Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деструкция сульфоароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балашов, Сергей Викторович, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

БАЛАШОВ Сергей Викторович

УДК: 579.25.017.7; 579.841.11

ДЕСТРУКЦИЯ СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONAS И COMAMONAS

03.00.07 - Микробиология

/ „

/2-К

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАН Воронин А.М.

Пущино - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................6

1.1 Актуальность проблемы................................................................................................6

1.2 Цель и задачи исследования.........................................................................................6

1.3 Научная новизна работы...............................................................................................7

1.4 Практическое значение результатов...........................................................................8

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................9

2.1 Бактерии рода Pseudomonas...........................................................................................9

2.2 Бактерии рода Comamonas...........................................................................................11

2.3 Метаболизм ароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas ......................................................................................................................12

2.4 Разложение ксенобиотиков бактериями родов Pseudomonas и Comamonas ......17

2.5 Сульфоароматические соединения.............................................................................20

2.5.1 Химическое строение, физико-химические свойства и области применения ароматических сульфонатов..............................................................................................21

2.5.2 Сульфоароматические соединения как загрязнители окружающей среды.....25

2.6 Биодеградация сульфоароматических соединений..................................................26

2.6.1 Разложение микроорганизмами алкилированных ароматических сульфонатов. ........................................................................................................................27

2.6.2 Бактериальная деструкция арилсульфонатов.......................................................30

2.6.2.1 Микроорганизмы-деструкторы ароматических сульфонатов........................31

2.6.2.2 Биохимические пути деградации арилсульфонатов у микроорганизмов.....34

2.6.2.3 Бактериальные ферменты биодеградации сульфоароматических соединений. .................................................................................................................................................39

2.6.2.4 Генетический контроль катаболизма ароматических сульфонатов у

микроорганизмов................................................................................................................43

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................47

3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.........................................................................47

3.2 Среды и другие материалы.........................................................................................49

3.3 Методы ...................................................................................................................52

3.3.1 Отбор проб почвы, воды и активного ила.............................................................52

3.3.2 Изоляция бактерий....................................................................................................52

3.3.3 Идентификация бактерий.........................................................................................52

3.3.4 Хранение бактериальных штаммов........................................................................54

3.3.5 Химический мутагенез.............................................................................................54

3.3.6 Обогащение мутантов...............................................................................................55

3.3.7 Диагностика ауксотрофных мутантов...................................................................55

3.3.8 Коньюгационный и мобилизационный перенос бактериальных плазмид......56

3.3.9 Элиминация бактериальных плазмид....................................................................56

3.3.10 Определение размера бактериальных плазмид..................................................57

3.3.11 Определение групп несовместимости плазмид..................................................57

3.3.12 Визуализация плазмидной ДНК...........................................................................57

3.3.13 Выделение плазмидной ДНК..................................................................................58

3.3.14 Скрининг плазмидной ДНК....................................................................................59

3.3.15 Очистка плазмидной ДНК.....................................................................................60

3.3.16 Электрофорез ДНК в агарозном геле...................................................................60

3.3.17 Гидролиз ДНК сайтспецифическими эндонуклеазами рестрикции...............60

3.3.18 Электроэлюция фрагментов ДНК.........................................................................61

3.3.19 Обработка ДНК линеализированного вектора щелочной фосфатазой..........61

3.3.20 Лигирование ДНК...................................................................................................62

3.3.21 Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК................................................ 62

3.3.22 Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами................................................63

3.3.23 Подготовка бактериальных культур для определения активностей ферментов.........................................................................................................................63

3.3.24 Приготовление клеточных экстрактов..................................................................63

3.3.25 Определение концентрации белка в клеточных экстрактах............................64

3.3.26 Определение активностей ферментов разрыва ароматического кольца........64

3.3.27 Анализ скорости окисления субстратов бактериальными клетками..............66

3.3.28 Экстракция органических метаболитов...............................................................66

3.3.29 Определение спектральных характеристик метаболитов.................................67

3.3.30 Тонкослойная хроматография...............................................................................67

3.3.31 Очистка метаболитов..............................................................................................67

3.3.32 Определение масс-спектров метаболитов...........................................................67

3.3.33 Определение концентраций органических веществ и ионов в культуральных средах ...................................................................................................................67

3.3.34 Изучение динамики и определение параметров роста бактериальных

культур. ................................................................................................................68

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................................................................70

4.1 Отбор образцов почвы, воды и активного ила........................................................70

4.2 Выделение бактериальных штаммов-деструкторов ароматических сульфонатов. 70

4.3 Идентификация бактериальных штаммов-деструкторов ароматических сульфонатов.........................................................................................................................71

4.4 Усвоение бактериями арилсульфонатов в качестве единственных источников углерода и энергии.............................................................................................................74

4.5 Усвоение бактериями сульфоароматических соединений в качестве единственных источников серы.......................................................................................75

4.6 Динамика роста бактерий на сульфоароматических субстратах..........................76

4.7 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида Pseudomonasputida..................81

4.7.1 Деструкция бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и сульфаниловой кислот штаммом Р.putida BS 1331 и его производными...............................................82

4.7.2 Деструкция бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и сульфаниловой кислот штаммом Р.putida BS 1304....................................................................................92

4.8 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида. Pseudomonas stützen................94

4.9 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида Comamonas testosteroni...........95

4.9.1 Деградация бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом С.testosteroni BS1310. .....................................................................................................................97

4.9.2 Деградация п-толуолсульфоната и п-сульфобензоата штаммом С.testosteroni BS1307. ....................................................................................................................99

4.9.3 Деградация 5-сульфосалицилата штаммом С.testosteroni ВS1309..................100

4.9.4 Деградация 2-нафталинсульфоната, бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом C.testosteroni BS1305. ..................................................................................... 102

4.10 Генетический контроль деградации арилсульфонатов изучаемыми штаммами. 103

4.10.1 Плазмиды деградации арилсульфонатов бактерий вида Р.putida.................104

4.10.2 Плазмиды деградации арилсульфонатов бактерий вида Comamonas testosteroni. .................................................................................................................109

4.10.2.1 Плазмиды деградации бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот бактерий вида Comamonas testosteroni..........................................................................Ill

4.10.2.1.1 Плазмида деградации бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот рВS1010 штамма Comamonas testosteroni BS 1310......................................................115

4.10.2.1.2 Анализ коньюгативности плазмиды pBS1023 штамма C.testosteroni BS 1323. ...................................................................................................................119

4.10.2.2 Плазмиды деградации п-толуолсульфоновой и п-сульфобензойной кислот бактерий вида Comamonas testosteroni..........................................................................119

4.10.2.3 Плазмиды деградации 5-сульфосалициловой кислоты бактерий вида Comamonas testosteroni....................................................................................................121

4.11 Создание штаммов с расширенным спектром утилизируемых субстратов. ..121

4.12 Клонирование генов ферментов биодеградации арилсульфонатов штамма Р.putida BS 1304.................................................................................................................122

4.12.1 Создание клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304...................122

4.12.2 Анализ клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304......................123

4.12.3 Поиск клонированных генов катехол-2,3-диоксигеназы................................123

4.12.4 Анализ репрезентативности клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304. ..................................................................................................................125

4.12.5 Поиск клонированных генов бензолсульфонат-диоксигеназы.......................125

4.12.6 Анализ клонированного гена катехол-2,3-ДЖ>ксигеназы................................129

4.12.7 Рестрикционный анализ клонированных фрагментов ДНК плазмиды pBS1004, несущих ген катехол-2,3-Диоксигеназы.......................................................129

4.12.8 Анализ экспрессии клонированного гена катехол-2,3-Диоксигеназы в клетках E.coli. .................................................................................................................134

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................136

6. ВЫВОДЫ ....................................................................................................................155

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................156

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы.

Масштабы поступления синтетических органических соединений в окружающую среду в результате хозяйственной деятельности человека возрастают год от года. Различные сульфоароматические соединения чрезвычайно широко применяются в промышленности и в быту, особенно в качестве поверхностно-активных веществ (ПАВ) и азокрасителей. Поэтому они часто и в больших количествах содержатся в индустриальных и бытовых стоках. Весь объем ПАВ на основе арилсульфонатов в силу их назначения целиком попадает в сточные воды. Ксенобиотический характер сульфо-группы придает ароматическим сульфонатам повышенную устойчивость к микробной деструкции. Это является причиной аккумуляции данного класса трудноразлагаемых загрязнителей в различных экосистемах, в первую очередь - в природных водоемах. В связи с этим проблема биодеградации сульфоароматических веществ приобретает все большую актуальность. Вследствие повсеместного применения сульфоароматических соединений особый интерес вызывает распространение способности к деструкции арилсульфонатов среди микроорганизмов, а также роль отдельных микробиологических таксонов в их деградации в естественных условиях. Определение биохимии катаболизма ароматических сульфонатов и генетического контроля биодеградации данных соединений также является неотъемлемым условием формирования целостного представления о роли микроорганизмов в разложении этих веществ в природе. Исследование микробной деструкции арилсульфонатов имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Изучение деструкции сульфоароматических веществ микроорганизмами необходимо для установления принципиальной биоразлагаемости данного класса загрязнителей, а также служит удобной моделью исследования формирования и распространения способности разлагать ксенобиотики у микроорганизмов. В то же время это является теоретической базой для создания новых эффективных биотехнологических методов борьбы с загрязнением огружающей среды данными химическими соединениями.

1.2 Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы было изучение деструкции различных сульфоароматических соединений природными микроорганизмами. В связи с этим ставились следующие конкретные задачи:

1. Исследовать распространение микроорганизмов, способных разлагать сульфоароматические соединения в различных экосистемах.

2. Выделить бактерии-деструкторы арилсульфонатов, идентифицировать их до вида.

3. Изучить усвоение сульфоароматических субстратов микроорганизмами в качестве источников углерода и серы, а также динамику роста бактерий на данных субстратах.

4. Проанализировать основные ферментные активности разрыва ароматического кольца в клетках всех штаммов. Определить биохимические пути катаболизма арилсульфонатов.

5. Изучить природу генетического контроля деструктивной активности штаммов. Охарактеризовать бактериальные плазмиды био деградации арилсульфонатов.

1.3 Научная новизна работы.

В ходе выполнения настоящей работы впервые описано широкое распространение микроорганизмов, деградирующих ароматические сульфонаты, в активном иле искусственных биологических очистных сооружений. Впервые показано, что среди микроорганизмов активного ила способность разлагать ароматические сульфонаты преимущественно распространена среди бактерий вида Comamonas testosteroni. Создана коллекция бактерий-деструкторов, включающая 30 штаммов. Впервые описана деградация арилсульфонатов бактериями Pseudomonas stützen. Впервые описана бактериальная деструкция 5-сульфосалицилата. На примере штамма Р.putida BS 1331 впервые показана индукция системы десульфонирования бензолсульфонатом. Впервые описана трансформация п-толуолсульфоната с образованием 4-метилкатехола, осуществляемая этим штаммом. На примере штамма Р.putida BS 1332 впервые описано разложение п-толуолсульфоната с участием ферментов орто-окисления

катехола. Впервые показано широкое распространение плазмид биодеградации арилсульфонатов у природных микроорганизмов. Плазмиды биодеградации арилсульфонатов бактерий рода Сотатопая описаны впервые. Впервые проведено клонирование генов биодеградации арилсульфонатов. Клонирован ген катехол-2,3-диоксигеназы, участвующей в катаболизме бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом Р.риШа В81304.

1.4 Практическое значение результатов.

Полученные данные по широкому распространению способности разрушать ароматические сульфонаты среди микроорганизмов активного ила демонстрируют принципиальную возможность биологического разложения данных загрязнителей традиционными методами очистки. Использование выделенных бактерий-деструкторов перспективно с точки зрения создания биопрепаратов для очистки локальных загрязнений. Полученный трансконьтюгантный штамм СЛезшгегот В81305(рВ81010) с расширенным спектром утилизируемых сульфоароматических субстратов может быть использован при очистке высокозагрязненных стоков, содержащих различные арилсульфонаты. На основе штамма СЛейШ1егот В81310 (рВ81010) и его бесплазмидного варианта В81320 в сотрудничестве с ВНТК "Биосенсор" ИБФМ РАН сконструирован и апробирован высокоспецифичный, высокочувствительный и стабильный биосенсор для детекции бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Бактерии рода Pseudomonas

Род Pseudomonas описан Мигула в 1894 (Migula, 1895) году для неспорооб-разующих грамотрицательных бактерий с полярными жгутиками. Наряду с родами Bacillus и Bacterium он был включен в состав семейства Bacteriaceae.

В описании рода, опубликованном в 1895 году (Migula, 1895), клетки бактерий характеризовались как "цилиндрические, длинные или короткие, иногда образующие небольшие нити, движущиеся с помощью полярных жгутиков, число которых на одном полюсе колеблется от 1 до 10, чаще 1 или 3-6. Спорообразование редко". Таким образом, первая классификация бактерий рода Pseudomonas строилась на их морфологии, подвижности, характере расположения жгутиков. Среди видов рода первым был описан Pseudomonas руосуапеа. В 1-м издании определителя Берги род Pseudomonas был включен в порядок Eubacteriales, семейство Bacteriaceae, трибу Cromobacteriaceae. Основное внимание в описании рода было уделено пигментам, характер пигментообразования на протяжении долгих лет оставался одним из важных критериев в систематике и идентификации микроорганизмов рода Pseudomonas.

В 1966 году Стейнером, Паллерони и Дудоровым была осуществлена ревизия систематического положения рода Pseudomonas (Stanier, Palleroni, Doudoroff, 1966). Эти исследования позволили провести фенотипическую классификацию 267 штаммов бактерий и выделить среди них несколько хорошо очерченных видов, четко диагностируемых на основании предложенных критериев. Были описаны флюоресцирующая группа с видами Р.aeruginosa, Р.putida и P.fluorescens, ''Асidovorans''-группа с видами P.acidovorans и P.testosteroni, "Аlealigenes"-группа с видами P.alcaligenes и P.pseudoalcaligenes, а также виды Р.multivorans, P.stutzeri, P.maltophilia. Предложенные Стейниером с соавторами методические подходы дали мощный толчок развитию систематики рода Pseudomonas. Полученные данные расширили представления о свойствах бактерий рода Pseudomonas, позволили сформулировать родовой диагноз и были использованы для построения ключей и диагностических