive myoclonus epilepsy type-1 repeat: implications for instability in the repeat expansion diseases. // FEBS Lett. 2001. V. 491, №3, P. 184-187.

39. Cogoi S., Quadrifoglio F., Xodo L.E. G-rich oligonucleotide inhibits the binding of a nuclear protein to the Ki-ras promoter and strongly reduces cell growth in human carcinoma pancreatic cells. // Biochemistry. 2004. V. 43, №9, P. 2512-2523.

40. Christiansen J., Kofod M., Nielsen F.C. A guanosine quadruplex and two stable hairpins flank a major cleavage site in insulin-like growth factor II mRNA. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22, №25, P. 5709-5716.

41. Guschlbauer W., Chantot J.F., Thiele D. Four-stranded nucleic acid structures 25 years later: from guanosine gels to telomer DNA. // J Biomol Struct Dyn. 1990. V. 8, №3, P. 491-511.

42. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures—variations on a theme. // Biol Chem. 2001. V. 382, №4, P. 621-628.

43. Webba da Silva M. NMR methods for studying quadruplex nucleic acids. // Methods. 2007. V. 43, №4, P. 264-277.

44. Campbell N.H., Parkinson G.N. Crystallographic studies of quadruplex nucleic acids. // Methods. 2007. V. 43, №4, P. 252-263.

45. Neaves K.J., Huppert J.L., Henderson R.M., Edwardson J.M. Direct visualization of G-quadruplexes in DNA using atomic force microscopy. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №18, P. 6269-6275.

46. Nakken S., Rognes Т., Hovig E. The disruptive positions in human G-quadruplex motifs are less polymorphic and more conserved than their neutral counterparts. //Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №17, P. 5749-5756.

47. Mirkin S.M. Discovery of alternative DNA structures: a heroic decade (19791989). // Front Biosci. 2008. V. 13, P. 1064-1071.

48. Parkinson G.N., Lee M.P., Neidle S. Crystal structure of parallel quadruplexes from human telomeric DNA. // Nature. 2002. V. 417, №6891, P. 876-880.

49. Wang Y., Patel D.J. Solution structure of the human telomeric repeat dAG3(T2AG3)3. G-tetraplex. // Structure. 1993. V. 1, №4, P. 263-282.

50. Balagurumoorthy P., Brahmachari S.K. Structure and stability of human telomeric sequence. // J Biol Chem. 1994. V. 269, №34, P. 21858-21869.

51. Fry M. Tetraplex DNA and its interacting proteins. // Front Biosci. 2007. V. 12, P. 4336-4351.

52. Kerwin S.M. G-Quadruplex DNA as a target for drug design. // Curr Pharm Des. 2000. V. 6, №4, P. 441-478.

53. Dapic V., Abdomerovic V., Marrington R., Peberdy J., Rodger A., Trent J.O., Bates PJ. Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31, №8, P. 2097-2107.

54. Larson E.D., Duquette M.L., Cummings W.J., Streiff R.J., Maizels N. MutSalpha binds to and promotes synapsis of transcriptionally activated immunoglobulin switch regions. // Curr Biol. 2005. V. 15, №5, P. 470-474.

55. Liu Z., Lee A., Gilbert W. Gene disruption of a G4-DNA-dependent nuclease in yeast leads to cellular senescence and telomere shortening. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92, №13, P. 6002-6006.

56. Sun H., Karow J.K., Hickson I.D., Maizels N. The Bloom's syndrome helicase unwinds G4 DNA. // J Biol Chem. 1998. V. 273, №42, P. 27587-27592.

57. Lin Y.C., Shih J.W., Hsu C.L., Lin J.J. Binding and partial denaturing of G-quartet DNA by Cdcl3p of Saccharomyces cerevisiae. // J Biol Chem. 2001. V. 276, №50, P. 47671-47674.

58. Gottschling D.E., Zakian V.A. Telomere proteins: specific recognition and protection of the natural termini of Oxytricha macronuclear DNA. // Cell. 1986. V. 47, №2, P. 195-205.

59. Gray J.T., Celander D.W., Price C.M., Cech T.R. Cloning and expression of genes for the Oxytricha telomere-binding protein: specific subunit interactions in the telomeric complex. // Cell. 1991. V. 67, №4, P. 807-814.

60. De Armond R., Wood S., Sun D., Hurley L.H., Ebbinghaus S.W. Evidence for the presence of a guanine quadruplex forming region within a polypurine tract of the hypoxia inducible factor 1 alpha promoter. // Biochemistry. 2005. V. 44, №49, P. 16341-16350.

61. Marcu K.B., Bossone S.A., Patel A.J. myc function and regulation. // Annu Rev Biochem. 1992. V. 61, P. 809-860.

62. Simonsson Т., Pecinka P., Kubista M. DNA tetraplex formation in the control region of c-myc. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, №5, P. 1167-1172.

63. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Hurley L.H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule torepress c-MYC transcription. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99, N218, P. 11593-11598.

64. Kumari S., Bugaut A., Huppert J.L., Balasubramanian S. An RNA G-quadruplex in the 5' UTR of the NRAS proto-oncogene modulates translation. // Nat Chem Biol. 2007. V. 3, №4, P. 218-221.

65. Богданов А. Теломеры и теломераза. // Соросовский Образовательный журнал. 1998. Т. 12, С. 12-18.

66. Egan С.А., Savre-Train I., Shay J.W., Wilson S.E., Bourne W.M. Analysis of telomere lengths in human corneal endothelial cells from donors of different ages. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998. V. 39, №3, P. 648-653.

67. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. // J Theor Biol. 1973. V. 41, №1, P. 181-190.

68. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. // Cell. 1985. V. 43, №2 Pt 1, P. 405413.

69. Блэкберн E. Теломера и теломераза: нуклеопротеидные комплексы, участвующие в гомеостатической системе поддержания постоянной длины теломер. // Биохимия,. 1997. Т. 62, №11, С. 1400-1406.

70. Shore D. The means to bind the ends. // Nat Struct Biol. 1996. V. 3, №6, P. 491-493.81. van Steensel В., de Lange T. Control of telomere length by the human telomeric proteinTRF1. //Nature. 1997. V. 385, №6618, P. 740-743.

71. Krauskopf A., Blackburn E.H. Rapl protein regulates telomere turnover in yeast. // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95, №21, P. 12486-12491.

72. McEachern M.J., Blackburn E.H. Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. // Nature. 1995. V. 376, №6539, P. 403-409.

73. Krauskopf A., Blackburn E.H. Control of telomere growth by interactions of RAP1 with the most distal telomeric repeats. // Nature. 1996. V. 383, №6598, P. 354-357.

74. Lee H.W., Blasco M.A., Gottlieb G.J., Horner J.W., 2nd, Greider C.W., DePinho R.A. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. // Nature. 1998. V. 392, №6676, P. 569-574.

75. Simonsson T. A substrate for telomerase. // Trends Biochem Sci. 2003. V. 28, №12, P. 632-638.

76. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. // Nature. 1990. V. 346, №6287, P. 818-822.

77. Tuerk С., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. // Science. 1990. V. 249, №4968, P. 505-510.

78. Pendergrast P.S., Marsh H.N., Grate D., Healy J.M., Stanton M. Nucleic acid aptamers for target validation and therapeutic applications. // J Biomol Tech. 2005. V. 16, №3, P. 224-234.

79. Mazumder A., Neamati N., Ojwang J.O., Sunder S., Rando R.F., Pommier Y. Inhibition of the human immunodeficiency virus type 1 integrase by guanosine quartet structures. //Biochemistry. 1996. V. 35, №43, P. 13762-13771.

80. Cherepanov P., Este J.A., Rando R.F., Ojwang J.O., Reekmans G., Steinfeld R., David G., De Clercq E., Debyser Z. Mode of interaction of G-quartets with the integrase of human immunodeficiency virus type 1. // Mol Pharmacol. 1997. V. 52, №5, P. 771-780.

81. Bless N.M., Smith D., Charlton J., Czermak B.J., Schmal H., Friedl H.P., Ward P.A. Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase in lung inflammatory injury. // Curr Biol. 1997. V. 7, №11, P. 877-880.

82. Konopka K., Duzgunes N., Rossi J., Lee N.S. Receptor ligand-facilitated cationic liposome delivery of anti-HTV-1 Rev-binding aptamer and ribozyme DNAs. // J Drug Target. 1998. V. 5, №4, P. 247-259.

83. Lin Y., Jayasena S.D. Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer. // J Mol Biol. 1997. V. 271, №1, P. 100-111.

84. Gatto В., Palumbo M., Sissi С. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential. // Curr Med Chem. 2009. V. 16, №10, P. 1248-1265.

85. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. // Biochemistry. 1991. V. 30, №43, P. 10363-10370.

86. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature. 1992. V. 355, №6360, P. 564-566.

87. Macaya R.F., Schultze P., Smith F.W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90, №8, P. 3745-3749.

88. Huntington J.A. Molecular recognition mechanisms of thrombin. // J Thromb Haemost. 2005. V. 3, №8, P. 1861-1872.

89. Fenton J.W., 2nd. Thrombin specificity. //AnnNY Acad Sci. 1981. V. 370, P. 468-495.

90. Fenton J.W., 2nd, Olson T.A., Zabinski M.P., Wilner G.D. Anion-binding exosite of human alpha-thrombin and fibrin(ogen) recognition. // Biochemistry. 1988. V. 27, №18, P. 7106-7112.

91. Wu Q., Tsiang M., Sadler J.E. Localization of the single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite. // J Biol Chem. 1992. V. 267, №34, P. 24408-24412.

92. Padmanabhan K., Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. // J Biol Chem. 1993. V. 268, №24, P. 17651-17654.

93. Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // J Mol Biol. 1997. V. 272, №5, P. 688-698.

94. Martino L., Virno A., Randazzo A., Virgilio A., Esposito V., Giancola C., Bucci M., Cirino G., Mayol L. A new modified thrombin binding aptamer containing a 5'-5' inversion of polarity site. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34, №22, P. 6653-6662.

95. DeAnda A., Jr., Coutre S.E., Moon M.R., Vial C.M., Griffin L.C., Law V.S., Komeda M., Leung L.L., Miller D.C. Pilot study of the efficacy of a thrombin inhibitor for use during cardiopulmonary bypass. // Ann Thorac Surg. 1994. V. 58, №2, P. 344-350.

96. Li W.X., Kaplan A.V., Grant G.W., Toole J J., Leung L.L. A novel nucleotide-based thrombin inhibitor inhibits clot-bound thrombin and reduces arterial platelet thrombus formation. // Blood. 1994. V. 83, №3, P. 677-682.

97. Peng C.G., Damha M.J. G-quadruplex induced stabilization by 2'-deoxy-2'-fluoro-D-arabinonucleic acids (2'F-ANA). // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №15, P. 4977-4988.

98. Keniry M.A., Owen E.A., Shafer R.H. The contribution of thymine-thymine interactions to the stability of folded dimeric quadruplexes. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25, №21, P. 4389-4392.

99. Решетников Р., Головин А., Спиридонова В., Копылов А.д.с. Модульное конструирование аптамеров методами суперкомпьютерных вычислений. // Сб тез секц докл Роснано 2008.

100. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Ингибирование активности тромбина ДНК-аптамерами. // Бюлл эксперим биол и мед. 2009. Т. 148, №7, С. 41-45.

101. Eckstein F. Nucleoside phosphorothioates. // Annu Rev Biochem. 1985. V. 54, P. 367-402.

102. Stein C., Cohen J. Physicochemical properties of phospborothioate oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16, № 8, P. 3209 3221.

103. Yaswen P., Stampfer M.R., Ghosh K., Cohen J.S. Effects of sequence of thioated oligonucleotides on cultured human mammary epithelial cells. // Antisense Res Dev. 1993. V. 3, №1, P. 67-77.

104. Dean F.B., Nelson J.R., Giesler T.L., Lasken R.S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. // Genome Res. 2001. V. 11, №6, P. 1095-1099.

105. Di Giusto D., King G.C. Single base extension (SBE) with proofreading polymerases and phosphorothioate primers: improved fidelity in single-substrate assays. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31, №3, P. e7.

106. Лактионов П.П., Брыксин A.B., Рыкова Е.Ю., Амирханов Н.В., Власов В.В. Исследование фармокинетики и стабильности в крови in vivoфосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45, №3, С. 170-177.

107. Marky L.A., Breslauer K.J. Calculating thermodynamic data for transitions of any molecularity from equilibrium melting curves. // Biopolymers. 1987. V. 26, №9, P. 1601-1620.

108. Zarytova V.F., Ivanova E.M., Chasovskikh M.N. Synthesis of steroid-containing oligonucleotides and their alkylating derivatives. // Bioorg Khim. 1990. V. 16, №5, P. 610-616.

109. Yoshina-Ishii C.5 Boxer S.G. Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipid bilayers. // J Am Chem Soc. 2003. V. 125, №13, P. 3696-3697.

110. Yoshina-Ishii C., Miller G.P., Kraft M.L., Kool E.T., Boxer S.G. General method for modification of liposomes for encoded assembly on supported bilayers. //J Am Chem Soc. 2005. V. 127, №5, P. 1356-1357.

111. Mishra R.K., Moreau C., Ramazeilles C., Moreau S., Bonnet J., Toulme J.J. Improved leishmanicidal effect of phosphorotioate antisense oligonucleotides by LDL-mediated delivery. // Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1264, №2, P. 229237.

112. Dean D.A. Peptide nucleic acids: versatile tools for gene therapy strategies. // Adv Drug Deliv Rev. 2000. V. 44, №2-3, P. 81-95.

113. Анцыпович И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии.2002. Т. 71, №1, С. 81-96.

114. Кнорре Д.Г., Власов В.В. Клеточные мембраны как барьер при биологических применениях антисмысловых олигонуклеотидов, их производных и аналогов. //Биоорг химия. 1992. Т. 18, №10-11, С. 1330-1340.

115. Ikebukuro К., Okumura Y., Sumikura К., Karube I. A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №12, P. el08.

Информация о работе

Зайцева, Марина Алексеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы