Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния антисигнатурных олигонуклеотидов и их аналогов на жизнедеятельность молликутов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния антисигнатурных олигонуклеотидов и их аналогов на жизнедеятельность молликутов"

Г-Г о ОД

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ имени Д. К. ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукописи ЕГОРОВ Олег Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ

АНТИСИГНАТУРНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ АНАЛОГОВ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МОЛЛИКУТОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев-1997

Диссертацией является рукопись

Работа выполнена в отделе микоплазмологии Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного HAH Украины.

Научный руководитель — член-корреспондент HAH Украины,

доктор биологических наук, профессор Скрипаль И. Г.

Официальные оппоненты— доктор биологических наук

Соколов И. Г. доктор биологических наук Швед А. Д.

Ведущая организация — Институт биоорганической химии и

нефтехимии HAH Украины

Защита состоится 17 сентября 1997 года в 1000 часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 01.81.01. при Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного HAH Украины (252143, Киев-143, ул. Заболотного, 154, Институт микробиологии и вирусологии HAH Украины, зал заседаний).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии HAH Украины.

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого совета

кандидат биологических наук Пуриш JI. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молликуты — наименьшие свободно-живущие прокариотические организмы, многие из которых являются возбудителями заболеваний человека, животных и растений. В связи с растущей резистентностью патогенных видов молликутов к действию антибиотиков все более актуальным становится поиск принципиально новых биологически активных соединений, способных эффективно подавлять их жизнедеятельность. Так как молликуты имеют самый малый среди самореплицирующихся организмов размер генома и все наборы генов, необходимых для нормального функционирования клетки, представлены у них чаще всего в одной копии, то это указывает на возможность использования уникальных свойств не только их генома, но и рибонуклеиновых кислот для разработки новых, с четко определенной мишенью средств подавления жизнедеятельности этих микроорганизмов. Учитывая такие особенности молликутов, как отсутствие клеточной стенки и механизма синтеза предшественников нуклеиновых кислот, источники которых являются экзогенными, одним из перспективных направлений в создании средств, способных избирательно подавлять жизнедеятельность этих микроорганизмов может явиться применение препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов.

Мы полагаем, что одним из объектов для атаки в клетках молликутов ген-направленными биологически активными веществами могут служить уникальные, характерные только для отдельных групп организмов нуклеотидные последовательности в составе их 16Б рРНК, так называемые "сигнатурные" участки (\Voese е1 а1., 1980).

Цель и задачи исследований. Основная цель настоящей работы состояла в получении доказательств возможности контролирования жизнедеятельности молликутов с помощью олигодезоксирибонуклео-тидов и их аналогов, которые являются комплементарными к сигна-

турным участкам 16Б рРНК данных микроорганизмов (в дальнейшем мы их будем называть антисигнатурными).

Для выполнения работы необходимо было решить такие задачи:

1. Провести сравнительное изучение связывания и поглощения клетками молликутов разнообразных антисигнатурных олигодезокси-рибонуклеотидов и их аналогов.

2. Обеспечить стабильность олигодезоксирибонуклеотидов в процессе их взаимодействия с клетками молликутов;

3. Разработать методы детекции внутриклеточной интернализа-ции олигонуклеотидов и их производных.

4. Изучить воздействие антисигнатурных олигодезоксирибонуклеотидов и их аналогов на жизнедеятельность клеток молликутов.

Научная новизна работы. Впервые получены экспериментальные доказательства активного поглощения коротких (длиной до 15 нуклео-тидных оснований) олигодезоксирибонуклеотидов и их тиоаналогов клетками молликутов.

Установлено, что модификации олигонуклеотидов по меж-нуклеотидным фосфатам обеспечивает полную резистентность к расщеплению нуклеазами молликутов.

Впервые осуществлено эффективное угнетение биосинтеза белка в клетках молликутов тиофосфатными аналогами олигонуклеотидов, комплементарными к сигнатурным участкам 16Б рРНК этих микроорганизмов. Показана высокая видовая специфичность антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов в подавлении процесса трансляции у молликутов. Обнаружен эффект аддитивности действия при одновременном использовании двух олигонуклеотидов, комплементарных к примыкающим участкам 16Б рРНК.

Предлагается модель механизма подавления жизнедеятельности молликутов антисигнатурными олигонуклеотидами.

Практическое значение работы. Результаты исследований утверждают перспективность применения антисмысловой технологии, основанной на использовании антисигнатурных олигонуклеотидов в целях контроля жизнедеятельности молликутов путем направленного воздействия на их нуклеиновые кислоты и создают основания для расширения фронта и интенсификации работ в этом направлении. Разработкой ген-направленных биологически-активных соединений на основе антисигнатурных олигонуклеотидов инициируется развитие нового направления генной терапии для лечения заболеваний, вызываемых разнообразными микроорганизмами.

Конкретное личное участие автора в полученных результатах. Работа выполнена лично автором под руководством член-корр. НАНУ, д. б. н., профессора И. Г. Скрипаля. Культивирование клеток молликутов осуществляли совместно с к. б. н. Л. П. Малиновской. Синтез ал-килирующих производных олигодезоксирибонуклеотидов проводился в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН к. х. н. Е. М. Ивановой и к. х. н. Н. В. Амирхановым. Синтез тиоанапогов олигонуклеотидов был выполнен в Институте биоорганической и нефтехимии HAH Украины к. х. н. И. Я. Дубеем, к. х. н. Д. М. Федоря-ком и в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН к. х. н. Н. В. Амирхановым.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции-конкурсе экспериментальных работ молодых ученых Института микробиологии и вирусологии HAH Украины (1990, 1991, 1992), ежегодной научной конференции-конкурсе работ Института микробиологии и вирусологии HAH Украины (1991, 1993, 1995, 1996), на IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, 1991), на Всесоюзной школе-конференции "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов —

фундаментальная основа биотехнологии" (Алушта, 1991), на II Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1993), на I Учредительном /VIII/ съезде Украинского микробиологического общества (Одесса, 1993), на I Национальной научно-практической конференции по проблемам ВИЧ/СПИДу с международным участием (Киев, 1995), на III Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (2 главы), заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает 245 наименований. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 11 таблицами.

Краткое содержанке работы

Материалы и методы исследований

Объектами исследований были Mycoplasma fermentans PG-1S, М. pneumoniae FH, M. capricolum California Kid, M. hominis PG-21, Acholeplasma laidlawii PG-8, полученные из коллекции Международного центра культур микоплазм (г. Орхус, Дания), а также А. laidlawii var. granulum (штамм 118) из коллекции культур ИМВ НАНУ.

Молликуты выращивали в среде СМ ИМВ-72 с 10% сывороткой (Скрипаль, Малиновская, 1984).

Олигодезоксирибонуклеотиды и их аналоги, комплементарные к определенным сигнатурным участкам 16S рРНК молликутов были синтезированы согласно заданному нами дизайну молекул в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН, Институте био-

органической химии и нефтехимии HAH Украины и Институте физиологической химии в Майнце (Германия) (табл. 1).

Таблица 1.

Структура и нуклеотидный состав синтезированных олигодезоксири-бонуклеотидов и их аналогов_

М реа- Нуклеотидный состав Комплемеп-

гента тарностьк

участкам

16SpPHK

1 5'-BnzNHp'AGGAGGTpSCH3-3' 1513-1519 всех

молликутов

2 5'-BnzNHp*ApGpGpApGpGpTpSCH3-3' 1513-1519 всех

молликутов

3 5'-BnzNHp*ApsGpsGpsApsGpsGpsTpSCH3-3' 1513-1519 всех

молликутов

4 5'-BnzNHp*CATTGTG(A)sTTpSCHj-3' 355-368 всех

микоплазм

5 5'-BnzNHp*CpsApsTpsTpsGpsTpsGps(Aps)sTpsTp-SCH3-3' 355-368 вссх

мккоплазм

6 5'-BnzNHp*CpssApssTpssTpssGpssTpssGpss(Apss)5TpssTpSCH3-3' 355-368 всех

микоплазм

7 5'-SnzNHpCATTGTG(A)5TTpSCH3-3' 355-368 всех

микоплазм

8 5'-CATTGTG(A)sTTpSCH3-3' 355-368 всех

микогшазм

9 5'-CpsApsTpsTpsGpsTpsGps(Aps)sTpsTp-SCH3-3' 355-368 всех

микоплазм

10 5'-CpssApssTpssTpssGpssTpssGpss(Apss)sTpssTpSCH3-3' 355-368 всех

микоплазм

11 5VBnzNHp*TCTAGCCATTACCTGCTAAApSCHj-3' 771-790 только

М. pneumoniae

12 y-BnzNHpTCTAGCCATTACCTGCTAAApSCHj-y 771-790 только

М. pneumoniae

13 £'-CpsApsTpsApsGpsTpsTpsApsG-3' 499-507 всех

молликутов

14 5'-CpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsTpsA-3' 523-532 всех

молликутов

Примечание: р*— [32Р]-фосфат; Впг—СНгС6Нд. В ряде экспериментов использовали метилфосфонатный аналог тетрадекатимидилата 5'-Вп2МНр*Тр(Тр),гТр5СНз-3' — реагент 15 и тиоаналог 5'-СрзАрбСрзТзСрзСрэТрзТрзТрзСрзТрз-З', комплементарный рДНК, кодирующей З'-концевой 1510-1522 участок 165 рРНК молликутов — реагент 16.

О

О

II

Р--о — Р— О— ;ps--О —Р —О—;pss--О-

I I

СНз S-

S

II

-Р—о-

I

s-

Об алкилировании нуклеиновых кислот и белков в клетках мол-ликутов судили по ковалентному связыванию с ними [32Р]-метки дека-тимидилатов, модифицированных по 5'-концу [4-(Ы-2-хлорэтил)-М-метиламинобензил]амином. Клеточные лизаты анализировались в ступенчатом 5/20%-ном полиакриламидном геле (ПААГе) с 7 М мочевиной. Идентификацию продуктов алкилирования проводили путем окрашивания гелей краской "stains-all" ("Serva").

Цитотоксическое действие антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов определяли по их влиянию на процессы трансляции и транскрипции в клетках определенных видов молликутов.

Результаты и их обсуждение

1. Исследование процессов сорбции и поглощения олигодезоксири-бонуклеотидов и их аналогов клетками молликутов

Основная цель настоящего исследования заключалась в оценке эффективности и селективности подавления жизнедеятельности молликутов олигодезоксирибонуклеотидами и их аналогами, комплементарными сигнатурным участкам 16S рРНК этих микроорганизмов. Однако, отсутствие каких либо сведений о проникновении в клетки мико-плазм природных и синтетических олигонуклеотидов поставило нас перед необходимостью проведения первоначальных экспериментов по исследованию вопросов связывания и поглощения испытуемых соединений клетками молликутов.

Для решения этой задачи использовали 32Р-меченые олиго-нуклеотиды (рис. 1), условно обозначенные как: реагент 17 — декати-мидилат, содержащий на 5'-конце алкилирующую группировку [4-(N-2-хлорэтил)-Ы-метиламинобензил]амин; реагент 18 — декатимидилат, модифицированный по 5'-концу указанной выше алкилирующей груп-

пировкой, а на З'-конце содержащий остаток холестерина; реагент 19 — декатимидилат, имевший на 5'-конце вышеназванную алкили-рующую группировку, а на З'-конце — полиароматический остаток М-(2-оксиэтил)феназиния.

с1сн,си,. сх;

о

о

Реагент 17

«з «¡н,

см—с

С1 СИ,СИ,. --« О

ся.-^ --' I I

* о о

Реагент 18

сисн.сн,^ 5 О

5 й- 4 см, СИ,

Реагент 19 ср. с!и>

ми—"I"

Рис. 1. Алкилирующие производные олигодеэоксирибонуклеотидов

В результате проведенных исследований нами был установлен не только высокий уровень сорбции алкилирующих производных декати-мидилатов с клетками молликутов (рис. 2), но и факт проникновения этих соединений в тестируемые клетки по регистрации алкилирования РНК и ДНК (рис. 3). Обнаружено, что после 2 ч инкубации клеток А. 1тс11а\\<п РС-8 с реагентом 19 при его 1 мкМ концентрации в среде культивирования около 14% радиоактивности от всего захваченного клетками радиоактивного материала локализуется на геле вблизи старта, в районе расположения ДНК, 10% радиоактивности — в зоне шлейфа белков, 27% радиоактивности—в зоне РНК.

Рис. 2. Уровень связывания алкилирующих производных олигонуклеотидов (реагенты 17—19) клетками A. laidlawii FG-8 (1), A. laidlawii var. granulum 118 (2), М. pneumoniae FH (3), M. fermentans PG-18 (4), M. capricolum California Kid (5), M. hominis PG-21 (6). Время инкубирования реагентов с клетками моллику-тов 2 ч при 37°С. Возраст тестируемых культур з эксперименте — 24 ч. Концентрация реагентов 0,1 мкМ

Рис. 3. Элекгрофоретический анализ меченого [32Р] материала, полученного при взаимодействии реагента 19 с клетками А. 1а1с11аууи РЭ-8 в 5%/20% ПААГ. 1 — исходный меченый реагент 19; 2 — меченый материал, связанный с клетками после 2 ч инкубации с реагентом 19; 3 —тот же материал, после обработки 5%-ной хлорной кислотой. А— зона окрашивания ДНК; Б — зона окрашивания белков; В — зона окрашивания РНК; БС — бромфеноловый синий

Расчеты, проведенные на основе полученных результатов показали, что при 1 мкМ концентрации реагентов 17—19 в среде культивирования за 2 ч инкубации в клетках молликутов с целевыми нуклеиновыми кислотами успевает прореагировать около 200000 молекул реакци-онноспособных олигонуклеотидов. Этого количества олигонуклеотидов достаточно для осуществления блокирования функционирования любых типов РНК в клетках микоплазм.

При анализе радиоактивного материала, поглощенного клетками A. laidlawii PG-8 и М. pneumoniae FH после 2 ч инкубации с реагентом 17 мы наблюдали деградацию "адресующей" части алкилирующего производного олигонуклеотида (рис. 4), что может явиться одним из основных препятствий в применении антисмысловых олигонуклеотидов в качестве антимикоплазменных агентов. В связи с этим мы уделили особое внимание разработке модификаций олигонуклеотидов. более устойчивых к нуклеазному гидролизу.

Рис.4. Электрофоретический анализ меченого [32Р] материала, полученного при взаимодействии реагента 17 с клетками молликутов в ступенчатом 5%/20%-ном ПААГе. 1 — исходный меченый реагент 17; 2 — меченый материал, связанный с клетками А. laidlawii PG-8 после 2 ч инкубации с реагентом 17; 3 — меченый материал в среде культивирования после инкубирования реагента 17 с клетками A. laidlawii PG-8; 4 — меченый материал, связанный с клетками М. pneumoniae FH после 2 ч экспозиции с реагентом 17. А — зона окрашивания ДНК; Б — зона окрашивания белков; В —■ зона окрашивания РНК; Г — исходный реакционнослособный де-катимидилат; Д — зона укороченных олигонуклеотидов; Е — неорганический фосфат; БС — бром-феноловый синий

Нами было установлено, что олигонуклеотиды, имевшие в составе 7-14 оснований, связывались с одинаковой эффективностью с клетками молликутов вне зависимости от терминальных модификаций. При дальнейшем же увеличение нуклеотидной цепи наблюдалось заметное снижение уровня сорбции (рис. 5).

Рис. 5. Связывание олигодезоксирибонуклеотидов клетками М. fermentans PG-18 (1), М. pneumoniae FH (2), A. laidlawii PG-8 (3) в зависимости от длины нуклеотидной цепи

Кроме длины нуклеотидной цепи на эффективность сорбции оли-гонуклеотидов с клетками молликутов в значительной степени влияет заряд их сахаро-фосфатного остова. Так, если доля сорбированных клетками молликутов полианионных аналогов олигонуклеотидов (тио-и дитиофосфатов) мало отличалась от количества связавшихся природных олигонуклеотидов с тестируемыми клетками (рис. 6), то отсутствие отрицательного заряда в рибозо-фосфатном остове у метилфос-фонатных аналогов олигонуклеотидов приводит к значительному уменьшению (в 4-5 раз) уровня их связывания клетками этих микроорганизмов. Обнаруженное явление может объясняться наличием различных механизмов поглощения молликутами неионных

(метилфосфонатных) аналогов и олигонуклеотидов, имеющих отрицательный заряд в углеводо-фосфатном остове (природных олигонуклеотидов и их тиоаналогов). Косвенно такое предположение подтверждают данные о неадекватном действии азида натрия на процессы связывания и поглощения клетками молликутов метилфосфонатных и тио-фосфатных аналогов олигонуклеотидов (рис. 7. А, Б). Мы предполагаем, что поглощение природных олигодезоксирибонуклеотидов и их тиоаналогов клетками микоплазм осуществляется за счет активного энергозависимого транспорта, который, вероятно, подавляется при добавлении в инкубационную смесь азида натрия. Проникновение метилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов в клетки молликутов может являться результатом процесса облегченной диффузии.

Рис. 6. Сорбция клетками A laidlawii PG-8 (1), М. pneumoniae FH (2), М. fermentans PG-18 (3) антисигнатурных олигодезоксирибонуклеотидов и их аналогов. а -— реагент 2, б — реагент 3, в — реагент 1, г— реагент 5, д — реагент 6, е — реагент 4, ж — реагент 15

30

т

2

Виды молликутов

3

Контроль 5 мМ азида

натрия

Контроль 5 мМ азида натрия

Рис. 7. Влияние азида натрия на связывание (А) и поглощение (Б) метилфос-фонатных и тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов (реагенты 2 и 3) клетками А. laidlawü PG-8 (а, б), М. pneumoniae FH (в, г) М. fermentans PG-18 (д, е)

2. Устойчивость олигонуклеотидов с терминальными модификациями и их тиоаналогов к нуклеазному гидролизу при взаимодействии этих соединений с клетками молликутов

В исследованиях стабильности антисигнатурных олигонуклеотидов и их аналогов в процессе взаимодействия их с клетками микоплазм и ахолеплазм использовали те же реагенты, которые применялись при изучении связывания и поглощения клетками данных микроорганизмов (табл. 1).

В результате проведенных исследований было установлено, что олигонуклеотиды с терминальной модификацией после длительного инкубирования с клетками молликутов деградируют (табл. 2), в то время, как тиоаналоги олигонуклеотидов оказались практически полностью резистентными к действию нуклеаз на протяжении 3 суток их экспозиции с клетками молликутов (рис. 8).

Таблица 2.

Внутриклеточная деградация антисигнатурных олигодезоксирибо-нуклеотидов (в %) при взаимодействии с клетками молликутов (возраст используемых культур - 24 ч)

Реагенты

Фракция

Время инкубирования клеток М. ^гтеп1ап$ РС-18 среаген-

тами, ч

Время инкубирования клеток А. ЫШан-и РС-8 с реагента_ми, ч_

1

4

12 24

1

4

12 24

Исходный оли- 85,4 69,7 56,8 36,9 83,2 63,4 50,3 20,3 гонуклеотид

Продукты гпдро- Ы 6 30;3 43?2 631 и 8 49 7 ?9 7

Исходный оли- 87,6 71,4 58,7 40,2 86,1 66,8 54,2 27,5 гонуклеотид

Продукты гидро- 12 4 28 6 41 3 59 8 13 9 33 2 45 8 72 5

ПИ79 7 '''''' '

4

Учитывая активное поглощение клетками молликутов тиофос-фатных аналогов олигонуклеотидов и их высокую устойчивость к действию нуклеаз, мы в дальнейших исследованиях использовали только эти соединения.

Старт

Рис. 8. Радиоавтограф элеюгро-форетического разделения в 20%-ном ПААГе с 7 М мочевиной тио-фосфатного аналога олигонуклео-тида (реагент 5), обнаруживаемого после 24 ч инкубации с клетками А. /ак//аи« Рй-8 (2) и М. (егтеМапя РС-18 (3) и дитиофосфатного аналога олигонуклеотида (реагент 6), связанного после 24 ч экспозиции с клетками А. ¡а/сНащи РО-8 (4) и М. (егте^апь РС-18 (5). 1 — исходный меченый реагент 5 (контроль); Кц — ксилолцианол; Бс — бромфеноловый синий

3. Влияние антисигнатурных олигодезоксирибонуклеотидов и их тиоаналогов на процесс трансляции в клетках молликутов В качестве мишеней для воздействия олигодезоксирибонуклеоти-дами и их тиоаналогами бьши выбраны сигнатурные последовательности в молекуле 16Б рРНК молликутов. Анализ расположения сигнатурных участков на молекуле 16Б рРНК, свойственных только для молликутов, показал, что они задействованы в формировании спиральных структур типа "шпилек", служащих местом узнавания и связывания с рибосомальными белками. В связи с этим нами было высказано предположение, что при воздействии олигонуклеотидами, комплементарными данным районам 16Б рРНК, можно вызывать разнообразные нарушения в функционировании этой молекулы.

Проверка влияния антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов, представленных в таблице 1 на интенсивность синтеза белка в клетках молликутов показала, что наиболее эффективное ин-гибирование процесса трансляции (до 70%) во всех тестируемых штам-

мах молликутов наблюдается при воздействии 9- и 10-звенными тио-фосфатными аналогами олигонуклеотидов, комплементарными участкам 499-507 и 523-532 16S рРНК этих микроорганизмов (рис. 9). Вероятно, данное обстоятельство обусловлено функциональной значимостью данных последовательностей, так как формируемая в этом районе 16S рРНК "шпилька" служит местом узнавания и связывания для рибосомального белка S4, который называют еще "сердцевинным". Этот белок первым из всех рибосомальных белков связывается с молекулой 16S рРНК и практически инициирует весь процесс сборки 30S субъединицы. Исследование антитрансляционной активности реагентов 7-10 показало высокую селективность действия этих антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов. Данные реагенты угнетали белковый синтез только в клетках микоплазм, не оказывая никакого влияния на этот процесс в клетках ахолеплазм (рис. 9). Еще более высокую специфичность в действии проявлял реагент 12, который угнетал процесс трансляции исключительно в клетках М. pneumoniae FH (рис. 9).

Обнаружена разная степень чувствительности клеток микоплазм к действию антисигнатурных тиоаналогов олигонуклеотидов. При инкубации клеток A. laidlawii PG-8 в течение 4 ч с реагентами 13 и 14 заметное угнетение процесса биосинтеза белков наблюдается при 500 нМ концентрации тиоаналогов в среде культивирования, тогда как для клеток М. fermentans PG-18 ингибирующий эффект отмечается при 250 нМ концентрации этих реагентов (рис. 10).

Исследование подавления белкового синтеза реагентами 13 и 14 в клетках А. laidlawii PG-8 в зависимости от их возраста показало, что эффективность ингибирования трансляции тиоаналогами олигонуклеотидов зависит от физиологической активности клеток и содержания в питательной среде экзогенных источников нуклеиновых кис-

лот (НК), которые конкурируют с применяемыми тиоаналогами в процессах их сорбции и поглощения клетками молликутов (рис. 11).

80г

1 2 3

f=l

I

Da □ б Ев Er ИД 1е Еж □ з

6

Рис. 9. Влияние олигодезоксирибонуклеотидов и их тиоаналогов, комплементарных различным сигнатурным участкам 16S рРНК молликутов на синтез белка в клетках этих микроорганизмов. 1 — М. pneumoniae FH; 2 — М. fermentans PG-18; 3 —А. laidlawii PG-8; 4 — М. capricolum California Kid; 5 — М. hominis PG-21; 6 — A. laidlawii var. granuium 118. а — реагент 13; б — реагент 14; в — реагент 7; г — реагент 8; д — реагент 9; е — реагент 10; ж — реагент 12; з — реагент 16

Концентрация, мкМ

Рис. 10. Ингибирование процесса трансляции в клетках молликутов в зависимости от количества вносимых в среду культивирования тиофосфатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидое: а — клетки М. fe/•meлfans РО-18 с реагентом 13; б — клетки М. (егтеМапз Рв-18 с реагентом 14; в — клетки А. Ш1а\лш РЭ-в с реагентом 13; г — клетки А. Ыс11аwiiPG-8 с реагентом 14

24 36 48 60 Возраст культуры, ч

Рис. 11. Ингибирование синтеза белка в клетках А. 1а1сПа\лЖ Рв-В тиоаналогами олигонуклеотидов в зависимости от возраста культуры, а — реагентом 13; б — реагентом 14; в — содержание экзогенных источников нуклеиновых кислот

Высокое содержание экзогенных источников НК и их предшественников, вероятно, может встречаться не только в искусственной среде культивирования, но и в естественной среде обитания моллику-тов ш vivo, что может в значительной степени снизить эффективность их воздействия на жизнедеятельность патогенных видов этих микроорганизмов. Увеличение концентрации взаимодействующих с клетками микоплазм антисигнатурных олигонуклеотидов до 10 мкМ в питательной среде СМ ИМВ-72 не приводило к повышению ингибирования процесса трансляции в тестированных клетках. Однако, одновременное применение двух тиоаналогов олигонуклеотидов (реагенты 13 и 14), комплементарных непосредственно примыкающим участкам (499507 и 523-532) в последовательности 16S рРНК, практически полностью подавляет синтез белка в клетках молликутов (рис. 12).

Рис. 12. Повышение эффективности ингибирования трансляции в клетках М. pneumoniae FH (1), M.fermentans PG-18 (2), A.laidlawii PG-8 (3) при совместном использовании реагентов 13 и 14 (в), а — ингибирование белкового синтеза при внесении в среду культивирования реагента 13; б — при добавлении реагента 14. Возраст культур молликутов —24 ч

На основе полученных данных предложена модель возможных механизмов действия олигонуклеотидов и их тиоаналогов, комплемен-

тарных сигнатурным участкам 16Б рРНК (рис. 13). По нашему мнению, антисигнатурные олигонуклеотиды осуществляют угнетение синтеза белка в клетках молликутов в результате уотсон-криковского ком-плексообразования с соответствующей сигнатурной последовательностью 16Б рРНК, блокируя, таким образом, пространственную укладку этой молекулы. При этом возможно гидролитическое расщепление рибонуклеазой Н 16Б рРНК молликутов вследствие образования РНК/ДНК дуплексов между этой рРНК и олигонуклеотидами, комплементарными ее сигнатурным участкам. Кроме того, антисигнатурные олигонуклеотиды в результате взаимодействия с комплементарными участками 16Б рРНК могут препятствовать связыванию с нею рибосомальных белков и, следовательно, блокировать сборку ЗОБ субъединицы рибосом молликутов.

А

ДНК

РНК-лолимераза \

РНК-полимераза \

16Б рРНК

Рибосомапьный — белок

ДНК

16Б рРНК

РНК-лолимераза \

Акта сигматури ый ~ олигонуклеотмд

Рибосомальныг — белок

Блокирование "укладки" 16Б рРПК и связывания рибосомальных белков с этой молекулой

РНК-лолимеваза \

Ахти сигм атурный олигснуклсотид

Рибонуклема Н Гидролиз 16Э рРНК в результате активации рибонуклеазы Н Рис. 13. Предполагаемый механизм действия олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных сигнатурным участкам 16Э рРНК молликутов

1рРНК

Выводы

1. Впервые установлено, что синтетические олигодезоксирибо-нуклеотиды и их тиоаналоги с длиной нуклеотидной цепи до 15 оснований эффективно сорбируются клетками мошшкутов независимо от отличий в модификации их 5'-,3'-концов. Кинетика и уровень этого процесса зависят от температуры, возраста культур и количества экзогенных нуклеиновых кислот в питательной среде.

2. Олигонуклеотиды способны проникать из среды культивирования в клетки молликутов, где их накопление может превышать внеклеточную концентрацию в 104—105раз, и около 60% из них расходуется на связывание с целевыми нуклеиновыми кислотами.

3. Установлено два различных механизма проникновения природных олкгодезоксирибонуклеотидов и их неионных аналогов. А именно, за счет: а) энергозависимого транспорта — олигодезоксири-бонуклеотиды и их тиоаналоги; б) облегченной диффузии — метил-фосфонатные аналоги олигонуклеотидов.

4. Терминальные модификации олигодезоксирибонуклеотидов ароматическими или полиароматическими группировками не защищают их от расщепления нуклеазами, а лишь увеличивают период их полужизни до 12-24 ч при контакте с клетками всех тестируемых молликутов.

5. Олигонуклеотиды, несущие модификации по всем межнуклео-тидным связям, практически полностью резистентны к нуклеазному расщеплению и их деградация не наблюдалась даже после 72 ч инкубирования с клетками всех испытуемых штаммов молликутов.

6. Антисигнатурныс олигодезоксирибонуклеотиды и их тиоаналоги обладают высокой антимикоплазменной активностью, проявляющейся в наномолярных концентрациях: 500 нМ тиоаналогов, комплементарных 499-507 или 523-532 участкам 16Б рРНК молликутов,

снижали биосинтез белка в их клетках на 60-70%, а полное блокирование синтеза белка было достигнуто одновременным применением двух таких олигонуклеотидов, комплементарных непосредственно примыкающим участкам 16Б рРНК.

7. Антисигнатурные олигонуклеотиды проявляют исключительно высокую селективность действия и, в зависимости от нуклеотидного состава их молекул, подавляют процесс трансляции в клетках представителей лишь одного рода или вида молликутов.

8. На основе полученных данных, разработана модель подавления трансляции в клетках молликутов антисигнатурными олиго-нуклеотидами, которая предполагает два механизма их действия: а) блокирование места посадки "сердцевинных" рибосомальных белков на 16Б рРНК и выключение процесса самозборки ЗОБ субъединицы рибосомы и б) разрушение 163 рРНК рибонуклеазой Н вследствие образования на этой молекуле РНК/ДНК дуплексов.

9. Разработкой ген-направленных биологически активных соединений на основе антисигнатурных олигонуклеотидов инициируется развитие нового направления генной терапии для лечения заболеваний, вызываемых разнообразными микроорганизмами.

Список публикаций по теме диссертации

1. Панченко Л. П., Егоров О. В., Скрипаль И. Г., Райт А. С., Иванова Е. М., Зарытова В. Ф., Власов В. В. Исследование стабильности алкилирующих производных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих присоединенный к З'-концу остаток холестерина или фена-зиния, при взаимодействии их с клетками АсЬо1ер1аБта ЫсИаит РО-В // Микробиол. журн. — 1991.—53, № 4. — С. 58—63.

2. Панченко Л. П., Егоров О. В., Райт А. С., Иванова Е. М., Амирханов Н. В., Зарытова В. Ф., Власов В. В., Скрипаль И. Г. Взаимодействие алкилирующих производных олигодезоксирибонуклеоти-

дов и их метилфосфонатных аналогов с клетками микоплазм // Микро-биол. журн. —1991.—53, № 4. — С. 63—68.

3. Егоров О. В., Панченко JI. П., Скрипаль И. Г., Малиновская JI. П., Райт А. С., Иванова Е. М., Власов В. В. Эффективность связывания реакционноспособных олигодезоксирибонуклеотидов клетками различных представителей класса Mollicutes обусловлена возрастом культур // Микробиол. журн. —1992.—54, № 2. — С. 65—70.

4. Егоров О. В., Панченко Л. П., Скрипаль И. Г. Исследование сорбции антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов клетками микоплазм// Микробиол. журн. —1996. — 58, № 3. — С. 30—37.

5. Егоров О. В., Скрипаль И. Г., Дубей И. Я., Федоряк О. Д., Федоряк Д. М. Ингибирование тиофосфатными аналогами олигодезоксирибонуклеотидов трансляции in vivo у молликутов II Микробиол. журн, —1996. —58, №4, —С. 11—19.

6. Егоров О. В., Панченко Л. П., Скрипаль И. Г., Амирханов Н. В. Связывание и поглощение клетками молликутов антисигнатурных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов II Микробиол. журн. — 1996. — 58, №6, — С. 18—29.

7. Егоров О. В. Модификация межнуклеотидных связей антисигнатурных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов как способ повышения их устойчивости к нуклеазному расщеплению в клетках молликутов II Микробиол. журн. —1997.—59, № 1. — С. 31—36.

8. Skripal' I. G., Babichev V. V., Panchenko L. P., Yegorov О. V., Korobkova K. S., Dubey I. Y., Fedoryak D. M., Shalamay A. S. Antisignature oligonucleotides and their analogs as inhibitors of mollicutes -cofactors of HIV // Микробиол. журн. —1997.—59, № 2. — С. 3—11.

9. Егоров О. В., Панченко Л. П., Скрипаль И. Г., Амирханов Н. В. Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодез-

оксирибонуклеотидов // Биополимеры и клетка. — 1997. —13, № 2. — С. 1—8.

10. Панченко Л. П., Егоров О. В., Райт А. С., Скрипаль И. Г., Власов В. В. Исследование алкилирующих производных олигонуклео-тидов как средств подавления жизнедеятельности микоплазм // IX Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, январь 1991 г.): Тез. докл. — Рига, 1991. — С. 6.

11. Егоров О. В., Панченко Л. П., Райт А. С., Скрипаль И. Г., Власов В. В. Взаимодействие алкилирующих производных олиго-нуклеотидов с клетками микоплазм И IX Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, январь 1991 г.): Тез. докл. — Рига, 1991. —С. 92.

12. Panchenko, L., Egorov, О. Effect of antisense oligonucleotides on vital activity of mycoplasmas associated with AIDS // 2-nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (St.-Petersburg, November 1993): Abstracts.— St.-Petersburg, 1993. — P. 38.

13. Панченко Л. П., Егоров О. В. Влияние антисмысловых олиго-нуклеотидов на жизнедеятельность микоплазм // MaTepiaim I установ-чого (VIII) зТзду украшського мжробюлопчного товариства (Одеса, вересень 1993): Микробиол. журн. —1994.—56, № 4. —С. 76.

14. Панченко Л. П., Сгоров О. В., Скрипаль I. Г. Пошук iHri6iTopiB життедояльносп мпсоплазм, причетних до захворювань на СН1Д// I Нащональна науково-практична конференщя з проблем В1Л/СН1Ду з мiжнapoднoю учаспо (Кшв, ачень 1995): 36ipHrac тез. — Кшв, 1995. —С. 64.

15. Panchenko, L., Babichev, V., Egorov, О., Skripal, I. Influence of antisense oligodeoxyribonucleotides on transcription process at AIDS-associate mycoplasmas. 3-nd International conference "AIDS, Cancer and

related diseases" (St-Petersburg, May 1995): Abstracts. — St.-Petersburg, 1995, —P. 86.

АННОТАЦИЯ

Егоров О. В. Исследование влияния антисигнатурных олигонуклеоти-дов и их аналогов на жизнедеятельность молликутов.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 — микробиология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, Киев, 1997.

Защищается работа, содержащая результаты исследования процессов связывания и поглощения клетками молликутов олигодезокси-рибонуклеотидов и их тио-, дитиофосфатных и метилфосфонатных аналогов, комплементарных сигнатурным последовательностям 16S рРНК. Установлен факт значительного накопления клетками молликутов антисигнатурных олигонуклеотидов и их тиоаналогов. Внутриклеточная концентрация этих соединений у всех изученных микроорганизмов превышала их внеклеточную в 104—105 раз. Изучено влияние модификаций по 5'-, З'-концам и межнуклеотидным связям антисигнатурных олигонуклеотидов на их устойчивость к нуклеазному расщеплению в клетках молликутов. Обнаружено значительное повышение стабильности в исследованных клетках тио- и дитиофосфатных аналогов олигонуклеотидов. Показано, что при концентрации 0,5—1 мкМ тиоаналогов олигонуклеотидов, комплементарных участкам 16S рРНК, ответственных за связывание с рибосомальным белком S4, снижается синтез белков в клетках молликутов до 90%. Предложена модель механизмов блокирования антисигнатурными олигонуклеотида-ми процесса трансляции в клетках молликутов.

SUMMARY

Yegorov O.V. Research of effect of antisignature oligonucleotides and their analogues on vital activity of mollicutes.

The Thesis presented for a Philosophy Doctor degree in a speciality 03.00.07 — microbiology. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of Natl. Acad. Sci. of Ukraine, Kiev, 1997.

Subject for defending is the thesis to present results of investigation of processes of absorption and uptake of oligodeoxynucleotides and their phosphorothio-, phosphorodithioate and methylphosphonate analogues, which are complementary to signature 16S rRNA sequences by cells of mollicutes. The fact of. significant accumulation of antisignature oligonucleotides and their thioanalogues by cells of mollicutes have been established. The intracellular concentration of these compounds in all investigated microorganisms exceeded extracellular one 104—105 time. Modification in 5'-,3'-ends and internucleotide bonds of antisignature oligonucleotides have been studied for their resistance to nuclease cleavage in cells of mollicutes. Considerable increase of stability in investigated cells of phosphorothio- and phosphorodithioate analogues of oligonucleotides has been detected. It is shown, that concentration of antisignature phosphorothioate analogues of oligonucleotides, complementary to the sites of 16S rRNA responsible for binding with ribosomal protein S4 being 0,5—1 цМ synthesis of proteins in cells of mollicutes decreases to 90 %. A model of mechanisms of blocking of the process of translation in cells of mollicutes by antisignature oligonucleotides has been offered.

Ключевые слова: молликуты, антисигнатурные олигонуклеотиды, связывание, поглощение, ингибирование жизнедеятельности.