Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доставка олигонуклеотидов в ткани и органы животных: естественный транспорт нуклеиновых кислот в организм и системы, повышающие его эффективность

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Доставка олигонуклеотидов в ткани и органы животных: естественный транспорт нуклеиновых кислот в организм и системы, повышающие его эффективность"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

Р Г Б ОД

« на правах рукописи

УДК 577.113.4 + 577.Г3

Нечаева Марина Васильевна

ДОСТАВКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ТКАНИ И ОРГАНЫ ЖИВОТНЫХ: ЕСТЕСТВЕННЫЙ ТРАНСПОРТ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ОРГАНИЗМ И СИСТЕМЫ, ПОВЫШАЮЩИЕ ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 1994 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители:

член-корр. РАН В.В. Власов к.б.н. Л.А. Якубов

Официальные оппоненты:

д.б.н. Г.М. Дымшиц к.х.н. М.А. Зенкова

Ведущая организация: ВНИИ молекулярной биологии (НПО "Вектор", Кольцово)

Защита состоится часов на заседании совета по защите диссертаций К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

¿Г

Н"Л"

Автореферат разослан " ¿¿" 1994 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций к. х. н.

О.С.Федорова

Общая характеристика работы

_Актуальность проблемы. Разработка эффективных методов введения

нуклеиновых кислот в живую клетку необходима для развития нескольких направлений молекулярной биологии и медицины. Среди них в первую очередь следует отметить генную терапию, включающую введение в клетки новых генов с целью коррекции генетических дефектов, а также генную иммунизацию, основанную на введении в организм нуклеиновых кислот, кодирующих необходимые для иммунизации белки. Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с определенными последовательностями одноцепочечных и двуцепочечных нуклеиновых кислот, открывает широкие возможности для лечения инфекционных заболеваний, а также для модуляции уровня экспрессии генов, ответственных за развитие определенных биохимических процессов в организме. Метод прямых инъекций, используемый в настоящее время для введения нуклеиновых кислот животным и пациентам, нельзя считать оптимальным: препарат быстро вымывается из организма и для поддержания терапевтически эффективных его концентраций необходимы многочисленные последовательные инъекции. Кроме того, этот метод не позволяет вводить нуклеиновые кислоты локально. В связи с этим актуальной задачей в настоящее время является изучение возможностей неповреждающих методов введения нуклеиновых кислот и разработка подходов для их локальной доставки в живые организмы.

_Целью настоящей работа являлось исследование неповреждающих

методов доставки с точки зрения их пригодности для введения нуклеиновых кислот в организм животных, а также разработка методов локальной доставки олигонуклеотидов. Для понимания механизмов терапевтического действия олигонуклеотидов необходимо было проследить за судьбой этих молекул в клетке, поэтому в задачу исследования входило изучение внутриклеточной локализации производных олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей диссертационной работе впервые применен и охарактеризован непов-реждающий метод введения нуклеиновых кислот в организм животных - через слизистые оболочки глаза. В процессе разработки подходов для локальной доставки олигонуклеотидов оптимизирован метод электро-форетического введения препарата в солидную подкожную опухоль мыши, при этом отмечен низкий уровень деградации олигонуклеотидов, экстрагированных из опухоли и мочи животного после электрофоретичес-

кой процедуры. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность использования катионных липидов (диоктадециламипоглицилспер-мина) для локальной доставки олигонуклеотидов в скелетные мышцы мышей. Показано, что олигонуклеотиды в комплексе с катионными липидами, инъецированные внутримышечно здоровым животным, удерживаются в месте введения в течение нескольких часов, при этом они устойчивы к действию нуклеаз организма в течение всего периода депонирования, что делает их потенциально пригодными для локального введения в солидные и асцитные опухоли животных. Исследована внутриклеточная локализация холестеринового и биотинового производных олигонуклеотидов. '

_Ну^ятгагрта и яттргУтдшта рд>Уггт.т По материалам диссертации опубликовано б печатных работ. Материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (СССР, Москва, 1991) и на 21-м международном симпозиуме по контролируемой доставке биологически активных материалов (Франция, Ницца, 1994).

_Структура и объем работы Диссертация изложена на А*' страницах,

включающих 21 рисунок, 2 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы.

Содержание работы Некоторые; характеристики транспортировки олигонуклеотилов через

слизистые оболочки глаза К наиболее оптимальным неповреждающим методам доставки ле-картв в организм фармакологи относят введение препарата через глаз. Для исследования возможностей этого метода с точки зрения его пригодности для введения нуклеиновых кислот в организм животного (и далее в работе по фармакокинетике) были использованы олигонуклеотиды: рАСТС (рЛГ4); рСАСАСССАСА (рЛГ10); рТСАСССТСТТСССАТС (рЕ1б), комплементарный фрагменту РНК белка Е вируса клещевого энцефалита; рСССТГССССССАААААСААССС (рЛ^), комплементарный фрагменту регуляторной области онкогена с-тус; октадекатимиди-лат рТ1д, а также его холестериновое производное рТ^рСЛо./. Для защиты 5'-[32р] фосфата от действия фосфатаз организма по 5'-концу олигонуклеотидов присоединяли бензиламин (Яг-).

3

FtexL Завизвксш наютления сшито нуклесгщгув во внутренних орга-1ИХ мыши от Бремени после введения 2мкл 150 мкМ

[згп-лчди

(3x10® (имп в мин)/ мкл) в глаз живсгг-нш 1 - печень, 2

- юта, 3 - гонк-реатач. жеяеза, 4

- селезенка, 5 -сердце, 6 - кровь*

На рис. 1 представлены данные по кинетикам накопления радиоактивного материала в крови и органах мышей после введения водного раствора в глаз животного. Концентрация [32р]-олн-гонуклеотида в кровотоке достигает максимума через 1 час после впе-дения, затем его уровень снижается, через 1,5 часа препарат, накапливается преимущественно в печени и почках.

Для. анализа сохранности бензиламидных производных олигонуклеотидов в организме животного материал, полученный из органов и тканей после фенольной депротеинизации, анализировали электрофорезом в денатурирующих условиях (рис. 2). Видно, что скорость разруше-" ния олигонуклеотидов в разных органах различ-

Рис2. Элегарофоретическое разделение (20% ПААГ, 7М мочевина) материала из внутренних срганов мыши через 30 мин после закапывания 2 мкл 150 мкМ [32Р}-.а^Е16 (3x10® (имп в мин)/мкл) в глаз живошсго (радиоавпжраф геля) 1 - кровь, 2 - печень, 3 - селезенка, 4 - моча Старт обозначен значкам >, Bz-pEj6 - положение исходило алигонуклеащца, Вг-pN ~ менмуклеощц 32р _ неорганический фосфат. .

на. Через 30 минут после введения практически недеградированный олигонуклеотид [32pj.Bz.pEjg присутствует и образце крови (дор. 1). В печени содержание исходного олигонуклеотида незначительно, радиоактивный материал представлен набором молекул длиной от 12 до 5 нуклеотидов, мононуклеотидом и неорганическим фосфатом (дор. 2). В электрофореграмме образца селезенки присутствуют две полосы, одна из них соответствует олигонуклеотиду длиной около 8, другая -неорганическому фосфату (дор. 3). В моче обнаруживается набор частично деградированных молекул (дор. 4).

Зависимость количества олигонуклеотида, накапливающегося в организме, от дозы препарата при введении через глаз приведена на рис. 3. Видно, что все графики имеют вид кривых с насыщением при достижении концентрации [32р]-Вг-рЕ1б 100-200 мкМ во вводимом растворе. Явно нелинейный характер кривых может свидетельствовать в пользу того, что транспорт олигонуклеотидов через слизистые оболочки глаз протекает через образование специфичного комплекса.

(имп в мин)/мг

Концентрация олигонуклеотида, мкМ

РиеЗ. Зависимость количества сшигонуклесгщца, проникающего в организм через слшжпък оболочки глаза через 30 мин после введения 2 мкл

[32р].^Е16 (1,5x107

(имп в мин)/нмоль) от концешрации препарата Использованы следующие конценг-рации одигонуклеотда: 11, 22, 33, 66, 100, 200, 300 мкМ 1 - почки, 2 - печень, 3 -панкреатическая железа, 4 - кровь, 5 - селезенка, 6 - сердце.

Возможно, олигонуклеотиды проникают в организм, используя полианионсвязывающие центры систем активного транспорта слизистых оболочек. В таком случае эффективность этого процесса должна снижаться в присутствии избытка полианионов различной природы. Данные по влиянию некоторых конкурентов на эффективность транспорта олигонуклеотида [32Р]-Вг-рЕ1в при ведении через глаз представлены на рис.4. Видно, что все конкуренты в условиях 100-кратного мольного избытка в той или иной степени снижают эффектив-(имп в мин)/мг

140

Рис.4. Л^^фамма, демякприруквдэя эффектвахть прсникжвения ашгснуклеопвдэв в организм мыши через 30 мин пекле введения в глаз 2 мкл 150 мкМ раствора ife-pEjg (1,5x10^ (имп в мин)/нмсщь) в физрастворе (1) и в присутствии различных ингибиторов - 1 мМ растаорсв тлианиенных красителей актавкго красного 17.1 (2) и цибакронавспэ синего 3GA (3), немеченого ife-pEjg (4), гепаран сульфата (5), а также озвученной ДНК в кенцегарации 5 мг/мл (6)

ность процесса, что указывает на присутствие полианионсвязывающих молекул, участвующих в транспорте олигонуклеотидов через слизистые оболочки глаза.

Для дальнейшей характеризации процесса была изучена зависимость эффективности транспорта от длины олигонуклеотида (рис. 5). Видно, что более крупные олигонуклеотиды проникают в организм несколько эффективнее мелких. Обратная зависимость эффективности этого процесса от размера олигонуклеотида может служить подтвержде-(имп в мин)/мг

2 3 4 5 6

Рис.5. Зависимость эффективности проникновения олигонуклесггидав в организм животного через глаз от длины олигонуклеощца (пктарамма) Мышам закапывали в глаз по 2 мкл 150 мкМ раствора (44х1(Г имп в мин) одюго из используемых олиго-нуклесгщдов (Bz-pN^, Bz-pN\Q Bz-pEjg, иди Bz-pN^ Через 30 мин образцы крови (1), сердца (2), селезенки (3), псдаселудсгшзй железы (4), печени (5) и почки (6) анализировали на содержание 32 р.

нием функционирования транспортного механизма, отличного от диффузии, обеспечивающего проникновение олигонуклеотидов в организм животного.

Для того, чтобы оценить вклад диффузии в этот процесс было изучено влияние детергентов во вводимом растворе на скорость накопления радиоактивного материала в организме. Было показано, что присутствие 1%-ных водных растворов БОБ, Т\уееп-80, Вп]-35, Тгиоп-114, и дезоксихолата натрия во вводимом растворе [^2р]-Дг-рЕ1д не влияет существенным образом на уровень его накопления в организме. Это позволило заключить, что диффузионная составляющая этого процесса невелика.

При введении набора фрагментов рестрикции плазмиды рВМЯЗ (20 мкг в объеме 5 мкл физраствора) в глаз животного было показано, что полимерные двуцепочечные ДНК размером до 700 п.о. также способны проникать в организм через слизистые оболочки глаза.

Локальная лоставка олигонуклеотилов в организм животного

Для локальной доставки олигонуклеотидов [32р]-В2-рД^22 в подкожную опухоль молочной железы был использован электрофо-ретический метод. После электрофоретического введения концентрация олигонуклеотида в опухоли неоднородна: наибольшее количество содержится в 1-м слое, ближайшем к месту приложения электрода (рис. 6).

Рис.6. Распределен!»? радгаэакгавнсго материала в срганизме мыши после алегаро-форешческаго введения (2 мА, 50 мин) 1 ЕМОЛЯ (4х107 имп в мин) [32Р]-&-рЛ^2 в сапвдрую опухоль живсанага Образцы внутренних органов и 3-х слоев опухоли (толщина слоя - 3-4 мм) анализировали на содержание ^Р. 1-й слой, подкожный, 2-й - из середины опухоли и 3-й-наиболее удаленный от места введения алигануклеащдэ.

О 20 40 60 80 100 (имп в мин)/мг

По мере удаления от этой поверхности вглубь опухоли концентрация препарата падает: очевидно, олигонуклеотиды, проникая в кровеносные сосуды опухоли, разносятся кровотоком по всему организму; при этом реализуется'типичный механизм системного распределения препарата с максимальной его концентрацией в печени и почках.

Для увеличения времени контакта олигонуклеотидов с клетками опухоли было использовано два подхода. Первый - это прямые инъекции в опухоль холестеринового производного олигонуклеотида, второй - инъекции в опухоль олигонуклеотидов в комплексе с кати-онными лшшдами. Для образования нуклеолипидного комплекса использовали диоктадециламиноглицилспермин (Трансфектам). Первоначально была исследована фармакокинетика олигонуклеотида [32р\-Bz-рЕ1б, инъецированного внутримышечно в составе нуклеолипидных комплексов здоровым животным.

На рис. 7 представлены зависимости вымывания из

мышечной ткани от времени после внутримышечных инъекций препарата в водном растворе и в составе нуклеолипидных частиц. Видно, что олигонуклеотиды в комплексе с Трансфектамом удерживаются в месте инъекции не менее 5 часов. Содержание радиоактивного материала в мышцах контрольных мышей, инъецированных

(имп в мин)/мг

Рис. 7. Кинетики вымывания радизакшв-юто материала из мышечвсй таани живот-

ного после внутрммы- 10004

шечшй инъекции 03 нмаля (4.4x11У имп в

мин) [32р]-.а?-рЕ1б в ЮО:

комплексе с катанными липвдами (о) и в физрастворе (д, контрольные животные).

1000

10

0 1 2 3 4 5 Время, часы -

6

олигонуклеотидом в физрастворе, уже через 1 час после инъекции было .. на два порядка ниже соответствующих значений для опытных мышей.

Олигонуклеотиды в составе комплекса с катионными липидами защищены от действия нуклеаз: электрофоретический анализ сохранности олигонуклеотидного материала, экстрагированного из мышечной ткани через 1, 3 и 5 часов после инъекции, показал практически полную сохранность олигонуклеотидов (рис. 8). - -

Рис. 8. Элеюрофорегоческий анализ (20% ПААГ, 7М мочевина) радиэакшвного материала, экстрагированиях) из мышечжй ткани жи-вотнсго после внутримышечных инъекций 03 нмояя (4.4х107 имп в мин) [32РЬ8г-рЕ1б в физ-расгаоре (кошроль) и в комплексе с катажными липццами (спыг), радиэавтяраф геля Дор1 1 и 6 - алегарофорефаммы исходило олигснуклео-•щца [З-РуВг-рЕк;, дер 2 - материал экспраш-рованный га мышечной таани кситрольняо животного, дор. 3, 4 и 5 - экстракпл мышеч-нзй ткани спытаых жиаогаых, полужиные через 1, 3 и 5 часов после инъекций, соответственна > - старт, BípN-мсниуклеопзд, ^р - неорганический фосфат.

Олигонуклеотиды, инъецированные внутримышечно в составе комплексов с катионными липидами, после определенного периода депонирования в месте введения (2-3 часа) начинают накапливаться во внутренних органах животного. После внутрибрюшинных инъекций 0,3 нмолей (44х107 имп в мин) [32Р]-Вг-рЕ1б в комплексе с Трансфектамом олигонуклеотид пояляется в крови через 1 час после введения, его концентрация в органах растет в течение 5-7 часов после инъекции.

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о потенциальной пригодности катионных липидов мя местного депонирования олигонуклеотидов. Помимо создания высоких концентраций препарата в месте введения при этом обеспечивается его пролонгированное действие.

Для прямых инъекций в солидные и асцитные опухоли мышей были использованы нуклеолипидные комплексы олиготимидилата [32р]-Вг-рТ18. а также его холестериновое производное [^2р\-Bz-рТ^рСЛоЛ Контрольным мышам инъецировали равное количество олигонуклеотида в физрастворе (рис. 9). Максимальное

содержание радиоактивного материала (в 20 раз выше контрольного) через 2 часа после введения в солидные опухоли наблюдается в случае инъекций нуклеолипидных частиц. Для холестеринового производного это превышение составило примерно 2 раза. Количество олиготимидила-

асцитная асцитные солидная жидкость клетки опухоль

Рис. 9. Гисггирамма распределения радиоактвнсго материала в солидных и асцигаых карцинжах Кребс-2 через 2 часа после прямых инъекций [32 р}-олигсиуклеащда и его холесгерадввсго пролнщоднога Мышам с солидными и асцигными опухолями инъецировали в спухоль 20 мкл 15 мкМ раствора (5x10е имп в мин на мышь) в комплексе с катианными липцдами (черный цвет на шгпхрамме) Другсй 1руппе мышей иньецирсвали равное количество холесгерижюаго прамзводшго [32р]-^-рТ13Р Сйа/ (белый цвет) Контрольным мышам инъецировали раввэе количество в физрастворе (запприхсванньк столбики на

гастирамме)

та, связанного клетками асцитных опухолей, в случае инъекции нуклеолипидных частиц в 2,5 раза, а для холестеринового производного в 1,5 раза больше по сравнению с контролем. Удельная радиоактивность асцитной жидкости после инъекций нуклеолипидных частиц не превышает контрольную, в случае же использования холестеринового производного возрастает в 2,5 раза, вероятно, за счет образования специфических комплексов холестериновой группы с гидрофобными структурами асцитной жидкости.

Электрофоретический анализ сохранности препарата, экстрагированного из солидных и асцитных карцином через 2 часа после инъекций олигонуклеотида в комплексе с Трансфектамом, холестеринового производного и олигонуклеотида в водном растворе (рис. 10), показал, что значительная часть исходного олигонуклеотида присутствует как в первой, так и во второй группе опытных мышей. В опухолях

Рис.10. Элсктрофоре-таческий анализ (20% ПААГ, 7 М мочевина) радиоактивного материала, зкстратараван-вэго из солидных и ас-цишых карцишм через 2 часа после инъекций 20 мкл 15 мкМ раствора [-ЙР^Вг-рТ^д (5x10® имп в мин) в комплексе с Трансфектамом (Тр), холес-теривэваго производного

(СЬ) и водного раствора [32РЬ^Т18 (К), ра-диэевгаграф геля Дор 1 - исходный олигонуклествд Первые дорожки в каэвдсй группе (№ 2, 5, 8) -материал, экстрагированный из солидных опухолей; следутоцц-к? три (№ 3, 6, 9) -асцигные клетки; последние дорожки (№ 4, 7,10) - асцишые жидкости > - старт, Вг-рТ^й - положение лсходгазго алигонуклеащца, - неорганический фосфат.

контрольных мышей, инъецированных равным количеством олиготими-дилата в физрастворе, недеградированный олигонуклеотид отсутствует.

Таким образом, данные' по фармакокинетике олигонуклеотидов в составе нуклеолипидных комплексов и олигонуклеотидов, несущих на 3'- конце холестериновую группу, позволяют заключить, что оба этих подхода являютя перспективными с точки зрения создания фармакологических агентов на основе олигонуклеотидов.

Внутриклеточная локализация произволных олигонуклеотилов

Для понимания механизмов терапевтического действия олигонуклеотидов необходимо проследить за судьбой этих молекул внутри клетки. Чтобы избежать потерь при субклеточном фракционировании и обработке ультратонких срезов клеток для исследования внутриклеточной локализации были использованы алкилирующие производные олигонуклеотидов.. В качестве реакционноспособной группы использовали остаток 4-[(Ы-2-хлорэтил-ГЧ-метил)амино]-бензяламина (RC1-).

Для изучения внутриклеточного распределения холестеринового производного декатимидилата, несущего алкилирующую группу, клетки асцитной карциномы Кребс-2, инкубированные в течение ¡2 час в 2 мкМ растворе этого реагента, фракционировали и определяли содержание холестеринового производного [32Р]-ДС/-рТюрСйЫ в клеточных фракциях (табл.1).

Табл.1. Содержание [32p]-.RC7-pTiopCAo7 в клеточных фракциях асЦитной карциномы Кребс-2

Клеточная фракция Связавшийся материал, %

Ядро 31,3 + 6,7

Цитозоль 25,2 ± 4,8

Мембраны 7,1 + 2,4

Лизосомы 0,4 ± 0,1

Из таблицы видно, что около трети радиоактивного материала клетки связано с ядрами, около четверти - с цитозолем, значительная

часть присутствует в мембранной фракции. Менее всего холестеринового производного связано с фракцией лизосом. Было предположено, что транспорт холестеринового производного в ядро обусловлен наличием на молекуле олигонуклеотида холестериновой группы.

Для визуализации данных о судьбе олигонуклеотида в клетке было исследовано внутриклеточное распределение биотинового производного гексадекатимидилата , также несущего

алкилирующую группу (7?С7-рТ[бр-В/о), на уровне электронной микроскопии.

На ультратонких срезах клеток линии А-9, инкубированных в 2 мкМ растворе ЯС/-рТ] ^р-В/о в течение 10 мин, была обнаружена локализация метки в клеточном ядре (рис. 11). Отдельные золотые гранулы вне ядра не связаны с цитозольными структурами.

Рис. 11. Распределение золотых гранул комплекса стрегтгавццин : золото (показаны стрелками), проявляющего биотин на ультратонком срезе клеток линии А-9, инкубированных в 2 мкМ ЯС'1-рТ)бр-В/о в течение 10 мин я - ддро, ц - цитоплазма Увеличение в 20 ООО раз.

Контроль на свободный биотин показал, что он также проникает в клетку, но при этом распределяется равномерно между ядром и цитоплазмой, в ядре клетки биотин не накапливается.

Чтобы исключить возможность артефактов, связанных с вымыванием неприсоединенных ковалентно олигонуклеотидов и их попаданием в ядро уже на стадии обработки клеточных срезов, были проведены контроли с биогиновым производным олигонуклеотида без алкилирующей группы (рТ^р-Л/о, 2 мкМ раствор). Было показано, что это приводит к существенным потерям метки, оставшаяся же метка равномерно распределяется по клетке без фиксации на каких бы то ни было клеточных структурах.

-... •' -ч; .. • ' Й

•л. л • ;

> ■

Таким образом, после первых же минут инкубации олигонук-леотид оказывается локализованным в клеточном ядре. Быстрота этого процесса, возможно, связана с функционированием специфического механизма транспорта нуклеиновых кислот в ядро.

Выводы

1. Впервые исследован процесс проникновения нуклеиновых кислот в организм животных при использовании неповреждающего метода введения - через слизистые оболочки глаза. В результате исследования показано, что:

а) доставка олигонуклеотидов в организм животного при этом способе введения осуществляется за счет функционирования систем активного транспорта слизистых оболочек: данный процесс имеет дозозависимый характер, его эффективность снижается в присутствии конкурентных ингибиторов полианионной, природы, при уменьшении длины олигонуклеотида и слабо зависит от наличия детергентов во вводимом растворе;

б) данный метод обеспечивает системное распределение препарата - через 10-15 минут после введения недеградированные олигонуклеотиды попадают в кровь и разносятся кровотоком по всему организму;

в) крупные фрагменты двуцепочечной ДНК (до 700 п.о.) также способны проникать в организм животного при введении их через глаз.

2. Исследована возможность применения электрофореза для доставки олигонуклеотидов через неповрежденный кожный покров в солидные опухоли. Показано, что максимальная концентрация олигонуклеотида наблюдается в подкожном слое опухоли, ближайшем к месту приложения отрицательного электрода, и падает по мере удаления от этого слоя; при этом деградация олигонуклеотидов, экстрагированных из опухоли и мочи животного, незначительна.

3. Впервые изучена возможность доставки олигонуклеотидов в составе нуклеолипидных комплексов в организм животного, в результате чего:

а) показано, что внутримышечные и внутрибрюшинные инъекции таких комплексов здоровым животным обеспечивают пролонгированное действие препарата: постепенное накопление олигонуклеотида в крови и органах начинается через 1 час после введения и продолжается в течение 5-7 часов; кроме того, внутримышечное инъецирование дает возможность поддержания высокой локальной концентрации препарата в месте введения в течение 5 часов, при этом олигонуклеотиды устойчивы к действию нуклеаз в течение всего периода депонирования;

б) исследована пригодность катионных липидов для локального введения олигонуклеотидов в солидные и асцитные опухоли мышей. Показано, что в составе нуклеолипидных комплексов олигонуклеотиды медленнее вымываются из опухолевой ткани и проявляют значительно более высокую устойчивость к действию нуклеаз, чем олигонуклеотиды, инъецированные в водном растворе.

4. Изучено внутриклеточное распределение производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие группы. С применением метода электронной микроскопии показана локализация олигонуклеотида в ядре клетки после непродолжительной (10 мин) инкубации культуры клеток с его биотиновым производным, что свидетельствует в пользу функционирования специфического механизма транспортировки нуклеиновых кислот в клеточное ядро. Исследовано распределение холестеринового производного олигонуклеотида по субклеточным фракциям.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Yakubov, L.A., Nechaeva, M.V., Rykova, E.Yu., Vlassov, V.V. Interaction of oligonucleotide derivatives with animal cells and their fate in animal organism. Synthetic oligonucleotides: Problems and Frontiers of Practical Application. International Symposium Abstracts (Moskow,

U.S.S.R.). 1991, p. 195. ♦

2. Ryte, A.S., Karamyshev, V.N., Nechaeva, M.V., Guskova, L.V., Zarytova, V.F., Vlassov, V. V. Interaction of cholesterol conjugated alkylating

oligonucleotide derivatives with cellular biopolymers. FEBS Lett. 1992, v. 299, p.124-126.

3. Nechaeva M.V., Behi J.-P., Karamyshev V.N., Yakubov L.A., Vlassov V.V. Oligonucleotide delivery in mice. Proceed. Intern. Symp. Conti. Rel. flioacf. Mater., 21 (1994), Controlled Released Sosiety, Inc.

4. Власова И.Е., Нечаева M.В., Власов В.В. Системы доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Успехи современной биологии, 1994, № 6, с. 7<S"- 92.

5. Vlassov V.V., Nechaeva M.V., Karamyshev V.N., Yakubov LA. Ion-tophoretic delivery of oligonucleotides into mouse mammary gland tumor. Antisense Research and Development, 1994, v. 4, № 4, p. 29/-293.

6. Vlassov V.V., Yakubov L.A., Karamyshev V., Pautova L., Rykova E. and Nechaeva M. In vivo pharmacokinetics of oligonucleotides following administration by different routes. In: Delivery strategies for antisense oligonucleotide therapeutics. S. Akhtar, éd., CRC Press, 1995, p. 71-83.

Подписано к печати 20.10.94 Формат 64 х 84 1/16 Объем 1 печ.л. Заказ Ю Тираж 100 экз.

Полиграфический участок 630090, Новосибирск, пр.акад

НИБХ СО РАН .Лаврентьева, 8