Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5"
На правах рукописи
Голикова Лариса Николаевна
( i-
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ BstFSI ИЗ Bacillus stearothermophilus F5
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
I
Кольцово - 2003
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной / биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии / «Вектор» МЗ РФ. '
Научные руководители: доктор биологических наук Дегтярев С.Х.
кандидат биологических наук Нетесова H.A.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Загребельный С.Н.
кандидат химических наук, старший научный сотрудник Зиновьев В.В.
I
Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И. ( 1
Вавилова РАН '<
I
Защита состоится 8 августа 2003 года в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: 630559, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Кольцове.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.
Автореферат разослан «_[_£_» 2003 г.
Учёный секретарь диссертационного совета
Малыгин Э.Г.
u
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальйость темы. Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт-специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метил азами) является одной из наиболее интересных проблем молекулярной биологии. За последнее время установлена важная роль этой модификации для регуляции экспрессии генов, процессов репликации и репараций в прокариотических И эукариотиоческих организмах, однако детальный механизм участия ДНК-метилаз в этих процессах мало изучен. Последние работы по определению Первичной структуры ДНК геномов ряда микроорганизмов выявили наличие в некоторых бактериальных клетках целого набора генов ДНК-метилтрансфераз, что поднимает новые вопросы о функциональной роли каждой такой метилазы в отдельности и всего их каскада в целом.
Таким образом, детальное изучение свойств ДНК-метилтрансф'ераз, входящих в состав систем рестрикции-модификации (РМ систем) со множеством метилаз, является одной из актуальных задач. Кроме того, всестороннее исследование процессов метилирования ДНК и ролй ДНК-метилтрансфераз в бактериальной клетке способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификации в частности, и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление структуры оперона системы рестрикции-модификации BstF5l из термофильного микроорганизма Bacillus stearothermaphxlus F5 й сравнительное исследование свойств выявленных ДНК-метилтрансфераз. Й задачи настоящего исследования входило:
- Определение структуры оперона уникальной системы рестрикции-модификации ÄS/F5I и установление полной нуклеотидной последовательности генов ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеазы рестрикции, входящих в эту систему.
- Экспрессия Генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации ßsfF5I в клетках E.coli.
- Установление субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации ÄsfF5I.
- Определение оптимальных условий функционирования ДНК-метилтрансфер&з системы рестрикции-модификации ÄsfF5I.
- Сравнительное изучение кинетических свойств новых, ферментов -ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации ÄrtF5I.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе определена полная структура оперона новой системы рестрикции-модификации BstFSl. Данная РМ система является уникальной и отличается от ранее известных тем, что содержит пять функционально активных генов: четыре гена ДНК-метилтрансфераз и ген эндонуклгазы .ррг,трйуции, .тогда.жак
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петер! ОЭ 300,
в литературе не описаны РМ системы, включающие более двух генов ДНК-метнлтрансфераз. Все гены системы рестрикции-модификации Bst¥5\ клонированы в термоиндуцибельный вектор и показан синтез и функциональная активность соответствующих белков в клетках E.coli. Впервые показано наличие двух пар ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью в одной бактериальной клетке. Ферменты M.ÄJ/F5I-1 и M.ÄI/F5I-3 модифицируют аденин в сайте 5'-GGATG-3', а M.ÄS/F5I-2 и M.ÄyfF5I-4 модифицируют аденин в сайте 5-САТСС-З'. Определены кинетические параметры реакций, катализируемых новыми ДНК-метилтрансферазами на различных ДНК-субстратах.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 4 опубликованные статьи и были представлены на международной конференции "FASEB Summer Research Conference" (США, Вермонт 1999 и 2001).
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (посвящённого ДНК-метилтрансферазам бактериальных систем рестрикции-модификации), экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (269 ссылок), содержит 27 рисунков и 13 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материалы и методы
Влияние различных температур, pH , концентраций ионов К+ и Na* на активность ДНК-метилтрансфераз, а также субстратную специфичность и кинетические параметры определяли в реакциях метилирования ДНК-субстратов по количеству включенных [3Н-СН3]-групп. Реакционный буфер содержал: 100 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДГТ, 0.2 мг/мл бычьего , сывороточного альбумина и 5% глицерина. Исцользовапи стандартную методику регистрации переноса метилтрансферазой на ДНК-субстрат от S-аденозил-Ь-метионина радиоактивно меченой СНз-группы. Объём реакционной смеси, концентрации субстратов и фермента, время варьировали в зависимости от условий эксперимента. При расчете концентраций использовали концентрации участков метилирования 5'-GGATG-3'/5'-CATCC-3\ получаемые умножением молярной концентрации ДНК фага X на число потенциальных участков модификации (150 сайтов узнавания на молекулу ДНК фага А,).
2. Определение полной иуклеотидиой последовательности оперона
РМ системы ÄS/F5I
Ранее были получены геномные библиотеки, содержащие встроенные в плазмидные вектора гены двух ДНК-метилтрансфераз РМ системы ÄT/F5I: fcfF5IM-l (pF5-l) и &sfF5IM-2 (pF5-21) (рис. 1.).
Клонирование гена bstF5I-3. Ген третьей ДНК-метилтрансферазы был клонирован при получении геномной библиотеки хромосомной ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой рестрикции BstX21 в линеаризованную плазмиду pMTL22 по сайту рестрикции ВатШ. Из библиотеки были отобраны рекомбинантные плазмиды, содержащие идентичные вставки и устойчивые к действию эндонуклеазы рестрикции BstF5l (целевая плазмида -pF5-32). Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента, несущего ген iwiF5IM-3, перекрывается с ранее известной областью бактериальной хромосомы B.stearothermophilus F5 на 821 п.о. (рис. 1.).
Клонирование гена bstFSIM-4. При анализе первичной структуры плазмиды, pF5-32 помимо ОРТ, несущей ген èsiF5IM-3, была обнаружена неполная рамка трансляции ОРТ-4 (670 п.о.), содержащая метилазные консервативные мотивы. Полную нуклеотидную последовательность четвертой рамки определили с помощью метода селективной супрессии полимеразной цепной реакции (СС ПЦР).
Для этого геномную ДНК B.stearothermophilus F5 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRV и Sspl. Полученные/ фрагменты лигировали со специфическим супрессионным адаптером:
5'-GCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'
3'-CGCCTCCCGCCA-5' После достройки 5'-выступающих концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli молекулы ДНК симметрично фланкированы последовательностью супрессионного адаптора. Полученные таким образом фрагменты геномной ДНК использовали в реакциях СС ПЦР в качестве матриц. Амплификации проводили с адапторным праймером (PI): 5-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3', который соответствует внешней части супрессионного адаптора и 5'-GAGCATAACCTCCACGAACT-3', генспецифическим праймером, сконструированным на основе уже известной последовательности гена ¿S/F5IM-3 (олигонуклеотид, идентичный 3'-концевой области кодирующей цепи ДНК гена ¿W/F5IM-3). Далее проводили второй раунд СС ПЦР с использованием: адапторного прайм¿ра (PII): 5-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3и праймера, идентично:« известной последовательности 5'-концевой области кодирующей 'цепи ДНК ОРТ-4: 5'-СATTTCTTGACGCTTATCCTGA-3 '. В результате были получены два ПЦР-фрагмента длиной 1700 п.о. с гидролизата EcoRV и его более короткий вариант 1200 п.о. с гидролизата Sspl, что подтвердилось рестрикционным анализом. Сопоставлением нуклеотидной последовательности секвенированной ранее области (pF5-32) длиной 670 п.о. и секвенированного ПЦР-фрагмента (1700 п.о.) выявили полную ОРТ-4 длиной 1143 п.о.
В результате клонирования ОРТ-4 получили целевую плазмиду pMTLM4-2, устойчивую к воздействию эндонуклеазы рестрикции fisfFSI (рис. 1.). Таким образом, гены ДНК-метилтрансфераз èsiF5IM-3 и &S/F5IM-4, клонированные по отдельности, обеспечивают защиту плазмидной ДНК от гидролиза эндонуклеазой рестрикции &/F5I, и следовательно, являются
Клонирдаание гена
Геномная библиотека по
рестриктазе А1и1
¿¿ЛЗДМ-! г>кГ5!М-2
Т ТТ Г
Кяр22\ АШ &Р221 Л1и1
БтаУАЫ
ЬяР51М-2
Клонирование гена й*Д?51М-3
Геномная библиотека Вз1Г51 по рестриктазе Вз1Х21
4.«Р51М-1
4$(Р51М-2
МР51М-3
&р221
ТТ т т
АМ ЙР221 ЙИХ21 А1и\
т
А«Х 21
ВатНУВиХ2\
8отН|/ЛмХ21
АкГ51М-3
Клонирование гена йж/Г51М-4
СС ПЦР с фрагментов геномной ДНК В$1Г51 по рестриктазе ЕсоЯУ
СС ПЦР-1700 п
©
ЯгЛ1/&(Х21
5/ш 1
¿и(Р51М-4
ДхФ51М-1 ЫР51М-2 А5/Р51М-3 АйР51М-4
-' £ ■ ЕХ <
Т Т Т Т ТТ т
&Р221 А1и\ К*Р221 ЯйХ21 ЕсоИЧ АЫ ВиХ21
Т
гсояу
Клонирование гена ¿.^Ш
СС /ЩР с фрагментов геномной ДНК В$1Р51 по рестриктазам &/>/ и ВзиШ
СС ПЦР-800 п.о. СС ПЦР-1000 п о.
¿«Р51М-1
т
&р221
4йР51М-2 4кР51М-3 ¿5Л?51М-4
Т Т Т ТТ т
АШI К5Рт &1Х21 ЕсоЯЧАЫ Я«Х21
4.«Р5И*
т т т т т
£саЯ\Г ДшМ ЯгаМ
Рис. 1. Схема клонирования генов оперона РМ системы Вэ{Р51.
функционально активными и продуцируют ферменты, обладающие ДНК-метилтрансферазной активностью.
Клонирование гена bstFSIR. При анализе нуклеотидной
последовательности ДНК, лежащей за геном ¿wiF5IM-4, обнаружен фрагмент пятой рамки трансляции. Было сделано предположение, что ОРТ-5 может кодировать ген эндонуклеазы рестрикции,
входящий в РМ систему Bs/F5I. Полную нуклеотидную последовательность пятой рамки определили в два этапа методом С С ПЦР с использованием праймеров (PI), (PII) и супрессионного адаптера. В результате были получены ПЦР-фрагменты длиной 1000 и 800 п.о. Сопоставлением ранее известной нуклеотидной последовательности и двух СС ПЦР-фрагментов выявили полную ОРТ-5 длиной 1398 п.о. (рис. 1.). ОРТ-5 была получена методом ПЦР и клонирована в экспрессирующий вектор pJW2 по сайтам рестрикции ВатШ. и FawNDI под термоиндуцибельный промотор фага X. Для трансформации использовали компетентные клетки E.coli RRI, несущие плазмиду pACYC-184 с клонироваными генами ДНК-метилтрансфераз &sfF5I-2 ч 5s/F5I-3 для предотвращения ауторестрикции клеточной ДНК.
Проведенный скрининг бактериальных колоний на наличие эндо-нуклеазной активности выявил 5 клонов из 200, несущих активный ген эндонуклеазы рестрикции BstF5I. На рисунке 2 приведены данные по анализу эндонуклеазной активности одного из клонов на субстратных ДНК. Таким образом, структура оперона РМ системы 5s/F5I, включает четыре гена ДНК метилтрансфераз и ген эндонуклеазы рестрикции.
Расположение генов в опероне РМ системы BstFSI на секвенирова-нном участке бактериальной хромосомы. Для подтверждения правильности объединения секвенированных последовательностей проводили контрольные ПЦР. В результате были получены ПЦР-фрагменты длиной 1950 и 3600 п.о., практически совпадающие с расчетными.
Проведенный рестрикционный анализ полученных фрагментов подтвердил правильность объединения нуклеотидных последовательностей генов, клонированных в плазмидах pF5-l, pF5-21, pF5-32 и амплифициро ванных СС ПЦР-фрагментов, которые имеют довольно
Рис. 2. Электрофореграмма тестирования активности эндонуклеазы рестрикции вв(Р51 на ДНК-субстратах из клеточных лизатов (клон № 7). 1 - ДНК фага А, 2-5 -продукты гидролиза ДНК фага А, 6 -маркер длин фрагментов (от 250 до 1000 л о., 7 - плазмидная ДНК риС-19, 8-11 -продукты гидролиза плазмидной ДН риС-19. Разведение клеточных лизатов в реакционной смеси: 2, 8 - 1/4; 3, 9 - 1/20; 4, 10 - 1/40. 5, 11 - продукты гидролиза ДНК-субстратов коммерческим препа ратом эндонуклеазы рестрикции В«(Р51.
протяженные участки перекрывания между собой. В результате была получена часть геномной хромосомы В. зХеагоХкегторкИт Р5 длиной 7450 п.о., несущая оперон РМ системы Р51, где гены ДНК-метилтрансфераз расположены друг за другом в одной ориентации, а ген эндонуклеазы рестрикции в противоположной (рис. 1.).
3. Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз РМ системы в
клетках Е.соИ
Гены ДНК-метилтрансфераз были получены методом ПЦР (табл. 1) и клонированы в экспрессирующий вектор под термоиндуцибельный
промотор фага X.
Таблица 1. Структура амплификационных праймеров для клонирования генов метилаз в экспрессирующую конструкцию.
Ген метилазы Структура праймеров*
¿W/F5IM-1 5 '-GGCC AT ATGTC ATTT ATTGTCGAATTT АТС А-3' 5 '-CCCGGATCCTCGGC AAAGACCGAT-3'
¿w?F5IM-2 5'-CGCCATATGCAAACAACAAAGGTAAAGTAT-3' 5'-CCCGGATCCTTTGCTGCCGATATATCTCAT-3'
¿wfF5IM-3 5 '-СССС AT ATG AG АТАТ ATCGGC AGC АА-3' 5 '-CCCGG ATCCTTCTTCTTC AATTAGA AA ATTT-3'
6siF5IM-4 5 '-CCCQATATG А А ATTTCTT AATG A AG A AG AGTT А A-3' 5 '-CCCGG ATCCGGTTAGCTTTTTAAGTTTTCTTT-3'
* Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции (FauNDI и ßamHI), жирным шрифтом выделен стартовый ATG-кодон генов ДНК-метилтрансфераз.
Было показано, что наряду с клеточными белками в случае ферментов M.ÄsfF5I-2, M.ÄsiF5I-3 и M.ßsfF5I-4 в E.coli синтезируются рекомбинантные белки ожидаемой молекулярной массы: 35 кДа (M.ÄJ/F5I-2), 41 кДа (M.ÄsfF5I-3) и 44 кДа (M.&7F5I-4). Однако в случае M.ßsfF5I-l на электрофореграмме наблюдали появление двух дополнительных полос, соответствующих белкам с молекулярными массами 30 и 26 кДа (рис. 3.). Ранее была определена нуклеотидная последовательность гена ÄJ/F5IM-1 (777 п.о.). Анализ нуклеотидной последовательности этого гена выявил, что в одной рамке трансляции находятся два ATG-кодона, расположенные на расстоянии 99 нуклеотидов друг от друга. Было сделано предположение, что оба белка являются вариантами, полученными в результате трансляции одного и того же РНК-транскрипта, но с двух разных стартовых кодонов.
Клонирование короткого варианта гена 6sfF5IM-l (678 п.о.) в экспрессирующую конструкцию, термоиндукция синтеза белка и электрофоретический анализ показали, что в этом случае в клетках E.coli синтезируется рекомбинантный белок с молекулярной массой 26 кДа (рис. 3.). Тестированием на наличие ферментативной активности определили, что
только белок 26 кДа обеспечивает защиту ДНК фага X от эндонуклеазы рестрикции В«ГР51.
4. Анализ первичных структур ДНК-метилтрансфераз
М S.!(F5I-1 (30 кДа)
M.&iF51-l (26 кДа)
маркер Ма)
Рис. 3. Электрофорефамма термоиндукции синтеза ДНК-метилтрансфераз, - до термоиндукции, + после термоиндукции.
ДНК-метилтрансфераза M.BstFSI-З. На прочитанном участке бактериальной хромосомы ген 6sfF5IM-3 занимает область 3072-4110 п.о. Анализ аминокислотной последовательности выявил наличие всех консервативных мотивов, характерных для ДНК-метилтрансфераз а-группы. Выравнивание аминокислотных последовательностей показало высокую степень сходства M.5sfF5I-3 с N-концевыми доменами ДНК-метилтрансфераз FokI (79,9% сходства и 57,2% идентичности) и StsI (77,5% сходства и 47,6% идентичности) (рис. 4.). Известно, что этот домен отвечает за модификацию аденинового основания в последовательности 5-GGATG-3'.
ДНК-метилтрансфераза M.BstFSI-4. Ген 6sfF5IM-4 на прочитанном участке бактериальной хромосомы занимает область 4118-5261 п.о. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности показал, что M.BiiF5I-4 содержит 6 из 9-ти консервативных метилазных мотивов и наиболее гомологична ферментам Р-группы адениновых ДНК-метилтрансфераз, однако обнаруживает иной порядок расположения участков, ответственных за катализ, связывание с SAM и узнавание специфического сайта ДНК (TRD - target recognition domain). В таком случае, согласно классификации Malone с соавт., M.fisiF5I-4 мы отнесли к ¿¡-группе ДНК-метилтрансфераз. На рисунке 5 приведено выравнивание полной
Мотив X
М.ВяСР51-3 селтв 1
М.ГоЫИ ввлте 1
ССАТС 1
М.5*дОКРС272Р-а (КАТС 1
М.ЗДо27844Р-а ОСАТв 1
М.гПаШ САТв 1
М.Нру166ГУ САТС 1
М.НруА! САТв 1
7 1
М. СгЩУII САТ(3 1
М.ВзО'51-3 ССАТС 57
М.ГоОД! СвАТв 58
м. зшн ССАТС 58
М. 5вдОЮ?С272Р-а ССАТС 34
М.£Ьо27844Р-а ввАТС 58
М.ШаШ САТС 61
И.Нру1661У САТв 61
М.НруА1 САТС 61
М.Х2а1 7 57
М. Сч*вУ11 САТ(3 62
м.в«еР51-з вОАТС 116
М.Го*1И ССАТС 113
М.81а1Н СвАТО 111
М. 3»<зСЖРС272Р-а ССАТС 84
М.5Ло27844Р-а ввАТС 109
н.шип САТС 106
М.Нру166Г/ САТв 105
Ы.Ирук! САТС 105
Н. 1.1*1 7 110
Н.СгНУЛИ САТС 104
М.ВавГ51-3 С6АТС 178
м. гоин СвАТв 175
М.ЗШН вйАТС 173
М.£а<э011РС272Р-а вСАТС 146
М.52ю27844Р-а вСАТв 171
и.шп САТС 168
И.Иру1661У САТС 167
М.НруА! САТС 167
М.£2а1 -з 172
САТЙ 164
Ногат II
. .МКУ1СЗСТЫ.ЬСК1ЫЕ71ЕЕН УОЫАЕЗРЦ>1ЕЗОТАЗУА. ИУПОЖУ. КУУЗШНЬУГ . .МЕ(Е153К1/Ы1.1,0Ы1С2ЕУ1ЕЕОТК0ПАШ/ПтЫ,ЗВТС1\ГС.ЕКПСКОТ.ОУЪЗИОЗЬУГ . .MRYIGSKKLLLPEIKKMVDKHTDGSEEVFLDLPAGTNWA.NYFKQFY.ТУУЗИОМЬГЕ
..........................мкетрцзьиюттлгз. ыеткоуу . туу$ш> итг
. .МКУХСЗКЗЬЬЬКЕЮЗЫЕКНКЬСОЕКГРЬгал'АвТЫ'ПГА.ЕУПСЗЮГ.ОУИНтЬТГ ММУ1СЗКУКЫРПКЕЫ1НАУАСНПЬЗСА1РСПЬРАвТС1УС.НАРКТЫУК0У1А1Н)МЕУУ ШУХСЗКУЮ,1РЕ1КЕН1НАтеЕ0Ы13ЕТ1РСПЬРдеТ01УВ.КАИ1КА7ЫКУ13га)ЬЕГУ ШYIGSKLKLSNWLETEISNVAGHSLSDKVFCDLFAGTGIVG.RKF1ЖAVNKVISHDLEYY . .^^RYLGNKTNLLNFIQQVIKKHDIQGQ ТРАВЬРЛСТСЗУС.ОУРТКЕТ.ТУЪЗОТ)УМТЕ
MNRIGYIGSKLKLKDWIFDEISKRTDETHTKFADLFЛSSCIMTHEALERNY.ECISNDLETY ** **** ** * ****** ** * * *** * *
Мотив III
8гуь0кат1ен. всуртговьккумуоргзуыто. . ерюзуугоешзиувыгзрыеыс
8Т1Ы.КАК1ЕН.Ы31РЫГЗЕЬКК1С1КЕРЦШ£НЕЕЕЕ13. . 31УЫАКАТ1ЕН.ЫЗКРЗГ5КЬ10Ав133РМТУЬ0ЫЬЕ. .УЫ. . nyvkakaiien.nsylsfnklkavgildpidyi.qrln. .й. . .
311ЫЗКАТ1УК.ЫКУРС!ГЗКЬКГВ____РЕЕУ1ЛгаЕ1Н1АР. .
SIVLNRNYIGHCQSILKAGELLQR.....LEQLP.......Р.
SFVLNQNYIGNIQEIPNQEELIDE.....ХЫЭУА.......L.
SFVLNQNYIGNIQEIPNQEELINE.....гавУА.......L.
ЗЮГСЗЕАКИМ. SEKPKFDSFVKRYGKTPFQWLNEREYTPN. .
syvilnglrcs. .рзои^сыез.....ьоаызту.......
** ***** * * * *****
. . . HEFFLTHNYSPYMGC • 0ЕТ1СУУЕУАУЗРТС.. . . . К1СУУТКЫТЗР1,С. .
...РЕО11У0НТ(ХСЗСЗ ...kkgfiyshyslg.cs
.. .kkgfiysyyslg.cs .. .осуеуунтгтре. .а
...ТЗСГУТМТУЗРРС.. ***
***** ****
** *** *** *** *** *
Мотив VII
М.ВаЬР51-3 ввктв 237
М.ГоНЫ свлтс 234
ОвАТв 232
М.5«чОВРС272Р-а ССАТС 205
М.5Ьо27844Р-а ССАТв 230
М.ШаХТ! САТС 227
И.Нру1661У САТС 226
М.фуМ САТв 226
М.ЫаХ 7 234
И.СкДОХХ САтё 221
Мотив VIII
Мотив IX
И.ВаеР51-3
Н.ГоМН
м.отля
М.З«чОКРС272Р-« М.5Ьа27844Р-в М.ШаШ И. Й*>у1б6гу Н.ЗруЫ
и.ыа к.мдп!
ввАТС 299 ТХЬЕП.СТУАУА03УКУУКУРУННУКСКЬ____SAKEHNLHELIFYAKKRKL
ССАТС 296 EIES1LKSHGLPETYRIYKMPYRKYKSKH____К0ЕАЗЕШЕУ1ГУ101ФтТ.....
ввАТС 291 0ЬТЫ11ЖЕРЗУ0С1У01КК1РУНКУаЗ!™____УЗКККЕ1УЕЬЬт01ШРГЗ.КМК. .
ССАТС 267 DLTLLLQRYSFNNQIDVKRIPYRKYQSKK____KSQNKDLYELLFYIQRKPINNRFKS.
вСАТБ 292 Е1ЬЫи.ККУ330ЫОТ01УТ1РТККУ03К1____РЗЗК1ЛШ1*1ПГ1ККЗШК......
САТС 287 QVREIFERFG. . .KYDLVQTEYRRFKADKTENRNHKANSTFEYLHILEKTF
САТв 286 ЕНОИЬККУС. . .АУЗШТКТУШГКАОЫ. . КВТНКААНТКЕСЬНУЫК
САТС 286 Е1СЫ1ЬККУС. . .TYSLMTKTYMRFKADN. . Ю<ТНКААЯТКЕ^Н^1К
? 295 ELVDLARBFAVDGIVEVETNEYREYSTNNS. ЗМКСЕСККЬОЕУНУРЮП^Е.......
САТв 280 ЕММви-ЗКИО. . . ЗСЕУЧХИОНКЛЕКАОЗ____№ЕОКОУЕЕУ1.ЕТ«ШВК
** * *** * * * * »**
Рис .4. Выравнивание аминокислотных последовательностей М.В5^51М-3 и ДНК-метил-трансфераэ а-фуппы. Серым цветом выделены консервативные мотивы, *- идентичные-аминркислотные остатки.
*
** **
М.В»№51-4
И.ВСЛ1А
М.ГУООВГ1413Р
САТСС 1 ССБСС ССвСО 1
МКГЬЫЕЕЕЪККУ1ЕКККЬЗОУ30Е1ЬЫ01.ЫЕУ1К0НЬШЛЬКЗУКЫКЕКЬАКЗЫЗЕКО31 -------------------------МОУЬОЮОААОМКУУЗЗКИТЬРиИМКЕНАКЕУОР
М.Вг№51-4
М.ВспХА
М. ГизОНГ1413Р
САТСС 61 рГЬВАУРОУЫЬЗОЪРЗИУКЕНгаЕАХУУСЗЗЮПЛГСдаПСККУНЬОНЗЬтЬЗСОЕгагГ
ССЭЕС 1 -------------------------ЮТОУЕМСТСР--------TKHINCMTGKEWMKS
ссгвс 36 -------------------------ЬКИЛЧКТСЗСК--------ЕтПДСЬТАКЕИИ®
М.ВСП1А М.ГтоОМ*1413Р
Иомв Ж
Мотка I
САТСС 121 ТСЗУЮТЯУРТОСКЕСУАННШЮ/НРЗРКРРОЬТКЕИЗГРТКЕКЕНУЬОУРМСТССТЬЬ
ССБСС 28 (ЛЛЗтеЯЕТУЕНКОХКО-----ККУНРАУУР131АККС1Е1.ГГН0СЕ1Л/10Р™336ТТ1,У
ссгсс 61 (ДОУЯЕГУУЕЮШгеО-----ЮТНРАТГРХЗЬАКОУХЕЪГгНЕСЕХЛ/УОРТОЗОТТЬУ
* * - ***• * *.•*:::.* *:* *:* * **:
М.ВеША М. ГтоОЙГШЗР
Мотив II
САТСС 181 САЗЬСМККА1С1В1ЛСтЕКУКЕААКАЬЫЬ0Ь0НТ10ОСА1Е11А1Ж031.13О11,1«ЗЕК
ССЭСБ 83 ААООЗЫКНА7СЕОЬКЕЕУ131.С(21ЯЬЕЕЛКИЫ^7ИТЫ(51А1КОЫАКН---1КНУ1КЕЫЗ
ССЭСВ 119 АА1ШЗН1ШАУ0Е01,0ЕКУ1К1,САЕК1,ЗТ0Н—1УСЫАМУА1ЕЕОА1Ш---13ИУЕТ)ЕЕЗ
* **.*:*:**: **. **: *.: *.. ::
Мотка IV
М.В»еЕ51-4
М.ВсЩА
М. ГуоОВР1413Р
САТСС 241 УБЬУЬЮРРУСОММЗКККТСЕАХКККООЗ---ЗАТРГГОЗРКОЫЛтЕААОЕУКНЮТЗУ
ССвОв 130 УЗЫЪТЗРРУАЫЬЬЫККККНКЗЯЕШКНЕОЕЬОХЕОУЗООРМОЬбУМЕЬОЕУТЕТХКМУ ССБЕй 164 13Ы1ГЗРРУАКЪ1ЫКЕВКМКЗКРЫККН№ЬСетЕОУЗООРКОЬСТЮУЕЗУТКЕМС01Г ■**■• *** ■•*.*::..:: :::::. . :::.*.*** ::
Мотив VI
Мотиа VII
М.ВзСР51-4
М.ВеША
М. Гто01!Р1413Р
САТСС 298 0^ЬКГЬКК68Нте1Г1К010РКСК0ЬЫЬЪНА0Ь1УЬ1ЫЕ1ВЕ1,УУ1.С--ТК™АСНЗ™
ССЭСС 191 СЗЪЬРЬЬКЗКбНСУУПУРОЕТвЯШЖШТЬН----^тШЛЕУвУЕЬЮТПИОКТОТУ
ССЗЙС 224 ЕОТКРА1ЛТКСНСТ1ИУРВМ»»КЕ1ЖК1А1Н----УУиЫЕМТЮЮУЕШШШШККШЛ/
*•. ** *: ; *: ..*:: : : :** : * **
М.ВаСЕ51-4
М.ВСП1А
М. ГУООВГ1413Р
САТСС 355 — ЬЕРУОУРЕЗУУЗИ-(31НОУ11ЛЕКККТ ССввС 247 ЫС1С1ЕСНРЗЫУ1ТМСТТГЕУЬЬНЕ1(КРЕ ССввв 270 Ы01МР1а1РЗЫУ1ТМетТЕЕУ1.Ы)™сР-
Рис. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз £ группы. Серым цветом выделены консервативные мотивы, *- идентичны аминокислотные остатки.
аминокислотной последовательности М.&/Р51-4 с двумя ДНК-метилазами С,-группы, описанными на сегодняшний момент в литературе. Уровень идентичности аминокислотных последовательностей М.Ду/Р51-4 с М.ВслГА составляет 30.6%, гомологии 47%, с М.7уо1413Р уровень идентичности -27.9%, гомологии - 49%. Следует отметить, что ТЬегтор1аята уокатит, также как и В. $1еашНегторМ\ш Б5 относится к термофильным микроорганизмам.
5. Изучение биохимических свойств ДНК-метилтрансфераз
Определение цепи, модифицируемой М.Вз1Р51-3. Ранее было показано, что М.В$/Р51-1 модифицирует адениновое основание в
последовательности 5'-СОАТО-3'. Определение цепи, модифицируемой М.В.у?Р51-3, проводили с использованием олигонуклеотидного дуплекса:
(19 Н.) 5СААССАТССАТАТСАССАв-1вТССАССТАОСССЮТА- 3' (16 н.)
(22 Н.) 3'-СТТССТАСОТАТАСТООТССАСТСТССАТСССССАТ-5' (13 н.)
который содержит сайт узнавания рестриктазы &7Р51 (подчеркнут) и сайт узнавания рестриктазы Вте 181 (выделен жирным шрифтом). После реакции метилирования дуплекс обрабатывали К.Вте\%\, указаны длины фрагментов, образующиеся после гидролиза, которые затем разделяли электрофорезом в денатурирующем 20% полиакриламидном геле. Из данных приведенных в таблице 2 видно, что метка включается только во фрагмент ДНК длиной 19 оснований. Таким образом, М.5$/Р51-3, согласно предположениям, модифицирует цепь ДНК, содержащую последовательность 5'-СЮАТО-3', и данный фермент является не только структурным, но и функциональным аналогом Ы-концевых доменов М.Рок! и М.ЗМ.
Таблица 2. Результаты включения в ДНК-субстрат [3Н-СНз]-группы в реакции метилирования, катализируемой М.Вв<Р51-3.
Длина фрагмента (количество нуклеотидов) 22 19 16 13
Количество включенной [3Н]-метки, имп./мин 210 2590 91 63
Определение цепи, модифицируемой M.BstFSI-2 и М.В$1Р51-4. Основываясь на высоком проценте гомологии аминокислотных последовательностей М.В5<Р51-2 с С-концевыми доменами М.Рок! (79.8%) и М.5»1 (80.7%), было сделано предположение, что метилаза Йу/Р51-2 метилирует адениновое основание в узнаваемой последовательности 5'-САТСС-3' так же, как М.РоИС и МЛЫС.
Для определения модифицируемой цепи метилазами М.&'/Р51-2 и М.5л/Р51-4 использовали комбинации олигонуклеотидов, содержащих модифицированное адениновое основание в сайте узнавания рестриктазы Ду/Р51 (сайт узнавания рестриктазы А?гР51 подчеркнут, М = Ы^метиладенин):
I 5'-СССССАОСЩДШССООАССО-3'
1ш 5'-СООССАОСОШШССССАОСО-3'
П 5 '-(ЗССОСТСССОСАТССОСТООССООС-З'
Пш
5 '-ОССОСТСССОСМТССОСТООССООС-З'
Таблица 3. Результаты включения в ДНК-субстрат [3Н-СНз]-группы в реакциях метилирования, катализируемых М.Вв^51-2 и М.Вз(Р51-4.
Количество включенной [3Н]-метки,
Комбинация олигонуклеотидов имп./мин
5^51-4
1 + И 44826 91706
1 + Нш 1824 1646
1ш + II 39913 95985
1т + Пт 1313 1734
фон 1204 1551
Таким образом, было показано, что М.В«гР51-2 действительно модифицирует цепь ДНК, содержащую последовательность 5'- САТСС -3', и данный фермент является не только структурным, но и функциональным аналогом С-концевых доменов М/чэМ и М.5М. Более того, в изучаемой РМ системе ферменты М.Д«Р51-2 и М.йу/Р51-4 обладают одинаковой субстратной специфичностью и являются функциональными аналогами, модифицирующими адениновое основание в последовательности 5-САТСС-З'.
Сравнение субстратной специфичности ДНК-метиптрансфераз. В
РМ системе 5$/Р51 выявлены две пары ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью: М.&?Р51-1 и М.5«/Р51-3, а также М.Аг/Р51-2 и М.Ду/Р51-4, которые модифицируют аденино-вые основания в последовательностях 5'-(ЮАТС-З' и 5'-САТСС-3', соответственно, в не-палиндромном сайте узнавания. Субстратная специфичность метил аз проверялась в реакции предельного метилирования ДНК фага лямбда (рис. 6.). Для трех метилтрансфераз: 5$/Р51-1, В^/Р51-2 и 5^51-4 плато кривых метилирования близко к 100%-ой модификации сайтов узнавания, что свидетельствует о высокой специфичности этих ферментов. В отличие от остальных метилаз для Ду/Р51-3
-МВ51Р51-1(100НМ) -МВз1Р51-2(100 ИМ) -МВ51Р51-3( 50 НМ)
- М В51Р51-3 (100 НМ) -МВ:1Р51-3(150нМ)
- М Вз1Р51-4 (100 КМ)
40 60 80 Время реакции, иин
Рис. 6. Предельное метилирование ДНК фага Л ДНК-метилтрансфераэами РМ системы Вя?Р51.
количество метилированных сайтов существенно возрастает с увеличением отношения фермент/субстрат. Можно предположить, что при определенных условиях фермент проявляет неспецифическую активность и метилирует неканонические сайты субстратной ДНК.
Зависимость активности ферментов от температуры, рН, концентрации ионов N0* и К*. Все метилазы проявляют наибольшую активность в температурном интервале 50-60°С, причем максимум активности для первой, второй и четвертой мети лаз приходится на 55°С, а для третьей - 60°С, что согласуется с термоф ильностью микроорганизма В. з1еагоЛегторЫ1ш Б5 (55°С) (рис. 7.А). Графики зависимости активности ферментов от величины рН для М.5^/Р51-1 и М.5^гР51-3 близки и имеют типичный характер, свойственный большинству ДНК-метилтрансферазам, оптимум действия которых обычно лежит в интервале рН 7.5-8.0. Зависимость активности для М.&/Р51-2 характеризуется более широким диапазоном рН 7.0-9.0, но оптимальное значение также лежит в выше приведенном интервале. М.5л/Р51-4 проявляет максимальную активность, в отличие от других метилаз, в более щелочных условиях и характеризуется острым пиком активности при значении рН 8.7 (рис. 7.Б).
Метилаза проявляет максимальную активность в диапазоне
концентраций от 0 до 50 мМ №С1 или КС1, причем с повышением концентрации Ыа+ и К+ активность фермента снижается медленно. М.&/Р51-3 и М.55/Р51-4 максимально активны в отсутствии как ионов Ыа+, так и ионов К+, и с увеличением концентрации солей их активность резко падает.
А Б
Рис. 7. Влияние температуры (А) и рН (Б) на активность ДНК-метилтрансфераз РМ системы ОДЯ51.
Метилаза ßsfF5I-2 проявляет максимальную активность в присутствии 50 мМ NaCl или KCl, причем с повышением концентрации ионов К+ активность фермента снижается более резко.
Основные биохимические характеристики ДНК-метилтрансфераз РМ системы BstFSl суммированы в таблице 4.
Таблица 4. Основные характеристики ДНК-метилтрансфераз РМ системы BslF5I.
Характеристика äs/F5-1 Bsm-i äs/F5-3 BstFS-4
Температура,°С 55 55 60 55
рН, оптимум 7.5 8.1 7.7 8.7
Количество а.к. остатков 226 294 346 381
Молекулярная масса, кБа 26.6 34.7 41.0 43.6
Классификация Р (Dil) a (D12) а (Dl2) С CP,,)
Сайт узнавания GGATG САТСС GGATG САТСС
[Ыа+], [К+], мМ 0-50 50 0 0
6. Кинетические характеристики ДНК-метилтрансфераз
Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на полимерной ДНК.
Графики зависимостей скоростей метилирования ДНК фага X от концентраций ДНК и SAM (рис. 8.) хорошо описываются уравнением Михаэлиса, из которых определены Кт днк, Кт sam. и коэффициенты специфичности (таблица 5.).
Полученные значения констант Михаэлиса по ДНК и SAM для метил аз 5i/F5I-l и 5j?F5I-3 имеют промежуточные значения, а для 5iiF5I-2 и £s/F5I-4 превышают Кт ДНк для ферментов, описанных в литературе. При этом сродство M.fisiF5I-4 к субстратной ДНК в 2, 12 и 30 раз ниже, чем у второй, первой и третьей метилаз, соответственно.
Полученные в данных экспериментах величины Кт sam вписываются в интервал значений, полученных для других адениновых метилаз. Наибольшая каталитическая константа на полимерной ДНК характерна для M.BifF5I-2. Вторая метилаза в 2.5 раза активнее, чем первая и четвертая, и в 23 раза активнее, чем третья. Самый высокий коэффициент специфичности по ДНК характерен для M.5sfF5I-l, а по SAM для M.5sfF5I-2.
I
I
А
04-
Ш
»с
>
02
M.SslFSM
M.SstFSI-3
—I—.—I—.—I—'—I—'—I—
0 10 20 30 40 50
[SAM], MKM
M.Ss(F5l-1
M.BsfF5l-3
[ДНК], мкМ
24-j 20 1 6
i x
I 12
Gf > 08
04
00
M.BS1F5I-2
10 20 30 40 50 [SAM], MKM
M.fls<F5l-2
16
1,2
ЕГ > 08
0400
M.Ss(F5l-4
1 2 3 4 5 [ДНК], мкМ
06-
Рис. 8. Концентрационные зависимости скоростей метилирования ДНК фага Л метилтрансферазами РМ системы SsfF5l. Скорости реакций нормированы на концентрацию ферментов в реакционной смеси. А - зависимости скоростей метилирования от концентрации SAM; концентрации сайтов метилирования составляли 1.2 мкМ и 8 мкМ (А). Б - зависимости скоростей метилирования от концентрации специфических сайтов; концентрация SAM составляла 10 мкМ.
Таблица 5. Кинетические параметры реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на ДНК фага А.
Параметр M.BsfF5I-l MJfrfF5I-2 M.As/F5I-3 M.BS/F5I-4
fccat, мин"' 0.98 ±0.04 2.56 ±0.39 0.11 ±0.01 0.99 ± 0.04
кт днк, мкМ 0.11 ±0.01 0.72 ± 0.24 0.043 ±0.013 1.29 ±0.11
km sam, мкм 1.47 + 0.09 0.67 ±0.26 1.38 ±0.24 0.94 ± 0.06
kcJKm лнк, мин'-мкМ"1 8.91 3.56 2.75 0.77
kcjkm sam, мин"1 мкМ' 0.67 3.82 0.08 1.05
Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах. Было исследовано взаимодействие ДНК-метилтрансфераз с синтетическими олигонуклеотидными дуплексами, содержащими участок узнавания ферментов 5'-GGATG-3'/5'-CATCC-3'. Полученные данные I позволили сопоставить каталитические константы ферментов, полученные на
' различных субстратах: полимерной ДНК и олигонуклеотидных дуплексах
(таблица 6.).
В реакциях метилирования олигонуклеотидного дуплекса во всех случаях наблюдается снижение каталитической константы в 2 - 5 раз. Коэффициент специфичности по ДНК для первой, второй и третьей метилаз снижается примерно в 6.5, 7.5 и 9.5 раз, соответственно, а для четвертой изменяется незначительно. Таким образом, M.BsfF5I-l, M.ñsíF5I-2 и M.BííF5J-3 предпочтительнее модифицируют полимерную ДНК, чем короткие ДНК-субстраты. Сродство к SAM в присутствии коротких субстратов для M.SsíF5I-4 уменьшается более чем в б раз. Кт sam для M.Bí?F5I-1 уменьшается в 2 раза, а для M.BsfF5I-2 и M.Bs/F5I-3 в этом случае изменяется незначительно.
Поскольку природными субстратами метилаз /и vivo обычно являются пострепликативные полуметилированные ДНК, было проведено сравнение кинетических параметров реакций для неметилированных и полуметилированных субстратов (таблица 6.). Кт дак для полуметилированного олигонуклеотидного дуплекса по сравнению с неметилированным у M.BífF5I-l и M.BííF5I-4 изменяется незначительно, у M.BsfF5I-3 сродство к субстрату увеличивается в 2 раза. А у M.Bs/F5I-2 снижается в 3 раза, причем без изменения каталитической константы.
Сравнивая коэффициенты специфичности ДНК-метилтрансфераз для различных субстратов, можно отметить, что для M.BííF5I-l и M.&ÍF5I-4
* предпочтительнее полуметилированный субстрат. M.Bj/F5I-2 лучше
• метилирует ^модифицированный субстрат, а для M.BsfF5I-3 нет выраженной предпочтительности к статусу метилирования ДНК.
i i
Таблица 6. Сравнение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах.
Параметр M.äs/F5I-1 M.ßsiF5I-2 M.äs/F5I-3 M.äs/F5I-4
Неметилированный олигонуклеотидный дуплекс*
кш, мин'1 0.33 ± 0.03 0.58 ±0.01 0.023±0.001 0.53 ±0.01
АГтднк, мкМ 0.23 ± 0.07 1.23 ±0.07 0.07 ±0.01 1.06 ±0.12
KmSAM, мкМ 0.68 ± 0.04 0.56 ± 0.07 2.49 ± 0.34 5.95 ± 0.37
kJKm дак мин'-мкМ"1 1.40 0.47 0.29 0.50
kat/kmsam мин'-МКМ"' 0.49 1.04 0.01 0.09
Полуметилированный олигонуклеотидный дуплекс*
kat, мин"' 0.51 ±0.02 0.59 ±0.03 0.012 ± 0.66 ±0.1
к,„ днк, мкМ 0.16 + 0.02 3.59 ±0.42 0.031 ± 0.60 ± 0.05
kcJKmднк мин'-мкМ" 3.17 0.16 0.38 1.1
*Для M.ßsfF5l-1 и M.ßsfF5l-3 использовали полуметилированный олигонуклеотидный дуплекс l/llm; для M.ßsfF5l-2 и M.ßsiF5l-4 - Im/Ii, как неметилированный олигонуклеотидный дуплекс - I/II.
Сравнение кинетических характеристик гомологичных ДНК-метилтрансфераз РМ систем BstFSI и Fokl. Как уже отмечалось, M.ÄjiF5I-2 и M.ßsiF5I-3 имеют высокую степень гомологии с С- и N-доменами метилазы Fokl. Было проведено сравнение кинетических свойств термофильных ферментов изучаемой РМ системы BstFSI как с функциональными доменами M.fMIC и M.FoAIN, так и с нативным белком M.Fokl из РМ системы мезофильного микроорганизма Flavobacterium okeanokoites (таблица 7).
M.ßiiF5I-2, по сравнению с M.FoklC и M.Fokl, имеет на порядок ниже сродство к ДНК. Однако, величина кш для M.ÄsiF5I-2 значительно выше. Сродство фермента M.AsiF5I-3 к ДНК в 20-40 раз превышает величины, полученные для домена M./o£IN и в 2-4 раза для нативного белка Fokl. Сравнивая коэффициенты специфичности ДНК-метилтрансфераз РМ системы 5.s/F5I и их аналогов из РМ системы Fokl, можно отметить, что, как M.äs/F5I-2, так и M.FoklC, предпочитают немодифицированный субстрат. А M..FofcIN, в отличие от BstF5I-3, проявляет выраженное предпочтение к полуметилированной ДНК. В целом метилазы РМ системы BstF5I практически во всех случаях эффективнее метилируют олигонуклеотидные дуплексы по сравнению с гомологичными ферментами РМ системы Fokl.
Избыточность генов ДНК-метилтрансфераз в РМ системе BstF5I поднимает вопрос о роли такого каскада метилтрансфераз в функционировании бактериальной клетки.
)
1
Таблица 7. Кинетические параметры реакций, катализируемых М.8в/Р51-2 М.Вв^-З в сравнении с М.йэМС, М.РоШ, М.ЯоМ на олигонуклеотидных дуплексах
Субстрат Фермент л'тднк, мкМ Ас„, мин"1 КЖ1 ЛГщднк мкМ"1 мин' 1
©ЗАТО ССТАС Рок! 0.16 0.027 0.17
Рок1С В5/Р51-2 0.23 1.23 0.024 0.58 0.11 0.47
Fo/fcIN В5/Р51-3 1.24 0.073 0.0007 0.023 0.0006 0.32
СС'АТС ССТАС Рок! 0.40 0.035 0.088
Рок\С 5^51-2 0.41 3.59 0.0065 0.59 0.016 0.16
ССАТв ССТШАС Рок! 0.13 0.12 0.96
мт 5^51-3 1.13 0.031 0.12 0.012 0.11 0.38
Ранее было сделано предположение, что РМ система В$гР51 эволюционно связана с РМ системами из других штаммов вида ВМеагоЛегторИИш. Высокий уровень гомологии метилаз В$/Р51-4 из ВМеаго^егторЫи Всп\К из В. сеп&о$рогш, принадлежащих к одной группе также может служить подтверждением этому факту. Вероятно, метилазы В5?Р51-1, 65^51-4 и эндонуклеаза рестрикции 5^51 существовали как самостоятельная РМ система, но в ходе эволюции произошел перенос генов двух ДНК-метилтрансфераз из ^&1-подобной РМ системы с перестановкой сайт-специфических доменов и образованием двух разных ферментов М.В^/Р51-2 и М.&?Р51-3. В пользу такого рекомбинационного события свидетельствует наличие спейсера с протяженным тандемным повтором между М.Вз7Р51-1 и М.В^/Р51-2 и высокий уровень гомологии С-домена М.^ой с М.В.#Р51-2 и Ы-домена М.Рок! с М.В^Р51-3.
Можно предположить, что перенесенные гены нашли свое применение в жизнедеятельности клетки. Как одну из причин сохранения в геноме перенесенных генов можно считать необычно высокую активность рестриктазы В$/Р51 в природном штамме-продуценте. Уровень активности Я.В5/Р51 в клетках В^еагогИегторЫШ Р5 приблизительно на два порядка превышает уровень активности К.Ро1Л в клетках Р1а\пЬа&епит океапококея (100000 и 1000 ед.акт./г биомассы, соответственно). Вероятно, как следствие, возникла необходимость в дополнительной защите бактериальной ДНК от гидролиза собственной эндонуклеазой рестрикции и эту функцию могут осуществлять перенесенные гены метилаз из /"оМ-подобной РМ системы -М.Я?/Р51-2 и М.В5/Р51-3. В первую очередь М.Вл/Р51-2, характеризующаяся
высокой каталитической константой и коэффициентом специфичности как к ДНК, так и к SAM, в широком диапазоне pH.
Несмотря на то, что все четыре метилазы способны модифицировать ДНК-субстраты, вероятно, только часть из них участвует в модификации бактериальной ДНК, другая же часть может выполнять регуляторные функции в опероне РМ системы.
ВЫВОДЫ
1. Определена полная нукпеотидная последовательность оперона системы рестрикции-модификации ÄsfF5I из термофильного микроорганизма Bacillus stearothermophilus F5, ферменты которой узнают последовательность ДНК 5'-GG ATG-3'/ 5 '-С АТСС-3'.
2. Впервые показано существование уникальной системы рестрикции-модификации, в состав оперона которой входят четыре гена ДНК-метилтрансфераз и ген эндонуклеазы рестрикции.
3. Показано, что система рестрикции-модификации ÄsiF5I включает две пары ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью: M.äs/F5I-1 и M.ÄJ/F5I-3, модифицирующие последовательность 5-GGATG-3'; и M.äs/F5I-2 и M.ÄsiF5I-4, модифицирующие последовательность 5-САТСС-3'.
4. Гены всех четырех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации äs/F5I клонированы в экспрессирующие конструкции на основе термоиндуцибельного вектора pJW2 и показан синтез соответствующих ДНК-метилтрансфераз в клетках E.coli.
5. Установлено, что ОРТ-1 для метилазы M.ÄsiF5I-l содержит два стартовых кодона, однако функционально активный белок синтезируется только со второго ATG-кодона.
6. Определены оптимальные условия функционирования всех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации ÄsiF5I: температура, величина pH, концентрации ионов Na+ и К+.
7. Проведено сравнительное изучение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами системы рестрикции-модификации äs/F5I. Для всех ферментов определены константы Михаэлиса - ^m Sam и Кт днк, каталитические константы ксЛ, константы специфичности для SAM и ДНК.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Голикова Л.Н., Нетесова H.A., Гуторов В.В., Белавин П.А., Абдурашитов
М.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Множественность сайт-специфических
ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации äs/F5I из Bacillus
stearothermophilus F5.// Молекуляр. биология. 2000, Т.34, № 3, С.443-447.
)
j
2. Нетесова H.A., Голикова JI.H., Овечкина Л.Г., Евдокимов A.A., Малыгин Э.Г., Гололобова Н.С., Гончар Д.А., Дегтярев СХ. Сравнительное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз Mi?sfF5I-l и Mi?siF5I-3 системы рестрикции-модификации Äs<F5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Молекуляр.биология. 2002. Т. 36. № 1.С. 136-143.
3. Голикова Л.Н., Гуторов В.В., Евдокимов A.A., Щелкунов С.Н., Гончар ДА., Охапкина С.С., Дегтярев СХ., Нетесова H.A. MÄsfF5I-4 - четвертая ДНК-метилтрансфераза системы рестрикции-модификации ÄS/F5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Биоорг. химия. 2002. Т. 28. № 1. С. 84-86.
4. Чернухин В.А., Голикова Л.Н., Гончар ДА., Абдурашитов М.А., Каширина Ю.Г., Нетесова H.A., Дегтярев СХ ДНК-метилтрансферазы M.äs/F5I-2 и M.äs/F5I-4 системы рестрикции-модификации ÄsfF5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 9.
1. Degtyarev S.Kh., Abdurashitov M.A., Golikova L.N., Netesova N.A., Gutorov V.V., Belavin P.A., Gonchar D.A. Multiplicity of genes for DNA-methyltransferases in ifcfFSI restriction-modification system. "FASEB Summer Research Conferences", Juli, 1999, Vermont, USA.
2. Degtyarev S.Kh., Golikova L.N., Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Gonchar D.A. Cascad of four genes for DNA-methyltransferases in Bst¥5l restriction-modification system. "FASEB Summer Research Conferences", Juli, 2001, Vermont, USA.
Тезисы материалов конференций
ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» Зак. ,41 т.80
s
(
1 8 83
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голикова, Лариса Николаевна
ОГЛАВЛЕНИЕ.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ДНК-МЕТИЛ Т РАН СФЕР АЗЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СИСТЕМ
РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).
2.1. РАСПРОСТРАНЕНИЕ СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ
И ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ В ПРИРОДЕ.
2.2. КЛАССИФИКАЦИЯ РМ СИСТЕМ.
2.2.1. РМ системы I типа.
2.2.2. РМ системы II типа.
2.2.3. РМ системы III типа.
2.2.4. РМ системы IV типа.
2.2.5. Одиночные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.
2.3. ФУНКЦИИ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РМ СИСТЕМ.
2.3.1. Обеспечение защитной функции. Рестрикция и антирестрикция.
2.3.2. Участие ДНК-метилтрансфераз в репарации и репликации.
2.3.3. Другие функции.
2.4. ОПЕРОНЫ РМ СИСТЕМ.
2.4.1. Расположение генов в оперонах РМ систем.
2.4.2. Регуляция активности ферментов РМ систем II типа С-белками.
2.5. КЛАССИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРА ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.
2.5.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз.
2.5.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз.
2.5.2.1. AdoMet-связывающий домен.
2.5.2.2. Каталитический домен.
2.5.2.3. TRD - домен.
2.6. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.
2.6.1. Модификация неканонических сайтов ДНК-метилтрансферазами.
2.6.2. Метилирование ДНК-метилтрансферазами одноцепочечных субстратов
2.6.3. Оптимальные условия функционирования ДНК-метилтрансфераз.
2.7. МЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИЙ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК.
2.7.1. Метилирование экзоциклических аминогрупп аденина и цитозина.
2.7.2. Метилирование эндоциклического С5 атома цитозина.
2.7.3. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. МАТЕРИАЛЫ.
3.2. МЕТОДЫ.
3.2.1. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК.
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.
3.2.3. Метод селективной супрессии полимеразной цепной реакции.
3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей.
3.2.5. Определение оптимальных условий метилирования ДНК-субстратов метилтрансферазами РМ системы &S/F5I.
3.2.6. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами.
3.2.7. Компьютерный анализ последовательностей ДНК и белков.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОПЕРОНА РМ СИСТЕМЫ Bst¥5l.
4.1.1. Клонирование гена &S7F5IM-3.
4.1.2. Определение четвертой открытой рамки трансляции.
4.1.3. Клонирование гена fo/F5IM-4.
4.1.4. Клонирование гена &sfF5IR.
4.1.5. Расположение генов в опероне РМ системы BstFSl на секвенированном участке бактериальной хромосомы.
4.2. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ РМ СИСТЕМЫ Bst¥5\ В КЛЕТКАХ E.coli.
4.3. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНЫХ СТРУКТУР ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.
4.3.1. ДНК-метилтрансфераза MJ?s/F5I-3.
4.3.2. ДНК-метилтрансфераза M.ifr/F5I-4.
4.4. ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.
4.4.1. Определение цепи, модифицируемой M.Bst¥5\-3.
4.4.2. Определение цепи, модифицируемой M.Z?s/F5I-2 и M.#s/F5I-4.
4.4.3. Сравнение субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз.
4.4.4. Зависимость активности ферментов от температуры.
4.4.5. Зависимость активности ферментов от величины рН.
4.4.6. Зависимость активности ферментов от концентраций ионов Na+ и К+
4.5. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.
4.5.1. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на полимерной ДНК.
4.5.2. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами на олигонуклеотидных дуплексах.
4.5.3. Сравнение кинетических характеристик гомологичных ДНК-метилтрансфераз РМ систем Z?s/F5I и FokI.
5. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5"
Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт-специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метилазами) является одной из наиболее интересных и актуальных проблем молекулярной биологии. За последнее время установлена важная роль этой модификации для регуляции экспрессии генов, процессов репликации и репарации в прокариотических и эукариотиоческих организмах, однако детальный механизм участия ДНК-метилаз в этих процессах мало изучен.
Более того, последние работы по определению первичной структуры ДНК целого ряда микроорганизмов выявили наличие в бактериальных клетках не одной (как ранее предполагалось), а целого набора генов ДНК-метилтрансфераз, что поднимает вопрос о роли такого каскада метилаз для функционирования клетки.
Большинство метилаз является составной частью так называемой сайт-специфической системы рестрикции-модификации (РМ системы) бактериальных клеток, обозначаемых по видовому названию микроорганизмов и состоящих, как правило, из эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы, узнающих одну и ту же последовательность нуклеотидов. Ранее было показано, что РМ система 5sfF5I из Bacillus stearothermophilus F5 имеет сайт узнавания 5'-GGATG-3', аналогичный сайту узнавания хорошо известной РМ системы Fokl из штамма Flavobacterium okeanokoites. Однако эндонуклеаза рестрикции &S/F5I расщепляет ДНК иначе, чем Fokl, а оперон РМ системы i?sfF5I, в отличие от РМ системы Fokl, содержит, как минимум, три ДНК-метилтрансферазы. Такая множественность ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью была обнаружена впервые, так как РМ системы, имеющие более двух ДНК-метилтрансфераз, до настоящего времени не описаны в литературе.
Целью данной работы явилось дальнейшее изучение РМ системы включая установление структуры всего оперона РМ системы и сравнительное исследование свойств выявленных ДНК-метилтрансфераз.
В задачи настоящего исследования входило:
- Определение структуры оперона уникальной системы рестрикции-модификации Z?s/F5I и установление полной нуклеотидной последовательности генов ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеазы рестрикции, входящих в эту систему.
- Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации #s7F5I в клетках E.coli.
- Установление субстратной специфичности всех ДНК- метилтрансфераз системы рестрикции-модификации Z?sJF5I.
- Определение оптимальных условий функционирования ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации £s/F5I.
- Сравнительное изучение кинетических свойств новых ферментов -ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации &s/F5I.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Голикова, Лариса Николаевна
5. ВЫВОДЫ
1. Определена полная нуклеотидная последовательность оперона системы рестрикции-модификации i?s?F5I из термофильного микроорганизма Bacillus stearothermophilus F5, ферменты которой узнают последовательность ДНК 5'-GGATG-3 '/5 -САТСС-3'.
2. Впервые показано существование уникальной системы рестрикции-модификации, в состав оперона которой входят четыре гена ДНК-метилтрансфераз и ген эндонуклеазы рестрикции.
3. Показано, что система рестрикции-модификации Z&/F5I включает две пары ДНК-метилтрансфераз с одинаковой субстратной специфичностью: M.itoF5I-l и M.Bst¥5l-3, модифицирующие последовательность 5 -GGATG-3'; и M.&S/F5I-2 и M.itoF5I-4, модифицирующие последовательность 5-САТСС-3'.
4. Гены всех четырех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации i?stF5I клонированы в экспрессирующие конструкции на основе термоиндуцибельного вектора pJW2 и показан синтез соответствующих ДНК-метилтрансфераз в клетках Е. coli.
5. Установлено, что ОРТ-1 для метилазы M.i?s?F5I-l содержит два стартовых кодона, однако функционально активный белок синтезируется только со второго ATG-кодона.
6. Определены оптимальные условия функционирования всех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I: температура, величина рН, концентрации ионов Na+ и К+.
7. Проведено сравнительное изучение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами системы рестрикции-модификации BstFSL Для всех ферментов определены константы Михаэлиса - KmsAM и -^чпднкэ каталитические константы кслЬ константы специфичности для SAM и ДНК.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голикова, Лариса Николаевна, Кольцово
1. Wilson G.G., Murray N.E. Restriction and modification systems // Annu. Rev. Genet. 1991. V. 25. P. 585-627.
2. Wilson G.G. Organization of restriction-modification systems // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. No. 10. P. 2539-2566.
3. Hale W.B., van der Woude M.W., Braaten B.A., Low D.A. Regulation of uropathogenic Escherichia coli adhesin expression by DNA methylation // Mol. Genet. Metab. 1998. V. 65. No. 3. P. 191-196.
4. Jeltsch A. Circular permutations in the molecular evolution of DNAmethyltransferases // J. Mol. Evol. 1999. V. 49. No. 1. P. 161-164.
5. Jeltsch A., Pingoud A. Horizontal gene transfer contributes to the wide distribution and evolution of type II restriction-modification systems // J. Mol. Evol. 1996. V. 42. No. 2. P. 91-96.
6. Heitman J. On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes // Genet. Eng. 1993. V. 15. P. 57-108.
7. Matveyev A.V., Young K.T., Meng A., Elhai J. DNA methyltransferases of the cyanobacterium Anabaena PCC 7120 // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. No. 7.$ P. 1491-1506.
8. Palmer B.R., Marinus M.G. The dam and dcm strains of Escherichia coli~a review//Gene. 1994. V. 143. No. l.P. 1-12.
9. Herman J.G., Modrich P. Escherichia coli dam methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. No. 5. P. 2605-2612.
10. Eberhard J., Oza J., Reich N.O. Cloning, sequence analysis and heterologous expression of the DNA adenine-(N(6)) methyltransferase from the human pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans II FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 195. No. 2. P. 223-229.
11. Torreblanca J., Casadesus J. DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium and a novel dam- regulated locus // Genetics. 1996. V. 144. No. 1. P. 15-26.
12. May B.J., Zhang Q., Li L.L., Paustian M.L., Whittam T.S., Kapur V. Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. V. 98. No. 6. P. 3460-3465.
13. Miner Z., Hattman S. Molecular cloning, sequencing, and mapping of the bacteriophage T2 dam gene // J. Bacteriol. 1988. V. 170. No. 11. P. 5177-5184.
14. Trautner T.A., Pawiek В., Behrens В., Willert J. Exact size and organization of DNA target-recognizing domains of multispecific DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases // EMBO J. 1996. V. 15. No. 6. P. 1434-1442.
15. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C., Herrmann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae II Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. No. 22. P. 4420-4449.
16. Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D., Bult C.J., Kerlavage A.R., Sutton G., Kelley J.M., . The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium II Science. 1995. V. 270. No. 5235. P. 397-403.
17. Zhang Y., Nelson M., Nietfeldt J., Xia Y., Burbank D., Ropp S., Van Etten J.L. Chlorella virus NY-2A encodes at least 12 DNA endonuclease/methyltransferase genes // Virology. 1998. V. 240. No. 2. P. 366375.
18. Vertino P.M. Eukaryotic DNA Methyltransferases // In: S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific, 1999. P. 341-372.
19. Bickle T.A., Kruger D.H. Biology of DNA restriction // Microbiol. Rev. 1993. V. 57. No. 2. P. 434-450.
20. Roberts R.J., Macelis D. REBASE-restriction enzymes and methylases // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. No. 1. P. 338-350.
21. Roberts R.J., Belfort M., Bestor Т.Н. et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. No. 7. P. 1805-18012.
22. Mernagh D.R., Taylor I.A., Kneale G.G. Interaction of the type I methyltransferase M.EcoR\24l with modified DNA substrates: sequence discrimination and base flipping // Biochem. J. 1998. V. 336. No. 3. P. 719-725.
23. Smith M.A., Read C.M., Kneale G.G. Domain structure and subunit interactions in the type I DNA methyltransferase M.iscoR124I // J. Mol. Biol. 2001. V. 314. No. 1. P. 41-50.
24. Janscak P., Dryden D.T., Firman K. Analysis of the subunit assembly of the typeIC restriction-modification enzyme EcoR\24\ II Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. No. 19. P. 4439-4445.
25. Powell L.M., Dryden D.T., Willcock D.F., Pain R.H., Murray N.E. DNA recognition by the EcoK methyltransferase. The influence of DNA methylation and the cofactor S-adenosyl-L-methionine // J. Mol. Biol. 1993. V. 234. No. 1. P. 60-71.
26. Kan N.C., Lautenberger J.A., Edgell M.H., Hutchison C.A., III. The nucleotide sequence recognized by the Escherichia coli K12 restriction and modification enzymes // J. Mol. Biol. 1979. V. 130. No. 2. P. 191-209.
27. Zinkevich V.E., Zograf I., Taniashin V.I. Genes of DNA methylase EcoK: their cloning and expression // Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1984. V. 279. No. 6. P. 1493-1496.
28. Rao D.N., Page M.G., Bickle T.A. Cloning, overexpression and the catalytic propeties of the £coP15I modification methylase from Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1989. V. 209. No. 4. P. 599-606.
29. Bitinaite J., Wah D.A., Aggarwal A.K., Schildkraut I. Fo/d dimerization is required for DNA cleavage // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. V. 95. No. 18. P. 10570-10575.
30. Dryden D.T. Bacterial DNA Methyltransferases // In: S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific, 1999. P. 283-340.
31. Cheng X., Kumar S., Klimasauskas S., Roberts R.J. Crystal structure of the Hhal DNA methytransferase // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. V. 58. P. 331-338.
32. Ueno Т., Ito H., Kimizuka F., Kotani H., Nakajima K. Gene structure and expression of the Mbol restriction-modification system // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21.No. 10. P. 2309-2313.
33. Szybalski W., Kim S.C., Hasan N., Podhajska A.J. Class-IIS restriction enzymes a review // Gene. 1991. V. 100. P. 13-26.
34. Vanamee E.S., Santagata S., Aggarwal A.K. FokI requires two specific DNA sites for cleavage // J. Mol. Biol. 2001. V. 309. No. 1. P. 69-78.
35. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., Takanami M. The Fokl restriction-modification system. I. Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes //J. Biol. Chem. 1989. V. 264. No. 10. P. 5751-5756.
36. Kita K., Suisha M., Kotani H., Yanase H., Kato N. Cloning and sequence analysis of the Stsl restriction-modification gene: presence of homology to Fok I restriction-modification enzymes // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 16. P. 4167-4172.
37. Lacks S., Greenberg B. A deoxyribonuclease of Diplococcus pneumoniae specific for methylated DNA // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. No. 11. P. 4060-4066.
38. Janulaitis A., Marcinkeviciene L.Y., Petrusyte M.P. A specific endonuclease from Caulobacter fusiformis that cleaves only methylated DNA. // Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1982. V. 262. P. 241-244.
39. Kong H., Roemer S.E., Waite-Rees P.A., Benner J.S., Wilson G.G., Nwankwo D.O. Characterization of Bcgl, a new kind of restriction-modification system // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. No. 1. P. 683-690.
40. Vitor J.M., Morgan R.D. Two novel restriction endonucleases from Campylobacter jejuni // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 109-110.
41. Piekarowicz A., Golaszewska M., Sunday A.O., Siwinska M., Stein D.C. The HaeYV restriction modification system of Haemophilus aegyptius is encoded by a single polypeptide // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. No. 5. P. 1055-1065.
42. Degtyarev S.K., Rechkunova N.I., Zernov Y.P., Dedkov V.S., Chizikov V.E., Van Calligan M., Williams R., Murray E. Bsp24l, a new unusual restriction endonuclease//Gene. 1993. V. 131. No. 1. P. 93-95.
43. Vitkute J., Maneliene Z., Petrusyte M., Janulaitis A. Bpll, a new Z?cgl-like restriction endonuclease, which recognizes a symmetric sequence // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. No. 22. P. 4444-4446.
44. Абдурашитов M.A., Беличенко О.А., Шевченко А.В., Дегтярев С.Х. N.Z?s^SE сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589 // Молекулярная биология. 1996. Т. 30. №. 6. С. 1261-1267.
45. Xu Y., Lunnen K.D., Kong Н. Engineering a nicking endonuclease N./1/wI by domain swapping // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. V. 98. No. 23. P. 12990-12995.
46. Higgins L.S., Besnier C., Kong H. The nicking endonuclease N.ZforNBI is closely related to type lis restriction endonucleases Mly\ and Pie I // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. No. 12. P. 2492-2501.
47. Morgan R.D., Calvet C., Demeter M., Agra R., Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.2?,s£NBI // Biol. Chem. 2000. V. 381. No. 11. P. 1123-1125.
48. Железная Jl.А., Перевязова T.A., Железнякова E.H., Матвиенко Н.И. Некоторые свойства сайт-специфической никазы N.Z?.s/?D6I и возможность ее применения в гибридизационном анализе ДНК // Биохимия. 2002. Т. 67. №. 4. С. 595-600.
49. Bujnicki J.M. Understanding the evolution of restriction-modification systems: clues from sequence and structure comparisons // Acta Biochim. Pol. 2001. V. 48. No. 4. P. 935-967.
50. Degtyarev S.K., Rechkunova N.I., Kolyhalov A.A., Dedkov V.S., Zhilkin P.A. II-Q restriction endonucleases new class of type II enzymes // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. No. 19. P. 5807-5810.
51. Дегтярев C.X., Жилкин П.А., Приходько Г.Г., Репин В.Е., Речкунова Н.И. Определение субстратной специфичности рестриктазы BpuXQil с необычным сайтом узнавания. // 1989 Т. 23. С. 11051-1056.
52. Stankevicius К., Lubys A., Timinskas A., Vaitkevicius D., Janulaitis А. Cloning and analysis of the four genes coding for Bpu\Q\ restriction- modification enzymes // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. No. 4. P. 1084-1091.
53. Hsieh P.C., Xiao J.P., O'loane D., Xu S.Y. Cloning, expression, and purification of a thermostable nonhomodimeric restriction enzyme, BslI // J. Bacteriol. 2000. V. 182. No. 4. P. 949-955.
54. Degtyarev S.K., Belichenko O.A., Lebedeva N.A., Dedkov V.S., Abdurashitov M.A. Btrl, a novel restriction endonuclease, recognises the non-palindromic sequence 5'-CACGTC(-3/-3)-3* // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. No. 11. P. E56
55. Kruger D.H., Barcak G.J., Reuter M., Smith H.O. ЕсоШ\ can be activated to cleave refractory DNA recognition sites // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. No. 9. P. 3997-4008.
56. Huai Q., Colandene J.D., Chen Y., Luo F., Zhao Y., Topal M.D., Ke H. Crystal structure of Nael-ш evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase//EMBO J. 2000. V. 19. No. 12. P. 3110-3118.
57. Deibert M., Grazulis S., Sasnauskas G., Siksnys V., Huber R. Structure of the tetrameric restriction endonuclease NgoMlW in complex with cleaved DNA // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. No. 9. P. 792-799.
58. Bilcock D.T., Halford S.E. DNA restriction dependent on two recognition sites: activities of the Sfil restriction-modification system in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1999. V. 31. No. 4. P. 1243-1254.
59. Janulaitis A., Petrusyte M., Maneliene Z., Klimasauskas S., Butkus V. Purification and properties of the EcoSll restriction endonuclease and methylase -prototypes of a new class (type IV) // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 22. P. 6043-6049.
60. Petrusyte M., Bitinaite J., Menkevicius S., Klimasauskas S., Butkus V., Janulaitis A. Restriction endonucleases of new type // Gene. 1989. V. 74. No. 1. P. 89-91.
61. Janulaitis A., Vaisvila R., Timinskas A., Klimasauskas S., Butkus V. Cloning and sequence analysis of the genes coding for EcoSll type IV restriction-modification enzymes 11 Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 22. P. 6051-6056.
62. Miyahara M., Nakajima K., Shimada Т., Mise K. Restriction endonuclease PshAl from Plesiomonas shigelloides with the novel recognition site 5'-GACNN/NNGTC//Gene. 1990. V. 87. No. l.P. 119-122.
63. Mernagh D., Marks P., Kneale G. Ahdl, a new class of restriction-modification system? // Biochem. Soc. Trans. 1999. 27: A126.
64. Shaw P.С., Мок Y.K. Xcml as a universal restriction enzyme for single-stranded DNA // Gene. 1993. V. 133. No. 1. P. 85-89.
65. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. No. 18. P. 3728-3741.
66. Piekarowicz A. Preferential cleavage by restriction endonuclease Hinflll II ActaBiochim. Pol. 1984. V. 31. No. 4. P. 453-464.
67. Reddy Y.V., Rao D.N. Binding of EcoV\5\ DNA methyltransferase to DNA reveals a large structural distortion within the recognition sequence // J. Mol. Biol. 2000. V. 298. No. 4. P. 597-610.
68. Rao D.N., Saha S., Krishnamurthy V. ATP-dependent restriction enzymes // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2000. V. 64. P. 1-63.
69. De Backer O., Colson C. Two-step cloning and expression in Escherichia coli of the DNA restriction-modification system iStyLTI of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1991. V. 173. No. 3. P. 1321-1327.
70. Krishnamurthy V., Rao D.N. Interaction of EcoVX modification methylase with S-adenosyl-L-methionine: a UV-crosslinking study // Biochem. Mol. Biol. Intl. 1994. V. 32. P. 623-632.
71. Kauc L., Piekarowicz A. Purification and properties of a new restriction endonuclease from Haemophilus influenzae Rf// Eur. J. Biochem. 1978. V. 92. No. 2. P. 417-426.
72. Meisel A., Mackeldanz P., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis // EMBO J. 1995. V. 14. No. 12. P. 2958-2966.
73. Meisel A., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage // Nature. 1992. V. 355. No. 6359. P. 467-469.
74. Stewart F.J., Raleigh E.A. Dependence of McrBC cleavage on distance between recognition elements // Biol. Chem. 1998. V. 379. No. 4-5. P. 611-616.
75. Panne D., Raleigh E.A., Bickle T.A. The McrBC endonuclease translocates DNA in a reaction dependent on GTP hydrolysis // J. Mol. Biol. 1999. V. 290. No. 1. P. 49-60.
76. Kruger Т., Wild C., Noyer-Weidner M. McrB: a prokaryotic protein specifically recognizing DNA containing modified cytosine residues // EMBO J. 1995. V. 14. No. 11. P. 2661-2669.
77. Dila D., Sutherland E., Moran L., Slatko В., Raleigh E.A. Genetic and sequence organization of the mcrBC locus of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1990. V. 172. No. 9. P. 4888-4900.
78. Revel H.R. Restriction of nonglucosylated T-even bacteriophage: properties of permissive mutants of Escherichia coli В and K12 // Virology. 1967. V. 31. No. 4. P. 688-701.
79. Janosi L., Yonemitsu H., Hong H., Kaji A. Molecular cloning and expression of a novel hydroxymethylcytosine- specific restriction enzyme (PvuRts 11) modulated by glucosylation of DNA // J. Mol. Biol. 1994. V. 242. No. 1. P. 45-61.
80. Schlagman S.L., Hattman S. Molecular cloning of a functional dam+ gene coding for phage T4 DNA adenine methylase // Gene. 1983. V. 22. No. 2-3. P. 139-156.
81. Behrens В., Noyer-Weidner M., Pawlek В., Lauster R., Balganesh T.S., Trautner T.A. Organization of multispecific DNA methyltransferases encoded by temperate Bacillus subtilis phages // EMBO J. 1987. V. 6. No. 4. P. 1137-1142.
82. Jurica M.S., Stoddard B.L. Homing endonucleases: structure, function and evolution // Cell Mol. Life Sci. 1999. V. 55. No. 10. P. 1304-1326.
83. Gimble F.S. Invasion of a multitude of genetic niches by mobile endonuclease genes // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 185. No. 2. P. 99-107.
84. Belfort M., Perlman P.S. Mechanisms of intron mobility // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. No. 51. P. 30237-30240.
85. Webb J.L., King G., Ternent D., Titheradge A.J., Murray N.E. Restriction by EcoKl is enhanced by co-operative interactions between target sequences and is dependent on DEAD box motifs // EMBO J. 1996. V. 15. No. 8. P. 2003-2009.
86. Modrich P. Methyl-directed DNA mismatch correction // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. No. 12. P. 6597-6600.
87. Polaczek P., Kwan K., Liberies D.A., Campbell J.L. Role of architectural elements in combinatorial regulation of initiation of DNA replication in Escherichia coli// Mol. Microbiol. 1997. V. 26. No. 2. P. 261-275.
88. Campbell J.L., Kleckner N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork // Cell. 1990. V. 62. No. 5. P. 967-979.
89. Sternberg N., Coulby J. Cleavage of the bacteriophage PI packaging site (рас) is regulated by adenine methylation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. V. 87. No. 20. P. 8070-8074.
90. Heithoff D.M., Sinsheimer R.L., Low D.A., Mahan M.J. An essential role for DNA adenine methylation in bacterial virulence // Science. 1999. V. 284. No. 5416. P. 967-970.
91. Goldman S., Navon Y., Fish F. Phase variation in Bordetella pertussis is accompanied by changes in DNA modification // Microb. Pathog. 1987. V. 2. No. 5. P. 327-338.
92. Wahnon D.C., Shier V.K., Benkovic S.J. Mechanism-based inhibition of an essential bacterial adenine DNA methyltransferase: rationally designed antibiotics // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. No. 5. P. 976-977.
93. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor Т.Н. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites // Trends Genet. 1997. V. 13. No. 8. P. 335-340.
94. Walsh C.P., Chaillet J.R., Bestor Т.Н. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation // Nat. Genet. 1998. V. 20. No. 2. P. 116-117.
95. Heidmann S., Seifert W., Kessler C., Domdey H. Cloning, characterization and heterologous expression of the Smal restriction-modification system // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. No. 23. P. 9783-9796.
96. Calvin K., Blumenthal R.M. Characterization of pPvul, the autonomous plasmid from Proteus vulgaris that carries the genes of the PvuW restriction-modification system // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 73-79.
97. O'Sullivan D.J., Zagula К., Klaenhammer T.R. In vivo restriction by Llal is encoded by three genes, arranged in an operon with //alM, on the conjugative Lactococcus plasmid pTR2030 // J. Bacteriol. 1995. V. 177. No. l.P. 134-143.
98. Hadi S.M., Bachi В., Iida S., Bickle T.A. DNA restriction—modification enzymes of phage PI and plasmid pl5B. Subunit functions and structural homologies//J. Mol. Biol. 1983. V. 165. No. 1. P. 19-34.
99. Tao Т., Bourne J.C., Blumenthal R.M. A family of regulatory genes associated with type II restriction- modification systems // J. Bacteriol. 1991. V. 173. No. 4. P. 1367-1375.
100. Lindroth A.M., Cao X., Jackson J.P., Zilberman D., McCallum C.M., Henikoff S., Jacobsen S.E. Requirement of CHROMOMETHYLASE3 for maintenance of CpXpG methylation // Science. 2001. V. 292. No. 5524. P. 20772080.
101. Vijesurier R.M., Carlock L., Blumenthal R.M., Dunbar J.C. Role and mechanism of action of C. PvuW, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems // J. Bacteriol. 2000. V. 182. No. 2. P. 477-487.
102. Vasquez C.C., Saavedra C.P., Pichuantes S.E. Nucleotide sequence of the gene encoding the itoLVI DNA methyltransferase: comparison with other amino-DNA methyltransferases // Curr. Microbiol. 2000. V. 40. No. 2. P. 114-118.
103. Sohail A., Ives C.L., Brooks J.E. Purification and characterization of С.ВатШ, a regulator of the ВатШ restriction-modification system // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 227-228.
104. Dubey А.К., Roberts R.J. Sequence specific DNA binding by the Mspl DNA methyltransferase // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 12. P. 3167-3173.
105. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. The DNA (cytosine-5) methyltransferases // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. No. l.P. 1-10.
106. Schluckebier G., O'Gara M., Saenger W., Cheng X. Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. No. l.P. 16-20.
107. Malone Th., Blumenthal R.M., Cheng X. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes // J. Mol. Biol. 1995. V. 253. No. 4. P. 618-632.
108. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G., Roberts R.J. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. No. 7. P. 2421-2435.
109. Bujnicki J.M. Sequence permutations in the molecular evolution of DNA methyltransferases // BMC. Evol. Biol. 2002. V. 2:3.
110. Timinskas A., Butkus V., Janulaitis A. Sequence motifs characteristic for DNA cytosine-N4. and DNA [adenine-N6] methyltransferases. Classification of all DNA methyltransferases // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 3-11.
111. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W., Roberts R.J. Crystal structure of the Hha\ DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl- L-methionine // Cell. 1993. V. 74. No. 2. P. 299
112. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. Hha\ methyltransferase flips its target base out of the DNA helix // Cell. 1994. V. 76. No. 2. P. 357-369.
113. O'Gara M., Zhang X., Roberts R.J., Cheng X. Structure of a binary complex of Hhal methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short non-specific DNA oligonucleotide // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. No. 2. P. 201-209.
114. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. The crystal structure of HaeIII methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing // Cell. 1995. V. 82. No. 1. P. 143-153.
115. Schluckebier G., Kozak M., Bleimling N., Weinhold E., Saenger W. Differential binding of S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine and sinefungin to the adenine-specific DNA methyltransferase M.Taql // J. Mol. Biol.1997. V. 265. No. 1. P. 56-67.
116. Gong W., O'Gara M., Blumenthal R.M., Cheng X. Structure of Pvull DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment//Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. No. 14. P. 2702-2715.
117. Jost J.P., Oakeley E.J., Schwarz S. In: S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific, 1999. P. 373
118. Vidgren J., Svensson L.A., Liljas A. Crystal structure of catechol O-methyltransferase//Nature. 1994. V. 368. P. 354
119. Fu Z., Hu Y., Konishi K., Takata Y., Ogawa H., Gomi Т., Fujioka M., Takusagawa F. Crystal structure of glycine N-methyltransferase from rat liver // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 11985
120. Djordjevic S., Stock A.M. Crystal structure of the chemotaxis receptor methyltransferase CheR suggests a conserved structural motif for binding S-adenosylmethionine // Structure. 1997. V. 5. No. 4. P. 545-558.
121. Hodel A.E., Gershon P.D., Quiocho F.A. Structural basis for sequence-nonspecific recognition of 5-capped mRNA by a cap-modifying enzyme // Mol. Cell. 1998. V. 1. No. 3. P. 443-447.
122. Carugo O., Argos P. NADP-dependent enzymes. II: Evolution of the mono-and dinucleotide binding domains // Proteins. 1997. V. 28. No. 1. P. 29-40.
123. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. Studies on the function of conserved sequence motifs in the T4 Dam-N6- adenine. and ZscoRII [C5-cytosine] DNA methyltransferases // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 125-126.
124. Ahmad I., Rao D.N. Functional analysis of conserved motifs in Eco?\5\ DNA methyltransferase // J. Mol. Biol. 1996. V. 259. No. 2. P. 229-240.
125. Jeltsch A., Roth M., Friedrich T. Mutational analysis of target base flipping by the £coRV adenine-N6 DNA methyltransferase // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. No. 3. P. 1121-1130.
126. Friedrich Т., Roth M., Helm-Kruse S., Jeltsch A. Functional mapping of the EcoRV DNA methyltransferase by random mutagenesis and screening for catalytically inactive mutants // Biol. Chem. 1998. V. 379. No. 4-5. P. 475-480.
127. Bergerat A., Guschlbauer W. The double role of methyl donor and allosteric effector of S-adenosyl-methionine for Dam methylase of E. coli II Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. No. 15. P. 4369-4375.
128. Adams G.M., Blumenthal R.M. The PvuW DNA (cytosine-N4)-methyltransferase comprises two trypsin-defined domains, each of which binds a molecule of S- adenosyl-L-methionine // Biochemistry. 1997. V. 36. No. 27. P. 8284-8292.
129. Bergerat A., Guschlbauer W., Fazakerley G.V. Allosteric and catalytic binding of S-adenosylmethionine to Escherichia coli DNA adenine methyltransferase monitored by 3H NMR // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88. No. 15. P. 6394-6397.
130. Sugisaki H., Kita К., Takanami M. The Fokl restriction modification system II. Presence of two domains in Fokl methylase responsible for modification of different DNA strands // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. No. 10. P. 5757-5761.
131. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S.M. Conserved sequence motif DPPY in region IV of the phage T4 Dam DNA-N6-adenine.-methyltransferase is important for S-adenosyl-L-methionine binding // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. No. 20. P. 4659-4662.
132. Guyot J.В., Grassi J., Hahn U., Guschlbauer W. The role of the preserved sequences of Dam methylase // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. No. 14. P. 31833190.
133. Willcock D.F., Dryden D.T., Murray N.E. A mutational analysis of the two motifs common to adenine methyltransferases // EMBO J. 1994. V. 13. No. 16. P. 3902-3908.
134. Fuller-Pace F.V., Murray N.E. Two DNA recognition domains of the specificity polypeptides of a family of type I restriction enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. V. 83. No. 24. P. 9368-9372.
135. Mi S., Roberts R.J. How M.Msp I and M.Hpall decide which base to methylate // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 18. P. 4811-4816.
136. Pradhan S., Roberts R.J. Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain // EMBO J. 2000. V. 19. No. 9. P. 2103-2114.
137. Gubler M., Braguglia D., Meyer J., Piekarowicz A., Bickle T.A. Recombination of constant and variable modules alters DNA sequence recognition by type 1С restriction-modification enzymes // EMBO J. 1992. V. 11. No. 1. P. 233-240.
138. Cheng X., Blumenthal R.M. Finding a basis for flipping bases // Structure. 1996. V. 4. No. 6. P. 639-645.
139. Szegedi S.S., Gumport R.I. DNA binding properties in vivo and target recognition domain sequence alignment analyses of wild-type and mutant Rsrl N6-adenine. DNA methyltransferases // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. No. 20. P. 3972-3981.
140. Bujnicki J., Radlinska M. Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) methyltransferases: evidence for their polyphyletic origin // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. No. 22. P. 4501-4509.
141. Radlinska M., Bujnicki J.M. Cloning of enterohemorrhagic Escherichia coli phage VT-2 dam methyltransferase // Acta Microbiol. Pol. 2001. V. 50. No. 2. P. 161-167.
142. Woodbury C.P., Jr., Hagenbuchle O., von Hippel P.H. DNA site recognition and reduced specificity of the EcoRl endonuclease // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. No. 23. P. 11534-11548.
143. Woodbury C.P., Jr., Downey R.L., von Hippel P.H. DNA site recognition and overmethylation by the EcoRl methylase // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. No. 23. P. 11526-11533.
144. Reich N.O., Olsen C., Osti F., Murphy J. In vitro specificity of EcoRl DNA methyltransferase // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. No. 22. P. 15802-15807.
145. Heitman J., Model P. Site-specific methylases induce the SOS DNA repair response in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1987. V. 169. No. 7. P. 3243-3250.
146. Ginetti F., Perego M., Albertini A.M., Galizzi A. Bacillus subtilis mutS mutL operon: identification, nucleotide sequence and mutagenesis // Microbiology. 1996. V. 142 ( Pt 8). P. 2021-2029.
147. Smith D.W., Crowder S.W., Reich N.O. In vivo specificity of ЕсоШ DNA methyltransferase //Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. No. 22. P. 6091-6096.
148. Bandaru В., Gopal J., Bhagwat A.S. Overproduction of DNA cytosine methyltransferases causes methylation and С —> T mutations at non-canonical sites // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. No. 13. P. 7851 -7859.
149. Cohen H.M., Tawfik D.S., Griffiths A.D. Promiscuous methylation of non-canonical DNA sites by HaeIII methyltransferase // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. No. 17. P. 3880-3885.
150. Friedrich Т., Fatemi M., Gowher H., Leismann O., Jeltsch A. Specificity of DNA binding and methylation by the M.Fofcl DNA methyltransferase // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1480. No. 1-2. P. 145-159.
151. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S.M. Phage T4 DNA N6-adenine.-methyltransferase. Overexpression, purification and characterization // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. No. 24. P. 14389-14393.
152. Minko I., Hattman S., Lloyd R.S., Kossykh V. Methylation by a mutant T2 DNA N(6)-adenine. methyltransferase expands the usage of RecA-assisted endonuclease (RARE) cleavage // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. No. 7. P. 14841490.
153. Jeltsch A., Christ F., Fatemi M., Roth M. On the substrate specificity of DNA methyltransferases //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. No. 28. P. 19538-19544.
154. Roth M., Jeltsch A. Changing the target base specificity of the EcoRV DNA methyltransferase by rational de novo protein-design // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29.No. 15. P. 3137-3144.
155. Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. DpnA, a methylase for single-strand DNA in the Dpnll restriction system, and its biological function // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. No. 23. P. 9223-9227.
156. Merkiene E., Vilkaitis G., Klimasauskas S. A pair of single-strand and double-strand DNA cytosine-N4 methyltransferases from Bacillus centrosporus II Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 569-571.
157. Allan B.W., Garcia R.A., Maegley K., Mort J., Wong D., Lindstrom W.M., Beechem J.M., Reich N.O. DNA bending by EcoRl DNA methyltransferase accelerates base flipping but compromises specificity // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. No. 27. P. 19269-19275.
158. Slatko B.E., Croft R., Moran L.S., Wilson G.G. Cloning and analysis of the Hae III and Haell methyltransferase genes 11 Gene. 1988. V. 74. No. 1. P. 45-50.
159. Rina M., Bouriotis V. Cloning, purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus II Gene. 1993. V. 133. No. 1. P. 91-94.
160. Bhattacharya S.K., Dubey A.K. Kinetic mechanism of cytosine DNA methyltransferase Mspl И J. Biol. Chem. 1999. V. 274. No. 21. P. 14743-14749.
161. Yoon H., Suh H., Kim K., Han M.H., Yoo O.J. The specificity fnd catalytic properties of Alui methylase. II Korean Biochem. 2002. V. 18. No. 1985. P. 88-93.
162. Malygin E.G., Ovechkina L.G., Zinoviev V.V., Lindstrom W.M., Reich N.O. DNA-(N4-cytosine)-methyltransferase from Bacillus amyloliquefaciens: kinetic and substrate-binding properties // Mol. Biol. (Mosk). 2001. V. 35. No. 1. P. 35-44.
163. Gunthert U., Jentsch S., Freund M. Restriction and modification in Bacillus subtilis: two DNA methyltransferases with BsuRI specificity // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. No. 17. P. 9346-9351.
164. Goedecke K., Pignot M., Goody R.S., Scheidig A.J., Weinhold E. Structure of the N6-adenine DNA methyltransferase MTaql in complex with DNA and a cofactor analog II Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. No. 2. P. 121-125.
165. Schluckebier G., Labahn J., Granzin J., Saenger W. M.Taql: possible catalysis via cation-pi interactions in N-specific DNA methyltransferases // Biol. Chem. 1998. V. 379. No. 4-5. P. 389-400.
166. Pogolotti A.L., Ono A., Subramaniam R., Santi D.V. On the mechanism of DNA adenine methylase // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. No. 16. P. 7461-7464.
167. Blumenthal R.M., Cheng X. A Taq attack displaces bases // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. No. 2. P. 101-103.
168. Klimasauskas S., Roberts R.J. M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. No. 8. P. 13881395.
169. Yang A.S., Shen J.C., Zingg J.M., Mi S., Jones P.A. Hhal and Hpall DNA methyltransferases bind DNA mismatches, methylate uracil and block DNA repair // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. No. 8. P. 1380-1387.
170. Allan B.W., Beechem J.M., Lindstrom W.M., Reich N.O. Direct real time observation of base flipping by the Eco RI DNA methyltransferase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. No. 4. P. 2368-2373.
171. Holz В., Klimasauskas S., Serva S., Weinhold E. 2-Aminopurine as a fluorescent probe for DNA base flipping by methyltransferases // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. No. 4. P. 1076-1083.
172. Szegedi S.S., Reich N.O., Gumport R.I. Substrate binding in vitro and kinetics of Rsrl N6-adenine. DNA methyltransferase // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. No. 20. P. 3962-3971.
173. Hosfield D.J., Guan Y., Haas B.J., Cunningham R.P., Tainer J.A. Structure of the DNA repair enzyme endonuclease IV and its DNA complex: double-nucleotide flipping at abasic sites and three-metal-ion catalysis // Cell. 1999. V. 98. No. 3. P. 397-408.
174. Slupphaug G., Mol C.D., Kavli В., Arvai A.S., Krokan H.E., Tainer J.A. A nucleotide-flipping mechanism from the structure of human uracil-DNA glycosylase bound to DNA // Nature. 1996. V. 384. No. 6604. P. 87-92.
175. Roberts R.J. On base flipping//Cell. 1995. V. 82. No. 1. P. 9-12.
176. Chen L., MacMillan A.M., Chang W., Ezaz-Nikpay K., Lane W.S., Verdine G.L. Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methyltransferase // Biochemistry. 1991. V. 30. No. 46. P. 11018-11025.
177. Verdine G.L. The flip side of DNA methylation // Cell. 1994. V. 76. No. 2. P. 197-200.
178. Santi D.V., Norment A., Garrett C.E. Covalent bond formation between a DNA-cytosine methyltransferase and DNA containing 5-azacytosine // Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. V. 81. No. 22. P. 6993-6997.
179. Friedman S., Ansari N. Binding of the ^coRII methyltransferase to 5-fluorocytosine containing DNA. Isolation of a bound peptide // Nucleic Acids Res.1992. V. 20. No. 12. P. 3241-3248.
180. Chen L., MacMillan A.M., Verdine G.L. Mutational separation of DNA binding from catalysis in DNA cytosine methyltransferase // J. Am. Chem. Soc.1993. V. 115. P. 5318-5319.
181. Renbaum P., Razin A. Interaction of M.SssI and M.Hhal with single-base mismatched oligodeoxynucleotide duplexes // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 177179.
182. Dubey A.K., Bhattacharya S.K. Angle and locus of the bend induced by the Mspl DNA methyltransferase in a sequence-specific complex with DNA // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. No. 10. P. 2025-2029.
183. Cal S., Connolly B.A. The Eco RV modification methylase causes considerable bending of DNA upon binding to its recognition sequence GATATC //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. No. 2. P. 1008-1015.
184. Garcia R.A., Bustamante C.J., Reich N.O. Sequence-specific recognition by cytosine C5 and adenine N6 DNA methyltransferases requires different deformations of DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. V. 93. No. 15. P. 7618-7622.
185. Lindstrom W.M., Flynn J., Reich N.O. Reconciling structure and function in Hha\ DNA cytosine-C-5 methyltransferase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. No. 7. P. 4912-4919.
186. Szczelkun M.D., Connolly B.A. Sequence-specific binding of DNA by the EcoRV restriction and modification enzymes with nucleic acid and cofactor analogues // Biochemistry. 1995. V. 34. No. 34. P. 10724-10733.
187. Greene P.H., Poonian M.S., Nussbaum A.L., Tobias L., Garfin D.E., Boyer H.W., Goodman H.M. Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the EcoRI substrate // J. Mol. Biol. 1975. V. 99. No. 2. P. 237-261.
188. Kaszubska W., Webb H.K., Gumport R.I. Purification and characterization of the M.Tfarl DNA methyltransferase from Escherichia coli II Gene. 1992. V. 118. No. 1. P. 5-11.
189. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. Comparative studies of the phage T2 and T4 DNA (N6- adenine)me thy transferases: amino acid changes that affect catalytic activity // J. Bacteriol. 1997. V. 179. No. 10. P. 3239-3243.
190. Nardone G., George J., Chirikjian J.G. Differences in the kinetic properties of ВатШ endonuclease and methylase with linear DNA substrates // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. No. 26. P. 12128-12133.
191. Kang Y.K., Lee H.B., Noh M.J., Cho N.Y., Yoo O.J. Different effects of base analog substitutions in ВатШ restriction site on recognition by ВатШ endonuclease and itowHImethylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 206. No. 3. P. 997-1002.
192. Thielking V., Dubois S., Eritja R., Guschlbauer W. Dam methyltransferase from Escherichia coli: Kinetic studies using modified DNA oligomers: nonmethylated substrates // Biol. Chem. 1997. V. 378. No. 5. P. 407-415.
193. Marzabal S., Dubois S., Thielking V., Cano A., Eritja R., Guschlbauer W. Dam methylase from Escherichia coli: kinetic studies using modified oligomers: hemimethylated substrates // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. No. 18. P. 36483655.
194. Szilak L., Der A., Deak F., Venetianer P. Kinetic characterization of the Ecal methyltransferase// Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. No. 2. P. 727-733.
195. Winter M. Investigation of de novo methylation activity in mutants of the EcoKl methyltransferase. University of Edinburgh; 1998.
196. Ahmad I., Rao D.N. Interaction of £coP15I DNA methyltransferase with oligonucleotides containing the asymmetric sequence 5'-CAGCAG-3' // J. Mol. Biol. 1994. V. 242. No. 4. P. 378-388.
197. Rubin R.A., Modrich P. ЕсоШ methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. No. 20. P. 7265-7272.
198. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the iscoRII cytosine-C5.-DNA methyltransferase // FEBS Lett. 1995. V. 370. No. 1-2. P. 75-77.
199. Wolcke J. University Dortmund, Germany; 1998.
200. Reich N.O., Danzitz M.J.J. Non-additivity of sequence-specific enzyme-DNA interactions in the ЕсоШ. DNA methyltransferase // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. No. 23. P. 6587-6594.
201. Jeltsch A., Friedrich Т., Roth M. Kinetics of methylation and binding of DNA by the £coRV adenine-N6 methyltransferase // J. Mol. Biol. 1998. V. 275. No. 5. P. 747-758.
202. Lee K.F., Liaw Y.-C., Shaw P.C. Overproduction, purification, and characterization of М.ЯсоНКЗП, a bacterial methyltransferase with two polypeptides // Biochem. J. 1996. V. 314. No. 1. P. 321-326.
203. Kaczorowski Т., Sektas M., Skowron P., Podhajska A.J. The Fokl methyltransferase from Flavobacterium okeanokoites. Purification and characterization of the enzyme and its truncated derivatives // Mol. Biotechnol. 1999. V. 13. No. l.P. 1-15.
204. Pradhan S., Bacolla A., Wells R.D., Roberts R.J. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. No. 46. P. 33002-33010.
205. Glickman J.F., Flynn J., Reich N.O. Purification and characterization of recombinant baculovirus-expressed mouse DNA methyltransferase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 230. No. 2. P. 280-284.
206. Vilkaitis G., Merkiene E., Serva S., Weinhold E., Klimasauskas S. The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hha\ methyltransferase // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. No. 24. P. 20924-20934.
207. Schluckebier G., Labahn J., Granzin J., Schildkraut I., Saenger W. A model for DNA binding and enzyme action derived from crystallographic studies of the Taql N6-adenine-methyltransferase // Gene. 1995. V. 157. No. 1-2. P. 131-134.
208. Reich N.O., Mashhoon N. Kinetic mechanism of the £<%>RI DNA methyltranserase // Biochemistry. 1991. V. 30. No. 11. P. 2933-2939.
209. Surby M.A., Reich N.O. Contribution of facilitated diffusion and processive catalysis to enzyme efficiency: implications for the ZscoRI restriction-modification system // Biochemistry. 1996. V. 35. No. 7. P. 2201-2208.
210. Gabbara S., Sheluho D., Bhagwat A.S. Cytosine methyltransferase from Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serine is partially active// Biochemistry. 1995. V. 34. No. 27. P. 8914-8923.
211. Boye E., Marinus M.G., Lobner-Olesen A. Quantitation of Dam methyltransferase in Escherichia coli Hi. Bacteriol. 1992. V. 174. No. 5. P. 16821685.
212. Kelleher J.E., Raleigh E.A. Response to UV damage by four Escherichia coli K-12 restriction systems // J. Bacteriol. 1994. V. 176. No. 19. P. 5888-5896.
213. Zhang W., Bond J.P., Anderson C.F., Lohman T.M., Record M.T., Jr. Large electrostatic differences in the binding thermodynamics of a cationic peptide to oligomeric and polymeric DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 93. No. 6. P. 2511-2516.
214. Neidhardt F.C., Ingraham J.L., Schaechter M. Physiology of the bacterial cell: a molecular approach. // Sinauer Associates Inc. Mass., 1990.
215. Ханаан Д. Методы трансформации E.coli. II Клонирование ДНК. Методы./ Под ред. Д.Гловера. М. Мир. 1988. С. 140-173.
216. Харди К.Г. Методы клонирования в бациллах. // Клонирование ДНК. Методы./ Под ред. Д.Гловера. М. Мир. 1988. С. 230-249.
217. Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov К.А., Lukyanov S.A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. No. 6. P. 1087-1088.
218. Chenchik A., Diachenco L., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G., Tarabykin V.S., Sverdlov E.D. Method for supression DNA fragments amplification during PCR. No. 5,565,340. 2002. Date Filed : 1996.
219. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages // Methods Enzymol. 1980. V. 65. No. 1. P. 499-560.
220. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. V. 74. No. 2. P. 560-564.
221. Degtyarev S.K., Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Shevchenko A.V. Primary structure and strand specificity of itoF5I-l DNA methyltransferase which recognizes 5'-GGATG-3' // Gene. 1997. V. 187. P. 217-219.
222. Whitehead P.R., Brown N.L. A simple and rapid method for screening bacteria for type II restriction endonucleases: enzymes in Aphanothece halophytica //Arch. Microbiol. 1985. V. 141. No. 1. P. 70-74.
223. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1988. Т. 24. С. 121-124.
224. Posfai G., Szybalski W. A simple method for locating methylated bases in DNA, as applied to detect asymmetric methylation by M.FoklA II Gene. 1988. V. 69. No. 1. P. 147-151.
225. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., Мир: 1979. Р. 145.
226. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М., Мир: 1980. Р. 167.
227. New England Biolabs. Catalog and Technical Reference 2002-03.
228. Abdurashitov M.A., Kileva E.V., Shinkarenko N.M., Shevchenko A.V., Dedkov V.S., Degtyarev S.K. 55-/F5I, an unusual isoschizomer of Fokl II Gene. 1996. V. 172. P. 49-51.
-
Голикова, Лариса Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Кольцово, 2003
-
ВАК 03.00.03
- Обнаружение новой бактериальной системы рестрикции-модификации BstF5I и изучение структуры ДНК-метилтрансфераз этой системы
- Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз
- Система рестрикции-модификации Sse91: клонирование, организация генов и сравнительный анализ структуры белков
- Характеристика систем рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteria-ceae и рода Pseudomonas
- Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз
