Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигонуклеотидные ингибиторы ДНК-метилтрансферазы 1 человека и их влияние на аберрантное гиперметилирование ДНК в раковых клетках

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Олигонуклеотидные ингибиторы ДНК-метилтрансферазы 1 человека и их влияние на аберрантное гиперметилирование ДНК в раковых клетках"

На правах рукописи

Кузнецов Виталий Викторович

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА АБЕРРАНТНОЕ ГИПЕРМЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК В РАКОВЫХ КЛЕТКАХ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 /ШГ 2015

Кольцове - 2015 005571384

005571384

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный руководитель: Нетесова Нина Александровна, доктор

биологических наук, заведующая лабораторией разработки средств ПЦР-диагностики вирусных и риккетсиозных заболеваний ФБУН

«Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Официальные оппоненты: Дейнеко Елена Викторовна, доктор биологических

наук, профессор, заведующая лабораторией биоинженерии растений ФГБНУ «Федерального исследовательского центра Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Брускин Сергей Александрович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией функциональной геномики ФГБУН «Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук»

Защита состоится «25» сентября 2015 г. в 11— часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцове, Новосибирского района, Новосибирской области, 630559, тел. 8 (383) 336-74-28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» http://www.vector.nsc.ru

Автореферат разослан «03» августа 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

В.А. Белявская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Несмотря на то, что все клетки человеческого организма несут одинаковую генетическую информацию, в ходе клеточной дифференцировки формируется более 100 различных цитотипов. Основная роль в этом процессе принадлежит системе метилирования ДНК, регулирующей транскрипционную активность генов.

Профиль метилирования ДНК эукариот поддерживается ферментом ДНК-метилтрансферазой I (МТазой Dnmtl), которая обеспечивает модификацию вновь синтезированной цепи ДНК при ее репликации. Известно, что метилирование ДНК является ключевым эпигенетическим механизмом, контролирующим не только экспрессию генов, но и родительский импринтинг, инактивацию Х-хромосомы, поддержание целостности генома клетки и его защиту от встраивания ретровирусов и транспозонов (Jurkowska et al. 2011). Аберрантное метилирование ДНК может способствовать развитию неврологических, психических, эндокринных заболеваний (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, аутизм, шизофрения, сахарный диабет II типа и др.), а также возникновению и прогрессии опухолей (рак молочной железы, яичников, шейки матки и др.) (Feinberg 2007, Jones and Baylin 2007).

Сбои в работе Dnmtl обусловливают масштабные изменения паттерна метилирования ДНК, включающие гиперметилирование CpG-островков (последовательностей, содержащих кластеры CpG-динуклеотидов) в составе генных промоторов или первых экзонов. Избыточное метилирование регуляторных областей, сопровождающееся подавлением транскрипции генов, рассматривается в настоящее время как альтернативный механизм (наряду с мутациями) инактивации большой группы генов-супрессоров опухолевого роста (ГСО), инвазии, метастазирования, неоангиогенеза, в том числе генов системы репарации ДНК и регуляции апоптоза, утрата функций которых обнаруживается на ранних стадиях опухолевой прогрессии (Lavric et al. 2002).

Поскольку присоединение метальной группы к цитозину в составе ДНК не приводит к изменению генетического кода, использование ингибиторов МТаз позволяет добиться реактивации генов-онкосупрессоров, приводящей к обратному развитию опухоли (Delpu et al. 2013). В настоящее время допущены к применению аналоги цитидина (Vidaza®, Dacogen®) для терапии острого миелоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома (Singh et al. 2013). Однако помимо высокой эффективности данные препараты обладают сильным токсическим и мутагенным эффектом. Таким образом, остается актуальным поиск прямых ингибиторов МТаз, обладающих наряду с противоопухолевой активностью умеренным воздействием на нормальные клетки.

Цель работы: разработать олигонуклеотидные ингибиторы ДНК-метилтрансферазы 1 человека и изучить их влияние на аберрантное гиперметилирование ДНК в раковых клетках (на примере карциномы шейки матки).

Задачи исследования: 1. Сконструировать и синтезировать конкурентные олигодезоксирибонуклеотидные ингибиторы Dnmtl человека, как наиболее близкие к природному субстрату фермента — клеточной ДНК.

2. Оценить субстратные свойства и ингибирующий потенциал полученных олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) in vitro.

3. Изучить локализацию и устойчивость ингибиторов Dnmtl в клетках рака шейки матки линий HeLa и CaSki.

4. Сравнить токсическое влияние ингибиторов Dnmtl на клетки рака шейки матки (HeLa и CaSki) и неопухолевые клетки (на примере линии L-68).

5. Оценить деметилирующий эффект ингибиторов Dnmtl в отношении гиперметилированных регуляторных районов генов-супрессоров опухолей CDKN2A, DAPK, MGMT, RARB и RASSF1 в клетках HeLa и CaSki.

Научная новизна. Впервые получены высокоаффинные ингибиторы Dnmtl, сконструированные на основе выбранной базовой 22-звенной последовательности 5'-GAAATGGATCCGCTCTAAACTG-3' (и комплементарной ей цепи).

Установлено, что в условиях эксперимента выбранные ОДН характеризуются высокой проникающей способностью и устойчивостью в ядрах опухолевых клеток.

Показано, что полученные синтетические структуры обладают способностью эффективно подавлять рост клеточных культур карциномы шейки матки в сочетании с низкой токсичностью в отношении нераковых клеток.

Для оценки деметилирующего эффекта полученных ингибиторов применен метод GLAD-ПЦР анализа (Glal digestion and Ligation Adapter Dependent ПЦР), впервые разработанный и запатентованый автором совместно с А.Г. Акишевым, к.б.н. М.А. Абдурашитовым и д.х.н., проф. С.Х. Дегтяревым.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании влияния ингибиторов Dnmtl на аберрантное гиперметилирование ДНК в клетках карциномы шейки матки, развивают современные представления о роли эпигенетических изменений в патогенезе злокачественных опухолей.

Полученные данные о высокой ингибирующей активности синтезированных ОДН в сочетании с их устойчивостью к действию клеточных экзо- и эндонуклеаз и низкой токсичностью в отношении нераковых клеток (индекс селективности > 100) позволяют рекомендовать данные соединения для дальнейших экспериментов с целью получения эффективных противоопухолевых препаратов.

Высокоспецифичный метод GLAD-ПЦР анализа может быть использован для типирования различных образцов ДНК, включая линии опухолевых клеток.

Высокая чувствительность GLAD-ПЦР, позволяющая детектировать порядка 20 пг метилированной ДНК среди суммарного пула, делает предложенный метод перспективным инструментом ранней диагностики злокачественных новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. ДНК-структуры, синтезированные на основе единой базовой последовательности 5'-GAAATGGATCCGCTCTAAACTG-3' (и комплементарной ей цепи) и содержащие модифицированный сайт узнавания фермента 5'-CG-3', обладают выраженными ингибирующими свойствами в отношении Dnmtl. Показано, что сочетание С:А некомплементарности в сайте узнавания, шпилечной структуры и замены фосфатов на фосфотиоаты значительно повышает сродство олигонуклеотида к ферменту.

2. После трансфекции в клетки карциномы шейки матки ОДН ингибиторы способны накапливаться в клеточном ядре, не подвергаясь деградации в течение 48 часов.

3. Наиболее эффективные ингибиторы Dnmtl обладают следующими характеристиками: ингибирование активности Dnmtl in vitro 80-90%, IC50 < 200 нМ,

(ТС5о.нераковых клеток-. г , Л ~

---) наилучшего ингибитора > 100,

Т^-50.раковых клеток

эффективность деметилирования ДНК в клетках HeLa порядка 90%, CaSki — до 80%.

4. Метод GLAD-ПЦР анализа может быть использован для оценки изменения статуса метилирования ДНК в клетках.

Апробация материалов диссертации. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на пяти российских и международных конференциях.

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы (включая две в журналах, входящих в перечень ВАК) и два патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из шести разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 131 странице машинописного текста и включает 17 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 305 источников, включая 10 отечественных и 295 зарубежных.

Вклад автора в диссертационную работу. Все основные эксперименты, представленные в работе, а также анализ полученных данных выполнены автором лично. Дизайн ОДН ингибиторов проводился совместно с к.б.н. A.A. Евдокимовым (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), Работа выполнялась в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор в рамках научных тем организации, а также грантов МНТЦ 3312, US Public Health Service grant from the Fogarty International Center (No. TW00529) и при поддержке Министерства образования и науки РФ по Соглашению № 14.604.21.0102 от 05.08.2014 г. (RFMEFI60414X0102) в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (часть представленных в диссертации результатов приведена в отчете о ПНИ по 3 этапу, раздел 3), в которых автор являлся исполнителем.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались: препарат рекомбинантной Dnmtl (2 е.а./мкл) ("New England Biolabs", США), [3H-CH3]AdoMet (15 кюри/ммоль), инозин-содержащий полимер поли^МС)»поли^МС) длиной 1755 п.н. ("GE Healthcare", Великобритания); AdoMet ("Sigma-Aldrich", США), эндонуклеазу рестрикции Тсщ\ (20 е.а./мкл), MD-эндонуклеазу Gla\ (8 е.а./мкл), высокоактивную Т4 ДНК-лигазу (2000 е.а./мкл), HotStart ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, стабилизатор для GC-ПЦР ("СибЭнзим", Россия) и Tween-80 - производства Sigma (Германия).

Олигодезоксирибонуклеотидные (ОДН) ингибиторы синтезированы ЗАО "Биосан" (Новосибирск), фосфорамидиты модифицированных оснований производства "Glen Research" (США). При получении фосфотиоатов использовали

реактив Beaucage ("Glen Research", США). Концентрации олигонуклеотидов определяли спектрофотометрически. Дуплексные и шпилечные ДНК-структуры получали отжигом олигонуклеотидов — нагревом до 85 °С с последующим плавным охлаждением до комнатной температуры.

Измерение скоростей реакции метилирования ДНК

Реакционная смесь содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 7,8, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 5 % глицерин и 0,1 мг/мл БСА. Концентрации Dnmtl, AdoMet, поли^1-dC)•пoли(dI-dC) и олигонуклеотидов составляли 0,05 е.а./мкл (~ 10"9 М), 10 мкМ, 1 мкМ (в пересчете на сайты) и 1 мкМ, соответственно, либо варьировались согласно типу эксперимента. Реакции запускали добавлением раствора Dnmtl к смеси [3H-CH3]AdoMet и субстратной ДНК (с олигонуклеотидами или без них) до конечного объема 20 мкл. Реакцию метилирования ДНК проводили при 37 °С, время реакции 3 часа. Аликвоты реакционных смесей объемом 18 мкл наносили на диски анионообменных фильтров DE-81 ("Whatman", Великобритания). Фильтры промывали трижды раствором 0,02 М NH4HCO3, дважды дистиллированной водой и один раз 75 %-ным этанолом, после чего фильтры высушивали и подсчитывали их 3Н-радиоактивность в толуолыюм сцинтилляторе на счетчике Mark III ("Searle Analytic", США).

Предварительную оценку субстратных и ингибиторных свойств проводили на основании сравнения степеней метилирования Dnmtl субстрата поли^МС)-поли^МС) (D), синтетических олигонуклеотидных структур (В) и их смесей с субстратом (С). Процент ингибирования реакции метилирования поли^МС)-поли^МС) в смесях вычисляли следующим образом:

1 - (С - В)

Процент ингибирования = 100 % х---

Зависимости активности Dnmtl (А) от концентрации ингибиторов (I) анализировали с помощью программы для нелинейного регрессионного анализа Origin 8.0 ("OriginLab"), вычисляя 50 %-ные ингибирующие концентрации (1С50) согласно

д

стандартному выражению: А =-шах п где п - коэффициент Хилла.

1 + W

Клеточные линии

Для экспериментов использовали клеточные линии HeLa (карцинома шейки матки, ассоциированная с ВПЧ-18), CaSki (карцинома шейки матки, ассоциированная с ВПЧ-16) и L-68 (легочные фибробласты эмбриона человека) из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", посевная концентрация 105 клеток/мл. Использовалась среда Игла MEM (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") с добавлением 5 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

Изучение внутриклеточной локализации олигонуклеотидов в клетках

Для изучения внутриклеточной локализации олигонуклеотидов в клетках HeLa и CaSki использовали флуоресцентно меченные олигонуклеотиды. Клетки культивировали в 6-луночных планшетах на покровных стеклах в 2 мл среды с сывороткой без антибиотиков (18 часов, 37 °С, 5 % С02), затем ее заменяли на среду без сыворотки и антибиотиков. Доставку ОДН в клетки осуществляли с помощью

трансфекционного агента Липофектамин 2000 ("Invitrogen", США) согласно инструкции производителя. Для этого преинкубированные смеси липофектамина и ОДН разводили средой Игла MEM, вносили по 100 мкл в лунки планшета и культивировали клетки в течение 4 часов. Количество ОДН подбиралось согласно условиям эксперимента. Затем среду заменяли обычной ростовой с ампициллином и культивировали еще 24-72 часа, после чего стекла с клетками помещали на 10 минут в 4 % раствор формалина для фиксации, трижды отмывали в однократном фосфатном буфере (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HP04 х 2Н20, 2 мМ КН2Р04, pH 7,4). Далее вносили по 1 мкл 1000-кратного раствора DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) ("Invitrogen", США) на 15 минут для окрашивания ядер и вновь трижды отмывали в фосфатном буфере. После этого проводили микроскопию образцов на люминесцентно-инверсионном микроскопе СКХ41 ("Olympus", Япония). При микроскопии делали отдельно снимки ядер клеток (DAPI, синее свечение) и метки на олигонуклеотидах (FAM, зеленое свечение), затем при помощи компьютерной обработки фотографии совмещали и оценивали распределение меченных ОДН в клетке.

Исследование цитотоксичности и ингибирующей активности олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl

Для оценки цитотоксической активности олигонуклеотидных ингибиторов использовали следующую стандартную методику. Монослой культуры клеток L-68, HeLa и CaSki выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. Экспозиция ингибиторов составляла 4 часа, после чего клетки культивировали в течение 24 часов. Затем среду удаляли, а монослой прокрашивали витальным красителем нейтральным красным. После удаления красителя и отмывки лунок добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированного живыми клетками монослоя, измеряли на планшетном спектрофотометре Emax ("Molecular Devices", США) на длине волны 540 нм. В качестве контролен использовали лунки планшета, в которые препараты не вносили, а также лунки без ингибиторов, но с добавлением липофектамина. Значения 50 %-ных цитотоксических концентраций (ТС50) препаратов рассчитывали аналогично расчету IC50. Статистическую обработку полученных результатов проводили по U-критерию Манна-Уитни.

Выделение ДНК из клеток

Промытый троекратно в ТЕ-буфере (рН=8,0) осадок клеток растворяли в 1,8 мл лизирующего буфера (10 тМ EDTA; 0,1 M NaCl; 50 тМ Трис-HCl, рН=8,0), с добавлением 2 мкл РНКазы (10 мг/мл), 5 мкл Протеиназы К (20 мг/мл) и SDS до концентрации 0,5 %. Смесь перемешивали и инкубировали в термостате при 37 °С до полного растворения осадка (2-4 часа). В дальнейшем проводили фенол-хлороформную экстракцию со спиртовой преципитацией ДНК. Полученную ДНК растворяли в ТЕ-буфере и определяли концентрацию нуклеиновых кислот на спектрофотометре Nano Vue Plus ("GE Helthcare", США).

GLAD-ПЦР анализ статуса метилирования ДНК

Предварительную фрагментацию ДНК проводили в 18,35 мкл реакционной смеси, содержащей 45 нг ДНК и 3 е.а. эндонуклеазы рестрикции Taql в течение 15

минут при 65 °С в буфере следующего состава: 10 мМ Tris-S04, pH 8.0, 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ ß-меркаптоэтанол. Затем к 7яс/1-гидролизату добавляли 1-2 е.a. Glal и компоненты буфера до достижения конечного состава 20 мМ Tris-SOi, pH 8.0, 4 мМ MgCl2, 1 мМ ß-меркаптоэтанол и 100 нг/мкл BSA, и проводили гидролиз в конечном объеме 21,7 мкл в течение 15 минут при 30 °С с последующей инактивацией Glal при 65 °С в течение 20 минут. Далее к G/aI-гидролизату вносили АТФ до конечной концентрации 0,5 мМ, ß-меркаптоэтанол до 6,8 мМ, универсальный адаптер до конечной концентрации 500 нМ и 1000 е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы. Реакцию лигирования адаптера проводили в 30 мкл реакционной смеси в течение 15 минут при 25 °С, затем лигазу термоинактивировали при 65 °С в течение 20 минут. Для проведения ПЦР ко всему объему полученной смеси добавляли следующие компоненты до достижения итоговых концентраций: 50 мМ Tris-S04, pH 9,0, 30 мМ KCl, 10 мМ сульфата аммония, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозид-трифосфатов, 0,01 % Tween-20, смесь праймеров и зонда по 0,4 мкМ каждого и 0,04 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы в конечном объеме равном 60 мкл, который разделяли на три равные части. Для повышения эффективности реакции использовали стабилизатор для GC-ПЦР. Амплификацию проводили на детектирующем амплификаторе CXF-96 («Bio-Rad», США). Программа амплификации: 95 °С - 3 минуты, далее 5 циклов без детекции: 95 °С - 10 секунд, 61 °С - 15 секунд, 72 °С - 5 секунд; затем 40 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95 °С - 10 секунд, 61 °С - 15 секунд, 72 °С - 5 секунд. Появление флуоресцентного сигнала в ходе ПЦР означало наличие последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК.

Для оценки изменения статуса метилирования проводили GLAD-ПЦР анализ ДНК из клеток HeLa и CaSki после обработки ОДН в концентрации, равной 1 мкМ, против контроля ДНК из необработанных клеток HeLa и CaSki. Все измерения проводили троекратно. Для анализа данных использовали программу Bio-Rad CFX Manager v.2.1 («Bio-Rad», США), статистическую обработку проводили по U-критерию Манна-Уитни.

Применяемые для GLAD-ПЦР анализа статуса метилирования ГСО праймеры, TaqMan-зонды и адаптер были синтезированы во ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" (табл. 1).

Таблица 1

Структура праймеров, зондов и адаптера для GLAD-ПЦР анализа

Универсальный адаптер 5' CTCCCGCCTGCTCTTTCATCG 3' ACGAGAAAGTAGC

CDKN2A 5 ' GGAAGAAAGGAAAGCGAGGTC

CDKN2A GLAD 5' CCTGCTCTTTCATCGGTGC

CDKN2A TaqMan 5' FAM-TTGCTCTATCCGCCAATCAGGAGG-BHQ1

DAPK 5' CTTGCAGGGTCCCCATTGG

DAPK GLAD 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTG

DAPK TaqMan 5' FAM-CCTCCTCACACTCCGAAGCAGCC-BHQ1

MGMT 5' GAGAGCTCCGCACTCTTC

MGMT GLAD 5' CCTCTTTCATCGGCACCGT

MGMT TaqMan 5' FAM-CCAGACACTCACCAAGTCGCAA-BHQ1

RARB 5' TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC

RARB GLAD 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTC

RARB TaqMan 5' FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1

RASSF1 5' ATGTCGGGGGAGCCTGAG

RASSF1 GLAD 5' CCTGCTCTTTCATCGGCCC

RASSF1 TaqMan 5' FAM-TGCCAGCTCCCGCAGCTCAAT-BHQ1

Примечание: FAM — 5-(and-6)-Carboxyfluorescem, BHQ1 — Black Hole Quencher -1. В составе гибридных праймеров красным цветом выделены нуклеотиды, комплементарные геномной ДНК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Дизайн олигонуклеотидов, специфичных к Dnmtl

С целью поиска эффективных олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl был синтезирован ряд олигодезоксирибонуклеотидов для получения различных одно-, двуцепочечных и шпилечных структур, содержащих неметилированный, полуметилированный или модифицированный участок узнавания фермента 5'-CpG. При выборе ДНК-последовательностей ориентировались на существующие литературные данные (Laayoun and Smith 1995, Sheikhnejad et al. 1999, Flynn et al. 2003), пытаясь максимально учесть совокупность известных экспериментальных фактов для получения эффективных лигандов таких как: длина субстратной ДНК при центрально расположенном CpG-сайте не менее 22 п.н.; эффективно взаимодействовать с Dnmtl могут одноцепочечные и самокомплементарные шпилечные структуры; скорость метилирования зависит от наличия в сайте 5-метилцитозина (полуметилированный сайт) и некомплементарных или модифицированных оснований; сродство Dnmtl к CpG сайту выше при наличии фланкирующих нуклеотидов 5'-CCG, 5'-GCGG, 5'-CCGC, 5'-CCGG и 5'-CGCTC; замена межнуклеотидных фосфатов на фосфотиоаты способна повышать сродство олигонуклеотида к ферменту.

В таблице 2 приведены синтезированные в результате ДНК-структуры, полученные на основе выбранной базовой 22-звенной последовательности 5'-GAAATGGATCCGCTCTAAACTG (и комплементарной ей цепи). В часть структур дополнительно вводили замены цитозина-мишени метилирования на 5,6-дигидро-5-азацитозин, 5-метил-2-пиримидинон и 6-метил-пирроло-[2,3^]-2-пиримидинон (рис. 1). Известно, что 5,6-дигидро-5-азацитозин и 2-пиримидинон (без 5-метильной группы) характеризуются более высоким сродством к цитозин-специфичным МТазам, чем к нативному цитозину. Третье соединение — 6-метил-пирроло-[2,3^]-2-пиримидинон — синтезированный флуоресцентный аналог цитозина.

5-метилцитозин

5,6-дигидро--5-азацитозин

NH2 HN^N

5-метил--2-пиримидинон

V

6-метил--пирроло-[2,3-<1]--2-пирнмидинон

Ы-фталил-1--триптофан

Рис. 1. Структурные формулы модифицированных аналогов цитозина и N-фталил-триптофана — низкомолекулярного ингибитора Dnmtl.

2. Субстратные свойства синтетических олигонуклеотидных структур

В качестве стандартной субстратной ДНК использовали полимер поли(с11-с1С)-поли(с11-<1С), характеризующийся высокой скоростью его метилирования Опти.

Результаты оценки субстратных свойств олигонуклеотидных структур в сравнении с поли(с!1-с1С)-поли(с11-с1С) представлены в таблице 2 (столбец СМ).

Таблица 2

Оценка субстратных/ингибиторных свойств синтетических олигонуклеотидных _структур в конкуренции с ДНК-полимером поли(сЛ-с1С)тголи((Н-с1С)

Лиганд

Структура

СМ, %

МС, %

1*0108

См. рис. 1

О

86

вС-ЬохЬ

5'СТССАТССТТССССМСССССТТСААТТССС

96

ОДН-15

5'САААТССАТССССТСТАААСТС

90

ОДН-25

5' САААТССАТССССТСТАААСТСССМССС

17

73

ОДН-38

5'САААТССАТССССТСТАААСТС

79

ОДН-45

5'САААТССАТССССТСТАААСТС

64

ОДН-5Б

5'САААТССАТССССТСТАААСТСССМССС

60

ОДН-65

5' САААТССАТСМССТСТАААСТСССМССС

32

ОДН-7$

5'САААТССАТСгССТСТАААСТСССМССС

53

ОДН-85

5'САААТССАТСОССТСТАААСТСССМССС

21

ОДН-Ю

САААТССАТССССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

16

0ДН-20

САААТССАТССССТСТАААСТСССМССС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

13

82

ОДН-ЗО

САААТССАТСМССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

43

0ДН-40

5'САААТССАТССССТСТАААСТС 3, стттдсстдсдмсдеАтттеАС

400

229

ОДН-5Э

5'САААТССАТССССТСТАААСТСССМССС 3' С Т Т Т АС С Т АСАМС АСАТ Т Т САС

382

309

ОДН-бЭ

5' САААТССАТСССССТСТАААСТС 3'СТТТАССТАСА МСАСАТТТСАС

179

170

0ДН-70

5'САААТССАТСССССТСТАААСТС 3, СТТТАССТДБе мбАвАТТТСАС

37

96

0ДН-80

5'САААТССАТССССТСТАААСТС 3'СТТТАССТАСАМСАСАТТТСАС

34

0ДН-90

САААТССАТ СОЗСТ С ТАААСТ С С Т Т Т АС С Т АССЗМС А САТ Т Т САС

23

67

ОДЫ-100

САААТССАТССССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

43

ОДН-1Ю

САААТССАТСМССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

19

0ДН-120

САААТССАТСРССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

17

0ДН-130

САААТССАТсгсстСТАААСТС С Т Т ТАСС ТАССМСАСАТ Т Т САС

12

0ДН-140

САААТССАТСРССТСТАААСТС СТТТАССТАССМСАСАТТТСАС

15

Лиганд Структура CM, % MC, % им, %

ОДН-ISD 5'GAAATGGATCCGCTCTAAACTG 3'CTTTACCTAGAMGAGATTTGAC 0 14 86

ОДН-16D 5'gaaatggatcMgctctaaactg 3' CTTTACCTAGAMGAGATTTGAC 0 35 65

ОДН-17D 5'GAAATGGATCZGCTCTAAACTG 3'CTTTACCTAGAMGAGATTTGAC 0 43 57

ОДН-18D 5'GAAATGGATCDGCTCTAAACTG 3' CTTTACCTAGAMGAGATTTGAC 0 15 85

ОДН-1Н 5'GAAATGGATC GCTCTAAACTGCCC 3'CTTTACCTAGGMGAGATTTGACccc 0 32 68

ОДН-2Н 5'GAAATGGATCCGCTCTAAACTGCCC 3'CTTTACCTAGGMGAGATTTGACccc 23 53 70

ОДН-ЗН 5'GAAATGGATCCGCTCTAAACTGCCM 3' CTTTACCTAGGMGAGATTTGACccG 25 60 65

ОДН-4Н 5'GAAATGGATCCGCTCTAAACTGCCC 3' CTTTACCTAGGMGAGATTTGACCCC 0 22 78

ОДН-5Н 5' GAAATGGATCCGCTCTAAACTGCCC 3' CTTTACCTAGAMGAGATTTGACccC 0 6 94

ОДН-1F 5'fam-gaaatggatccgctctaaactgcccgcc - - -

OflH-2F 5'fam-gaatggatccgctctaactgcc 3' cttacctaggcgagattgacpc - - -

ОДН-К 5'gaaatggatcatctctaaactg 0 0 0

ОДН-1 5'GAAATGGATCMGCTCTAAACTGCCMGCC 0 13 87

ОДН-2 5' GAATGGATCMGCTCTAACTGcr 3'CTTACCTAGGCGAGATTGACCC 0 24 76

ОДН-3 5'gaatggatccgctctaactgcn 3' cttacctagamgagattgaccc 0 18 82

ОДН-4 5'GAATGGATCMACTCTAACTGCr 3'CTTACCTAGGcGAGATTGACcC 0 18 82

Примечание. СМ — метилирование относительно dl-dC, МС — метилирование смеси с dl-dC, ИМ — ингибирование метилирования dl-dC. RG108 — М-фтапил-1 -триптофан (рис. 1). Реакционные смеси содержали 0.05 ед. акт./мкл Dnmtl, 10 мкМ [3H-CH3]AdoMet, 1 мкМ поли(сН-£1С)-поли(<11-dC) (в пересчете на сайты 5'-С1) и/или 1 мкМ лиганда.

В качестве контрольных ингибиторов использовали низкомолекулярное соединение Ы-фталил-1-триптофан (рис. 1) и дополнительно синтезированный 30-звенный олигонуклеотид GC-boxb^', показавшие ранее ингибирующий эффект in vitro в отношении бактериальной МТазы SssI и мышиной Dnmtl и вызывавшие деметилирование геномной ДНК и реактивацию генов-супрессоров опухолей.

Как и ожидалось, одноцепочечные олигонуклеотиды не проявили заметных субстратных свойств, исключение составил олигонуклеотид ОД( 1-2 S, который

оказался способным к модификации (табл. 2). Можно предположить, что дополнительно введенный в олигонуклеотид ОДН-28 метилированный динуклеотид 5'-МО стимулирует метилирование первого динуклеотида 5'-СО, что наблюдали и ранее при взаимодействии ОптП с одноцепочечными олигонуклеотидами. Дальнейшее введение в структуру олигонуклеотида ОДН-28 фосфотиоатов резко снижало его субстратный потенциал (см. ОДН-5Б, табл. 2). Двуцепочечные и шпилечные структуры, потенциально способные быть акцепторами метильной группы, проявляли субстратные свойства широкого диапазона. Структуры ОДН-Ш, ОДН-2Н и ОДН-ЗН, несущие канонический полуметилированный сайт, ожидаемо являлись субстратами для ОптН и метилировались в 4-6 раз медленнее поли((11-ёС)-поли(с11-ёС). Интересно, что дополнительный динуклеотид 5'-МО, стимулирующий взаимодействие ОптП с одноцепочечной структурой ОДН-28, терял свою эффекторную активность в двуцепочечных структурах, уже содержавших канонический полуметилированный сайт (ср. ОДН-Ш с 0ДН-20 и ОДН-2Н с ОДН-ЗН, табл. 2). Резко выделялись своими "суперсубстратными" свойствами дуплексы 0ДН-4П-60, метилировавшиеся в 2-4 раза быстрее поли(с11-с1С)-поли(с11-с1С), наиболее эффективного из известных субстратов ОптН. Их общей отличительной особенностью является некомплементарное размещение цитозина-мишени метилирования против аденина, а в случае дуплекса ОДН-бБ -экстраспиральное расположение динуклеотида СС. По-видимому, эти структурные особенности существенно облегчают "выворачивание" цитозина-мишени из двойной спирали ДНК в активный центр фермента. Дополнительное введение пяти фосфотиоатов в район участка узнавания предотвращало реакцию метилирования (см. ОДН-ЮБ, 0ДН-150, ОДН-4Н, ОДН-5Н, табл. 2).

3. Ингибиторные свойства олигонуклеотидных структур в отношении

активности ОптИ

Оценку ингибиторных свойств синтетических олигонуклеотидных структур проводили, сравнивая степень их собственного метилирования ОптП со степенью метилирования их смесей с ДНК-субстратом поли(сП-с1С)-поли(с11-с1С). Процент ингибирования реакции метилирования ДНК-субстрата в смесях, вычисленный по разности степеней метилирования, представлен в таблице 2 (столбец ИМ). Среди одноцепочечных олигонуклеотидов выраженные ингибиторные свойства проявил олигонуклеотид ОДН-28 (44 %), а также олигонуклеотиды ОДН-48-88, несущие в районе участка узнавания замены межнуклеотидных фосфатов на фосфотиоаты (3679 %). Из последних наиболее эффективным ингибитором был ОДН-88, содержавший дополнительную замену цитозина в участке узнавания на 5,6-дигидро-

5-азацитозин (79 %). В ряду двуцепочечных и шпилечных олигонуклеотидных структур практически все соединения демонстрировали выраженные ингибирующие свойства (30-94 %), а семь из них показали ингибирование > 80 %. В первую очередь стоит отметить структуры ОДН-15Б (86%), 0ДН-180 (85%) и ОДН-5Н (94%), общими элементами для которых являлись некомплементарность С:А (0:А для 0ДН-180) и замещение фосфатов на фосфотиоаты, а также дуплекс 0ДН-140 (85 % ингибирования), содержавший в участке узнавания новый аналог цитозина —

6-метил-пирроло-[2,3-с1]-2-пиримидинон. Сравнение свойств шпилечных структур ОДН-1Н и ОДН-2Н показало, что делеция остатка цитозина в верхней цепи сайта

узнавания не сказывается на способности дуплекса ОДН-1Н ингибировать метилирование субстрата.

Далее для отдельных олигонуклеотидных структур измеряли зависимости скоростей реакции метилирования 1 мкМ поли(сП-с1С)поли((11-с1С) от количества

Рис. 2. Ингибирование активности Опгш1 возрастающими концентрациями олигонуклеотидных ингибиторов. Реакционные смеси содержали 1 мкМ поли(с11-с1С)поли(ё1-с1С), 10 мкМ [3Н-СНз]АёоМе1 и 0,05 ед. акт./мкл ОпгпП.

Самое высокое значение 1С50 (1 120 нМ) зафиксировано у ОДН-48, обладающего наименьшим процентом ингибирования (36 %), однако добавление дополнительного сайта Мв и наличие модифицированного основания — 5,6-дигидро-5-азацитозина (ОДН-88) — уменьшают ГС50 в 5 раз до значения 224 нМ (рис. 2). Показательно сравнение полученных величин 1С5о в ряду фосфотиоат-содержащих структур ОДН-4Б, ОДН-ЮЭ и ОДН-13Б (рис. 2): значения 1С50 отчетливо понижаются при переходе от одно- (1120 нМ) к двуцепочечной структуре (795 нМ) и при дальнейшей замене цитозина его более аффинным аналогом — 5-метил-2-пиримидиноном (162 нМ). Ожидаемо хорошими параметрами 1С50 характеризуются ингибиторы ОДН-15В и ОДН-5Н (рис. 2), отличительной особенностью которых является некомплементарное размещение цитозина-мишени против аденина.

Таким образом, наибольший ингибирующий эффект проявляли олигонуклеотиды, у которых сочетались несколько модификаций базовой последовательности, а именно: введение в структуру ингибитора высокоаффинных аналогов цитозина, наличие неспаренных оснований в сайте узнавания,

двуцепочечная или шпилечная структура и замена фосфатов на фосфотиоаты (например, 0ДН-150, 0ДН-180 и ОДН-5Н, табл. 2).

На основании того, что модифицированные аналоги цитозина (5,6-дигидро-5-азацитозин и 5-метил-2-пиримидинон), введенные в сайт узнавания МТазы, показывают существенное снижение 1С50 только в сравнении с интактной структурой (ср. (ЭДН-IOD и ОДН-13D в табл. 2), тогда как сама по себе С:А некомплементарность в ОДН-15D снижает 1С50 почти в три раза при сопоставимой эффективности ингибирования (табл. 2), было решено в дальнейшие эксперименты на раковых клетках брать структуры с неспаренными основаниями в сайте-мишени Dnmtl и дополнительно модифицировать все фосфаты в фосфотиоаты для защиты от экзо- и эндонуклеазной активности ферментов клетки. Кроме того, во избежание спонтанной денатурации двуцепочечные структуры не применялись для экспериментов с раковыми клетками, а были заменены шпилечными аналогами. В результате были синтезированы следующие ОДН: одноцепочечный ОДН-1, шпилечные ОДН-2-4 и контрольный олигонуклеотид ОДН-К, не обладающий субстратными свойствами и способностью ингибировать реакцию метилирования (табл. 2), которые также были оценены с точки зрения способности ингибировать Dnmtl в реакции метилирования субстрата in vitro.

Как видно из таблицы, некоторые выбранные структуры проявляют лучшие ингибиторные свойства по сравнению со своими прототипами: ОДН-1 превосходит ОДН-бБ по эффективности ингибирования (87 % против 68 %, см. табл. 2), а ОДН-2 (76 %) ненамного, но эффективнее, чем ОДН-4Н (70 %). ОДН-3 и ОДН-4 (по 82 %), напротив, проигрывают в способности ингибировать реакцию метилирования dl-dC ОДН-5Н (94 %) и 0ДН-150 (86 %), соответственно (см. табл. 2).

4. Локализация олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl в клетках карцином

шейки матки

Для исследования способности ОДН проникать в клетки HeLa и CaSki и сохраняться в них длительное время были синтезированы меченые FAM олигонуклеотиды (ОДН-IF, аналог ОДН-1 и ОДН-2Р аналог ОДН-2, см. табл. 2), в которых все фосфаты заменены фосфотиоатами.

На рисунке 3 приведены фотографии флуоресценции ОДН-IF в клетках HeLa и CaSki после экспозиции 100 нМ олигонуклеотида. Использование ОДН-2Р вместо ОДН-IF, а также снижение концентрации препарата в среде, вплоть до 10 нМ, не приводило к значительному изменению картины флуоресценции.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что выбранные условия эксперимента обеспечивают эффективную доставку синтетических структур в клетки. При этом интенсивность флуоресценции (а, следовательно, и концентрация ОДН) в подавляющем большинстве (до 90-100%) клеточных ядер практически одинакова. Следовательно, трансфецированные ОДН локализуются непосредственно там, где происходит реакция метилирования ДНК.

При изучении деградации олигонуклеотида ОДН-IF в клетках HeLa в течение 72 часов было выявлено постепенное снижение интенсивности свечения в цитоплазме начиная с первого дня эксперимента, тогда как флуоресценция в клеточных ядрах начинала снижаться только после трех дней культивации (рис. 4. Для ОДН-2Р получены аналогичные результаты). В клетках CaSki оба

олигонуклеотида продемонстрировали схожие результаты, однако окрашивание ядер на третий день было интенсивнее, чем в клетках НеЬа. Это можно объяснить расходованием ОДН в результате деления клеток, а различия во флуоресценции на третий день являются следствием неодинакового темпа клеточных делений, что подтверждается литературными данными (Радаева и др. 2009). Таким образом, можно предполагать, что в суточных экспериментах с немечеными ОДН не происходит значимой деградации ингибитора в клетках.

Рис. 3. Оценка проникновения и преимущественной локализации олигонуклеотида ОДН-П в клетках Не!^а (А, Б) и СаБк! (В, Г). А, В — флуоресценция ОДН, Б, Г — то же, но с наложением свечения ядер клеток, окрашенных ОАР1.

Рис. 4. Устойчивость ОДН-1Р в клетках НеЬа (А — 24 ч. Б — 48 ч, В — 72 ч) и СавИ (Г — 24 ч, Д

— 48 ч, Е —72 ч). 15

5. Оценка цитотоксичности олигонуклеотидных ингибиторов ОптН

Для оценки токсического действия ингибиторов ОпгпИ на клетки НеЬа, Са8кт и Ь-68 были проведены эксперименты по изучению влияния различных концентраций олигонуклеотидов (от 1,25 до 1280 нМ) на жизнеспособность клеток. На рисунке 5 изображены зависимости количества живых клеток трех линий (в единицах оптической плотности) от концентрации ингибиторов в ростовой среде. Значения 50 %-ных токсических концентраций (ТС5о) приведены в таблице 3. А 0,8-

100

Концентрация, нМ

1000

10000

0,3

Я 0,2-

0.1

0,0

« и

^ТГ"—■—«______в

\Ч ' А *

ЧЧ

О* ▲

■ -одн-к

•----ОДН-1

А ОДН-2 " \ч -\ УА -

▼ -----ОДН-З

4 - - ОДН-4 Ч*. ...

10

100 1000 Концентрация, нМ

10000

В 0,6

8 0,4

0,2

с

О

0,0

- одн-к ■ОДН-1 ОДН-2

■ одн-з ОДН-4

10

100

Концентрация, нМ

1000

10000

Рис. 5. Цитотоксическая активность олигонуклеотидных ингибиторов ОпгпП на культурах клеток НеЬа (А), Са51а (Б) и Ь-68 (В) в зависимости от концентрации ОДЫ (нМ).

Таблица 3

Оценка цитотоксического действия олигонуклеотидных ингибиторов ОптИ в _ отношении клеточных линий НеЬа, Са5к1 и Ь-68_

№ Структура (5'—>3') TC50, HM

HeLa CaSki L-68

одн-к GAAATGGATCATCTCTAAACTG >104 >104 >104

ОДН-1 GAAATGGATCMGCTCTAAACTGCCMGCC 285±15* 147±5* >10"

ОДН-2 GAATGGATCMGCTCTAACTGcr 408±9* 170±5* >104

CTTACCTAGGCGAGATTGACC£

ОДН-3 GAATGGATCCGCTCTAACTGC(-: CTTACCTAGaMGAGATTGACcC 236±10* 118±3* >104

ОДН-4 GAATGGATCMACTCTAACTGCn CTTACCTAGGCGAGATTGAC(-£ 290±18* 136±5* >104

* - различия с контрольным ОДН статистически значимы, р < 0,01.

Для исследованных синтетических ингибиторов получены весьма низкие значения ТС50 в отношении раковых клеток (118-408 нМ, см. табл. 3), в то время как для фибробластов L-68 ТС50 оказалась на уровне контроля (>104 нМ). Различие с контролем более чем в 100 раз указывает на хороший терапевтический потенциал сконструированных олигонуклеотидов. Наиболее эффективным оказался ОДН-3 (TCso.HeLa = 236 нМ, TCS0.caSki = И8 нМ, см. табл. 3), содержащий полуметилированный сайт с С:А некомплементарностью.

Сравнивая эффективность ингибирования роста клеток HeLa (ТС50 = 236-408 нМ) и CaSki (ТС50 = 118-170 нМ), можно предположить, что выявленное различие в чувствительности клеточных линий к ОДН обусловлено неодинаковым функциональным значением аберрантного гиперметилирования ДНК для прогрессии различных типов рака шейки матки.

Для исследования влияния Липофектамина 2000 на жизнеспособность клеток в ростовую среду вносили липофектамин в количествах, необходимых для транспортировки ингибиторов ОДН-1-4, взятых в аналогичных опыту концентрациях. Полученные значения ТС50 для липофектамина более чем на порядок отличались от ТС50 ингибиторов, что позволило считать его вклад в цитотоксический эффект ОДН незначительным.

6. Выбор метода для анализа статуса метилирования ДНК

Метилирование de novo осуществляется в клетках человека и млекопитающих ДНК-метилтрансферазами Dnmt3a и Dnmt3b. В ходе реакции метилирования ферменты Dnmt3a и Dnmt3b узнают тетрануклеотид 5'-RCGY-3' и модифицируют цитозиновый остаток внутреннего CG-динуклеотида с образованием последовательности 5'-R(5mC)GY-3' (Handa and Jeltsch 2005). Таким образом, к изменению статуса метилирования гена и его выключению приводит метилирование именно сайтов 5'-RCGY-3' в области промотора и первого экзона. Следовательно, для оценки деметилирующего эффекта ингибиторов можно исследовать степень метилирования не всего региона в целом, а только точек метилирования de novo (RCGY).

В настоящее время "золотым стандартом" для оценки статуса метилирования ДНК являются методы, основанные на бисульфитной конверсии ДНК (von Kanel and Huber 2013). Однако у данной группы методов имеются существенные недостатки: высокая вероятность неполной конверсии и деградации ДНК, многостадийность, длительность и трудоемкость исследования, что делает их применение нерациональным для анализа большого количества образцов ДНК по нескольким регионам.

С другой стороны, набирают популярность методы, основанные на использовании метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции так как для анализа используется ДНК без дополнительной обработки, сокращается время исследования (до 1,5-5 часов от момента выделения ДНК) и число необходимых манипуляций. Для исследования эпигенетического статуса участков ДНК чаще всего применяются эндонуклеазы рестрикции, ингибируемые метилированием цитозиновых оснований в сайтах узнавания. Например, эндонуклеазы Hpall и Mspl, узнающие последовательность 5'-CCGG, блокируются по-разному: Hpall не способна расщеплять последовательность 5'-(5mC)CGG, a Mspl — 5'-C(5mC)GG (Zilberman and Henikoff 2007). К недостаткам метода для настоящей работы можно отнести возможность неполного гидролиза ДНК, дающего ложноположительный результат, а также то, что последовательность 5'-CCGG в отличие от RCGY не является сайтом для аберрантного метилирования de novo.

Альтернативным подходом является использование метилзависимых (MD) эндонуклеаз, которые специфически фрагментируют только метилированную ДНК. Недавно зарубежными исследователями в этих целях был использован фермент МсгВС, узнающий последовательность R(5mC)N40.3oooR(5mC) и расщепляющий ее вблизи от одного из двух узнаваемых динуклеотидов. Неспецифичность гидролиза и большое расстояние между узнаваемыми последовательностями R(5mC) существенно ограничивает возможность применения МсгВС для исследования произвольно выбранной области ДНК. В то же время сайт узнавания метилзависимой ДНК-эндонуклеазы Glal (R(5mC)J.GY, место гидролиза указано стрелкой) (Tarasova et al. 2008) полностью соответствует последовательности ДНК, модифицируемой de novo клеточными метилазами Dnmt3a и Dnmt3b, что позволяет применять основанные на ней методы для анализа аберрантного метилирования ДНК. Стоит отметить, что ранее был предложен метод анализа статуса метилирования участков ДНК — GM-ПЦР анализ {Акишев, 2011 365 /id;roH4ap, 2010 366 /id}, однако его использование в данной работе было нерационально, так как он обладал недостатками присущими MSP методам. В частности, для правильной оценки результатов было необходимо точно разделять исследуемую ДНК на две равные части, одну из которых обрабатывали Glal, а другая служила контролем, что приводило к инструментальным погрешностям. Поэтому было решено использовать новый способ определения метилированной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК — GLAD-ПЦР анализ (Glal digestion and Ligation Adapter Dependent ПЦР, рис. 6) — для изучения изменения картины метилирования ДНК при использовании ингибиторов Dnmtl.

Выбор метода был не случаен, так как он выгодно отличался от широко распространенных на сегодняшний день методов (табл. 4).

Таблица 4

Сравнение ОЬАО-ПЦР анализа и бисульфитных методов.

Параметр Бисульфитные методы СЬАО-ПЦР анализ

Аналитическая чувствительность От 500 пг От 20 пг

Специфичность До 80% 100%

Время анализа > 12 часов < 5 часов

Предобработка ДНК Есть Нет

Деградация ДНК Значительная Нет

Сложность От 5 стадий в разных пробирках 3 реакции в одной пробирке

Экономичность Часто требуют дорогостоящего оборудования Не требует дорогостоящего оборудования

Чувствительность к примеси неметилированной ДНК Высокая Нет

7. Оценка деметилирующего эффекта ингибиторов на гиперметилированные регуляторные районы генов-супрессоров опухолей

Для оценки деметилирующего эффекта ингибиторов на гиперметилированные регуляторные районы генов-супрессоров опухолей был применен СЬАО-ПЦР анализ для определения статуса метилирования регуляторных районов ряда генов-онкосупрессоров в ДНК из клеток НеЬа и СаБк! — как интактных, так и после однократной экспозиции с ингибиторами в концентрации 1 мкМ с последующим суточным культивированием. Эффективность ингибиторов оценивали исходя из

значений С,, за 100 % уровень метилирования был принят сигнал, получаемый с нативной ДНК.

Основываясь на литературных данных, были выбраны пять ГСО, для которых показано наличие гиперметилирования регуляторных районов в карциномах шейки матки: ген-регулятор клеточного цикла СйКЫ2А, ген апоптоза БАРК, ген белка системы репарации ДНК МСМТ, ген-регулятор процессов эмбрионального морфогенеза, клеточного роста и дифференциации ЯАЯВ и ген негативного Пая-эффектора НАББПА. Результаты анализа статуса метилирования этих генов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Степень метилирования регуляторных областей ГСО в клетках карцином шейки матки НеЬа и СаБкт при обработке ОДН-ингибиторами и без нее (в

процентах от уровня метилирования ДНК интактных клеток)

^--^ГСО Проба СБШ2А ОАРК МСМТ МЯВ

НеЬа 100 0 0 100 0

НеЬа+ОДН-1 10,3±3,5* 0 0 12,5±2,1* 0

НеЬа+ОДН-2 11,3±2,2* 0 0 11,9±2,8* 0

НеЬа+ОДН-З 9,5±0,3* 0 0 11,7±1,3* 0

НеЬа+ОДН-4 10,8±2,5* 0 0 13,1±2,1* 0

Са8Ы 100 0 100 100 0

Са8Ы+ОДН-1 21,6±6,3* 0 27,3±5,2* 19,5±1,9* 0

Са8к1+ОДН-2 23,5±5,9* 0 25,6±4,7* 19,8±3,0* 0

Са8к1+ОДН-3 19,2±0,6* 0 20,1 ±4,2* 20,4±0,3* 0

СаБ1а+ОДН-4 22,8±3,9* 0 25,7±5,9* 22,9±2,5* 0

* - различия с контролем (соответствующая ДНК без обработки ингибитором) статистически значимы, р < 0,01.

Полученные данные выявили различия в метилировании исследуемых районов клеток НеЬа и Са8кт. Так, в случае с НеЬа СЬАО-ПЦР анализ выявил наличие метилирования сайтов ЯССУ в генах СйКЫ2Л и ПАЯВ, тогда как в ДНК из клеток Са5к1 исследуемый сайт был метилирован и в гене МСМТ. Таким образом, выбранный набор генов позволил дифференцировать один ДНК-препарат от другого на основании проведенного исследования, что позволяет использовать ОЬАЕ)-ПЦР анализ для типирования малигнантных клеточных линий, как это предлагалось ранее родственным методом С/сЛ-ПЦР анализа.

Регуляторные районы генов БАРК и ЯАББРЫ оказались неметилированными в обеих клеточных линиях. Стоит отметить, что отсутствие метилирования гена ЯАББРЫ в изученных ВПЧ-ассоциированных карциномах подтверждается литературными данными, что свидетельствует в пользу высокой специфичности метода.

Сравнение уровня метилирования ДНК клеток карцином шейки матки до и после обработки синтетическими олигонуклеотидами выявило значительное деметилирование изучаемых сайтов (72-90 %). Наиболее выраженный деметилирующий эффект был отмечен в отношении клеток НеЬа (87-90 %), в то

время как для CaSki данный показатель был ниже (72-80 %). Это можно объяснить как принципом воздействия ингибитора на Dnmtl, так и физиологическими особенностями клеток: поскольку синтетические олигонуклеотидные структуры являются более аффинным субстратом для клеточной МТазы 1, чем геномная ДНК, большинство молекул фермента оказываются связаны с ингибитором, что индуцирует пассивное деметилирование дочерних ДНК в процессе репликации. Следовательно, скорость деметилирования будет зависеть от устойчивости ингибитора в клетке и частоты клеточных делений. Выбранные условия эксперимента (инкубация клеток в течение 24 часов после экспозиции с ОДН) позволяют считать, что ингибитор в клетке не деградирует, а, значит, полученные данные указывают на различную скорость деления клеток HeLa и CaSki, что подтверждается литературными данными.

Наиболее эффективным ингибитором Dnmtl оказался ОДН-3 (степень деметилирования ДНК составила 88-90 % и 79-81 %, здесь и далее для клеток HeLa и CaSki, соответственно, табл. 5), для которого получено наименьшее значение 1С50. Максимальная ингибирующая активность ОДН-3 может быть обусловлена наиболее выгодным пространственным расположением шпилечной структуры относительно фермента. Dnmtl является высокопроцессивным ферментом и характеризуется строгой направленностью перемещения (3'—+5") по неметилированной цепи ДНК, а в случае с ОДН-2 и ОДН-4 шпилька располагается по ходу движения Dnmtl (табл. 2), что, видимо, снижает эффективность взаимодействия олигонуклеотида с аллостерическим сайтом в регуляторном домене белка.

ВЫВОДЫ

1. На основе выбранной базовой 22-звенной последовательности были сконструированы и синтезированы олигодезоксирибонуклеотиды для получения различных одно-, двуцепочечных и шпилечных структур, содержащих неметилированный, полуметилированный или модифицированный участок узнавания фермента 5'-CpG.

2. В результате оценки ингибирующего потенциала и субстратных свойств полученных олигонуклеотидов in vitro были отобраны четыре структуры с наиболее высоким процентом ингибирования (76-87%), не проявляющие субстратных свойств.

3. Показано, что флуоресцентно меченые аналоги отобранных ингибиторов локализуются преимущественно в ядре клеток и не подвергаются явной деградации в течение как минимум двух суток.

4. Определены величины ТС50 ингибиторов для клеток карцином шейки матки HeLa и CaSki (0,2-0,4 мкМ и 0,1-0,2 мкМ соответственно), а также фибробластов

легкого L-68 (>10 мкМ). Индекс селективности ( ^онеРак°'","'клет°к) наилучшего

ТС5о.рак0вых клеток

ингибитора > 100.

5. Было оценено влияние ОДН ингибиторов на аберрантное гиперметилирование ДНК в раковых клетках. Степень метилирования генов CDKN2A и RARB в клетках HeLa снизилась на 88-90 %, а генов CDKN2A, RARB и MGMT в клетках CaSki на 79-81 %.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Dnmt — DNA methyltransferase, ДНК-метилтрансфераза

IC50 — 50 %-ая ингибирующая концентрация

MD — Methylation Directed, метилзависимые

MSP — Methylation Sensitive PCR, метилчувствительная ПЦР

ТС50 — 50 %-ая цитотоксическая концентрация

ВПЧ — вирус папилломы человека

ГСО — ген-супрессор опухолей

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

МТаза — ДНК-метилтрансфераза

ОДН — олигодезоксирибонуклеотид

ПЦР — полимеразная цепная реакция

Обозначения нуклеотидов:

5mC, М — 5-метилцитозин

D — 5,6-дигидро-5-азацитозин

N — А или G, или Т, или С

Р — 6-метил-пирроло-[2,3^]-2-пиримидинон

R — А или G

Y —Тили С

Z — 5-метил-2-пиримидинон

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Кузнецов В. В.. Евдокимов А. А., Нетесова Н. А. Создание ингибиторов ДНК-метилтрансферазы 1 человека // Достижения современной биотехнологии: Сб. науч. тр. / Под ред. проф. И. Г. Дроздова. - Новосибирск, 2008. - С. 264-270. (не входит в перечень ВАК)

2. Евдокимов А. А., Зиновьев В. В., Кузнецов В. В.. Нетесова Н. А., Малыгин Э. Г. Конструирование олигонуклеотидных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы 1 человека // Молекулярная биология. - 2009. - Т. 43, №3. - С. 455-463.

3. Кузнецов В. В.. Евдокимов А. А., Акишев А. Г., Дегтярев С. X., Нетесова Н. А. Влияние олигонуклеотидов-ингибиторов Dnmtl человека на рост раковых клеток Hela и уровень метилирования генов-онкосупрессоров // Сборник трудов первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 23-26 11.2010, Санкт-Петербург, Россия / под ред. А. П. Кудинова, Б. В. Крылова. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та. - 2010. - Т. 4 - С. 70-74.

4. Кузнецов В. В.. Акишев А. Г., Абдурашитов М. А., Дегтярев С. X. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК // Патент РФ №2525710, опубл. 20.08.2014, Бюл. № 23.

5. Кузнецов В. В.. Евдокимов А. А., Нетесова H.A. Олигодезоксирибо-нуклеотидный ингибитор ДНК-метилтрансферазы 1 человека // Патент РФ №2553349, опубл. 10.06.2015, Бюл. № 16.

6. Кузнецов В. В.. Евдокимов А. А., Нетесова Н. А. Олигонуклеотидные ингибиторы Dnmtl: Проникновение и ингибирование роста клеток Hela и

Caski//Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2015. -№1(29).-С. 155-163.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Евдокимов А. А., Зиновьев В. В., Кузнецов В. В., Нетесова Н. А., Малыгин Э. Г. Конструирование олигонуклеотидных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы Dnmtl человека // Сборник трудов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 58

2. Evdokimov A. A., Kuznetsov V. V., Zinoviev V. V., Netesova N. A., Malygin Е. G. Specific oligonucleotide inhibitors of the human DNA methyltransferase 1 // Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability International conference. - St. Petersburg, June 24-26,2008.

3. Petruseva I. O., Khodyreva S. N. , Nazarkina Z. K, Ilina E. S., Maltseva E. A., Malygin E. G., Zinov'ev V. V., Evdokimov A. A., Kuznetsov V. V., Lavrik О. I., Netesova N. A. Methylation as epigenetic factor in progression of human tumors associated with HPV infection. DNMT1 and DNA replication proteins - search for selective DNMT1 inhibitors // Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability International conference. - St. Petersburg, June 24 - 26, 2008.

4. Кузнецов В. В., Землянская Е. В., Дегтярев С. X. Glal-qPCR анализ — новый инструмент количественной оценки метилирования ДНК и его применение для изучения генов-супрессоров опухоли // XXV Международная зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, 2013 г.

5. Kuznetsov VV, Akishev AG, Abdurashitov MA, Degtyarev SKh GLAD PCR analysis of aberrant DNA methylation in cancer // Cell Symposia: Cancer Epigenomics 2013. Sitges, Spain. 2013.

Подписано в печать 27.07.2015 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 270

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07