Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИКРООРГАНИЗМЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ КАК ИНДИКАТОРЫ АНТРОПОГЕННОГО ВЛИЯНИЯ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "МИКРООРГАНИЗМЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ КАК ИНДИКАТОРЫ АНТРОПОГЕННОГО ВЛИЯНИЯ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ"



Иа правах рукописи

Верхознна Елена Владимировна

Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влиянкя и ііерспектииа нх использования в биотехнологии

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кан/тлата биологических наук

Улан-Удэ - 2003

Работа выполнена в Институте эпидемиологии (■ микробиологии

ГУ нц мэ псиц СО РЛМИ

Наушміі руководитель: локтор медицинских наук, профессор, Санилов Е.Д.

Офи (шальные он попенты:

доктор биологических наук, профессор Вошгиков В.К., кандидат технических паук, доцент Баллаев І І.С

Ведущий организация:

Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится 4 декабря 2003 г. в 14 часов

на заседании Регионального диссертационного Совета Д.М. 212.039.02 Восточно-Сибирского государственного технологического университета по адресу: 670013 г, Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в.

Отзывы в двух- экземплярах, заверенные печатью учреждения, просим отправлять но указанному адресу ученому секретарю Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БСГТУ. Автореферат разослан 3 ноября 2003 г.

Ученый секретарь

Регионального диссертационного Совета,

доктор технических наук . - і Хамнаева Н.И.

Общая характеристик:) работы

Актуальность проблемы. Современное состояние проблемы заключается в оценке антропогенного воздействия на качество воды на начальной, наиболее быстро релакспрующей части трофической цепи -микроорганизмах. Это перспективно и общественно значимо, поскольку позволяет оперативно выявить нарушения и принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов человеческой деятельности на экосистемы. Антропогенное вмешательство в экосистемы крупнейших поверхностных водоемов, таких как оз. Байкал, связано с возможностью необратимых последствий для ныне живущих и будущих поколений, что находится в противоречии с устойчивым экономическим развитием.

Многие исследователи всего мира давно пытаются найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на водные объекты. В данной работе, мы объединили традиционные методы микробиологических исследований с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз определили характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента. Поиск новых штамм о в-проду i ie нто в рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Эндонуклеазы рестрикции [I типа (рестриктазы), благодаря способности фрагментировать ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов, нашли широкое применение в решении научных и прикладных задач (Smith Н. С. Nathans D., 1973; Murrey К,, Hughes S„ G„ 1976; Акулин и др., 1988; Roberts R.J., 1990). Анализ специфичности рестриктаз предполагает существование неоткрытых прототипов этих ферментов (Янулайтис A.A., 1989). Поэтому актуален поиск новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции и изошизомеров известных рестриктаз, поскольку они могут оказаться более биотехнологичными.

Ц116 SACXA '»*Д Неумной лмте^зту;,.-; [

^sg-ЗШО ' Ь

Цель работы — поиск и идентификация новых наиболее перспективных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал, исследование влияния антропогенного фактора на распределение и биологические свойства бактерий, а также отбор наиболее б и отех нелогичных штаммов-продуцентов рестриктаз.

Основные задачи:

1. Выделение бактериальных штаммов из различных экологических ниш оз. Байкал и исследование их биологических свойств: ферментов эндонуклеаз рестрикции и антибиотикорезистентности.

2. Поиск культур микроорганизмов, продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов.

3. Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов >

4. Разработка алгоритма степени устойчивости экосистемы по микробиологическим показателям, позволяющим выявить риск воздействия на экосистему оз. Байкал.

Теоретической значение и научная новизна работы. Впервые разработан н реализован новый биотехнологический подход к оценке антропогенного влияния на олиготрофные водоемы. Проверено 650 штаммов микроорганизмов, выделенных из различных районов оз. Байкал, в 10% которых обнаружена рестриктаэная активность. Проведена идентификация по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Создан алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал по микробиологическим показателям. Установлено, что в районах антропогенного влияния появляются бактериальные штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков и выявляются штаммы бактерий, с новыми ферментами рестриктазами, которые используются в биотехнологических разработках.

Практическая значимость. В работе показана целесообразность использования ферментов эндонукдеаз рестрикции, выделенных и бактериальных штаммах хемоорганоторофлых бактерий как индикаторов антропогенного воздействия. Результаты работы использовались Ан rapo Байкальским Бассейновым Водным Управлением при оценке работ «Современное состояние экосистемы оз. Байкал», а также при рассмотрении «Нормативов предельно допустимых вредных воздействий на экологическую систему оз. Байкал» для обоснования необходимой организации систематических наблюдений за микробиологическими показателями оз. Байкал на водохозяйственных участках поселений. Разработанный алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал, позволит улучшить контроль качества природной воды, а также всей экосистемы Байкала - участка мирового природного наследия - с целью сохранения уникального озера.

Создана коллекция из 650 бактериальных штаммов, включающих 5 штаммов-продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции. Байкальские штаммы-продуценты уникальных и редких ферментов, используются в НПО «Вектор» и ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск) при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal, Bsil, Fcrnl, Sse9D, Cet N!. Штаммы микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus B-7 и Flavabacterium aquaiil B-l зарегистрированы во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов. Коллекционные штаммы микроорганизмов используются при изучении качества воды по бактериальным показателям.

Результаты исследований использованы при выполнении Гранта РФФИ-Байкал (Ms 01-04-97209) и хоздоговорных работ с Администрацией Иркутской области (Влияние антропогенного фактора на качественный состав микроорганизмов и эколого-эпидемиологн ческу ю ситуацию в районе Южного Байкала, 2001-2003 гг.). Материалы диссертации использованы в учебных курсах Иркутского государственного технического университета но

дисциплинам: "Биотехнология», "Техническая микробиология" и "Микробиология",

Апробация работы. Основные защищаемые положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на: второй школе-семинаре молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2001); Молодежной научной школе «Нефть и газ в современном мире: геол о го-экономические и социально-культурные аспекты» (Иркутск, 2001); научно- практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе» (Иркутск, 2002); третьей республиканской школе-конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2003); Всероссийской гидрогеохимической научной конференции «Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири» (Томск, 2003). между народ ном семинаре "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" (Иркутск, 2001); международном совещании проекта бурения Байкала и Хубсугула (Улан-Батор, 2001); на 2-ой международной научно- практической конференции «Энергосберегающие и природоохранные технологии» (Улан-Удэ, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано Ы работ. Струюура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения и основных выводов, приложения, изложена на 130 страницах, включает 13 рисунков, 21 таблицу и библиографию из 196 наименований, 97 из которых иностранные авторы.

Основное содержание работы Литературный обзор Микроорганизмы рассмотрены как индикаторы антропогенных воздействий на экосистемы водоемов, в том числе и на озеро Байкал. Дан анализ современного состояния проблемы — поиску штаммов- продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди микроорганизмов, выделенных из различных

природных изолятов, Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся бело к-нуклеиновых взаимодействий. Исключительное значение специфических эндонуклеаз обусловлено в первую очередь той ролыо, которую зги ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-¡енетических исследованиях и генной инженерии. Дальнейшее развитие этих ведущих направлении современной биологической науки и их прикладных приложений, имеющих самое непосредственное отношение к решению биотехно логических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.

Объекты, методы и объем выполненных исследований

Объектами исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из различных экологических ниш оз. Байкал. Рассмотрены методы, объем выполненных исследований и достоверность полученных результатов.

Пробы воды и донных отложений из озер Байкал отбирали с разных глубин водной толщи в чистых фоновых районах и в районах антропогенного влияния. Пробы воды засевали методом глубинного посева, донные отложения - методом предельных разведений. В качестве питательной среды использовали мясопептонный а1~ар. Культивнрование бактерий проводили при температуре 22°С в течение 48 ч. Выросшие колонии расчищали и отсевали в пробирки на поверхность питательного агара, инкубировали 20 ч. при 25"С. Культуры идентифицировали по Берги (1980).

Для поиска рестриктаз, бактерии пересевали на другую чашку Петри с питательным агаром и вырашнвалн 10 час., при 22°С. Штаммы, в которых обнаруживали рестриктазную активность, рассевапи штрихом для получения клонов и их последующего исследования. Поиск рестриктаз проводили в культурах после экспозиции, равной 12 ч. Наличие рестриктаз определяли,

как описано в методиках (Белавни, 1988; Дедков и др., 1990). Выделение рестриктаз и поиск сайтов их узнавання, осуществляли в НПО «Вектор» и «ОООСибЭнзим» сотрудниками; B.C. Дедковым и Д.Л. Гончаром.

При исследовании проб воды, на санитарно-микробиологический анализ, использовали методики МУК 4,2.671-97, основанные на разработках СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода», а также «Гигиена окружающей среды» (нормативно-методические документы, 1991).

Основные результаты исследований отражены в следующих защищаемых положениях:

I. Исследование Риторических свойств бактериальных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал показало, что в прибрежных районах, испытывающих антропогенное влияние наблюдается увеличение численности хемоорганоторофных бактерий. появление грамотрииательных штаммов, а также наличие бактерий, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. В пробах глубоководных осадков и чистых фоновых районах Байкала таких штаммов не выявлено

В последние годы в результате социально-экономической перестройки, антропогенное влияние на озеро Байкал усиливается с каждым голом. Особенно, это касается поселка Листвянка, расположенного в истоке реки Ангары. Ото обусловлено не только относительно высокой плотностью проживающего здесь населения, но и интенсивным развитием отечественного и международного туризма, строительством частных гостиниц, бань, саун, дачных домов, ресторанов и закусочных, которые не имеют ни очистных сооружений, ни выгребных ям и т.д. Часто хозяйственно- бытовые стоки и пищевые отходы, а также стоки из бань и саун сбрасываются в озеро Байкал или его притоки без какой- либо очистки. Результаты исследований показали, что в воде Байкала и в истоке р. Ангары выявлены нехарактерные для озера бактерии. Встал вопрос о контроле поступления хозяйственно- бытовых стоков частных гостиниц, бань, саун.

построенных прямо на берегу озера, утилизация пищевых отходов от ресторанов и закусочных в береговой зоне. Наблюдается не только при внос посторонней микрофлоры в воду озера, но и поставка легко минерализуемого органического вещества, являющегося питательной средой для микроорганизмов.

Нашими исследованиями, проведенными в 2001*2000 гг. установлено, что саннтарно-биологическая характеристика байкальской воды в районе п. Листвянка и в истоке реки Ангары характеризуется явно выраженной сезонной динамикой. Количество, растущих при 22°С и считающихся естественным и обитателями водоемов, достигает максимума в летний период. Количество бактерий-сапрофитов, растущих при 37°С (общее микробное число - ОМЧ) и считающихся условно-патогенной микрофлорой, во все сезоны было примерно на порядок ниже, чем показатель сапрофитов, растущих при комнатной температуре, но максимальные значения были отмечены также в летний период. То же касается и бактерий группы кишечной палочки.

Используя классификацию В.Н. Жукинского (1981) качество воды в пелагиали оз. Байкал можно охарактеризовать как предельно-чистую, на водозаборе - как чистую, а в истоке Ангары и в прибрежных водах Байкала (район п. Листвянка) как вполне чистую, т.е. качество воды в прибрежных районах гораздо ниже.

Таким образом, имеющиеся данные показывают, что микробный фон Байкала неоднороден и зависит во многом от использования водоема человеком. Район южной оконечности озера Байкал, особенно п. Листвянка и исток р. Ангары наиболее подвержен влиянию антропогенного фактора. Наблюдается увеличение численности гетеротрофных бактерий в несколько раз, появление в летне-осенний период в воде группы кишечной палочки. Общее микробное число возрастает в осенний и, особенно в летний период. Обращает на себя внимание факт появления кишечной палочки в этом

районе и увеличения численности хемоорганотрофиих бактерий по сравнению с даже с 90-ми голами.

На антибиотикорезистснтпость исследовано 120 штаммов, выделенных при обследовании водозабора р. Ангары, ее истока, прибрежной зоны 01. Байкал и кернов его доншлх осад к о п. Использовались антибиотики как широкого спектра действия, так и с выраженной активностью но отношению к трамотрнцатслЕ>ной микрофлоре: тетрациклин, ампициллин, стрептомицин, полимсксин, хлоранфеникол, невиграмои, гентаминип, рифамиции, нефа юл ип, котримаксазол, нефатокенн, исфлаксоцин, диоксидин, канамишш. Анализ материалов пройден по двум группам: чувствительные и устойчивые.

Проведенные исследования показали, что антибиотикоустойчивые штаммы были пыявлены на всех станциях в рзйоне н. Листвянка. В летний период из озера Байкал были выявлены грамотрицательные бактерии, устойчивые ко многим антибиотикам. Количество нгтаммоп, устойчивых к б и более антибиотикам п озере Байкал составила 26%, п истоке реки Ангары 18%, на л о до заборе 45% от количества исследованных. Штаммы, выделенные из истока р. Ангары, обнаруживают большую чувствительность, чем микроорганизмы оз. Байкал, которые, в спою очередь, Солее чувствительны, чем микроорганизмы выделенные с водозабора. На водозаборе грам отрицательных бактерий не выявлено, грам положительные палочки составляют 55%, грамположительные кокки- 45%. В истоке р. Ангары количество грам отрицательных палочек составил 27%, грамиоложитсльных палочек - 46%, а грамположитсльных кокков — 27%. В оз Байкал гр&мотрицагсльнме палочки составляли 13%, грамположительные палочки - 36%, а грамположительные кокки - 33%. Наиболее эффективное воздействие обнаруживхт гентамицин и цсфазолин. Количество штаммов, чувствительных к ним, составило 67% и 59%. Устойчивых к действию всех

антибиотиков был 1% от всех выделенных штаммов, чувствительных ко всем антибиотикам в водной среде 6%, вместе с кернами донных осадков 21%,

Таким образом, микроорганизмы, выделенные в районе антропогенного влияния (район п. Листвянка) изменяют свои биологические свойства, 11оявляются штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков. Штаммы, выделенные из кернов донных осадков оз. Байкал, характеризуются высокой чувствительностью практически ко всем антибиотикам, использованным в опыте.

2. Пписк культур микроорганизмов, продуцентов полых ->ндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов показа-;, что бактерии-прод\уенты новых ферментов рестрикции обнаружены только в антропогенных районах т Байкал. В чистых фоновых районах Байкала, пробах глубоководных осадков, где нет антропогенного во ^действия, таких бактерий не выделено

Поиск штаммов новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) обусловлен в первую очередь той ролью, которую эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетнческих исследованиях вообще и генетической инженерии в частности. Дальнейшее развитие этих ведущих направлений современной биологической науки и их прикладных значений, имеют самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем. Во многом это зависит от доступности широкого ассортимента рестрнктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.

Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них были выявлены ферменты с новой специфичностью (Дегтярев и др., 1987). Поиск эндонуклеаз рестрикции обусловлен тем, что выявленные новые штаммы бактерий, продуцирующие этн ферменты новые, редкие или более биотехнологичны, чем известные.

Из различных регионов оз. Байкал была составлена коллекция из более 650 штаммов микроорганизмов выделенных из различных экологических ниш: водной толщи, донных осадков и кернов глубинного бурения. Проведены исследования по тестированию культур микроорганизмов по наличию или отсутствию в них новых ферментов рестрпктаз. Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема поиска новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции.

Ферменты эндонунклеаз рестрикции выявляются не во всех исследованных иггаммах, а лишь в 10% проанализированных штаммов, выделенных из воды и в 5% штаммов, выделенных из донных осадков. В штаммах бактерий, выделенных из чистых участков озера, все обнаруженные нами рестриктазы являются хорошо известными, т.е. продуценты-бактерии их существовали давно и не только на Байкале. К таким «непродуктивным» районам относятся штаммы микроорганизмов, выделенные из скважины глубоководного бурения «Байкал-93», возраста около 500 тыс. лет.

За период 2001-2003 гг. из района п. Листвянка, истока р. Ангары и района Малого моря выделили и проанализировали около 350 штаммов бактерий. Эндонуклеазы рестрикции были обнаружены лишь в 33 штаммах.

Причем они не являлись новыми, хотя многие из них являются довольно редкими. Обращает на себя внимание факт идентичности ферментов, определенных в штаммах бактерий, выделенных из района Малого моря.

Сравнение состава бактериопланктона по наличию или отсутствию ферментов оидонуклеаз рестрикции позволяет оцепить изменение структуры бактериопланктона и дает качественную индикацию влияния антропогенного загрязнения. За время исследования бактерии - продуценты неизвестные ранее рестриктаз, были обнаружены в районах антропогенного влияния. Так, например, штамм бактерий Flavobacterium aquati! - продуцент рестриктазы Fau I был выделен нз воды оз. Байкал в районе п. Листвянка. Штамм бактерии Acinetobacter calcoaceücus - продуцент рестриктазы Аса 1 был выявлен в районе г. Банкальска. Продуцент Bacillus sphaericus эндонуклеазы рестрикции Bsi I, который является новым ферментом среди известных рестриктаз, был выделен из этого же района. В районе истока-р. Ангары выделен штамм бактерии Cittrobacteriwtt citrium, продуцент CciNI, который является иэошизомером Not I (табл. 1).

Таблица 1

Штаммы- продуценты новых рестриктаз

Район Год Вид Рестриктаза Сайт узнавания

БаЙкальск 1991 Flavobacterium aquatil Fau I 5-CCCGC-3'

1991 Acinetobacter calcoaceticus Аса I 5'-CCANTGG-3'

Листвянка 1995 Curtobacterium citreum CciNI 5'-GCGGCCGC-3'

1992 Bacillus sphaericus Bsi 1 5'-CTCGNG-3'

1998 Sporosarcina sp 9D Sse91 5'-AATT-3'

Полученные результаты дают основание полагать, что прибрежная часть Байкала, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для появления продуцентов штаммов эндонуклеаз рестрикции.

3. Изучение спектра ферментов чндонуклеаз рестрикции бактериальных штаммоя noifíoiiLW выявить наличие новых (Fanl. Acal. Bs'tl). а также весьма редких ферментов рестрикции (Sce9l. CciN П.

Выявлено, что в выделенных штаммах встречаются эндонуклеазы рестрикции как широко распространенные, так и новые. Среди байкальских штаммов, выявленных в районах антропогенного влияния, обнаружены микроорганизмы, дающие специфическую фрагментацию ДНК (рис. 2). Как видно из рисунка, на восьмой дорожке нанесен лизат бактерии, продуцирующей фермент-изошизомер рестриктазы Clal (сайт узнавания ATCGAT). Штамм относится к виду Pseudomonas gladioli, а фермент, продуцируемый им, называется Pga 1, согласно общепринятой номенклатуре.

Определение остальных микроорганизмов, лизаты которых расщепляют ДНК, позволило отнести их к видам Flavobacieriwn aqitatil (дорожка 2), Ha/nia alvei (дорожка 4), Acinetobacter calcoaceticits (дорожка 6). Ферменты названы соответственно: Fanl, Hall, Hall), Acal. Предварительный анализ субстратной специфичности этих рестриктаз с помощью сопоставления картин гидролиза ДНК фага L Cl 857 с рассчитанными теоретически для различных ферментов (Roberts R.J., Macelis D. 1993) показал, что Hal 1 и Hal 11 по-видимому, являются изошизомерами рестриктаз Eco R 1 и Pst 1 соответственно, а Аса I узнает и расшепляет последовательность CCA(N)jTTG, являясь изошизомером рестриктазы РЯМ1. Определенные нами штаммы ранее не были описаны как продуценты рестриктаз. В штаммах Hafnia alve ж Flavobacterium aquatile рестриктазы выявлены впервые.

Среди микроорганизмов рода Pseudomonas ранее не было обнаружено продуцентов ферментов, способных узнавать и расщеплять последовательность ATCGAT, хотя это один нз наиболее «богатых» рестриктазами видов. Вид A. calcoaceticits менее изучен, но продуцентов ферментов, способных расщеплять ДНК по последовательности

CCA(N)sTGG до наших исследований п нем не обнаруживали. Также, из байкальской воды был ни делен штамм Curiobacterium citreum. Определенная в нем рестриктаза Cci N1 (cafir узнавания 5*-GCGGCCGC-3l) я ¡шлется нзоншзомером Notl.

I Z S Ъ $ 6 т 2 9

Рис. 2. Фотография геля после элскрофорсза продуктов

гидролиза Д1 ]К лизатами различных микроорганизмов

1 >2-Fhivobacterium aquatile (Fan I); 3,A-Hafnia alwi (Hal I); 5%6-Acinciobactcr calcoaceticus (Аса I); 7t8-Pseuciomonas gladioli (1'g.a 1); 9-к ДНК добавлено 2 ca. фермента Cla 1.

Позже, при изучении микроорганизмов водного происхождения нами был обнаружен штамм Sporosarcina sp. 9D, являющийся продуцентом эндонуклеази рестрикции (рсстриктазы) Ssc91, (сайт 5'-ЛЛТТ-3'). Новая эндонуклеаза рестрикции Ssc 9D является еще одним новым ферментом из байкальской коллекции и испитым тошизомером рсстриктазы Tsp 5091, выделяемой из штамма Thermits sp. 509 (Roberts et al., 1994). В отличие or прототипа, новый фермент работает при температуре 55°С и нпактипирустся

при 65°С в течение 20 мин. Это позволяет по окончании обработки ДНК рестрнктазой просто прогреть инкубационную смесь, а не проводить -дополнительную фенольную экстракцию в том случае, если продукты гидролиза необходимо использовать для дальнейших экспериментов. Важной особенностью этого фермента является его способность образовывать продукты гидролиза с 5'-вы ступающим и липкими концами, комплементарными липким концам, образующимся при гидролизе ДНК рестриктазами EcoRI (5'-GAATTC-3') и Acsl (5'-RAA'rTY-3'), где R-A или G; Y-T или С.

Выявленные нами штаммы легко культивируются и технологичны при производственном получении рестриктаз. Обнаруженные эндонуклеазы рестрикции можно использовать во многих экспериментах в области молекулярной биологии и генетической инженерии.

4. Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов показало, что бактерии, активны и могут притшать участие в деструкиии многих органических соединений в Байкале,

Из воды в районе антропогенного влияния (п. Листвянка) было выделено 200 штаммов. Из них- 177 штамма было доведено до рода, до вида-23. Преобладающей формой бактерий является р. Pseudomonas (34%), р. Microccocus (15%), р. Bacillus (12%), р. Clostridium {9%), p. Flavobacterium (5%), p. Acinetobacter (4%).

К роду Pseudomonas отнесено 47 штаммов бактерий, из них 5 культур определено до вида: Ps. aeruginosa, Ps. cepacia, Ps. stutzen, Ps, fluorescens, Ps. alcaligenes. Спорообразующие палочки, выделенные из фунтов, отнесены к роду Clostridium, по принципу разжижать желатину ко 2 группе. Подвижные спороносные грамположительные палочки отнесены к роду Bacillus, 4 штамма определено до вида: Б. pumilus, В. megatherium, В. circulons, В. subtiiis. Два штамма неспорообразующих, грамотрицательных палочек

отнесены к роду Bacteroides, 3 штамма-к роду Chromobacterium и 19-к р. Fiavobactertum. Из них 4 — определено до вида: Fl. rigense, Fl. capsulalum, Fl, ferrugenium, FL aquarile. Из 3 штаммов Chromobacterium, один определен до вида: Ch, ItvUUum. Двадцать два штамма кокковых форм отнесены к роду Micrococcus, один из них определен до вида: Л/. luteus. Из 23 определенных до вида культур, грамотрнштельные палочки составляли 52 %, грамположительные палочки — 35 %, Грам положительные кокки - 4 %, грамотрицательные кокки - 9%

Наряду с определением видового состава, представляло интерес выяснить биохимические свойства микроорганизмов. Оказалось, что протест из желатина осуществлялся почти всеми культурами (94%), пептонизацкя молока наблюдалась у 55% штаммов. Выявлено, что 33% культур гадролизуют крахмал, 39% восстанавливает нитраты, индол образуют 6%. Образование сероводорода наблюдается у 56% штаммов, ацетил метил карб ннола-44,6%. Способность усваивать минеральный азот найдена только у 11% культур. Многие штаммы сбраживают углеводы с подкислен нем среды.

Определение катал агн ой, оксидазной, амилазной к дегидрогеназной активности активности показало, что можно составить следующий ряд активности: катал аз ная—»амилазная—юксндазная—1► дегидрогеиазная. Количество активных штаммов, обладающих каталаэной активностью, составляет 99%, амилолнтической активностью-85%, оксидазной 65%, де гидрогеназно й-3 6%.

Таким образом, штаммы микроорганизмов, выделенные из воды Байкала, активны и могут принимать участие в деструкции многах органических соединений. Бактериям, с их высокой ферментативной активностью а, следовательно, главным участием, в биогеохимических циклах в водоемах, принадлежит основная роль.

5. Разработанный алгоритм степени устойчивости экосистемы ot Байкал по микробиологическим показателям позволяет выявить риск антропогенного воздействия на начальной стадии.

Исследователи всего мира сталкиваются с общей проблемой выделения антропогенных изменений на фоне естественной природной изменчивости н экосистемах и давно пытаются решить проблему - найтн способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на волпые объекты. Мы объединили традиционные методы исследований в микробиологии с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестрнктаз «определили характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента. Бактерии - продуценты новых рестрнктаз были выделены из озера Байкал в районах антропогенного влияния (вблизи п. Листвянка и г. Байкальска).

В настоящее время в мире известно более 1500 типов рестрнктаз с различной степенью активности, т.е. способных с той или иной скоростью разрывать определенные, специфические последовательности двойной спирали ДНК. Очевидно, что специфичность рестриктазы определяет характеристику бактерии, из которой она выделена. Поэтому, этот фермент может служить характеристикой специфичности самой бактерии продуцента. Многолетние исследования, начиная с 50-х голов, лают основание считать такую характеристику эндемизма бактерий не менее достоверной, чем морфолотческие отличия и физиолого-биохимнческие признаки.

В результате проведенной работы, предложен алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал (рис. 3), который позволит делать своевременные прогнозы по влиянию антропогенного фактора на качество воды в оз. Байкал. Это - появление кишечной палочки и микрофлоры, устойчивой ко многим антибиотикам, повышенное количество хемоорганотрофных бактерий (сапрофитов), а также выявление бактерий-продуцентов новых и редких ферментов (эндонуклеаз рестрикции).

Рис. 3. Схема алгоритма степени устойчивости экосистемы озера Байкал по состоянию микробного сообщества

Заключение

Проведенные исследования с использованием методов физико-химической биологии при решении экологических задач позволяют судить о качественном изменении микроорганизмов в прибрежной части Байкала, находящейся под антропогенным влиянием. Возможно, что результаты исследований будут способствовать решению проблемы надежности индикации антропогенного загрязнения в биологической части трофической цепи. С другой стороны, полученные результаты дают основание предположить, что прибрежная часть Байкала, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для возникновения продуцентов штаммов эндонуклеаз рестрикции, широко используемых в биотехнологии.

Выводы:

1. Выявлено, что в прибрежной части оз, Байкал появляются штаммы-продуценты новых ферментов эндоэндонуклеаз рестрикции. В пелагиали озера и в кернах донных осадков таких бактерий не найдено. Возникновение новых рестриктаз в штаммах бактерий, выделенных из районов антропогенного влияния, является результатом бактериальных мутаций.

2. Биологические свойства выделенных штаммов в районах антропогенного влияния изменены и по другим показателям. Часть штаммов, выделенных из антропогенных районов, отличается устойчивостью к широкому спектру антибиотиков в отличие от микроорганизмов, выделенных из чистых фоновых районов и кернов осадков оз. Байкал.

3. Создана коллекция бактерий, обладающих новыми и редкими ферментами - эндонуклеазами рестрикции. Пять штаммов идентифицированы как Flavobacterium aquatil, Acinetobacter calcoaceftcus, Curtobacterium citreum, Bacillus sphaeriem, Sporosarcina sp 9D.

4. Штаммы - продуценты новых эндонуклеаз рестрикции используются при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal„ Bsii, Fanl, Sse9D, Cci NI фирмой ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск).

5. Установлена таксономическая принадлежность 200-х бактериальных штаммов, выделенных из прибрежных районов вблизи поселений, 23 штамма определены до вида, остальные до рода.

6. На основе полученных результатов, разработан алгоритм степени устойчивости экосистемы озера Байкал по микробиологическим показателям, позволяющий выявить риск антропогенного воздействия на качество воды оз. Байкал.

7. Показана целесообразность применения ферментов эндонуклеаз рестрикции бактериальных штаммов как тестов на антропогенное влияние на начальном этапе изменения экосистемы оз. Байкал, что необходимо для обоснования организации систематических .. наблюдений за микробиологическими показателями оз. Байкал на водохозяйственных участках поселений,

8. Новый биотехнологическнй подход оценки антропогенного влияния на качество природной воды оз. Байкал на наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи - микроорганизмах, перспективен, поскольку позволит оперативно принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов деятельности в прибайкальских зонах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ver kh im na V.A., Vcrkhozina E.V., Conchar D.A., Dedkov V.S., Degtyarev S.Kh„ Kusncr Yu.S. Qualitative characteristics of bacteria strain of water body and bottom sediments of lake Baikal// International workshop for the Baikal @ Hovsgol drilling project in Ulaanbaatar. Abstracts. Ulaanbaator, Mongolia, 2001. P. 76- 77.

2. Верхозпна E.IÍ. Проблемы чистой воды и рационального использования водных ресурсов озера Байкал. // 2-ая школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона». Улан- Удэ, 2001, С. 144-148.

3. Верхозпна В. Д., Верхозпна Е.В., Кус не р Ю.С. Принятие решений в управлении экосистемы озера Байкал. //Теория, методы и инструменты принятия решений в живых, социальных и технических системах. 19-ый международный семинар "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" Иркутск. 2001. С. 85-89.

4. Верхозпна В.А., Верхозпна Е.В. Микроорганизмы- индикаторы антропогенных изменений в экосистеме озера Байкал. //Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе. Иркутск, 2002, С. 132- 137 С.

5. Верхозпна Е.В., Верхозина В.А. Изучение геохимической деятельности углеводородокиеляющих микроорганизмов на нефтяных месторождениях и в биодеструкнионных процессах // Молодежная научная школа «Нефть и rao в современном мире: геолого- экономические и социально-культурные аспекты». Иркутск, 2001. С. 41-43.

6. Верхозпна Е.В., Верхозпна В.А. Изучение геохимической деятельности углеводородокиеляющих микроорганизмов на нефтяных месторождениях и в биодеструкционных процессах. //Нефть и газ в современном мире; геолого- экономические и социально-культурные аспекты. Иркутск, 2002. С. 153-165.

7. Верхозпна Е.В., Верхозпна В.А., Гудков С.С., Емельянов Ю.Е., Рязанова И.И., Шкетова Л.Е. Биогеохимические процессы транс форм aim и металлов с участием микроорганизмов и их использование в биотехнологических разработках. //Вестник ИрГТУ. № 12. 2002. С. 65-71.

Верхознна 1С.В., Верхознна В.Л., Ошилов Е.Д. Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии //Сибирь- Восток. 2003, № 8. С. 11-15.

9. Лстафъев В.А., Мамонтов» JJ.M, , Савнлов Е.Д., Верх own а H.A., Верхознна E.H., Максимова Э.А., Крайкнискан O.Ii., Гуйткишч It.Я., Тимошенко АЛ. Загрязнение вод бассейна oiepa Байкал патогенными вирусами// Сибирь- Восток. 2003. С. 23-24.

10.Верхознна В.А., Верхознна К.13., Гончар Д.А., Дедков И,С., Дегтярев С.Х., Куснср Ю.С. Микроорганизмы озер Байкал и I h.nca как индикаторы антропогенного влиянии и перспектива их использовании в биотехнологии // Прикладная Биохимия и микробиология 2003. №3.

И.Астафьев В.А. Мамонтова J1. М., Савнлов ЕЛ., Верхознна В.А.,, Максимова Э.А, Кранкинская О.В., Рубаноинч И.Я., Тимошенко АЛ. Загрязнение бассейна озера Байкал патогенным» вирусами. //'Сибирь-Восток. 2003.X« 8. С. 23-24,

12.Верхознна Е.В,, Верхознна В.А., Савнлов Е.Д, Мамонтова Л.М, Астафьев В.А, Оценка качества воды озера Байкал по микробиологическим показателям // Сибирь- Восток, № 10. С. 24-19.

13.Верхознна В.А., Верхознна Е.В. Куснср Ю.С. Промессы азотфнксанни и денитрификации в озере Байкал, их влияние на качество воды и общий баланс азота в экосистеме //Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири. //Материалы научной конференции, посвященной 100-летию профессора Томского политехи, ун-та П.А.Улолова. Томск: ГПУ. 2003. С. 220-222.

14.Верхознна Е.В, Верхознна H.A. Принятие решений н методы оценки состояния экосистемы озера Байкал. //Молодежь и пути России к устойчивому развитию. Третья республиканская школа-конференция. Институт физики СО РАН. 2003. С. 35-37.

Подписано к печати 2,11.03. Формат 60\34Лб Уся печ. листов 1,3, Тираж НЮ Зака) 165 Отпечатано в ИЗК СО РАН

$21346