Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие олигонуклеотидов с белками и клетками организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие олигонуклеотидов с белками и клетками организма"

РГб од

0 8 на правах рукописи

Лактионов Павел Петрович

Взаимодействие олигонуклеотидов с белками и клетками организма.

03.00.4 - Биохимия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1997 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель: член-корр. РАН В.В. Власов Официальные

оппоненты: проф. д.х.н. Г.А. Невинский

д.б.н. Е.И. Каракин

Ведущая организация:

Институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится " 12 " сентября 1997 г. в_часов

на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан: " 11 "августа 1997 г.

Ученый секретарь ^^¡мХЬ^

диссертационного совета ' О.С. Федорова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Производные олигонуклеотидов и экспрессирующие генетические конструкции являются перспективным новым классом потенциальных химиотерапевтических препаратов. Создание уникальных терапевтических препаратов на основе олигонуклеотидов, способных высокоселекгивно ингибировать экспрессию генов за счет комплементарных взаимодействий, становится все более реальным в связи с разработкой и синтезом новых производных, обладающих повышенной устойчивостью к действию нуклеаз и способных проникать через гидрофобные мембраны. Способность генноинженерных конструкций экспрессировать в клетках организма чужеродные белки, вероятно, позволит создавать генноинженерные вакцины для защиты организма от инфекционных заболеваний.

Необходимым этапом на пути терапевтического использования олигонуклеотидов является разработка методов доставки олигонуклеотидов в организм. Нсповреждающие способы доставки терапевтических препаратов в настоящее время рассматриваются как наиболее перспективные. Было показано, что перокулярный и пероральный способы введения олигонуклеотидов обеспечивают эффективную системную доставку олигонуклеотидов в организм. Исследование фармакокинетики олигонуклеотидов в организме показало, что олигонуклеотиды и продукты их деградации распределяются через кровоток. В экспериментах in vitro продемонстрировано, что олигонуклеотиды образуют комплексы с некоторыми белками сыворотки крови и поверхностными белками клеток. Получены данные о возможном участии белков в транспорте олигонуклеотидов в клетки и органы. Исследование стабильности олигонуклеотидов и их взаимодействий с биополимерами крови и барьерных жидкостей является актуальным, поскольку позволит разработать подходы к использованию естественных механизмов транспорта нуклеиновых кислот для более эффективной доставки препаратов и предотвращению нежелательных побочных эффектов.

Проведенные в последнее время исследования обнаружили некоторые биологические эффекты, вызываемые олигонуклеотидами, которые не могут быть объяснены комплементарным взаимодействием с мишенью. Обнаружено, что при введении в организм фосфоротиоатные аналоги олигонуклеотидов вызывают изменение сердечного ритма и артериального давления, увеличение веса печени, почек, сердца и модуляцию гемопоэза у обезьян. Обнаружена способность бактериальной ДНК и некоторых олигонуклеотидов активировать клетки иммунной системы. Выявлены факты взаимодействия олигонуклеотидов с белками лимфоидных клеток, которые могут опосредовать неспецифические эффекты нуклеиновых кислот. В связи с этим представляется

актуальным исследовать белки лимфоцитов, взаимодействующие с ДНК, олигонуклеотидами и их аналогами, а также механизмы иммуномодулирующего действия нуклеиновых кислот. Изучение механизмов олигонуклеотид-белковых взаимодействий и их влияния на клеточные функции обеспечит базу для конструирования терапевтических препаратов на основе олигонуклеотидов и их аналогов, не обладающих побочными эффектами. Цель работы. Целью представляемой работы было, во-первых, исследовать стабильность олигонуклеотидов в барьерных жидкостях, выявить белки барьерных жидкостей, взаимодействующие с олигонуклеотидами, оценить сродство олигонуклеотидов и их производных к белкам, что необходимо для понимания процессов транспорта олигонуклеотидов и разработки подходов к оптимизации процесса доставки нуклеиновых кислот. Второй задачей настоящей работы было исследование сохранности олигонуклеотидов и их аналогов в крови in vivo, а также взаимодействий олигонуклеотидов и продуктов их деградации с белковыми и клеточными компонентами крови in vivo. Третьей задачей настоящей работы было исследование стимулирующих свойств плазмидной ДНК и олигонуклеотидов в модели пролиферации первичной культуры лимфоцитов селезенки, исследование механизмов иммуностимулирующего действия нуклеиновых кислот, выявление белков спленоцитов, принимающих участие в связывании нуклеиновых кислот. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей 'диссертационной работе впервые показано, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды в течение длительного времени сохраняются недеградированными в слюнной и слезной жидкостях. Установлено, что олигонуклеотиды взаимодействуют с белками барьерных жидкостей: лизоцимом, лактоферрином и иммуноглобулинами классов А и G. Данные о высокой сохранности олигонуклеотидов в барьерных жидкостях имеют практическую значимость, так как демонстрируют возможность высокоэффективного использования олигонуклеотидов для борьбы с вирусными инфекциями ротовой полости и глазного мешка.

Впервые проведен сравнительный анализ стабильности и взаимодействий в крови фосфодиэфирных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов с двумя фосфоротиоатнйми группами на 3'-конце молекулы. Было впервые показано, что короткие фрагменты олигонуклеотидов и мононуклеотиды практически необратимо накапливаются в эритроцитарной фракции. Обнаружено, что альбумин и иммуноглобулины крови связывают олигонуклеотиды in vivo, причем олигонуклеотид-белковые комплексы длительно рециркулируют в организме и частично защищают олигонуклеотиды от действия нуклеаз.

Обнаружено, что плазмвдная ДНК и олигонуклеотид d(pGAAGGGAGGA) активируют пролиферацию первичной культуры лимфоцитов селезенки. Исследование комитогенной стимуляции лимфоцитов известными митогенами и ДНК, а также конкурентного ингибирования стимулирующего эффекта ДНК Fab фрагментами анти-Ig антител показало, что иммуноглобулиновые рецепторы участвуют в ДНК-индуцируемой активации пролиферации спленоцитов. Среди мембранно-цитозольных белков лимфоцитов, специфично взаимодействующих с олигонуклеотидами, выявлены полипептиды с молекулярной массой 72, 67 и 25 кДа, соответствующие по молекулярной массе полипептидным цепям IgM и IgD.

Продемонстрировано, что обработка полиэтиленимином нуклеиновых кислот, обладающих иммуностимулирующими свойствами, ингибирует способность олигонуклеотидов и ДНК активировать пролиферацию спленоцитов, что важно не только для подтверждения рецептор-опосредованного механизма активации под действием нуклеиновых кислот, но имеет практическое значение для ген-направленной терапии. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Материалы диссертации были доложены на двух международных конференциях.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 146 страницах, включающих 22 рисунка, 3 таблицы. Список литературы включает 198 работ. Диссертационная работа состоит из следующих разделов : введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы.

Содержание работы.

Исследование стабильности и взаимодействий олигонуклеотидов в барьерны: жидкостях организма.

Для исследования стабильности нуклеотидного материала 32Р-меченный олигонуклеотид d(pTGACCCTCTTCCCATT), обозначаемый в дальнейшем р(Е)]6, инкубировали со слюнной и слезной жидкостью и анализировали сохранность олигонуклеотидов электрофорезом в ПААГ. Было показано, что в слюнной жидкости олигонуклеотиды сохраняются интактными в течение не менее 45 минут, а в слезной жидкости деградация олигонуклеотидов становится заметной только через 3 часа от начала инкубации (рис. 1). Низкая скорость деградации олигонуклеотидов в барьерных жидкостях может обеспечить пролонгированную доставку олигонуклеотидов к очагам вирусных инфекций ротовой полости, глазного мешка и всего организма.

Для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с белковыми компонентами барьерных жидкостей использовали аффинную модификацию белков алкилирующим производным 32Р- меченного олигонуклеотида р(Е)ц,, несущего на 5-конце группировку 4-[(Ы-2-хлорэтил-Ы-метил)амино]бензиламина (С1Кр(Е)16). При инкубации слезной и слюнной жидкостей с этим реагентом в концентрации, соответствующей концентрациям олигонуклеотидов, использующимся для достижения биологических эффектов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

ч- старт

P(E)i6

ч— мононук-леотид

ч- фосфат

Рис. 1. Сохранность олигонуклеотидов в слюнной (дорожки 1-5 и 11-15) и слезной жидкостях (дорожки 6-10 и 16-20). Электрофорез в 20% ПААГ с последующей радиоавтографией. Олигонуклеотид p(E)i6 (дорожки 11-20) и ClRp(E) (дорожки 1-10) инкубировали с цельными барьерными жидкостями в течении 10 минут (дорожки 1,6,11,16), 20 минут (дорожки 2,7,12,17), 45 минут (дрожки 3,8,13,18), 1,5 часов (дорожки 4,9,14,19), 3 часов (дорожки 5,10,15,20).

(1-20 мкМ), наблюдается интенсивная модификация белков уже через 15 минут инкубации. Эти данные свидетельствуют о том, что такие комплексы могут формироваться in vivo прежде, чем попавшие в барьерные жидкости олигонуклеотиды проникнут в прилежащие ткани.

Для идентификации олигонуклеотвд-связывающих белков барьерных жидкостей была использована иммунопреципитация этих белков специфическими антителами. Иммунные комплексы из барьерных жидкостей, прединкубированных с Э2Р-меченным ClRp(E)16, выделяли хроматографией на белок А-сефарозе (для кроличьих антител против лактоферрина) и переосаждением 2% полиэтиленгликолем (для крозьих и овечьих aimifeJi

против иммуноглобулина А и лизоцима). ^С выделяли хроматографией слезной жидкости на белок А-сефарозе. Были идентифицированы некоторые олигонуклеотид-связывающие белки барьерных жидкостей: лактоферрин (78 кДа), иммуноглобулин в (52, 23 кДа) и лизоцим (14 кДа) в слезной жидкости, секреторный иммуноглобулин А ( 71, 60, 23 кДа) и лизоцим (14 кДа) в слюнной жидкости (рис. 2). Основным олигонуклеотид-связывающим белком слезной жидкости является лактоферрин, обеспечивающий транспорт ионов железа, неспецифическую иммунную защиту и выполняющий некоторые иммунорегуляторные функции.

Рис. 2. Иммунохимическая идентификация олигонуклеотид-связывающих белков барьерных жидкостей. Барьерные жидкости и растворы маркерных белков модифицировали СШр(Е)1б, инкубировали аликвоты барьерных жидкостей со специфическими антителами, выделяли иммунные комплексы (ИК) и анализировали их состав БВЗ-дискэлектрофорезом в градиентном (1020%) ПААГ, с последующей радиоавтографией. 1- ИК из слюнной жидкости прединкубированной с антителами против лизоцима; 2 - ИК из слюнной жидкости прединкубированной с антителами против б^А; 3 - слюнная жидкость; 4 - в^А; 5 - лизоцим; б - ^в; 7 -лактоферрин; 8 - слезная жидкость; 9 - ИК из слезной жидкости, прединкубированной с антителами против лактоферрина; 10 - фракция слезной жидкости, связанная с белок А-сефарозой; 11 - ИК из слезной жидкости, прединкубированной с антителами против лизоцима.

ос, у - тяжелые цепи ^А и соответственно.

а Д - легкие цепи иммуноглобулинов.

Эксперименты по изучению параметров связывания олигонуклеотидов с белками были выполнены на очищенных препаратах лактоферрина, лизоцима и ^А. Белки инкубировали в забуференном физиологическом растворе с 32Р-меченным С1Яр(Е)16 в различных концентрациях (от ОД до 20мкМ) 40 минут при 37°С. Модификацию белка определяли, исходя из данных об интенсивности радиоактивной метки (в имп/мин) в полосках белка, вырезанных из геля. На рис. 3 приведены данные о зависимости модификации этих белков от концентрации олигонуклеотида, которые позволяют оценить константы диссоциации (Кс1) для комплексов СЖ(рЕ)16 с исследованными белками, которые составляют 0,5 мкМ для лактоферрина, 2 мкМ для лизоцима и 5 мкМ для ^А.

[С1Кр(Е)16], мкМ

Рис. 3. Зависимость степени модификации белков барьерных жидкостей от конентрации реагента СЖр(Е)1б. Кривая 1- лактоферрин, кривая 2 -лизоцим, кривая 3 - иммуноглобулин А.

Константы диссоциации комплексов фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей оценивали по ингибированию фосфоротиоатами аффинной модификации белков С111(рЕ)16. Замена кислорода на серу в фосфоротиоатных аналогах олигонуклеотидов существенно повышает их сродство ко всем исследованным белкам. Способность белков слезы и слюны депонировать олигонуклеотиды, а также высокая сохранность олигонуклеотидов в исследованных барьерных жидкостях позволяют надеяться на высокую терапевтическую эффективность олигонуклеотидов в борьбе с вирусными инфекциями ротовой полости и

глазного мешка. Учитывая, что иммуноглобулины и лактоферрин рецептор-опосредованно взаимодействуют с различными типами клеток, эти белки могут участвовать в транспорте олигонуклеотидов в организме. Исследование фармакокинетики. стабильности и взаимодействш олигонуклеотидов в крови in vivo.

В опытах по изучению стабильности и фармакокинетики олигонуклеотидов в крови были использованы 32Р-меченные олигонуклеотиды: p(E)i6, d(pTp(TpCp)6Tpsme) (p(N)14sme) и d(pTp(TpCp)6TpsTpsT) (p(N)i4sTsT).

Для изучения сохранности мышам линии BALB/c перорально или внутрибрюшинно вводили 32Р-меченные производные олигонуклеотидов, проводили забор крови и разделение на фракции в градиенте плотности.

<- старт

<- P(N)ie

<- pN

<-32Р

Рис. 4. Сохранность Э2Р-меченных алкилирующих производных олигонуклеотидов в сыворотке крови мышей линии ВАЬВ/с после внутрибрюшинного введения в дозе 0,5 мг/кг. Электрофорез (20% ПААГ, 8М мочевина), радиоавтограф.

Ь маркерные олигонуклеотиды, 2.3.4,- олигонуклеотиды сыворотки через 0,3, 0,7, 1,5 ч после введения СШр^^те, 5.6.7.8.9.10- олигонуклеотиды сыворотки через 0,3, 0,7, 1,5, 3, 9, 24 ч после введения С1Яр(М)145Т5Т, 11. 12.13,- олигонуклеотиды сыворотки через 0,3, 0,7, 1,5 ч после введения С1Яр(Е)16.

Олигонуклеотидный материал фракций анализировали электрофорезом с последующей радиоавтографией. В сыворотке крови наблюдается быстрая деградация 5'-защищенного фосфодиэфирного олигонуклеотида ClRp(E)i6 (рис.4). Защитная тиометильная группа, присоединенная к 3'-концевому фосфату, также не оказывает заметного влияния на сохранность олигонуклеотида ClRp(N)Msme в сыворотке крови. Исходные производные олигонуклеотида ClRp(E)i6 и ClRp(N)i4sme не выявляются в сыворотке уже через 20 мин после введения, а продукты их деградации, присутствующие в следовых количествах, представлены 6-10 звенными олигонуклеотидами. Через 1,5 часа после введения препаратов на радиоавтографе не выявляются также продукты деградации исходного олигонуклеотида. Через 1,5 часа после введения мышам 32Р-меченного ClRp(N)14sTsT, в сывороточной фракции обнаружены 3, 4, 7, 10, 13-14 и 16-звенные олигонуклеотиды (рис. 4 ). Через 24 часа от момента введения ClRp(N)]4sTsT основными продуктами являются 16, 13-14 и 10-звенные олигонуклеотиды. Таким образом, ClRp(N)I4sTsT обладает значительно более высокой сохранностью в сыворотке крови по сравнению с двумя другими исследованными олигонуклеотидными производными ClRp(N)i4sme и ClRp(E)i6. Исходный продукт ClRp(N)]4sTsT выявляется в циркуляции на протяжении более чем 24 часов. Низкая скорость деградации in vivo фосфодиэфирных олигонуклеотидов с двумя фосфоротиоатными межнуклеозидными группами на 3'-конце позволяет надеяться на их успешное использование в работах, связанных с ген-направленной терапией.

В эритроцитах были обнаружены moho-, ди-, три- и тетрануклеотиды независимо от сохранности производного олигонуклеотида. Было показано (рис. 5), что олигонуклеотиды, экстрагированные из эритроцитов, являются продуктом деградации исходных олигонуклеотидных производных, а не результатом включения меченого фосфата при синтезе de novo, поскольку обработка 5% НС104, приводит к гидролизу 5'-фосфамидной связи и увеличению электрофоретической подвижности динуклеотида эритроцитарной фракции. Эритроциты связывают короткие олигонуклеотиды более эффективно, чем длинные, поскольку при введении ClRp(N)14sTsT, несмотря на наличие в сыворотке исходного олигонуклеотида и фрагментов длиной 7, 10, 13-14 нуклеотидов, в эритроцитарной фракции таких фрагментов нет, а обнаруживаются только моно-, ди-, три- и тетрануклеотиды (рис. 5). Свойство эритроцитов более эффективно связывать короткие олигонуклеотиды было подтверждено в экспериментах in vitro, показавших, что в ряду ATP, рТТ, pGATC, p(E))6 наблюдается уменьшение уровня связывания радиоактивности. Следует отметить тот факт, что 95% pGATC удерживается в эритроцитах не менее 2-х часов, что согласно литературным

данным сильно отличает эритроциты от других клеток, которые за 2 часа экскретируют до 70% захваченных олигонуклеотидов. Полученные в работе данные позволяют считать, что эритроциты не участвуют в метаболизме олигонуклеотидов, но с высокой эффективностью захватывают продукты их метаболизма, происходящего в сыворотке крови или в тканях.

<— старт

<-р0*)16

Рис. 5. Сохранность 32Р-меченных алкилирующих производных олигонуклеотидов в эритроцитах мышей линии ВАЬВ/с после внутрибрюшинного введения в дозе 0,5 мг/кг. Электрофорез (20% ПААГ, 8М мочевина), радиоавтограф.

1.2.3.4,5- олигонуклеотиды сыворотки через 0,3, 0,7, 1,5, 3, 9, 24 ч поел введения СШр^нБте, 6,7.8.9,10,11- олигонуклеотиды сыворотки через 0,3 0,7, 1,5, 3, 9, 24 ' ч после введения СШр^ЬБТвТ, 12.13.14.15.16 олигонуклеотиды сыворотки через 0,3, 0,7, 1,5, 3, 9, 24 ч после введени: С1Ир(Е)1б, 17- маркерные олигонуклеотиды.

В опытах по изучению фармакокинетики в крови было обнаружено, что снижение уровня радиоактивности в сыворотке крови имеет две фазы независимо от стабильности олигонуклеотидного производного. Первая фаза характеризуется быстрым уменьшением концентрации олигонуклеотидов и продуктов их деградации (Т1;2о!.=30 мин), на второй стадии происходит

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

медленное снижение концентрации нуклеотидного материала (Т1/2Р составляет 34-45 часов). В эритроцитах со временем наблюдается накопление радиоактивного материала. Через 20 мин после введения олигонуклеотида не менее 95 % радиоктивности содержится в сыворотке крови. Через 24 часа после введения р(Е)16 в эритроцитах содержится около 25 % радиоактивности крови, а через 24 часа после введения р^^вТвТ радиоактивность эритроцитарной фракции составляет более 80 % радиоактивности крови. За счет связывания коротких олигонуклеотидов и мононуклеотидов эритроцитами временная зависимость суммарной радиоактивности крови (рис. 6) в значительной степени отличается от временной зависимости радиоактивности сыворотки. Накопление радиоактивности эритроцитарной фракцией крови увеличивает характеристическое время Ту2р для р(Е)]6 и рОТнвте до 76-82 часов, а после введения р^мвТвТ начиная от 1,5 часов наблюдается рост суммарной радиоактивности крови. В лейкоцитарной фракции со временем также наблюдается накопление радиоактивности.

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Время, часы

Рис. 6. Содержание радиоактивного материала в крови после внутрибрюшинного введения мышам ВАЬВ/с 32Р-меченных алкилирующих производных олигонуклеотидов: СШ.р(Е)16 ( • ); СЖр(М)145те ( ■ ); СКрОЮмвТвТ ( ♦ ); доза 0.5 мг/кг.

Однако, если через 20 и 40 минут после внутрибрюшинного введения олигонуклеотида суммарная радиоактивность лейкоцитов составляет 5-8% от суммарной радиоактивности эритроцитов, то к 24 часам этот показатель составляет всего 2,5%.

Для исследования олигонуклеотид-белковых комплексов, образующихся в крови животных in vivo, использовали аффинную модификацию белков производными p(E)i6 и p(N)i4sTsT, несущими на 5'-концевом фосфате остаток 4-[(№2-хлорэтил-М-метил)амино]бензиламина. Мышам вводили 32Р-меченные производные олигонуклеотидов, забирали кровь, разделяли на клеточные и сывороточную фракции и анализировали электрофорезом в ПААГ. В сыворотке крови было выявлено два белка, аффинно модифицирующихся алкилирующим производным олигонуклеотида, соответствующие по электрофоретической подвижности тяжелой цепи

1

3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15

<- старт

70 кДа <- 52 кДа

Рис. 7. Модификация белков сыворотки и клеточных элементов крови мышей линии ВАЫЗ/с после внутрибрюшинного введения 0,5 мг/кг 32Р-меченного С111р(Е)1б. БОЗ-дискэлектрофорез в градиентном (10-20%) ПААГ, радиоавтограф. 1.4,7,10.13- белки сыворотки через 0,66, 1,5, 3, 9, 24 ч после введения, 2.5,8.11,14- белки сыворотки через 0,66, 1,5, 3, 9, 24 ч после введения, 3, 6, 9,12, 15- белки сыворотки через 0,66, 1,5, 3, 9, 24 ч после введения С1Яр(Е)]6.

иммуноглобулина класса в и сывороточному альбумину (рис. 7). Олигонуклеотид-белковые комплексы появляются в крови сразу после введения олигонуклеотида и длительно циркулируют в организме. Максимальное их количество наблюдается через 6 часов после введения. Для идентификации белков, образующих комплексы с олигонуклеотидами была использована иммунодиффузия.

Для выяснения того, как влияет связывание с белками на сохранность олигонуклеотидов в сыворотке крови, мы выделяли суммарную фракцию олигонуклеотид-связывающих белков из сыворотки, взятой через 24 часа после введения мышам олигонуклеотида, методом элюции из геля после БОБ-дискэлектрофореза в ПААГ. После разрушения кислотолабильной связи обработкой 5% НС1С>4, входящие в состав комплекса олигонуклеотиды были проанализированы электрофорезом в 20% ПААГ (рис. 8). В составе комплексов содержались олигонуклеотиды длиной 7-8 и 4-6 звеньев.

ч- старт

<- Р(И)16 <- Р(И)10

Рис. 8. Анализ олигонуклеотидного материала, ассоциированного с белками сыворотки после внутрибрюшинной инъекции 0,5 мг/кг алкилирующего производного олигонуклеотида С1Кр(Е)]6. Электрофорез (20% ПААГ, 8М мочевина), радиоавтограф.

1- маркерный 16-звенный олигонуклеотид,

2- олигонуклеотиды ассоциированые с белками сыворотки,

3- маркерный 10-звенный олигонуклеотид,

4- маркерная последовательность.

<_32р

При введении мышам СШр(Е)16 в мембранной фракции лейкоцитов аффинно модифицируется белок с мол. массой 72 кДа. Учитывая, что олигонуклеотиды образуют комплексы с иммуноглобулинами сыворотки, выявленный белок, возможно, является тяжелой цепью мембранного 1§М.

Исследование взаимодействий олигонуклеотидов и ДНК с клетками иммунной системы.

На основании полученных данных о связывании олигонуклеотидов с иммуноглобулинами in vivo можно предполагать, что одним из возможных механизмов активации лимфоцитов под действием митогенных олигонуклеотидов и ДНК является взаимодействие нуклеиновых кислот с поверхностными иммуноглобулинами.

1. Влияние олигонуклеотидов и ДНК на пролиферацию спленоцитов. Методом включения [3Н]тимидина было показано, что ДНК плазмиды pUC19 стимулирует пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей СВА в культуре in vitro, дозозависимым образом. Было показано, что митогенный эффект обусловлен именно полинуклеотидным материалом, поскольку плазмидная ДНК, предварительно обработанная ДНКазой, не вызывала стимуляции пролиферации лимфоцитов. Кроме того, добавление в культуральную среду олигонуклеотида p(E)i6, не имеющего активирующего влияния на культуру

Контроль ДНК ФМА ФМА+ДНК КонА КонА+ДНК Л ПС ЛПС+ДНК

О 20 40 60 80 100

ВКЛЮЧЕНИЕ [3Н] ТИМ ИДИ НА (имп/мин 10"3)

Рис. 9. Комитогенные эффекты плазмидной ДНК и поликлональных активаторов лимфоцитов. Клетки селезенки мышей СВА культивировали 54 часа в присутствии плазмидной ДНК (0,5мкг/мл), ФМА (Юнг/мл), Кон А (0,2мкг/мл), ЛПС (2,5мкг/мл) и без стимуляторов (контроль). Клетки культивировали с [3Н]тимидином 18 часов, собирали на мембранном фильтре и определяли связанную радиоактивность на сцинтиляционном счетчике.

лимфоцитов, приводит к ингибированию стимуляции иммунных клеток под действием ДНК.

Исследование совместного влияния плазмидной ДНК и некоторых известных мигогенов на пролиферацию лимфоидных клеток показало, что митогеные активаторы как Т-, так и В- клеточной пролиферации, а именно, конканавалин А и бактериальный липополисахарид (ЛПС) аддитивно усиливают эффект плазмидной ДНК на пролиферацию лимфоцитов селезенки (рис. 9). Активирующий эффект, вероятно, складывается из увеличения пролиферации Т-клеток под действием КонА и независимого В-клеточного

Контроль

:1

КонА

ЛПС

КонА ДНК ДНКаза ПЭИ

- + - -

- + + -

- + - +

+ + - -

+ + - +

ЛПС сюи ДНКаза ПЭИ

- + -

- + +

- + - +

+ + - -

+ + + -

+ + _ +

I

20

40

60 80 СРМ • 10*

Рис. 10. Влияние полиэтиленимина на пролиферацию спленоцитов под действием митогеннойДНК и олигонуклеотида (СААСССАССА)р. Спленоциты мышей линии СВА культивировали в течении 72 часов в присутствии плазмидной ДНК (0,5 мкг/лунку), олигонуклеотида (6 мкг/лунку), или в присутствии комплексов этих соединений с ПЭИ. КонА (1мкг/мл) и ЛПС (2,5 мкг/мл) добавляли к лимфоцитам одновременно с олигонуклеотидом и ДНК. Для проверки специфичности митогенного эффекта обрабатывали нуклеотидный материал ДНКазой (2 Ед/ нг).

ответа под действием плазмидной ДНК. Можно предполагать, что ЛПС и митогенная ДНК стимулируют различные, но перекрывающиеся субпопуляции В-лимфоцитов. Синсргичное влияние ФМА и плазмидной ДНК может быть результатом того, что их активирующее влияние на клетки опосредуется через различные сигнальные механизмы. Наиболее вероятным кажется рецептор-опосредованное действие ДНК, в отличие от ФМА, взаимодействующего непосредственно с внутриклеточными посредниками.

Для того чтобы выяснить роль взаимодействия поверхностных рецепторов клеток с экзогенными нуклеиновыми кислотами в стимуляции лимфоцитов, была исследована активация пролиферации лимфоцитов под действием комплексов плазмидной ДНК и олигонуклеотидов с полиэтиленимином (ПЭИ). Ранее ПЭИ был успешно использован для трансфекции и доставки олигонуклеотидов в клетки. Из рис. 10 следует, что в составе комплексов с ПЭИ ДНК и олигонуклеотид не имеют стимулирующего действия, причем цитотоксического действия ПЭИ не обнаружено.

Ингибирующее действие катионного полимера на стимуляцию, вероятно, связано с тем, что ПЭИ предотвращает взаимодействие нуклеотидного материала с рецепторами лимфоцитов. Отмена митогенных свойств нуклеиновых кислот может обеспечить ПЭИ дополнительные преимущества при использовании в качестве вектора для генной терапии.

Влияние конкурентов на активацию спленоцитов под действием митогенной ДНК. Было исследовано влияние анти-Ig антител на пролиферацию клеток селезенки под действием плазмидной ДНК. Оказалось, что в присутствии кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши стимулирующее действие плазмидной ДНК на включение [3Н]тимидина селезеночными клетками снижается в 5-10 раз (табл. 1). Учитывая, что цельные молекулы иммуноглобулинов кролика против Ig мыши могут взаимодействовать одновременно с иммуноглобулинами и с Fe рецепторами на поверхности В лимфоцитов, в результате чего ингибируются некоторые активирующие сигналы, было исследовано влияние моно- и бивалентных Fab-фрагментов анти-Ig антител на пролиферацию лимфоцитов под действием плазмидной ДНК. Оказалось, фрагменты анти-Ig антител также вызывают значительное ингибирование пролиферативного эффекта плазмидной ДНК (табл. 1), при этом ингибирующее влияние на действие ЛПС не наблюдается. Бивалентные (РаЬ)2-фрагменты не оказывают столь заметного снижающего влияния на пролиферацию клеток под действием плазмиды, так как способны активировать лимфоциты. На основании полученных данных можно предполагать, что одним из посредников передачи митогенного сигнала ДНК

Табл. 1 Влияние анти-Ig антител и их Fab-фрагментов на активацию

митогены Включение [JH] тими цина (имп/мин х 10~J)

контроль анти-Ig Fab (Fab)2

контроль ДНК 10 мкг/мл ДНК 1 мкг/мл ДНК 0,1 мкг/мл ЛПС 2,5 мкг/мл 2.6 ±0.2 51.5 ±7.2 41.0 ±4.5 15.0 ± 1.4 42.0 ±5.1 1.9 ±0.2 16.5 ±1.3 9.0 ±1.1 4.5 ±3.9 20.0 ±3.5 2.0 ±0.1 26.0 ±3.2 11.0 ±1.4 2.8 ±0.4 35.0 ±4.2 11.5 ± 2.1 39.0 ±5.3 27.0 ±2.3 13.0 ± 1.8 38.0 ±3.7

Клетки селезенки мышей СВА культивировали в присутствии ДНК и ЛПС в указанных концентрациях. Кроличьи поликлональные антитела против Ig мыши, их моновалентные Fab и бивалентные (РаЬ)2-фрагменты (все в концентрации 50 мкг/мл) добавляли к клеткам одновременно с митогенами. Клетки культивировали с [3Н]тимидином 18 часов, собирали на мембранном фильтре и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике.

3. Исследование поверхностных белков спленоцитов, взаимодействующих с ДНК при помощи алкилирующих производных олигонуклеотидов. Данные об ингибировании митогенного влияния плазмидной ДНК под действием 10-кратного избытка олигонуклеотида р(Е)]6 показали, что не имеющие митогенного эффекта олигонуклеотиды (и полимерная ДНК) взаимодействуют с теми же рецепторными структурами клетки, что и бактериальная ДНК. Это позволило использовать алкилирующее производное олигонуклеотида ClRp(E)i6 для выявления белков, опосредующих митогенные эффекты ДНК. После инкубации клеток селезенки мышей СВА in vitro с 32Р-меченным ClRp(E)i6, выделяли мембранно-цитозольную фракцию и анализировали модифицированные белки электрофорезом в ПААГ с последующей радиоавтографией. Как видно из рис. 11, в лимфоцитах селезенки происходит модификация нескольких белков, из которых на радиоавтографе наиболее ярко видны полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 15 и 18 кДа, 40 и 42,5 кДа, а также 4 полосы, расположенные в высокомолекулярной области, с молекулярным весом 67, 72, 77 и 82 кДа. Константы диссоциации олигонуклеотид-белковых комплексов были определены из данных о зависимости степени модификации этих белков от концентрации CIRp(E)16 (табл.2). При модификации 32Р-меченным ClRp(E)i6 лимфоцитов селезенки, предварительно стимулированных

К КонАФМАМФЛПС ДНК

кДа

82 -> 67 -»

40 ->

30 -> 18 ->

Г!

1

р;

адУ,

2 3 4 5 6 Рис. 11. Модификация белков мембранно - цитозольной фракции (МФ) лимфоцитов селезенки 32Р-меченным СЖр(Е))6. Лимфоциты селезенки мышей СБА культивировали в течение 24 часов в присутствии плазмидной ДНК (1мкг/мл), КонА (1мкг/мл), ЛПС (2,5мкг/мл), МФ (1мкг/мл), ФМА (Юнг/мл) или без митогенов (контроль). Клетки в плотности 107 кл/мл инкубировали в среде без сыворотки с СЩр(Е)16 в концентрации 2,5 мкМ, при 37°С в течение 45 минут. Белки МФ анализировали ЗОБ-дискэлектрофорезом в градиентном (10-20%) ПААГ.

Табл. 2. Константы диссоциации комплексов мембранно - цитозольных белков

Молекулярная масса белков (кДа)

15 и 18 25 30 40 и 42,5 67 и 82 72 и 77 95 и 145

Кс1, мкМ 2,5±0,4 5 ±0,9 3 ±0,5 0,5±0,2 2±0,4 1±0,3 3 ±0,5

Молекулярную массу белков, модифицированных 32Р-меченным СЖр(Е)|б определяли по их подвижности в градиентном 808-дискэлекгрофорезе (1020%) ПААГ. Константы диссоциации олигонуклеотид - белковых комплексов вычисляли из данных о зависимости степени модификации белков от концентрации СЖр(1Ч)1б. Приведенные данные являются средним значением результатов трех независимых экспериментов.

различными митогенами, был выявлен набор белков, в целом похожий на таковой в нестимулированных клетках. Однако, некоторые из использованных

митогенов приводят к увеличению радиоактивности белковых полос на радиоавтографе (рис. 11). Форболовый эфир, митоген с широким спектром действия, вызывает практически равномерное увеличение экспрессии олигонуклеотид - связывающих белков в лимфоидных клетках. В случае КонА-стимулированных лимфоцитов по сравнению с контролем практически нет увеличения радиоактивности в группе белков с мол. массой 67-82 кДа, а также практически отсутствуют минорные полосы 30 и 25 кДа, но при этом заметно увеличивается количество меченного белка 42,5 кДа. Напротив, митогены, специфически усиливающие пролиферацию В-лимфоцитов - ЛПС и МФ - в отличие от Т-клеточного стимулятора КонА, приводят к увеличению количества модифицированного белка в группе с мол. массой 67-82 кДа, а также 25 кДа, что соответствует полипептидным цепям поверхностных иммуноглобулинов и Можно предполагать, что белки с мол. массой 40-42.5 кДа имеют Т-клеточное происхождение, и увеличение их количества при КонА - стимуляции связано с увеличением относительного числа Т-клеток в селезеночной культуре. Возможно, меченные белки представляют собой полипептиды, составляющие гетеромерный Т-клеточный рецепторный комплекс (ТСЯ), имеющий иммуноглобулин - подобную структуру, а-, р- и уцепи ТСЯ, согласно литературным данным имеют мол. массу от 40 до 50 кДа.

Выявленные в работе белки мембранной фракции лимфоцитов, имеющие высокое сродство к нуклеиновым кислотам, могут участвовать в процессе митогенной стимуляции спленоцитов. Идентификация и выяснение физиологической роли белков, которые по нашим данным, достаточно специфично и аффинно взаимодействуют с олигонуклеотидами, необходимо для успешного изучения механизмов митогенного действия ДНК.

Таким образом, экзогенные нуклеиновые кислоты могут вызывать побочные эффекты, одним из которых является иммуностимулирующий эффект бактериальной ДНК и некоторых олигонуклеотидов. Иммунная стимуляция может быть полезным фактором и обеспечивать благоприятный эффект в случае генной иммунизации плазмидной ДНК, а также при использовании антисмысловых олигонуклеотидов в борьбе с вирусной или бактериальной инфекцией. Однако, в других случаях, например ингибирование размножения вирусов, пермиссирующих в лимфоцитах, такие побочные эффекты могут оказаться нежелательными. Понимание механизмов взаимодействия экзогенных нуклеиновых кислот с иммунными клетками и разработка подходов, позволяющих управлять иммуностимулирующим действием нуклеиновых кислот, позволит конструировать высокоэффективные ген-направленные терапевтические препараты, лишенные неблагоприятных побочных Эффектов.

Выводы.

1. Впервые исследовано взаимодействие дезоксирибоолигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей организма. С помощью аффинной модификации реакционноспособным производным олигонуклеотида с применением иммунохимических методов показано, что в слезной и слюнной жидкостях с олигонуклеотидами взаимодействуют лактоферрин, лизоцим и иммуноглобулины кассов А и G. Величины Kd для комплексов ClRp(E)i6 с лактоферрином, лизоцимом и иммуноглобулином А составляют 0,5; 2; и 5 мкМ соответственно. Показано, что в барьерных жидкостях фосфодиэфирные олигонуклеотиды разрушаются значительно медленнее, чем в крови (время полураспада олигонуклеотидов в слюнной жидкости составляет 1ч 40 мин, в слезной жидкости - 2ч 20мин).

2. Изучены взаимодействия с белками и стабильность в крови in vivo дезоксирибоолигонуклеотидов и дезоксирибоолигонуклеотидов с модифицированным 3'-концевым фрагментом молекулы. Впервые показано что олигонуклеотиды образуют комплексы с иммуноглобулинами и альбумином в сыворотке крови in vivo. Обнаружено, что наиболее эффективная защита олигонуклеотидов от действия нуклеаз достигается введением двух 3'-концевых межнуклеозидных фосфоротиоатных групп. При введении мышам p(N)]4sTsT исходное производное выявляется в сыворотке крови в течение не менее 24 часов. Обнаружено, что в эритроцитах крови избирательно и эффективно накапливаются короткие продукты деградации олигонуклеотидов: moho-, ди-, три- и тетрануклеотиды.

3. В экспериментах на первичной культуре лимфоцитов in vitro показано иммуностимулирующее действие ДНК плазмиды pUC19 и олигонуклеотида d(pGAAGGGAGGA). Установлено ингибирующее влияние моновалентных Fab-фрагментов антимышиных иммуноглобулинов, а также олигонуклеотидов и полимерной ДНК, не имеющих митогенных свойств, на стимуляцию пролиферации лимфоцитов под действием плазмидной ДНК. Показано, что комплексы митогенных олигонуклеотидов и ДНК с поликатионом полиэтиленимином не обладают иммуностимулирующим действием на спленоциты. На основании перечисленных данных сделаны выводы о рецептор-опосредованном иммуностимулирующем действии нуклеиновых кислот и об участии в механизме иммуностимуляции иммуноглобулин-подобных рецепторов.

4. С помощью аффинной модификации алкилирующими производными олигонуклеотидов показано, что олигонуклеотиды взаимодействуют с несколькими белками мембранной фракции спленоцитов мышей СВА с молекулярными массами от 15 до 150 к Да и в том числе с полипептидами,

которые соответствуют по молекулярной массе тяжелым цепям рецепторных иммуноглобулинов, IgD и IgM (67 и 72 кДа соответственно). На основани этих данных сделано предположение о том, что иммуноглобулиновые рецепторы принимают участие в процессе активации лимфоцитов под действием ДНК.

Основные результаты диссертации содержатся в следующих публикациях:

1. Лактионов П. П., Рыкова Е. Ю., Крепкий Д. В., Брыксин А. В., Власов В. В." Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей. Биохимия, 1997, Т. 62 (6), С. 716-723.

2. Лактионов П. П., Рыкова Е. Ю., Власов В. В. Участие поверхностных иммуноглобулинов в активации лимфоцитов под действием плазмидной ДНК. Молекулярная биология, 1997, Т.З, С. 506-514.

3. Rykova E.Yu, Laktionov P.P., Vlassov V.V. Polyethyleneimine masks mitogenic effect of DNA. Nucleosides and Nucleotides, 1997, V.16, P.

4. Паутова Л. В., Рыкова Е. Ю., Лактионов П. П., Власов В. В. Исследование взаимодействий полиреактивных антител с нуклеиновыми кислотами при помощи алкилирующих производных олигонуклеотидов. Молекулярная биология, 1996, Т.30 (4), С. 941-950.

5. Pautova L.V., Rykova E.Yu, Laktionov P.P., Vlassov V.V. Oligonucleotides interact with immunoglobulins on a polyanion binding site.

Abstracts of the 23-d FEBS Meeting, Basel, 1995, P1.24., P. 138.

6. Andreeva A., Biyksin A., Krepky D., Laktionov P., Pautova L., Rykova E., Yakubov L., Nechaeva M., and Vlassov V. Interactions with proteins affect cellular uptake, biodistribution and biological activities of oligonucleotides. Abstracts of the XII International Roundtable Nucleosides, Nucleotides And Their Biological Applications. 1996, OP17, p. 31.