Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигонуклеотидные производные в живом организме: распределение по органам, устойчивость к деградации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Олигонуклеотидные производные в живом организме: распределение по органам, устойчивость к деградации"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ............СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.123.2+541.69

КАРАМЫШЕВ Валерий Николаевич

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В ЖИВОМ ОРГАНИЗМЕ: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ОРГАНАМ, УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕГРАДАЦИИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1-993 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители: к.б.н. Л.А.Якубов

чл.- корр. РАН В.В.Власов

Официальные оппоненты: д.б.н. С.Н.Загребельный к.б.н Л.В.Паутова

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится " ¿/~п ¿¿1&//-Р 1993 г. в 0 ^часов на заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, цроспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно - ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан ". /У " угС/£Г*Р 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ____ Актуальность проблемы. Производные_______олигонуклеотидов______

рассматриваются как потенциальные биологически активные

вещества, способные к наиболее избирательному воздействии на гонсттг?ее::ио процессы изгоях организмов за счвт своей уникальной способности к образованию комплексов с нуклеиновыми клелстяыи, содержащими комплементарные им нуклеотвдные последовательности. Успехи, достигнутые в первых опнтех на культур» клрсок;

подэвл.?:те различных вирусов, подавление синтеза опреде.^'тдах онкобелков сввдетельствовали о принципиальной возможности

ТЯКПРП ГТОТТТЛТГЯ « ШТЛОПпптгггтя - готатттлтип« отгттвпптпм ^.»-.гя^- "

клеток, ь течение по сладких несколько лет опубликовано множество работ о различных биологических эффектах олигонуклеотидов, подтверждающих правильность выбранного подхода. Данные о

возможности подавления развития инфекции у мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита, производными олигонуклеотидов, комплементарных РНК этого вируса, открывающие перспективы терапевтических приложений производных олигонуклеотидов,

ТНебУЮТ ЛвТаЛЬНОГО ияучйКИЯ гггтйпйняя п.тлргту^ п^-глтмп^» »

оргвюдо*» жшотдох -

Пил;-ш рябеть' являлось изучение расяг?д.°.'!ожтя по

органам &К80ТР!« о-пигскуклеотидсв при: разных спосс'лг вгедыыя, стабильности и возможных механизмов яеграл&шя: ¡троизвод.-«;* олигонуклеотидов в разных органах, а также 2.^:I^-^•rí^'^, рдолхчкмх модификаций олигонуклеотидов на их поведение к орг «клз"* • В задачу исследования входило такие изучение ззаям&дбЯсзягя

алкилирующих производных олигоиуклеотида с клеткачи 1' киком организме. Такая работа потребовала, прежде всего, больших

детектировать доке после многократного разбвзлсния г. оргз.-си-м? животных. 3 связи с этим в задачу исследования входил поиск условий, позволяющих нарабатывать радиоактивном©ченый

олигонуклеотид в количествах, позволяющих работать с большой группой животных и детектировать сшичэнуклеотид и продукты его деградации после введешм в организм.

Научная новизна и практическая ценность работе. В настоящей работе исследовано распределение по органам мши олигонуклеотидоь

и их производных при различных способах введения. Показано, что олигонуклеотиды, введенные внутривенно и внутрибрппинно. быстро, в течение нескольких минут распространяются по тканям организма, накапливаясь преимущественно в органах ретикуло-вндотелиальной системы и выводясь с мочой. Изучена стабильность олигонуклеотидов в организме. Ныло показано, что олигонуклеотиды разрушаются в различных тканях с разными скоростями: через 30 минут после введения сохраняется 5-50% неразрушенных олигонуклеотидов, в зависимости от ткани. Также было показано, что защитные группы на 3' и 5'- концах олигонуклеотида предохраняли олигонуклеотид от деградации. Наиболее эффективно предохраняли олигонуклеотид от деградации холестериновая группа на 3*- конце и бензиламинная группа на 5'- конце. Была исследована возможность введения олигонуклеотидов животным неповреждающими методами. Показано, что олигонуклеотиды способны проникать в организм через слизистые оболочки и кожу. Использование процедуры електрофореза или наличие детергента в растворе при аппликации олигонуклеотида на кожу животного существенно увеличивают эффективность проникновения в органы и ткани. Результаты этого исследования могут быть использованы при конструировании различных производных олигонуклеотидов с целью увеличения их терапевтического потенциала.

Также было исследовано взаимодействие алкилирующих Производных с белками различных тканей. Показано, что клетки различного происхождения содержат белка, связывающие олигонуклеотида. Обнаружены тканеспецифические белки, связывающие олигонуклеотиды у млекопитающих (мыши) и насекомых (дрозофила).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме "Нуклеозиды, нуклеотиды и их применение в биологии" (Швеция, Уппсала, 1990) и на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991).

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 114 страницах, включающих 15 рисунков, 2 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и

обсуждение, выводы.

СОДЕРЖ.-'ЧИЕ РАБОТЫ

Г10

Получение Р- олигонуклеотидов высокой молярной активности.

Для изучения кинетических особенностей поведения

олигонуклеотидов в организме необходимы радиоактивные олигонук-

леотидные производные в количествах 3-5 мКи на опыт и с высокой

молярной активностью из-за низкой чувствительности обнаружения

радиоактивности в органах и тканях и необходимости использования

в одной серии опытов нескольких животных (как правило, не менее

6) для получения статистистически достоверных результатов, Пртт

использорании для мечения олигонуклеотидов коммерческих препаратов 32

[7- Р]АТФ зачастую мы не получали меченый олигонуклеотид с нужной молярной активностью из- за низкой молярной активности исходного нуклеотида и потери биологической активности меченых препаратов при хранении и транспортировке. Поэтому была проведена работа по поиску условий, позволяющих получать [7~32Р]АТФ высокой молярной активности (5000-7000 Ки/мМоль) и с хорошей биологической

ор ор

активностью. [7- Р]АТФ получали из Н^ РО, и АДФ с использованием пяти ферментов согласно метода Дгонсона - Волсетса . Метод основан на воспроизведении части цепочки реакций гликолиза и позволяет присоединить неорганический фосфат к АДФ.

, 2 в 4 Рис I. Радиоавтографа пластинки фосфат > р ПЭИ-целлюлозы после восходящей ТСХ

в 0,5 М КН^РО. меченых субстратов при синтезе [ Р]— олигонуклеотидов.

,1

(

и-32р!атр>

а*игом^<лмтиА > (Л

У

4

то

I- олигонуклеотид [5'-" Р]рЕ, 2-

[7-^2Р]АТФ через 30 дней хранения, 3- [7-32Р]АТФ, 4- [32?3- сртофос-стдрт> V • • форная кислота.

32

Для получения [7- Р]АТФ максимальной молярной

активности все используемые растворы не должны содержать примесей

неорганического фосфата, в первую очередь это относится к исходным

АДФ и р-НАД. В условиях, описанных в экспериментальной части, 32

синтез [7- Р]АТФ завершался за 30 минут после добавления в реакционную смесь АДФ. Выход реакции, определяем^ по [^Р]-ортофосфорной кислоте составлял не менее 95-99%. Условия синтеза

[7- Р]АТФ: наличие в реакционной смеси Трис-НС1 с необходимым для реакции меченая олигонуклеотвда значением рН и высокая объемная активность (100 ыКи/ил) позволяют без предварительной очистки и концентрирования использовать полученный препарат, лишь добавив в реакционную смесь олигонуклеотид и Т-4-полинуклеотидкиназу. Синтез [ 5'--^Р] олигонуклеотидов проводили при 37°С в течение 40 минут, либо в течение ночи при комнатной температуре. Выход реакции,

оп 30

определяемый по [7- Р]ДТФ составлял не менее 70% (рис.1) Р-олигонуклеотвды имели молярную активность не менее 300 Ки/мМоль. Использование в реакциях мечения олигонуклеотидов синтезированного таким способом [7~^2Р]АТФ имеет и еще одно немаловажное преимущество: препарат в течение, по крайней мере, 30 дней сохраняет высокую биологическую активность при температуре хранения -8°С.

Распределение и деградация олигонуклеотидных производных в организме мыши. Для выяснения поведения олигонуклеотидов в организме мышей мы использовали 5'-[^2Р]-меченые олигонуклеотиды, несущие на 5'- концевом фосфате остаток бензиламина (рис 2).Аналогичную структуру имеют многие испытывающиеся в настоящее время производные олигонуклеотидов. Концевой фосфат этих

1) В2рЕ1б> ^—^^СН^-МН-рТСАСССТСТТСССАТС

2) ВгрвЕ1£ 1 фосфотиоатный аналог производного ВгрЕ1^

3) ВгрТ1 „СТю! *" гонуклеотида ВгрТ-

Рис.2 Производные олигонуклеотидов, используемые в работе.

производных не удаляется фосфатазами, что позволяет регистрировать олигонуклеотиды и продукты их деградации по имеющейся в них радиоизотопной метке.

На рис. 3(а,б,в) приведены кинетики накопления и выведения меченых производных олигонуклеотидов в организме мыши. Видно, что при внутрибрюшинном способе введения уже через несколько минут после введения препараты достигают всех органов и тканей, очевидно, разносясь кровотоком. Позднее происходит некоторое концентрирование препаратов в органах выведения: печени и почках, и уменьшение их содержания в селезенке, поджелудочной железе и мышцах. Наименьшее количество радиоактивного материала обнаруживается в головном мозге. В почках и печени в течение суток происходит многократное уменьшение содержания радиоактивного материала.

^ 1 илух^ д»-"«

4) СШрЕ1б,

24 i.we V W

Ряо.З(а,б,в).

11 24 1.«

Фарыакокинв гика меченых олигонук-леотидных производных в мыши. 2 наномоля олигонуклеотвда BzpE1g (40 Ки/иЫоль) в мышь было инъецировано внутрибрпвинно (непре-

_,рывная линия) и подкожно (пунк-

тир'йай'линия) в мышь. Была рассчитана удельная радиоактивность

(импДшн

• мг ). R- почки , H- печень, Р— подгэлудочная ¡кэлеза t M— мышечная ткань, S- кровь, I- селезенка, С- мозг. Рис.Зв- кинетика выведения радиоактивного материала с мочой.

Видно, что yse через 30 минут после введения значительное количество радиоактивного материала выводится с мочой: 12% при внутрибрпшшном способе введения и 18$ при подкоютсы способе введения. Следует отметить, что при внутриСркиинном введении в мышь эквивалентных количеств 32Р- фосфата через 18 часов после инъекции в моче было обнаружено только 2% радиоактивного материала и, таким образом, можно предположить, что, в течение, по крайней мере 1,5 часов выводится в основном олигонуклеотидное производное и продукты его деградации, а не 32Р~фосфат. При подкожном способе введения максимальный уровень содержания радиоактивности в тканях организма ниже, чем цри внутривенном и внутрибрпшшном способе введения, а кинетика накопления более плавная, свидетельствующая о депонировании производного в месте иньекции. При внутривенном способе введения через Б минут после иньекции кинетики накопления и выведения

олигонуклеотидных производных в тканях такие se, как и внутрибрпшшном способе введения.

при

рис.4 Включение Н^2Р04 в нуклеиновые

13 Г 3' 2' 3' «' Г 2* 3*

кислоты мыши. В мышь весом 10 грамм

32

вводили внутрибршшшо 5 мКи Нд Р0^. Через 4 часа мышь забивали, образцы тканей анализировали электрофорезом.

Кд Образцы тканей перед электрофорезом

* ^ШЗшШшЖешШ & обрабатывали ДНКазой(2; 3*), РНКазой »^ИЯ1ИИЯиИ81И1^ (2,3,4 ) и щелочной фосфатазой

(1+,г+,3+) I- мышечная ткань, 2- почка, 3-печень, 4- кровь. Точками слева обозначены позиции маркерных олигонуклеотидов длиной 16, 7 и 4 нуклеотидных остатка.

Для изучения деградации производных олигонуклеотидов в тканях нуклеотидвый материал, полученный фенольной депротеинизацией образцов тканей, анализировали электрофорезом в 20%-ном полиакрил-амидном геле. Анализ такого материала из мышей, которым инъецировали меченое олигонуклеотидное производное, показал наличие радиоактивного материала, соответствующего по подвижности исходному продукту, продуктам деградации олигонуклеотидов а также появление высокомолекулярных меченых продуктов на старте и вблизи старта и низкомолекулярных меченых продуктов, соответствующих по подвижности [^2Р]АТР и [^2Р]- фосфату. Очевидно, радиоактивный неорганический фосфат за время после инъекции реутилизируется ферментами клетки и включается в синтезируемый АТР.

Для того, чтобы отличить на влектрофореграмме материал, обра-аукщийся при деградации олигонуклеотидов, и материал, появляхцийся за счет реутилизации фосфата, были проведены эксперименты,в которых животным за 4 часа до проведения анализа вводили радиоактивный неорганический фосфат. При влектрофоретическом анализе образцов тканей обнаружено значительное количество радиоактивного материала как с высокой, так и низкой электрофоретической подвижностью (рис.4). Экстрагированный из тканей материал обрабатывали щелочной фосфатазой для исключения из анализируемых продуктов соединений, содержащих незащищенный фосфат, а также РНКазой и ДНКазой для установления природы меченого материала. Обработка щелочной фосфатазой приводила к исчезновению радиоактивных полос в низкомолекулярной области. При обработке образцов РНКазой полимерный меченый материал в образцах из печени и почек исчезал. При инъецировании

....... .... рис.5 Производные олигонуклеотидов в

I 1 1 I ! 11*3$ 5 3 4^1

, ------------- ------------------ — ' тканях мыши через 30 минут___после

внутрибрилинной инъекции 5 наномолей олигонуклеотидов ВгрЕ16> ВгрзЕ^, ВгрТ10СКо1. I, селезенка; 2, панкреас; 3, почки; 4, кровь; 5, печень.

ОД 11 %1

Л , ДД ^ \ I'-5'- BzpsE16 в тех же тканях. X

Э * о • ^' 4 3zpT1QChol в тех же тканях.

• _ »<

EspT10Ch.ol, стандарт. Старт обозначен значком >. Точками слева обозначены

in ■■■и iimimnj П032ЦШ1 -.тркерянт олигонуклеотидов

О длиной 16, 7. i нуклеотидных остатков. Р- неорганический фосфат.

32

Р- фосфата в мышь в количествах, не превышающих его содержание в вводимом производном олигонуклеотида за 1,5 часа не образуется меченых продуктов, близких по подвижности инъецированному производному олигонуклеотида и его фрагментов. Таким образом, хотя в пробах накапливается некоторое количество неорганического фосфата, несмотря на наличие зпзапигх групп в инъецированном олигонуклеотиде, на электрофореграммах мы видим практически только олигонуклеотида и продукты их де^адацки (рис. 5). Для того, чтобы оценить сохранность олигонуклеотидной части мы денситометрировали полученные радиоавтографы и определяли количествеппо содеркание фракций олигонуклеотидов длиной 16-10, 10-5 нуклеотидных остатков. Видно, что содержание полимерного материала (16- 10 нуклеотидных остатков) через 30 минут после внутрибряиинной инъекции варьирует в разных тканях от 50% в крови до 5 Ж в печени (рис.6). Объяснение этих различий может быть связано с функциональными особенностями соответствующих клеток. Очевидно, в клетках органов ретикуло-эндотелиальной и выделительной систем (печень, селезенка, почки) происходит более быстрое разрушение, в крови деградация идет медленнее .

Мы предполагали, что при высоких дозах вводимых етвотным олигонуклеотидов, деградация должна проявляться в меньшее стеттстпг, однако опыт по выяснению зависимости деградации олигонуклеотидов от дозы дал отрицательный результат. При введении олигонуклеотидов в дозах 150; 15; 1,5; 0,15 нмоль производного на 30-грамовую мыиь

е225-9 n 110-16 n

рис. б. Деградация олигонуклеотидов и фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов в мыши. 5 наномолей олиго-нуклеотида ВгрЕ1б или ВгрзЕ1б было инъецировано в мышь внутрибрюшинно и подкожно. Ось ординат, содержание фракций олигонуклеотидов: 10- 1611-фракция 10-16 нуклеотидных остатков, 5-91Г- фракция 5-9 нуклеотидных остатков, процент радиоактивного материала в геле. I и 2 - образцы тканей через 30 и 90 минут после внутрибрюпшнной инъекции ВгрЕ^-ц, соответственно. 3- образцы тканей через 90 минут после подкожной инъекции ВгрЕ16. 4- образцы тканей через 30 минут после аяутрибрппинной инъекции ВгрвЕ-^. Н- печень, И- почки, Р-панкреатическая железа, Б- кровь, I- селезенка.

нами не было обнаружено каких-либо изменений в скоростях деградации олигонуклеотидов в разных тканях. Это свидетельствует о том, что доза I мг производного 16-иера на мышь не вызывает насыщения ферментативных систем, обеспечивающих деградацию олигонуклеотидов.

Для оценкй влияния на стабильность олигонуклеотидов замены фосфатных груш на тиофосфатные, мы исследовали производное фосфотиоата олигонуклеотида. Оказалось, что его деградация в тканях существенно отличается от деградации производного с обычными фосфоди эфирными связями. За 30 минут производное фосфотиоата олигонуклеотида существенно меньше деградирует в крови и поджелудочной железе (рис.5,6). При I,5-часовом нахождении в организме мыши наблюдалась та жа закономерность: в крови и поджелудочной железе сохранялось не менее 20% недеградированного производного. При сравнении картины деградации фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов в панкреатической железе и крови видно, что в панкреатической железе имеет место деградация, при которой полоса с максимальной интенсивностью соответствует недеградированному производному и одинаково слабо видны полосы с меньшим числом нуклеотидных остатков вплоть до мононуклеотидов. Такая картина характерна для неполного статистического расщепления 5'- меченого олигонуклеотида ендонуклеазами. В крови же имеет место деградация, при которой полоса меньшей интенсивности сответст-

вует олигонуклеотиду с меньшим числом нуклеотидных остатков, что характерно для неполного расщепления олигонуклеотида 3'- екзонук-леазами. Похожая картина наблюдается при деградации производных олигонуклеотидов с обычными фосфодиэфирными связями, хотя на ра-диоавтограмме видно присутствие одновременно и значительного количества недеградированного производного и продуктов деградации до мононуклеотида, что, вероятно, свидетельствует о деградации олигонуклеотидов как 3'- экзонуклезами, так и впдонуклеазами. Полученные результаты указывают на перспективность фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов для воздействия на нуклеиновые кислоты в живом организме. При этом вззяо отметить, что фосфотиоатные производные олигонуклеотидов, будучи существенно стабильнее в крови и панкреатической железе, в других тканях не так сильно отличались по стабильности от олигонуклеотидов с обычными фосфодиэфирными связями. Таким образом, проблема увеличения стабильности олигонуклеотидов сохраняет свое значение и, возможно, одним из путей ее решения может быть концевая модификация олигонуклеотидов.

При исследовании олигонуклеотидов, несущих на 3'-конце холестериновую группу, оказалось,' что эти производные медленнее деградируют, чем производные с незащищенным З'-концом. За 30 минут в крови и поджелудочной железе доля недеградированного производного составляет около 80Ж (рис.5) и через час - около 50Ж. По - видимому, присутствие защитных группировок на обоих концах олигонуклеотида способно существенно повысить стабильность олигонуклеотидного производного в организме животного. При сравнении распределения холестеринового производного

олигонуклеотида с олигонуклеотидом, не имеющим на 3'- конце защитной группы были получены интересные данные: через несколько минут после внутрибрюшинной иньекции концентрация холестеринового производного в крови и жировой ткани в 2-3 раза вше, чем концентрация олигонуклеотида, не имеющего на 3'- конце защитной, группы, причем в жировой ткани в течение, по крайней мере часа идет накопление холестеринового производного олигонуклеотида, что также являемся косвенным доказательством повышенной стабильности таких соединений (рис.7). При анализе образцов крови, полученных после иньекции холестеринового производного олигонуклеотида было отмечено, что 5 минут после иньекции содержание холестеринового

Рис 7. Фармакокинетика производного ВгрТ^СЬ в жировой ткани (I), крови (2), формешг х элементах крови (I') и плазме (2') и производного ВгрТ10 в крови (3) жировой ткани (4), плазме (3") и форменных элементах (4') после внутрибршинного введения 2 нано-молей олигонуклеотида.

производного в форменных элементах увеличивается в течение часа, в то время как содержание холестеринового производного в плазме крови плавно убывает, содержание же олигонуклеотидного производного, не имеющего защитной группы на 3'- конце в форменных элементах крови существенно ниже, чем в плазме крови (рис.?).

Сравнительный анализ распределения и стабильности олигонуклеотидных производных в организме животного при разных способах введения. На рис. 8 представлены данные о распределении радиоактивного материала по органам при различных способах введения олигонуклеотидов в мышь. Видно, что уже через 20 минут в органах накапливается значительное количество радиоактивного материала, причем захват радиоактивного материала органами и тканями при интраназальном и пероральном способах введения составляет 5-20% от уровня наблюдаемого при интраперитонеальном способе введения. Концентрация олигонуклеотидного производного в крови оказывается равной 40 нМоль при интраперитонеальном введениии, 10 нМоль при интраназальном и пероральном введении.

Количество радиоактивного материала, проникающее в органы при аппликации на кожу раствора олигонуклеотидного производного, содержащего детергент, минимальное и составляло

рис.8. 2 наномоля [5'-^2Р]-олиго-б.оауклеотвдаBzpEJ6 (-2,5 Ки/Шоль) -------

Е34 вводили мышам внутрибрхжпшшо(1), в 3-0обьеме 200 микролитров физраствора,

са i интраназально (2) в объеме 5 мик- физраствора, перорально (3) в объеме Е0 микролитров физраствора, ректально (4) и интравагиналь-но в обьеме 10 микролитров физраствора Ъ, печень; К, почки; В, Р, панкреатическая железа;S, селезенка; U, мышечная ткань.

0,1Ж- 0,5% по сравнению с интраперитонеалылш введением. Прп аппликации подлого раствора олигонуклеотида на кояу радиоактивны® материал был обнаружен только в печени и почках. Но если к апплицированному на коже брюшной полости олигонуклоотидао-му производному подвести отрицательный электрод, а к коже спины положительный электрод и вести электрофорез при силе тока 3 мД и напряжении ЗОВ (при этих значениях не наблюдалось отклонений в поведении животного), то концентрации олигонуклеотидного производного в органах и тканях в несколько раз увеличиваются и становятся сравнимыми с концентрациями, характерными для

интравагинального введения (Таблица 1). Этот способ введения

привлекателен тем, что появляется возможность доставлять олигонуклеотидное производное к требуемому органу или ткани непрерывно в течение длительного времени и использовать олигонуклеотидное производное как фармакологический агент.

Независимо от способов введения было отмечена почти похожая картина распределения олигонуклеотидов по органам. Это означает, что, вероятно, во всех случаях функционирует один и тот же механизм транспорта олигонуклеотидов: они разносятся с потоком

Таблица I.Проникновение олигонуклеотидных производных через кожу.

1 К Б" " р S ' ■ I' " н

водный раствор 0.12 Ó.54 - - - - -

лосьон с детергентом 0.5 0.5 0.6 0.6 0.25 0.25 0.35

электрофорез 2.4 3-5 0.1 2.7 0.2 0.1 2.2

Удельная радиоактивность (имп/мин-мг) была рассчитана для кандо-го органа. Ь- печень. К- почки, Р- панкреас, Б- селезенка, I- тонкая кишка, М- мышечная ткань.

1 2 3 4 5 6 7 8

рис. 9 Стабильность олигонуклеотидных производных, введенных в мышь разными способами. Образцы крови (1,4,6,8) и панкреатической железы (2,3,5,7) анализировали электрофоре зом. ВгрЕ16-

позиция недеградированного олигонук-леотида, ВгрЛ, позиция производного мояонуклеотида, РО,, позиция фосфата.

СТАРТ >

В1рЕ16 >

ВгрМ >

I *

ФОСФАТ >

крови по органам и затем захватываются клетками разных органов.

На рис. 9. приведены результаты электрофореза радиоактивного материала, содержащегося в крови и панкреатической железе через 20 минут после введения олигонуклеотидных производных разными способами. Видно, что во всех случаях в образцах, полученных из крови и панкреатической железы, основная часть радиоактивного материала представлена неразрушенными производными олигонуклеотидов. При

интраперитонеальном и пероральном способе введения в крови

32

присутствует значительное количество Р- фосфата и обнаруживается некоторое количество продуктов деградации, вплоть до мононуклео-тидов, в то время как при интравагинальном и' интраназальном способах введения в крови не обнаруживались продукты деградации олигонуклеотида. Это может объясняться высокой активностью макрофагов и нуклеаз брюшной полости и кишечника,

вследствии чего олигонуклеотид попадает в кровь уже частично деградированным.

В панкреатической железе олигонуклеотиды менее деградированы, чем в крови. Около 95% при интравагинальном введении и 45% при интраназальном введении представлено недеградароваяным производным олигонуклеотида. Клетки панкреатической железы, очевидно, захватывают преимущественно недеградированный олигонуклеотид. Проникновение олигонуклеотидов в организм цри интраназальном введении зависит и от дозы препарата и, по видимому, носит насыщаемый характер. Увеличение вводимой дозы в 7 раз приводит к увеличению содержания р а материала в тканях в 2-3 раза.

Олигонуклеотидовязывадме белки млекопитающих и насекомых.

Изучение механизмов взаимодействия олигонуклеотидов с клетка-

рис.10 Радиоавтограф ге^л после разделения

__ ________по Леммли белков, модифицированных 5 пи-

V ! 2 2 3 3 4* 4 комолямк производного RClpSjg в орга-^ —1шзме мнгаи через 30 минут после внутри-Ср$5пишюго взодетптя !SZSZÍi I- тгсюттт», 2; почки, 3- кровь, 4- панкреатическая ' "í^tSESl И железа. Х'-4|- эти же ткани мыши, которой * ¿л-: I вместе с реагенте?! ввели Ю- краткий избыток холодного олигонуклеотида.

ми млекопитающих привело в недавнее время к обнаружению на

iiODGÜAHUUTjri IWllálWf^ Mjr£t!.uOiwi» lili o0 jl nnt.i.r .1 Aj ,

специфично связывающих олигонуклеотида и, по-видимому, участвующих в их транспорте внутрь клетки. На рис. 10 приведены

электрофоретические данные модификации белков в тканях мышей, которым было введено алкилирухщее производное олигонуклеотида, при этом в одну из мышей вместе с производным был инъецирован немеченый олигонуклеотид в Ю- кратном избытке. Во всех тканях присутствуют продукты модификации белков, однако только одна из радлоактийьы» полос оказалась чустеительна к избытку немеченого олигонуклеотида. Эта полоса с молекулярным весом около 60 кДа полностью отсутствует в кроЕИ, а в печени, почках и панкреатической хелезэ ее интенсивность примерно коррелирует с количеством радиоактивного производного, захватываемого ткапьа. Меченые белки, присутствующие в образцах тканей и ол»бо реагирующие на избыток олигонуклеотида, очевидно, обладают меньшей специфичностью к олигонуклеотидам, хотя, несомненно, имеют сродство к ним, поскольку концентрация реакционноспособного производного в крови не превосходила величину 5 мкМ и неспицефмческая модификация белка в таких условиях должна быть очень мала. В настоящей работе представлены данные,

свидетельствующие о наличии подобных белков у дрозофилы. Учитывая, что во взрослое насекомое можно инъецировать раствор до I/I0-I/5 объема гемолимфы, мы использовали для инъекций 20 мкМ раствор алкилирупцего олигонуклеотидного производного, что давало среднюю концентрацию реагента в мухе 5 мкМ и меньше. На рис II (дорожа 9) приведена авторадиограмма электрофоретического разделения белков имаго при средней концентрации производного олигонуклеотида в

kDa 1 2 3 4 5 6 Г 8 9 10 11 12 13 14

siart»

90»

50, U> 39'

Рис.11 Белки имаго Drosophila melanogaster, модифицируемые ал-килиругщим производным олигонуклетида. Электрофорез в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 1-4 -белки яичников инкубировавшихся 30 мин. в растворе 21, 10.5, 5.25, 2.6 мкМ реагента, соответственно; 5,11 - яичники самки, инъецированной 5 пмоль реагента (через 30 мин. после инъекции); 6,8,9 -суммарно белки инъецированной мухи; 7-белки мухи, инъецированной в присутствии избытка немеченого олигонуклеотида; 10- модифицируемые белки мухи с удаленными яичниками; 12,13 - яичники, инкубированные в растворе реагента в отсутствии и присутствии ДНК из спермы лосося , соответственно; 14- экстракт бульбуса, удаленного из инъецированного самца.

гемолимфе 5 мкМ. Хорошо видны три меченые полосы с молекулярными массами 50, 44 и 39 кДа. Виден также набор полос в более низкомолекулярной области. Здесь же (дорожки 13 и 7, рте II) приведены электрофоре граммы белков, алкилируемых в насекомых в присутствии конкурентов: ДНК, в средней концентрации в имаго 10 мкг мл (т.е. около 25 мкМ в пересчете на нуклеотид или 0,1 мкМ ДНК со средней длиной 200 нуклеотидов) и олигонуклеотида рТ(СТ)6, в концентрации 100 мкМ. Видно, что добавление олигонуклеотида в такой концентрации полностью подавляет модификацию белков. Модификация также частично ингибируется в присутствии ДНК, хотя ее концентрация в мухе недостаточно высока (около 2 мкМ в пересчете на декануклеотид при концентрации алкилирукщего производного 5 мкМ). При концентрации олигонуклеотида 10 мкМ наблюдается интенсивная модификация в основном одного белка 39 кДа. При етом в интервале концентраций 2,5 - 20 мкМ реагента не наблюдается существенного увеличения уровня модификации белка 39 кДа (рис.11, дорожки 1-4). Добавление конкурента рТ(СТ)е в концентрации 200 мкМ

практически полностью ингибирует включение метки в белок (рис.II, дорожка 7). Эти данные определенно свидетельствуют, что уже при

концентрации 2,5 мкМ наблюдается_______насыщение_______связывания ----

олигонуклеотидов с исследуемым белком. Кроме белка 39 кДа на электрофореграмме присутствует белок 90 кДа, модифицируемый так же, как и 39 кДа, алкилирукщим реагентом, при этом реакция ингибируется как избытком холодного олигонуклеотида, так и присутствием ДНК спермы лосося в концентрации 40 мкг/мл, что практически не препятствует модификации белка 39 кДа (дорожки 12, 13). По-видимому, белок 90 кДа имеет большее сродство к полимерной ДНК. У самцов присутствует добавочная полоса 32 кДа, при этом 'только эта полоса присутствует на в лектрсфорегр w.c¿s белков бульбусов (bulbus еJaculatorius), алкилируемых в инъецированных реагентом самцах (дорожка 14).

ВЫВОДЫ

1. С целью получения в условиях радиохимической лаборатории меченых олигонуклеотидов в количествах и с качеством, удовлетворяющих требованиям экспериментов in vivo, оптимизирован метод синтеза (7~^2Р]-АТФ и разработана эффективная технология получения производных олигонуклеотидов высокой молярной активности.

2. Исследовано распределение по органам мыши олигонуклеотидов и их производных при различных способах введения. Показано, что олигонуклеотида, введенные внутривенно и внутрябрюшинно, быстро, в течение нескольких минут распространяются по тканям организма, накапливаясь преимущественно в органах ретикуло-ендотелиальной системы.В течение 4 часов 24% олигонуклеотидного производного выводится с мочой.

3. Изучена стабильность олигонуклеотидов в организме.

Олигонуклеотида разрушаются в различных тканях с разными скоростями: через 30 минут после введения сохраняется 5-50% неразрушенных олигонуклеотидов, в зависимости от ткани. Показано, что защитные группы на 3* и 5'- концах олигонуклеотида предохраняют олигонуклеотид от деградации. Наиболее аффективно предохраняют олигонуклеотид от деградации холестериновая группа на 3'- конце и бензиламинная группа на 5'- конце.

4. Исследована возможность введения олигонуклеотидов животным

неповревдающими методами. Показано, что

олигонуклеотиды

способны проникать в организм через слизистые оболочки и коку. Эффективность проникновения олигонуклеотидов в органы и ткани мыши убывает в ряду : внутривенно, внутрибрюиинно, подкожно, интраназально, интравагинально, в виде лосьона на коку. Использование процедуры электрофореза или наличие детергента в растворе при аппликации о лцгонукле о тида на коку кшютного существенно увеличивают эффективность проникновения в органы и ткани.

5. Исследовано взаимодействие алкилируицих производных с белками различных тканей. Показано, что клетки различного происхождения содержат белки, связывающие олигонуклеотиды. Обнаружены тканеспецифические белки, связываание олигонуклеотиды у млекопитающих (маши) и насекомых (дрозофила).

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Карамышев В.Н., Власов В.В., Зон Г., Иванова Е.М., Якубов Л.А. Распределение олигонуклеотидных производных и их стабильность в тканях мышей. Биохимия, 1993, т.86, Н4, с.590-598.

2. Якубов Л.А..Карамышев В.Н., Власов В.В., Савинкова И.В., Щербаков Д.Ю. Олигонуклеотидсвязывакщие белки Drosophila: свойства и тканевая специфичность. Молекулярная биология, 1991, т.25, с.1611- 1614.

3. Bazanova О.Ы., Yaku'aov L.A., Vlassov V.V., Kuligina .A., Abdukayuznov M.N., Karamyshev V.N., Zon G. Oligonucleotide derivatives in organism: distribution among organs, rates of release and degradation. Nucleosides & Nucleotides, 1991, v.10, p.523-526

4. Yakubov L.A.,.Yurchenko L.V., Nechaeva M.N., Rycova E.N., Karamyshev V.N., Tonoinson J., Vlassov V.V., Stein C.A. Interaction of oligonucleotides with cellular receptors. Nucleic Acids Res. Symposium Ser., 1991, p.2431-2432.