Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфоната и фенола

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфоната и фенола"

На правах рукописи

МАКАРЕНКО Александр Александрович

БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ И ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ COMAMONAS И PSEUDOMONAS - ДЕСТРУКТОРОВ л-ТОЛУОЛСУЛЬФОНАТА И ФЕНОЛА

03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□317БЭ14

Саратов - 2007

003176914

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) учебного центра биохимии и физиологии микроорганизмов Путинского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

А Н Решетилов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор О В Игнатов

доктор биологических наук, профессор А А Щербаков

Ведущая организация

Институт биохимии им А H Баха, г Москва

Защита состоится «_» 2007 г в часов на заседании диссерта-

ционного совета Д 002 14601 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г Саратов, просп Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН

Автореферат диссертации размещен на сайте

http /"www ibppm saiatov щ/obvavdis html « » 2007 г

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

В Е Никитина

Актуальность проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн тонн сульфонатов Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов, только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(THK-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации В связи с этим задача обнаружения токсичных веществ, в частности, фенолов и сульфоароматических соединений, в объектах окружающей среды, относится к разряду актуальных В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе Одним из важных условий является снижение стоимости анализа Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе - токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля Важную роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать биосенсоры для детекции различных органических соединений Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны биосенсоры микробного или другого типов для анализа сульфоароматики, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке фермент-

ных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования

Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами и-толуолсульфоната, как представителя сульфоароматических соединений, и фенола, соответственно

Были поставлены следующие задачи:

1 На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции w-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала

2 Оценить характеристики процесса деградации «-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометриче-ской детекции (кислородного электрода типа Кларка) Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров

3 Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции «-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмид-ного штаммов С testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas

4 Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства

Научная новизна работы. Выбраны штаммы, обладающие характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции «-толуолсульфоната и фенола и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде Оценены характеристики процесса деградации и-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка) Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции л-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов С testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas Показано, что сенсоры, основанные на плазмидсо-

держащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соединений Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плазмидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров

Практическая значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции н-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов, так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструктров л-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации

Разработанные модели биосенсоров могут составить основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плаз-мидный и бесплазмидный штаммы, соответственно Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий

Результаты, полученные при изучении разложения п-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа

Качественная оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки Предложен метод оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Аэробные микроорганизмы-деструкторы при разложении целевого вещества потребляют кислород Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений Плазмидная детерминированность катаболизма целевого соединения позволяет создавать пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества

Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 22 рисунка Библиографический указатель содержит 207 источников литературы

Апробация работы и публикации Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях "Биокатализ-98" (Пущине, 1998), "Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (3-я Научно-техническая конференция, Москва, 1999), Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор - 2000" (Санкт-Петербург, 2000), "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (Оболенск, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001) Всего по материалам диссертации опубликовано 13 работ - 8 публикаций материалов конференций, 3 статьи в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 1 статья в журнале «Известия ТулГУ», 1 статья в журнале «Экологические системы и приборы»

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.Исследование способности микроорганизмов к деградации то-луолсульфоната (ТС). В работе использован бактериальный штамм Сотатопаз ¡езЮ51егоп1 ВБ1310, содержащий плазмиду катаболизма бензол-сульфоната и ТС (рВБЮЮ), размером 130 тпн Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО "Новомосков-скбытхим", г Новомосковск Тульской области, и предоставлен для исследования лабораторией биологии плазмид ИБФМ им Г К Скрябина РАН Культуру выращивали на минеральной среде Е с ТС в качестве единственного источника углерода и энергии Полученные клетки отделяли центрифугированием, после чего промывали калий-фосфатным буфером Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе Клетки иммобилизовали в 2%-ный агаровый гель при температуре 45°С Полученный блок геля с иммобилизованными клетками гранулировали, продавливая через сито с размером ячеек 500 мкм Гранулы агара с иммобилизованными клетками промывали буфером декантацией 3-5 раз в цилиндре объемом 250 мл, отбирая 1-минутную фракцию

1.1. Трансформация ТС свободными клетками. Процесс осуществляли свободными отмытыми клетками в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера ТС вносили в виде водного раствора в конечной концентрации 1 25 мМ Концентрация (по массе сухих клеток) в реакци-

онной среде составляла 0 4 мг/мл Для контроля динамики процесса через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробы объемом 2 мл Концентрацию ТС измеряли после удаления клеток центрифугированием в течение 15мин при 5000 g Концентрацию ТС определяли двумя способами спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность ОП2бь и обращенно-фазовой жидкостной хроматографией высокого давления, измеряя ОП254 Значение скорости деградации рассчитывали по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку рабочей кинетической кривой Скорость деградации выражали в единицах удельной активности (нмоль • мин" мг'1 клеток (сухой вес))

1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками. Трансформацию ТС клетками, включенными в агаровый гель, осуществляли в условиях, аналогичных для свободных клеток

1.3. Оценка стехиометрии процесса окисления ТС клетками. Потребление кислорода свободными и иммобилизованными клетками измеряли в закрытой ячейке с помощью электрода Кларка В качестве среды использовали калий-фосфатный буфер, pH 7 6 Измерения выполняли при 22°С в ячейке объемом 2 мл

1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях. Процесс осуществляли иммобилизованными клетками в стеклянной термостатированной колонке (реактор идеального вытеснения) Рабочий объем колонки составлял 5.7 мл, диаметр 1 7 см, высота колонки 2 5 см, концентрация клеток - 5 мг/мл геля Скорость подачи раствора в колонку варьировали от 72 до 353 мл/ч, что соответствовало удельной скорости от 12 до 62 ч Степень трансформации субстрата, выраженная в процентах от исходной концентрации, и производительность колонки (нмоль'мин''«мг'«клеток (по сухому весу)) оценивали, измеряя концентрацию ТС в элюате

2. Разработка микробного сенсора для определения ТС.

Иммобилизацию микроорганизмов С testosterom BS1310 производили их включением в 2%-ный агаровый гель в соответствии с методикой, примененной при исследовании процесса биодеградации л-толуолсульфоната Из геля формировали мембрану толщиной 0 3 - 0 5 мм и площадью 20 мм2, которую фиксировали на измерительной поверхности электрода Кларка Измерения проводили в кювете объемом 5 мл при температуре 20°С и постоянном перемешивании Измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dl/dt, нА/с) при введении исследуемого вещества

3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола.

3.1. Объектом исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из почв месторождений нефти Западной Сибири и хранящиеся в коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им Г К Скрябина РАН Штаммы выделялись методом накопительных культур с использованием в качестве субстрата нефти и дизельного топлива Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса, содержащей нефть в качестве единст-

венного источника углерода и энергии, в течение 3-5 дней. Разведения высевали на агаризованную среду Е с нефтью Отдельные колонии, выросшие на нефти, пересевали Выделено свыше 100 штаммов - деструкторов нефти и нефтепродуктов Отдельные штаммы проверялись на способность к росту на индивидуальных субстратах - компонентах нефти нафталине, 2- метил -нафталине, фенантрене, гексадекане, м-крезоле, феноле и ряде других Двадцать восемь штаммов оказались способны к утилизации фенола

Для культивирования утилизирующих фенол микроорганизмов использовали минеральную среду Е Состав среды Эванса следующий (г/л или мл/л) К2НР04 - 8 71 г, 5 М раствор NH4CI - 1 мл, 0 1 М раствор Na2S04 - 1 мл, 62 мМ раствор MgCI2 - 1 мл, 1 мМ раствор СаС12 - 1мл, 0 005 мМ раствор (NH4)6Mo7024 4Н20, микроэлементы — 1мл (состав микроэлементов в г/л) ZnO - 0 41 г, FeCI3 6 Н20 - 5 4 г, MnCI2 4HzO - 2 г, CuCI2 2Н20 - 0 17 г, СоС12 6Н20 - 0 48 г, Н3ВО3 - 0 06 г, (рН 7 0)

Для получения агаризованной среды того же состава в нее добавляли 1 5% агара В качестве единственного источника углерода и энергии использовали пары фенола

3.2. Штаммы-деструкторы фенола. В эксперименте были использованы 8 штаммов грамотрицательных бактерий, отобранные из 28 штаммов, способных к росту на моноциклических ароматических субстратах, в том числе на феноле, и характеризующиеся наибольшей скоростью роста, и 1 штамм-деструктор нафталина (Р putida BS394(p20)) Штаммы были предоставлены для исследований Лабораторией биологии плазмид ИБФМ им Г К Скрябина РАН и исходно были выделены из почв нефтяных месторождений Западной Сибири

Проводилась предварительная идентификация отобранных штаммов Высев штаммов на среду KingB и дальнейший анализ под UV показал, что все 9 штаммов относятся к флуоресцирующим псевдомонадам Далее видовую принадлежность штаммов флуоресцирующих псевдомонад определяли на основании ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) продуктов амплификации гена 16S рРНК с использованием мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции Rsa\, Mspll и Haelll Рестрикционные фрагменты 16S рДНК разделяли электрофоретически в 2%-м агарозном геле В качестве контрольных штаммов использовали хорошо изученные и охарактеризованные штаммы Р putida mt-2 (Nelson et al, 2002), P fluoresces 2-79 (Weller, 1983) и P aeruginosa РАК NP1 (Delaney et al, 2001) Результаты ARDRA показали, что 7 из используемых штаммов принадлежат предположительно к Р putida mt-2 и только один из них, А-13 по- видимому, относится к Р fluorescens

Исследовалась способность выбранных штаммов к росту на различных субстратах Ни один из штаммов не был способен к росту на полициклических ароматических углеводородах Штаммы росли на бензоате. Штамм А-13 помимо способности к росту на феноле, мог использовать также гексаде-кан в качестве единственного источника углерода и энергии

3.3. Иммобилизацию клеток проводили методом физической сорбции на хроматографической бумаге, для чего 10 мкл клеточной суспензии наносили на бумагу (5x5 мм2) и высушивали в течение 20 мин Сформированный таким образом рецепторный элемент фиксировали на рабочей поверхности кислородного электрода Кларка Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dl/dt, нА/с) Измерения проводили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при 20°С и постоянном перемешивании раствора

3.4. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом.

Иммобилизацию активного ила проводили физической сорбцией на активированном угле Размер гранул активированного угля составлял 1 -3 мм Для иммобилизации применяли осадок ила, получаемый после 30 мин отстаивания иловой смеси в цилиндре объемом 1 л Удельная скорость протока через колонку была постоянной и составляла 0 2 мин"1 Объем стоков, пропускавшийся через колонку, был постоянным и составлял 300 мл (5 объемов колонки) Диаметр колонки составлял 30 мм, высота 90 мм Конструкция колонки обеспечивала возможность применения аэрации среды Концентрацию кислорода на выходе определяли титриметрически по методу Винклера

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биодеградация ТС бактериями С. testosterom BS1310(pBS1010).

Штамм С testosterom BS1310 (pBS1010) был использован как основа биореактора для деградации ТС в периодических и непрерывных условиях

1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях. На рис 1 представлены кинетические кривые катаболизма ТС свободными и включенными в агаровый гель клетками С testosterom BS1310 (pBS1010) при начальной концентрации субстрата 1 25 мМ Включение клеток в агаровый гель приводило к снижению их активности на 25% (оценка по начальной скорости деградации), так, скорость превращения ТС иммобилизованными и свободными клетками составляла 11 0 и 14 6 нмоль мин'1 мг"1 клеток, соответственно Снижение скорости процесса в случае применения иммобилизованных бактерий обусловлено, вероятно, диффузионными ограничениями для проникновения ТС и/или кислорода в гранулы геля При изучении дыхательной активности свободных и иммобилизованных клеток было установлено, что деградация ТС сопряжена с потреблением 2 молей кислорода при окислении 1 моля ТС Скорость потребления 02 иммобилизованными клетками была также на 25% ниже, чем свободными, и составляла 22 0 нмоль*мин"1,мг"1 Как известно из литературных данных, для штамма С testosterom BS 1310 (pBS1010) путь деградации ТС включает его десульфонирование с последующим окислением по мета-пути и окислением образовавшегося катехола до пировиноградной кислоты Первые две реакции идут с потреблением кислорода Аналогичные результаты были описаны в литературе при исследовании процессов деградации сульфоарома-

тических соединений микроорганизмами При сопоставлении имеющихся данных с полученными нами результатами можно сделать вывод о сходстве процессов деградации бензолсульфоната и его производных у бактерий-деструкторов

1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях. Были изучены параметры трансформации ТС включенными в агаровый гель клетками С testosterom BS1310 (pBSlOlO) на колонке (реактор идеального вытеснения, начальная концентрация ТС составляла 250 мкМ) Как показано на рис 2, степень разложения субстрата (зависимость 1) составляла в среднем 35% при скоростях протока от 10 до 40 ч"1, при повышении скорости протока происходило снижение степени разложения Этот эффект обусловлен тем, что при высоких скоростях протока количество субстрата, которое не переработано клетками, увеличивается, чем и обусловлено происходящее снижение степени окисления Производительность иммобилизованных клеток (зависимость 2) была максимальной при скорости протока 45 ч"1 и составляла 10 4 нмоль,мин"1,мг'1, что соответствует производительности иммобилизованных клеток, полученной при трансформации ТС в периодических условиях при той же концентрации субстрата Можно предполагать, что лимитирующей стадией процесса деградации в колонке является концентрация кислорода в среде, что и обусловливает невысокую степень превращения субстрата (35%) Лимитирование процесса деградации ТС по кислороду (на 1 моль ТС требуется 2 моля кислорода) вносит определенные коррективы в применении иммобилизованных клеток при создании биосенсора колоночного типа Следует иметь в виду, что верхний теоретический предел обнаружения ТС, выполняемый с помощью биосенсора колоночного типа, не может превышать 125 мкМ, поскольку максимальная растворимость кислорода в воде составляет 250 мкМ при стандартных условиях Для повышения степени превращения субстрата можно рекомендовать дополнительную аэрацию

В оптимальных условиях (абсолютной скорости протока 170 мл*ч"' и относительной скорости протока 45 ч*1) реактор функционировал без потери активности в течение 5 суток, через 8 суток активность снижалась в два раза

Рис 1 Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками С testosterom в периодических условиях

Рис. 2 Зависимости деградации ТС и продуктивности процесса от удельной скорости протока через колонку Входная концентрация ТС составляла 250 мкМ

2. Сенсор для детекции я-толуолсульфоната (ТС).

Штамм Сотатопаз 1езго81егот ВБИЮ, использованный в биореакторе для разложения л-толуолсульфоната, был применен в качестве основы биосенсора мембранного типа для определения и-толуолсульфоната в водных средах

2.1. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма С. ХеьгоМетот В81310.

На рис 3 показана калибровочная зависимость биосенсора для детекции и-толуолсульфоната Биосенсор характеризовался высокой чувствительностью, которая составила 0 17 нА/с Нижний предел детекции (определяемый как концентрация субстрата, ответ на которую вдвое превосходит значение относительной ошибки) составил величину ~5 мкМ Верхний предел детекции (определяемый как нижняя часть диапазона концентраций, в котором амплитуда ответов сенсора в зависимости от концентрации не превышает величину относительной ошибки более чем в два раза) равнялся 1 мМ, при более высоких концентрациях наблюдали насыщение зависимости Сравнение верхнего предела детекции мембранного сенсора (1 мМ) и предельной концентрации ТС, разрушаемой в реакторе с вытеснением (125 мкМ), показывает, что указанные концентрации различаются почти в 10 раз Поскольку реактор с вытеснением также может рассматриваться как элемент биосенсора колоночного типа, можно отметить, что для детекции «-толуолсульфо ната более предпочтительно использовать сенсор мембранного типа в тех случаях, где ожидается его присутствие в более высоких концентрациях.

С целью подбора оптимального режима измерений сенсором исследовали влияние внешних факторов на амплитуду сигналов сенсора Максимальный ответ наблюдали при 35°С, при более высоких значениях температуры величина сигнала снижалась, по-видимому, в связи с частичной инакти-

вацией ферментных систем бактерий Оптимальным значением является рН 7 6, что совпадает с рН-оптимумом роста использованного штамма

Изучение зависимости ответов сенсора от ионной силы раствора (обеспечивали путем изменения концентрации NaCl в буферном растворе) показало, что максимальные сигналы соответствовали содержанию NaCl в растворе, равному 30 мМ Отметим, что сенсор на основе С testosterот BS1320 (бесплазмидный штамм, субстрат сенсора - этанол) был менее чувствителен к концентрации солей, чем сенсор на основе исходного штамма (субстрат - я-толуолсульфонат) Возможное объяснение полученных зависимостей заключается в том, что у бактерий, содержащих плазмиду деградации, происходит ингибирование систем активного транспорта сульфоароматиче-ских соединений или ингибирование ферментативной активности высокими концентрациями солей, присутствующих во внешнем растворе Для проверки этого предположения была получена зависимость ответа сенсора на основе плазмидсодержащего штамма для этанола в концентрации 10 мМ Вид полученной кривой был аналогичен полученной для ионной зависимости штамма С testosterom BS1320

Рис 3 Калибровочная зависимость сенсора на основе иммобилизованных клеток С 1ехШ1егот В81310 (рВ81010) Исследуемое вещество - ТС

Зависимость сигналов сенсоров от концентрации клеток в биорецеп-торном элементе приведена на рис 4 Для изученного штамма оптимальным объемным соотношением клетки/агар в рецепторе являлось значение 1 10 (концентрация клеток в агаре по сухому весу составляла 30 мг/мл) Снижение величины ответа при более высоких концентрациях биомассы, по-видимому, объясняется недостатком 02 в области рецепторного элемента вследствие интенсивного фонового дыхания клеток, что подтверждается снижением базового уровня сигнала электрода с иммобилизованными клетками

Стабильность сенсора изучали путем периодических измерений контрольных концентраций исследуемого вещества через определенные промежутки времени (4 раза/сут) Ответы сенсора сохраняли постоянный уровень в течение двух недель при хранении геля с иммобилизованными клетками С /еу/ол/егои/ В81310 при комнатной температуре В случае хранения при 4°С чувствительность рецепторных элементов не снижалась в течение 24 сут

ооо.........................' ■ '

О 30 60 90 120 150

Кошюприция клеток в агаре мг/мл

Рис 4 Зависимость величины сигналов микробных сенсоров на основе иммобилизованных клеток С 1ез1о51егоп1 ВБ1310 (рВйЮЮ) и элиминанта С Ш(о$1егот В81320 от концентрации клеток в агаре 1 - штамм С 1е$Ш1егот ВЭ1310 (рВЙЮЮ), субстрат - ТС (25 мкМ), 2 - штамм С ВЭШО, субстрат - этанол (10 мМ)

Приведены средние значения величин и их стандартные отклонения Число измерений для каждой концентрации составляло 5

Сенсор на основе бактерий С ?е5/<мГегош ВБШО (рВБЮЮ) обладал высокой специфичностью к л-толуолсульфонату, бензолсульфонату и катехо-лу (рис 5) Высокая чувствительность сенсора к катехолу объясняется, по-видимому, тем, что это соединение является интермедиатом катаболизма сульфоароматических соединений (рис 6)

Следует отметить, что биосенсор на основе штамма С 1е8Ш(егот В81320 был практически нечувствителен к сульфоароматике, что объясняется отсутствием плазмиды рВБЮЮ Сигналы сенсора в ответ на введение кате-хола и других ароматических соединений были также невелики (что можно объяснить потреблением кислорода химическим путем при диссоциации исследуемых соединений), в то время как чувствительность к углеводам, спиртам и органическим кислотам была близка к чувствительности биосенсора на основе С В81310 (рВБЮЮ) Это обстоятельство позволяет сде-

лать предположение о потенциальной эффективности дифференциальной системы детекции сульфоароматических соединений, включающей сенсоры на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов В этом случае сигнал, обусловленный присутствием целевого соединения в пробе, может быть получен путем вычитания сигналов измерительного и вспомогательного сенсоров

Субстраты в концентрации 10 мМ

Рис. 5. Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного (темные столбики) и бесплазмидного (светлые столбики) штаммов С. 1е$1о81егот. Все субстраты тестировали в концентрации 10 мМ. Обозначения: 1 - ТС, 2 - фенол, 3 - салицилат, 4 - бензоат, 5 - бензолсульфонат, 6 - сульфобензоат, 7- катехол, 8 - алкилбензол-сульфонат, 9 - арабиноза, 10 - арабит, 11 - глицерин, 12 - этанол, 13 - глюкоза, 14 -ксилоза, 15-ксилит, 16-метанол, 17 - сорбит, 18 - цитрат-ион, 19 - ацетат-ион, 20 -сорбоза, 21 - додецилсулъфат 1Ча.

Рис. 6. Схема катаболизма ТС.

В рамках данной работы была произведена сравнительная оценка субстратной чувствительности сенсора на основе бактерий С. ге^оягегош В81310 (рВБЮЮ), выращенных на бензолсульфонате и ТС. Чувствительность двух модифицированных моделей биосенсора к указанным веществам достоверно не различалась, что может служить косвенным подтверждением того, что деградация бензолсульфоната и ТС осуществляется одним ферментом.

Суммируя результаты, полученные при разработке модели микробного сенсора на основе бактерий С testosteroni BS1310 (pBSlOlO), можно отметить следующее Биосенсор обладает высокой чувствительностью к целевому соединению и позволяет производить его детекцию в модельных условиях с нижним пределом определения 5 мкМ Это обстоятельство в сочетании с высокой селективностью анализа делает возможным рассматривать созданный биосенсор в качестве прототипа промышленного анализатора арилсульфонатов Относительно оценки степени селективности в данном случае уместно привести сравнение параметров селективности для биосенсора на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Они составляют 11 к 1, (оценка получена как отношение сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного штаммов в ответ на целевое соединение) Таким образом, селективность сенсора на основе плазмидсодержащего штамма в 11 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного Чувствительность сенсора к ацетату, этанолу и глюкозе не следует рассматривать в качестве существенной помехи для анализа, поскольку данные вещества не встречаются в промышленных сточных водах, а, кроме того, как указывалось ранее, для снижения мешающего влияния можно использовать специальные методы измерения, например, дифференциальную детекцию Кроме того, имеются и другие варианты повышения селективности Так, способ повышения селективности анализа может быть основан на свойстве клеток, состоящем в том, что одной из первых стадий деградации арилсульфонатов данной культурой является их десульфонирование с высвобождением сульфита Таким образом, принципиально возможной схемой может быть формирование гибридного анализатора, включающего колоночный реактор с иммобилизованными клетками С testosteroni BS1310 и биосенсор для детекции сульфита (аналоги описаны в литературе) Такой подход, хотя и связанный с некоторым усложнением конструкции анализатора, позволил бы ограничить спектр детектируемых субстратов только сульфоароматическими соединениями

Важно отметить, что в литературе отсутствуют сведения о разработках микробных сенсоров для определения сульфоароматических соединений Имеются данные по исследованию специфичности к широкому спектру субстратов сенсоров на основе штаммов Pseudomonas rathonis Т, Pseudomonas sp 2Т/1, Р aeruginosa IS, P putida K, Achromobacter eurydice TK, тем не менее, чувствительность к сульфоароматическим соединениям не была обнаружена Таким образом, показанная в данном исследовании высокая чувствительность и специфичность биосенсора на основе штамма С testosteroni BS1310 (pBSlOlO) является важной как с теоретической, так и с практической точки зрения, и позволяет рассматривать созданную модель как основу аналитического прибора для детекции сульфоароматических соединений в реальных образцах

3. Разработка микробного биосенсора для детекции фенола.

3.1. Штаммы-деструкторы фенола.

Результаты оценки субстратной специфичности сенсоров на основе исследованных штаммов приведены на рис. 7. У штамма 32-1 величины ответов на фенол и катехол превышали величины ответов на углеводы в 5-7 раз. Следует отметить, что катехол вызывал у всех исследованных штаммов, кроме штамма 32-1, более высокий, по сравнению с фенолом, уровень сигнала. Для всех штаммов была характерна широкая субстратная специфичность. Величина сигналов, наблюдавшихся при введении моносахаров (кроме глюкозы и ксилозы), была в 2-3 раза ниже сигналов, вызванных низкомолекулярными спиртами с неразветвленной цепью.

Изучение генетического контроля утилизации фенола показало, что, по крайней мере, у двух штаммов, 32-1 и 83-1У, деградация этого соединения детерминирована генами, локализованными на плазмидах размером около 100 тпн. Штамм 32-1, проявивший высокую избирательность по отношению к фенолу, был исследован более детально.

Рис. 7. Субстратная специфичность исследованных штаммов. Все субстраты использовались в концентрации 10 мМ.

1-фенол, 2-этанол, 3-глицерин, 4-сорбит, 5-сорбоза, 6-ксилоза, 7-бутанол, 8-изопропанол, 9-глюкоза, 10-катехол, 11-нафталин, 12-арабит, 13-ксилит, 14-метанол, 15-пропанол, 16-изобутанол, 17-ацетат-ион, 18-я-толуолсульфонат, 19-бензолсульфонат, 20-арсенит-ион, 21-динитроортокрезол, 22-гранозан.

Рабочие названия исследованных штаммов:

1-394(р20), 2-А-13, 3-45-1, 4-32-1, 5-50-Ш, 6-81-1, 7-89-1, 8-74-Ш, 9-74-1.

3.2. Характеристика сенсора на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-1.

Субстратная специфичность плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-1 представлена на рис. 8. Сенсор на основе бесплазмидного варианта (32-1-1) был слабочувствителен к фенолу; чувствительность к остальным субстратам была сравнима с таковой для сенсора на основе плаз-мидсодержащего штамма 32-1.

Калибровочная зависимость штамма 32-1, построенная для фенола, представлена на рис. 9. Детекция фенола была возможна в диапазоне концентраций от 5 до 300 мкМ. Более высокие концентрации фенола вызывали ин-гибирование клеточного дыхания. Эффект ингибирования хорошо известен для микроорганизмов-деструкторов; в данном же случае применения бактериальных клеток в качестве основы биосенсора его количественная оценка необходима для того, чтобы избегать недостоверных результатов анализа. Область ингибирования продолжается до концентрации 10 мМ (когда отклик сенсора менее чем вдвое превосходит величину ошибки). При определении концентраций сенсором необходимо после проведения анализа произвести разбавление образца и провести повторное исследование для точного определения концентрации. Такой способ позволит детектировать образцы в концентрации от 5 до 10000 мкМ. Нижние пределы детекции для микробных сенсоров, описанных в литературе, сопоставимы с нижним пределом для сенсора на основе штамма 32-1. Полученные оптимальные значения для рН (7.4) и температуры (35°С) для штамма 32-1 позволяют произвести сравнение с аналогичными параметрами для ферментов, проявляющих фенолоксидазную активность Так, известно, что для р-тирозиназы оптимальными является рН 9.0 и температура 30°С, для фенол-2-монооксигеназы - рН 7.6 и температура 22°С, для полифенолоксидазы - рН 7.0 и температура 25°С, для лакказы - рН 7.0 и температура 37°С. Значение температурного оптимума для биосенсора на основе клеток, по-видимому, отражает не столько оптимум функционирования фермента, сколько общие закономерности работы клеточных систем.

о. о

" < а в

О

Субстраты в концентрации 10 мМ

Рис. 8. Диаграмма субстратной специфичности сенсоров на основе плазмид-ного и бесплазмидного вариантов штамма 32-1. Субстраты вводились в концентрации 10 мМ. Обозначение субстратов: фенол -фн. катехол - кх, салицилат - сл, гентизат -гт, бензоат - бз, динитрофенол - ДНФ, динитроортокрезол - ДНОК, глюкоза - гл. сор-боза - сб, ксилоза - кс, галактоза - гал, манноза - ман, изопропанол - ип, этанол - эт. бутанол — бт, метанол - мт.

Концентрация фенола, мМ

Рис 9 Калибровочная зависимость сенсора на основе иммобилизованных клеток плазмидсодержащего варианта штамма 32-1 Исследуемое вещество - фенол

Время непрерывных измерений сенсором, при котором сигналы снижались на 50% от исходной величины, составляло 30 часов Стабильные ответы (неизменные по амплитуде) наблюдали на протяжении 8 часов С целью проверки предположения о том, что причиной снижения сигналов сенсора является вымывание клеток из рецепторного элемента, исследовали стабильность сенсора при иммобилизации клеток в агаровый гель. Нашли, что при включении бактерий в гель принципиально характер стабильности не изменился Следовательно, причиной малого времени жизни сенсора является снижение активности в результате гибели клеток, а не потеря активности ферментов, окисляющих фенол, данное заключение основано на том, что сигналы сенсора снижались пропорционально в отношении всех измеряемых соединений Это позволило сделать вывод о снижении клеточной активности в целом, а не активности отдельных ферментных систем. Для решения проблемы стабильности представляется целесообразным исследовать другие методы и носители для иммобилизации

Поскольку ко всем остальным веществам, кроме фенола и катехола, чувствительность сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного варианта штамма 32-1 была сопоставима, можно сделать предположение о возможности использования сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма в системе дифференциальной детекции фенола в средах сложного состава

4. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода.

4.1. Практическая апробация колоночного реактора.

Применение созданных лабораторных макетов биосенсоров на основе штамма-деструктора ТС и штамма 32-1 для анализа сточных вод нефтеперерабатывающего производства (г Лисичанск, предприятие Лисичанскнеф-теоргсинтез) показало, что основным эффектом при контакте сенсора со стоками является ингибирование клеточного дыхания Наблюдаемый эффект

объяснили присутствием токсичных компонентов стоков На основе лабораторных анализов по основным компонентам стоков можно предположить, что ингибирование было обусловлено присутствием значительного количества токсичной органики (химическое потребление кислорода -ХПК - 300 мг/л и более) и сульфидов (более 20 мг/л) Это послужило основанием для выполнения серии тестов, основанных на полученном ранее опыте по изучению деградации ТС в колоночном реакторе, содержащем С Ге,у?сШегош ВБПК) (рВБЮЮ) и направленном на исследование возможности использования для определения токсичных соединений в сточных водах микроорганизмов активного ила, применяемых при их очистке В данном случае в колоночном реакторе вместо бактериальных клеток применили активный ил водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства, который, по сути, является более адаптированным биоматериалом для подобных анализов

Для работы с реальными стоками иммобилизацию микроорганизмов активного ила производили на активированном угле Объемное соотношение отстоявшегося активного ила и носителя составляло 1 5 Реактор использовался в двух вариантах - без аэрации и с принудительной аэрацией Были рассмотрены три варианта заполнения колонки иммобилизованным илом -30, 60, 90 мм (высота колонки составляла 90 мм) Контролем служил реактор, заполненный активированным углем без микроорганизмов Постановка такого контроля представлялась необходимой, поскольку активированный уголь обладает высокой сорбционной способностью и часть веществ поглощается носителем Измеряемым параметром являлась концентрация фенола в стоке до и после его пропускания через колонку Полученные результаты по уменьшению концентрации фенола в пропускавшемся через колонку стоке представлены на рис 10 На колонках без аэрации степень деструкции не изменялась в зависимости от высоты колонки и в целом была низкой На колонках с аэрацией получена пропорциональная зависимость На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что для мониторинга реальных сточных вод необходимо использовать микроорганизмы активного ила, адаптированные к жизнедеятельности в присутствии токсичных соединений Лабораторные микроорганизмы, специфически разлагающие целевое вещество, не справляются с токсичными соединениями сточных вод, и их использование в таких условиях невозможно Но при этом необходимо учитывать высокое потребление кислорода, для работы подбирать невысокие концентрации биомассы и производить соответствующее разбавление сточных вод Другим путем может быть использование сенсора в мембранном варианте вместо колоночного

Можно предположить, что в экспериментах с колонкой без аэрации (зависимость 1) имеет место лимитирование процесса окисления целевых веществ по кислороду, поскольку на колонках различной высоты получены практически одинаковые результаты по степени снижения концентрации фенола и степень деструкции в целом была низкой В колонках с принудительной аэрацией (зависимость 2) получена пропорциональная от высоты колонки

степень снижения концентрации фенола, что означает необходимость применения гипераэрации при работе в таких условиях

Рис 10 Уменьшение содержания фенола в стоках, пропущенных через колоночный реактор с активным илом Число измерений по каждому опыту составляло 5 Погрешность измерений 6%

Тесты с применением колоночного реактора с активным илом позволили сделать следующие выводы

- использованный реактор колоночного типа без аэрации представляет собой модель биосенсора, с помощью которого можно выполнять оценку индекса БПК стоков

- использованный реактор колоночного типа с аэрацией представляет собой модель аэротенка, из чего следует, что существенным параметром в работе аэротенка является содержание кислорода в среде, поскольку его недостаток может снижать эффективность очистки стоков Из полученных данных следует, что для оценки общего состояния сооружений биохимической очистки необходимо в первую очередь провести анализ концентрации кислорода по всему профилю аэ-ротенков

Относительно биосенсорного мониторинга стоков можно предположить, что для оценки общего количества органических примесей в стоках целесообразно применение низкоселективных микробных сенсоров, например, на основе активного ила данного водоочистного предприятия, адаптированных к химическому составу тестируемых сточных вод, которые позволят производить оценку индекса БПК Биосенсоры с высокой селективностью не являются инструментом, пригодным для проведения такого анализа, как правило, его выполнению в таких случаях должна предшествовать стадия определенной пробоподготовки или специфической калибровки биосенсора В данном исследовании активный ил был использован как основа колоночного

реактора - модели биосенсора На основе исследования параметров реактора был предложен метод качественной оценки окислительной активности микроорганизмов биоценоза активного ила и их общего состояния Этот способ предполагает измерение концентрации кислорода на входе и выходе колонки с иммобилизованным активным илом По разнице концентраций можно оценить общее состояние активного ила и его окислительную способность Поскольку колоночный реактор с аэрацией является моделью аэро-тенка, на основе полученных результатов было сделано предположение о целесообразности проверки эффективности функционирования реальных аэро-тенков водоочистных сооружений

4.2. Использование полученных данных для оценки эффективности процесса очистки стоков в аэротенках установки биохимической очистки.

В экспериментах на колонке с иммобилизованным активным илом без аэрации, как показали тесты, возникало ограничение убыли фенола, обусловленное лимитированием процесса по кислороду На колонке с аэрацией ограничения не возникало и убыль фенола была пропорциональна высоте колонки, что позволяет прийти к заключению о том, что эффективность деградации в значительной степени определяется уровнем аэрации реактора

В связи с наблюдаемым эффектом нам представлялось важным применить полученные данные к контролю условий, в которых происходит очистка стоков нефтехимического предприятия на установках биохимической очистки, являющихся, по сути, реакторами с принудительной аэрацией, прототипом которого (но без принудительной аэрации) является разработанный нами колоночный сенсор

Цели данного раздела работы заключались в оценке состояния аэро-тенков очистных сооружений нефтеперерабатывающего производства и оптимизации их работы, при необходимости Было решено проверить степень насыщения кислородом водной фазы по профилю аэротенка Для данных измерений применили кислородный электрод Кларка, т е датчик, который в первой части исследования был использован как преобразователь биосенсоров для детекции ТС и фенола Результаты, полученные по исходному состоянию всех аэротенков первого и второго блоков, показали, что распределение кислорода, как по аэротенкам, так и в пределах каждого аэротенка, неравномерное Обнаружили, что зоны гипераэрации чередовались с анаэробными зонами В результате проведенной работы удалось добиться равномерного распределения кислорода как в пределах каждого аэротенка, так и по сооружениям в целом

Достигнутый результат можно выразить следующим образом Снижение ХПК в среднем по сооружениям составляло 200 мг/л До начала мероприятий по оптимизации работы сооружений снижение ХПК в среднем составляло 170 мг/л Проведенные мероприятия позволили увеличить степень очистки по ХПК на аэротенках на 17%

Выводы

1 Создана модель микробного биосенсора, обладающего высокой чувствительностью и селективностью в отношении сульфоароматических соединений В основе биорецептора использован штамм С testosteroni BS1310 (pBSlOlO) несущий плазмиду биодеградации сульфоароматических соединений pBSlOlO Показано, что биосенсор мембранного типа позволяет производить экспресс-анализ «-толуолсульфоната в модельных средах в диапазоне детекции 5 - 1000 мкМ Чувствительность сенсора по отношению к толуол-сульфонату составляет 0 17 нА/с(мМ"') Использование плазмидсодержащих бактерий в сенсоре позволяет в 11 раз повысить селективность в отношении «-толуолсульфоната по сравнению с сенсором на основе бесплазмидного штамма

2 Для упрощенной модели дифференциальной детекции произведена оценка возможной ошибки измерения целевых соединений - толуолсульфона-та и фенола на фоне исследованных мешающих примесей Погрешность детекции составит 24% при определении и-толуолсульфоната, 11% при определении общего содержания сульфоароматических соединений, 35% при определении фенола и 12% при определении общего содержания ароматических соединений в случае равной концентрации как мешающих, так и целевых соединений При анализе реальных сточных вод, содержащих преимущественно целевые соединения, погрешность должна существенно снизиться

3 Впервые экспериментально показали, что окисление п-толуолсульфоната бактериальными клетками Comamonas testosteroni BS1310 как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии происходит в стехио-метрическом соотношении 2 1 (кислород и-толуолсульфонат) Полученные данные составили основу для выбора типа биорецептора - мембранного или колоночного - при создании биосенсора для детекции данного соединения

4 Бактериальный штамм, принадлежащий к роду Pseudomonas (рабочая маркировка "32-1"), использовали как основу биосенсора для детекции фенола Измерение концентрации фенола было возможно в диапазоне 5-300 мкМ Нашли, что в отношении фенола селективность сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма Изучили параметры биосенсора и их зависимость от внешних условий

5 На основании выполненных тестов с активным илом водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства представили рекомендации по оптимизации работы очистных сооружений, заключающиеся в проведении контроля степени оксигенации стоков Реализация критерия на практике позволила на 17% увеличить очистку стоков (оценка по индексу ХПК)

Список работ, опубликованных по теме диссерт«» ии

Статьи:

1 Штамм Comamonas testosterom BS1310 (pBSlOlO) как основа биосенсорного анализатора сульфоароматических соединений/ Макаренко А А , Балашов С В , Кувичкина Т Н , Ильясов П В , Решетилов АН// Прикладная биохимия и микробиология - 1999 - Том 35, № 3 - С 417-421

2 Биосенсор для детекции сульфоароматических соединений на основе клеток Comamonas testosterom BS1310 (pBSlOlO)/ Макаренко А А , Балашов С В , Качурин Н М , Свиридова Т С , Кувичкина Т Н , Ильясов П В , Решетилов АН// Изв ТулГУ, сер "Экология и безопасность жизнедеятельности" - 1999 - Том 6, № 5 - С 48-50

3 Биосенсоры для экологического контроля/ Лобанов А В, Шувалова Ю В , Зырина Н В , Китова А Е , Макаренко А А , Кувичкина Т Н , Фесай А П, Решетилов АН// Экологические системы и приборы - 2001 - Том 5, № 6 - С 72-76

4 Бактерии из почв месторождений Западной Сибири как основа биосенсоров для определения фенола/ Макаренко А А, Безвербная И П , Кошелева И А, Кувичкина Т Н., Ильясов П В , Решетилов АН// Прикладная биохимия и микробиология микроорганизмов - 2002 - Т 38, № 1 -С 29-34.

5. Деградация и-толуолсульфоната иммобилизованными клетками Comamonas testosterom BS 1310 (pBSlOlO)/ Макаренко А А, Аринбасарова А Ю, Кувичкина Т Н, Балашов С В , Решетилов АН// Прикладная биохимия и микробиология - 2005 - Т 41, № 5 - С 521-524

Тезисы:

6. Biosensoric detection of xenobiotics/ Reshetilov A N , Iliasov P V , Makarenko A A // Fourth International Workshop "Biosensors and biosensing devices m medicine and environmental sciences, Tashkent 1997 Uzbekistan P 127

7. Биосенсорное определение п-толуолсульфоната с помощью бактерий Comamonas testosrerom BS 1310 (pBS 1010)/ Макаренко А А, Балашов С В, Ильясов П В, Кувичкина Т Н, Решетилов АН// XVI Менделеевский сьезд по общей и прикладной химии Санкт-Петербург, 1998 -С 226

8 The p-toluene sulfonate degradation by immobilized Comamonas testosterom BS1310 (pBSlOlO) cells/ Makarenko A A, Annbasarova A Yu , Balashov S V , Iliasov P V, Kuvichkma TN , Reshetilov AN// Biocatalysis'98 -Puschino, 1998 - P 44.

9 Влияние арсенита на потребление кислорода штаммом Pseudomonas putida - деструктором полициклических ароматических углеводородов/ Козлова Е В , Макаренко А А , Кувичкина Т Н , Решетилов А Н // II сьезд биофизиков России Тезисы докладов - Москва- 1999 - С 887

10 Бактерии из почв месторождений нефти Западной Сибири как основа биосенсоров для определения фенола/ Макаренко А А,

Безвербная И П , Кошелева И А , Кувичкина ТН , Решетилов АН// "Проблемы способы и средства защиты окружающей среды от загрянний ний нефтью и нефтепродуктами" Материалы 3-ей Научно-технической конференции Государственное унитарное предприятие "Всероссийский НИИ межотраслевой информации" М - 1999 - С. 95-97

И Подход к созданию колоночного биосенсора, определение 2,4-динитрофенола с помощью иммобилизованных клеток ЯИос1ососсш ЕгуМгоро/и НЬ РМ-1/ Кувичкина Т.Н, Ильясов ПВ, Макаренко А А, Китова А Е , Аринбасарова А Ю , Решетилов А.Н // Материалы Всеросийской конференции с международным участием "Сенсор - 2000" - Санкт-Петербург - 2000 - С 139

12 Определение токсических моноароматических соединений с ипользованием микробных сенсоров/ Кувичкина Т Н, Ильясов П В, Макаренко А А, Китова АЕ, Аринбасарова А Ю., Решетилов АН// Материалы конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" - Оболенск - 2000 - С 402

13 Штаммы-деструкторы фенола как потенциальная основа биосенсоров для его обнаружения/ Зырина Н В , Макаренко А А, Кошелева И А, Решетилов А Н // Материалы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" - Пущино -2001 - С 55

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макаренко, Александр Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление в аналитической биотехнологии

2.1. Типы преобразователей, используемые в биосенсорах. Электрохимические преобразователи

2.2. Типы биологических материалов, применяемых в рецепторных элементах биосенсоров

2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и иммунных комплексов, ДНК, животных и растительных клеток, клеточных органоидов

2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток

2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых и водных сред

2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы

2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы

2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью микробных биосенсоров

2.2.2.2.1. Определение БПК

2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов

2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных поверхностно-активных веществ (ПАВ)

2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического материала в рецепторном элементе сенсора

2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование в разработке биосенсоров для детекции токсичных соединений

2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений

2.3.2. Методы направленной модификации микроорганизмов для придания им деструктивных свойств

2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации

2.4. Потребности в детекции ароматических и сульфоароматических соединений

2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы

2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических соединений

2.4.3. Возможный механизм биодеградации толуолсульфоната (ТС)

2.5. Характеристика штамма СотатопаБ (е8Ш1егоп1 38 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)

3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками

3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками

3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток

3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях

3.1.5. Контроль процесса деградации

3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта штамма С. Ыък^егот

3.2. Разработка микробного сенсора для определения //-толуолсульфоната

3.2.1. Среда культивирования

3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов

3.2.3. Исследование деградирующей активности микроорганизмов

3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола

3.3.1. Объект исследования

3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола

3.3.3. Иммобилизация клеток

3.3.4. Хранение беактериальных штаммов

3.3.5. Скорость окисления субстрата бактериальными клетками

3.4. Характеристика полярографической измерительной системы

3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом установки биохимочистки (БХО)

3.5.1. Отбор проб активного ила

3.5.2. Иммобилизация активного ила

3.5.3. Условия эксперимента

3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки

3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки

3.5.6. Определение фенола

3.6. Оптимизация работы установки БХО

3.6.1. Концентрация растворенного кислорода

3.6.2. Проведение замеров

3.7. Статистическая обработка полеченных результатов

3.8. Основные технические параметры анализатора 50 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Биодеградация ТС с помощью

ЫюШегот В81310(рВ81010)

4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях

4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях

4.2. Сенсор для детекции я-толуолсульфоната (ТС)

4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов

4.2.2. Характеристика штамма Сотатопаъ (е8Ш(егот

4.2.3. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма С.

4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток

Со mamonas íestosteroni в проточной системе

4.3. Разработка микробного биосснсора для детекции фенола

4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола

4.3.2. Характеристика штамма 32

Субстратная специфичность)

4.3.3. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32

4.4. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода

4.4.1. Деградация целевых соединений сточных вод иммобилизованными на колонке микроорганизмами установки биохимочистки сточных вод (БХО)

4.4.2. Использование полученных данных для оценки эффективности процесса очистки стоков в аэротенках установки биохимической очистки

4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки

4.4.2.2. Результаты проведенных технических и технологических мероприятий на сооружениях БХО

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфоната и фенола"

Актуальность проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями [1-3]. Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде. Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн. тонн сульфонатов. Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства. В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов; только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн. Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства. На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(THK-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации. В связи с этим задача обнаружения токсичных соединений, в частности, фенолов и сульфоароматических, в объектах окружающей среды относится к разряду актуальных. В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе. Одним из важных условий является снижение стоимости анализа. Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи [4, 5]. Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе - токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции [6-9]. В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля. Важная роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений. Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать Биосенсоры для детекции различных органических соединений. Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны Биосенсоры микробного или другого типов для анализа я-толуолсульфоната, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке ферментных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных. Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования.

Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами и-толуолсульфоната и фенола, соответственно.

Были поставлены следующие задачи:

1. На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции /-z-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала.

2. Оценить характеристики процесса деградации я-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперо-метрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров.

3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции я-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмид-ного штаммов С. testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.

4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.

Научная новизна работы. На основании имеющихся литературных данных произведен выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции я-толуолсульфоната и фенола, и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде. Оценены характеристики процесса деградации я-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях. Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS 1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции я-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов С. testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. Показано, что сенсоры, основанные на плазмидсодержащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соединений, которая резко снижается при использовании бесплазмидных штаммов. Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плаз-мидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров.

Практическая значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции w-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов; так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструкторов я-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации.

Разработанные модели биосенсоров могут составить основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плазмид-ный и бесплазмидный штаммы, соответственно. Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий.

Результаты, полученные при изучении разложения я-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа.

Качественная оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки. Предложен метод оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Аэробные микроорганизмы-деструкторы при разложении целевого вещества потребляют кислород. Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения. Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений.

Плазмидная детерминированность катаболизма целевого соединения позволяет создавать пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит, В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением. Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества.

Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила. Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений. Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 207 источников литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Макаренко, Александр Александрович

6. ВЫВОДЫ

1. Создана модель микробного биосенсора, обладающего высокой чувствительностью и селективностью в отношении сульфоароматических соединений. В основе биорецептора использован штамм С. testosteroni ВВ1310 (рВ81010) несущий плазмиду биодеградации сульфоароматических соединений рВБЮЮ. Показано, что биосенсор мембранного типа позволяетО производить экспресс-анализ я-толуолсульфоната в модельных средах в диапазоне детекции 5 - 1000 мкМ. Чувствительность сенсора по отношению к толуол-сульфонату составляет 0.17 нА/с при концентрации 1 мМ. Использование плазмидсодержащих бактерий в сенсоре позволяет в 11 раз повысить селективность в отношении я-толуолсульфоната по сравнению с сенсором на основе бесплазмидного штамма.

2. Для упрощенной модели дифференциальной детекции произведена оценка возможной ошибки измерения целевых соединений - толуолсульфо-ната и фенола на фоне исследованных мешающих примесей. Нашли, что погрешность детекции составила бы 24% при определении я-толуолсульфоната, 11% при определении общего содержания сульфоароматических соединений, 35% при определении фенола и 12% при определении общего содержания ароматических соединений в случае равной концентрации как мешающих, так и целевых соединений. При анализе реальных сточных вод, содержащих преимущественно целевые соединения, погрешность должна существенно снизиться.

3. Впервые экспериментально показали, что окисление п-толуолсульфоната бактериальными клетками СотатопаБ 1е8Ю81егот В81310 как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии происходит в стехио-метрическом соотношении 2:1 (кислород: и-толуолсульфонат). Полученные данные составили основу для выбора типа биорецептора - мембранного или колоночного - при создании биосенсора для детекции данного соединения.

4. Бактериальный штамм, принадлежащий к роду Pseudomonas (рабочая маркировка "32-1"), использовали как основу биосенсора для детекции фенола. Измерение концентрации фенола было возможно в диапазоне 5 - 300 мкМ. Нашли, что в отношении фенола селективность сенсора, основанного на плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз превышает селективность сенсора на основе бесплазмидного штамма. Изучили параметры биосенсора и их зависимость от внешних условий.

5. На основании выполненных тестов с активным илом, имитирующим функционирование биологического материала в составе биосенсора, представили рекомендации по оптимизации работы водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства, заключающиеся в проведении контроля степени оксигенации стоков. Полученные данные позволили на практике на 17% увеличить очистку стоков, содержащих фенол (оценка по индексу ХПК).

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обзор современных достижений в области биосенсорной детекции позволяет сделать вывод о необходимости конструирования новых микробных сенсоров для детекции ароматических и сульфоароматических соединений, поскольку в настоящее время биосенсорная детекция этих соединений представлена в основном ферментными сенсорами, применение которых в ряде случаев нежелательно, о чем говорилось в гл. 2.2.2. Применение биосенсоров сдерживается высокой стоимостью высокоочищенных биологических компонентов, необходимостью защиты чувствительного элемента от вредных воздействий среды, малым сроком службы, а также необходимостью повышения селективности преобразователей.

В работе показана возможность применения микроорганизмов-деструкторов целевых веществ в качестве рецепторных элементов биосенсоров для детекции соответствующих ароматических соединений. В частности, созданы модели микробных сенсоров для детекции я-толуолсульфоната и фенола , их нижние пределы детекции составили 5 мкМ. Основным отличием работы от гроводимых ранее исследований является идея об использовании дифференциальной пары сенсоров на основе микроорганизмов одного и того же штамма, отличающихся только наличием плазмиды деградации целевого соединения. Выполнен математический расчет погрешности при работе дифференциальной системы детекции. Необходимы дальнейшие исследования с целью определения оптимальных условий функционирования дифференциальной пары, оптимизации параметров функционирования двухканальной системы регистрации с целью их практического применения для детекции ароматических ксенобиотиков в сточных водах промышленных производств и экологических системах.

В работе также проведено исследование процесса деградации целевого соединения в периодических и непрерывных условиях. Полученные данные могут служить основой для разработки прмышленных реакторов для деградации целевых соединений, содержащихся в стоках химических производств.

Предложен прототип колоночного сенсора, который может быть использован в качестве аналитического метода оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила установок биохимической очистки промышленных сточных вод. Применение данного метода позволит проводить анализ в кратчайшие сроки и без применения реагентов.

Биосенсорный подход был применен также для оптимизации работы очистных сооружений промышленного предприятия, использование кислородного электрода Кларка позволило более эффективно отладить работу аэробных биохимических очистных сооружений, повысить качество очистки промышленных стоков на 17%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макаренко, Александр Александрович, Саратов

1. Hobson, I. Tothill, A. P. Turner. Microbial detection// Biosensors and Bioelectronics.- 1996,- N 6-P. 466 - 477.2. <. Истамов. Экологические аспекты биологического действия ксенобиотиков. Пермь. 1994.- 198 с.

2. Marty, D. Garcia, R. Rouillon. Biosensors: potential in pesticide detection// Trends in Analytical Chemistry.- 1995.- N 7-P. 329 333.

3. Биосенсоры для экологического мониторинга/ Т. Харченко, В. И. Мягких, Ю. И. Остроумов, И. Б. Евстафьев, Н. В. Завьялова// Журн. Всес. Биохим. о ва им. Д. И. Менделеева.- 1991, т. 36, N2-C. 178 - 180.

4. М. Rogers, L. R. Williams. Biosensors for environmental monitoring: a regulatory perspective// Trends in Analytical Chemistry.- 1995.- N 7-P. 289.

5. D. M. Rawson. The Use of biosensors for Pollution Detection in Clean Waters// J. Chem. Tech. Biotechnol.- 1992.- N 2-P 58-67.

6. Krivoshein Iu, S., L. Berzhanskaia, et al. Biosensors in biotechnology and medicine// Mikrobiol.- 1993.- № 55(1)-P. 101-111.

7. Clark L. C. Jr. Lyons C. Electrode Systems for continuous \ monitoring in cardiovascular surgery// Annals of the New York Academy of Sciences 1962.-№ 102.- P.29 45.1..J. Racek. Cell-Based Biosensors.- Technomic Publishing Co. Inc., 1995.-256 P.

8. Development of a new ion-selective field-effect transistor sensor for anionic surfactants: Application to Potentiometrie titrations/ J. Sanchez,

9. A. Beltran, J. Alonso, C. Jinuanez, M. del Vaile// Analytica Chimica Acta.-1999,-Vol. 382; №2.-P. 157- 164.

10. I. G. Torro, J. V. C. Matteo, J. M. Calatayud. Flow-injection am-perometric determination of nitrate (by photoreduction) and nitrite with the N02 -12 reaction// Analytica Chimica Acta.- 1998,- № 4,- P. 241 249.

11. M. Amperometric determination of sympathometric drugs by flow injection analysis with a metallic copper electrode/ Chicharro, A. Zapardicle, E. Bermejo, J. A. Pearez, L. Herhaandez// Analytica Chimica Acta.- 1999.-Vol. 379; № l.-P. 81 -88.

12. Amperometric Determination of Ammonium Ions with a Microbial Sensor/ K. Riedel, J. Huth, M. Cuehn, P. Liebs// J. Tech. Biotechnol.-1990.- № 47-P. 109-116.

13. J. Ngen-Ngwanbi, A. A. Suleiman, G. G. Guilbault. Piezoelectric crystal biosensors// Biosensors and Bioelectronics.- 1990.- N 1-P. 18 26.

14. A. A. Suleiman, G. G. Guilbault. Recent developments in piezoelectric immunosensors. A review// Analyst.- 1994.- N 11-P. 2279 2282.

15. A rapid method for determination of Staphylococcus aureus based on milk coagulation by using a series piezoelectric quartz crystal sensor/ L. Bao, H. Tan, Q. Duan, X. Su, W. Wei// Analytica Chimica Acta.- 1998. Vol. 369; №2.-P. 139- 145.

16. Heitzer A., Malachowsky K., Thonnard J. E., Bienkowsky P. R., White D. C., Sayles G. S. Appl. End Environ. Microbiology. 1994. V. 60; № 5.-P. 1487- 1494.

17. A. W. M. Lee, J.-Z. Lu. Optode for the specific determination of anionic surfactants// Analytica Chimica Acta.- 1998.- № 1 -P. 55 61.

18. A new sandwich-type diphthalocyanine as a potential optical transducer for N02 detection/ F. Baldini, A. Capobianchi, A. Falai, G. Pen-nesi// Sensors and Actuators B.- 1998.- № 2-P. 176 180.

19. H. Maramatsu, E. Tamiya, I. Karube. Odorant Recognition using quartz resonators coated with a mixed film of asolectin and cholesterol and monitoring the viscoelastic change of the film// Analytica Chimica Acta.-1991.-№ 2-P. 133 141.

20. Design and characteristics of DBR-laser-based environmental sensors/ G. Boregaegski, D. Hemug, M. Fallahi, F. Guzman, R. Clemens, S. Mendes, N. Reighambarian// Sensors and Actuators B.- 1998.- Vol. 53; № 4.-P. 116-124.

21. D. R. Coon, C. W. Babb, G. A. Rechnitz. Biomagnetic Neurosen-sors. 4. Design and Optimization for Analytical Use// Analytical Chemistry.-1996.- № 11-P. 1671 1675.

22. Detection of propylene under oxidizing conditions using zirconia-based potentiometric sensor/ T. Hibino, S. Wang, S. Kakimoto, M. Sano// Sensors and Actuators B.- 1998.- № 2-P. 149 155.

23. Iridium oxide and palladium modified nitric oxide microsensor/Y. Xian, W. Sun, J. Xue, M. Luo, L. Jin// Biosensors & Bioelectronics.- 1998.-Vol. 13; № 11.- P. 1 187 1195.

24. Electrocatalytic reduction of nitrite at a glassy carbon electrode surface modified with palladium (Il)-substituted Keggin type heteropoly-sungstate/ W. Sun, S. Zhang, H. Lin, L. Jin, J. Kong// Analytica Chimica Acta.- 1999.- Vol. 388; № 1.-P. 103 110.

25. A compact solid-state amperometric sensor for detection of N02 in ppb range/ N. Miura, M. Ono, K. Shinanoe, N. Yamazoe// Sensors and Actuators B.- 1998.- Vol. 49; № l.-P. 101 109.

26. Sequential injection sandwich technique for the simultaneous determination of nitrate and nitrite/ A. Cerdal, M. T. Oms, R. Forteza, V. Cer-dal//Analytica Chimica Acta.- 1998.-№ 1-P. 63 -71.

27. M. del M. Cordero-Rando, J. Nacanjo-Rodroaquez, H. H. de Cisneros. Voltammetric study of 2-methyl-4, 6- dinitrophenol at a modified carbon paste electrode// Sensors and Actuators В.- 1998.-№ 1-P. 9 18.

28. А. А. Карякин, E. E. Карякина, С. Д. Варфоломеев. Электрохимические сенсоры на основе полимерных полупроводников и неорганических поликристаллов// Сенсорные системы.- 1997 г.- № 4-С.24-33.

29. А. А. Туманов, Е. А. Коростылева. Биосенсоры в анализе объектов окружающей среды// Журнал аналитической химии.- 1990.- № 7-С.36-47.

30. High-Performance Liquid-Chromatographic Determination of Phenols Using a Tyrosinase-Based Amperometric Biosensor Detection System/ Adeyoju O, Iwuoha EI, Smyth MR, Leech D// Analyst.- 1996.- Iss 12-P 1885 1889.

31. Amperometric Detection of Phenols Using Peroxidase-Modified Graphite-Electrodes/ Lindgren A., Emneus J., Ruzgas T., Gorton L., Mark-ovarga J.// Analytica Chimica Acta.- 1997.- Vol. 347; № 1 2.-P 51 - 62.

32. Rivas G. A., Solis V. M. Electrochemical Quantification of Phenol-Using Mushroom Tyrosinase Determination of the Kinetic Parameters of the Enzyme// Electroanalysis.- 1994.-№ 11 12-P 1136 - 1 140.

33. Iwuoha E.I., Smyth M.R., Lyons M.E.G. Organic-Phase Enzyme Electrodes Kinetics and Analytical Applications// Biosensors and Bioelec-tronics.- 1997.-№ 1-P 53 - 75.

34. Wollenberger U., Neumann B. Quinoprotein Glucose-Dehydrogenase Modified Carbon-Paste Electrode for the Detection of Phenolic Compounds//Electroanalysis.- 1997.-№ 5-P.366 371.

35. Effect of Hy-Zeolites on the Performance of Tyrosinase-Modified Carbon-Paste Electrodes/ Marcovarga J., Burestedt E., Svensson C.J., Emneus J., Gorton L., Ruzgas T., Lutz M., Unger K.K.// Electroanalysis.1996.- Vol.8; № 12.-P. 1121 1126.

36. Characterization of Tyrosinase-Teflon/ Graphite Composite Electrodes for the Determination of Catechol in Environmental Analysis/ Puig D., Ruzgas T., Emneus J., Gorton L., Markovarga G., Barcelo D.// Electro-analysis. 1996.- Vol.8; № 10-P. 885 - 890.

37. Lutz E. S. M., Domínguez E. Development and Optimisation of a Solid Composite Tyrosinase Biosensor for Phenol Detection in Flow-Injection Systems// Electroanalysis.- 1996.- № 2-P. 117 123.

38. Tyrosinase Graphite-Epoxy Based Composite Electrodes for Detection of Phenols/ Onnerfjord P., Emneus J., Markovarga G., Gorton L., Ortega F., Domingues E.// Biosensors&Bioelectronics.- 1995.- Vol. 10; № 6 -7-P. 607-619.

39. Wang J., Fang L., Lopez D. Amperometric Biosensor for Phenols Based on a Tyrosinase Graphite-Epoxy Biocomposite// Analyst.- 1994,- № 3-P. 455 458.

40. Petit C., Gonzalezcortes A., Kauffmann J. M. Preparation and Characterisation of a New Enzyme Electrode Based on Solid Paraffin and Activated Graphite Particles//Talanta.- 1995.-№ 1-P. 1783 1789.

41. Wang J., Lu F., Lopez D. Tyrosinase-Based Ruthenium Dispersed Carbon-Paste Biosensor for Phenols// Biosensors & Bioelectronics.- 1994.-№ 1-P. 9- 15.

42. Amperometric Biosensor for the Determination of Phenolic Compounds Using a Tyrosinase Graphite Electrode in a Flow-Injection System/ Ortega F., Dominguez E., Jonssonpetterson G., Gorton L.// Journal of Biotechnology.- 1993.- № 3-P. 289 300.

43. Methylphenazonium Modified Enzyme Sensor Based on Polymer Thick Films for Subnanomolar Detection of Phenols/ H. Cotte, B. Grundig, K. - D. Vorlop, B. Strehlitz, U. Stottmeister// Anal. Chem.- 1995.-Vol. 67; № l.-P. 65 - 70.

44. Biosensor Based on an Enzyme-Modified Electrode for Highly-Sensitive Measurement of Polyphenols/ Eremenko A., Makower A., Jin W., Ruger P., Scheller F.// Biosensors & Bioelectronics. 1995.- Vol.10; № 8.-P. 717- 722.

45. Flow-Injection Analysis of Phenols at a Graphite Electrode Modified with Co-Immobilized Laccase and Tyrosinase/ Yaropolov A. I., Kharybin A. N., Emneus J., Markovarga G., Gorton L.// Analytica Chimica Acta.-1995,- Vol. 308; № 1 3.-P. 137 - 144.

46. Cosnier S., Popescu I. C. Poly(AmphiphiIic PyrroIe)-Tyrosinase-Peroxidase Electrode for AmplifiedFlow Injection-Amperometric Detection of Phenol// Analytica Chimica Acta.- 1996.-№ 1 -2-P. 145-151.

47. Marco M.P., Barcelo D. Environmental Applications of Analytical Biosensors// Measurement Science & Technology.- 1996.- № 11-P. 1547 -1562.

48. Determination of Phenol and Chlorinated Phenolic Compounds Based on a PPO-Bioelectrode and Its Inhibition/ Besombes J. 1., Cosnier S., Labbe P, Reverdy G.// Analytical Letters.-1995.- № 3-P. 405 424.

49. Ghindilis A. L., Gavrilova V. P., Yaropolov A. J. Laccase-based sensor for determination of polyphenols: Determination of catechol in tea// Biosensors & Bioelectronics.- 1992.-№ 2-P. 127-131.

50. Tyrosinase Graphite-Epoxy Based Composite Electrodes for Detection of Phenols/ Onnerfjord P., Emneus J., Markovarga G., Gorton L., Ortega F., Domingues E.// Biosensors & Bioelectronics. 1995.- Vol. 10; № 6 -7.-P. 607 - 619.

51. Cosnier S., Innocent C. A New Strategy for the Construction of a Tyrosinase-Based Amperometric Phenol and O-Diphenol Sensor// Bioelec-trochemistry and Bioenergetics. 1993.-№ 2- P. 147 - 160.

52. Wang J., Chen Q. Highly Sensitive Biosensing of Phenolic Compounds Using Bioaccumulation Chronoamperometry at a Tyrosinase Electrode// Electroanalysis. 1995.-№ 8- P. 746 - 749.

53. A biosensor as warning device for the detection of cyanide, chlorophenols, atrazine and carbamate pesticides/ J-L Besombes, S. Cosnier, P. Labbe, G. Reverdy// Analytica Chimica Acta.- 1995.-№ 2-P. 253 263.

54. A novel enzyme sensor for the determination of inorganic phosphate/ M. Conrath, B. Grundig, S. Huwel, K. Cammann// Analytica Chimica Acta.- 1995.-№ 1-P. 47 52.

55. Reagentless carbon paste phosphate biosensors: preliminary studies/ J. J. Fernandez, J. R. Lopez, X. Correig, I. Katakis// Sensors and Actuators B.- 1998.-№ 1-P. 13 20.

56. Amperometric biosensors based on solid binding matrices applied in food quality monitoring/ S. Miertusi, J. Katrly'k, A. Pizzariello, M. Stred'ansky, J. Sinuitel, J. Sinworc// Biosensors & Bioelectronics.- 1998.-Vol. 13; №7.- P. 911 -923.

57. C. Qiong, P. Tuzhi, Y. Liju. Silk fibroine/cellulose acetate membrane electrodes incorporating xantine oxidise for the determination of fish breshness// Analytica Chimica Acta.- 1998.-№ 2-P. 245 -251.

58. G. Ghosh (Hazra), D. Sarker, T. N. Misra. Development of amperometric enzyme electrode biosensor for fish freshness detection// Sensors and Actuators B.- 1998.-№ 1- P. 58 62.

59. M. P. Marco, S. Gee, B. D. Hammock. Immunochemical techniques for environmental analysis. Immunosensors// Analytical Chemistry.-1992.-№ 7-P 47 55.

60. Field Experiments. Potential and Capabbilities of Biosensors fir the Assessment of Environmental Pollutants/ K. Cammann, G. Chemnitius,

61. M. Meusel, C. Zaborosch// Analytica Chimica Acta.- 1997.-№ 3-P. 375 -382.

62. Highly sensitive electrochemical biosensors for water monitoring. Food Technology and Biotechnology/ G. Chemnitius, M. Mlusel, C. Zabor-osh, M. Knoel, F. Spener, K. Cammann// Analytica Chimica Acta.- 1996.-Vol. 34; № l.-P. 23 -29.

63. M. P. Marco, S. Gee, B. D. Hammock. Immunochemical techniques for environmental analysis// Analytical Chemistry.- 1995.- № 7-P. 341 350.

64. New ways in bioanalysis one-way optical sensor chip for environmental analysis/ M. Mevsel, D. Trau, A. Katerkamp, F. Meier, R. Pol-zivs, K. Cammann// Sensors and Actuators B.- 1998.- Vol. 51; № 3.- P. 249 - 255.

65. Remote electrochemical sensor for monitoring TNT in natural waters/ J. Wang, R. K. Bhada, J. Lu, D. MacDonald// Analytica Chimica Acta.-1998.-№ 1-P. 85-91.

66. Multi-analyte explosive detection using a fiber-optic biosensor/ I. B. Bakaltcheva, F. S. Ligler, C. H. Patterson, L. C. Shriver-Lake// Analytica Chimica Acta.- 1999.- № 1-P. 13-20.

67. A. Oubinla, D. Barceloz, M.-P. Marco. Effect of competitor design of immunoassay specificity: Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for 2,4-dinitrophenol// Analytica Chimica Acta.- 1999.-№ 3-P. 267-279.

68. K. Rogers, L. R. Williams. Biosensors for environmental monitoring: a regulatory perspective// Trends in Analytical Chemistry.- 1995.- № 4P. 289 294.

69. K. Dill, L. H. Stanker, C. R. Young. Detection of salmonella in poultry using a silicon chip-based biosensor// Journal of Biochemical Biophysical Methods.- 1999.-N» 1-P. 61 67.

70. D. Knopp. Application of immunological methods for the determination of environmental pollutants in human biomonitoring. A review// Analytica Chimica Acta.- 1995.- № 4-P. 383 392.

71. An optical biosensor for monitoring recombinant proteins in process media// D. M. Disley, P. R. Morrill, K. Sproule, C. R. Lowe// Biosensors & Bioelectronics.- 1999.- № 5-P. 481 493.

72. E. Crowley, C. O'Sullivan, G. G. Guilbault. Amperometric immunosensor for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using screen-printed electrodes// Analytica Chimica Acta.- 1999.- № 2-P. 171 -178.

73. M. C. Hennion, D. Barcelo. Strengths and limitations of immunoassays for effective and efficient use for pesticide analysis in water samples: A review// Analytica Chimica Acta.- 1998.- № 1 -P. 3 - 34.

74. Electrochemical immunosensors. Analytical Uses of Immobilized Biological Compounds for Detection/ W. H. Heineman, H. B. Haloall, G. G. Guilbault and M. Mascini (eds)// Medical and Industrial uses.- 1999. P. 281 -290.

75. A submersible flow injection based sensor for the determination of total oxidised nitrogen in coastal waters/ A. R. J. David, T. McCormack, A. W. Morris, P. J. Worsfold// Analytica Chimica Acta.- 1998.- № 1-P. 63 -72.

76. An integrated microdistillation flow injection system for nitrite measurement/ R. Lane, C. W. K. Chow, D. E. Davey, D. E. Mulcahy, S. McLeod// Analytica Chimica Acta.- 1999.- Vol. 395; № 3.- P. 225 234.

77. I. Chianella, M. Mascini. Disposable DNA electrochemical biosensors for environmental monitoring// Analytica Chimica Acta.- 1999.- № 3-P. 297 307.

78. Sulfite Ion Sensor with Use of immobilized Organelle/1. Karube, S. Sogabe, T. Matsunaga, S. Suzuki// Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1983.-№2-P. 216-220.

79. Portable cell-based biosensor system for toxine detection/ J. J. Pankrazio, P. P. Beyer, D. S. Kuttino, J. K. Kusel, D. A. Borkholder, К. M. Shaffer, G. T. A. Kovacs, D. A. Stenger// Sensors and Actuators В.- 1998.-Vol. 53;№2.-P. 179- 185.

80. I. Karube, K. Nakanishi. Immobilized cells used for detection and analysis// Curr Opin Biotechnol.- 1994.-№ 1.- P. 84 89.

81. Divies, C. Ethanol oxidation by an acetobacter xylinum microbial electrode// Ann. Microbiol.- 1975,-№ 126.-P. 175 -186.

82. В. В. Сорочинский, Б. И. Курганов. Биосенсоры для определения органических соединений. Сенсоры углеводов, ароматических, гетероциклических и других органических соединений// Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.-№ 1.-С. 22-42.

83. Я. И. Корпан, А. В. Ельская. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы//Биохимия.- 1995.-№ 12.-С. 1988 1998.

84. Microbial Sensor for Determination of Tannic Acid/ Y. B. Zhao, M. L. Wen, S. Q. Liu, E. Z. H. Liu, W. D. Zhang, Y. Y. Yao, C. Y. Wang// Microchemical Journal.- 1998.- Vol. 60; № 3.-P. 201 209.

85. An IFSET-algal (Chlamydomonas) hybride provides a system for eco-toxicological tests/ D. Schubnell, M. Lehmann, W. Bawmann, F. G. Rott, B. Wolf, C. F. Beck//Biosensors & Bioelectronics.- 1999.- Vol. 14; № 5.-P. 465 472.

86. D. Frense, A. Muller, D. Beckmann. Detection of environmental pollutants using optical biosensor with immobilized algae cells// Sensors and Actuators В.- 1998.- № 3.-P. 256 260.

87. Microscale biosensors for environmental monitoring/ L. R. Damgaard, L. H. Larsen, N. P. Revsbech, A. Denmark// Trends in analytical chemistry.- 1995.- № 7.-P. 637 643.

88. A microbial sensor for BOD/ K. Riedel, K. P. Lange, H G Stein, M. Kuhn P. Ott and F. Scheller// General institute of Molecular Biology, Department of Enzymology, Academy of Sciences of G. D. R., Berlin, 1989.-P. 87-94.

89. А. А. Туманов, M. H. Глухоев, Г. M. Субботина. Ответные реакции микроорганизмов на изменение химического состава среды и трансформация их в аналитический сигнал// Журнал аналитической химии,- 1998.- № 12,- С. 1252 1260.

90. J. С. Morey. A Manufacturing Technology for Biosensing// Trends in analytical chemistry.- 1994.- № 6.-P. 532 541.

91. Simultaneous mixture analysis using a dynamic microbial sensor combined with chemometric/ M. Slama, C. Zaborosch, D. Wienke, V. Spener//Analytical Chemistry.- 1996,- № 12-P. 3845 3850.

92. Biosensors for Environmental Controle/ H.Suzuki, H.N.Kojima, A.Sugama, F.Takei, K.Ikegami, E.Tamiya and I.Karube// Electroanalysis.-1989.- Vol. 12; № 1.-P.305.1071. Karube. Microbial sensor/Journal of Biotechnology.- 1990.-№ 3-P. 255 -266.

93. Microbial Biosensor for Sulfite Detection/ J.L.Marty, N.Mionetto, T.Nogure, F.Ortega, C.Roy// Biosensors and Bioelectronics.-1993.- Vol. 8; № 3.-P 273 279.

94. H.Muramatsu, E.Tamiya and I.Karube. Microbial sensor for Nitrite//Analytica Chimica Acta.- 1991,-№ 1-P. 13.

95. I.Karube and E.Tamiya. Biosensors for environmental control// Pure and Appl. Chem.- 1987.- № 4-P. 545 554.

96. I Karube & E. Tamiya. Biosensors for environmental control// Pure and Appl. Chem.- 1987.- № 4-P. 545 554.

97. M. Nassens, C. Tran-Minh. Whole cell biosensor for determination of volatile organic compounds in the form of aerosols// Analytica Chimica Acta.- 1998.- № 2-P. 153 - 158.

98. G. Y. Tai, M. L. Wen, C. Y. Wang. Bacteria-Based Biosensor for Determination of Hydrogen Peroxyde// Biochemical Journal.- 1996.- № 2-P. 152 157.

99. Feasibility of using prokaryote biosensors to assess acute toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons/ B. J. Reid, К. T. Semple, C. J.

100. Macleod, H. J. Weitz, Y. I. Paton// FEMS Microbiology Letters.- 1998.-Vol. 169; № 2.-P. 227 233.

101. V. Vollenberger, F. Scheller, F. Azzat. Microbial membrane electrode for steroid assay//Analytical Letters.- 1980,-№ 10-P. 1201 1210.

102. Determination of BOD-values of starch-containing wastewater by a BOD-biosensor/ M. Reiss, A. Heibges, J. Metsger, W. Martmeier// Biosensors and Bioelectronics.- 1998.-№ 10-P. 1083 1090.

103. M. N. Kim, H. B. Kwon. Biochemical oxygen demand sensor using Serratia marcescsns LSV 4// Biosensors and Bioelectronics.- 1999.- № 1-P. 1 -7.

104. F. Li, C. Tan. Effect of heavy metal ions on the efficasy of a mixed Bacilli BOD sensor// Biosensors and Bioelectronics.- 1994.- №4-5-P. 315 324.

105. Microbial sensor for rapid estimation of the Biochemical Oxygen Demand (BOD) in presence of heavy metal ions/ M. Slama, C. Zaborosh, F. Spener// In: Int. Conference Heavy Metals in the Environment - Edinburgh, 1995.- Vol. 2-P. 171-174.

106. Microbial sensor for preliminary screening of mutagens utilising a phage induction test/1. Karube, K. Sode, M. Suzuki, T. Nakahara// Analytical Chemistry.- 1989,- № 21-P. 2388 2391.

107. Monitoring of Genotoxicity Recombinant Escherichia Coli Cells as Biodetector System for Genotoxins/ G. Homeck, L. R. Patryn, P. Rettberg, 0. Komova, S. Kozubek, E. A. Krasavin// Analytical Chemistry.-1989.- Vol. 62; №2.-P. 121 129.

108. Monochlorinated Derivatives Which Can be Used in Water and n-Hexane// Analytical Letters.- 1990.- № 14-P. 2361 2373.

109. K-D Vorlop, A. Muscat, J. Beyersdorf. Entrapment of microbial cells within polyurethane hydrogel beads with the advantage of low toxicity// Biochemical Techniques.- 1997.- № 6-P. 483 488.

110. S-P Cheong,T-C Tan. An amperometric benzene sensor using whole cell Pseudomonas putida ML2// Biosensors and Bioelectronics.-1994,-№ 1-P. 1-9.

111. Thavarungkul P., Hakanson H., Matiasson B. Comparative study of cell-based biosensor using Pseudomonas cepacia for monitoring aromatic compounds// Analytica Chimica Acta. 1991.- № 1-P. 17 - 23.

112. Штамм Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) как основа биосенсорного анализатора сульфоароматических соединений/ А. А. Макаренко, С. В. Балашов, П. В. Ильясов, А. Н. Решетилов// Прикладная биохимия и микробиология. 1999.- № 4-С. 417 421.

113. Защитное действие агара при иммобилизации штаммов-деструкторов ароматических соединений/ А. Ю. Федоров, Е. В. Вол-ченко, И. Н. Сингирцев, В. Н. Корженевич, Г. М. Шуб// Прикладная биохимия и микробиология. 1999.- Том 35; № 2.- С. 165 172.

114. МоОЗ based sputtered thin films for fast N02 detection/ M. Ferroni, V. Guidi, G. Martinelli, M. Sacezdoti, P. Nelli, G. Sberveglieri// Sensors and Actuators В.- 1998.- Vol. 51; № 3.- P. 176 - 180.

115. Давиденко Т. И., Севостьянов О. В., Чичкина М. А. Скрининг морских микроорганизмов на способность к биодеградации органических поллютантов// Микробиологический журнал.- 1994.- № 1-С. 50- 59.

116. Polarographic and voltammetric determination of selected nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons/ A. Barek, M. Pumera, A. Muck, M. Kaderiabrova, A. Zima// Analytica Chimica Acta.- 1999.- Vol. 393; № 2,-P. 141 146.

117. С. В. Балашов, А. М. Воронин. Бактерии деструкторы суль-фоароматических соединений из активного ила// Микробиология.-1996.- №5-С. 627 - 631.

118. Desulfonation of Linear Alkylbenzenesulfonate Surfactants and Related Compounds by Bacteria/ M. A. Kertesz, P. Kolbener, P. Stodeinger, S. Bell, A. M. Cook// Applied and Environmental Microbiology.- 1994.-Vol. 60; № 7.- P. 2296- 2303.

119. B. J. Feigel, H-J. Knackmuss. Syntrophic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulphonic acid by a two species bacterial culture// Archives of Microbiology.- 1993.- № 2-P. 124 130.

120. R. J. Cain & D. R. Farr. Metabolism of Arylsulfonates by Microorganisms// Biochemical Journal.- 1988.- № 6-P. 669 677.

121. A. J. Willets. Microbial Metabolism of alkylbenzenesulphonates. Fungal metabolism of 1-phenylundecane-b-sulphonate and 1-phenyldodecane-p-sulphonate// Journal of Microbiology and Serology. Antonie van Levenhoek.- 1973,- № 5-P. 585 597.

122. Безбородов A.M. Ферменты микроорганизмов, их ингибиторы и биокаталитичские процессы в биотехнологии// Прикладная биохимия и микробиология.- 1995.- № 1-С. 21 26.

123. Dynamics of phenol degradation by Pseudomonas putida/ Allsop P. J., Chisti Y., Moo-Young M., Sullivan G. R// Biotechnology and Bioen-geneering.- 1993.- № 5-P. 572 580.

124. K. T. Semple, R. B. Cain. Metabolism of Phenols by Ochromo-nas danica// FEMS Microbiology Letters.- 1995.- № 3-P. 253 257.

125. Lee J. Y., Choi Y. - В., Kim H. - S. Simultaneous biodégradation of toluene and p-xylene in a novel bioreactor: Experimental results and mathematical analysis// Biotechnol. Progr.- 1993.- № 1-P. 40 - 53.

126. Козловский С. А., Наумов А. В., Цой Т. В. Выделение и характеристика штаммов микроорганизмов, утилизирующих фенол// Химия и технология воды.- 1993,- № 5-С. 383 389.

127. Initial steps in the degradation of benzenesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid and orthanilic acid in Alcaligenes sp. strain 0-1/ Thurnheer T., Zunner D., Hodlinger 0., Leysinger T., Cook All Biodégradation.- 1990,- Vol. 1;№ l.-P. 55 -64.

128. Wittich R.M., Rast H.G., Knackmuss H.-J. Degradation of naph-talene-2,6- and naphtalene- 1,6-disulfonic acid by a Moraxella sp.// Applied and Environmental Microbiology.- 1988.- № 7-P. 1842 1847.

129. Willets A.J., Cain R.B. Microbial metabolism of alkylben-zenesulphonates. Bacterial metabolism of andecylbenzene-p-sulphonate and dodecylbenzene-p-sulphonate // Biochemical Journal.- 1972.- № 2.- P. 389 -402.

130. Feigel B.J., Knackmuss H.-J. Syntrophic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial culture// Archives of Microbiology.- 1993.-№ 2-P. 124- 130.

131. Cain M.B., Farr D.R. Metabolism of arylsulphonates by microorganisms// Biochemical Journal.- 1968.- № 7-P. 859.

132. Mineralisation of sulfoaromatic compounds by microorganisms/ M. Janke, T. El-Banna, R. Klintworth, G. Auling// Applied Biochemistry And Biotechnology.- 1991.- № 1-P. 14-19.

133. Locher H., Leisinger T., Cook A. 4-sulphobenzoate 3,4-dioxygenase, purification and properties of desulphonative two-component enzyme system from Comamonas testosteroni T 111 Biochemical Journal.-1991.- № 7-P. 833 - 842.

134. Locher H.H., Leisinger T., Cook A.M. Degradation of p-toluenesulphonic acid via sidechain oxidation, desulphonation and meta ring cleavage in Pseudomonas (Comamonas) testosteroni T 2// J. Gen. Microbiol.- 1989,-№ 7-P. 1969- 1978.

135. Khlebnikov A, Peringer P. Degradation of p-toluenesulphonic acid by Comamonas testosteroni in an aerobic counter-current structuredpacking biofilm reactor// Water Science and Technology. 1996.-№ 5-6-P. 257 -266.

136. Balashov S. V., Boronin A. M. Sewadge-sludge bacterial isolates decomposing sulfoaromatic compounds// Microbiology. 1996.- № 5-P. 549 - 552.

137. Hurtubise Y., Barriault D., Sylvestre M. Characterization of active recombinant his-tagged oxygenase component of Comamonas testosteroni B-356 biphenyl dioxygenase// Journal of Biological Chemistry.-1996.-№ 14-P. 08152 08156.

138. Junker F., Kiewitz R., Cook A.M. Characterization of the p-toluenesulfonate operon tsaMBCD and tsaR in Comamonas testosteroni T -2//Journal of Bacteriology.- 1997.- № 3-P. 919 927.

139. С. В. Балашов, H. В. Балашова, A. M. Воронин. Плазмидный контроль деградации п-толуолсульфоновой кислоты штаммом Comamonas testosteroni BS1310// Микробиология.- 1997.- № 1-С. 65 69.

140. A. Khlebnikov, V. Zhoukov and P. Peringer. Comparison of p-toluenesulphonic acid degradation by two Comamonas strains// Biotechnology letters.- № 4-P. 389 393.

141. В. E. Whiteman, J. R. Mihelcis, D. R. Lucking. Naphtalene biosorption in soil/ water systems of low or high sorptive capacity// Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1995,- № 5-P. 539 544.

142. Boronin A. M. Генетический контроль деградации и создание эффективных деградирующих штаммов// Acta Biotechnol.- 1991.- № 2-Р. 177-181.

143. Screening of xenobiotic compounds degrading microorganisms using biosensor techniques/ B. Bayersdorf-Radeck, K. Riedel, U. Karlson, T. T. Backmann, R. D. Schmid// Microbiology research.- 1996.- Vol. 153; № 3.-P. 239-245.

144. I. Sengleton. Microbial Metabolism of Xenobiotics: Foundation and Applied Research// J. Chem. Tech. Biotechnol.- 1994.- № 1-P. 9 23.

145. W. K. Keener, D. J. Arp. Transformation of Aromatic Compounds by Nitrosomonas europaea// Applied and Environmental Microbiology.- 1994.-№ 6-P. 1914- 1920.

146. R. A. Rosello Mora, J. Lalucot, E. Garcia-Valdes. Comparative Biochemical and Genetic Analysis of Naphtalene Degradation among Pseudomonas stutzeri Strains// Applied and Environmental Microbiology.-1994.-№ 3-P. 966-972.

147. P. Полюдек Фабини, Т. Бейрих. Органический анализ. Ленинград. "Химия". Ленинградское отделение. 1981.- 286 с.

148. The Chemistry of sulphonic acids, esters and their derivatives.1991.

149. F. Junker and A. M. Cook. Conjugative Plasmids and the Degradation of Arylsulfonates in Comamonas testosterone// Applied and Environmental Microbiology.- 1997.- № 6-P. 2403 2410.

150. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир. 1976. 53 с.

151. Рекомендации по методам производства анализов на сооружениях биохимической очистки сточных вод. Всесоюзный НИИ Во-дгео Госстроя СССР. М:. 1970.

152. Методика вим1рювань Macoßoi концентрацп розчииеного кисню методом йодометричного титрування за Вшклером/ MIHICTEPCTBO ЕКОЛОГН ТА ПРИРОДНИХ РЕСУРС1В УКРА1НИ. ПОВЕРХНЕВ1 ТА ОЧИЩЕН1 CTI4HI ВОДИ. MBB 081/12-0008-01. КИ1В, 2002

153. Thomas Е. Barman. Enzyme handbook. Springer Verlag. Berlin - Heidelberg - New York. 1969.- 537 p.