Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз

Нетесова, Нина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз"

На правах рукописи

Нетесова Нина Александровна

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ Ив ТИПА: СТРУКТУРА ОПЕРОНОВ, КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ

03.01.03 - молекулярная биология

4852341

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 5 АВГ 2011

Кольцово — 2011

4852341

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Дегтярев Сергей Харитонович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Ильичев Александр Алексеевич Носиков Валерий Вячеславович Татьков Сергей Иванович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта В.А. РАН, г. Москва

Защита состоится « 7 » октября 2011 года в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630559; тел. (8-383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « /£» Л /и/(/г><2. 2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт-специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метилазами), является наиболее распространённой формой модификации ДНК и вовлечено в широкий спектр важнейших биохимических процессов в живых организмах. Значительная часть метилаз микроорганизмов функционирует в составе бактериальных систем рестрикции-модификации (РМ-систем), которые, как правило, включают эндонуклеазу рестрикции (рестриктазу) и метилазу с одинаковой субстратной специфичностью, т.е., узнающих одну и ту же короткую последовательность ДНК, называемую сайтом узнавания. Рестриктаза расщепляет ДНК по сайтам узнавания, а метилаза модифицирует сайты узнавания, перенося метильную группу на цитозин или аденин узнаваемой последовательности. При этом модифицированный сайт узнавания не расщепляется собственной эндонуклеазой рестрикции, тогда как чужеродная немодифицированная ДНК будет гидролизоваться рестриктазой, что обеспечивает бактериальной клетке защиту от проникновения посторонней ДНК.

Существует несколько типов РМ-систем, но абсолютное большинство известных на сегодня метилаз и рестриктаз входят в состав РМ-систем типа II, являющегося наиболее простым. Для этого типа РМ-систем характерен палиндромнын сайт узнавания, имеющий симметрию вращения второго порядка. К типу II относятся хорошо известные РМ-системы b'coRI (сайт узнавания 5'-GAATTC-3'), ЛИЛ (5'-AGCT-3'), Pst] (5'-CTGCAG-3'), Taq\ (5'-TCGA-3'), Xbal (З'-ТСТАОА-З') и многие другие.

В последнее время интерес исследователей привлекают бактериальные РМ-системы, имеющие несимметричный сайт узнавания. Как правило, рестриктазы таких РМ-систем расщепляют ДНК в стороне от сайта узнавания, в связи с чем они были названы рестриктазами типа IIS (от слова «shift» - сдвиг). Рестриктазы и метилазы РМ-систем типа IIS были открыты существенно позднее и значительно менее изучены, касается ли это их структуры и механизма действия или организации оперонов таких систем.

Цель настоящей работы заключалась в изучении структуры оперонов бактериальных систем рестрикции-модификации типа IIS и отдельных генов метилаз, входящих в эти РМ-системы, сравнительном анализе аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа, изучении свойств и субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз бактериальных РМ-систем типа IIS.

В задачи исследования входило:

1. Определение нуклеотидной последовательности и организации оперонов трех систем рестрикции-модификации IIS типа: &S/F5I (сайт узнавания 5'-GGATG-3'), Faul (5'-CCCGC-3'),.S/aNI (5'-GCATC-3').

2. Сравнительное изучение первичной структуры ДНК-метилаз РМ-систем типа IIS Bs tF 51, Faul, SfcMl и определение типа каждого фермента и метилируемого им основания.

3. Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I в составе экспрессирующего вектора и получение гомогенных препаратов данных ДНК-метилтрансфераз.

4. Установление субстратной специфичности клонированных ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I.

5. Определение оптимальных условий метилирования ДНК клонированными ферментами и установление кинетических параметров реакции метилирования олигонуклеотидных дуплексов и ДНК фага лямбда.

6. Сравнительный анализ кинетических параметров реакции метилирования природных субстратов ДНК-метилтрансферазами типа IIS и метилазами, модифицирующими палиндромные сайты узнавания.

Научная новизна

Впервые описана система рестрикции-модификации, содержащая четыре гена ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт. Проведено определение полной нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы В st? 51 из Bacillus stearothermophilus F5, содержащего четыре однонаправленных и расположенных друг за другом генов ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, направленный им навстречу.

Впервые описана система рестрикции-модификации, в которой ген рестриктазы расположен между генами метил аз. Установлена нуклеотидная последовательность РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile. Оперон РМ-системы Faul состоит из однонаправленных гена контрольного белка, гена первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, гена эндонуклеазы рестрикции и гена второй ДНК-метилазы M2.FauI.

Впервые описана система рестрикции-модификаци ¿TaNI из Streptococcus faecalis ND547 и проведено клонирование всего оперона РМ-системы 5/eNI, содержащего однонаправленные и расположенные последовательно ген метилазы и ген рестриктазы SfaNI.

Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности клонированных ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа между собой и с другими метилазами с известной структурой. Определен тип каждой метилазы РМ-систем BstF5l, Faul и SfaNI и изучена их субстратная специфичность.

Определены оптимальные условия реакции метилирования ДНК клонированными ферментами Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I.

Установлены кинетические параметры реакции метилирования природных ДНК и олигонуклеотидных дуплексов ферментами Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I.

Показано, что коэффициент специфичности {kQJKm днк) большинства ДНК-метилтрансфераз, узнающих палиндромные сайты узнавания, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.

Теоретическая и практическая значимость. В результате работы исследованы новые системы рестрикции-модификации IIS типа из штаммов Bacillus stearothermophilus F5, Flavobacterium aquatile и Streptococcus faecalis ND547.

Проведенное детальное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз, входящих в состав РМ-систем IIS типа со множеством метилаз, вносит новый вклад во всестороннее исследование процессов метилирования ДНК и роли ДНК-метилтрансфераз в бактериальной клетке, способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификации в частности и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.

Получение штаммов-продуцентов четырех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5\, двух ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Faul, ДНК-метилтрансферазы M.SfaNI расширяет генно-инженерный и аналитический инструментарий при изучении геномных ДНК и исследовании их взаимодействия с белками и ферментами нуклеинового обмена. В частности, ДНК-метилтрансфераза M3.BstF5I входит в список продуктов, реализуемых компанией «СибЭнзим» [www.sibenzyme.com], и была использована при исследовании процессивности взаимодействия ферментов с ДНК [Zinoviev V.V., 2003, 2007].

Основные положения, выносимые на защиту:

- Оперон РМ-системы Ä«F5I из Bacillus stearothermophilus F5 содержит четыре однонаправленных и расположенных друг за другом гена ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, ориентированный навстречу. РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт, описана впервые.

- Оперон РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile состоит из однонаправленных генов контрольного белка, первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, эндонуклеазы рестрикции и второй ДНК-метилазы M2.FauI. Такое необычное строение оперона с наличием гена контрольного белка перед геном метилазы и расположением гена рестриктазы между генами метилаз обнаружено впервые.

- Система рестрикции-модификации S/aNI из Streptococcus faecalis ND547 состоит из однонаправленных генов ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.

-ДНК-метилтрансферазы Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I являются Ы6-аденин-ДНК-метилтрансферазами, при этом M2.BstF5I и M3.BstF5I относятся к альфа типу, Ml.BstF5I принадлежит бета типу, а M4.BstF5I имеет первичную структуру дельта типа.

- Субстратная специфичность клонированных Ml.BstFSI, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I имеет следующие отличия:

- Ml.BstF5I и M3.BstF5I узнают и модифицируют верхнюю цепь сайта 5'-GGATG-3', тогда как M2.BstF5I и M4.BstF5I метилируют нижнюю цепь этого сайта;

- Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M4.BstF5I метилируют только установленный сайт узнавания, тогда как M3.BstF5I модифицирует также сайт 5'-GGATC-3' с £clt в 20 раз меньше.

-Ферменты Ml.BstF5I и M4.BstF5I предпочтительно модифицируют полуметилированный дуплекс и, вероятно, участвуют в пострепликативном метилировании вновь образованной ДНК.

-Коэффициент специфичности (&са/Кт днк) большинства ДНК-метиягрансфераз, узнающих палиндромные сайты, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.

Апробация материалов диссертации. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1996; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1997; 4 New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Innsbruck, 1997; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1999; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 2000; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 2001; 3-й съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002; 4-й съезд биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.

Реализация результатов исследования. Материалы диссертации изложены в 15 статьях, все статьи опубликованы в научных журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из шести разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 189 страницах машинописного текста и включает 41 рисунок, 22 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 270 ссылок.

Вклад автора в диссертационную работу. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все основные эксперименты, проведенные в работе, выполнены лично автором, а также руководимыми им сотрудниками и аспирантами. Существенный вклад в исследование был сделан Л.Н.Голиковой, у которой автор являлся руководителем диссертационной работы. На разных этапах в работе принимали участие Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Гончар Д.А., Кузнецов В.В., Евдокимов A.A.

Автор благодарит всех участников за плодотворное сотрудничество. Автор выражает особую признательность профессору С.Х. Дегтяреву и профессору Э.Г. Малыгину, чьи приоритетные исследования были положены в основу настоящей работы.

Работа выполнялась в ФГУН ГНЦВБ Вектор Роспотребнадзора в рамках научных тем организации 1996-2002 гг., по грантам РФФИ 98-0449514, РФФИ 00-04-49153 и МНТЦ 3312, в которых автор являлся руководителем; в рамках гранта РФФИ 02-04-48909 и US Public Health Service grant from the Fogarty International Center (No. TW00529), в которых автор являлся исполнителем.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Определение структуры оперона РМ-системы BstFSl

Одной из наиболее интересных задач представлялось изучение РМ-системы IIS типа бактериального штамма Bacillus stearothermophilus F5, узнающей непалиндромную последовательность 5'-GGATG-3' (сайт расщепления 2/0). Штамм-продуцент данной РМ-системы был выделен из природных изолятов в 1996 году [Abdurashitov М.А., 1996].

РМ-система BstF5l имеет одинаковый сайт узнавания с хорошо изученными РМ-системами IIS типа FokI из штамма Flavobacterium okeanokoites и из штамма Streptococcus sanguis 54, однако R.Fokl расщепляет ДНК в положении 9/13, a R.StsI - в положении 10/14.

На первом этапе были получены геномные библиотеки ДНК штамма üsfF5I по нескольким рестриктазам. Затем, основываясь на методе, впервые предложенном в работе P. Venetianer и соавт. [Posfai G., 1983] и впоследствии названном hungarian trick, были получены плазмиды, несущие гены bstF51 ДНК-метилтрансфераз.

1.1. Получение геномных библиотек по R.Ksp22f, R.AluI и R.BstX21 и плазмнд pF5-l, pF5-21 и pF5-32

Первую геномную библиотеку штамма бактерии Bacillus stearothermophilus F5 получали по методу Е.Р. Забаровского и Р.Л. Алликметса [Забаровский Е.Р., Алликметс P.JI., 1986]. ДНК В. stearothermophilus F5 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Ksp22I (сайт узнавания 5'-TAGATCA-3'), и образовавшиеся липкие концы достраивали нуклеотидами dATP и dGTP с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Векторную плазмиду pMTL22 линеаризовали рестриктазой Sali (сайт узнавания 5'-GATCGAC-3'), и образовавшийся липкий конец достраивали нуклеотидами dCTP и dTTP с помощью фрагмента Кленова. Полученные в результате достройки вектор и фрагменты геномной ДНК имели липкие концы 5'-ТС-3' и 5'-GA-3\ соответственно, и эффективно сшивались друг с другом.

Для получения второй геномной библиотеки проводили частичный гидролиз ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой рестрикции Alul (сайт узнавания 5'-AGACT-3'). В качестве векторной плазмиды использовали pMTL22, линеаризованную R.Smal.

Для получения третьей геномной библиотеки применяли частичный гидролизат хромосомной ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой

рестрикции BstX2I (сайт узнавания 5'-R'GATCY-3')- В качестве векторной плазмиды использовали pMTL22, линеаризованную R.BamHI.

После лигирования и трансформации выделяли суммарный пул плазмид, которые подвергали исчерпывающей рестрикции R.BstF5I. После проведения повторной трансформации отбирали клоны, несущие плазмиды, устойчивые к расщеплению ферментом R.BstF5I. Плазмиды были названы pF5-l, pF5-21 и pF5-32, соответственно. Последовательность клонированных фрагментов ДНК определяли с помощью метода Максама-Гилберта [Махаш A.M., Gilbert W„ 1977].

1.2. Картирование участка ДНК, несущего вставки из плазмид pF5-1, pF5-21 и pF5-32

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, клонированных в плазмидах pF5-l, pF5-21 и pF5-32, показало, что они взаимно перекрываются. На рисунке 1 схематично представлена структура клонированной части РМ-системы ÄsiF5I. Фрагменты в плазмидах pF5-l и pF5-21 перекрываются на 119 нуклеотидов, а в плазмидах pF5-21 и pF5-32 -на 821 нуклеотид. Выравнивание полученных первичных структур клонированных фрагментов ДНК позволило установить нуклеотидную последовательность общего фрагмента геномной ДНК штамма Bacillus stearothermophilus F5 длиной 4747 п.н., несущего ферменты РМ-системы ÜS/F5I. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что данный фрагмент ДНК кодирует три полные рамки считывания и часть четвертой рамки, расположенные последовательно друг за другом.

BamHI / BstX2I

isiF5IM-3

ГSmil

Ksp22I-<}>parMeHT

1ШХ21-фрагмекг

119 п.н.

821 п.н.

Alul-фрагмент

Рис. 1. Клонирование части РМ-системы Bst¥5l.

На рисунке 2 представлена часть нуклеотидной последовательности фрагмента 4747 п.н. с указанием ключевых элементов рамок считывания.

-35 -10

1141 атсзастааст аататтаатт сааттсзатас таааататат сгтаататат аа^асда^гаа

/к(Р51М1 50 1201 с-тсатетса? ттаттогсса атттатсааа сстасаасас сассоаттаа астсстттсс 1261 аататтстта атаааасата ттстсттсзат твтстазаас (заатесоааа тттаттааат -----------------------------------------------------------------------------4йР51М1

1921 аатсасоаст асстасаоат тссааатсаа асваттаааа ататтсааст атстстаата 1981 тааатаасат ссстстттос соассаааас таааттт^са ттаастта(за аатоатссат 2041 атаата |аатт таоаататсс атаааооааа ссстсстс^> [а атттасаата тссатааасв! _к _кТандемед>ш повтор

2101 ьбасссстсс тст>сстсс16с тсатм>ттат<атат5 а6с1тт ттттаттттт ттаатааааа

_Инвертированный повтор Поли-АТ-последовательность

2161 ттттастттт с |ааосаасс| с ааасгтатсс ааасаасааа сстаааотат атаааатстс бэ /шк51м2

2221 саттоаатта тасассасст ааатттааот тасттсатса сататтасст аааттсссса 2941 сстстсааас саатсаатат ттсстатасс стататсттс ааастатаст аатассастт

3001 атсатаоааа асассстаас асттстттас аасттттаат тасааастас оатсттабип . М(Е51МЗ 50

3061 нгатаааста АТСасатата тссссассаа астаттаттс стасатаааа тааатоааст

__Л.«Р51М4

4081 тататтттас сстдааааф 6саа1лттат(3 атотатсааа ТТТСТТААТв ААвААСЯСТТ

эб :

4141 аааааааста ата(зааааоа ааааастттс тсаттаттса сатоаааттт тааатсаатт

Рис. 2. Частичная нуклеотидная последовательность фрагмента 4747 п.н. из оперона РМ-системы Д#Р51. Выделены старт и стоп-кодоны генов метилаз. Последовательности БО обведены.

Как видно из рисунка, перед первой рамкой имеется последовательность 5' -ТГС АТА>1( 18)ТАТА АТ-3', которая строго соответствует каноническому прокариотическому промотору, а сигнальные последовательности Шайна-Дальгарно предшествуют всем рамкам считывания. Мы не обнаружили терминатора транскрипции в составе данного фрагмента ДНК. Исходя из этого, можно заключить, что изучаемый фрагмент 4747 п.н. представляет собой часть оперона и содержит промотор, три полных и одну неполную рамку считывания. Поскольку все три плазмиды рР5-1, рР5-21 и рР5-32 устойчивы к расщеплению ферментом Я.Вз1Р51 и содержат по одной полной и отличающейся от других рамке считывания, можно заключить, что данные рамки кодируют три различных Я#Р51 ДНК-метилтрансферазы, названные, соответственно, М1.В51Р51, М2^Р51 и МЗ.Вз1Р51.

1.3. Анализ аминокислотных последовательностей трех рамок считывания

1.3.1. ДНК-метилтрансфераза М1.1ЫЕ51

Ген ДНК-метилтрансферазы М1.Вз1Р51 лежит непосредственно за промоторной областью и последовательностью Шайна-Дальгарно в положении 1204-1983 п.н. Анализ аминокислотной последовательности М1.Вб1Р5 выявил в структуре фермента набор консервативных мотивов, расположенных в порядке, характерном для р класса ДНК-метилтрансфераз [Ма1опе ТЬ., 1995]. Кроме того, наблюдалась сравнительно высокая степень идентичности выявленной метилазы другим представителям класса Р ДНК-метилтрансфераз, таких как М.БрпА (28,5%), М.НшЯ (31,7%) и М.МЬо1С (29,0 %).

1.3.2. ДНК-метилтрансфераза М2.В8(Е51

Ген ДНК-метилтрансферазы М2.Вб1Р51 расположен в позиции 21873071 п.н. (рис. 2) и имеет хорошо выраженную сигнальную последовательность Шайна-Дальгарно. Гены ферментов М2.Вз1Р51 и М1.Вб1Р51 ориентированы в одном направлении и разделены спейсером из 204 п.н. Интересно отметить, что между двумя генами располагаются тандемный повтор (длины звеньев 33 и 34 п.н., из них 31 п.н. идентичны), инвертированный повтор (длина звена 8 п.н.), а также АТ-богатый участок из 32 п.н. (рис.2). Пока еще не выяснено, играют ли эти структурные особенности какую-либо роль в транскрипции и трансляции генов оперона РМ.&/Р51, однако известно, что наличие таких повторов свидетельствует об интеграции в геном по данным повторам чужеродной ДНК [Смирнов Г.Б., 2008]. Можно также предположить, что структурная комбинация инвертированный повтор - Т-богатая последовательность, аналогичная Шю-независимым терминаторам, но в отличие от них не содержащая значительного количества вС-пар в повторе, в данном случае может выполнять роль аттенюатора транскрипции. ДНК-метилаза М2.Вз1Р51 состоит из 294 аминокислот. Множественное выравнивание аминокислотной последовательности М2.Вб1Р51 с другими белками показало, что М2.Вз1Р51 содержит консервативные мотивы метилаз, расположенные в порядке, характерном для а класса ДНК-метилтрансфераз, и имеет наибольшее сходство с С-доменами метилаз М.Рок1 и М.БЫ. Уровень гомологии составляет 54,0% идентичности и 79,8% сходства с М.Рок1С, 49,7% идентичности и 80,7 % сходства с М.БйГС. Доказанная функция М2.В81Р51 как ДНК-метилазы в совокупности с данными по гомологии М2.Вз1Р51-2 с М.РокГС и М.МС позволяет утверждать, что М2.Вб1Р5 модифицирует адениновое основание в нижней цепи сайта узнавания 5'-ССАТС-3'.

1.3.3. ДНК-метилтрансфераза МЗ.В$1Р51

На прочитанном участке бактериальной хромосомы ген ¿5/Р51МЗ занимает область 3071-4111 п.н. За 10 п.н. до старт-кодона 6.^51МЗ находится каноническая последовательность Шайна-Дальгарно 5'-АСОАО-

3'. M3.BstF5I состоит из 346 аминокислотных остатков. Множественное выравнивание аминокислотной последовательности M3.BstF5I с другими белками выявило, что данный белок содержит консервативные мотивы метилаз, расположенные как у а класса ДНК-метилтрансфераз. При этом M3.BstF5I имеет максимальную степень сходства с N-концевыми доменами ДНК-метилтрансфераз M.Fokl (79,9 % сходства и 57,2 % идентичности) и M.StsI (77,5 % сходства и 47,6 % идентичности). Известно, что N-концевой домен M.Fokl и M.StsI отвечает за модификацию аденинового основания в верхней цепи последовательности 5'-GGATG-3' [Posfai G., 1988; Sugisaki H., 1989], что позволяет говорить об аналогичной специфичности фермента M3.BstF5.

1.3.4. Анализ первичной структуры четвертой рамки считывания

В секвенированном нами фрагменте геномной ДНК длиной 4747 п.н., вплотную за геном M3.BstF5I, находится еще одна неполная рамка считывания. Она имеет длину 632 нуклеотида и также содержит последовательность Шайна-Дальгарно перед старт-кодоном. Нами было проведено выравнивание аминокислотной последовательности данной рамки считывания с различными белками и показано, что кодируемый четвертой рамкой белок имеет сходство с ДНК-метилтрансферазами, что позволяет предположить существование четвертой метилазы в опероне РМ-системы BstFSI.

1.3.5. Определение первичной структуры гена M4.BstF5I

Полную нуклеотидную последовательность гена ¿>s,iF5M4 определяли с помощью метода "прогулки" по хромосоме [Siebert P.D., 1995] (рис.3). Для этого геномную ДНК B.stearothermophilus F5 обрабатывали порознь эндонуклеазами рестрикции EcoRV и Sspl, которые расщепляют ДНК с образованием тупых концов. Полученные фрагменты геномной ДНК лигировали со специфическим двуцепочечным адаптором:

5'-GCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'

3'-CGCCTCCCGCCA-5'

Фрагменты геномной ДНК, фланкированные с двух сторон адаптором, обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli в присутствии dNTP (для получения тупых концов адаптора). Полученные таким образом фланкированные фрагменты геномной ДНК использовали в ПЦР в качестве матриц. Амплификации проводили с адапторным праймером (PI) 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3', который соответствует внешней части адаптора, и генспецифическим праймером 5'-

GAGCATAACCTCCACGAACT-3', сконструированным на основе уже известной последовательности гена èiiF5IM-3 (олигонуклеотид, идентичный 3'-концевой области кодирующей цепи ДНК гена ès/F5IM3).

Далее проводили второй раунд ПЦР («nested» ПЦР) с использованием адапторного праймера (PII): 5'-AGGGCGTGGTGCG

ОАССССССТ-З' и праймера (N11) 5'-САТТТСТТСАСС СТТАТССТСА-З', идентичного известной последовательности 5'-концевой области кодирующей цепи ДНК ОРТ4.

В результате были получены продукты двух полимеразных цепных реакций длиной 1700 п.н. с гидролизата ЕсоЯУ и, как оказалось, его более короткий вариант 1200 п.н. с гидролизата Звр! (рис. 3).

EcoRV

¿«F5MI-3

Рис.3. Получение ПЦР-фрагментов ОРТ4. Черными прямоугольниками обозначены праймеры: N11 — генспецифический, PII - адапторные. Серым цветом обозначена область перекрывания ранее известной последовательности и последовательности ПЦР-фрагментов.

Первичную структуру ПЦР-фрагмента 1700 п.н. определяли на автоматическом секвенаторе. Сопоставление нуклеотидной

последовательности секвенированного фрагмента 4747 п.н. (см. рис. 2) и секвенированного ПЦР-фрагмента (1700 п.н.) позволило определить нуклеотидную последовательность фрагмента РМ-системы BstF5 длиной 5300 п.н., представленную в базе данных GeneBank под номером Х97069. Данный фрагмент ДНК содержит полную рамку считывания M4.BstF5I длиной 1146п.н. в положении 4115-5260 п.н.

1.3.6. Клонирование гена ¿s*F5M4

Для доказательства фунциональной активности предполагаемого гена метилазы M4.BstF5I мы проводили двухэтапное клонирование полной рамки считывания гена ÔS/F5M4. Вначале ПЦР-фрагмент длиной 1200 п.н., полученный с Sspl гидролизата геномной ДНК, обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli в присутствии dNTP . В качестве вектора использовали плазмиду pMTL22, линеаризованную R.Smal. После проведения лигазной сшивки и трансформации были отобраны клоны, несущие 3'-концевую область ¿\siF5M4. Далее из этой конструкции готовили вектор для следующего этапа клонирования по сайтам рестрикции BglII и Smil. Из плазмиды pF5-32 вырезали фрагмент 1000 п.н. по сайтам рестрикции BstX2I и Smil, несущий 5'-концевую область ОРТ4 (рис.1).

В результате лигирования и трансформации были получены два клона, рестрикционно идентичные и устойчивые к воздействию эндонуклеазы рестрикции BstF5I. Таким образом, нами была доказано, что ген 6.s/F5M4

Sspl г____-670пн___-, SsPf EcoRV

^ I I

--1200П.н--------

--------1700п.н--

ОРТ4

действительно кодирует функционально активную четвертую ДНК-метилтрансферазу M4.BstF5I РМ-системы BstFSl.

1.3.7. Определение типа ДНК-метилтрансферазы M4.BstF5I

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности (381 аминокислотный остаток) показал, что метилаза M4.BstF51 содержит как минимум шесть из девяти консервативных метилазных мотивов (мотивы I, И, IV, VI, VII и X) и наиболее гомологична ферментам р типа адениновых ДНК-метилтрансфераз, однако обнаруживает иной порядок расположения участков, ответственных за катализ (мотивы X, I, II) и связывание S-аденозил-Ь-метионина (мотивы IV, VI, VII). Поскольку N-концевая область белка (аминокислотные остатки 1-144) не проявляет значительного сходства с известными белковыми последовательностями, она, по-видимому, может содержать участок, ответственный за узнавание специфического сайта ДНК (TRD - target recognition domain). Таким образом, в соответствии с классификацией ДНК-метилтрансфераз, мы отнесли M4.BstF5l к классу С [Malone Th., 1995]. С применением программы CLUSTALW проведено выравнивание полной аминокислотной последовательности M4.BstF5I с двумя ДНК-метилазами С,-класса, описанными на сегодняшний момент в литературе: M.BcnIA и M.Tvol413P. Уровень идентичности аминокислотных последовательностей M4.BstF5I с M.BcnIA составляет 30,6%, гомологии -47,0%, уровень идентичности с M.Tvol413P - 27,9%, гомологии - 49,0%. Следует отметить, что Thermoplasma volcanium [Kawashima Т., 2000], также как и B.stearothermophilus F5, относится к термофильным микроорганизмам. На рисунке 4 приведено расположение функциональных доменов первичных структур ДНК-метилтрансфераз РМ системы ñs/F5I по классификации Малоне с соавт.

Каталитический домен (мотивы IV-V1II)

AdoMet-связывающий домен (мотивы I, II, III, X)

ДНК-узнающий домен (TRD)

Ml.BslFSI

¡'-класс

M2.BstF5I, M3.BstF5l

M4.BstF5I

£-класс

Рис. 4. Расположение функциональных доменов первичных структур ДНК-метилтрансфераз РМ-системы Д«/751 по классификации Малоне с соавт.

1.3.8. Клонирование гена 65^5111

При анализе нуклеотидной последовательности ДНК, лежащей за геном ¿Л7Р51М4, был обнаружен фрагмент еще одной рамки трансляции. Полную нуклеотидную последовательность пятой рамки мы определяли в

два этапа с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров PI, PII и адаптера, структура которых приведена в пункте 1.3.5.

Геномную ДНК B.stearothermophilus F5 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Sspl. Полученные фрагменты лигировали с адаптером, достраивали 5'-выступающие концы и использовали в реакции ПЦР в качестве матрицы. Амплификацию проводили с адапторным праймером PI и генспецифическим праймером 5 ACGTCTTTCGTAATGCC A AT АС-3 сконструированным на основе уже известной последовательности, идентичной 3'-концевой области комплементарной цепи ДНК гена, несущего ОРТ5.

Далее проводили второй раунд ПЦР («nested» ПЦР) с использованием: адапторного праймера РИ и праймера 5'-GTGGCATAATAATTCCATCGAG-3', также идентичного известной последовательности ОРТ5. В результате ПЦР получили фрагмент длиной 1000 п.н., нуклеотидную последовательность которого определяли на автоматическом секвенаторе. Для второго этапа ПЦР фрагменты геномной ДНК, гидролизованные эндонуклеазой рестрикции BsuRI, готовили, как описано выше. ПЦР последовательно проводили с теми же адапторными праймерами PI, PII и генспецифическими праймерами, сконструированными на основе известной струюгуры, идентичной З'-концевой области комплементарной цепи ДНК гена, несущего ОРТ5:

5'-ACTTTAGGTCTGCTCCTCAGTG-3' и

5'-GACTCAACAATAATCCCTCCAG-3'

В результате был получен ПЦР-фрагмент длиной 800 п.н. Сопоставление ранее известной нуклеотидной последовательности и двух ПЦР-фрагментов позволило установить полную ОРТ5 длиной 1398 п.н. Данная рамка не имела гомологии с генами ДНК-метилтрансфераз, и нами было сделано предположение, что ОРТ5 кодирует ген эндонуклеазы рестрикции BstF5I.

ОРТ5 была получена методом ПЦР и встроена в экспрессирующий вектор pJW2 по сайтам рестрикции BamHI и FauNDI [Kossykh V.G., 1995]. Для трансформации использовали компетентные клетки Е. coli штамм RRI, несущие плазмиду pACYC-M2M3 (в плазмиду pACYC-184 [Chang A.C.Y., Cohen S.N., 1978] по сайтам рестрикции SphI и BamHI были встроены гены ДНК-метилтрансфераз ¿wfF5M2 и ¿W/F5M3 для предотвращения ауторестрикции).

На рисунке 5 приведены данные по анализу эндонуклеазной активности одного из клонов на субстратных ДНК.

1 2 3456789 10 11

Рис.5. Электрофореграмма тестирования активности R.BstF5I в клеточных люатах. Дорожки: 1 - ДНК фага X; 2-5 - продукты гидролиза ДНК фага X; 6 -маркер молекулярных весов ДНК (от 250 до 10000 п.н.); 7 - плазмидная ДНК pUC19; 8-11 - продукты гидролиза плазмидной ДНК pUC19. Разведение клеточных лизатов в реакционной смеси: 2, 8 - 1/4; 3, 9 - 1/20; 4, 10 - 1/40.

Дорожки 5,11- продукты гидролиза ДНК-субстратов коммерческим препаратом эндонуклеазы рестрикции BstF5I.

Таким образом, нами определена структура оперона РМ-системы IIS-типа BstFSl, включающая четыре гена ДНК-метилтрансфераз и ген эндонуклеазы рестрикции (рис.6а). На рисунке 66 представлено сравнение оперонов РМ-систем IIS типа BstF5l и Fokl.

&S/F5IM1 (1303-1983)

-мотор-10 (1180-1188)

foff5IM4 (4115-5260)

/Терминатор ,транскрипции / (5260-5287) / у R.IIp0M0T0p -10 (6718-

^»Ч^^^^И ( ( 6726)

R.Промотор -35 (6742-

Промотор-35 (1159-1164) toF5IM3 (3071-4111) toF5IR (5291-6688)

6747)

Рис.6а. Структура оперона системы рестрикции-модификации ÄsiF5I.

brfF5IM-2

САТСС, 294 а.1С ÜrfFSIM-l 57,6%

идентичности

PM.B.f/F5I [

PM.FoH

iilF5IM-3

GGATG, 346 а к.

S4ß% идентичн ости

N- домен

С — долен

^GOATG, 367 a.KL САТСС, 312 а.к. j

MJokI

GOATO/CATCC, 647 а к.

Рис. 66. Сравнение оперонов РМ-систем IIS типа BstFSl и Fokl.

2. Определение структуры оперона РМ-системы Faul

2.1.0пределение нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы Faul

РМ-система Faul из Flavobacterium aquatile является уникальной среди всех пяти- и шести нуклеотидных РМ-систем IIS типа, поскольку сайт узнавания этой системы состоит только из GC пар и представляет собой последовательность 5'-CCCGC-3' Сайг узнавания R.FauI обозначается как 5'-CCCGC(N)4/6-3', что соответствует расщеплению ДНК на расстоянии 4/6 нуклеотидов от узнаваемой последовательности. Для получения геномной библиотеки хромосомную ДНК штамма F. aquatile гидролизовали R.Xbal. После лигирования с векторной плазмидой pMTL22 и трансформации выделяли суммарный пул плазмид, обрабатывали их R.FauI. После повторной трансформации отбирали плазмиды, устойчивые к расщеплению R.FauI. Анализ клонов показал, что один из них проявляет активность эндонуклеазы рестрикции Faul. Плазмида размером около 9000 п.н., выделенная из этого клона, названа pFAU42. После рестрикционного картирования плазмиды pFAU42 были проанализировали ее делеционные варианты. Выяснилось, что одна из плазмид с делецией Afel-фрагмента, названная pFauI-1, сохранила фенотип M+R+. Клонированный фрагмент ДНК из этой плазмиды, длиной более 5000 п.н., секвенировали по методу Максама-Гилберта. Часть установленной нуклеотидной последовательности с указанием ключевых элементов рамок считывания представлена на рисунке 7. Данный фрагмент ДНК содержит полный оперон с промотором и терминатором транскрипции и включает четыре открытых рамки считывания ОРТ1, ОРТ2, ОРТЗ и ОРТ4.

361 tttttccaat gttgtattta сттатааааа ataattgaat taacaaattt gcaaaagtaa

_С-бокс__OPTI

421 aagatttggg taaat]xrgtc attaattgac афттттаат ttgcaagcat atgaaagcaa 481 catttggcga atatatcaag atgctaagga cagaaaaggg tttgacctta actcaacttg 541 catttcaact tgatctagat tctgcaaatc ttagtaaaat cgaaaatgga aaacgggaat

OPT2

781 gaaaaataaa ttttgacgat gaaaaatäag ccaacagtaa tagacttgtt ttgtggttgt 841 ggagggcttt cttacggttt catagaagca ggttataacg ttcttttagg aattgaccat

1741 ttaggaagta aaactagtca gtataaacaa gtgggaaacg cagttcctcc tttgttagcc

OPT3,

1801 aaagtgttag caatagaaat taaaaagtat ctatgaaaga aataaaaact tatgaaatac 1861 ctgatgaata cttttttcgt ttacatcatg taagacctcg cttcaaaaat gatgttgaag 3181 aattaggtaa tattagaatt gacaaaaatt tagttgttga attttctaaa tcatcaggac

OPT4

3241 aatggaacaa attattggaa atagcaaact ^äaagttgca tcactttttt gtggttgtgg 3301 cggtatggac gtaggtattc agggagattt taaatttctt aaaaagcact atgatacatt 4201 tgcaaacgca ■rtaa^gaga gttgtgtaga aaatattgtg aaaagcaaat cagaagaatg 4261 rffl'tcaagtt tft> <ataaactt gaaaacattc тт1tcgacaca tccttgtata atgctgacga

v 4 Инвертированный повтор

4321 tagtttatag ttggaatata cagtgcaacc gtcattgaat cagcttctcc tacttccact 4381 tttttcttgc tgattatata ttgccaagtt aggagatatt taactcttat tatgcaagaa

5161 gtttccatag gttgctttat gaaacagata gatct

Рис.7. Частичная нуклеотидная последовательность фрагмента бактериальной ДНК штамма Flavobacterium aquatile.

Предполагаемый промоторный участок оперона - расположенная перед ОРТ1 последовательность 5'-TTGCAAN16ТАААТТ-3'. Терминатором транскрипции служит, очевидно, протяженный инвертированный повтор с длиной звена 19 п.н. в положении 4254-4292 п.н. клонированного фрагмента. Участки связывания рибосом перед всеми генами выражены слабо, что согласуется с выводом о невысоком уровне экспрессии генов ферментов этой системы, сделанном нами по результатам выделения рестриктазы и метилаз как из штамма дикого типа, так и из Е. coli RRI, несущей плазмиду pFauI-1 с опероном системы Fau\.

2.2. Определение функции белка, кодируемого ОРТ1 ОРТ1 находится в районе 471-809 п.н. и кодирует белок длиной 112 аминокислот. Нами было проведен сравнительный анализ его первичной структуры и аминокислотных последовательностей родственных белков. Регулятор транскрипции, кодируемый ОРТ1, относится к семейству НТН_3 по классификации PFAM [Bateman А., 2002] (асс. по. PF01381) и рассматривается как контрольный белок РМ-системы Faul. Ранее для ряда белков других РМ-систем была выявлена гомологичная нуклеотидная последовательность, которая может служить участком связывания С-белков (так называемый С-бокс) [Vijesurier R.M., 2000].

Этот участок располагается на расстоянии 20-50 п.н. до инициаторных кодонов генов контрольных белков. Проведенный нами

анализ выявил палиндром TTOTCAN5TGACAA, расположений за 18 п.н. до инициаторного кодона ATG, с которым может взаимодействовать белок C.FauI. Следует отметить, что тетрануклеотид TTGT, входящий в этот участок, найден в известных участках связывания целого ряда регуляторных белков, включая Lacl, А, CroHSinR [Cervin М.А., 1998].

2.3. Определение функций белков, кодируемых ОРТ2 и ОРТ4

ОРТ2 расположена вслед за ОРТ1 в положении 799-1836 п.н. и перекрывается с нею на 10 нуклеотидов. ОРТ4 находится в положении 32424273 п.н. Последовательность продукта ОРТ2 составляет 345 аминокислотных остатков, тогда как ОРТ4 — 343 аминокислоты. Наличие в структурах обеих ОРТ консервативных мотивов DPPY и FxGxG свидетельствует о том, что данные белки принадлежат к С5-ДНК-метил-трансферазам. Белки, кодируемые ОРТ2 и ОРТ4, были названы Ml.Faul и M2.FauI, соответственно. Обе метилазы содержат 10 консервативных мотивов, характерных для ДНК-метилтрансфераз класса С5.

У ферментов данной группы участок, ответственный за специфическое связывание ДНК, обладает высокой вариабельностью. У метилаз системы Fau\ этот участок, как и у большинства других С5-метилаз, расположен между восьмым и девятым консервативными мотивами. В таблице 1 представлены данные по сходству обеих метилаз с известными ДНК-метилтрансферазами. В целом уровень гомологии аминокислотных последовательностей двух ДНК-метилаз РМ-системы Faul составляет 39,0 % сходства и 26,0 % идентичности. Интересно, что группа ферментов, гомологичных Ml.Faul, включает метилазы с различными участками узнавания. В то же время М2.Раи1-подобные метилазы узнают преимущественно участки с существенным преобладанием CG-nap.

Таблица 1

ДНК-метилтрансферазы, гомологичные Ml.Faul и M2.FauI

Метил аза системы РМ Faul Гомологичная Участок Сходство, Идентичность,

метил аза узнавания* % %

М.НруА VIB CCTC 51 39

M.HphlA ТСАСС 48 39

Ml.Faul M.Ddel CTNAG 48 37

M.BspLU 11 ШВ GTCCC 47 34

M.NspHI RCATGY 47 34

M.LIaDH GCNGC 49 34

M.Haell RGCGCY 46 31

M2.FauI M.HaeIH GGCC 44 33

M.Hhal GCGC 44 29

M.ScrFIA CCNGG 44 28

Примечание: * Подчеркнуты метилируемые основания.

2.4. Определение функции белка, кодируемого ОРТЗ

ОРТЗ находится в положении 1833-3272 п.н. и перекрывается как с faitlMX (три нуклеотида), так и с faulMl (30 нуклеотидов). ОРТЗ кодирует белок из 479 аминокислотных остатков, который предположительно является рестриктазой Faul, так как других ОРТ, способных кодировать ген рестриктазы, в данном опероне нет. Удивительная особенность эндонуклеаз рестрикции класса II - отсутствие значительной гомологии первичных структур у отдельных представителей рестриктаз [Pingoud А., 2001]. Исключение составляют лишь некоторые истинные изошизомеры, т.е. ферменты с одинаковыми участками узнавания и положением расщепляемой связи в ДНК. Нами было выявлено, что R.Faul имеет наибольшую гомологию с сайт-специфичной никазой N.BstSEI (сайт узнавания 5'-GAGTC-3') и рядом рестриктаз, включая Hgal и NineBI (сайт узнавания обеих 5'-GACGC-3'), а также Piel (5'-GAGTC-3'), Mlyl (5'-GAGTC-3') и Alwl (5'-GGATC-3') (рис. 8).

95 PGVTAKR§A§NQYLDEFFHYFeYSEfYPGGHl|SQNVIKQIEÄNIKFK§CQFIME|LIEGEKLTGKP 161

YIQKI FLTtíWAI PFPHPYiB-------TDESIQLYB®LIFK|LSDERLDCKLF 151

KLSKIFSCM§ISN|FPHPYS§-------PSECFLLYJFRLIFKJLLDKRLQGRLY 160

92 iteagk(^a|niírpkdvflko§vkw¡ypsfqh¡gkey—peeewsin|lvfvls|lkkvgglskld 155

R.Faul

R.NbeBI

R.Hgal

N.BstSEI

R.Mlyl

R.Plel R.AiwI

90 ltkagnq 90 ltdagve

V§aKRLPELFTKQ§LK IKAKRKDDIFLRQMLK!

lpspyhtqs-----ptvnfnv]

ilpspyhllsd----kaalfyv

rMylellr!

k¡yle)Fpf

inelgsiskte 151 ivrhfgsltfde 152

93 ltengpn|l|sv>tlqsdqecy§rslilysykaens-----dnpggffs|lmltlhimkeleirtsss 154

R.Faul 372 TQL§V§-Y§LQSIEIEKKKRY-I(v|t| R.NmeBI 353 KIGBp|N'iJlECLYITQKRKFAV¡A|s| r.Hga 364 kla|a|rt|iecmylpinekfsi|a|s|

¡NKLSt^^^G^LKRHRT 398

Рис. 8. Консервативные блоки, выявленные при сравнении аминокислотных последовательностей R.Faul и ряда эндонуклеаз рестрикции класса IIS, расположенные в N-концевой (а) и С-концевой (б)

частях белков.

Все представленные в выравнивании эндонуклеазы имеют пентануклеотидный сайт узнавания, оканчивающийся цитозином, и расщепляют верхнюю цепь ДНК на расстоянии 4 или 5 нуклеотидов. Таким образом, данные ферменты, вероятно, эволюционно родственны друг другу. Сравнение аминокислотных последовательностей R.Faul и других эндонуклеаз рестрикции позволило выделить два консервативных участка, один из которых (рис. 8а) является общим для всех перечисленных ферментов, а другой (рис. 86) - лишь для R.Faul. R.Hgal и R.NmeBI. Как нетрудно видеть, сайты узнавания трех последних ферментов имеют большее сходство и содержат одинаковую последовательность CGC на 3'-конце.

Таким образом, расположение генов в опероне РМ-системы Faul соответствует схеме C-M1-R-M2 (рис. 9).

Ml.Faul (799-1836)

M2.FauI (3242-4273)

С. Faul (471-809)

Промотор

R.FauI(1833-3272)

Терминатор транскрипции

Рис. 9. Структура оперона системы рестрикции-модификации Faul.

Такой порядок расположения генов РМ-системы является уникальным. Как правило, контрольный белок расположен перед геном рестриктазы, а не перед геном метилазы, что наблюдается в случае РМ-системы Faul. Известна одна РМ-система Bsml (GenBank асс. по. AY079085), являющаяся исключением, в которой гены метилаз разделены небольшим геном контрольного белка. Кроме того, обычно гены метилаз следуют друг за другом, тогда как в РМ-системе Faul ген рестриктазы находится между генами метилаз.

3. Определение структуры оперона РМ-системы Л/aNI из Streptococcus faecalis ND547

Первое упоминание о рестриктазе SfaNI из бактерии Streptococcus faecalis ND547 появилось в 1978 году, хотя и без указания точного сайта узнавания и места расщепления ДНК [Roberts R., 1978; Szybalski W., 1991]. Рестриктаза IIS типа SfaNI имеет последовательность узнавания 5'-GCATC(N)5/9-3'. Известно несколько изошизомеров данной эндонуклеазы рестрикции, включая рестриктазу Bstl9I, обнаруженную в работе Ю.Э. Томиловой и соавт. [Томилова Ю.Э., 2002]. По сравнению с R.Bstl9I рестриктаза SfaNI расщепляет ДНК на один нуклеотид дальше от сайта узнавания по верхней цепи и на три нуьслеотида - по нижней цепи. На сегодня из всех метилаз, узнающих сайт 5'-GCATC-3', известна структура ДНК-метилтрансфераз Ml.Bstl9I и M2.Bstl9I из Bacillus stearothermophilus 19, а также Ml.Bhal и M2.BhaI из Bacillus halodurans С-125 [http://rebase.neb.сот]. Гены двух МТаз - M2.BhaI и Ml.Bhal (ОРТ ВН4003 и ВН4004, соответственно) были обнаружены в полностью секвенированном геноме В. halodurans С-125 (GeneBank № NC_002570). Таким образом, представляло интерес клонировать метилирующий фермент из Streptococcus faecalis ND547 и сравнить его структуру с аминокислотной последовательностью других метилаз.

3.1. Определение нуклеотидной последовательности оперона РМ-снстемы S/aNI

Хромосомную и плазмидную ДНК S.faecalis ND547 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции BglH. Липкие концы частично достраивали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli в присутствии dATP и dGTP. Полученные фрагменты ДНК встраивали в плазмидный вектор pUC19 по сайту узнавания рестриктазы Sali, частично достроенному фрагментом Кленова в присутствии dTTP и dCTP. В результате трансформации клеток E.coli RRI лигированными ДНК в первом случае получили клоны, несущие фрагменты хромосомной ДНК, во втором - клоны с фрагментами плазмидной ДНК. В каждом случае выделяли суммарный пул плазмид, который обрабатывали эндонуклеазой рестрикции SfaNI. После повторной трансформации клеток клоны с фрагментами хромосомной ДНК были неустойчивы к воздействию эндонуклеазы рестрикции SfaNI. Из второй группы клонов, несущих фрагменты плазмидной ДНК, отобрали два устойчивых к R.SfaNI, содержащих вставки длиной около 10 и 20 тыс. п.н. Из плазмиды со вставкой 10 тыс. п.н., названной pSfaN30, с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRV и Nhel вырезали фрагмент длиной около 4,8 тыс. п.н. и встраивали его в плазмидный вектор pUC19 Полученный после трансформации штамм E.coli, несущий плазмиду pSfaN30-4, проявлял рестриктазную активность, аналогичную R.SfaNI. Плазмида pSfaN30-4, выделенная из полученного штамма, была устойчива к действию рестриктазы SfaNI и использовалась нами для определения нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы SfaNI.

После секвенирования pSfaN30-4 во вставке, содержащей фрагмент 4794 п.н. плазмидной ДНК S. faecalis ND547, обнаружили ОРТ1 и ОРТ2 длиной 2100 п.н. и 1953 п.н. соответственно (рис. 10).

601 attgcactta atatggtaga attgcattaa ctgtaaagag agggtgatgc ctaaatgatg

2701 gctaaacaaa gtgaaacagt tgaagtttta gtcacaaatt acgagaggga tätttaatga

4 681 gagataaaat ttttgttgaa gctaätatgt aaaaatgtag tagtttcgaг ttaaacggga 4 741 atgtttttta gtcaatggaa aatatcactt aatggtgtga acttatggta aaag

Рис. 10. Часть нуклеотидной последовательности фрагмента бактериальной ДНК штамма Streptococcus faecalis ND547.

3.2. Анализ ОРТ1 РМ-системы S/аШ

Анализ аминокислотной последовательности показал, что ОРТ1 содержит консервативные мотивы FxGxG (I) и D(P/T)PY (II), характерные для сайт-специфических метилаз, в связи с чем данная ОРТ была названа М.SfaNI. На рисунке 11 представлено сравнение аминокислотной последовательности M.SfaNI со структурами ДНК-метилтрансфераз Ml.Bstl9I, M2.Bstl9I, Ml.Bhal и M2.BhaI.

MRSEVSKMNVNIRTKDILNKFSL5¡j^¡LY¡5¡[¡I l'EGKLNA^KKDWRGWRM^jEQHLLEÍ.SNI IEMNEQКNQTPLNPDAK. Í2QGh52222^

jjjEQHVKEIDS11RKKEDEQLSLPIMSQK.

M2.Bstl9X M2.Bhal M.SfaNI

M2 .Bstl9I M2.Bhal M.SfaNI

M2.Bstl91 M2.Bhal M.SfaNI

M2.Bstl91 M2.Bhal M.SfaNI Ml. Bstl9I Ml.Bhal

M.SfaNI Ml.Bstl9I Ml.Bhal

M.SfaNI Ml.Bstl91 Ml.Bhal

M. SfaNI Ml .Bstl9I Ml.Bhal Ml.BhalBP

É ■

J: e"I'*ee2T2

_¿MNTKVK*

MCPIKCD£!?!k,?EV'TiLny?Ki?iAEN ■ . .22 vi

Рис. 11. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз, узнающих последовательность 5'-ССАТС-3\

Согласно классификации метилаз, мотивы D(P/T)PY являются характерным признаком принадлежности белка к группе N-модифицирующих метилаз, а остаток аспарагиновой кислоты (D) в первом положении мотива II и расположение мотивов в порядке I-11 свидетельствуют, что белок относится к классу а метилтрансфераз, метилирующих аденин в положении N6. Таким образом, можно утверждать, что клонированная нами метилаза M.SfaNI относится к классу а Nó-ДНК-метилтрансфераз. Из представленного сравнения аминокислотных последовательностей метилаз видно, что все пять метилаз являются высокогомологичными, при этом, в отличие от ранее клонированных нами РМ-систем ÄsiF5I и Faul, имеющих две или больше метилаз, РМ-система SfaNI имеет одну составную метилазу M.SfaNI.

3.3. Анализ ОРТ2 РМ-системы SfaNI

Поскольку полученный штамм E.coli, несущий плазмиду pSfaN30-4, проявлял рестриктазную активность R.SfaNI, причем в клонированном фрагменте не было обнаружено других ОРТ, кроме гена метилазы и ОРТ2, мы заключили, что ОРТ2 является рестриктазой SfaNI. Сравнение со структурами известных белков выявило гомологию ОРТ2 с сайт-специфическими эндонуклеазами и никазами R.AlwI, R.Mlyl, R.Plel, R.MmyCIII, N.BstNBI, N.BstSEI, что подтверждает установленную функцию ОРТ2 как R.SfaNI.

3.4. Расположение генов МТаз, узнающих сайт вСАТС, в ДНК бактерий В^еаШИегторкИиз 19, В. ИаШигапя С-125 и Б./аесаШ N0547

На рисунке 12 показано расположение и размеры генов М1.В8И91 и М2.В5И91, а также М1.В11а1 и М2.ВЬа1 относительно МТазы 5/аМ.

ЫИ91М2(766-2004) Ы1191М1 (2015-2953)

.....................(=>1=>ттт...............................

,фМ1М (655-2755) фМЯ (2757-4710)

—=И ' =>С=!=>-

ЫюШ2 (246590-245493) ЪШМ1 (245486-244692)

ЬИаШ1ВР (244731-244564)

Рис. 12. Гены ДНК-метилтрансфераз В^еагоЛегторИИиз 19 , Л'./аесаНя N0547 и В.ИаЫигаю С-125.

Как видно из рисунка 11, ген М. 8Га№ состоит из двух половинок, каждая из которых содержит набор консервативных мотивов. Аналогично метилазе М.Рок1 [Б^вай Н., 1989] М^аМ содержит консервативные мотивы, характерные для адениновых метилаз класса а, и, соответственно, модифицирует аденин в верхней и нижней цепи сайта узнавания. При этом, ЬГ-концевая часть М^аШ гомологична М2.В5И91 и М2.ВЬа1, а С-концевая часть М^ГаШ соответствует М1.В$и91 и М1.В1ш1.

Кроме наличия сходных консервативных мотивов, необходимо отметить высокую гомологию аминокислотной последовательности ^ домена МЖаМ с ферментами М2.ВЬа1 и М2.ВяИ91, также как и С-домена M.SfaNI с метилазами М1.ВЬа1 и М1.Вв1191 в районе Т1Ш. Идентичность аминокислотной последовательности ТЬШ составляет 73,0% в первом случае и 77,0% во втором, что свидетельствует об одинаковом механизме реакции метилирования в каждом случае.

3.5. Сравнение метилтрансферазы М.БГаМ с другими метилазами

Метилаза ЭГаМ и ферменты М1.В5П91 и М2.В5П91 узнают непалиндромную последовательность 5'-ССАТС-3\ При этом две метилтрансферазы РМ-системы &/191 являются функциональными и структурными аналогами ^ и С-концевых частей М.8Га№. Выше (разделы 1.3.2. и 1.3.3) мы показали, что РМ-система В«гР51 содержит метилазы М2.Вв1Р51 и МЗ.В51Р51, которые являются гомологами С- и ^ доменов метилазы Рок1, соответственно. Обе группы ферментов (М.Рок1-и М^аЫ-подобныс) относятся к одному и тому же классу а-Ыб-ДНК-метилтрансфераз и узнают непалиндромные участки длиной 5 нуклеотидов (рис. 13). При этом, как видно из рисунка 13, участок узнавания метилаз группы Ь'ок\ возникает, если последовательность нуклеотидов ОАГО в верхней цепи ДНК на 5'-конце достраивается нуклеотидом в (в

комплементарной цепи С на 3'-конце). В то же время, если в достраивается на 5'-конце нижней цепи (и, соответственно, С на З'-конце верхней цепи), возникает участок узнавания для метилаз группы Лу"а№, но ориентированный противоположным образом.

Рис. 13. Структура участков узнавания ДНК-метилтрансфераз групп Бок1

и ЗАаМ.

В таблице 2 приведены результаты сравнения первичной структуры Ы- и С-концевых доменов метилазы 8£а№ и наиболее гомологичных ферментов.

Как видно из таблицы 2, идентичность и сходство аминокислотной последовательности у сравниваемых ферментов варьирует от 22,2 % до 55,8 % и от 37,3 % до 64,8 %, соответственно. Как правило, показатель сходства у МТаз разных классов не превышает 20,0 %, т.е. в таблице приведены данные только для МТаз, наиболее близких к исследуемой. При этом в качестве пороговой величины отбора мы выбрали достаточно высокий уровень сходства - 37,0 %. Общим свойством всех рассмотренных метилаз является модификация адениновых остатков в составе динуклеотида АТ.

К числу ферментов, представленных в таблице 2 и наиболее похожих на изучаемую МТазу МЖаМ по первичной структуре, относятся изошизомеры МЬВвИЭД и М2.В$П91, а также Рок1-подобные МТазы. По-видимому, это обусловлено заметным сходством участков узнавания М.1'ок1- и М.ЗГаМ-подобных МТаз, а именно, наличием общего тетрануклеотидного фрагмента в сайте узнавания (рис. 13).

Таблица 2

Сравнение первичных структур ДНК-метилтрансфераз, гомологичных И- и

С-доменам М^аШ

ДНК-метплтрансфераза \l.SfaNI-N

Название Сайт узнавания* (5'—>3') Идентичность/сходство, %

М^аМ-Ы ОСАТСЛЗАТССС?) -

М2.В5П91 САТСС 55,8/64,8

М2.ВЬа1 САТСС 55,7/65,4

ООАГО 34,5/48,0

МЗ.Вз1Р51 СОАТС 28,2/40,7

М.Рок1-Ы ООАТО 30,4/44,5

\l.LlaI-N ? 27,5/40,9

М.Нру1 САТС 30,4/44,2

М.МаШ САТС 28,4/42,4

М.СЧчАП слге 24,6/39,3

М.85е91 ААТТ 24,5/40,6

Продолжение таблицы 2

ДНК-метилтрансфераза M.SfaNI-C

Название Сайт узнавания* Идентичность/сходство, %

M.SfaNI-C GCATC/GATGC(?) -

Ml.Bstl9I GCATC 47,9/59,7

Ml.Bhal GCATC 48,5/59,8

M.Fokl-C CATCC 34,0/48,9

M.StsI-C CATCC 36,2/47,0

M2.BstF5I CATCC 37,3/50,0

M.EcoT2Dam GATC 41,0/52,6

M.EcoT4Dam GATC 40,3/51,5

M.Llal-C 7 28,2/39,1

M.EcoRV GATATC 24,4/38,1

M.DpnllA GATC 22,2/37,3

Примечание: * метилируемые адениновые остатки в участках узнавания выделены жирным шрифтом.

Известно, что N- и С-домены M.FokI модифицируют адениновые остатки в верхней (5'-GGATG-3') и нижней (5'-САТСС-3') цепях сайта узнавания, соответственно [Sugisaki Н., 1989; LeismanO., 1998]. Исходя из гомологии между N- и С-концевыми участками M.Fokl и M.SfaNI, можно предположить, что N-домен M.SfaNI, также как и N-домен M.FokI, отвечает за метилирование остатка аденина в последовательности с внутренним тетрануклеотидом GATG, т.е., N-домен M.SfaNI метилирует аденин в последовательности 5'-GATGC-3' в нижней цепи сайта узнавания, а С-домен M.SfaNI отвечает за метилирование последовательности 5'-GCATC-3' в верхней цепи. Дальнейшие исследования субстратной специфичности метилаз позволят проверить высказанное предположение.

4. Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз РМ-системы BstFSl в клетках Е. cotí

Гены ДНК-метилтрансфераз были получены методом ПЦР, где в качестве матрицы использовалась геномная ДНК B.stearolhermophilus F5 и праймеры, рассчитанные для каждого гена отдельно.

Полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующий вектор pJW2 [Kossykh V.G., 1995] по сайтам рестрикции FauNDI и BamHI. После термоиндукции лизаты трансформированных клеток E.coli анализировали методом диск-электрофореза. Было показано, что наряду с клеточными белками в случае ферментов M2.BstF5I, M3.BstF5I и M.4BstF5I в E.coli синтезируются рекомбинантные белки ожидаемой молекулярной массы: 35 кДа (M2.BstF5I), 41 кДа (M3.BstF5I) и 44 кДа (M4.BstF5I) (рис. 14).

Однако в случае Ml.BstF5I на электрофореграме мы наблюдали появление двух дополнительных полос, соответствующих белкам с молекулярными массами 30 и 26 кДа (рис. 15).

66 55 45

29 24

Рис. 14. Электрофореграмма клеточных лизатов£. coli: M2.BstF5I (дорожки 2, 3), M3.BstF5I (4, 5), M4.BstF5I (6, 7). Электрофорез в 12,5 % ПААГ в денатурирующих условиях с додецилсульфатом натрия. Дорожки 2, 4, 6 - до термоиндукции; 3, 5, 7 - после термоиндукции в течение 3,5 ч; 1 -молекулярные массы белков - маркеров в кДа. 26

Анализ нуклеотидной последовательности гена М1.В51Р51 выявил, что в одной рамке трансляции находятся два АТО-кодона, расположенные на расстоянии 99 нуклеотидов друг от друга. Было сделано предположение, что белки 30 и 26 кДа являются вариантами, полученными в результате трансляции одного и того же РНК-транскрипта, но с двух разных стартовых ко донов.

Последовательными хроматографиями на различных носителях были получены высокоочигценные препараты рекомбинантных белков М2.Вз1Р51, МЗ.В81Р51 и М.4В$1Р51 (данные не приводятся). Однако в ходе хроматографической очистки М1.В$1Р51 мы получили смесь белков 30 и 26 кДа в равных соотношениях, с общей концентрацией 0,2 мг/мл. Метилтрансферазную активность оценивали электрофоретически по степени защиты ДНК фага X от гидролиза Я.В81Р51. Удельная активность препарата составила менее 1ед/мкл.

M4.BstF5I

M3.BstF5I

M2.BstF5I

(26 кДа)

Шшш. й^ййййй- Iii ' г ^Sfr 9л

^ щш

12 3 4 5 Рис. 15. Электрофореграмма клеточных лизатов Е. coli: первоначальный вариант Ml.BstF5I (30 и 26 кДа) (1, 2), Ml.BstF5I (26 кДа) (3, 4). Электрофорез в 12,5 % ПААГ в денатурирующих условиях с додецилсульфатом натрия. Дорожки: 1, 3 - до термоиндукции; 2, 4 — после термоиндукции в течение 3,5 ч; 5 - молекулярные массы белков-маркеров в кДа.

Для уточнения стартовой позиции гена ¿>siF5IMl был расчитан праймер для клонирования в экспрессирующий вектор, содержащий только второй инициирующий трансляцию ATG-кодон:

5' -CGCCAIATGCG А А АТТТАТТА А ATAATTATGG-3'.

Клонирование гена 6siF5IMl (678 п.н.) в составе экспрессирующей конструкции, термоиндукция и электрофоретический анализ показали, что в этом случае в клетках E.coli синтезируется рекомбинантный белок с молекулярной массой 26 кДа (рис. 15).

С помощью хроматографической очистки был получен гомогенный препарат белка (26 кДа) с концентрацией 0,1 мг/мл. Тестированием ферментативной активности мы определили, что белок 26 кДа обеспечивает защиту ДНК фага X от эндонуклеазы рестрикции BstF5I, а его удельная активность составляет 2 ед/мкл. Таким образом, функционально активным является фермент Ml.BstF5I, синтезируемый со второго ATG-кодона.

5. Определение оптимальных условий функционирования метилаз

Нами были определены оптимальные условия функционирования полученных ДНК-метилтрансфераз - зависимость активности ферментов от температуры, pH, концентрации солей. Основные биохимические характеристики ДНК-метилтрансфераз представлены в таблице 4.

Таблица 4

Основные биохимические характеристики ДНК-метилтрансфераз

Характеристика Ml.BstF5 M2.BstF5 M3.BstF5 M4.BstF5

Специфичность GGATG САТСС GGATG САТСС

Молекулярная масса, к0а 26,6 34,7 41,0 43,6

pH, оптимум 7,5 8,1 7,7 8,7

Температура, °С 55 55 60 55

[Na*], [К4], мМ 0-50 50 0 0

Все дальнейшие эксперименты проводили в оптимальных для каждого фермента условиях.

5.1. Определение субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз

На модельных олигонуклеотидах нами было показано, что Ml.BstF5I и M3.BstF5I модифицируют адениновое основание в последовательности 5'-GGATG-3', M2.BstF5I и M4.BstF5I - в сайте 5'-САТСС-3'. Нами также было проведено сравнительное изучение субстратной специфичности и кинетических свойств метилазы IIS типа Ml.Bstl9I, которая гомологична С-концевому домену M.SfaNI и метилирует аденин в последовательности 5'-GCATC-3'(раздел 3.4., 3.5.).

5.2. Определение неспецифической активности ДНК-метилтрансфераз

Субстратная специфичность метилаз проверялась в реакции предельного метилирования ДНК фага лямбда (рис. 16). Как видно из рисунка, для четырех метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M4.BstF5I и Ml.Bstl9I плато кривых метилирования близко к 100 % модификации сайтов узнавания, что свидетельствует о высокой специфичности этих ферментов. В отличие от остальных метилаз, для M3.BstF5I количество метилированных сайтов существенно возрастает с увеличением отношения фермент/субстрат.

—■— Mi.BstF5I(100 нМ) -•-m2.Bsif5i(100hM) —Л— M3.BstF5I (50 нМ) -T— M3.BslF5I (100 нМ) —^—M3.BstF5I (150 нМ) —M4.BstF5I (100 нМ) М1 .Bstl9I(100HM)

§ а

О 10 20 30 40 50 60 70 Время реакции, мин

Рис. 16. Зависимость концентрации метилированных сайтов в ДНК фага X. от времени инкубации.

Для изучения возможного неканонического метилирования ДНК ферментом M3.BstF5I был изучен гидролиз различными ферментами плазмиды pF5-32, полученной путем встраивания гена метилазы M3.BstF5I в вектор pMTL22 и последующей трансформации клеток штамма E.coli JM119, дефектного по гену dam-метилазы. На рисунке 17 приведены результаты гидролиза плазмиды pF5-32 различными рестриктазами.

1 2 з 4 м

i —

■—1

gßg

зооо ь 2000 ь

1500 b 1000 b

Рис. 17. Рестрикционный анализ плазмиды рР5-32. Дорожки: 1 - рР5-32; 2 - рР5-32, обработанная Я. Вз1Р51; 3 -Я. Кго91; 4 - Я. ВяЖИ; М - маркер молекулярных весов ДНК.

Метилирование ферментом M3.BstF5I in vivo приводит к блокированию гидролиза плазмидной ДНК рестриктазой BstF5I (дорожка 2). Эндонуклеаза рестрикции Kzo9I, узнающая последовательность 5'-GATC-3' и нечувствительная к наличию в сайте узнавания метилированного аденина, полностью гидролизует ДНК (дорожка 3). В тоже время появляется дополнительный фрагмент 1,7-1,8 тыс. п.н. (дорожка 4) при гидролизе ДНК ферментом BstKTI, который также узнает последовательность 5'-GATC-3', но не расщепляет ее при наличии в сайте узнавания двух метилированных адениновых оснований [Надеев А.Н., 2006].

В соответствии с первичной структурой плазмиды pF5-32 фрагмент ДНК длиной 1792 п.н. образуется при блокировании гидролиза единственной последовательности 5'-GGATCC-3'. Эта последовательность будет метилироваться ферментом M3.BstF5I in vivo, если, помимо канонического сайта узнавания 5'-GGATG-3', он также модифицирует нуклеотидную последовательность 5'-GGATC-3'. В этом случае метилирование сайтов 5'-GGATC-3' приведет к модификации последовательности 5'-GGATCC-3' по обеим цепям и блокированию гидролиза рестриктазой BstKTI, что мы и наблюдали в эксперименте.

Известно, что ДНК-метштгрансферазы способны метилировать неканонические последовательности ДНК, причем эта особенность усиливается при изменении реакционных условий в сторону менее физиологических. Возможность неканонического метилирования показана для ферментов, модифицирующих как палиндромные сайты (метилазы EcoDam и T4Dam с каноническим сайтом 5'-GATC-3' [Корниш-Боуден Э. 1979; MaloneTh., 1995], M.HaelII с каноническим сайтом 5'-GGCC-3' [Horton J.R., 2006], M.EcoRI с каноническим сайтом 5'-GAATTC-3' [Horton J.R., 2005]), так и для ферментов, узнающих непалиндромные последовательности (отдельные домены M.FokI). Ранее было показано, что N-концевой домен метилазы FokI, которому фермент M3.BstF5I наиболее гомологичен, также проявляет звездчатую активность [Friedrich, Т., 2000]. Удивительно, однако, что авторы наблюдали существенно более высокую звездчатую активность у С-концевого домена M.FokI, который гомологичен M2.BstF5I. Высокий уровень звездчатой активности у С-концевого домена метилазы FokI (при ее отсутствии у M2.BstF5I) может быть связан как с отличиями в структуре этих ферментов, так и в изменении свойств нативной структуры С-концевого домена вследствие добавления к нему лидерного гистидинового пептида, несущего существенный положительный заряд.

6. Изучение кинетических свойств ДНК-метилтрансфераз

Изучение кинетических параметров реакции метилирования ДНК ферментами РМ-системы BstF5l проводилось нами как на природном высокополимерном субстрате, в качестве которого использовали ДНК фага X, так и на синтетических олигонуклеотидах. В наших расчетах концентрация

сайтов метилирования 5'-GGATG-3' определялась умножением молярной концентрации ДНК фага X на число сайтов в одной молекуле ДНК (150 сайтов BstF5I).

6.1. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на полимерной ДНК

Определение стационарных кинетических параметров реакций метилирования проводили на линейных участках зависимости скоростей реакций метилирования ДНК фага X от концентраций сайтов узнавания и донора метильных групп, SAM. Зависимость активности Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I от концентрации SAM и ДНК фага X приведена на рисунках 18 и 19. Как видно из рисунков, экспериментальные точки хорошо соответствуют кривой Михаэлиса [Корниш-Боуден Э., 1979].

A M2.BstF5I M2.BstF5I

2.4-, . 2.4-j

Рис. 18. Зависимость скорости метилирования ДНК фага А. от концентрации ДНК фага X (А) и SAM (Б). Концентрация ДНК фага X в пересчете на сайты 5'-GGATG-3' - 8 мкм (А) и 1,2 мкМ (Б), M2.BstF5I - 5,18 нм, M4.BstF5I -28,7 нм. Концентрация SAM - ЮмкМ (А), время реакции 20 мин.

0.0

2 3 4 5 [ДНК], мкМ

0 10 20 30 40 50 [SAM], мкМ

УДЕ], мин1 1.1-и> ол и м о.«

0.5 0.4

из

м»

1 2

У1Щ. мин1

1.0-

ол

<0 я>

[ЭАМ]. МКМ

«*

03» о» 41»

.1 а

у"

о.о

йЛ 0,4 0,в 0.« 1,0 1,2 1.4

[ДНК фага Л в пересчете на сайты], мкМ

Рис. 19. Зависимость скорости метилирования ДНК фага X от концентрации БАМ (А) и рестриктов ДНК фага X (Б)./ - М1.Вз1Р51,2 - МЗ.Вб1Р51. Концентрация ДНК фага X в пересчете на сайты б'-вСАТО-З' - 1,3 мкМ, М1.Вз1Р51 - 24,7 нМ, МЗ.Вз1Р51 -100 нМ, время реакции 20 мин.

В таблице 5 представлены кинетические параметры (константа Михаэлиса, каталитическая константа, коэффициент специфичности), установленные в нашей работе в сравнении с ранее полученными результатами для других метил аз.

Таблица 5

Стационарные кинетические параметры метилирования ДНК-метилтрансферазами нативных субстратов

Фермент Субстрат мин"1 к днк «ш » мкМ к ,к днк икМ'^мин'1 Ссылка

Т21)ат ДНК фага Т4 18,6 0,00021 8,9 х 104 \Kossykh У.С.,1997]

Т40ат ДНК фага Т4 8,4 0,00021 4,0 х 104 \Kossykh У.О.,1997]

ВатШ плазмида рВЯ322 3,36 0,0032 1,1 х 103 рЧагйопе С., 1986]

Есойат Со1Е 1 ДНК 19,02 0,0036 5,3 х 103 [Неппап ХО., 1982]

Еса1 ДНК фага X 1,14 0,17 6,71 [вгПак Ь., 1993]

платила рУВ40 0,14 0,023 6,09 |5гПак 1993)

ЕсоШ плазмнда рВК322 8,4 0,00033 2,4 х 104 \Kossykh УЛ.,1995|

ЕсоШ! ДНК фага к 232 0,00022 1,1 х 104 \Kossykh У.С.,1995|

БсоНКЗП плазмнда 3,0 0,002 13 х 10э |Ьее К.К., 19961

Продолжение таблицы 5

Mspl ДНК фага X 10,2 0,0018 5,7 х 103 [ВЬаЦасЬагуа 8.К., 1999]

FokI ДНК фага X - 0,18 - [Кас/ого\\^1а Т., 1999]

FokIC ДНК фага X - 0,21 - [Касгогоивк! Т., 19991

FokIN ДНК фага X - 0,20 - [КасгогошЫ Т., 19991

Ml.Bstl9I ДНК фага *. 1,8 0,68 2,65 *

Ml.BstF5I ДНК фага >. 0,98 0,11 8,91 Данная работа

M2.BstF5I ДНК фага X 2,56 0,72 3,56 Дапная работа

M3.BstF5I ДНК фага X 0,24 0,11 2,18 Данная работа

M4.BstF5I ДНК фага X 0,99 1,29 0,77 Данная работа

Ml.BspAI ДНК фага X 0,095 0,053 1,8 **

Примечания: * - данные получены в совместной работе с Ю.Э. Томиловой

** - данные получены в совместной работе с М.В. Тарасовой

Как видно из таблицы, значения Кттк для всех адениновых ДНК-метилаз типа IIS варьируют от 0,11 мкМ до 1,29 мкМ. В тоже время значения Кттк в реакции метилирования полимерной ДНК для большинства метилаз, узнающих палиндромный сайт (за исключением M.Ecal), лежат в достаточно узком диапазоне, от 0,21 нМ для T4Dam до 2 нМ для ЕсоНКЗП, что на три порядка меньше, чем величина /\т л1Пч у ферментов IIS типа.

Полученные в наших экспериментах величины KmSAM варьируют совсем незначительно от 0,67 мкМ до 3,31 мкМ и вписываются в интервал значений, полученных для других адениновых метилаз, от 0,1 мкМ для T4Dam [Kossykh V.G., 1995.] до 12 мкМ для M.EcoRV [Jeltsch А., 1998].

Наибольшие каталитические константы 2,6 и 1,8 обратных минут установлены для M2.BstF5I и Ml.Bstl9I, соответственно. Остальные изучаемые нами ферменты имеют значение Агса, от 0,24 до 1,0 мин" . Таким образом, вариации ксм у изученных нами метилаз IIS типа наблюдаются от 0,24 до 2,6 мин1.

Каталитические константы большинства ферментов, имеющих палиндромные сайты узнавания, варьируют в реакции метилирования природных полимерных ДНК в диапазоне 2,52-19,02 мин"1.

Интересно отметить, что фермент Ml.BspACI, (сайт узнавания CCGC, метилируемое основание подчеркнуто), относящийся к IIQ типу метилаз, имеет значение ксйХ еще меньшее, чем у метилаз IIS типа. Однако величина

^СпДНК У Ml.BspACI занимает промежуточное положение между значениями Кт у метилаз IIS типа и ферментов, узнающих палиндромные сайты.

В таблице 5 приведены также значения коэффициента специфичности для ДНК в случае всех четырех ферментов РМ-системы ÄS/F5I. Максимальное значение kcJ КтДНК наблюдается для Ml.BstF5I, тогда как коэффициент специфичности его аналога M3.BstF5I в четыре раза меньше. Минимальный коэффициент наблюдается для M4.BstF5I, причем у фермента с той же субстратной специфичностью M2.BstF5I данный показатель в 4,6 раза больше.

Из представленного сравнения данных следует, что значения констант Михаэлиса по ДНК для ДНК-метилтрансфераз изучаемых ферментов IIS типа не менее чем в 100 раз превышают Кштк для большинства ферментов, узнающих палиндромные сайты узнавания. При этом значения kat для первых ниже, чем для вторых. Таким образом, ферменты, узнающие палиндромные сайты узнавания, проявляют большую активность и значительно эффективнее связываются с ДНК, чем метилтрансферазы IIS типа, модифицирующие непалиндромные последовательности ДНК. Как видно из таблицы 5, коэффициент специфичности kcJKm дпк для протяженных природных ДНК варьирует от 0,77 до 8,91 мкМ"''мин1 у ферментов IIS типа, тогда как у большинства ферментов, имеющих палиндромный сайт узнавания, этот параметр превышает 1000 мкМ"1 -мин"1.

Полученные нами значения £cat 0,24 для M3.BstF5I и кы 2,6 для M2.BstF5I, являющихся аналогами С- и N-конца метилазы FokI, соответственно, выше, чем величина kC!¡t 0,18 обратных минут, установленная для самой M.Fokl [Kaczorowski Т., 1999]. Однако следует иметь ввиду, что метилаза FokI предсталяет собой тандем ферментов, в котором скорость реакции метилирования обеих цепей сайта узнавания определяется ксЛ менее активного домена. Величина кса, 0,24 мин"1 для M3.BstF5I очень близка к значению fccat0,18 мин"1, установленной для метилазы FokI.

Близкие значения кинетических параметров /гса( и А'тднк у Ml.Bstl9I и M2.BstF5I обусловлены, видимо, их принадлежностью к одному типу ферментов (а-Ы6-ДНК-метилтрансферазам) и присутствием в узнаваемых последовательностях общего тетрануклеотида CATC. Все остальные метилазы, представленные в таблице 5, либо имеют другой тетрануклеотид в сайте узнавания, либо не относятся к а-Ы6-ДНК-метилтрансферазам.

6.2. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами РМ-системы l?síF5I на олигонуклеотидных дуплексах

Знания полученных выше кинетических параметров не достаточно, чтобы установить роль всех четырех ДНК-метилтрансфераз РМ-системы BstFSI в жизнедеятельности бактериальной клетки. Поскольку природными субстратами метилаз in vivo обычно являются пострепликативные полуметилированные ДНК, интересно было сравнить кинетические

параметры реакций для неметилированных и полуметилированных субстратов. Мы исследовали взаимодействие ДНК-метиптрансфераз М1.В51Р31, М2.Вз1Р51, МЗ.В$1Р51 и М4.В*1Р51 с синтетическими олигонуклеотидными дуплексами, содержащими участок узнавания ферментов 5'-СОАТО-3'/5'-САТСС-3'. Были использованы комбинации олигонуклеотидов, содержащих модифицированное адениновое основание в сайте узнавания рестриктазы Вэ1Р5Г (сайт узнавания Я.Вз1Р51 подчеркнут, М = Т^-метиладенин):

I 5'-СССССАСССОАШССССАССО-3' 1ш 5'-СООССАОСОС}МТССОООЛОСС-3'

II 5'-ОССССТСССОСАТССССТОвССООС-3' Нпг 5 '-СССОСТСССССМТССОСТООССООС-3'

В таблице 6 приведены данные, полученные для ферментов М1.В5»1Р51, М2.В51Р51, МЗ.Вз1Р51 и М4.В51Р51 на олигонуклеотидах, содержащих нативный и полуметилированный сайты узнавания.

Таблица 6

Сравнение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-

метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах

Параметр М1ЛМР51-1 МЗ.В$1Г51 М4.ВЯГ51

Немепиишровапный олигонуклеотидпый дуплекс*

Лсаь мин"' 0,328 0,58 0,053 0,53

/Г„днк,мкМ 0,23 0,(68 1,06

А'и8лм, мкМ 0,68 0,56 4,36 5,95

мшГ'-мкМ'1 1,42 0,47 0,31 0,50

¡Толуметилиромпный олигопуклеотидныа дуплекс*

Ас«1, мни"1 0,51 0,59 0,032 0,66

АГгаднк,мкМ 0,16 3,59 0,09 0,60

Ас1(//Г|п 1ИК мшг'-мкМ'1 3,18 0,16 0,35 1,1

Дуплекс с неканоническим сайтом 5'-ССАТС-3'

к,,„ мин"' - 0,0026 -

А-ДНК,мкМ - 3,3 -

Примечание. *Для Ml.BstF5I-l и M3.BstF5I-3 использовали полуметилированный олигонуклеотидный дуплекс I/IIm; для M2.BstF5I и M4.BstF5I - Im/II; неметилированный олигонуклеотидный дуплекс - I/II.

Как и при метилировании полимерной ДНК (табл. 5) максимальное значение коэффициента специфичности kcJKm Д11К в реакции модификации олигонуклеотидов наблюдается для метилазы Ml.BstF5I, тогда как данный параметр для M3.BstF5I в два раза меньше. Однако, в отличие от метилирования ДНК фага X, при модификации неметилированного олигонуклеотида коэффициенты специфичности по ДНК для M2.BstF5I и M4.BstF5I практически совпадают. Нами также были определены кинетические параметры реакции модификации ДНК на полуметилированном дуплексе. Как видно из таблицы 6, в случае полуметилированого субстрата по сравнению с нативным олигонуклеотидом, коэффициент специфичности Ml.BstF5I возрастает в два раза, тогда для M3.BstF5I он практически не меняется. В тоже время коэффициент специфичности M4.BstF5I в случае полуметилированного субстрата возрастает в два раза, а значение kcJKm ^ у M2.BstF5I падает в три раза. Таким образом, модификация полуметилированного субстрата преимущественно осуществляется ферментами Ml.BstF5I и M4.BstF5I, при этом отношение коэффициентов специфичности (£Са/Ктлик) в реакции модификации полуметилированного дуплекса в парах ферментов Ml.BstF5I/ M3.BstF5I и M4.BstF51/ M2.BstF5I составляет 8,6 и 7, соответственно. Предпочтительная модификация полуметилированных сайтов характерна для ферментов, участвующих в пострепликативной модификации ДНК. В частности, для ДНК-метилтрансферазы человека Dnmtl различие в скорости метилирования таких сайтов по сравнению с немодифицированными варьируется от 20 до 1000 раз [Hermann et.al., 2004].

Фермент M3.BstF5I метилирует также неканонический сайт узнавания 5'-GGATC-3' (см. раздел 5.2.). В связи с этим мы установили кинетические параметры модификации метилазой M3.BstF5I олигонуклеотидного дуплекса, содержащего последовательность 5'-GGATC-3'. Структура использованного дуплекса приведена ниже (полужирным шрифтом выделена последовательность 5 '-GGАТС-3 '/5 '-GATCC-3'):

5: 5'-CAGTTTAGGATCCATTTCAC-3',

6: 3'-GTCAAATCCTAGGTAAAGTG-5\

Зависимость скорости метилирования ферментом M3.BstF5I от концентрации олигонуклеотидного дуплекса 5/6 приведена на рисунке 20, а вычисленные на основе представленных зависимостей кинетические параметры представлены в таблице 6.

V/[E], мин"1

0,0030-,

У"

[дуплекса], мкМ

Рис.20. Зависимость скорости метилирования от концентрации олигонуклеотидного дуплекса 5/6 с неканоническим сайтом 5'-GGATC-3'. Концентрация SAM - ЮмкМ, M3.BstF5I - 100 нМ, время реакции - 60 мин.

Каталитическая константа метилирования олигонуклеотидного дуплекса с сайтом 5'-GGATC-3' в 20 раз меньше каталитической константы реакции модификации олигонуклеотидного дуплекса с каноническим сайтом, а коэффициент специфичности этой реакции (kcJKm днк) меньше в 400 раз. В результате, наблюдаемое нами метилирование ферментом M3.BstF5I сайта 5'-GGATC-3' происходит с существенно меньшей эффективностью по сравнению с метилированием канонического сайта 5'-GGATG-3'.

7. Эволюционные связи РМ-снстем и роль метилаз в РМ-системе BstF5l

Таким образом, ферменты Ml.BstF5I и M4.BstF5I более активны в реакции модификации полуметилированной ДНК и, видимо, именно они участвуют в пострепликативном метилировании ДНК в клетках В. stearothermophilus F5. Нетрудно видеть, что эволюция РМ-систем рода Bacillus идет значительно более активно, чем у других родов. Бактерии рода Bacillus содержат РМ-системы 144 специфичностей [http://rebase.neb.com], что составляет более половины известных к настоящему времени прототипов. При этом значительная часть новых ферментов (более 30 %), обнаруженных за последние 10 лет, найдены именно у представителей данного рода. Можно предположить, что РМ-система BstF5l эволюционно связана с РМ-системами других штаммов рода Bacillus.

В таблице 7 приведены данные по сходству сайтов узнавания трех групп рестриктаз различных РМ-систем, включая и ферменты РМ-систем BstFSl и Faul. В каждой группе представлены ферменты, образующие фрагменты ДНК с однотипными 5'- или З'-выступающими концами и наличием одинаковых оснований в сайте узнавания вблизи гидролизуемых связей. На наш взгляд, образование таких групп ферментов свидетельствует о существовании нескольких эволюционно связанных

семейств рестриктаз, для каждого из которых характерен свой механизм гидролиза ДНК. Внутри каждого семейства в ходе эволюции происходит последовательное частичное изменение сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, но сохраняется сам механизм расщепления ДНК, являющийся более консервативным элементом, чем последовательность узнавания.

Данное положение нашло подтверждение в случае семейства Faul-подобных ферментов, для которых известна первичная структура и найдена гомология в структуре как самих ферментов Faul, Piel, Mlyl, Alwl, N.BstSEI и Hgal, так и их активного центра (см. раздел 2).

Существование BstFSI-подобного семейства рестриктаз позволяет предположить, что метилазы Ml.BstF5I, M4.BstF5I и эндонуклеаза рестрикции R.BstF5I, существовали в исходном геноме как самостоятельная РМ-система, возникшая в эволюционной группе BstFSI-подобных РМ-систем.

Таблица 7

Семейства эволюционно связанных эндонуклеаз рестрикции

Семейство ферментов Эндонуклеаза рестрикции Участок узнавания*

1ЫР51-подобные BstF5I 5 3 - G С G С А Т Т А G С N N Ni N -3' -5'

BsrDI 5 3 -G -С С G А Т А Т Т А G q N N Ni N -3' -5'

BtsI 5 3 -G -С С G А Т G С Т А G С N N Nl N -3' -5'

Bsml 5 3 - G С А Т А Т Т А а с С G Nj N -3' -5'

BsrI 5 3 - А Т С G Т А G с G С Nl N -3' -5'

BstAPI-подобные BstAPl 5 3 - G С С G А Т N N N TN N N Nj N N T N А G С С-3' G- 5'

PflMI 5 3 - С G С G А Т N N N tN N N Nl N N T N А в С G-3' С-5'

Dralll 5 3 - tí G А Т С А N tN N N Ni N G T С А G- С- •3' ■5'

AIwNl 5 3 - С G А Т G С N tN N N Nl N С T G А (S-с- -3' -5-

Mwol 5 3 - G С С G N N N N N tN N N Nl N N N N N G С С-3' G-5'

BgH 5 3 - G с С G С G N N N tN N N Nl N N G N С G С С-3' G-5'

Sfil 5 3 -С -С G С С G С G N N N tN N N Nl N N G N С G С С С-3' G G-5'

Гомологичные Faul Faul 5 -c С с G С N N N Ni N N NN N N-3 1

3 -G G G С в N N N N N Nf N N N N-5 1

N.BstSEI 5 -G А G 1 Ü N N N Nl NN NN N N-3'

3 -C T с А G N N N N NN NN N N-5'

Plel 5 -G А G Т С N N Н Ni N N NN N N-3'

3 -C T С А G N N N N Nt N N N N N-5'

Alwl 5 -G G А Т С N N N N lN N NN N N-3'

3 -C С Т А G N N N N Nt N N N N N-5'

Mlyl 5' -G А G Т С NN N N Nl N NN N N-3 '

3 -C Г С А G N N N NN jN N N N N-5'

Hgal 5' -G А С G С N N N N Nj N NN NN -3'

3' -C Т G С G N N N NN N N N N Nt -5'

Примечание: * Выделены идентичные нуклеотиды.

В ходе дальнейшей эволюции произошел дополнительный перенос генов из ТчШ-подобной РМ-системы с образованием двух новых ДНК-метилтрансфераз М2.Вз1Р51 и МЗ.Вз1Р51. Известно, что РМ-система Рок! была обнаружена в 1981 г. [Би^аЫ Н., 1981], тогда как РМ-система &/Р51 была описана значительно позднее [АЬёигаБЬкоу М.А., 1996], что соответствует высказанному предположению. О раздельном появлении вышеуказанных пар генов можно судить по их ОС-составу. Гены метилаз М1.Вз1Р51 и М4.Вб1Р51 характеризуются близкими и более высокими значениями вС-содержания (32,3 % и 32,2 %, соответственно), по сравнению с генами М2.Вб1Р51 и МЗ.Вз1Р51 (29,1 % и 29,0 %, соответственно). В итоге встройки генов М2.Вб1Р51 и МЗ.Вз1Р51 образовалась РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз и геном рестриктазы, узнающими один и тот же сайт узнавания. В пользу такого рекомбинационного события свидетельствует наличие спейсера с протяженным тандемным повтором между генами М1.Вз1Р51 и М2.Вз1Р51, а также высокий уровень гомологии С-домена М.Рок1 и М2.В51Р51, Ы-домена М.Рок1 и МЗ.Вз1Р51.

Можно предположить, что перенесенные гены нашли свое применение в жизнедеятельности клетки. Одной из причин их сохранения в геноме может быть необычайно высокая активность рестриктазы Вз1Р51 в природном штамме-продуценте. Уровень активности К.Вз1Р51 в клетках В. 5ХеаШкегторЫ1т Р5 приблизительно на два порядка превышает таковой у в клетках Р1ск1Ьас1ег'шт океапокоНез (100000 и 1000 ед.акт./г биомассы, соответственно). Вероятно, из-за такого высокого уровня активности И.Вб1Р51 возникла необходимость в дополнительной защите бактериальной ДНК от гидролиза собственной эндонуклеазой рестрикции, которую могут осуществлять метилазы М2.Вб1Р51 и МЗ.Вз1Р51, перенесенные из Рок1-подобной РМ-системы. Кроме того, избыточные ферменты могут выполнять и какую-либо другую функцию в бактериальной клетке, в

частности, МЗ.Вз1Р51 способен метилировать субстраты, отличные от последовательности узнавания Я-Бок!.

ВЫВОДЫ

1. Определена нуклеотидная последовательность оперонов трех систем рестрикции-модификации IIS типа: ÄS/F5I (сайт узнавания 5'-GGATG-3'), Faul (5'-CCCGC-3') и S/аШ (5'-GCATC-3'):

а) установлено, что оперон РМ-системы BstFSl из Bacillus stearothermophilus F5 содержит четыре однонаправленных и расположенных друг за другом генов ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, ориентированный навстречу. РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт, описана впервые;

б) показано, что оперон РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile состоит из однонаправленных гена контрольного белка, гена первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, гена эндонуклеазы рестрикции и гена второй ДНК-метил азы M2.FauI. Такое необычное строение оперона с наличием гена контрольного белка перед геном метилазы и расположением гена рестриктазы между генами метилаз обнаружено впервые;

в) выявлено, что РМ-система SfaNl из Streptococcus faecalis ND547 состоит из однонаправленных и последовательно расположенных генов метилазы и рестриктазы.

а) установлено, что Ml.BstF5I принадлежит к бета-типу, M2.BstF5I и M3.BstF5I относятся к альфа-типу и M4.BstF5I представляет дельта-тип Ш-аденин-ДНК-метилтрансфераз. При этом, M2.BstF5I и M3.BstF5I гомологичны С- и N-концевым доменам, соответственно, ДНК-метилтрансферазы FokI, также узнающей сайт 5'-GGATG-3';

б) показано, что ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul и M2.FauI имеют все 10 консервативных доменов, характерных для С5-ДНК-метилтрансферазам и проявляют максимальную гомологию с ДНК-метилтрансферазами, узнающими GC-богатые сайты узнавания;

в) выявлена высокая гомология N- и С-концевых частей ДНК-метилтрансферазы M.SfaNI с ферментами M2.Bstl9I и Ml.Bstl9I, соответственно, имеющими такой же сайт узнавания 5'-GCATC-3'.

3. Проведено клонирование ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I в составе экспрессирующего вектора и получены гомогенные препараты данных ДНК-метилтрансфераз с молекулярным весом 26, 35, 41 и 44 kD, соответственно.

4. Изучена субстратная специфичность клонированных ферментов и показано, что:

а) Ml.BstF51 и МЗ. BstF5I узнают н модифицируют верхнюю цепь сайта узнавания 5'-GGATG-3', тогда как M2.BstF5I и М4. BstF5I метилируют нижнюю цепь этого сайта;

б) Ml.BstF5I, M2.BstF5I и M4.BstF5I метилируют только установленный сайт узнавания, тогда как M3.BstF5I модифицирует не только канонический сайт 5'-GGATG-3', но и сайт 5'-GGATC-3\ однако Атакой реакции меньше в 20 раз, а коэффициент специфичности (kzJKm тк) меньше в 400 раз.

5. Определены оптимальные условия реакции метилирования ДНК клонированными ферментами. Показано, что ДНК-метилтрансферазы Ml.BstF5I, M2.BstF5I и M4.BstF5I проявляют максимальную активность при 55°С, тогда как M3.BstF5I при 60°С. Оптимальным значением рН для M4.BstF5I является 8,7, тогда как для остальных ферментов оптимум лежит в диапазоне 7,5-8,0. Активность всех ферментов ингибируется при концентрации NaCl выше 50 мМ.

6. Установлены значения кинетических параметров ксаt и 1Ст для ферментов Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I в реакции метилирования ДНК:

а) при модификации ДНК фага лямбда kcat для M3.BstF5I составляет 0,24 мин"1, тогда как для остальных ферментов эта величина варьирует от 1 до 2,6 обратной минуты, /¡fn,14™ в случае ферментов Ml.BstF5I и M3.BstF5I составляет 0,11 мкМ, тогда как для других ферментов варьируется от 0,68 до 1,29 мкМ;

б) для олигонуклеотидных дуплексов, содержащих полуметили-рованный и нативный сайгг узнавания, отношение коэффициентов специфичности (¿cat/Km^®) в реакции модификации полуметилированного дуплекса в парах ферментов Ml.BstF5I/ M3.BstF5I и M4.BstF5I/ M2.BstF5I составляет 8,6 и 7, соответственно. Ферменты Ml.BstF5I и M4.BstF5I предпочтительно модифицируют полу метилированный дуплекс, что указывает на их участие в пострепликативном метилировании вновь образованной ДНК.

7. Показано, что коэффициент специфичности (Аса,/Ктднк) ферментов IIS типа в реакции модификации протяженных природных ДНК варьирует от 0,77 до 8,91 мкМ'мин"1, тогда как у большинства ферментов, имеющих палиндромный сайт узнавания, этот параметр превышает 103 мкМ'-мин"'.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Shevchenko A.V. Primary structure and strand specificity of BstF5I DNA-methyltransferase recognizing GGATG // Gene. 1997. V.187. P. 217-219.

2. Абдурашитов M.A., Нетесова H.A., Голикова JI.H., Гуторов В.В., Белавин П.А., Дегтярев С.Х. Вторая ДНК-метилтрансфераза из системы рестрикции-модификации BstFSI гомологична С-концевым доменам FokI и Stsl // Мол. биол. 2000. Т.34. N1. С.87-94.

3. Голикова Л.Н., Нетесова H.A., Гуторов В.В., Белавин П.А., Абдурашитов М.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Множественность сайт-специфических ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 // Мол. биол. 2000. Т.34. N3. С.443-447.

4. Нетесова H.A., Голикова Л.Н., Овечкина Л.Г., Евдокимов A.A., Малыгин Э.Г., Гололобова Н.С., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Сравнительное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз M.BstF5I-l и M.BstF5I-3 системы рестрикции-модификации BstF5I // Мол. биол. 2002. Т.36. N1. С.136-143.

5. Голикова Л.Н., Гуторов В.В., Евдокимов A.A., Щелкунов С.Н., Гончар Д.А., Охапкина С.С., Дегтярев С.Х., Нетесова H.A. M.BstF5I-4 - четвертая ДНК-метилтрансфераза системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5» // Биоорган, химия. 2002. Т.28. N1. С. 84-86.

6. Чернухин В.А., Голикова Л.Н, Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Каширина Ю.Г., Нетесова НА., Дегтярев С.Х. ДНК-метилтрансферазы M.BstF5I-2 и M.BstF5I-4 системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 // Биохимия. 2003.T.68.N9.C.1183-1192.

7. Чернухин В.А., Кузнецов В.В., Гончар Д.А., Каширина Ю.Г., Нетесова H.A., Дегтярев С.Х. Субстратная специфичность и биохимические свойства ДНК-метилтрансферазы M3.BstF5I из системы рестрикции-модификации BstF5l // Биохимия. 2010. Т.75. N1. С.78-87.

8. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A., Chizikov V.E., Abdurashitiv M.A. Cloning and characterization of the gene encoding M-Faul DNA-methyltransferase // Biol. Chem. 1998.V. 379. P.567-568.

9. Абдурашитов M.A., Охапкина C.C., Нетесова H.A., Голикова Л.Н., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Уникальная система рестрикции-модификации Faul, клонирование, сравнительный анализ структуры белков // Мол. биол. 2003.Т.37. N4. С.619-624.

Ю.Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Нетесова Н.А., Чижиков В.Е., Малыгин Э.Г., Кочкин А.В., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Установление специфичности энонуклеазы рестрикции Vnel // Биоорган, химия. 1987. T.13.N3. С.422-423.

П.Охапкина С.С., Нетесова Н.А., Голикова JI.H., Серегина Е.В., Сосиовцев C.B., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Сравнительный анализ гомологичных систем рестрикции-модификации Sfel и LlaBI // Мол. биол. 2002. Т.36. N3. С.432-437.

12.Томилова Ю.Э., Абдурашитов М.А., Голикова Л.Н., Нетесова Н.А., Дегтярев С.Х. Клонирование, установление первичной структуры и сравнительный анализ ДНК-метилтрансфераз из систем рестрикции-модификации SfaNI и Bstl91 //Мол. биол. 2004. Т.38. N6. С.997-1004.

13.Евдокимов А.А., Зиновьев В.В., Кузнецов В.В., Нетесова Н.А., Малыгин Э.Г. Конструирование олигонуклеотидных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы I человека// Мол. биол. 2009. T.43.N3. С.455-463.

14.Томилова Ю.Э., Кузнецов В.В., Абдурашитов М.А., Нетесова Н.А., Дегтярев С.Х. Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза Ml.Bstl9I из Bacillus stearothermophilus 19: получение, свойства и сравнительный анализ аминокислотной последовательности // Мол. биол. 2010. Т.44. N4. С.688-698.

15.Тарасова М.В., Кузнецов В.В., Нетесова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза из Bacillus psychrodurans AC: получение и изучение свойств // Биохимия. 2010. Т.75. N12. С.1712 - 1719.

Тезисы конференций

1. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A. Abdurashitov M.A. Primary structure and strand specificity of BstF5I DNA-methyltransferase recognizing GGATG // FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 1996. P. 47.

2. Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Degtyarev S.Kh. Two BstF5I-methyltransferases recognize and modify different strand DNA sequence GGATG // FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 1997. P. 136.

3. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A. Cloning and characterization of the gene encoding Faul DNA-methyltransferase from Flavobacterium aquatile // 4 New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification. Insbruc. 1997. P. 153-154.

4. Netesova N.A, Degtyarev S.Kh., Golikova L.N., Gutorov V.V., Belavin P.A. Second DNA-methyltransferase from BstF5I restriction-modification system is homologous to C-domain of Fokl methylase // FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 1999. P.89.

5. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A., Golikova L.N., Gutorov V.V., Belavin P.A. Multiplicity of genes for DNA-methyltransferases in BstF5I restriction-modification system U FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 2000. P. 46.

6. Netesova N.A Degtyarev S.Kh., Abdurashitov M.A. Unique structure of Faul R-M system from Flavobacterium aquatile; Restriction endonuclease gene is located between genes of DNA methyltransferases // FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 2000. P. 42.

7. Degtyarev S. Kh., Netesova N.A., Golikova L.N. Cascad of four genes for DNA-methyltransferases in BstF5I restriction-modification system // FASEB Summer Research Conferences. Vermont, USA. 2001. P. 33.

8. Абдурашитов M.A., Охапкина C.C., Нетесова H.A., Дегтярев С.Х. Уникальная система рестрикции-модификации Faul, клонирование и анализ структуры оперона // 3-й съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002. С.600-601.

9. Абдурашитов М.А., Охапкина С.С., Нетесова Н.А., Дегтярев С.Х. Сравнительный анализ гомологичных систем рестрикции-модификации Sfel и LlaBI // 3-й съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002. С. 601-602.

Ю.Чернухин В.А., Кузнецов В.В., Гончар Д.А., Каширина Ю.Г., Нетесова Н.А., Дегтярев С.Х. Изучение субстратной специфичности и биохимических свойств ДНК-метилтрансферазы BstF5I-3 из системы рестрикции-модификации BstF5I // 4-й съезд биохимиков. Новосибирск, 2008. С. 154.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

НЕТЕСОВА НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ НБ ТИПА: СТРУКТУРА ОПЕРОНОВ, КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук. Подписано в печать 28.06.2011. Заказ №71. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2. Тираж 100экз Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Нетесова, Нина Александровна

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14 1. Бактериальные системы рестрикции-модификации и структура их оперонов

1.1. Распространенность систем рестрикции-модификации в бактериях

• 1.2. Защитная функция систем рестрикции-модификации

1.3. Другие возможные функции систем рестрикции-модификации

1.4. Типы систем рестрикции-модификации

1.4.1. Системы рестрикции-модификации типа I

1.4.2. Системы рестрикции-модификации типа II

1.4.3. Системы рестрикции-модификации типа IIS

1.4.4. Системы рестрикции-модификации типа III *

1.4.5. Другие системы рестрикции-модификации

1.5. Структура оперонов РМ-систем

1.6. Структура оперонов РМ-систем типа IIS

1.7. Строение и свойства ДНК-метилтрансфераз РМ-систем типа II

1.7.1. SAM-зависимое ферментативное метилирование

1.7.2. Первичная структура ДНК-метилтрансфераз

1.7.3. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз

1.7.4. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа II

1.7.4.1. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа IIP

1.7.4.2. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа IIQ и

1.7.4.3. Неспецифическая активность ДНК-метилтрансфераз типа II

1.8. Механизмы реакций метилирования ДНК и биохимические свойства ДНК-метилтрансфераз

1.8.1. Механизм катализа аминометилаз

1.8.2. Метилирование эндоциклического С5-атома цитозина

1.8.3. Биохимические свойства ДНК-метилтрансфераз типа II

1.8.4. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз типа II

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз"

Актуальность исследования. Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт-специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метилазами), является наиболее распространённой формой модификации.ДНК и вовлечено в широкий спектр важнейших биохимических процессов в живых организмах. Значительная, часть метилаз микроорганизмов является составной частью бактериальных систем рестрикции-модификации (РМ-систем), которые, как правило, включают эндонуклеазу (рестриктазу) и метилазу с одинаковой субстратной специфичностью, т.е., узнающих одну и ту же короткую последовательность ДНК, называемую последовательностью узнавания или сайтом узнавания. При этом метилаза переносит метальную группу на цитозин или аденин узнаваемой последовательности, предотвращая, таким образом, гидролиз бактериальной ДНК собственной- рестриктазощ которая не способна расщеплять модифицированный таким образом сайт узнавания, но расщепляет чужеродную немодифицированную ДНК. Существует несколько типов РМ-систем^ (типы 1-1У), но» абсолютное большинство описанных РМ-систем относятся к наиболее простому типу (тип II) и имеют так называемый палиндромиый сайт узнавания, т.е., сайт, имеющий симметрию вращения второго порядка. К ним относятся хорошо * известные РМ-системы А1и\ (сайт узнавания 5'-АССТ-3'), РзИ (5'-СТССАО-3'), Тад! (5'-ТСОА-3'), ХЬа\ (5'-ТСТАОА-З') и многие другие.

Чем больше открывалось новых ферментов рестрикции-модификации и чем глубже изучалась их генетическая организация и механизм действия, тем больше возникало сомнений в том, что защита ДНК клетки-хозяина — единственная функция РМ-систем. Более того, последние работы по определению первичной структуры ДНК целого ряда микроорганизмов выявили наличие в бактериальных клетках не одной (как ранее предполагалось), а целого набора генов ДНК-метилтрансфераз [97, 120, 262], что поднимает вопрос о роли такого каскада метилаз для функционирования клетки. На сегодня считается установленным, что роль РМ-систем не ограничивается защитной функцией, и они принимают активное участие в других клеточных процессах. Показано, что метилирование в бактериях играет важную роль в репликации и репарации ДНК, а также, по некоторым данным, в регуляции экспрессии генов. Кроме того, в ряде случаев было установлено, что* патогенность бактериальных штаммов связана" с метилированием собственной ДНК.

Важность функций биологического метилирования ДНК делают актуальными как изучение строения РМ-систем в целом, так и свойств ДНК-метилтрансфераз. Пристальный интерес исследователей к ДНК-метилтрансферазам обусловлен сравнительной простотой организации этих ферментов, их разнообразной и высокой субстратной, специфичностью, а также доступностью большого количества клонированных и выделенных ферментов [8]. Исследование бактериальных метилаз позволяет понять молекулярные механизмы действия эукариотических метилаз, более сложных и менее доступных для исследования объектов.

Ферменты РМ-систем входят также в ряд наиболее удобных модельных объектов в молекулярной биологии для исследования проблем белок-нуклеинового взаимодействия в.целом [51]. В последнее время интерес исследователей' привлекают бактериальные РМ-системы, имеющие несимметричный сайт узнавания. Как правило, рестриктазы таких РМ-систем расщепляют ДНК в стороне от сайта, узнавания, в связи с чем они и были названы ферментами рестрикции-модификации типа IIS (от слова shift -сдвиг). РМ-системы типа IIS были открыты существенно позднее остальных, и потому их изученность значительно отстает от других ферментов типа II, касается ли это их белковой структуры, механизма узнавания или строения оперонов соответствующих РМ-систем.

В задачи исследования входило:

1 .Определение нуклеотидной последовательности и организации оперонов трех систем рестрикции-модификации IIS типа: ÄS/F5I (сайт узнавания 5'-GGATG-3'), Faul (5'-CCCGC-3'), SfaNl (5'-GCATC-3').

2.Сравнительное изучение первичной структуры ДНК-метилаз РМ-систем типа IIS BstF5l, Faul, SfäNl и определение типа каждого фермента и метилируемого им основания.

3.Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I в составе экспрессирующего вектора и получение гомогенных препаратов данных ДНК-метилтрансфераз.

4.Установление субстратной специфичности клонированных ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I.

5.Определение оптимальных условий метилирования ДНК клонированными ферментами и установление кинетических параметров реакции метилирования олигонуклеотидных дуплексов и ДНК фага лямбда.

Научная новизна

Впервые описана система рестрикции-модификации, содержащая четыре гена ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт. Проведено определение полной нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы BstF5l из Bacillus stearothermophilus F5, содержащего четьдре однонаправленных и расположенных друг за другом гена ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, направленный им навстречу.

Впервые описана система рестрикции-модификации, в которой ген рестриктазы расположен между генами метилаз. Установлена нуклеотидная последовательность РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile. Оперон РМ-системы Faul состоит из однонаправленных гена контрольного белка, гена первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, гена эндонуклеазы рестрикции и-гена второй ДНК-метилазы M2.FauI.

Впервые описана система рестрикции-модификаци. SfaNl из Streptococcus faecalis ND547 и проведено клонирование всего оперона РМ-системы «S/arNI, содержащего однонаправленные и расположенные последовательно ген метилазы и ген рестриктазы SfaNI.

Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности клонированных ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа между собой и с другими метилазами с известной структурой. Определен тип каждой метилазы РМ-систем Ä?iF5I, Faul и SfaNI и изучена их субстратная специфичность.

Показано, что коэффициент специфичности {kcJKm днк) большинства ДНК-метилтрансфераз, узнающих палиндромные сайты узнавания, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.

Теоретическая и практическая значимость

В результате работы исследованы новые системы рестрикции-модификации IIS типа из штаммов Bacillus stearothermophilus F5, Flavobacterium aquatile и Streptococcus faecalis ND547.

Проведенное детальное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз, входящих в состав РМ-систем IIS типа с множеством метилаз, вносит новый вклад во всестороннее исследование процессов метилирования ДНК и роли ДНК-метилтрансфераз в бактериальной клетке, способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификации в частности и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.

Получение штаммов-продуцентов четырех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstFSl, двух ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Faul, ДНК-метилтрансферазы M.SfaNI расширяет генно-инженерный и аналитический инструментарий при изучении геномных ДНК и исследовании их взаимодействия с белками и ферментами нуклеинового обмена. В частности, ДНК-метилтрансфераза M3.BstF5I входит в список продуктов, реализуемых компанией «СибЭнзим» [207], и была использована при исследовании процессивности взаимодействия ферментов с ДНК [44; 93].

Основные положения, выносимые на защиту:

- Оперон РМ-системы Äs^F5I из Bacillus stearothermophilus F5 содержит четыре однонаправленных и расположенных друг за другом гена ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, ориентированный навстречу. РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт, описана впервые.

- Оперон РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile состоит из однонаправленных генов контрольного белка, первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, эндонуклеазы рестрикции и второй ДНКметилазы M2.FauI. Такое необычное строение оперона с наличием гена контрольного белка перед геном метилазы и расположением гена рестриктазы между генами метилаз обнаружено впервые.

- Система рестрикции-модификации SfaN1 из Streptococcus faecalis ND547 состоит из однонаправленных генов ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.

-ДНК-метилтрансферазы Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I являются К6-аденин-ДНК-метилтрансферазами, при этом M2.BstF5I и M3.BstF5I относятся к альфа типу, Ml.BstF5I принадлежит бета типу, а M4.BstF5I имеет первичную структуру дельта типа.

- Субстратная специфичность клонированных Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, M4.BstF5I имеет следующие отличия:

- Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M4.BstF5I метилируют только установленный сайт узнавания, тогда как M3.BstF5I модифицирует также сайт 5'-GGATC-3' с ксаХв 20 раз меньше.

- Коэффициент специфичности (ксat/Km днк) большинства ДНК-метилтрансфераз, узнающих палиндромные сайты, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Нетесова, Нина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Определена нуклеотидная последовательность оперонов трех систем рестрикции-модификации IIS типа: Äs^F5I (сайт узнавания 5'-GGATG-3'), Faul (5'-CCCGC-3') и SfaNl (5'-GCATC-3'): а) установлено, что оперон РМ-системы ÄstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 содержит четыре однонаправленных и расположенных друг за другом гена ДНК-метилтрансфераз Ml.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I и M4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, ориентированный навстречу. РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт, описана впервые; б) показано, что оперон РМ-системы Faul из Flavobacterium aquatile состоит из однонаправленных гена контрольного белка, гена первой ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul, гена эндонуклеазы рестрикции и гена второй« ДНК-метилазы M2.FauI. Такое необычное строение оперона с наличием гена контрольного белка перед геном метилазы и расположением гена л рестриктазы между генами метилаз обнаружено впервые; в) выявлено, что РМ-система S/aNI из Streptococcus faecalis ND547 состоит из однонаправленных и последовательно расположенных генов метилазы и рестриктазы.

2. Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности клонированных ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа между собой и с другими метилазами с известной структурой: а) установлено, что Ml.BstF5I принадлежит к бета-типу, M2.BstF5I и M3.BstF5I относятся к альфа-типу и M4.BstF5I представляет дельта-тип К6-аденин-ДНК-метилтрансфераз. При этом, M2.BstF5I и M3.BstF5I гомологичны С- и N-концевым доменам, соответственно, ДНК-метилтрансферазы FokI, также узнающей сайт 5'-GGATG-3'; б) показано, что ДНК-метилтрансферазы Ml.Faul и M2.FauI имеют все 10 консервативных доменов, характерных для С5-ДНК-метилтрансфераз, и проявляют максимальную гомологию с ДНК-метилтрансферазами,1 узнающими ОС-богатые сайты; в) выявлена высокая гомология и С-концевых частей ДНК-метилтрансферазы М^аМ с ферментами М2.Вб1191 и М1.Вз1:191, соответственно, имеющими такой же сайт узнавания 5'-ОСАТС-3'.

3. Проведено клонирование ДНК-метилтрансфераз. М1.Вз1Р51, М2.В81Р51, МЗ.Вз1Р51 и М4.Вз1Р51 в составе экспрессирующего вектора и получены гомогенные препараты данных ДНК-метилтрансфераз с молекулярным весом 26, 35, 41 и 44 кДа, соответственно.

4'. Изучена субстратная специфичность клонированных ферментов и показано, что: а) М1.Вз1Р51 и МЗ.Вз1Р51 узнают и модифицируют верхнюю цепь сайта узнавания 5'-ООАТО-3', тогда как М2.Вз1Р51 и М4. Вз1Р51 метилируют нижнюю цепь этого сайта; б) М1.В81Р51, М2.Вз1Р51 и М4.Вз1Р51 метилируют только установленный сайт узнавания, тогда как МЗ.В81Р51 модифицирует не только канонический сайт 5'-СОАТО-3', но и сайт 5'-ООАТС-3', однако ксм такой реакции меньше в 20 раз, а коэффициент специфичности (ксйХ/Кт днк) меньше в 400 раз.

5. Определены оптимальные условия реакции метилирования ДНК клонированными ферментами. Показано, что ДНК-метилтрансферазы М1.Вз1Р51, М2.Вз1Р51 и М4.Вб1Р51'проявляют максимальную активность при 55°С, тогда как МЗ.Вз1Р51 - при 60°С. Оптимальным значением рН для М4.Вз1Р51 является 8,7, тогда как для остальных ферментов оптимум лежит в диапазоне 7,5-8,0. Активность всех ферментов ингибируется при концентрации №С1 выше 50 мМ.

6. Установлены значения кинетических параметров ксаХ и Кт для ферментов М1.Вз1Р51, М2.В81Р51, МЗ.Вз1Р51 и М4.Вз1Р51 в реакции метилирования ДНК: а) при модификации ДНК фага лямбда ксаt для M3.BstF5I составляет 0,24 мин"1, тогда как для остальных ферментов эта величина варьирует от 1 до 2-,6 обратной минуты. Кт^НК в случае ферментов Ml.BstF5I и M3.BstF5I составляет 0,11 мкМ, тогда как для других ферментов варьИрУет от 0,68 до 1,29 мкМ; б) для олигонуклеотидных дуплексов, содержащих полуметилированный и нативный сайт узнавания, отношение коэффициентов специфичности (Аса/Кт"4111^ в реакции модификации полуметилированного дуплекса в парах ферментов Ml.BstF5I/ M3.BstF5I и M4.BstF5I/ M2.BstF5I составляет 8,6 и 7, соответственно. Ферменты Ml.BstF5I и M4.BstF5I предпочтительно модифицируют полуметилированный дуплекс, чт0 указывает на их участие в пострепликативном метилировании вновь образованной ДНК.

7. Показано, что коэффициент специфичности (kcaJ.Km днк) ферментов

IIS типа в реакции модификации протяженных природных ДНК варьирУеТ от

0,77 до 8,91 мкМ'^мин"1, тогда как у большинства ферментов, имеЮШих

1 -1 палиндромный сайт узнавания, этот параметр превышает 1000 мкМ мин •

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как следует из литературного обзора, количество изученных РМ-систем типа IIS значительно меньше, чем палиндромных РМ-систем-. Видимо, с этим связано и небольшое разнообразие выявленных структур оперонов РМ-систем типа IIS, и отсутствие регуляторных элементов типа контрольных белков в этих оперонах. Изучение, новых РМ-систем типа IIS, позволит расширить наши, знания о структуре оперонов и выявить новые элементы в организации и строении РМ-систем типа IIS.

В литературе приведены отрывочные данные по субстратной специфичности метилаз РМ-систем типа IIS, при этом, как видно из таблицы 1.9, во многих случаях не установлено, какое основание в сайте узнавания метилируется, а в некоторых случаях неясно даже, какие метилазы какие цепи узнаваемой последовательности модифицируют. Кинетические исследования метилаз типа IIS по- сути не проводились, так как опубликованы кинетические параметры, только одного фермента. FokI (5'-GGATG-3') и отдельно его N- и С-доменов, однако эти домены были модифицированы и к ним «пришиты» гистидиновые пептиды, которые в силу существенного положительного заряда могут в значительной степени искажать истинные кинетические параметры.

Таким образом, исследования свойств метилаз типа IIS позволят установить свойства этих практически неизученных ферментов и сравнить их со свойствами ДНК-метилаз палиндромных ферментов, которые исследованы достаточно хорошо.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ

Трис-(гидроксиметил)аминометан, ЭДТА, бромистый этидий, бромфеноловый синий, гепарин-сефароза, ДТТ, PMSF, глицерин. -производства «Sigma», США; акриламид,'КН2Р04, ампициллин («Helicón», Россия); бисакриламид, додецилсульфат натрия- (SDS) («Fluka AG», Швейцария); агароза («Hybaid-AGS», Германия); 2-меркаптоэтанол, Тритон* Х-100- («ICN», США); лизоцим («Serva», Германия); S-аденозилметионин, [ Н-метил]-8-аденозилметионин (15 Ки/ммоль) - производства «Amersham», США; триптон* и* дрожжевой экстракт - производства «Difco», США; гидроксилапатит («BioRad», США); ватман ЗММ* фосфоцеллюлоза* Р-11 («Whatman», Англия).

Остальные реактивы российских, производителей, марки ОСЧ.

В работе были использованы бактериальные, штаммьь Bacillus stearothermophilus F5, Flavobacterium aquatile, Streptococcus faecalis ND547 из коллекции--штаммов НПО «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия), Escherichia coli JM109; Escherichia coli RRI (New England-Biolabs, США). Бактериальные клетки-выращивали на среде Луриа-Бертани;(LB) [14].

Препараты ДНК фага-, X (dam7, dem-) и плазмидных ДНК, олигодезоксирибонуклеотиды, эндонуклеазы рестрикции, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli, ДНК-лигаза, полинуклеотидкиназа. фага Т4, щелочная фосфатаза, dNTP; Taq-ДНК-полимераза, маркеры молекулярных весов1 ДНК - производства НПО «СибЭнзим» Новосибирск.

В работе были использованы плазмидные ДНК: pUC19[270], pBR322 [84], рМТЬ22 [239], pACYC 184' [68], pJW2 [146].

2.2. МЕТОДЫ

2.2.1 Получение препаратов ДНК

Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом [15]. Колонию бактерий инокулировали в среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и выращивали на термостатированной воздушной качалке при о

37 С в течение ночи. Для выделения аналитического количества плазмидной

ДНК использовали 5 мл, а для препаративного- выделения - 50 мл* бактериальной, культуры.

Хромосомные ДНК штаммов Bacillus stearothermophilus F5, Flavobacterium aquatile, Streptococcus faecalis ND547 выделяли- по» методу СЛ. Смит и соавт. (1988) [209]*

2.2.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

Компетентные клетки E.coli RR1 готовили по методу, описанному в

16]'. Для> трансформации использовали 200 мкл свежеразмороженных компетентных клеток, к которым- добавляли; 5-10 нг плазмидной- ДНК в буфере ТЕ (10мМ<Трис-НС1; Ь мМ>ЭДТА, р№7,0). Смесь выдерживали во льду влечение 30 мин, затем проводили тепловой шок в водяной« бане при: 42°С в течение 90 с. После быстрого охлаждения во льду смесь.инкубировали 15 мин при комнатной-температуре и высевали на селективную среду LB с ампициллином (50 мкг/мл).

2.2.3. Постановкаферментативных реакций

Реакцию гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование ДНК, обработку фрагментом Кленова ДНК полимеразы I проводили по стандартной схеме согласно рекомендациям' фирмы-изготовителя. (НПО «Сибэнзим»).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в» условиях, подобранных для каждой пары праймеров отдельно, на приборе «Терцик» («ДНК-Технология»).

При постановке электрофореза' в агарозном геле* следовали рекомендациям, изложенным в руководстве «Электрофорез и разделение биологических молекул» [5]. Электрофоретическое разделение проводили при напряженности поля 10 В/см. Детекцию ДНК проводили на трансиллюминаторе «Biometra» с использованием длинноволнового УФизлучения. Для экстракции ДНК участки агарозного геля, содержищие нужные фрагменты ДНК, вырезали, помещали в пробирку. Экстракцию проводили с использованием наборов Qiagen - «MinElute Gel Extraction Kit».

Электрофоретическое разделение белков осуществляли согласно методическим указаниям [149]. Электрофоретическое разделение белков проводили при напряженности поля 15-29 В/см.

2.2.4. Метод селективной супрессии полимеразной цепной реакции

Для идентификации неизвестных участков бактериальных ДНК использовали метод «прогулки по хромосоме» [39].

Данный метод основан на эффекте селективной супрессии полимеразной цепной реакции с использованием супрессионного адаптора, адапторного амплификационного праймера и генспецифического праймера. СС ПЦР состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми повторами (ИКП). Генспецифические праймеры конструируются на основе известной структуры ДНК и позволяют «прогуливаться» по геному в 3'- или 5'-сторону в зависимости от выбранного направления праймера. %

Последовательность проведения СС ПЦР:

Геномная ДНК обрабатывается эндонуклеазой рестрикции, образующей при гидролизе тупые концы, поскольку в этом случае возможно универсальное использование супрессионных адапторов, также имеющих тупой конец.

- Фрагменты геномной ДНК лигируются с псевдодвуцепочечным (супрессионным) адаптором:

51-GCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'

3'-CGCCTCCCGCCA-5' Один из концов адаптора также является «тупым», а другой представляет собой 5'-выступающий одноцепочечный участок длиной 27 нуклеотидов , предназначенный для связывания адапторного праймера

- полученные фрагменты ДНК используются в реакции ПЦР с адапторным и специфичным праймером.

Супрессия ПЦР достигается за счет использования адапторного праймера, более короткого по длине, чем адаптор, и способного гибридизоваться с этим адаптором. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация^ ИКП супрессионного адаптора (самоотжиг) происходит раньше, чем, отжиг адапторного праймера; поскольку температура самоотжига ИКП. выше температуры- отжига1 праймера. При- этом формируется, структура типа «сковородки», закрывающая ¡сайт посадки адапторного праймера.

В результате селективно амплифицируются- только- те молекулы, которые содержат сайт для «отжига» специфичного праймера. Амплификация.молекул, не содержащих такой сайт, подавляется.

2:2.5; Определение нуклеотидных последовательностей

Нуклеотидную последовательность генов 6s7F5IM Г, Z«/F5IM2, ¿5/F5IM3 из Bacillus stearothermophilus F5, выявленных ОРТ из Flavobacterium aquatile и Streptococcus faecalis* ND547 определяли методом A.Mi Максама и В.Гилберта [159, 160]: ПЦР-продукгы, полученные методом селективной' супрессии полимеразной цепной реакции, секвенировали на приборе «Prism 310 Genetic Analyzer» с использованием набора «BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems).

Анализ данных секвенирования проводили с использованием программы Chromas 2.22 (Technelysium Pty Ltd)1.

2.2.6. Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз

Гены ДНК-метилтрансфераз были получены методом ПЦР, где использовалась геномная ДНК В. stearothermophilus F5 в качестве матрицы и праймеры, рассчитанные для каждого гена отдельно (см. главу 3.4). Полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующий вектор pJW2 [146] по сайтам рестрикции FauNDLn BamHI.

Колонии, содержащие целевые плазмиды, засевали в пробирки с 5 мл бульона LB (1 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 0,5 % NaCl, pH 7,0-7,3), содержавшего 50 мкг/мл ампициллина. Клетки растили на термостатированной воздушной качалке при 30°С и 140 об/мин в течение ночи. Затем из этих пробирок отбирали по 200 мкл культуры и переносили в пробирки с 5 мл свежей ^селективной, среды-с тем же антибиотиком. Культуру растили, на качалке при,30°С и 140 об/мин в течение 3 ч, а затем проводили^ термоиндукцию в- течение 4 ч* при> 42°С. Клетки осаждали центрифугированием.

При- наработке биомассы использовали 0,5-литровые флаконы со 100 мл питательной среды. 5 мл инокулята культуры, выросшей при 30°С за ночь, засевали во флакон со 100 мл питательного бульона LB, содержавшего 100 мкг/мл ампициллина. Клетки' подращивали на термостатированной воздушной качалке при 30°С и 130 об/мин в течение примерно 3 ч до средней логарифмической фазы: Затем проводили термоиндукцию в течение."4 ч при 42°С. Клетки собирали центрифугированием при, 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге J2-21 («Beckman», США). Хранили биомассу при температуре -20°С.

Получение гомогенных препаратов рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз проводилось путем последовательной хроматографии на гидроксилапатите, фосфоцеллюлозе Р-11, гепарин-сефарозе совместно с сотрудниками НПО «Сибэнзим».

2.2.7. Определение биохимических свойств препаратов ДНК-метилтрансфераз

Измерение температурной, pH-зависимости и влияние концентраций ионов К+ и Na+ на активность метилаз определяли в реакциях метилирования ДНК фага X (darrf, dem") по количеству включенных [3Н-СН3]-групп. В эксперименте по, определению оптимальной температуры реакционный буфер содержал 100 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5 % глицерина. Реакцию проводили в диапозоне температур от 25°С до 65°С в течение 15 мин.

Подбор оптимальной величины рН проводили в диапазоне значений от 4 до 11. Время реакции 20 мин. Реакционная смесь содержала 50 мМ Трис-НС1 (для значений рН от 7 до 11) или цитратно-фосфатный буфер (для рН от 4 до 7), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ.

Для определения оптимальных солевых условий использовали три концентрации №С1 и КС1: 50, 100 и 150 мМ в реакционном буфере; а также стандартный буфер без добавления солей для контроля. Концентрация БАМ составляла 5 мкМ, концентрации ферментов М1.В8£Р51, М2.Вз1Р51, МЗ.Вб1Р5Г и МЗ.Вб1Р51 составляли 12 нМ, 8 нМ, 90 нМ, 57 нМ соответственно. Подбирали оптимальное значение рН для каждого фермента. Время реакции

- 20 минут.

2.2.8. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами

Использовали стандартную методику регистрации переноса метилтрансферазой на ДНК-субстрат от 8-аденозил-Ь-метионина радиоактивно меченой СН3-группы. Реакции метилирования проводили при оптимальной для каждой ДНК-метилтрансферазы температуре. Реакционная смесь для проведения реакции метилирования содержала 100 мМ Трис-НС1 (подбиралось оптимальное значение рН для каждой метилазы), 1мМ ЕБТА, 1 мМ ДТТ, 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5% глицерина. Конечный объём реакционной смеси, концентрации субстратов и фермента варьировали в зависимости от условий эксперимента. Время подбирали таким образом, чтобы обеспечить измерение начальных скоростей реакций. В качестве субстрата использовали ДНК фага X, а при расчете концентраций

- концентрации участков метилирования, получаемые умножением молярной концентрации ДНК на число потенциальных участков модификации

Через определенные интервалы времени из реакционных смесей отбирали аликвоты и наносили на фильтры DE81 («Whatman», 1x1 см). Для учёта слабой фоновой радиоактивности, обусловленной остаточным количеством (после процедуры отмывки фильтров) неспецифически сорбированного [ H-CH3]-SAM, параллельно наносили на фильтры аликвоты аналогичных смесей, в которых отсутствовал фермент. Фильтры промывали трижды раствором 0,02 М NH4HC03, дважды водой; и один раз, 75 % о этанолом* после чегофильтры высушивали и считал и-их Н-радиоактивность в толуольном. сцинтилляторе при.помощи счетчика радиоактивности. «Searle Mark III». Расчётные концентрации [3H-GH3]-групп, включенных в ДНК, в пределах 5-8 % совпадали с концентрацией остатков дезоксиаденозина, способных метилироваться. Эксперименты повторяли не менее 2 раз.

2.2.9. Статистическая обработка результатов, и; анализ аминокислотных последовательностей

Параметры функций, соответствующих кинетическим ¡моделям, вычисляли, с использованием регрессионного анализа; проводимого с помощью программы Origin 5.0 (Microcal, США) [177]. Каталитическую константу и константу Михаэлиса определяли регрессионным анализом функции Михаэлиса, описывающей экспериментальные данные, с помощью минимизации величины %2.

Для выявления открытых рамок трансляции использовалась программа Vector NTI v.4.10 (InforMax, Inc). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы BioEdit 7.0.5 с параметрами по умолчанию [53]. Аминокислотные последовательности, использованные для сравнения, взяты из баз данных GenBank [116] и REBASE [240].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Определение структуры оперона РМ-системы BstF5I

Одной из наиболее интересных задач представлялось клонирование генов системы рестрикции-модификации- IIS типа бактериального штамма Bacillus stearothermophilus F5, узнающей непалиндромную последовательность узнавания 5'-GGATG-3' и расщепляющей ее в положении 2/0. Штамм-продуцент данной РМ-системы был выделен из природных изолятов в 1996 году [58].

РМ-система Bst¥5l имеет одинаковый сайт узнавания с хорошо изученными РМ-системами FokI [156] из штамма Flavobacterium okeanokoites, и Stsl [78] из штамма Streptococcus sanguis 54, однако R.Fokl расщепляет ДНК в положении 9/13, a R.StsI в положении 10/14.

На первом этапе были получены геномные библиотеки ДНК штамма 2faiF5I по нескольким рестриктазам. Затем, основываясь на методе, впервые предложенном в работе П.Венецианера и соавт. (1983) [218] и впоследствии названом «hungarian trick», были получены плазмиды, несущие гены Z«/F51 ДНК-метилтрансфераз.

3.1.1. Получение геномной библиотеки по R.Ksp22I и плазмиды pF5-l Первую геномную библиотеку штамма бактерии Bacillus stearothermophilus F5 получали по методу Е.Р. Забаровского и P.JI. Алликметса (1989) [11]. ДНК В. stearothermophilus F5 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Ksp221 (сайт узнавания 5'-TAGATCA-3'), и образовавшиеся липкие концы достраивали двумя нуклеотидами dATP* и dGTP с помощью- фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Векторную плазмиду pMTL22 линеаризовали рестриктазой Sali (сайт узнавания 5'-GATCGAC-3'), и образовавшийся липкий конец достраивали двумя нуклеотидами dCTP и dTTP с помощью фрагмента Кленова. Полученные в результате достройки вектор и фрагменты геномной ДНК имели липкие концы 5'-GA-3' и 5'-ТС-3', соответственно, и эффективно сшивались друг с другом. Клетки Е. coli RRI трансформировали полученной лигазной смесью, выделяли суммарную плазмидную ДНК и обрабатывали ее эндонуклеазой рестрикции BstF5I. Продуктами гидролиза суммарной плазмиды. трансформировали клетки Е. coli RRI и получили 12 клонов, несущих плазмиды, устойчивые к расщеплению ферментом R.BstF5I. Рестрикционное картирование показало, что полученные плазмиды идентичны и содержат вставку размером около 2250 п.н. Плазмида была названа pF5-l. Последовательность клонированного фрагмента ДНК определяли с помощью метода A.M. Максама и В.Рилберта [159, 160], и.в ней была обнаружена открытая рамка считывания» длиной 780 п.н.

3.1.2. Получение геномной библиотеки по R.AluI и плазмиды pF5-21

Для получения второй геномной библиотеки проводили частичный гидролиз ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой-рестрикции Alul (сайт узнавания 5'-AGACT-3'). Полученные фрагменты с помощью лигазной сшивки встраивали в плазмиду pMTL22, обработанную R.Smal. Клетки Е. coli RRI трансформировали лигированными ДНК, выделяли суммарный пул плазмид и обрабатывали эндонуклеазой- рестрикции BstF5I. После трансформации Е. coli RRI продуктами гидролиза получили два клона, несущие плазмиды, устойчивые к расщеплению ферментом R.BstF5I. Рестрикционное картирование показало, что полученные плазмиды идентичны и содержат вставку размером около 1200 п.н. Плазмида была названа pF5-21. Последовательность клонированного фрагмента ДНК определяли с помощью метода A.M. Максама и В:Гилберта.

3.1.31 Получение' геномной библиотеки по- R.BstX2I и' плазмиды pF5-32

При получении третьей геномной библиотеки использовали частичный гидролизат хромосомной ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой рестрикции BstX2I (сайт узнавания 5'-R'GATCY-3'). Полученные фрагменты геномной ДНК и плазмиду pMTL22, линеаризованную R.BamHI, сшивали

ДНК-лигазой. Лигазные сшивки проводили в различных соотношениях, фрагментов и вектора: 1/1, 2/1, 4/1. По окончании реакции лигирования лигазные смеси объединяли.

Компетентные клетки Е. coli RRI трансформировали аликвотой суммарной лигазной смеси и высевали на агаризованную среду LB с ампициллином. Выросшие колонии объединяли и проводили выделение суммарной плазмидной ДНК. Полученный препарат суммарной плазмидной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BstF5I и проводили повторную трансформацию. 48 клонов из выросших 120 были проанализированы с помощью рестрикционного анализа. Рестрикционный анализ показал, что восемь выделенных плазмидных ДНК содержат идентичные вставки длиной 2,2 тыс. п.н. и являются устойчивыми к действию эндонуклеазы рестрикции BstF5I. Полученная целевая плазмида была названа pF5-32. Нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента определили методом А.Максама и В.Гилберта.

3.1.4. Картирование участка ДНК, несущего вставки из плазмид pF5-l, pF5-21 и pF5-32

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, клонированных в плазмидах pF5-l, pF5-21 и pF5-32, показал, что они взаимно перекрываются. На рис. 3.1 схематично представлена структура . клонированной части РМ-системы ifaiF5I. Фрагменты в плазмидах pF5-l и pF5-21 перекрываются на 119 нуклеотидов, а в плазмидах pF5-21 и pF5-32 -на 821 нуклеотид. Выравнивание полученных первичных структур клонированных фрагментов ДНК позволило установить нуклеотидную последовательность общего ,фрагмента геномной ДНК штамма Bacillus stearothermophilus F5 длиной 4,7 тыс. п.н., несущего гены ферментов РМ-системы BstVSl. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что данный фрагмент ДНК кодирует три полные рамки считывания и часть четвертой рамки, расположенные последовательно друг за другом.

Кэр221-фрагмент В81Х21-фрагмент

-►

119 п.н. 821 п.н.

А1и1-фрагмент

Рис. 3.1. Клонирование части РМ-системы #^51.

На рисунке 3.2 представлена детальная схема фрагмента 4747 п.н. с указанием нуклеотидной последовательности ключевых элементов рамок считывания; полная структура оперона РМ-системы BstF5I, в состав которой входит данный фрагмент, приведена в главе 3.1.6.2. Как видно из рисунка перед первой рамкой имеется последовательность 5'-ТТОАТАЫ(18) ТАТААТ-3', которая строго соответствует каноническому прокариотическому промотору, а сигнальные последовательности Шайна-Дальгарно предшествуют всем рамкам считывания. Мы не обнаружили терминатора транскрипции в составе данного фрагмента ДНК. Исходя из этого, можно заключить, что изучаемый фрагмент 4747 п.н. представляет собой часть оперона и содержит промотор, три полных и одну неполную рамку считывания. Поскольку все три плазмиды рР5-1, рР5-21 и рР5-32 устойчивы к расщеплению ферментом Я.В81Р51 и содержат по одной полной и отличающейся от других рамке считывания, то можно заключить, что данные рамки кодируют три различные 5^51 ДНК-метилтрансферазы, названные, соответственно, М1.Вв1Р51, М2.Вз1Р51 и МЗ.Вб1Р51.

1081 ССАТТАТССС ТТТТСТААСА АСТТСТААТА ААААААСАТТ СбТАСТАСАТ АТТТТССТАА

-35 -10

1141 ATGAGTAACT AATATTAATT caattgatac TAAAATATAT GTTAATATAT ААТ\AGAГАА

СП bst¥5m\

1201 GTCATGTCAT TTATTGTCGA ATTTATCAAA CGTAGAAGAG GAGGGATTAA ACTGCTTTCC 1261 ААТАТТСТТА ATAAAACATA TTGTCTTGAT TGTGTAGAAG GAATGCGAAA ТТТАТТАААТ

1921 AATGAGGAGT ACGTACAGAT TGCAAATGAA AGGATTAAAA АТАТТСААСТ АТСТСТААТА 1981 ТАААТААСАТ CGGTCTTTGC CGAGGAAAAC ТАААТТТТ.СА TTAACTTAGA AATGATGCAT

2041 АТААТА [ААТТ TAGAATATCC ATAAAGGAAA СССТССТС^> |А ATTTAGAATA TCCATAAAGG к л андемеди повтор

2101 pGAGCCCTCC TCT>CCTCG [GC TCATÄ^TTAT<£TATG AGC ITT TTTTATTTTT TTAATAAAAA

Инвертированный повтор Поли-АТ-последовательность

2161 TTTTACTTTT С \AGGAAGG

G AAAGTTATGC AAACAACAAA GGTAAAGTAT ATAAAATСTС sd &j/f5im2

2221 CATTGAATTA TACAGGAGGT AAATTTAAGT TACTTGATCA GATATTACCT AAATTCCCGA 2941 GGTGTGAAAG GAATGAATAT TTCGTATACC CTATATCTTC AAACTATAGT AATAGCAGTT

3001 AT СATAGAAA AGACCGTAAC ACTTCTTTAG AAGTTTTAAT TACAAACTAC GATGTTAGGA

6srf5im3 sd

3061 ppATAAACTA ATGAGATATA TCGGCAGCAA AGTATTATTG CTAGATAAAA TAAATGAAGT

3121 AATTGAGGAA AATGTAGATA ATGCTGAATC TTTTCTTGAT ATTTTTTCAG GTACTGCTTC

4021 ATACCCTTAT AGAAGGTATA AAGGCAAAT T AT СAG СAAAA GAGCATAACC TCCACGAACT s/f5im4

4 081 ТАТАТТТТАС ССТААААА2А ССААСТТАТв АТСТАТвААА ТТТСТТААТй АА6АА6А6ТТ 4141 АААААААСТА АТАбААААйА АААААСТТТС Т6АТТАТТСА САТСАААТТТ ТАААТСААТТ

Рис. 3.2. Нуклеотидная последовательность фрагмента 4747 п.н. из оперона РМ-системы Зеленым цветом выделены старт-кодоны метилаз

М1.Вз£Р51, М2.Вб1Р51 и МЗ.Вз1Р51, красным цветом — стоп-кодоны, Последовательности обведены голубым цветом.

3.1.5. Анализ аминокислотных последовательностей трех рамок считывания

3.1.5.1. ДНК-метилтрансфераза М1.В81Г51

Ген ДНК-метилтрансферазы М1.Вз1Р51 лежит непосредственно за промоторной областью и последовательностью Шайно-Дальгарно (выделены на рис. 3.2) в положении 1204-1983 п.н. Анализ аминокислотной последовательности М1.Вз1Р5 выявил наличие в структуре фермента консервативных мотивов, свойственных ДНК-метилтрансферазам класса Б21 [92, 245]. В таблице 3.1 представлено множественное выравнивание и сравнение аминокислотных последовательностей М1.Вз1Г51 и других метилаз. Наблюдается сравнительно высокая степень идентичности выявленной метилазы другим представителями класса П2\ ДНК-метилтрансфераз, таких как М.БрпА (28,5 %), М.НтЙ (31,7 %) и М.МЬо1С (29,0 %).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Нетесова, Нина Александровна, Кольцово

1. BstKTI новый, dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции Mbol, способный гидролизовать полуметилированный субстрат / A.IL Надсев и др. // Биотехнол. 2006. 2. С. 5-10.

2. Белавин H.A., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий: // Прикл. биохим. микробиол. 1988. Т. 24. С. 121-1241

3. Бурьянов Я.И., Кирьянов Т. И. Структурно-функциональные основы энзимагического метилирования ДНК / Итоги науки и техники; Сер. мол. биол. М., ВНИТИ, 1987. 23. 220 с.

4. Буткус В!В;, Пятрушите М:Н;, Янулайтис A.A. Определение субстратной специфичности эндонуклеаз рестрикции Есо471 и Есо521 / Биоорг. химия. 1985. 11.7. С. 987-988.

5. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкей Л. Электрофорез в разделении биологических молекул. М:, Мир: 1982.446 с.

6. Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. ВЫ- и Glal- ПЦР анализ? новый .метод исследования!, метилированных участков ДНК7/ Вестник; биотехнол. физ.-хим. биол. им. Ю.А. Овчинникова: 2010. 6. 1. Р: 5-12.

7. Гончар Д;А., . Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. Способ определения гиперметилированных CpG островков в области генов-супрессоров опухолевого роста в ДНК человека. // Патент на изобретение RU 2413773 С. 2011. • , ^

8. Громова Е.С., Хорошаев A.Bv Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК // Мол: биол. 2003. 37. 2. С. 300314.

9. Дедков B.C. Определение специфичности ДНК-метилтрансферазы M.Bsc41 в клеточном лизате- при помощи блокирования эндонуклеаз рестрикции: и компьютерного моделирования//Мол. генетика, микробиол. вирусол. 2009. 3.1. С. 3-8.

10. ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной последовательности 5'-CCCGC-3' (выделение и свойства) / В .А. Чернухин и др. // Биохимия. 2005. 70. 6. С. 829-837.

11. Забаровский Е.Р:, Алликметс PJL Векторы для конструирования представительных геномных библиотек // Мол. биол. 1989. 23. С. 1494'-1515.

12. Изучение специфичности новых рестриктаз и метилаз. Необычная модификация, цитозина по 4-му положению / A.A. Янулайтис и др. // Мол. биол. 1984. 18. С. 115-129.

13. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., Мир: 1979. 280 с.

14. МаниатисТ., ФричЭ., СэмбрукДж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: Мир, 1984. 480 с.15; Методы клонирования в бациллах / К.Г. Харди // Клонирование ДНК. Методы / под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. С. 230-249.

15. Методы трансформации E.coli / Д.Ханаан // Клонирование ДНК. Методы / под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. С. 140-173.

16. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза BspACI ra Bacillus psychrodurans АС узнает последовательность 54-CACGC-373,-GGCAG-57 M.B. Тарасова и др. // Вестник биотехнол. физ.-хим. биол. им. Ю.А. Овчинникова. 2009. 5. 1. С. 16-24.

17. Поляновский O.JI., Носиков В.В. Рестрикционные эндонуклеазы в генетической инженерии / Итоги науки и техники. Сер. мол. биол. М., ВНИТИ, 1978. 190 с.

18. Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза Ml.BspACI из Bacillus psychrodurans

19. АС: получение и свойства / M.B. Тарасова и др. //Биохимия. 2010. 75. 12. С. 1712-1719.

20. Траиспозирующиеся элементы бактерий" / Б. Льюин // Гены: пер. с англ. / Б. Лыоин М.: Мир, 1987. С. 460.

21. Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции Vne I / С.Х. Дегтярев: и др.//Биоорг. хим. 1987. 13. С. 420-421.

22. ФерштЭ. Структураимехшшзм действия, ферментов. М., Мир: 1980. 432 с.

23. Штамм бактерии Kocuria rosea продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Krol / В.А. Чернухин й др. // Патент на изобретение RU 2394099 С1: 2010.

24. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens ЗК продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pes I / В.А. Чернухин и, др. // Патент на изобретение RU 2377294 С1. 2009.

25. A model for DNA binding and enzyme action derived from crystallographic studies of the Taql N6-adenine-methyltransferase7 G. Schluckcbier et al. // Gene. 1995.157. 1-2. P. 131-134.

26. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes / R.J. Roberts et al. // Nucleic Acids Res. 2003. 31. 7. P. 1805-18012.

27. A nucleotide-flipping mechanism from- the structure of human uracil-DNA glycosylase bound to DNA / G. Slupphaug et al. // Nature. 1996. 384. 6604. P. 87-92.

28. A unique family of Mrr-like modification-dependent restriction endonucleases / Y. Zheng et al. //Nucleic Acids Res. 2010: 38. P. 5527-5534.

29. Adams G.M., Blumenthal R.M. The Pvull DNA (cytosine-N4)-methyltransferase comprises two trypsin-defmed domains, each of which binds a molecule of S-adenosyl-L-methionine // Biochemistry. 1997. 36. 27. P: 8284-8292.

30. Adler S .P., Nathans D. Studies of SV40 DNA. V. Conversion of circular to -linear SV40 DNA by restriction endonuclease from Escherichia coli B // Biochim. Biophys. Acta. 1973. 299. P. 177-188.

31. Ahmad I., Rao D.N. Functional analysis of conserved motifs in Eco?\5l DNA, methyltransferase // J. Mol. Biol. 1996. 259. 2. P. 229-240.

32. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA / P.D. Siebert et al. //Nucleic Acids Res. 1995. 23. 6. P. 1087-1088.

33. Arber W. DNA modification and'restriction // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1974. 14. P. 1-37.

34. Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution // FEMS Microbiol. Rev. 2000. 24. P. 1-7.

35. Archaeal adaptation to higher temperatures revealed by genomic sequence of Thermoplasma volcanium / T. Kawashima et al. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. 97. (26). P. 14257-14262.

36. Atomic model of a pyrimidine dimer specific excision repair enzyme complexed with a DNA substrate: structural basis for damaged DNA recognition /

37. D.G. Vassylyev et al. // Cell. 1995. 83. 5. P. 773-782.

38. Bacteriophage T4 Dam DNA-(N6-adenine)-methyltransferase. Processivity and orientation to the methylation target / V.V. Zinoviev et al. // J. Biol. Chem. 2003. 278. P. 7829-7833.

39. Ban C., Yang W. Structural basis for MutH activation in E. coli mismatch repair and relationship of MutH to restriction endonucleases // EMBO J: 1998. 17. P. 1526-1534.

40. BandaruB., Gopal J., BhagwatA.S. Overproduction of DNA cytosine methyltransferases causes methylation»and С —> T mutations at non-canonical sites //J. Biol. Chem. 1996. 271. 13. P. 7851-7859.

41. Barcus V.A., Murray N.E. Barriers to recombination: restriction // Population Genetics of Bacteria / S. Baumberg et al. (eds). Cambridge: Cambridge University Press, 1995. P. 31-58.'

42. BergeratA., Guschlbauer W. The double role of methyl donor and allosteric effector of S-adenosyl-methionine for Dam methylase of E. coli II Nucleic Acids Res. 1990. 18. 15. P. 4369-4375.

43. Bewley C.A., Holland N.D., Faulkner D.J. Two classes of metabolites from Theonella swinhoei are localized in distinct populations of bacterial symbionts II. Experientia. 1996. 52. P. 716-722.

44. Bhattacharya S.K., DubeyA.K. Kinetic mechanism of cytosine DNA methyltransferase Mspl И J. Biol. Chem. 1999. 274. 21. P. 14743-14749.

45. Bheemanaik S., Reddy Y.V., Rao D.N. Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases // Biochem. J. 2006. 399. P. 177-190.

46. Bickle T.A., Kruger D.H. Biology of DNA restriction // Microbiol. Rev. 1993. 57. P. 434-450.

47. Biological sequence alignment editor for Win95/98/NT/2K/XP. Цитировано 11 апреля 2011. Доступно с сайта: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

48. Blumental М., Cheng X. Restriction-modification systems // Modern microbialgenetics, second edition / U.N. Streips, R.E. Yasbin (eds). New York, Wiley-Liss Inc., 2002. P. 177-225.

49. Blumenthal R.M., Cheng X. A Taq attack displaces bases // Nat. Struct. Biol. 2001. 8. P. 101-103.

50. Boye E., Marinus M.G., Lobner-Olesen A. Quantitation of Dam methyltransferase in Escherichia coli// J. Bacteriol. 1992. 174. 5. P. 1682-1685.

51. Brown N.L., Smith M. Cleavage specificity of the restriction endonucleases isolated from Haemophilus gallinarum (Hgal) // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. 74. P. 3213-3216:

52. BstF5I, an unusual isoschizomer of FokL/ M.A. Abdurashitov et al. // Gene. 1996. 172. P. 49-51.

53. Btrl; a novel restriction endonuclease, recognises the nonpalindromic sequence 5'-CACGTC(-3/-3)-3' / S.K. Degtyarev et al. //Nucleic Acids Res. 2000. 28. P. 56.

54. BujnickiJ., RadlinskaM. Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) methyltransferases: evidence for their polyphyletic origin // Nucleic Acids Res. 1999.27. 22. P. 4501-4509.

55. BujnickiJ.M. Sequence permutations in the molecular evolution of DNA methyltransferases // BMC. Evol. Biol. 2002. 2. P. 3.

56. Cal S., Connolly B.A. The Eco RV modification methylase causes considerable bending of DNA upon binding to its recognition sequence GATATC // J. Biol. Chem. 1996. 271. 2. P. 1008-1015.

57. Campbell A.M. Cryptic Prophages // Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology / F.C. Neidhardt et al. (eds). Washington, DC: ASM Press, 1996. P. 2041-2046.

58. Can phage defense maintain colicin plasmids in Escherichia coli? / M. Feldgarden et al. // Microbiology. 1995. 141. P. 2977-2984.

59. Cantoni G.L. Biological methylation: selected aspects // Annu. Rev. Biochem. 1975.44. P. 435-451.

60. Carlson K., Kosturko L.D. Endonuclease II of coliphage T4: A recombinase disguised as a restriction endonuclease? // Mol. Microbiol. 1998. 27. P. 671-676.

61. Cellular origin of chlorinated diketopiperazines in the dictyoceratid sponge Dysidea herbacea (Keller) / A.E. Flowers et al. // Cell Tissue Res. 1998. 292. P. 597-607.

62. Chang A.C.Y., Cohen S.N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the pl5A cryptic miniplasmid // J. Bacteriol. 1978. 134. P. 1141-1156.

63. Characterization of Bcgl, a new kind of restriction-modification system / H. Kong et al. // J. Biol. Chem. 1994. 269. 1. P. 683-690.

64. Chen L., MacMillan A.M., Verdine G.L. Mutational separation of DNA binding from catalysis in DNA cytosine methyltransferase // J: Am. Chem. Soc. 1993. 115. P. 5318-5319.

65. Cheng X. Structure and function of DNA methyltransferases // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. 24. P: 293-318.

66. Cheng X., Blumenthal R.M. Finding a basis for flipping bases // Structure. 1996. 4'. P. 639-645.

67. Cheng X., Roberts RJ. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping //Nucl. Acids Res. 2001. 29. P. 3784-3795.

68. Circular permutation of DNA cytosine-N4 methyltransferases: in vivo coexistence in the Bail' system and in vitro probing by hybrid formation / G. Vilkaitis et al. // Nucleic Acids Res. 2002. 30. 7. P. 1547-1557.

69. Cloning and-analysis of-the four genes coding for BpulOI restriction-modification enzymes /K. Stankevicius et al. //Nucl. Acids Res. 1998. 26. P. 1084-1091.

70. Cloning and analysis of the HaeIII and HaeII methyltransferase genes / B.E. Slatko et al. I I Gene. 1988. 74. 1. P. 45-50.

71. Cloning and sequence analysis of the genes coding for Eco57I type IV restriction-modification enzymes / A. Janulaitis et al. // Nucleic Acids Res. 1992. 20. P. 6051-6056.

72. Cloning and sequence analysis of the StsI restriction-modification gen^: Presen of homology to Fokl restriction-modification enzymes / K. Kita et al J ^ Nuclei Acids Res. 1992. 20. P. 4167-4172.restriction

73. Cloning, characterization and heterologous expression of the Smal 117 23. Pmodification system / S. Heidmann et al. // Nucleic Acids Res. 19899783-9796.restriction

74. Cloning, expression, and purification of a thermostable nonhomodimeri^ x enzyme, BslI / P.-C. Hsieh et al. // J. Bacteriol. 2000. 182. P. 949-955.

75. Cohen H.M., TawfikD.S., Griffiths A.D. Promiscuous methylatioü-canonical DNA sites by Haelll methyltransferase // Nucleic Acids Res-17. P. 3880-3885.

76. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneui*3of non-2002. 30.oniaeand

77. Mycoplasma genitalium / R. Himmelreich et al. // Nucleic Acids Res 701-712.x 997. 25. P.str^ MC58 '

78. Complete genome sequence of Neisseria meningitidis serogroup B H. Tettelin et al. // Science. 2000. 287. P. 1809-1815.e cloning

79. Construction and characterization of new cloning vehicles. A multipurpC^ system / F. Bolivar et al. // Gene. 1977. 2. P. 95.

80. Crystal structure of the DpnM DNA adenine methyltransferase from restriction system of Streptococcus pneumoniae bound to S-adenosylnx^1 P.H. Tran et al. // Structure. 1998. 6. 12. P. 1563-1575.

81. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-' L-methionine / X. Cheng et al. // Cell. 1993. 74. 2. P. 299

82. Dam methylase from Escherichia coli: kinetic studies using modified ¿z^^^023. 18.hemimethylated substrates / S. Marzabal et al. II Nucleic Acids Res. 19^=^ P. 3648-3655.-fled DNA

83. Dam methyltransferase from Escherichia coli: Kinetic studies using raoa3^"^-m- 1997.oligomers: nonmethylated substrates / V. Thielking et al. // Biol. CIx«*2^-ttie DpnlI-thionine /-adenosyl378. 5. P. 407-415.

84. De Backer O., Colson C. Two-step cloning and expression in Escherichia coli of the DNA restriction-modification system SVyLTI of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1991. 173. 3. P. 1321-1327.

85. Developmentally regulated protein synthesis during intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J7 M.P. McCann et al. // Can. J. Microbiol. 1998. 44. P. 50-55.

86. Differential binding of S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine and sinefungin to the adenine-specific DNA methyltransferase M.Taql I G. Schluckebier et al. Il J. Mol. Biol. 1997. 265. 1. P. 56-67.

87. Differential methylation kinetics of individual target site strands by T4Dam DNA methyltransferase / V.V. Zinoviev et al. // J. Biol Chem. 2007. 388. 11. P. 11991207.

88. Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methyltransferase / L. Chen et al. // Biochemistry. 1991. 30. 46. P. 11018-11025.

89. Discovery of natural nicking endonucleases Nb.BsrDI and Nb.BtsI and engineering of top-strand nicking variants from BsrDI and BtsI / S.Y. Xu et al. // Nucleic Acids Res. 2007. 35. P. 4608-4618.

90. DNA bending by EcoRi DNA methyltransferase accelerates base flipping but compromises specificity / B.W. Allan et al. II J. Biol. Chem. 1999. 274. 27. P. 19269-19275.

91. DNA methyltransferases of the cyanobacterium Anabaena PCC 7120 / A.V. Matveyev et al. //Nucleic Acids Res. 2001. 29. 7. P. 1491-1506.

92. DNA-(N4-cytosine)-methyltransferase from Bacillus amyloliquefaciens\ kineticand substrate-binding properties / E.G. Malygin et al. // Mol. Biol. (Mosk). 2001. 35. l.P. 35-44.

93. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes //Nucleic Acids Res. 2001. 29. 18. P. 3728-3741.

94. Dubey A.K., Bhattacharya S.K. Angle and locus of the bend induced by the Mspl DNA-methyltransferase in a sequence-specific complex with DNA // Nucleic Acids Res. 1997. 25. 10. P. 2025-2029.

95. Dubey A.K., Roberts R.J. Sequence specific DNA binding by the Mspl DNA methyltransferase //Nucleic Acids Res. 1992. 20. 12. P. 3167-3173.

96. DybvigK., SitaramanR., French C.T. A family of phase-variable restriction enzymes with differing specificities generated by high-frequency gene rearrangements // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. P. 13923-13928.

97. Earampamoorthy S., Koff R.S. Health hazards of bivalve-mollusk ingestion // Ann. Intern. Med. 1975. 83. P. 107-110.

98. EskinB., Linn S. The deoxyribonucleic acid modification and'restriction enzymes-of Escherichia coli B. III. Studies of the restriction adenosine triphosphatase // J. Biol. Chem. 1972. 247. 19. P. 6192-6196.

99. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: All the world's a phage / R.W. Hendrix et al. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1999. 96. P. 2192-2197.

100. Exact size and organization of DNA target-recognizing domains of multispecific DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases / T.A. Trautner et al. // EMBO J. 1996. 15. P. 1434-1442.

101. Friedman S., AnsariN. Binding of the ZscoRII methyltransferase to 5fluorocytosine containing DNA. Isolation of a bound peptide 11 Nucleic Acids Res. 1992. 20. 12. P. 3241-3248.

102. Fuller-Pace F.V., Murray N.E. Two DNA recognition domains of the specificity polypeptides of a family of type I restriction enzymes // Proc. Natl- Acad. Sci. USA. 1986. 83. 24. P. 9368-9372.

103. Fuller-Pace F.V., Cowan G.M., Murray N.E. EcoA and EcoE: Alterr^tives t0 the EcoK family of type I restriction and modification systems ofEscheri^ia • '

104. Mol. Biol. 1985. 186. P. 65-75.

105. GabbaraS., SheluhoD., BhagwatA.S. Cytosine methyltransf^^ fr°m Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serineactive // Biochemistry. 1995. 34. 27. P. 8914-8923.

106. Garcia R.A., Bustamante/C.J., Reich N.O. Sequence-specific rЬУ cytosine C5 and adenine N6 DNA methyltransferases requir^^ different deformations of DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93. 15. P. 7<5 18-7622.

107. Gehrig П., SchusslerA., KlugeM. Geosiphon pyriforme, a fun^*^ formmgfoer of theendocytobiosis with Nostoc (cyanobacteria), is an ancestral mettx-*-*

108. Glomales: Evidence by SSU rRNA analysis // J. Mol. Evol. 1996. 43. "718Lс сайта:

109. GenBank Overview. Цитировано 11 апреля 2011. Доступно* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/

110. Gingeras T.R., MilazzoJ.P., Roberts RJ. A computer assisted metfcn-J°a1978 5determination of restriction enzyme recognition sites // Nucleic Acids P. 4105-4127.

111. Heitman J. On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes // Genet. Eng. 1993. V. 15. P. 57-108.

112. Heitman J., Ivaneko T., Kiss A. DNA nicks inflicted by restriction endonucleases are repaired by a RecA- and RecB-dependent pathway in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1999. 33. P. 1141-1151,

113. Heitman J;, Zinder N.D., Model P. Repair of the Escherichia coli? chromosome after in vivo scission by the EcoRI endonuclease // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. 86. P.2281-2285.

114. Herman J.G., Modrich P. Escherichia coli; dam methyläse. Physical- and catalytic properties of the homogeneous enzyme // J. Biol. Chem. 1982. 257. 5. P. 26052612.

115. Hermann A., Goyal R., Jeltsch A. The Dnmtl DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase methylates DNA processively with high preference for hemimethylatedtarget sites// J^ Biol; Chem; 2004; 279i48C Pr350-359: .

116. Hhal and Hpall DNA methyltransferases bind DNA mismatches, methylate uracil and block DNA repair / A.S. Yang et al. // Nucleic Acids Res. 1995. 23. 8. P; 1380-1387;

117. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix / S. Klimasauskas et al. // Cell. 1994. 76. P. 357-369.

118. Homeologous recombination and mismatch repair during transformation in Streptococcus pneumoniae', saturation of the Hex mismatch repair system / 0. Humbert et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. 92. 20. P. 9052-9056.

119. How does a DNA interacting enzyme change its specificity during molecular evolution? A site-directed mutagenesis study at the DNA binding site of the DNA-(adenine-N6)-methyltransferase EcoRV / C. Beck et al. // Biochem. 2001. 40. 37. P. 10956-10965.

120. HsiaR.C., TingL.M., Bavoil P.M. Microvirus of Chlamydia psittaci strain guinea pig inclusion conjunctivitis: isolation and molecular characterization // Microbiology. 2000. 146. P. 1651-1660.

121. In vitro specificity of EcoRI DNA methyltransferase / N.O. Reich et al. // J. Biol. Chem. 1992. 267. 22. P. 15802-15807.

122. Inhibition of the type I restriction-modification enzymes EcoB and EcoK by the gene 0.3 protein of bacteriophage T7 / P.K. Bandyopadhyay et al. // J. Mol. Biol. 1985. 182. P. 567-578.

123. Interaction of the phage T4 DNA-N6-adenine.-(Dam)methyltransferase with oligonucleotides containing native or modified (defective) recognition sites / E.G. Malygin [et al.] // Nucleic Acids Res. 1997. 25. 21. P. 4393-4399.

124. JeltschA., Friedrich T., Roth M. Kinetics of methylation and binding of DNA by the jEcoRV adenine-N6 methyltransferase // J. Mol. Biol. 1998. 275. 5. P. 747-758.

125. Jeltsh A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltranferases // Chembiochem. 2002. 3. P. 274-293.

126. Karreman C., deWaardA. Agmenellum quadruplicatum M.AquI, a novel modification methylase // J. Bacteriol. 1990. 172. P. 266-272.

127. Kelleher J.E., Raleigh E.A. Response to UV damage by four Escherichia coli K-12 restriction systems // J. Bacteriol. 1994. 176. 19. P. 5888-5896.

128. Kinetic characterization of the Ecal methyltransferase / L. Szilak et al. // Eur. J. Biochem. 1993. 218. 2. P. 727-733.

129. Klimasauskas S., Nelson J.L., Roberts R.J. The sequence specificity d cytosine-C5 methylases//Nucleic Acids Res. 1991. 19. P. 6183-6190.

130. Klimasauskas S., Roberts R.J. M.Hhal binds tightly to substrates с mismatches at the target base // Nucleic Acids Res. 1995. 23. 8. P. 1388-13

131. Kobayashi I. Behavior of restriction-modification systems as selfistx elements and their impact on genome evolution // Nucleic Acids Res. 20О 3742-3756.

132. Kobayashi I. Selfishness and death: raison d'être of restriction, recombin^^ mitochondria // Trends Genet. 1998. 14. P. 368-374.

133. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. Comparative studies of the and T4 DNA (N6-adenine)methyltransferases: amino acid changes th.^ catalytic activity//J. Bacteriol. 1997. 179. 10. P. 3239-3243.

134. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. Function of Pro-185 in the Рзг=-conserved motif IV in the iscoRII cytosine-C5.-DNA methyltransferase Lett. 1995.370. 1-2. P. 75-77.mobile . 29. P.-ion and1. V FEBS

135. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S.M. Phage T4 DNA N6-a^ methyltransferase. Overexpression, purification and characterization // — Chem. 1995. 270. 24. P. 14389-14393.

136. Krishnamurthy V., Rao D.N. Interaction of EcoPl modification methylasejenine.-Biol.adenosyl-L-methionine: a UV-crosslinking study // Biochem. Mol. Biol. Iiri^ 32. P. 623-632.

137. Kruger D.H., Bickle T.A. Bacteriophage survival: multiple mechanist avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts // Mi-^ Rev. 1983. 47. P. 345-360.

138. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriofhage T4//Nature. 1970. 227. P. 680-685.

139. Lange C., Wild C., Trautner T.A. Altered sequence recognition specificity o--DNA methyltransferase carrying a chimeric "target recognizing domain" />"vvith S1. Z3L- 1994'ead of1995. 157. P. 127-128.

140. Large electrostatic differences in the binding thermodynamics of a cationic peptide to oligomeric and polymeric DNA / W. Zhang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93. 6. P. 2511-2516.

141. LeeK.-F., LiawY.-C., ShawP.-C. Overproduction, purification^ and' characterization of M.EcoHK31I; a- bacterial methyltransferase with two> polypeptides // Biochem. J. 1996. 314. P. 321-326.

142. Lindstrom W.M., Flynn J., Reich N.O. Reconciling structure and'function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase // J. Biol. Chem. 2000. 275. 7. P. 4912-4919.

143. Linn S., Arber W. Host specificity of DNA produced by Escherichia, coli:, X. In vitro restriction-of phage fd replicative form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. 59. P. 1300-1306.

144. Loenen W.A., Murray N.E. Modification enhancement by the restriction-alleviation protein (Ral)«ofbacteriophage lambda//J. Mol. Biol. 1986. 190. P. 11-22.

145. M.Fokl methylates adenine in both1 strands »of its asymmetric recognition sequence / D. Landry et al. // Gene. 1989. 77. P. 1-10.

146. MaloneT., Blumenthal R.M., Cheng X. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and-suggests a catalytic mechanism-for these enzymes // J. Mol. Biol. 1995. 253. 4. P. 618-632.

147. Master S.S., Blumenthal R.M. A genetic and functional analysis of the unusually large variable region in the M.AluF DNA-(cytosine C5)-methyltransferase // MoU Gen. Genet. 1997. 257. P. 14-22.

148. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. 74! (2). P. 560-564.

149. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages //Methods Enzymol. 1980. 65. (1). P. 499-560.

150. McBrideM.J., Zusman D.R. Behavioral analysis of single cells of Myxococcus xanthus in response to prey cells of Escherichia coli // FEMS Microbiol. Lett. 1996.137. P. 227-231.

151. McCarthy M.D., Hedges J.I., BennerR. Major bacterial contribution to marine dissolved organic nitrogen // Science. 1998. 281. P. 231-234.

152. Methylation by a mutant T2 DNA N(6)-adenine. methyltransferase expands the usage of RecA-assisted endonuclease (RARE) cleavage /1. Minko [et ah] H Nucleic Acids Res. 2001: 29. 7. P. 1484-1490.

153. MivS., Roberts R.J'. How M.Msp I- and M Hp all decide which base to-methylate // Nucleic Acids Res. 19921 20. 18. PI 4811-4816.

154. Milkman R. Gene transfer in Escherichia-coli // Organizations of the Prokaryotic Genome / R.L. Charlebois (ed). Washington, DC: ASM Press, 1999. P. 291-309.

155. Molecular characterization of a bacteriophage (Ghp2) from Chlamydia psittaci / B.L. Liu et al. // J. Virol. 2000. 74. P.' 3464-3469.

156. Molecular evolution of the Escherichia coli chromosome: V. Recombination! patterns among strains of diverse origin / R. Milkman et al. // Genetics. 1999. 153. P: 539-554.

157. Nakayama Y., Kobayashi I. Restriction-modification gene complexes as selfish gene entities: roles of a regulatory system in their establishment, maintenance, and apoptotic mutual exclusion // Proc. Natl'. Acad. Sci. USA. 1998. 95. P: 6442-6447.

158. Nardone G., George J., Chirikjian J.G. Differences in the kinetic properties of BamHl endonuclease and* methylase with linear DNA substrates // J. Biol. Chem. 1986. 261. 26. P. 12128-12133.

159. Neidhardt F.C., Ingraham J.L., SchaechterM: Physiology of the bacterial'cell: a molecular approach. // Sinauer Associates Inc. Mass., 1990. 506 pp.

160. New England Biolabs. Catalog and>Technical Reference 2002-03.

161. OchmanH., Lawrence J.G., GroismanE.A. Lateral gene transfer and-the nature of bacterial innovation //Nature. 2000. 405. P. 299-304.

162. OhkumaM., Kudo T. Phylogenetic diversity of the intestinal bacterial- community in the termite Reticulitermes speratus // Appl. Environ. Microbiol. 1996. 62. P. 461

163. On the mechanism of DNA adenine methylase / A.L. Pogolotti et al. // J. Biol. Chem. 1988. 263. 16. P. 7461-7464.

164. On the substrate specificity of DNA methyltransferases / A. Jeltsch et al. // J. Biol. Chem. 1999. 274. 28. P. 19538-19544.

165. Organization of multispecific DNA methyltransferases encoded by temperate Bacillus subtilis phages / B. Behrens et al. // EMBO J. 1987. 6. 4. P. 1137-1142.

166. Origin 7. Цитировано 11 апреля 2011. Доступно с сайта: http://www.microcal.com/products/software-accessories/origin.asp

167. Palmer B.R., Marinus M.G. The dam and dem strains of Escherichia coli—a review //Gene. 1994. 143. l.P. 1-12.

168. Phage T4 DNA N6-adenine. methyltransferase: kinetic studies using oligonucleotides containing native or modified recognition sites / V.V. Zinoviev [et al.] //Biol. Chem. 1998. 379. 4-5. P. 481-488.

169. Piekarowicz A. Preferential cleavage by restriction endonuclease Hinffll // Acta Biochim. Pol. 1984. 31. 4. P. 453-464.

170. Pingoud A., Jeltsh A. Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. 2001. 29. P. 3705-3727.

171. Posfai G., Szybalski W. A simple method for locating methylated bases in DNA, as applied to detect asymmetric methylation by M.FoklA II Gene. 1988. 69. (1). P. 147-151.

172. Posfai J., Bhagwat A.S., Roberts R.J. Sequence motifs specific for cytosine methyltransferases // Gene. 1988. 74. P. 261-265.

173. Pradhan S., Roberts R.J. Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain // EMBO J. 2000. 19. 9. P. 2103-2114.

174. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases / J. Posfai et al. // Nucleic Acids Res. 1989. 17. 7. P. 2421-2435.

175. Price C., Bickle T.A. A possible role for DNA restriction in bacterial evolution // Microbiol. Sci. 1986. 3. P. 296-299.

176. Purification and properties of the Eco511 restriction endonuclease and methylase— Prototypes of a new class (type IV) / A. Janulaitis et al. // Nucleic Acids Res. 1992. 20. P. 6043-6049.

177. RadlinskaM., Bujnicki J.M. Cloning of enterohemorrhagic Escherichia coli phage VT-2 dam methyltransferase // Acta Microbiol. Pol. 2001. 50. 2. P. 161-167.

178. Raleigh E.A., Brooks J.E. Restriction modification systems: where they are and what they do // Bacterial Genomes / F.J. De Bruijn, J.R. Lupski, G.M. Weinstock (eds). New York: Chapman and Hall, 1998. P. 78-92.

179. Rao D.N., Saha S., Krishnamurthy V.s ATP-dependent restriction enzymes // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2000. 64. P. 1-63.

180. Recombination of constant and variable modules alters DNA sequence recognition by type IC restriction-modification enzymes / M. Gubler et al. // EMBO J. 1992. 11. l.P. 233-240.

181. Reddy Y.V., Rao D.N. Binding of Eco?\5l DNA methyltransferase to DNA reveals a large structural distortion within the recognition sequence // J. Mol. Biol. 2000. 298. 4. P. 597-610.

182. Reich N.O., Danzitz M J J. Non-additivity of sequence-specific enzyme-DNA interactions in the EcoRl DNA methyltransferase // Nucleic Acids Res. 1991. 19. 23. P. 6587-6594.

183. Renbaum P., RazinA. Interaction of M.^fasl and M.Hhal with single-base mismatched oligodeoxynucleotide duplexes// Gene. 1995. 157. 1-2. P. 177-179.

184. RinaM., Bouriotis V. Cloning, purification and characterization of the BseCl DNAmethyltransferase from Bacillus stearothermophilus // Gene. 1993. 133. 1. P- 9194.

185. Roberts R.J. On base flipping // Cell. 1995. 82. 1. P. 9-12.

186. Roberts R.J., Cheng X. Base flipping // Annu. Rev. Biochem. 1998. 67. P. 181-198.

187. Rodriguez-Zaragoza S. Ecology of free-living amoebae // Crit. Rev. .ylicrobiol. 1994. 20. P. 225-241.

188. Role and mechanism of action of C. Pvull, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems / R.Kl. Vijesurier et al. // J. Bacteriol. 2000. 182. 2. p. 477-487.

189. Roth M., JeltschA. Changing the target base specificity of the ЕсоЯУ DNA methyltransferase by rational de novo protein-design // Nucleic Acids F-eS* 2001. 29. 15. P. 3137-3144.

190. Ruby E.G., McFall-Ngai M.J. Oxygen-utilizing reactions and symbiotic colonization of the squid light organ by Vibrio fischeri // Trends Microbial- 1999. 7. P. 414-420.

191. Santi D.V., NormentA., Garrett C.E. Covalent bond formation between a DNA-cytosine methyltransferase and DNA containing 5-azacytosine // Proc. Na/Cl* Acad. Sci. USA. 1984. 81. 22. P. 6993-6997

192. Sequence motifs characteristic of DNA cytosine-N4. methylases: Similarlty to adenine and cytosine-C5 DNA-methylases / S. Klimasauskas [et al.] //

193. Acids Res. 1989. 17. P. 9823-9832.

194. Shaping the genome restriction-modification systems as mobile genetic elements /1. Kobayashi et al. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. 9. P. 649-656.

195. Shishido K., Berg P. Restriction endonucleases from Haemophilus g^ll^narum (Hgal) cleaves polyoma DNA at four locations // J. Virol. 1976. 18. P. 793-^798'

196. SibEnzyme. Цитировано 15.06.2011. Доступно с сайта: www.sibenzyrx^e.com

197. Smith D.W., Crowder S.W., Reich N.O: In vivo specificity of Eco&^l E>NA methyltransferase // Nucleic Acids Res. 1992. 20. 22. P. 6091-6096.

198. Smith C.L., Klco S.R., Cantor C.R. Pulsed Field Gel Electrophoresis and the Technology of Large DNA Molecules // Genome Analysis: A Practical Approach / K. Davies (ed). New York: IRL Press Oxford, 1988. P. 41-72.

199. Smith H.O., Nathans-D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes // J. Mol. Biol. 1973. 81. P. 419-423.

200. Specificity of DNA binding and methylation by the M.Fokl DNA methyltransferase / T. Friedrich et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. 1480. 1-2. P. 145-159.

201. Spoerel N., Herrlich P., Bickle T.A. A novel bacteriophage defence mechanism: the anti-restriction protein//Nature. 1979. 278. P. 30-34.

202. Stereochemical studies of the C-methylation of deoxycytidine catalyzed by Hhal methylase and the N-methylation of deoxyadenosine catalyzed by EcoRl methylase /D.K. Ho et al. //Arch. Biochem. Biophys. 1991. 284. 2. P. 264-269.

203. Structure and substrate recognition of the Escherichia coli DNA adeninr methyltransferase / J.R. Horton et al. // J. Mol. Biol. 2006. 358. P. 559-570.

204. Structure of Fokl has implications for DNA cleavage / D.A. Wah et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. P. 10564-10569.

205. Structure of Pvull DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment / W. Gong et al. // Nucleic Acids Res. 1997. 25. 14. P. 2702-2715.

206. Structure of Rsrl methyltransferase, a member of the N6-adenine beta class of DNA methyltransferases / R.D. Scavetta et al. // Nucleic Acids Res. 2000. 28. 20. P. 3950-3961.

207. Structure of the Bacillus sphaericus R modification methylase gene / G. Posfai et al. //Mol. Biol. 1983. 170. P.597-610.

208. Structure of the-DNA repair enzyme endonuclease IV and its DNA complex: double-nucleotide flipping at abasic sites and three-metal-ion catalysis / D.J. Hosfield et al. // Cell. 1999. 98. 3. P. 397-408.

209. Structure of the N6-adenine DNA methyltransferase M.TaqI in complex with DNAand a cofactor analog / K. Goedecke et al. // Nat. Struct. Biol. 2001. 8. P. 121125.

210. Sugisaki H., Kanasawa S. New restriction endonucleases from Flavobacterium okeanokoites (Fokl) and Micrococcus luteus (Mlul) // Gene. 1981. 16. P. 73-78.

211. Sugisaki H., Kita K., Takanami M. The Fokl restriction-modification system. II. Presence of two domains, in Fokl methylase responsible for modification of different DNA strands // J. Biol. Chem. 1989. 264. P. 5757-5761.

212. Surby M.A., Reich N.O. Contribution of facilitated diffusion and processive catalysis to enzyme efficiency: implications for the iscoRI restriction-modification system // Biochemistry. 1996. 35. 7. P. 2201-2208.

213. Szczelkun M.D., Connolly B.A. Sequence-specific binding of DNA by the EcoRN restriction and modification enzymes with nucleic acid and cofactor analogues // Biochemistry. 1995. 34. 34. P. 10724-10733.V

214. Szegedi S.S., Gumport R.I. DNA binding properties in vivo and target recognition domain sequence alignment analyses of wild-type and mutant Rsrl N6-adenine. DNA methyltransferases //Nucleic Acids Res. 2000. 28. 20. P. 3972-3981.

215. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. A family of regulatory genes associated with type II restriction- modification systems // J. Bacteriol. 1991. 173. 4. P. 1367-1375.

216. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S. Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease Glal// BMC Mol. Biol. 2008. 9. P. 7.

217. The Bacillus subtilis regulator SinR inhibits spoIIG promoter transcription in vitro / M.A. Cervin et al. //Nucleic Acids Res. 1998. 26. P. 3806-3812.

218. The CfrlOI restriction'enzyme is functional as a tetramer / V. Siksnys et al. //J. Mol. Biol. 1999. 291. P. 1105-1118.

219. The crystal structure of HaeIII methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing / K.M. Reinisch et al. // Cell. 1995.82. l.P. 143-153.

220. The DNA (cytosine-5) methyltransferases / S. Kumar et al. // Nucleic Acids Res.1994. 22. l.P. 1-10.

221. The Flavobacterium okeanokoites adenine-N6-specific DNA-methyltransferase M.Fokl is a tandem enzyme of two independent domains with very different kinetic properties / O. Leismann et al. // Eur. J. Biochem. 1998. 251. 3. P. 899-906.

222. The Fokl methyltransferase from Flavobacterium okeanokoites. Purification and characterization of the enzyme and its truncated derivatives / T. Kaczorowski et al. //Mol. Biotechnol. 1999. 13. 1. P. 1-15.

223. The length of a tetranucleotide repeat tract in Haemophilus influenzae determines the phase variation rate of a gene with homology to type III DNA methyltransferases / X. De Bolle et al. // Mol. Microbiol. 2000. 35. P. 211-222.

224. The M.AluI DNA-('cytosine C5)-methyltransferase has an unusually large, partially dispensable, variable region / B. Zhang et al. // Nucleic Acids Res. 1993. 21. P. 905-911.

225. The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhal methyltransferase / G. Vilkaitis et al. II J. Biol. Chem. 2001. 276. 24. P. 20924-20934.

226. The methylation of DNA as the biochemical basis of host controlled modification of DNA in bacteria / H.W. Boyer et al. // FEES Symposium (1974). Budapest, Hungary. 1975. 34. P. 23-37.

227. The Pfam protein families database / A. Bateman et al. // Nucleic Acids Res. 2002. 30. P. 276-280.

228. The pMTLnic" cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing / S.P. Chambers et al. // Gene. 1998. 68. P. 139-149.

229. The Restriction Enzyme Database. Цитировано 11 апреля 2011. Доступно с сайта: http://rebase.neb.com

230. The significance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genomes / D.H. Kruger et al. // FEMS Microbiol. Rev. 1995.17. P. 177-184.

231. The specificity and catalytic properties of Alul methylase / H. Yoon et al. // Korean Biochem. 2002. 18. 1985. P. 88-93.

232. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting; position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. 22. P. 4673-4680.

233. Three-dimensional structure of the adenine-specific DNA methyltransferase Wl.Taql in complex with the cofactor S- adenosylmethionine / J. Labahn et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. 23. P. 10957-10961.

234. Timinskas A., Butkus V., Janulaitis A. Sequence motifs characteristic for DNA cytosine-N4. and DNA [adenine-N6] methyltransferases. Classification of all DNA methyltransferases // Gene. 1995. 157. 1-2. P. 3-11

235. Transition from nonspecific to specific DNA interactions along the substrate-recognition pathway of dam methyltransferase / J.R. Horton et al. // Cell. 2005. 121. P. 349-361.

236. Trautner T.A., Balganesh T.S., PawlekB. Chimeric multispecific DNA methyltransferases with novel combinations of target recognition // Nucleic Acids Res. 1988. 16. P. 6649-6658.

237. Type III DNA restriction and modification systems EcoPl and £c<9P15. Nucleotide sequence of the Eco?\ operon, the Eco?\5 mod gene and some Eco?\ mod mutants / M. Humbelin et al. // J. Mol.-Biol. 1988. 200. 1. P. 23-29.

238. Universal catalytic domain structure of Ado-Met-dependent methyltransferases /

239. G. Schluckebier et al. // J .Mol. Biol. 1995. 247. P. 16-20.

240. Van Etten J.L., Meints R.H. Giant viruses infecting algae // Annu. Re v. Microbiol. 1999. 53. P. 447-494.

241. Varga G.A., KolverE.S. Microbial and animal limitations to fiber digestion and utilization // J. Nutr. 1997. 127. P. 819S-823S.

242. Verdine G.L. The flip side of DNA methylation // Cell. 1994. 76. 2. P- 197-200.

243. Walter J., Trautner T.A., Noyer-Weidner M. High plasticity of multispecific DNA methyltransferases in the region carrying DNA target recognizing Qn2^ytnC modules I IEMBO J. 1992. 11. P. 4445-4450.

244. Weraegreen J.J. Decoupling of genome size and sequencedivergence m asymbiotic bacterium // J. Bacteriol. 2000. 182. P. 3867-3869.

245. Whitehead P.R., Brown N.L. A simple and rapid method for screening bacteria ortype II restriction endonucleases: enzymes in Aphanothece halophy^^ca ^ Microbiol. 1985. 141. (1). P. 70-74.

246. Whitman W.B., Coleman D.C., Wiebe W.J. Prokaryotes: The unseed majority H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. P. 6578-6583.

247. Wilson G.G. Organization of restriction-modification systems // Nuclei0 1991. 19. 10. P. 2539-2566.

248. Wolcke J. University Dortmund, Germany. 1998.

249. Wommack K.E., Colwell R.R. Virioplankton: Viruses in aquatic ecosystems // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. 64. P. 69-114.

250. Woodbury C.P., Jr., Downey R.L., von Hippel P.H. DNA site recognition and overmethylation by the £coRI methylase // J. Biol. Chem. 1980. 255. 23. P. 1152611533.

251. Woodbury C.P., Jr., Hagenbuchle O., von Hippel P.H. DNA site recognition and reduced specificity of the EcoBl endonuclease // J. Biol. Chem. 1980. 255. 23. P. 11534-11548.

252. Wu J.C., Santi D.V. Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase // J. Biol. Chem. 1987. 262. 10. P. 4778-4786.

253. Xu S.-Y., Maunus R., Benner J. A method for cloning and expression of BseRI restriction endonuclease and BseRI methylase in E. coli II US 6593122. US Patent Office 2003.

254. Xu Y., Lunnen K.D., Kong H. Engineering a nicking endonuclease N./i/wI by domain swapping // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. 98. P. 12990-12995.

255. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. 1985. 33. P. 103-119.

Информация о работе

Нетесова, Нина Александровна
доктора биологических наук
Кольцово, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы