Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика систем рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteria-ceae и рода Pseudomonas

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перцев, Александр Владимирович, Пущино

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г.К.СКРЯБИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи

УДК 577.152.3; 577.152.312'14

ПЕРЦЕВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

/

ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКА1ЩИ II ТИПА В КОЛЛЕКЦИИ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIAСЕЛЕ И РОДА PSEUDOMONAS

03. 00. 04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Александр Сергеевич Солонин

Пущино - 1998

Г7 ¡'

ri

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................................................................................8

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................................................10

1.1. Системы рестрикции-модификации прокариот..............................................................................................................10

1.1.1. Явление рестрикции-модификации................................................................................................................................................10

1.1.2. Номенклатура сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз..............................................................................................................11

1.1.3. Классификация ферментов системы рестрикции-модификации..................................................12

1.1.4. Изомеры........................................................................................................................................................................................................................................16

1.1.5. Ферменты системы рестрикции-модификации I типа....................................................................................16

1.1.6. Ферменты системы рестрикции-модификации II типа..................................................................................19

1.1.6.1. Системы рестрикции-модификации Н-Б субкласса.........................................................................22

1.1.6.2. Системы рестрикции-модификации Н-Е субкласса..................................................................25

1.1.7. Системы рестрикции-модификации Ш-го типа........................................................................................................28

1.1.7. Системы рестрикции-модификации ГУ-го типа........................................................................................................32

1.1.8. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации......................................................33

1.1.9. Распространение систем рестрикции-модификации........................................................................................36

1.1.10. Выделение и очистка ферментов рестрикции-модификации..........................................................39

1.1.10.1. Разделение нуклеиновых кислот и сайт-специфических эндонуклеаз......................40

1.1.10.2. Очистка ферментов рестрикции-модификации................................................................................................43

1.1.11. Некоторые физико-химические и энзиматические свойства сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз................................................................47

1.1.11.1. Физико-химические свойства........................................................................................................................................................47

1.1.11.2. Влияние различных факторов на активность эндонуклеаз рестрикции..................48

1.2. Непарные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции......................................................51

1.3. Метилирование ДНК эукариот....................................................................................................................................................................54

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................................................59

II. 1. Материалы.................................................................................................................. . 59

II. 1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, фаговые и плазмидные вектора....................................59

II. 1.2. Среды и основные буферы..........................................................................................................................................................................60

II. 1.3. Материалы и реактивы......................................................................................................................................................................................62

И.2. Методы исследования................................................................................................................................................................................................63

Н.2.1. Поиск штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз..............................................63

И.2.2. Получение бактериальной биомассы.....................................................................64

II.2.3. Выделение плазмидной ДНК..................................................................................................................................................................65

11.2.3.1. Лизис кипячением..............................................................................................................................................................................................65

11.2.3.2. Выделение гшазмид по методу Кадо и Лю................................................................................................................65

11.2.3.3. Лизис щелочью........................................................................................................................................................................................................66

11.2.3.4. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия..........................................................................................................66

И.2.3.5. Удаление примесей РНК из препарата ДНК..........................................................................................................67

IL2.4. Получение препаратов фагов /„vir, /х[857 и <p80vir в высоком титре..................................67

II.2.5. Выделение ДНК фагов Хс1857 и cp80vir................................................................. 67

И.2.6. Периодическое культивирование штаммов....................................................................................................................68

И.2.7. Очистка обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз................................................................69

11.2.8. Определение ферментативной активности

сайт-специфических эндонуклеаз................................................................................................................70

11.2.9. Определение сайта узнавания и места расщепления фосфодиэфирной связи на субстратной ДНК, обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз................................................................................................................70

И.2.10. Определение оптимальных условий реакции для обнаруженных

сайт-специфических эндонуклеаз...............................................................................................................71

11.2.11. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация..................................................72

11.2.12. Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации................................................................................73

11.2.13. Определение локализации генов, обнаруженных систем рестрикции-модификации......................................................................................................................................................................73

И.2.14. Гибридизация плазмидных ДНК..................................................................................................................................................74

II.2.15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).................................................................................75

И.2.16. Скрининг рекомбинантных клонов........................................................................................................................................75

11.2.17. Препаративное выделение фрагментов ДНК........................................................................................................76

11.2.18. Лигирование фрагментов ДНК........................................................................................................................................................76

11.2.19. Фосфорилирование олигонуклеотидных праймеров полинуклеотид-киназой фага Т4....................................................................................................................................................77

11.2.20. Клонирование гена эндонуклеазы R'Eco29)d..........................................................................................................77

11.2.21. Клонирование гена эндонуклеазы R'£co29kI-N6His....................................................................................77

11.2.22. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы M'£co29kI......................................................................7В

11.2.23. Экспрессия гена эндонуклеазы R'£co29kI......................................................................................................................78

11.2.24. Экспрессия гена эндонуклеазы R'£co29kI-N6His..............................................................................................78

11.2.25. Экспрессия гена ДНК-метилтрансферазы M'£co29kI................................................................................79

11.2.26. Очистка эндонуклеазы рестрикции Есо29к\ до гомогенного состояния....................79

И.2.27. Очистка эндонуклеазы рестрикции R'£co29kI-N6His до гомогенного

состояния..............................................................................................................................................................................................................................80

И.2.28. Электрофорез ДНК и белков................................................................................................................................................................81

11.2.29. Определение молекулярного веса R'£co29kI............................................................................................................82

11.2.30. Определение молекулярного веса M'£co29kI..........................................................................................................84

11.2.31. Определение концентрации белка..............................................................................................................................................84

11.2.32. Определение активности ДНК-метилтрансферазы M°£co29kI..................................................84

11.2.33. Статистическая обработка полученных данных..............................................................................................85

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................................................86

III. 1. Поиск, очистка, идентификация и локализация генов систем

рестрикция-модификация в штаммах семейства Enterobacteriaceae

и рода Pseudomonas........................................................................................................................................................86

III. 1.1. Поиск сайт-специфических эндонуклеаз..........................................................................................................................86

III. 1.2. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных в штаммах P. aeruginosa: новый подход к выделению и очистке

эндонуклеаз рестрикции..............................................................................................................................................................................89

III. 1.3. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных

в штаммах семейства Enterobacteriaceae....................................................................................94

III. 1.4. Локализация генов систем рестрикции-модификации II типа

в обнаруженных штаммах-продуцентах..........................................................................................................................97

III.2. Рестрикционное картирование природной плазмиды рЕС029

и клонирование генов системы рестрикции-модификации Есо29к1..........................................100

111.2.1. Рестрикционное картирование плазмиды рЕС029........................................................................................100

111.2.2. Получение штамма-продуцента с увеличенным биосинтезом сайт-специфической эндонуклеазы R2?co29kI........................................................................................................103

111.2.3. Создание штаммов-продуцентов с регулируемым уровнем экспрессии ферментов системы рестрикции-модификации Есо29к\........................................................................104

III. 3. Синтез эндонуклеазы рестрикции Eco29kJ клетками штамма

E. coli К802 [рЕС029А15] в условиях периодического культивирования

на различных питательных средах......................................................................................111

111.4. Выделение и очистка до гомогенного состояния эндонуклеазы

рестрикции R £co29kI и некоторые ее свойства........................................................................................................117

111.5. Очистка эндонуклеазы R £co29kI-N6His.......................................................................................122

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................................................126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................127

ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................................................................................................................................................................................................157

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP - аденозин-5'-трифосфат dATP - дезоксиаденозин-5'-трифосфат dCTP - дезоксицитидин-5'-трифосфат dGTP - дезоксигуанозин-5'-трифосфат dTTP - дезокситимидин-5'-трифосфат А -аденин С - цитозин G - гуанин Т - тимин A (Ala) - аланин С (Cys) - цистеин D (Asp) - аспарагиновая кислота Е (Glu) - глутаминовая кислота F (Phe) - фенилаланин G (Gly) - глицин H (His) - гистидин I (Ile) - изолейцин К (Lys) - лизин L(Leu) - лейцин M (Met) - метионин N (Asn) - аспарагин Р (Pro) - пролин Q (Gin) -глутамин R (Arg) - аргинин S (Ser) - серин Т (The) - треонин W (Тгр) -триптофан Y (Туг) - тирозин

Абоо/ОДбоо - оптическая плотность при 600 нм БСА - бычий сывороточный альбумин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК-аза - дезоксирибонуклеаза

РНК-аза - рибонуклеаза

НТФЛМТР - нуклеозидтрифосфат

АМФ - аденозин-5'-монофосфат

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА/Ыаг-ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ДТТ - дитиотреитол

ДДС-К'а - додецил сульфат натрия

мМ - молекулярная масса

нм - нанометр (оптическая длина волны)

пМ - пикомоль (молекулярная масса)

н.п. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

н.п. - пар нуклеотидов

ПЭГ - полиэтилен гликоль

ПЭГ6000 - полиэтилен гликоль с молекулярной массой 6000

ИПТГ - изопропилтио-(3-В-галактозид (изопропил-1 -тио-Р-О-галактогшранозид)

ПААГ - полиакриламидный гель

а.о. - аминокислотные остатки

Да - дальтон

кДа - килодальтон

Х^а1 -5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-галактозид ОРС - открытая рамка считывания ПЦР - полимеразная цепная реакция

БАМ - Б-Аденозилметионин (8-(5'-дезоксиаденозин-5')метионин) об./мин - скорость вращения ротора

ВВЕДЕНИЕ

Открытие в конце 60-х годов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) вызвало переворот в молекулярной биологии, приведя к появлению и разработке генно-инженерных технологий. К этому времени были уже выделены и подробно изучены такие ферменты как, ДНК-полимераза и ДНК-лигаза, которые позволяли исследователям синтезировать ДНК in vitro и соединять между собой различные фрагменты ДНК, Не было только способов специфически фрагментировать ДНК и поэтому именно открытие сайт-специфических эндонуклеаз (ССЭН) и послужило последней и решающей предпосылкой возникновения генной инженерии.

ССЭН и ДНК-метилтрансферазы (МТ) прокариот позволяют клетке отличать собственную ДНК от чужеродной. Вся ДНК клетки после репликации метилируется МТ в строго определённых участках. Соответствующие ССЭН отличают её по наличию метилированных оснований в этих участках от чужеродной неметилированной ДНК и не подвергают гидролизу. ССЭН и МТ, узнающие одну и ту же последовательность образуют систему рестрикции-модификации (СРМ). Однако только для небольшого числа сайт-специфических эндонуклеаз, выделенных к настоящему времени, доказана принадлежность к СРМ, поскольку МТ, соответствующие эндонуклеазам рестрикции, в большинстве подобных работ не выделялись. Это объясняется тем обстоятельством, что именно ССЭН являются основными инструментами при конструирование рекомбинантных ДНК, практическое же использование МТ весьма ограничено. Однако в последнее время наблюдается растущий интерес к сайт-специфическим МТ, обусловленный главным образом успехами в изучении механизма метилирования.

Выделяют четыре основных типа РМС. Наибольший интерес для генетической инженерии представляют ССЭН СРМ II типа (КФ 3.1.21.4) благодаря своей способности узнавать строго определённые последовательности нуклеотидов. Несмотря на то, что уже известно более 210 прототипов по узнаваемой последовательности на ДНК, поиск их изошизомеров остаётся весьма актуальным. Некоторые изошизомеры обладают целым рядом свойств, делающими их более полезными для работ в генетической инженерии: повышенной стабильностью при хранении и/или при расщеплении ДНК, меньшей штриховой активностью, большей активностью в экстремальных условиях инкубации.

Ферменты СРМ являются также привлекательной моделью для изучения ДНК-белкового и белок-белкового взаимодействия, благодаря широкому разнообразию узнаваемой

последовательности ДНК, высокой специфичности и тому обстоятельству, что для многих ферментов уже известна аминокислотная последовательность и для более 20 белков получены кристаллы.

Для успешного применения ССЭН и МТ, входящих в состав СРМ, важно знать их свойства, а для их получения - свойства штаммов, продуцентов этих ферментов. Несмотря на большое число применяемых в практике эндонуклеаз рестрикции, их свойства недостаточно глубоко изучены, мало сведений и о факторах, влияющих на их биосинтез и эволюцию в бактериальной клетке.

В связи с этим клонирование и определение первичной нуклеотидной последовательности генов, входящих в состав СРМ, компьютерное моделирование, функциональный анализ самих ферментов СРМ направлены на решение важных эволюционных и молекулярно-биологических вопросов. Полученная информация о структурно-функциональных свойствах ферментов и ее анализ открывают возможности разработки подходов в белковой инженерии ферментов СРМ с целью изменения их специфичности.

Цель настоящей работы заключалась в характеристике систем рестрикции-модификации II типа коллекции природных штаммов семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas. Для достижения поставленной цели в данной работе нами решались следующие задачи:

1. Провести поиск, очистку и идентификацию эндонуклеаз рестрикции, относящихся к системам рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas.

2. Провести исследования локализации генов обнаруженных систем.

3. Провести сравнительный анализ плазмид, несущих гены системы рестрикции-модификации II типа у обнаруженных штаммов-продуцентов.

4. Провести физическое картирование природной плазмиды, кодирующей систему рестрикции-модификации II типа Есо29к1 изошизомера Sacll, сконструировать штаммы с увеличенным синтезом ферментов этой системы, получить гомогенный препарат эндонуклеазы рестрикции и охарактеризовать ее каталитические свойства.

Работа выполнена в ВНТК "Молекулярно-генетические основы адаптации микроорганизмов" Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ