Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии"

На правах рукописи

Верхозина Елена Владимировна

Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ - 2003

Работа выполнена в Институте эпидемиологии и микробиологии ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Савилов Е.Д.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Войников В.К., кандидат технических наук, доцент Балдаев Н.С.

Ведущая организация:

Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится 4 декабря 2003 г. в 14 часов

на заседании Регионального диссертационного Совета Д.М. 212.039.02 Восточно-Сибирского государственного технологического университета по адресу: 670013 г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью учреждения, просим отправлять по указанному адресу ученому секретарю Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГТУ. Автореферат разослан 3 ноября 2003 г.

Ученый секретарь

Регионального диссертационного Совета,

доктор технических наук <э£ Хамнаева Н.И.

¿00 О" м

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Современное состояние проблемы заключается в оценке антропогенного воздействия на качество воды на начальной, наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи -

позволяет оперативно выявить нарушения и принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов человеческой деятельности на экосистемы. Антропогенное вмешательство в экосистемы крупнейших поверхностных водоемов, таких как оз. Байкал, связано с возможностью необратимых последствий для ныне живущих и будущих поколений, что находится в противоречии с устойчивым экономическим развитием.

Многие исследователи всего мира давно пытаются найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на водные объекты. В данной работе, мы объединили традиционные методы микробиологических исследований с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз определили характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента. Поиск новых штаммов-продуцентов рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Эндонуклеазы рестрикции II типа (рестриктазы), благодаря способности фрагментировать ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов, нашли широкое применение в решении научных и прикладных задач (Smith Н. С. Nathans D., 1973; Мштеу К., Hughes S., G., 1976; Акулин и др., 1988; Roberts R.J., 1990). Анализ специфичности рестриктаз предполагает существование неоткрытых прототипов этих ферментов (Янулайтис A.A., 1989). Поэтому актуален поиск новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции и изошизомеров известных рестриктаз, поскольку они могут оказаться более биотехнологичными.

микроорганизмах. Это перспективно и общественно значимо, поскольку

Цель работы - поиск и идентификация новых наиболее перспективных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал, исследование влияния антропогенного фактора на распределение и биологические свойства бактерий, а также отбор наиболее биотехнологичных штаммов-продуцентов рестриктаз. Основные задачи:

1. Выделение бактериальных штаммов из различных экологических ниш оз. Байкал и исследование их биологических свойств: ферментов эндонуклеаз рестрикции и антибиотикорезистентности.

2. Поиск культур микроорганизмов, продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов.

3. Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов

4. Разработка алгоритма степени устойчивости экосистемы по микробиологическим показателям, позволяющим выявить риск воздействия на экосистему оз. Байкал.

Теоретической значение и научная новизна работы. Впервые разработан и реализован новый биотехнологический подход к оценке антропогенного влияния на олиготрофные водоемы. Проверено 650 штаммов микроорганизмов, выделенных из различных районов оз. Байкал, в 10% которых обнаружена рестриктазная активность. Проведена идентификация по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Создан алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал по микробиологическим показателям. Установлено, что в районах антропогенного влияния появляются бактериальные штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков и выявляются штаммы бактерий, с новыми ферментами рестриктазами, которые используются в биотехнологических разработках.

» . к , 1< ■

' а* ; ;

> » 4

Практическая значимость. В работе показана целесообразность использования ферментов эндонуклеаз рестрикции, выделенных в бактериальных штаммах хемоорганоторофных бактерий как индикаторов антропогенного воздействия. Результаты работы использовались Ангаро-« Байкальским Бассейновым Водным Управлением при оценке работ

«Современное состояние экосистемы оз. Байкал», а также при рассмотрении ■ «Нормативов предельно допустимых вредных воздействий на экологическую

систему оз. Байкал» для обоснования необходимой организации систематических наблюдений за микробиологическими показателями оз. Байкал на водохозяйственных участках поселений. Разработанный алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал, позволит улучшить контроль качества природной воды, а также всей экосистемы Байкала - участка мирового природного наследия - с целью сохранения уникального озера.

Создана коллекция из 650 бактериальных штаммов, включающих 5 штаммов-продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции. Байкальские штаммы-продуценты уникальных и редких ферментов, используются в НПО «Вектор» и ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск) при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal, Bsil, FanI, Sse9D, Cci NI. Штаммы микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus B-7 и Flavabacterium aquatil B-l зарегистрированы во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов. Коллекционные штаммы микроорганизмов используются при изучении качества воды по бактериальным показателям.

Результаты исследований использованы при выполнении Гранта РФФИ-Байкал (№ 01-04-97209) и хоздоговорных работ с Администрацией Иркутской области (Влияние антропогенного фактора на качественный состав микроорганизмов и эколого-эпидемиологическую ситуацию в районе Южного Байкала, 2001-2003 гг.). Материалы диссертации использованы в учебных курсах Иркутского государственного технического университета по

дисциплинам: "Биотехнология», "Техническая микробиология" и "Микробиология".

Апробация работы. Основные защищаемые положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на: второй школе-семинаре молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2001); Молодежной научной школе «Нефть и газ в современном мире: геолого-экономические и социально-культурные аспекты» (Иркутск, 2001); научно- практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе» (Иркутск, 2002); третьей республиканской школе-конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2003); Всероссийской гидрогеохимической научной конференции «Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири» (Томск, 2003).международном семинаре "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" (Иркутск, 2001); международном совещании проекта бурения Байкала и Хубсугула (Улан-Батор, 2001); на 2-ой международной научно- практической конференции «Энергосберегающие и природоохранные технологии» (Улан-Удэ, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения и основных выводов, приложения, изложена на 130 страницах, включает 13 рисунков, 21 таблицу и библиографию из 196 наименований, 97 из которых иностранные авторы.

Основное содержание работы Литературный обзор Микроорганизмы рассмотрены как индикаторы антропогенных воздействий на экосистемы водоемов, в том числе и на озеро Байкал. Дан анализ современного состояния проблемы - поиску штаммов- продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди микроорганизмов, выделенных из различных

б

природных изолятов. Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся белок-нуклеиновых взаимодействий. Исключительное значение специфических эндонуклеаз обусловлено в первую очередь той ролью, > которую эш ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-

генетических исследованиях и генной инженерии. Дальнейшее развитие этих ведущих направлении современной биологической науки и их прикладных приложений, имеющих самое непосредственное отношение к решению био технологических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.

Объекты, методы и объем выполненных исследований

Объектами исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из различных экологических ниш оз. Байкал. Рассмотрены методы, объем выполненных исследований и достоверность полученных результатов.

Пробы воды и донных отложений из озер Байкал отбирали с разных глубин водной толщи в чистых фоновых районах и в районах антропогенного влияния. Пробы воды засевали методом глубинного посева, донные отложения - методом предельных разведений. В качестве питательной среды использовали мясопептонный агар. Культивирование бактерий проводили , при температуре 22°С в течение 48 ч. Выросшие колонии расчищали и

отсевали в пробирки на поверхность питательного агара, инкубировали 20 ч. при 25°С. Культуры идентифицировали по Берги (1980).

Для поиска рестриктаз, бактерии пересевали на другую чашку Петри с питательным агаром и выращивали 10 час., при 22°С. Штаммы, в которых обнаруживали рестриктазную активность, рассевали штрихом для получения клонов и их последующего исследования. Поиск рестриктаз проводили в культурах после экспозиции, равной 12 ч. Наличие рестриктаз определяли,

как описано в методиках (Белавин, 1988; Дедков и др., 1990). Выделение рестриктаз и поиск сайтов их узнавания, осуществляли в НПО «Вектор» и «ОООСибЭнзим» сотрудниками: B.C. Дедковым и Д.А. Гончаром.

При исследовании проб воды, на санитарно-микробиологический анализ, использовали методики МУК 4.2.671-97, основанные на разработках СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода», а также «Гигиена окружающей среды» (нормативно-методические документы, 1991).

Основные результаты исследований отражены в следующих защищаемых положениях:

1. Исследование биологических свойств бактериальных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал показало, что в прибрежных районах, испытывающих антропогенное влияние наблюдается увеличение численности хемоорганоторофных бактерий, появление грамотрицательных штаммов, а также наличие бактерий, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. В пробах глубоководных осадков и чистых фоновых районах Байкала таких штаммов не выявлено

В последние годы в результате социально-экономической перестройки, антропогенное влияние на озеро Байкал усиливается с каждым годом. Особенно, это касается поселка Листвянка, расположенного в истоке реки Ангары. Это обусловлено не только относительно высокой плотностью проживающего здесь населения, но и интенсивным развитием отечественного и международного туризма, строительством частных гостиниц, бань, саун, дачных домов, ресторанов и закусочных, которые не имеют ни очистных сооружений, ни выгребных ям и т.д. Часто хозяйственно- бытовые стоки и пищевые отходы, а также стоки из бань и саун сбрасываются в озеро Байкал или его притоки без какой- либо очистки. Результаты исследований показали, что в воде Байкала и в истоке р. Ангары выявлены нехарактерные для озера бактерии. Встал вопрос о контроле поступления хозяйственно- бытовых стоков частных гостиниц, бань, саун,

построенных прямо на берегу озера, утилизация пищевых отходов от ресторанов и закусочных в береговой зоне. Наблюдается не только привнос посторонней микрофлоры в воду озера, но и поставка легко минерализуемого органического вещества, являющегося питательной средой для микроорганизмов.

Нашими исследованиями, проведенными в 2001-2000 гг. установлено, что санитарно-биологическая характеристика байкальской воды в районе п. Листвянка и в истоке реки Ангары характеризуется явно выраженной сезонной динамикой. Количество, растущих при 22°С и считающихся естественным и обитателями водоемов, достигает максимума в летний период. Количество бактерий-сапрофитов, растущих при 37°С (общее микробное число - ОМЧ) и считающихся условно-патогенной микрофлорой, во все сезоны было примерно на порядок ниже, чем показатель сапрофитов, растущих при комнатной температуре, но максимальные значения были отмечены также в летний период. То же касается и бактерий группы кишечной палочки.

Используя классификацию В.Н. Жукинского (1981) качество воды в пелагиали оз. Байкал можно охарактеризовать как предельно-чистую, на водозаборе - как чистую, а в истоке Ангары и в прибрежных водах Байкала (район п. Листвянка) как вполне чистую, т.е. качество воды в прибрежных районах гораздо ниже.

Таким образом, имеющиеся данные показывают, что микробный фон Байкала неоднороден и зависит во многом от использования водоема человеком. Район южной оконечности озера Байкал, особенно п. Листвянка и исток р. Ангары наиболее подвержен влиянию антропогенного фактора. Наблюдается увеличение численности гетеротрофных бактерий в несколько раз, появление в летне-осенний период в воде группы кишечной палочки. Общее микробное число возрастает в осенний и, особенно в летний период. Обращает на себя внимание факт появления кишечной палочки в этом

районе и увеличения численности хемоорганотрофных бактерий по сравнению с даже с 90-ми годами.

На антибиотикорезистентность исследовано 120 штаммов, выделенных при обследовании водозабора р. Ангары, ее истока, прибрежной зоны оз. Байкал и кернов его донных осадков. Использовались антибиотики как широкого спектра действия, так и с выраженной активностью по отношению к грамотрицательной микрофлоре: тетрациклин, ампициллин, стрептомицин, полимексин, хлоранфеникол, невиграмон, гентамицин, рифамицин, цефазолин, котримаксазол, цефатоксин, пефлаксоцин, диоксидин, канамицин. Анализ материалов проведен по двум группам: чувствительные и устойчивые.

Проведенные исследования показали, что антибиотикоустойчивые штаммы были выявлены на всех станциях в районе п. Листвянка. В летний период из озера Байкал были выявлены грамотрицательные бактерии, устойчивые ко многим антибиотикам. Количество штаммов, устойчивых к б и более антибиотикам в озере Байкал составила 26%, в истоке реки Ангары 18%, на водозаборе 45% от количества исследованных. Штаммы, выделенные из истока р. Ангары, обнаруживают большую чувствительность, чем микроорганизмы оз. Байкал, которые, в свою очередь, более чувствительны, чем микроорганизмы выделенные с водозабора. На водозаборе грамотрицательных бактерий не выявлено, грамположительные палочки составляют 55%, грамположительные кокки- 45%. В истоке р. Ангары количество грамотрицательных палочек составил 27%, грамположительных палочек - 46%, а грамположительных кокков - 27%. В оз Байкал грамотрицательные палочки составляли 13%, грамположительные палочки - 36%, а грамположительные кокки - 33%. Наиболее эффективное воздействие обнаруживали гентамицин и цефазолин. Количество штаммов, чувствительных к ним, составило 67% и 59%. Устойчивых к действию всех

ю

антибиотиков был 1% от всех выделенных штаммов, чувствительных ко всем антибиотикам в водной среде 6%, вместе с кернами донных осадков 21%.

Таким образом, микроорганизмы, выделенные в районе антропогенного влияния (район п. Листвянка) изменяют свои биологические свойства. Появляются штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков. Штаммы, выделенные из кернов донных осадков оз. Байкал, характеризуются высокой чувствительностью практически ко всем антибиотикам, использованным в опыте.

2. Поиск культур микроорганизмов, продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов показал, что бактерии-продуценты новых ферментов рестрикции обнаружены только в антропогенных районах оз. Байкал. В чистых фоновых районах Байкала, пробах глубоководных осадков, где нет антропогенного воздействия, таких бактерий не выделено

Поиск штаммов новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) обусловлен в первую очередь той ролью, которую эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетических исследованиях вообще и генетической инженерии в частности. Дальнейшее развитие этих ведущих направлений современной биологической науки и их прикладных значений, имеют самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем. Во многом это зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.

Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них были выявлены ферменты с новой специфичностью (Дегтярев и др., 1987). Поиск эндонуклеаз рестрикции обусловлен тем, что выявленные новые штаммы бактерий, продуцирующие эти ферменты новые, редкие или более биотехнологичны, чем известные.

Из различных регионов оз. Байкал была составлена коллекция из более 650 штаммов микроорганизмов выделенных из различных экологических ниш: водной толщи, донных осадков и кернов глубинного бурения. Проведены исследования по тестированию культур микроорганизмов по наличию или отсутствию в них новых ферментов рестриктаз. Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема поиска новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции.

Ферменты эндонунклеаз рестрикции выявляются не во всех исследованных штаммах, а лишь в 10% проанализированных штаммов, выделенных из воды и в 5% штаммов, выделенных из донных осадков. В штаммах бактерий, выделенных из чистых участков озера, все обнаруженные нами рестриктазы являются хорошо известными, т.е. продуценты-бактерии их существовали давно и не только на Байкале. К таким «непродуктивным» районам относятся штаммы микроорганизмов, выделенные из скважины глубоководного бурения «Байкал-93», возраста около 500 тыс. лет.

За период 2001-2003 гг. из района п. Листвянка, истока р. Ангары и района Малого моря выделили и проанализировали около 350 штаммов бактерий. Эндонуклеазы рестрикции были обнаружены лишь в 33 штаммах.

Причем они не являлись новыми, хотя многие из них являются довольно редкими. Обращает на себя внимание факт идентичности ферментов, определенных в штаммах бактерий, выделенных из района Малого моря.

Сравнение состава бактериопланктона по наличию или отсутствию ферментов эндонуклеаз рестрикции позволяет оценить изменение структуры бактериопланктона и дает качественную индикацию влияния антропогенного загрязнения. За время исследования бактерии - продуценты неизвестные ранее рестриктаз, были обнаружены в районах антропогенного влияния. Так, например, штамм бактерий Flavobacterium aquatil - продуцент рестриктазы Fau I был выделен из воды оз. Байкал в районе п. Листвянка. Штамм бактерии Acinetobacter calcoaceticus - продуцент рестриктазы Аса I был выявлен в районе г. Байкальска. Продуцент Bacillus sphaericus эндонуклеазы рестрикции Bsi I, который является новым ферментом среди известных рестриктаз, был выделен из этого же района. В районе истока р. Ангары выделен штамм бактерии Cutrobacterium citrium, продуцент CciNI, который является изошизомером Not I (табл. 1).

Таблица 1

Штаммы- продуценты новых рестриктаз

Район Год Вид Рестриктаза Сайт узнавания

Байкальск 1991 Flavobacterium aquatil Fau I 5'-CCCGC-3'

1991 Acinetobacter calcoaceticus Аса I 5'-CCANTGG-3'

Листвянка 1995 Curtobacterium citreum CciNI 5'-GCGGCCGC-3'

1992 Bacillus sphaericus Bsi I 5-CTCGNG-3'

1998 Sporosarcina sp 9D Sse9 I S'-AATT-З'

Полученные результаты дают основание полагать, что прибрежная часть Байкала, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для появления продуцентов штаммов эндонуклеаз рестрикции.

3. Изучение спектра ферментов эндонуклеаз рестрикции бактериальных штаммов позволило выявить наличие новых (Fanl, Acal, Bsil), а также весьма редких ферментов рестрикции (Sce9l, CciN I).

Выявлено, что в выделенных штаммах встречаются эндонуклеазы рестрикции как широко распространенные, так и новые. Среди байкальских штаммов, выявленных в районах антропогенного влияния, обнаружены микроорганизмы, дающие специфическую фрагментацию ДНК (рис. 2). Как видно из рисунка, на восьмой дорожке нанесен лизат бактерии, продуцирующей фермент-изошизомер рестриктазы Clal (сайт узнавания ATCGAT). Штамм относится к виду Pseudomonas gladioli, а фермент, продуцируемый им, называется Pga 1, согласно общепринятой номенклатуре.

Определение остальных микроорганизмов, лизаты которых расщепляют ДНК, позволило отнести их к видам Flavobacterium aqualil (дорожка 2), Hafnia alvei (дорожка 4), Acinetobacter calcoaceticus (дорожка 6). Ферменты названы соответственно: Fan I, Hal 1, Hal 11, Аса 1. Предварительный анализ субстратной специфичности этих рестриктаз с помощью сопоставления картин гидролиза ДНК фага L С1 857 с рассчитанными теоретически для различных ферментов (Roberts R.J., Macelis D. 1993) показал, что Hal 1 и Hal 11 по-видимому, являются изошизомерами рестриктаз Eco R 1 и Pst 1 соответственно, а Аса 1 узнает и расщепляет последовательность CCA(N)sTTG, являясь изошизомером рестриктазы PflMl. Определенные нами штаммы ранее не были описаны как продуценты рестриктаз. В штаммах Hafnia alve in Flavobacterium aquatile рестриктазы выявлены впервые.

Среди микроорганизмов рода Pseudomonas ранее не было обнаружено продуцентов ферментов, способных узнавать и расщеплять последовательность ATCGAT, хотя это один из наиболее «богатых» рестриктазами видов. Вид А. calcoaceticus менее изучен, но продуцентов ферментов, способных расщеплять ДНК по последовательности

ССА(Ы)5ТСС до наших исследований в нем не обнаруживали. Также, из байкальской воды был выделен штамм Сиг1оЬас1епит сПгеит. Определенная в нем рестриктаза Сс'1 N1 (сайт узнавания 5'-ОСОСССОС-3') является изошизомером ИоН.

i Z S V & 6 7 2 9

Рис. 2. Фотография геля после элекрофореза продуктов

гидролиза ДНК лизатами различных микроорганизмов

1,2-Flavobacterium aquatile (Fan I); 3,4-Hafnia alvei (Hal I); 5,6-Acinetobacter calcoaceticus (Аса I); 7,%-Pseudomonas gladioli (Pga I); 9-к ДНК добавлено 2 ед. фермента Cía 1.

Позже, при изучении микроорганизмов водного происхождения нами был обнаружен штамм Sporosarcina sp. 9D, являющийся продуцентом эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) Sse91, (сайт 5'-ААТТ-3'). Новая эндонуклеаза рестрикции Sse 9D является еще одним новым ферментом из байкальской коллекции и истинным изошизомером рестриктазы Tsp 5091, выделяемой из штамма Thermits sp. 509 (Roberts et al., 1994). В отличие от прототипа, новый фермент работает при температуре 55°С и инактивируется

при 65°С в течение 20 мин. Это позволяет по окончании обработки ДНК рестриктазой просто прогреть инкубационную смесь, а не проводить дополнительную фенольную экстракцию в том случае, если продукты гидролиза необходимо использовать для дальнейших экспериментов. Важной особенностью этого фермента является его способность образовывать ^

продукты гидролиза с 5'-выступающими липкими концами, комплементарными липким концам, образующимся при гидролизе ДНК {

рестриктазами EcoRI (5'-GAATTC-3') и Acsl (5'-RAATTY-3'), где R-A или G; Y-T или С.

Выявленные нами штаммы легко культивируются и технологичны при производственном получении рестриктаз. Обнаруженные эндонуклеазы рестрикции можно использовать во многих экспериментах в области молекулярной биологии и генетической инженерии.

4 Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов показало, что бактерии, активны и могут принимать участие в деструкции многих органических соединений в Байкале.

Из воды в районе антропогенного влияния (п. Листвянка) было выделено 200 штаммов. Из них- 177 штамма было доведено до рода, до вида-23. Преобладающей формой бактерий является р. Pseudomonas (34%), р. Microccocus (15%), р. Bacillus (12%), р. Clostridium (9%), p. Flavobacterium (5%), p. Acinetobacter (4%).

К роду Pseudomonas отнесено 47 штаммов бактерий, из них 5 культур •

определено до вида: Ps. aeruginosa, Ps. cepacia, Ps. stutzeri, Ps. fluorescens, Ps. alcaligenes. Спорообразующие палочки, выделенные из грунтов, отнесены к .

роду Clostridium, по принципу разжижать желатину ко 2 группе. Подвижные спороносные грамположительные палочки отнесены к роду Bacillus, 4 штамма определено до вида: В. pumilus, В. megatherium, В. circulons, В. subtilis. Два штамма неспорообразующих, грамотрицательных палочек

отнесены к роду Bacteroides, 3 штамма-к роду Chromobacterium и 19-к р. Flavobacterium. Из них 4 - определено до вида: Fl. rigense, Fl. capsulatum, Fl. ferrugenium, Fl. aquatile. Из 3 штаммов Chromobacterium, один определен до вида: Ch. lividium. Двадцать два штамма кокковых форм отнесены к роду Micrococcus, один из них определен до вида: М. luteus. Из 23 определенных до вида культур, грамотрицательные палочки составляли 52 %, грамположительные палочки - 35 %, Грамположительные кокки - 4 %, грамотрицательные кокки - 9%

Наряду с определением видового состава, представляло интерес выяснить биохимические свойства микроорганизмов. Оказалось, что протеолиз желатина осуществлялся почти всеми культурами (94%), пептонизация молока наблюдалась у 55% штаммов. Выявлено, что 33% культур гидролизуют крахмал, 39% восстанавливает нитраты, индол образуют 6%. Образование сероводорода наблюдается у 56% штаммов, ацетилметилкарбинола-44,6%. Способность усваивать минеральный азот найдена только у 11 % культур. Многие штаммы сбраживают углеводы с подкислением среды.

Определение каталазной, оксидазной, амилазной и дегидрогеназной активности активности показало, что можно составить следующий ряд активности: каталазная—»амилазная—»оксидазная—► дегидрогеназная. Количество активных штаммов, обладающих каталазной активностью, составляет 99%, амилолитической активностью-85%, оксидазной 65%, дегидрогеназной-36%.

Таким образом, штаммы микроорганизмов, выделенные из воды Байкала, активны и могут принимать участие в деструкции многих органических соединений. Бактериям, с их высокой ферментативной активностью а, следовательно, главным участием, в биогеохимических циклах в водоемах, принадлежит основная роль.

5. Разработанный алгоритм степени устойчивости экосистемы оз Байкал по микробиологическим показателям позволяет выявить риск антропогенного воздействия на начальной стадии.

Исследователи всего мира сталкиваются с общей проблемой выделения антропогенных изменений на фоне естественной природной изменчивости в экосистемах и давно пытаются решить проблему - найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на водные объекты. Мы /

I

объединили традиционные методы исследований в микробиологии с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз определили характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента. Бактерии - продуценты новых рестриктаз были выделены из озера Байкал в районах антропогенного влияния (вблизи п. Листвянка и г. Байкальска).

В настоящее время в мире известно более 1500 типов рестриктаз с различной степенью активное I и, т.е. способных с той или иной скоростью разрывать определенные, специфические последовательности двойной спирали ДНК. Очевидно, что специфичность рестриктазы определяет характеристику бактерии, из которой она выделена. Поэтому, этот фермент может служить характернаикой специфичности самой бактерии продуцента. Многолетние исследования, начиная с 50-х годов, дают основание считать такую характеристику эндемизма бактерий не менее достоверной, чем морфологические отличия и физиолого-биохимические признаки.

В результате проведенной работы, предложен алгоритм степени а

устойчивости экосистемы оз. Байкал (рис. 3), который позволит делать своевременные прогнозы по влиянию антропогенного фактора на качество воды в оз. Байкал. Это - появление кишечной палочки и микрофлоры, устойчивой ко многим антибиотикам, повышенное количество хемоорганотрофных бактерий (сапрофитов), а также выявление бактерий-продуцентов новых и редких ферментов (эндонуклеаз рестрикции).

Рис. 3. Схема алгоритма степени устойчивости экосистемы озера Байкал по состоянию микробного сообщества

Заключение

Проведенные исследования с использованием методов физико-химической биологии при решении экологических задач позволяют судить о качественном изменении микроорганизмов в прибрежной части Байкала, находящейся под антропогенным влиянием. Возможно, что результаты исследований будут способствовать решению проблемы надежности индикации антропогенного загрязнения в биологической части трофической цепи. С другой стороны, полученные результаты дают основание предположить, что прибрежная часть Байкала, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для возникновения продуцентов штаммов эндонуклеаз рестрикции, широко используемых в биотехнологии.

Выводы:

1. Выявлено, что в прибрежной части оз. Байкал появляются штаммы-продуценты новых ферментов эндоэндонуклеаз рестрикции. В пелагиали озера и в кернах донных осадков таких бактерий не найдено. Возникновение новых рестриктаз в штаммах бактерий, выделенных из районов антропогенного влияния, является результатом бактериальных мутаций.

2. Биологические свойства выделенных штаммов в районах антропогенного влияния изменены и по другим показателям. Часть штаммов, выделенных из антропогенных районов, отличается устойчивостью к широкому спектру антибиотиков в отличие от микроорганизмов, выделенных из чистых фоновых районов и кернов осадков оз. Байкал.

3. Создана коллекция бактерий, обладающих новыми и редкими ферментами - эндонуклеазами рестрикции. Пять штаммов идентифицированы как Flavobacterium aquatil, Acinetobacter calcoaceticus, Curtobacterium citreum, Bacillus sphaericus, Sporosarcina sp 9D.

4. Штаммы - продуценты новых эндонуклеаз рестрикции используются при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal, BsiJ, FanI, Sse9D, Cci NI фирмой ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск).

5. Установлена таксономическая принадлежность 200-х бактериальных штаммов, выделенных из прибрежных районов вблизи поселений, 23 штамма определены до вида, остальные до рода.

6. На основе полученных результатов, разработан алгоритм степени устойчивости экосистемы озера Байкал по микробиологическим показателям, позволяющий выявить риск антропогенного воздействия на качество воды оз. Байкал.

7. Показана целесообразность применения ферментов эндонуклеаз рестрикции бактериальных штаммов как тестов на антропогенное влияние на начальном этапе изменения экосистемы оз. Байкал, что необходимо для обоснования организации систематических наблюдений за микробиологическими показателями оз. Байкал на водохозяйственных участках поселений.

8. Новый биотехнологический подход оценки антропогенного влияния на качество природной воды оз. Байкал на наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи - микроорганизмах, перспективен, поскольку позволит оперативно принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов деятельности в прибайкальских зонах.

I,

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Verkhozina V.A., Verkhozina E.V., Gonchar D.A., Dedkov V.S., Degtyarev S.Kh., Kusner Yu.S. Qualitative characteristics of bacteria strain of water body and bottom sediments of lake Baikal // International workshop for the Baikal @ Hovsgol drilling project in Ulaanbaatar. Abstracts. Ulaanbaator, Mongolia, 2001. P. 76- 77.

2. Верхозина E.B. Проблемы чистой воды и рационального использования водных ресурсов озера Байкал. // 2-ая школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона». Улан- Удэ, 2001, С. 144-148.

3. Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Куснер Ю.С. Принятие решений в управлении экосистемы озера Байкал. //Теория, методы и инструменты принятия решений в живых, социальных и технических системах. 19-ый международный семинар "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" Иркутск. 2001. С. 85-89.

4. Верхозина В.А., Верхозина Е.В. Микроорганизмы- индикаторы антропогенных изменений в экосистеме озера Байкал. //Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе. Иркутск, 2002, С. 132- 137 С.

5. Верхозина Е.В., Верхозина В.А. Изучение геохимической деятельности углеводородокисляющих микроорганизмов на нефтяных месторождениях и в биодеструкционных процессах // Молодежная научная школа «Нефть и газ в современном мире: геолого- экономические и социально-культурные аспекты». Иркутск, 2001. С. 41- 43.

6. Верхозина Е.В., Верхозина В.А. Изучение геохимической деятельности углеводородокисляющих микроорганизмов на нефтяных месторождениях и в биодеструкционных процессах. //Нефть и газ в современном мире: геолого- экономические и социально-культурные аспекты. Иркутск, 2002. С. 153-165.

7. Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Гудков С.С., Емельянов Ю.Е., Рязанова И.И., Шкетова JI.E. Биогеохимические процессы трансформации металлов с участием микроорганизмов и их использование в биотехнологических разработках. //Вестник ИрГТУ. № 12. 2002. С. 65-71.

8. Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Савилов Е.Д. Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии //Сибирь- Восток. 2003. № 8. С. 11-15.

9. Астафьев В.А., Мамонтова J1.M. , Савилов Е.Д., Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Максимова Э.А., Крайкивская О.В., Рубанович И.Я., Тимошенко A.JI. Загрязнение вод бассейна озера Байкал патогенными вирусами// Сибирь- Восток. 2003. С. 23-24.

10.Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х., Куснер Ю.С. Микроорганизмы озер Байкал и Ньяса как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии // Прикладная Биохимия и микробиология 2003. №3.

Н.Астафьев В.А. Мамонтова JI. М., Савилов Е.Д., Верхозина В.А.,. Максимова Э.А, Крайкивская О.В., Рубанович И.Я., Тимошенко A.JI. Загрязнение бассейна озера Байкал патогенными вирусами. //Сибирь-Восток. 2003.№ 8. С. 23-24.

12.Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Савилов Е.Д. Мамонтова JI.M., Астафьев В.А. Оценка качества воды озера Байкал по микробиологическим показателям // Сибирь- Восток. № 10. С. 24-19.

13.Верхозина В.А., Верхозина Е.В. Куснер Ю.С. Процессы азотфиксации и денитрификации в озере Байкал, их влияние на качество воды и общий баланс азота в экосистеме //Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири. //Материалы научной конференции, посвященной 100-летию профессора Томского политехи, ун-та П.А.Удодова. Томск: ТПУ. 2003. С. 220-222.

14.Верхозина Е.В, Верхозина В.А. Принятие решений и методы оценки состояния экосистемы озера Байкал. //Молодежь и пути России к устойчивому развитию. Третья республиканская школа-конференция. Институт физики СО РАН. 2003. С. 35-37.

Подписано к печати 2 11.03 Формат 60x84/16 Уел печ листов 1,3 Тираж 100 Заказ 165 Отпечатано в ИЗК СО РАН

r¿1 а* V

А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Верхозина, Елена Владимировна

Введение.

Глава 1. Современное состояние проблемы, микроорганизмы как индикаторы антропогенных воздействий на экосистемы водоемов.

1.1. Современная классификация источников водоснабжения по микробиологическим показателям.

1.2. Влияние антропогенного фактора на качество питьевой воды.

1.3. Изменчивость численности микроорганизмов и трофности озер при антропогенных нагрузках.

1.4. Микробиологические исследования на Байкале.

1.5. Принцип организации мониторинга за состоянием экосистемы озер.

Глава 2. Штаммы- продуценты ферментов рестрикции для биотехнологии.

2.1. Ферменты рестрикции, их номенклатура и классификация

2.2. Распространение рестриктаз

2.3. Характеристика субстратной специфичности рестриктаз 36 ^ 2.4. Ферментативные свойства рестриктаз

2.5. Ферменты рестрикции их поиск и применение

Глава 3. Объекты, методы и объем выполненных исследований.

3.1. Объем и объем выполненных исследований.

3.2. Микробиологические методы.

3.3. Методы определения ферментов рестрикции.

Глава 4. Влияние антропогенного фактора в районе Южного Байкала

4.1. Количественная характеристика микробных сообществ в воде Южного Байкала.

4.2. Чувствительность бактериальных штаммов к антибиотикам.

Глава 5 Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов.

Глава 6. Микроорганизмы воды и донных осадков оз. Байкал как потенциальные источники получения ферментов рестрикции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии"

Рациональное использование природных ресурсов, таких как экосистема оз. Байкал, а также разработка водо-охранных мероприятий невозможна без выявления роли микроорганизмов и их изменчивости в процессах превращения веществ и микрофлоры антропогенной природы, поступающих в озеро. Оценка антропогенного воздействия на качество воды на начальной, наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи -микроорганизмах. Это перспективно и общественно значимо, поскольку позволяет оперативно выявить нарушения и принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов человеческой деятельности на экосистемы. Антропогенное вмешательство в экосистемы крупнейших поверхностных водоемов, таких как оз. Байкал, связано с возможностью необратимых последствий для ныне живущих и будущих поколений, что находится в противоречии с устойчивым экономическим развитием.

Многие исследователи всего мира давно пытаются найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на водные объекты. В данной работе, мы попытались объединить традиционные методы микробиологических исследований с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз определить характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента.

Поиск штаммов новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) обусловлен в первую очередь той ролью, которую эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетических исследованиях вообще и генной инженерии в частности. Дальнейшее развитие этих ведущих направлений современной биологической науки и их прикладных значений, имеют самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем. Во многом это зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.

Эндонуклеазы рестрикции II типа (рестриктазы), благодаря способности фрагментировать ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов, нашли широкое применение в решении научных и прикладных задач (Smith Н. С. Nathans D., 1973; Murrey К., Hughes S., G., 1976; Акулин и др., 1988; Roberts R.J., 1990). Анализ специфичности рестриктаз предполагает существование неоткрытых прототипов этих ферментов (Янулайтис А.А., 1989). Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них были выявлены ферменты с новой специфичностью (Дегтярев и др., 1987). Поиск эндонуклеаз рестрикции обусловлен тем, что выявленные новые штаммы бактерий, продуцирующие эти ферменты новые, редкие или более технологичны, чем известные. Таким образом, все вышеуказанное определило актуальность темы диссертационной работы.

Цель работы - поиск и идентификация новых наиболее перспективных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал, исследование влияния антропогенного фактора на распределение и биологические свойства бактерий, а также отбор наиболее технологичных штаммов-продуцентов.

Основные задачи:

1. Выделение бактериальных штаммов из различных экологических ниш оз. Байкал и исследование их биологических свойств: ферментов эндонуклеаз рестрикции и антибиотикорезистентности.

2. Поиск культур микроорганизмов, продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов.

3. Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов

4. Разработка алгоритма степени устойчивости экосистемы по микробиологическим показателям, позволяющим выявить риск воздействия на экосистему оз. Байкал.

Теоретической значение и научная новизна работы. Впервые разработан и реализован новый эколого-биотехнологический подход к оценке антропогенного влияния на олиготрофные водоемы. Проверено 650 штаммов микроорганизмов, выделенных из различных районов оз. Байкал, в 10% которых обнаружена рестриктазная активность. Проведена идентификация по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Создан алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал по микробиологическим показателям. Установлено, что в районах антропогенного влияния появляются бактериальные штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков и выявляются штаммы бактерий, с новыми ферментами рестриктазами, которые используются в биотехнологических разработках.

Практическая значимость. В работе показана целесообразность использования ферментов эндонуклеаз рестрикции, выделенных в бактериальных штаммах хемоорганоторофных бактерий как индикаторов антропогенного воздействия. Рекомендовано использование разработанного алгоритма устойчивости озера Байкал Ангаро-Байкальским Бассейновым Водным Управлением при рассмотрении «Норм допустимых воздействий на экосистему оз. Байкал» (приложение). Результаты будут необходимы при мониторинговых исследованиях за качеством воды, а также всей экосистемы Байкала - участка мирового природного наследия - с целью сохранения уникального озера.

Создана коллекция из 650 бактериальных штаммов, включающих 5 штаммов-продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции. Байкальские штаммы-продуценты уникальных и редких ферментов, используются в НПО «Вектор» и ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск) при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal, Bsil, FanI, Sse9D, Cci N1. Штаммы микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus B-7 и Flavabacterium aquatil B-l зарегистрированы во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов. Коллекционные штаммы микроорганизмов используются при изучении качества воды по бактериальным показателям.

Результаты исследований использованы при выполнении Гранта РФФИ-Байкал (№ 01-04-97209) и хоздоговорных работ с Администрацией Иркутской области (Влияние антропогенного фактора на качественный состав микроорганизмов и эколого-эпидемиологическую ситуацию в районе Южного Байкала, 2001-2003 гг.). Материалы диссертации использованы в учебных курсах Иркутского государственного технического университета по дисциплинам: "Биотехнология», "Техническая микробиология" и "Микробиология".

Апробация работы. Основные защищаемые положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на международном семинаре "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" (Иркутск, 2001); на международном совещании проекта бурения Байкала и Хубсугула (Улан-Батор, 2001); на второй школе-семинаре молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2001); на Молодежной научной школе «Нефть и газ в современном мире: геолого-экономические и социально-культурные аспекты» (Иркутск, 2001); на научно- практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), на 2-ой международной научно- практической конференции «Энергосберегающие и природоохранные технологии» (Улан-Удэ, 2003); на третьей республиканской школе-конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2003), На Всероссийской гидрогеохимической научной конференции «Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири» (Томск, 2003).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Верхозина, Елена Владимировна

Выводы:

1. Выявлено, что в прибрежной части оз. Байкал появляются штаммы-продуценты новых ферментов эндоэндонуклеаз рестрикции. В пелагиали озера и в кернах донных осадков таких бактерий не найдено.

Возникновение новых рестриктаз в штаммах бактерий, выделенных из районов антропогенного влияния, является результатом бактериальных мутаций.

2. Биологические свойства выделенных штаммов в районах антропогенного влияния изменены и по другим показателям. Часть штаммов, выделенных из антропогенных районов, отличается устойчивостью к широкому спектру антибиотиков в отличие от микроорганизмов, выделенных из чистых фоновых районов и кернов осадков оз. Байкал.

3. Создана коллекция бактерий, обладающих новыми и редкими ферментами - эндонуклеазами рестрикции. Пять штаммов идентифицированы как Flavobacterium aquatil, Acinetobacter calcoaceticus, Curtobacterium citreum, Bacillus sphaericus, Sporosarcina sp 9D.

4. Штаммы - продуценты новых эндонуклеаз рестрикции используются при получении сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: Acal, Bsil, FanI, Sse9D, Cci N1 фирмой ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск).

5. Установлена таксономическая принадлежность 200-х бактериальных штаммов, выделенных из прибрежных районов вблизи поселений, 23 штамма определены до вида, остальные до рода.

6. На основе полученных результатов, разработан алгоритм степени устойчивости экосистемы озера Байкал по микробиологическим показателям, позволяющий выявить риск антропогенного воздействия на качество воды оз. Байкал.

7. Показана целесообразность применения ферментов эндонуклеаз рестрикции бактериальных штаммов как тестов на антропогенное влияние на начальном этапе изменения экосистемы оз. Байкал, что необходимо для обоснования организации систематических наблюдений за микробиологическими показателями оз. Байкал на водохозяйственных участках поселений.

8. Новый биотехнологический подход оценки антропогенного влияния на качество природной воды оз. Байкал на наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи - микроорганизмах, перспективен, поскольку позволит оперативно принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов деятельности в прибайкальских зонах.

Заключение

Проведенные исследования с использованием методов физико-химической биологии при решении экологических задач позволяют судить о качественном изменении микроорганизмов в прибрежной части Байкала, находящейся под антропогенным влиянием. Возможно, что результаты исследований будут способствовать решению проблемы надежности индикации антропогенного загрязнения в биологической части трофической цепи. С другой стороны, полученные результаты дают основание предположить, что прибрежная часть Байкала, находящаяся под антропогенным влиянием, может оказаться подходящей экологической нишей для возникновения продуцентов штаммов эндонуклеаз рестрикции, широко используемых в биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Верхозина, Елена Владимировна, Иркутск

1. Амбразене Ж.П. Классификация речных вод по степени загрязненности на основании микробиологических показателей //Водные ресурсы 1974. № 5. С. 102-109.

2. Белькова Н.Л., Денисова Л.Я., Манакова Е.Н., Зайчиков Е.Ф., Грачев

3. М.А. Видовое разнообразие глубоководных микроорганизмов озера Байкал, выявленное по последовательностям 16 S рРНК //ДАН. 1996. т. 348. №5. С. 692-695.

4. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург: УрО РАН. 1997. С. 3-5.

5. Бухарин О.В., Усявцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург: УрО РАН. 1996. 203 с.

6. Верхозина В.А. Микробиальные процессы круговорота азота в оз. Байкал. Автореф. на соиск. уч. ст. к.б.н. Алма-Ата. 1983. 16 с.

7. Верхозина В.А., Парфенова В.В. Микроорганизмы круговорота азота и фосфора//Экология Южного Байкала. Иркутск. 1983. С. 84-103.

8. Верхозина В.А. Микробиальные процессы круговорота азота в оз. Байкал //Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Наука. 1985. С. 33^2.

9. Верхозина В.А. Влияние антропогенного фактора на микробиальные процессы круговорота азота //Совершенствование регионального мониторинга состояния оз. Байкал. 1985. Л. С. 66-70.

10. Верхозина В.А., Верхозина Е.В. Микроорганизмы-индикаторы антропогенных изменений в экосистеме озера Байкал //Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе. Иркутск. 2002. С. 132-137.

11. Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Савилов Е.Д. Микроорганизмы оз. Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива ихиспользования в биотехнологии //Сибирь-Восток. Иркутск. 2003. № 8. С. 11-15.

12. Верхозина Е.В. Проблемы чистой воды и рационального использования водных ресурсов озера Байкал. //2-ая школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона». Улан-Удэ, 2001, С. 144-148.

13. Верхозина В. А., Верхозина Е.В. Микроорганизмы-индикаторы антропогенных изменений в экосистеме озера Байкал. //Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе. Иркутск, 2002, С. 132-137 С.

14. Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Савилов Е.Д. Микроорганизмы озера Байкал как индикаторы антропогенного влияния и перспектива их использования в биотехнологии //Сибирь-Восток. 2003. № 8. С. 11-15.

15. Астафьев В.А., Мамонтова JT.M., Савилов Е.Д., Верхозина В.А., Верхозина Е.В., Максимова Э.А., Крайкивская О.В., Рубанович И.Я., Тимошенко АЛ. Загрязнение вод бассейна озера Байкал патогенными вирусами //Сибирь-Восток. 2003. С. 23-24.

16. Верхозина Е.В., Верхозина В.А., Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Астафьев В.А. Оценка качества воды озера Байкал по микробиологическим показателям//Сибирь-Восток. 2003. (в печати).

17. Астафьев В.А. Мамонтова Л. М., Савилов Е.Д., Верхозина В.А.,. Максимова Э.А, Крайкивская О.В., Рубанович И.Я., Тимошенко АЛ. Загрязнение бассейна озера Байкал патогенными вирусами. //Сибирь-Восток. 2003.№ 8. С. 23-24.

18. Верхозина Е.В, Верхозина В.А. Принятие решений и методы оценки состояния экосистемы озера Байкал. //Молодежь и пути России кустойчивому развитию. Третья республиканская школа-конференция. Институт физики СО РАН. 2003. С. 35-37.

19. Винберг Г.Г. Сравнительная оценка некоторых распространенных методов расчета продукции водных бактерий //Гидробиол. журн. 1971. Т. 7, № 4. С. 86-97.

20. Виноградова JI.A., Пархомчук Т.К. Комплексные санитарно-микробиологические критерии оценки качества водных объектов в условиях возрастающей антропогенной нагрузки //Гигиена и санитария. 1991. №1. С. 24-26.

21. Воейкова Т.А., Славинская Е.В. и др. Определение ферментов рестрикции биологическими методами //Генетика. 1979. т. 15. С. 17461755.

22. Галазий Г.И. Об общих основах охраны водоемов от загрязнения //Гидробиолог, журн. 1982. Т. 18. С. 102-109.

23. Гоман Г.А., Нечесов И.А. Некоторые вопросы микробиологического мониторинга на Байкале //Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Н.: Наука. 1985. С. 105-114.

24. Гончар Д.А., Дедков B.C., Верхозина В.А., Куснер Ю.С., Шевченко А.В., Дегтярев С.Х. Эндонуклеаза рестрикции Sse 91 из штамма Sporosarcina sp. 9D узнает последовательность ДНК-5-ААТТЗ' //Молекулярная генетика. 1998. № I.e. 32-34.

25. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. Экология водных микроорганизмов. М.: Наука. 1977. 287 с.

26. Государственный доклад "О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 1991 году". М.: 1992. 74 с.

27. Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды Иркутской области в 1998 году. Иркутск, Государственный комитет по охране окружающей среды Иркутской области Госкомэкологии России Администрации Иркутской области. 1999 г. 303 с.

28. Грачев М.И. О современном состоянии экологической системы озера Байкал. Иркутск. 1999. 117 с.

29. Даукшита А.С. Данные микробиологического обследования некоторых озер Латвийской СССР. 1967. № 1. С. 20-22.

30. Дегтярев С.Х., Репин В.Е., Речкунова Н.И. Определение субстратной специфичности рестрикционной эндонуклеазы Vspl //Биорганич. химия. 1987.T.13.N. 3. С. 420-421.

31. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Нетесова Н.А. и др. Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции Vnel //Биорг. химия. 1987. т. 13. С. 422-423.

32. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И. Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции //Изв. СО АН СССР. 1988. сер. биолог. Науки. В.2. № 14. С. 102-105.

33. Дедков B.C., Репин В.Е.,Речкунова Н.И., Дегтярев С.Х., Верхозина

34. B.А., Виноградова Т.П. Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди водных микроорганизмов озера Байкал. Изв. Сиб. Отдел. АН СССР. сер. биолог. 1990. № 1. С. 35-37.

35. Драчев С.С. Борьба с загрязнением рек, озер и водохранилищ промышленными и бытовыми стоками. М.: Наука. 1964. 326 с.

36. Жукинский В.Н., Оксиюк О.П., Олейник Г.Н., Кошелева С.И. Принципы и опыт построения экологической классификации качества поверхностных вод суши //Гидробиологический журнал. 1981. Т. 12. № 2.1. C.38-49.

37. Израэлъ Ю.А., Гасилина Н.К., Абакумов В.А., Цыбань А.В.

38. Гидробиологическая служба наблюдений и контроля водной среды //Научные основы контроля качества вод по гидробиологическим показателям. Л.: Гидрометиздат. 1981. 201 с.

39. Илялетдинов А.Н., Верхозина В.А. Микроорганизмы круговорота азота -индикаторы загрязнения водоема //Изв. АН Каз. СССР. сер. биолог. 1982а. №3. С. 44-49.

40. Илялетдинов А.Н., Верхозина В.А. Микроорганизмы круговорота азота -индикаторы загрязнения водоемов. //Проблемы экологии Прибайкалья. 1982 6. т.2. 36 с.

41. Иоргенсен С.Э. Управление озерными системами М.: Агропромиздат. 1985. 160 с.

42. Киселев И. А. Планктон морей и континентальных водоемов. Л.: Наука. 1969. т. 1. 563 с.

43. Кожова О.М. и Казанцева Э.А. О сезонных изменениях бактериопланктона в водах оз. Байкал. Микробиология. 1961. т. 30. № 1. С. 113-118.

44. Кожова О.М. Экологический мониторинг и проблемы здоровья населения //Тез. докл. науч.-практ. конф. Иркутск. 1991. 16 с.

45. Кочу ров Б.И., Сарвайская Л.И., Денисова Т.Б. Экологическая ситуация в России в связи с состоянием здоровья населения //Региональные проблемы здоровья населения России. М.: ВИНИТИ. 1993. С. 43-45.

46. Крамаров В.М., Смолянинов В.В. "Биохимия". 1981. 46. 1526-1529.

47. Крисс А.Е., Мишустина И.Е., Мицкевич Н.Н., Земцова Э.В. Микробное население мирового океана. М.: Наука. 1964. 291 с.

48. Крылов В.Н., Карапетян А.Т. «Генетика». 1977. т. 13. С. 1079-1088.

49. Кузнецов С.И. Применение микробиологических методов и изучение органического вещества в водоемах. Микробиология. 1949. т. 18. в. 3. С. 203-215.

50. Кузнецов С.И. Сравнительная характеристика биомассы бактерий и фитопланктона в поверхностном слое воды Среднего Байкала. Тр. Байкал. Лимн. Ст. АН СССР. 1951. т. 13. С. 217-225.

51. Кузнецов С.И. Микробиологическая характеристика вод и грунтов Байкала. //В сб.: Тр. Байк. лимн. ст., М.: Л. 1957. т. 15 q 387-396

52. Кузнецов С.И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. Изд-во Наука. 1970. 439 с.

53. Лабинская А.С. Практикум по микробиологческим методам исследования. М.: Медицинская литература. 1963. 462 с.

54. Лабинская А.С., 1978. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина. С. 303-314.

55. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1973. 343 с.

56. Лаптева Н.А. Видовая характеристика гетеротрофных бактерий в озере Байкал. //Микробиология. 1990. т. 59. в. 3. С. 499-506

57. Максимова Э.А., Максимов В.Н., Воробьева Е.И. О количестве гетеротрофных микроорганизмов в воде озера Байкал. Микробиология. 1974. т. 43. в. 1.С. 124-129.

58. Максимова Э.А., Максимов В.Н. Время генерации чистых культур гетеротрофных микроорганизмов Байкала. Микробиология. 1975. т. 44. в. 6. С. 1098-1102.

59. Максимова Э.А., Максимов В.Н. Характеристика водных масс литорали Байкала по микробиологическим показателям. Оценка и классификация качества поверхностных вод для водопользования. Всесоюзная конференция. 1979. Тез. сооб. Харьков. 1979. С. 59-61

60. Мамонтова Л.М., Савилов Е.Д., Протодьяконов А.П., Маркова Ю.А. Инфекционная "агрессивность" окружающей среды: Концепция микробиологического мониторинга. //Новосибирск: Наука. 2000. 240 с.

61. Мейнел Дж., Мейнел Э. Экспериментальная микробиология. М.: Мир. 1967. 347 с.

62. Младова Т.А. Влияние промстоков БЦЗ на микрофлору водной толщи и донных отложений Южного Байкала. //Круговорот вещества и энергии в водоемах. 1977. С. 143-145.

63. Нормативно-методические документы по гигиене, серия "Гигиена окружающей среды". Выпуск №2 "Гигиена воды". Министерство здравоохранения СССР НПО "Союзмединформ", Москва. 1991. С. 140.67.0дум Ю. Основы экологии. М.: Мир. 1975. 740 с.

64. Одум Ю. Экология. М.: Мир. 1986. т. 1. 328 с.69.0дум Ю. Экология. М.: Мир. 1986. т. 2. 740 с.70.0нищенко Г.Г. Анализ современной эпидемиологической обстановки //Мед. каф. 2002. № янв. С. 10-15, 113-127.

65. Панасюк Е.Ю., Дрюккер В.В., Парфенова В.В., Косторнова Т.Я.

66. Выделение потенциально-патогенных бактерий из озера Байкал //Сибирь -Восток. 2002. № 2. С. 12-15.

67. Парфенова В.В. Количественная характеристика и сезонная динамика микроорганизмов, мобилизующих фосфаты в воде Байкала. //Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Н.: Наука. 1985. С. 42-55.

68. Парфенова В.В. Количественная характеристика и сезонная динамика микроорганизмов, мобилизубщих фосфаты в воде Байкала.

69. Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Новосибирск. Наука. 1985. С. 55-64.

70. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М.: Наука. 1976. 255 с.

71. Покорны И., Талаева Ю.Г., Дмитриева Р.А. и др. Микробиологические критерии качества рекреационной воды в странах членах СЭВ //Гигиена и санитария. 1991. №4. С. 64-67.

72. Разумов А.С. Микробиальный планктон воды //Тр. Всес. гидробиолог, о-ва. 1962. т. 12. С. 60-190.

73. Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Доскина Т.В. и др. Индикаторная значимость коли-фагов в отношении загрязнения питьевой воды кишечными вирусами //Гигиена и санитария. 1990. № 6.-С. 21-23.

74. Родина А. Г., Кузьмицкая Н. К. Видовой состав гетеротрофных микроорганизмов водной толщи Ладожского озера //Микробиология. 1964. т. 33. в. 6. с. 1010-1017.

75. Родина А.Г. Методы водной микробиологии (практическое руководство). М.: Наука. 1965. 363 с.

76. Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. "Биол. науки", 1980, 11, 5-20.

77. Романова А.П. Интенсивность развития бактериальной флоры на литорали озера Байкал (по пластинам обрастания). //Микробиология. 1958а. т. 27(5). с. 634-640.

78. Романова А.П. Сезонная динамика бактерио планктона, его горизонтальная и вертикальное распределение в южной части Байкала. Изв. СО АН СССР. 19586. № 7. с. 114-124.

79. Романова А.П. К микробиологии озера Байкал, сезонная динамика численности бактерий и процессов круговорота азота в водной толще и грунтах Южного Байкала. Автореф. Дисс. . канд. биол. наук. Иркутск. 1961.-22 с.

80. Романова А.П. Сезонная динамика круговорота азота в водной толще и грунтах литорали оз. Байкал. Тр. 6 совещания по проблемам биологии вид. вод. ИБВВ и ЗИИ. М.: Л. 1959. с. 159-167.

81. Романова А.П. К микробиологии озера Байкал, сезонная динамика численности бактерий и прцессов круговорота азота в водной толще и грунтах Южного Байкала. Автореф. Дисс. . канд. биол. наук. Иркутск. 1961. 22 с.

82. Савилов Е.Д., Колесников С.И., Красовский Г.Н. Инфекция и техногенное загрязнение: Подходы к управлению эпидемическим процессом. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние. 1996а. 192 с.

83. Таняшин В. И. В сб: " Итоги науки и техники". Сер. "Молекулярная биология", ВНИТИ, М., 1979, 36-98.

84. Черкасский Б.Л. Современные особенности эпидемиологии кишечных инфекций в Российской Федерации //Эпидемиология и инфекционные болезни. № 5.-С. 12-15.

85. Шлегель Г. Общая микробиология. Изд-во "Мир" М. 1972. 476 с.

86. Юрковская В.А. Микробиологические критерии загрязненности и кислородный режим в реке в зоне влияния сточных вод ЦБК //Материалы

87. VI Всесоюз. Симпозиума по современным проблемам самоочищения водоемов и регулирования качества воды. Таллин. 1979. Т. 2. С. 52-54.

88. Янулайтис А.А., Стакенас П.С. и др. «Мол. биол.», 1984, 115-129.

89. Ясницкий В.И., Бланков Б.А., Гортиков В.М. Отчет о работах Байкальской биологической станции. Известия Биолого-почвенного научно-исслед. Ин-та при Государственном Иркутском университете, 1927. т. З.в. 3.35 с.

90. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.N. //Microbiol. Rew. 1995. v. 345. p. 60-63.

91. Barns S.M., Fundyga R.E., Jeffries M.W., Pace N.R. //Tbid. 1992. v. 356. p. 148-149.

92. Berdgey's manual of systematic Bacteriology. Baltimor; London. 1984. v.l, 2.

93. Bigger С. H., Murray K. et al. "Nature", 1973. v. 244. p. 7-10.

94. Boyer H.W. "Annu Rev. Microbiol.", 1971. v 25. p. 153-176.

95. Butkus V., Klimasauskas S. et al. "Nucl. Acids Res.",1985. v. 13. p. 57275746.

96. Clarke C.M., Hartley B.S. "Biochem. J.", 1979. v. 177. p. 49-62.

97. Daudner Y., Adamec R., Toht D., Yohnova V. Vplyv trofichych podmienoc na rozomozenic crevnvch bacterii vo vode //Bratisl. Lec. Listy. 1979. Vol. 72. № l.P. 58-64.

98. DeLong E.F., Franks R. E., Alldredge A.L. //Limnol. Oceanogr. 1993. v.38. p. 924-934.

99. Desmarchelier P., Lew A., Caique W. Et al. An evaluation on the hydrogen sulphide water screening test and coliform counts for water quality assesment in ryral Malaysia //Trans, roy. Soc. trop. Med. and Hyg. 1992. Vol. 86. № 4. p. 448-450.

100. Doerfler W. «J. Gen. Virol.», 1981. v. 57. p. 1-20.

101. Dufour Alfred P. Water microbiology //J. AO AC Int. 1992. Vol. 78. № i. p. 136.

102. Dussoix D., Arber W. "J. Mol. Biol", 1962. v. 5. p. 37-49.

103. Duyvesteyn M.G.C., Korsuize J. et al. "Arch. Microbiol.". 1983. p. 134, 276-281.

104. Ehrlich M., Wang R.Y.-H. "Science", 1981. v. 212. p. 1350-1357.

105. Ehrlich M., Gama-Sosa M. et al. "Nucl. Acids Res", 1985. v. 13. p. 1399-• 1412.

106. Ehrlich M., Wilson G.G. et al. "J. Bacterid", 1987. p. 169, 939-943.

107. Endow S.A., Roberts R.J. "J. Mol. Biol ", 1977. p. 112,521-529.

108. Fitzgerald G. F., Daly C. et al. "Nucl. Acids Res.", 1982. v. 10. p. 81718179.

109. Fuhrman J.A., McCallum K., Davis A.A. //Ibid. 1992. v. 345. p. 63-65.

110. Gauthier Michel J., Munro Patrick M., Flatau Gilles N. et al. Nouvelles perspectives sur Г adaptation des enterobakteries dans le milieu marin //Mar. Liffe. 1993. Vol. 3. № 1-2. p.l-18.

111. George J., Blakesley W. et al. "J. Biol. Chem ", 1980. p. 255, 6521-6524.

112. George J., Chirikjian J. G. "Proc. Nat. Acad. Sci", Usa, 1982. v. 79. p. 2432-2436.

113. Giovannoni S.J., Britschgi T.V., Moyer C.L., Field K.G //Nature. 1990. v. 345. p. 60-63.

114. Halford S. E., Johnson N.P. "Biochem J.", 1981. v. 199. p. 767-777.

115. Harris G. Time series analysis of water quality data from Lake Ontario % implication for the measurement of water quality in larde and small lakes. //Freshwater Biology. 1987. v. 18. p. 389-405.

116. Heininger K., Horz W. et al. "Gene",1977, 5/6. p. 291-303.

117. Hsu M., Berg P. "Biochemistry", 1978. v. 17. p. 131-138.

118. Hulsse Ch., Thielebeule U. Epidemiologische Studien uber den Eintlub von Luftverunreinigungen auf den kindlichen Organismus //Gesundh. Umw. 1987. Bd 3. № l.-S. 2-28.

119. Hutchinson G.E. A triatise on Limnology, v. 1. 1957. Nev York: John Wiley and sons, Ins. 1015 p.

120. Janulaitis A., Klimasauskas S. et al. "FEBS Letters", 1983. v. 161. p. 131134.

121. Kaddu-Mulindwa D., Filip Z. Mikrobiologische Untersuchungen als ein Beltrag zum Grundwasserschutzkonzept //Schrifitenr.Ver.Wasser, Boden und Lufthyg. 1986. № 64. S. 203-214.

122. Kallen R.G., Simon M. et al. "Mol. Biol.", 1962. v. 5. p. 248-250.

123. Kauc L., Piekarowicz A. "Eur. J. Biochem", 1978. v. 92. p. 417-426.

124. Keith Jones. Factors controlling the distribution of thermophilic Campylobacters in surfaces waters 116 th Int. Symp. Microb. Ecjl. (ISME-6). Barcelona, 6-11 Sept., 1992. Barcelona, 1992. P.149.

125. Kruger D.H., Bickle T.A. "Microbiol. Rev.", 1983. v. 47. p. 345-360.

126. Lehman I.R., Pratt E.A. "J. Biol. Chem.", 1960. v. 235. p. 3254-3259.

127. Linn S., Arber W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA". 1968. v. 59. p. 13001306.

128. Loof M. Langzeituntersuchung zur Persistenz von E. coli in Wassern unterschidlicher Zusammensetzung //Zentralbl. Hyg. Und Umweltmed. 1992. Bd 193. №4. S. 379-394.

129. Malyquine E., Vannier P. et al. "Gene", 1980. v. 8. p. 163-177.

130. Mayer H. "FEBS Letters", 1978. v. 90. p. 341-344.

131. McClelland M. "Nucl. Acids Res.", 1981.v. 9. p. 5859-5866.

132. McClelland M., Nelson M. "Gene", 1988. v. 74. p. 291-304.

133. Modrich P., Zabel D. "J. Biol. Chem.". 1976. p. 251, 5866-5874.

134. Modrich P., Roberts R.J. In: Nucleases meet., Cold Spring Habrour, 1982. p. 109-154.

135. Morgan.R.D."Nucl. Acids Res", 1988. v. 16. p. 3104.

136. Naumann E. Zeil und Hauptprobleme der reginalen Limnolodi //Bot. Notiser. 1927. S. 81-103.

137. Naumann E. Uder den Begriff. Eisenogranismus- Ber. Dtsch. Bot. Ges. 1928.46 p.

138. Nelson M., Christ C. et al. "Nucl. Acids Res.", 1984. v. 12. p. 5165-5173.

139. New England Biolab. Catalog 1987-1988.

140. New England Biolab. Catalog 1995. NEB Inc. USA. P. 8.

141. Nikolskaya I.I., Tediashvili M.I. et al. "Biochim. Biophys, Acta", 1979. p. 561,232-239.

142. Polisky В., Greene P. et al. "Proc. Nat. Acad. Sci. USA", 1975. v. 72. p. 3310-3314.

143. Pommepuy M., Guillaud J.F. Devenir des bacteries entleriques reietees en mer //Techn., meth.1992. № 1. P. 49-53.

144. Pathak S.P., Bhattacherjee J.W. Effect of pollutants on survival of Escherichia coli in microcosms of river water //Bull. Environ. Contam. And Toxicol. 1994. Vol. 53. № 2. P. 198-203.

145. Qiang B.-Q., Schildkraut I. "Nucl. Acids. Res.", 1984. v. 12. p. 4507-4515.

146. Reaston J., Duyvesteyn M. G. C. et al. "Gene", 1982. p. 20, 103-110.

147. Roberts R.J. "CRC Crit. Rev. Biochem." 1976. p. 4, 123-164.

148. Roberts R.J."Gene", 1978. p. 4, 183-194.

149. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1984, 12, rl67-r203.

150. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1980, 8, r63-r80.

151. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1982, 10, rl 17-rl44.

152. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1985, 13, rl65-r200.

153. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1987, 15, rl89-r217.

154. Roberts R.J. " Nucl. Acids Res.", 1988, 16, r271-r313.

155. Roberts R.J., Macelis D. //Restriction endonucleases and their isolshizomes. //Nucleic Acids Res. 1993. v. 21. p. 3125-3137.

156. Roberts R.J., Macelis D. //Nucleic Acids Res. 1994. v. 22. № 17. p. 36283639.

157. Rochelle P.A., Fry J.C., Parkers R.J., Weightman A.J. //FEMS Microbiol. Lett. 1992. v. 100. p. 59-66.

158. Rice Eugene W., Scaprino Pasquale V., Reasoner Donald J. Et al.

159. Correlation of coliform growth response with other water quality parameters //J. Amer /Water Works Assoc. 1991. Vol. 83. №7. p. 98-102.

160. Sanger F., Coulson A.R. //J. Molec. Biol. 1982. v. 162. p. 739-773.

161. Sharp P.A., Sugden B. et al. "Biochemistry", 1973. v. 12. p. 3055-3063.

162. Shibata Т., Irawa S. et al. "J. Bacteriol", 1976. p. 128, 473-476.

163. Shinomiya Т., Kobayashi M. "J. Biochem.", 1982. v. 92, p. 1823-1832.

164. Shirey James J., Bissonnette Gary K. Sheen formation and growth response of groundwater bacteria to reduced oxygen concentrations during incubation of M-Endo medium //Can. J. Microbiol. 1992. Vol. 38. № 3. p. 261266.

165. Smith И.О., Wilcox K.W. //J. Mol. Biol. 1970. v.51. p. 379-391.

166. Smith И.О., Nathans D. //J. Mol. Biol. 1973. v. 81. N. 3. p. 419-423.

167. Steele Jodn H. The Structure of Marine Ecosysyem. Printer in the United Stated of America. 1976. p. 130.

168. Takahashi I.,Marmur J. "Nature", 1963. p. 197, 794-795.

169. Terai Hisaycshi. Taxanomic study and distribution of denitrifying bacteria in lake Kisakii. «Jap. J. Limnol.», 1979.v. 40. № 2. p. 81-92.

170. Thienemann A. Die BinnengewAsser Mitteluropas //Eine Limnologische Finfhurung. 1925. Bd 11. 210 s.

171. Thienemann A. Der Sauerstoff im eutrophen und oligotrophen Seen //Die Binnengewasser. 1928. Bd 4. S. 1-215.

172. Tikchonenko T.I., Karamov E.V. et al. "Gene", 1978. v. 4. p. 195-212.

173. Van der Ploeg L. H. Т., Flavell R. A. "Cell", 1980. v. 19. p. 947-958.

174. Veenstra J., Rietra P.J.G.M., Coster J.M., Slaats E., Dircs-Go S. Seasonal variatios in the occurence of Vibrio vulnificus along the dutch coast //Epidemiol adn Infec. 1994. Vol. 112. № 2. p. 285-290.

175. Zack M. Air pollution and pediatric respiratory disease: croup //Lung. 1990. № 168. Suppl.p. 353-357.

176. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. //Nature. 1990. v . 345.

177. Water Quality Bulleten. //ISSN 07068158. 1992.

178. Whitehead P.R., Brown N.L. "FEBS Letters", 1982. v. 143. p. 296-300.

179. Wold drinking water standards //Water Quality Bulleten. 1985. v. 10. N. 4. p. 186-188.

180. Wold drinking water standards. Water Quality Bulleten. 1985. v. 10. №> 4. P. 186-188.

181. Woodbury C. P., Hagenbuchle O. et al. "J. Biol. Chem", 1980. v. 255. p. 11534-11546.

182. Wyatt G.R., Cohen S.S. "Nature" (London), 1952. v. 170. p. 1072-1073.

183. Xia Y., Burbank D. et al. "Nucl. Acids Res". 1986. v. 14. p. 6017-6030.

184. Yanish-Perron C., Vieira J., Messing J. //Gene. 1985. v. 33. N. 1. P. 103119.

185. Yoshimori R. Phd Thesis, University of California, San Francisco. 1971.

186. Youssoufian M., Mulder C. "J. Mol. Biol", 1981. p. 150, 133-136.

187. Yuan R., "Annu. Rev. Biochem.", 1981. p. 50, 285-315.

188. ZoBell J.G., Grant C.W. Bacterial utilization of low concentrations of organic matter. //J. Bacteriol. 1943. vol. 45. № 6. p. 555-564.