Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений

Сиунова, Татьяна Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений"

На правах рукописи

005004122

СИУНОВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИЕ РИЗОСФЕРНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА PSEUDOMONAS, УСТОЙЧИВЫЕ К КОБАЛЬТУ/НИКЕЛЮ И СТИМУЛИРУЮЩИЕ РОСТ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУТЦИНО - 2011

005004122

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Владимир Васильевич Кочетков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Валентина Николаевна Хмеленина

кандидат биологических наук, Наталья Сергеевна Захарченко

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения, Пущино

Защита диссертации состоится «_1_» декабря 2011 г. в 10 часов 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Автореферат размещен на сайтах http://valc.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru Автореферат разослан «^-у» октября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Кулаковская Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами является одной из наиболее актуальных экологических проблем, поскольку затрагивает не только техногенные, но и природные ландшафты. По данным ВОЗ, никель и близкий по свойствам кобальт признаны веществами 2 класса опасности и канцерогенами. Территории, где осуществляется добыча или обработка металлов являются зонами чрезвычайной экологической ситуации, для которых характерно образование «биогеохимических провинций» с высоким содержанием никеля в воздухе, воде, почве и местных продуктах питания. По данным агрохимической службы Российской Федерации уровень загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является умеренным, однако почвы, загрязненные никелем, по занимаемой площади превосходят почвы, загрязненные свинцом, кадмием, цинком и другими высокотоксичными металлами (Аристархов, Харитонова, 2002). Основными источниками загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является неконтролируемое применение минеральных удобрений, а также осадков промышленных сточных вод, используемых в качестве мелиорантов (Аристархов, Харитонова, 2002).

В последнее десятилетие у производителей сельскохозяйственной продукции возрос интерес к применению биопрепаратов, разрабатываемых на основе ризосферпых бактерий группы PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенов. Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что инокуляция растений ризосферными бактериями увеличивает риск аккумуляции металлов в растениях, выращиваемых на загрязненных почвах (Kamnev and van der Lelie, 2000; Zaidi et al., 2006; Белимов, 2008; Khan et al., 2009; Белимов, Тихонович, 2011). Устойчивые к тяжелым металлам ризосферные бактерии являются основой для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации загрязненных почв. В связи с этим представляется целесообразным исследовать ризосферные бактерии, обладающие разнообразными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, поскольку бактерии способны оказывать различное влияние на аккумуляцию металлов в растениях. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости к никелю/кобальту у бактерий, является активный экспорт токсичных катионов из клетки в окружающую среду. Роль данного механизма устойчивости исследовалась только в штаммах эндофитных бактерий в фиторемедиационных экспериментах с субстратами, загрязненными никелем (Lodewyckx et al., 2001) или в комплексе с хлорированными ксенобиотиками (Weyens et al., 2010; 2011). Однако исследованные эндофитные штаммы не обладали свойствами, характерными для бактерий группы PGPR. К настоящему времени ремедиационный потенциал аналогичных генетических систем устойчивости в ризосферных бактериях не изучен. В связи с этим актуальным является поиск природных или создание рекомбинантпых штаммов

ризосферных бактерий, обладающих системами экспорта никеля и других металлов. При этом следует учитывать способность бактерий к биосорбции и иммобилизации металлов, что является важным фактором, регулирующим поступление тяжелых металлов в растения. Исследование ризосферных бактерий, обладающих различными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, позволит понять принципы их взаимодействия с растениями и более эффективно реализовать генетический потенциал бактерий при разработке новых биотехнологий защиты растений и фиторемедиации почв, загрязненных как тяжелыми металлами, так и в комплексе с органическими токсикантами.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к никелю/кобальту штаммов PGPR Pseudomonas и исследование их взаимодействия с растениями в условиях загрязнения тяжелыми металлами.

В соответствии с данной целью решались следующие задачи:

1. Из различных экологических ниш выделить и идентифицировать бактерии, содержащие плазмиды устойчивости к никелю (кобальту, цинку, кадмию), и определить соответствующие детерминанты устойчивости.

2. Получить на основе различных видов PGPR Pseudomonas и выделенных плазмид новые штаммы, устойчивые к кобальту/никелю. Исследовать физиолого-биохимические особенности трансконыогантов.

3. Исследовать у полученных ризосферных штаммов особенности аккумуляции металлов из среды культивирования.

4. Исследовать влияние устойчивых к кобальту/никелю ризосферных штаммов на аккумуляцию никеля в растениях и на параметры роста растений в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.

5. Сконструировать штаммы ризосферных бактерий, содержащие совместимые плазмиды - устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ). Исследовать у полученных штаммов эффективность биодеградации нафталина в присутствии никеля в среде культивирования и способность стимулировать рост растений в условиях, моделирующих смешанное загрязнение ПАУ (включая нафталин и фенантрен) и никелем.

Научная новизна работы

содержащие природные плазмиды биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) и устойчивости к кобальту/никелю. Показана способность штаммов к полной утилизации модельного ПАУ в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.

Научно-практическая значимость работы

Получен устойчивый к кобальту/никелю штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), аккумулирующий из среды до 17% кобальта, который может быть использован в биотехнологиях очистки промышленных сточных вод от солей кобальта/никеля. Штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), стимулирующий рост ячменя и препятствующий аккумуляции никеля в растительной биомассе, можно использовать при разработке биопрепарата для защиты растений, выращиваемых на почвах с загрязнением никелем до 5 ПДК. Полученные устойчивые к никелю/кобальту ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут использоваться при разработке технологий очистки промышленных сточных вод, а также в качестве нового поколения биопрепаратов для защиты/стимуляции роста растений или биоремедиации почв со смешанным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и солями никеля/кобальта. Штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтвержден патентом РФ на изобретение №2396339.

Апробация материалов работы

Основные результаты диссертации были представлены на 9 конференциях: «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках». Всероссийская конференция, 14-19 июня 2001, Санкт-Петербург; Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология 2003», 22-26 сентября 2003 г., Сочи; 1-я Международная геоэкологическая конференция. Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, 30-31 октября 2003 г., Тула; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, научно-практическая конференция, 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 25-31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007, Colchester, England.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 6 статей, 2 главы в книгах, 9 тезисов, 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц и 22 рисунка. Библиография насчитывает 231 наименование, из них 47 отечественных и 184 зарубежные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы

Устойчивые к тяжелым металлам бактерии выделяли из ризосферы растений, образцов почвы и промышленных сточных вод. В работе также использовали штаммы Comamonas из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино), ризосферные штаммы Pseudomonas и фитопатогенные грибы коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН (Пущино).

Культивирование бактерий проводили при 28°С на среде LB (Маниатис и др., 1984) и трис-минеральной среде (ТМС) (Mergeay et al., 1985). В качестве источника углерода и энергии добавляли глюкозу, глютамат натрия или нафталин. Соли металлов: СоС12 х 6Н20, NiCl2 х 6Н20, CdS04 х 8Н20, ZnS04 х 7Н20, К2СЮ4 добавляли в среду до конечных концентраций 0.005-10 мМ.

Конъюгационный перенос плазмид осуществляли согласно (Dunn and Gunsalus, 1973). Трансконъюгантные штаммы Pseudomonas отбирали на ТМС, содержащей 0.5 мМ кобальта или 1-2 мМ никеля.

Выделение плазмиднон ДНК Осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim and Doly, 1979).

Полнмеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы «Hybide» (Великобритания) в 20-50 мкл смеси по протоколу фирмы-производителя «Fermentas» (Литва). В ПЦР использовали разработанные нами праймеры, фланкирующие структурные гены оперона устойчивости к кобальту/никелю спг плазмиды pMOL28 из С. metallidurans СН34: спгСВ Рдз50 (5'tgaaacaggtgatctcctcgttcc3') и Р,.4850 (5' tcggcacagattctgtcaggcgt3'), cnrA Р^800 (5'gtggactcgcaaactcatgcttcc3') и Pr8o5o (5'ccgctgagaatgctctcgatcat3'). Использовали протоколы проведения ПЦР: для амплификации генов с плазмиды pMOL28 (контроль) : 1 цикл - 96°С 1 мин; 25 циклов - 95°С 30 с, 55°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 1 цикл - 72°С 3 мин; для амплификации генов с плазмиды pBS501: 1 цикл - 9б°С 1 мин; 2 цикла - 96°С 40 с, 42°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 25 циклов - 95°С 30 с, 55°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 1 цикл - 72°С 3 мин.

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции ЕсоШ, HindlU, ВатШ, Pstl, SmaI проводили согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем («Fermentas», Литва).

Включение радиоактивной метки в рестрикционные фрагменты ДНК

осуществляли с помощью Decalabel™ DNA labeling kit («Fermentas», Литва) по

протоколу фирмы-изготовителя. В качестве зондов использовали [32Р]-меченые фрагменты клонированных оперонов устойчивости czcCBAD, cnrXYHCBA, пссСВ (плазмиды любезно предоставлены доктором Д. Нисом (D.H. Nies, Institute of Microbiology, Halle, Germany). Мечение ампликонов осуществляли во время ПЦР, добавляя в реакционную смесь [aP32]dATP. ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методике, описанной (Sambrook et al., 2001).

Для амплификации и секвепировапия фрагментов гена 16S рРНК

использовали универсальные праймеры (Lane, (1991). ПЦР-фрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, USA), используя набор реагентов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, USA). Нуклеогидные последовательности гена 16S рРНК анализировали с помощью пакетов программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov) и CLUSTAL W (http://www.genebee.msu.su/clustal). Построение филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR), реализованным в пакете программ TREECON (Van de Peer et al., 1994).

Солюбилизацию поверхностных белков проводили 5 M хлоридом лития согласно методу (Lortal et al., 1992) с модификациями. Электрофорез белков проводили согласно (Laemmli, 1970).

Концентрацию кобальта в бактериальных клетках, выращенных в присутствии 0.25-2 мМ хлорида кобальта, определяли с помощью пламенной атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе AAS-5100/Zeeman (Perkin-Elmer).

Ультратонкие срезы клеток бактерий готовили согласно методике (Reynolds, 1963) и просматривали в электронном микроскопе JEM 100В («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, а негативно контраетированные клетки - при 60 кВ.

Удельные активности ферментов нафталиндиоксигеназы (Dua and Meera, 1981), салицилатгидроксилазы (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974), катехол-2,3-оксигеназы (Hegeman, 1966), катехол-1,2-оксигеназы (Feist and Hegeman, 1969) определяли в бесклеточных экстрактах клеток, выращенных в ТМС на нафталине (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля и без металла, на UV-160A спектрофотометре (Shimadzu, Япония). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (Kalb and Bernlohr, 1977).

Концентрацию нафталина в среде определяли с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS-2 С18, Supelco (США). Разделение проводилось в градиенте: 1% уксусная кислота: (0-100%) метанол в течение 10 мин. Процент деградации нафталина определяли, учитывая его естественное испарение в контроле - среда с нафталином (1 г/л) без бактерий.

Вегетационные эксперименты, моделирующие загрязнение никелем,

проводили в течение 4 недель на станции искусственного климата «Биотрон» (ФИБХ). Семена ярового ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (108 клеток/мл) штаммов Р. aweofaciens BS 1393 и P. aureofaciens

BS1393(pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г субстрата (торф : песок, 3 : 1 (pH 6.2)). Хлорид никеля вносили в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг. Через 2 недели определяли титр бактерий в ризосфере (КОЕ/см корня), в конце эксперимента массу растений и концентрацию никеля в корнях и надземной части растения. Эксперименты проводили в 8-кратной повторное™.

Концентрацию никеля в растительных образцах определяли спектрофотометрически (СФ-26, Х=470 нм) с диметилглиоксимом в присутствии окислителя йодида калия согласно методике (Алимарин и Иванов, 1987). Концентрацию никеля рассчитывали в мг/кг сухой массы растений.

Вегетационные эксперименты, моделирующие смешанное загрязнение ПАУ и никелем проводили в течение 4 недель с естественным световым и температурным режимами. Семена сорго сорта «пищевое» и ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (108 клеток/мл) штаммов-деструкторов ПАУ Р. aureofaciens BS1393(pBS216) и Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г серой лесной почвы (pH 7.05). В качестве загрязнителей в почву вносили нафталин (1 г/кг) в варианте с сорго или смесь ПАУ (нафталин (1 г/кг) и фенантрен (0.2 г/кг)) в варианте с ячменем. Почву увлажняли раствором сульфата никеля (конечная концентрация 400 мг/кг). Через 4 недели определяли титр ризосферных бактерий и массу растений. Эксперименты проводились в 3- кратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цннку, кадмию

На первом этапе работы проводили поиск бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку и кадмию, в ризосфере (1) дикорастущих растений заповедника (г. Владивосток), (2) культурных злаков, выращиваемых на сельскохозяйственной почве (г. Краснодар) и (3) диких злаков, собранных на заводской территории автозавода «СеАЗ» (г. Серпухов). Оказалось, что у ризосферных псевдомонад уровень устойчивости к никелю и цинку не превышал 2-3 мМ, кобальту - 0.5 мМ, кадмию - 0.2 мМ (кроме бактерий из 3 группы, которые были устойчивы к 2 мМ кадмия). Поэтому поиск высокорезистентных бактерий был продолжен в техногенно-загрязненных источниках: в почвах с территории нефтеперерабатывающего завода (г. Нижнекамск) и пробах промышленных сточных вод «Горьковского металлургического завода» (г. Нижний Новгород). Только в последних пробах были обнаружены бактерии, устойчивые к высоким концентрациям никеля/кобальта (3-8 мМ), цинка (3-5 мМ) и кадмия (2-3 мМ) (табл. 1).

Последующая задача состояла в обнаружении в этих бактериях плазмид, содержащих функциональные детерминанты устойчивости к тяжелым металлам, для переноса в известные штаммы PGPR Pseudomonas. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости у

бактерий, является быстрый экспорт тяжелых металлов с помощью мембранной помпы. Известны три типа оперонов, которые детерминируют этот механизм устойчивости: cnrXYHCBAT (CoW), czcCBADRSNI (CoVZn'/Cd') (Mergeay et al., 1985) и nccCBA YXHN (NiVCoVCd') (Schmidt and Schlegel, 1994). Фрагменты этих оперонов были использованы в качестве зондов для поиска гомологичных систем среди отобранных 42 штаммов со средним уровнем устойчивости к нескольким металлам. В табл. 1 представлены результаты положительной гибридизации, выявленные у 13 штаммов.

Таблица 1. Результаты гибридизации ДНК колоний выделенных устойчивых штаммов с зондами с:сСВЛО, спгХУНСВАТи пссСВ

Штамм Фенотип Гибридизация с зондами

устойчивости c:c cnr ncc

Ризосфера диких злаков («СеАЗ»)

Pseudomonas sp.1 R1 Ni(l)Zn(3) Cd(2) + - -

Pseudomonas sp. R2 Ni(l) Zn (3)Cd(l) + - -

Почва

Pseudomonas sp. Sl 1 N¡(2) Zn(5) Cd(2) ± - -

Pseudomonas sp. S13 N¡(3) Zn(3) Cd(2) ± - -

Pseudomonas sp. S16 Zn(5) Cd(2) ± - -

Сточные воды

и.о.2 W27 (пл. 90 т.п.н.) Co(8) Ni(8) Zn(1.5) - + ±

W283 (пл. 65 т.п.н.) Co(8) N¡(8) Zn(2) - + ±

н.о. W29 (пл.10 т.п.н.) Co(3) Ni(5) Zn(2) - + ±

н.о. W31 Co(5) Zn(3) Cd(3) + - -

н.о. W32 Co(3) Zn(3) Cd(3) + - -

н.о. W33 Co(3) Zn(5) Cd(3) + - -

и.о. W37 (пл. 5 т.п.н.) Co(5) Ni(5) Cd(2) - - +

н.о. W38 (пл. 5 т.п.н.) Co(5)Ni(3)Cd(2) - - +

Контроли

Е. coli ЕС246 (cnrXYHCBA :pSUP202) - + -

Е. coli ЕС115 (c:cCBAD\pTl-5) + - -

E. coli EC767 (nccCB:pVDZ'2) - - +

Примечания:1 На основании морфо-физиологических признаков изолят отнесен к Pseudomonas sp.;2 и.о. - не определен до рода; 3 изолят W28 (лабораторный номер BS501(pBS501)) в дальнейшем идентифицирован как Comamonas testosteroni. Штаммы, выделенные из ризосферы (R), почвы (S), воды (W). 4 В скобках указана максимальная концентрация металла (мМ) в среде LB, при которой наблюдается рост штамма. (-) Отсутствие сигнала, (+) сильный, (±) слабый сигналы гибридизации.

Как видно из табл. 1, у пяти ризосферных и почвенных псевдомонад выявлена гомология с зондом c:cCBAD, однако эти штаммы были

чувствительны к никелю и не содержали плазмид. У восьми штаммов, выделенных из сточной воды, выявлены сигналы гибридизации с зондами czcCBAD (3 штамма), пссСВ (2 штамма) и одновременно с двумя зондами спгХ}тНСВАТ/пссСВ (3 штамма). Только в этой группе бактерий обнаружены 5 плазмидосодержащих штаммов.

2. Характеристика детерминанты устойчивости к кобальту/никелю в штамме Comamonas tesíosteroni BS501(pBS501)

2.1 Плазмидная локализация. Наибольший интерес для дальнейших исследований представлял выделенный из пробы сточной воды штамм W28, (лабораторный номер BS501 (pBS501)) устойчивый к 5 мМ кобальта, 5 мМ никеля и 2 мМ цинка. В штамме обнаружена плазмида pBS501 размером около 65 т.п.н. (рис. 1, дорожка /), которая передавалась при конъюгации в чувствительные штаммы Р. pulida BS394 и W340 с частотой 10~6 и обеспечивала устойчивость только к 2 мМ кобальта и никеля. Из данных Таблицы 1 видно, что при гибридизации ДНК колоний штамма BS501 (pBS50 i) были выявлены 2 сигнала - сильный с зондом спг и слабый с зондом псс. Однако, гибридизация EcoR\-, HindШ- и 5я/1-фрагментов рестрикции ДНК pBS501 с этими зондами выявила только один положительный сигнал с опероном cnrXYHCBA, локализованным на плазмиде pMOL28.

Рис. 1. Электрофорез плазмидных ДНК из штаммов: (У) W28 (BS501(pBS501)) (65 т.п.н.), (2) W29 (90 т.п.н.); маркерные плазмиды: (5) pMG18 (102 т.п.н.), (4) pBS216 (85 т.п.н.), (5) pULBl 13 (68 т.п.н.).

2.2 Идентификация штамма BS501(pBS501). До настоящего времени обнаружены только три плазмиды, содержащие функциональные детерминанты устойчивости: pMOL28 (спг) и рМОЬЗО (с:с) в Cupriavidus metallidarans СН34 (Mergeay et al., 1985) и рТОМ9 (псс) в С. metallidurans 31а (Schmidt and Schlegel,

1994). Плазмида pBS501 (65 т.п.н.) в отличие от pMOL28 (180 т.п.н.), значительно меньшего размера и не детерминирует устойчивость к хромату и ртути. Поэтому несомненный интерес представляло выяснение таксономического положения штамма BS501(pBS501). По совокупности морфологических, физиолого-биохимических признаков и по результатам сравнительного анализа последовательности гена 16S рибосомальной РНК штамм BS501 (pBS50i) отнесен к роду Comamonas (класс Betaproteobacteria, порядок Burkholderiales, семейство Comamonadaceae), и идентифицирован как Comamonas tesíosteroni (рис. 2). В бактериях рода Comamonas описаны плазмиды, несущие гены биодеградации толуолсульфоната, сульфобензоата, хлоро- и нитробензенов, фталатов и других токсичных ксенобиотиков (Tralau et al., 2001; Wu, et al., 2006). Хотя в геномах бактерий порядка Burkholderiales выявлены последовательности, гомологичные спг и псс (Stoppel and Schlegel,

1995), их исследование не проводилось, и плазмиды, контролирующие

устойчивость к двухвалентным катионам, в Сотатопаз до настоящего времени не были обнаружены.

ВигШМепа серааа "АТСС25416" (АР097530)

1000

1'ат1игта арШа 'ТМв 16407" (АПЗЧПЗ) - ПаШотарккеЧи "АТСС 27512" (Х67042)

На1з1оЫа хЫапассагит "АТСС 11696"(Х67036)

Ка\зЮта таппИоШуНса "1ЛЮ6866" (А;270258) I ^ПтгшМш сатртепз13 "^52" (АРЗ 12020)

СпрЫагШз тсаШг (1ЫчЮта ешгорка) "05185" (У10825) СнрпачШиз кИаЫИ (А ГС 7 6 ':>)

-щ!— СирптШш раиси/из "1ЛЮ 3413" (АГ085226)

аол I-" СирпиуЫиз пшшНМигапх СН34" (\'10824)

-СирпагШш охаШПаа 'ТСМ 1105" (АП55567)

- СирптШш пииюг АТСС 17697 (М32021) - СтШЛа ЬшИемЫ "ЕШГ (АРЗ 12021)

- СирпагШиз ЬаяНетн "ЯК 1" (АЛ002302)

■й

852

СиргшиЛя ЬазПепш "ОБМ 11853Т"(АРЗ 12022) Сотатопаз аМогогат "1АМ 12409Т"(АВ021417)

'-"Ш//ш ¡зитШета" "Т7" (АВ075017)

| 1000 "Сотатопаз когеепт" "КСТС 12005" (АР275377)

1-"Сотатопаз зр." " 12022" (АР078773)

"Сотатопаз пНгаНуогапз" "23310" (А^51577)

Н]

•"Сотатопаз сн/иаИса" ЬМв 2370Т" (АК30344)

- "Сотатопаз /ет^епа" "1М1 359870" (АР078772)

-"Сотатопаз кегзыгзп" ГМО 3475Т (АД430347)

_г "1'шпатопаз 1ез1оз1егопГ "вМСС В329"АР336312

Сотатопаз 1ез1оз1егот БМСС В0589 (АР501880) 997 Г" "Сотатопаз Ыз1озНгопГ "\VDL7" (АР538933) ' "Сотатопаз 1из1оз1чгоп1" "5В4" (А^ОбЗЗб) "Сотатопаз 1ез1оз1егоп1" ГЛУ6532 [9| ('чтапюпаз (елолегане '^С1МВ 10643" (АУ247415) "Сотатопаз ь>з1оз[егот" "ЗВЗ" (А^06335) ■ "Сотатопаз Кзюз/аот"МВ1СЗ841" (АВ007997) 545-" Сотатопаз 1езиа1егот" В8501(рВ5501) (ЕК409944)

"Сотатопаз 1ез1оз1егоп1" "010" (АР5 19533) Сотатопаз тзШзШот АТСС 1 1996 (М1 1224) "Сотатопаз Ш1т1ептГ "МВ1С3840" (АВ007996)

"Сотатопаз 1емо\(еги/н" "АТЗ" (ЛГ5328711

"Сотатопаз 1езюз1егоп/" "КР704" (АВ109750)

"Сотатопаз ¡езишегот" "А'С1МН 9872" (АП72067) "Сотатопаз Ышкт«'" "КГ712" (АВ10*)751)

Рис. 2. Положение штамма Сотапюпая ¡е$Ш1егот ВЭ501(рВ8501) на филогенетическом дереве порядка ВигкЬо1с1епа1ез (класс Вс1арго1еоЬае1ег1а) на основании последовательности гена 168 рРНК. Масштаб (0.01) соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «Ьоо1з1гар-анализа» 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы ТЯЕЕСОЫ.

Праймеры, фланкирующие структурные гены спгСВ и спгА оперона спг плазмиды pMOL28, были использованы в ПЦР с плазмидной ДНК pBS501. Различия, обнаруженные в спектре и размерах ампликонов, свидетельствуют о том, что исследуемая детерминанта отличается от оперона спг (рис. За, дорожки 4, 5). В то же время, положительная гибридизация с зондами спгСВ (рис. 36, дорожка 4) и спг А (рис. Зв, дорожка 5) указывает на их значительную гомологию.

(в)

I 2 3

Г*Т s •

Рис. 3. Выявление гомологии детерминанты устойчивости к кобальту/никелю плазмиды pBS501 с 32Р-меченными ампликонами спгСВ (б) и спгА (в), (а) Электрофореграмма: 1 - XHindIII; 2 и 3 - ампликоны спгСВ и спгА, соответственно, с плазмиды c/irAYHCBA:pSUP202 («+» контроли); 4 и 5 -ампликоны «спгСВ» и «спгА», соответственно, с плазмиды pBS501.

2.3 Индукция устойчивости к кобальту/никелю. Экспрессия оперона спг в С. metallidurans СН34 индуцируется катионами кобальта и никеля (Schmidt and Schlegel, 1994). Предварительное выращивание инокулята штамма С. teslosteroni BS501(pBS501) при 10-200 мкМ никеля или кобальта с первых часов обеспечивало быстрый рост культуры в среде, содержащей 2 мМ кобальта или никеля (рис. 4, кривые /, 2), тогда как в вариантах без индукции наблюдалась продолжительная лаг-фаза (4-6 ч) (рис. 4, кривая 5). Из рисунка видно, что катионы цинка и кадмия не являются индукторами устойчивости (рис. 4, кривые 4 и 5).

Рис. 4. Влияние индукции системы устойчивости катионами тяжелых металлов на рост С. testosteroni BS501 (pBS501) в присутствии 2 мМ никеля. Инокулят выращивали при: (/) 20 мкМ Ni, (2) 50 мкМ Со, (4)200 мкМ Zn, (5) 50 мкМ Cd, (3) без индукции.

0 12 3 4 5 6

2.4 Устойчивость цитоплазматической мембраны клеток исходного штамма С. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта Р. pulida BS394(pBS501) к воздействию кобальта

С помощью метода электроориентационпой спектроскопии (ЭОС) (Мирошников и др., 1986) показано, что цитоплазматическая мембрана (ЦМ) клеток С. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта Р. pulida BS394(pBS501), инкубированных в присутствии 50-200 мкМ кобальта, подвергается лишь незначительному повреждению. Так, при 100 мкМ кобальта для клеток С. testosteroni BS501(pBS501) и Р. pulida BS394(pBS501) величина Aß/pK, характеризующая степень повреждения ЦМ, составила -0.1310.05 и -0.15+0.05, соответственно, тогда как для чувствительного штамма Р. pulida BS394 Aß/ßK = -0.48+0.2. После мягкой обработки клеток штамма С. testosteroni BS501 (pBS501) трипсином степень повреждения его ЦМ при воздействии 100 мкМ кобальта увеличивалась до -0.5410.1, что может указывать на наличие защитных белков на поверхности клеток С. testosteroni BS501(pBS501). С поверхности клеток штаммов С. testosteroni BS501(pBS50I) и Р. pulida BS394(pBS501) 5 М хлоридом лития солюбилизировапись белки массой около 49, 40 и 32 кДа, которые отсутствовали у чувствительного штамма Р. pulida BS394 (рис. 5). Обнаруженные белки оказались близки по массе белкам, кодируемым cw-опероном из С. metallidurans СН34: CnrC (44 кДа), CnrB (40 кДа) и СпгТ (37 кДа) (Liesegang et al., 1993).

Рис 5. Электрофореграмма белков, солюбилизированных 5 М хлоридом лития с поверхности клеток устойчивых штаммов, в 9% ПААГ-ДСН: (/) белковые маркеры (кДа), (2) Р. pulida BS394, (5) С. testosteroni BS501(pBS501), (4) Р. pulida BS394(pBS501).

Измерения ЭОС клеток проводились при 20°С через 15 мин после внесения в бактериальную суспензию кобальта. Поэтому обнаруженные поверхностные белки могли участвовать в процессах экспорта катионов тяжелых металлов из клеток исследуемых устойчивых бактерий, однако не исключено также их участие в биосорбции и иммобилизации металлов.

3. Характеристика штаммов PGPR Pseudomonas, содержащих плазмиду pBS501

3.1 Получение устойчивых вариантов PGPR. Плазмида pBS501 с помощью конъюгации была перенесена в ризосферные штаммы Р. aureofaciens BS 1393, Р. ßuorescens 38а и Р. chlororaphis PCL1391. С частотой 10"4-10~5 получены трансконъюганты, в которых плазмида стабильно сохраняется в

неселективпых условиях, как минимум, в течение 10 пассажей и обеспечивает повышение устойчивости к кобальту (0.5-2.0 мМ) от 5 до 20 раз, и никелю (1.0-2.5 мМ) от 2 до 10 раз (табл.2).

Таблица 2. Уровни устойчивости к тяжелым металлам штаммов Pseudomonas и Comamonas в трис-минеральной среде с глютаматом натрия или глюкозой

Штаммы

Максимальный уровень устойчивости (мМ)

Co Ni Zn Cd

Р. aureofaciens BS 1393 0.1 1.0 1.5 0.2

P. aureofaciens BS1393(pBS501) 2.0 2.0 1.5 0.2

P. chlororaphis PCL1391 0.05 0.15 2.5 0.2

P. chlororaphis PCL1391(pBS501) 0.5 2.0 2.5 0.2

P. fluorescens 38a 0.05 0.1 2.0 0.1

P. fluorescens 38a(pBS501) 0.5 1.0 2.0 0.1

C. testosteroni B-1241 0.5 1.0 1.0 0.1

C. testosteroni B-1241(pBS501) 5.0 5.0 1.0 0.1

C. acidovorans B-1251 1.0 2.0 1.0 0.2

C. acidovorans B-1251(pBS501) 5.0 5.0 1.5 0.2

C. testosteroni BS501(pBS50i) 5.0 5.0 1.0 0.1

3.2 Супрессия фитоиатогеиов и продукция индольных соединений рнзосферпыми штаммами в присутствии кобальта/никеля. Исходные ризосферные штаммы являются продуцентами фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и противогрибных антибиотиков - феназинов (Р. aitreofaciens BS 1393), пиолютеорина {P. fluorescens 38а) и феназинкарбоксамида (P. chlororaphis PCL1391). Известно о положительном влиянии микромолярных концентраций тяжелых металлов на синтез ИУК (Belimov et al., 2000, Белимов, 2008) и некоторых антибиотиков (Slininger and Jackson, 1992; Chin-A-Woeng et al., 1998 Duffy and Defago, 1999). В настоящей работе показано, что в культуральной среде устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501), выращенных в присутствии 2 мМ никеля или кобальта, концентрация индольных соединений (1.6-2.0 мкг/мг биомассы) в 1.5-2 раза выше по сравнению с чувствительными вариантами.

В ходе работы выявлено, что большинство видов фитопатогенных грибов родов Fusarium, Rhizoctonia или Geumanomyces обладает более высоким уровнем устойчивости к кобальту и никелю, чем исследуемые ризосферные бактерии. Однако ризосферные штаммы, содержащие плазмиду pBS501, при совместном выращивании с различными видами перечисленных фитопатогенов, подавляли рост грибов в присутствии 2 мМ кобальта или никеля, в отличие от исходных штаммов. На рис. 6 показан пример супрессии Fusarium oxysporum устойчивыми штаммами Р. aureofaciens BS1393(pBS501), Р. fluorescens 38a(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501) {1-3) при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля. В то же время

чувствительные варианты BS1393 (4) и 38а (5) слабее подавляли рост гриба, а штамм PCL 1391 (6) зарастал грибным мицелием.

Рис. 6. Супрессия Fusarium oxysporum ризосферными штаммами при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля: (/) Р. aureofaciens BS1393(pBS501),

(2) Р. fluorescens 38a(pBS501),

(3)Р. chlororaphis PCL 1391 (pBS501);

(4) BS1393, (5) 38a, (6) PCL1391.

3.3 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами. На основе штамма Р. aureofaciens BS 1393 разработан и широко применяется биопрепарат для защиты и стимуляции роста растений «Псевдобактерин-2» (Воронин, Кочетков, 1995). В связи с загрязнением почв тяжелыми металлами необходимо было выяснить возможность использования устойчивого варианта BS 1393(pBS501) на загрязненных почвах. Было показано, что при выращивании Р. aureofaciens BS1393(pBS501) и С. lestosteroni BS501(pBS501) в среде, содержащей от 0.25 до 2 мМ хлорида кобальта, в клетках штаммов увеличивалось содержание кобальта (табл. 3).

Таблица 3. Аккумуляция кобальта штаммами С. lestosteroni BS501 (pBS501) и Р. aureofaciens BS 1393(pBS501)

Концентрация Со, Сухая % Со, Сухая %

Со2+ в среде, мкг/мг биомасса, акку мкг/мг биомасса, акку

мМ сухой мг/мл муля сухой мг/мл муля

(мкг Со/мл)* биомассы культуры ции биомассы культуры ции

С. lestosteroni BS501(pBS501) Р. aureofaciens

BS 1393(pBS501)

0.25 (14.7)* 0.11±0.02 4.0±0.1 3 0.69±0.03 3.7±0.4 17

0.5 (29.4) 0,34±0.03 3.8±0.2 4 1.49±0.01 3.5±0.3 17

1.0 (58.9) 0.51±0.01 3.8±0.2 3 2.34±0.02 3.0±0.1 12

1.5 (88.4) 0.91±0.01 3.6±0.1 3 3.14±0.02 2.5±0.1 9

2.0(117.8) 0.86±0.03 3.5±0.1 2 3.54±0.01 2.5±0.2 7

Из данных табл. 3 видно, что ризосферный штамм Р. aureofaciens В81393(рВ8501) аккумулировал в 3-6 раз больше металла по сравнению со штаммом С. 1е51о$1егот В8501(рВ8501). При концентрации кобальта в среде до 0.5 мМ через 18 часов роста в биомассе ризосферного штамма наблюдалась максимальная аккумуляция - до 17%. При субингибирующей концентрации металла в среде (2 мМ) его аккумуляция понижалась до 7%. Штамм С. гейш/егол/ В8501(рВЭ501), имеющий более высокий уровень устойчивости (5 мМ), аккумулировал не более 4%.

3.4 Локализация кобальта в клетках. На поверхности клеток устойчивых штаммов Р. аигео/аЫет В81393(рВ8501) (рис. 7а) и С. /ез/о^егоя/ В8501 (рВ8501) (рис. 76), выращенных в присутствии кобальта, обнаружены электронно-плотные гранулы и кристаллиты, соответственно.

(а) (б)

кргщаллиты

гранулы

Рис. 7. Ультратонкие срезы клеток Р. аигео/аЫет В81393(рВ8501) (а), С. ie.s7o.sie/-o«/ В8501(рВ8501) (б), Р. аигео/аает В81393 (в), выращенных в присутствии 2 мМ кобальта, и Р. аигео/ас1ет В81393(рВ8501) (г), выращенных в среде без кобальта. Стрелками указаны электронно-плотные структуры в виде гранул (а, в) и кристаллитов (б). Шкала 0.5 мкм.

В чувствительном штамме Р. аигео/аавпя ВЭ1393 гранулы были обнаружены не только на поверхности клеток, но также в цитоплазме и периплазматическом пространстве клеток (рис. 7в), что может объясняться отсутствием у данного штамма системы вывода токсичных катионов. Возможно, что гранулы в клетках Р. аигео/ас'шпз ВЭ1393 и ВЭ 1393(рВ8501) представляют собой конгломераты связанных с кобальтом клеточных метаболитов, например, сидерофоров, феназиновых производных или экзополисахаридов, которые синтезируются во время роста штаммов. В пользу этого предположения свидетельствует отсутствие гранул после инкубации отмытых клеток в среде с кобальтом, хотя в этом случае клетки накапливали до 2 мкг Со/мг биомассы.

4. Ризосферный штамм Р. аигео/аает В81393(рВ8501) в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем

Известно, что соли никеля более токсичны для растений, чем соли кобальта (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Поэтому в вегетационных экспериментах с растениями ячменя исследовали способность штамма Р. аигео/ас'шпз ВЭ 1393(рВ8501) защищать растения от аккумуляции никеля. Никель вносили в торфосмесь в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг, что согласно гигиеническим нормативам соответствует примерно 2.5, 5 и 10 ПДК валового содержания никеля. Предварительные эксперименты показали, что при данных концентрациях никель оказывает негативное влияние как на рост ячменя, так и на численность бактерий в ризосфере.

4.1 При загрязнении 235 мг никеля/кг торфосмеси (2.5 ПДК)

устойчивый штамм Р. аигео/ас1ею ВЭ1393(рВЭ501) обладал численным преимуществом в ризосфере ячменя по сравнению с бесплазмидным вариантом Р. аигео/ас'1вт В81393. Через 2 недели роста растений численность устойчивого штамма в ризосфере (6.2x108 КОЕ/см корня) была на два порядка выше численности чувствительного штамма ВЭ1393 (5.4x10 КОЕ/см корня). Очевидно, это преимущество и обеспечило большую стимуляцию роста растений (рис. 8).

Рис. 8. Развитие растений ячменя

i/ ЛШВ при уровне загрязнения никелем

, , Ф Й 2'5 ПДК 3' 4); 1 ~ Растения без

I да 1:1 И инокуляции; 3 и 4 - растения

тШМ 1ШЯК УЮ инокулированы штаммами

шЙШ В1 иигео/ас1ет ВБ1393 и

К ЩШ; чХЪ Р. аигео/аЫет Вв 1393(рВ8501),

I 1 4 '^Кр соответственно; 2 - растения без

* ' ■■[ , ШЁ 4 — инокуляции, выращенные в чистом

При сравнении массы инокулированных и контрольных растений было показано, что даже в условиях загрязнения никелем чувствительный штамм

Р. аигео/ааепз В81393 обеспечивал увеличение массы корней в 2.5 раза и надземной части растений на 30%. Однако устойчивый штамм Р. аигео/ас'шю В81393(рВ8501) более эффективно стимулировал рост растений: обеспечивал прирост массы корней в 4.5 раза и надземной части растений на 48% (табл. 4). В среднем общая масса растения, инокулированного Р. аигео/аЫепя ВЭ 1393(рВ8501), была на 40% больше массы растения, инокулированного Р. аигео/аЫепз ВЭ1393. При этом плазмидосодержащий штамм, по сравнению с исходным штаммом, обеспечивал двукратное увеличение массы корней и на 14% - надземной части растений.

Таблица 4. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 235 мг Ni/кг торфосмеси (2.5 ПДК)

Надземная Корни Целое

Обработка семян часть растение

сухая масса, мг

Без инокуляции 65±3 18±4 83

Р. аигео/ас1еп$ ВБ1393 84±2 43±2 127

Р. аигео/аЫет В81393(рВ8501) 96±3 80±3 176

концентрация Ni, мг/кг сухой массы

Без инокуляции 30±5 46±5 38±5

Р. аигео/ас'шпх В81393 100±15 330±20 177±17

Р. аигео/аает В81393(рВ8501) 80±10 108±15 92±12

Без инокуляции в чистом субстрате 78±4 38±3 116

Помимо стимулирующего эффекта на растения, инокуляция семян ячменя устойчивым штаммом способствовала снижению токсического воздействия никеля на растения и уменьшению аккумуляции металла в растительных тканях. Как видно из данных табл. 4, в корнях растений, инокулированных плазмидосодержащим штаммом, концентрация никеля (108 мг никеля/кг сухой массы растений), была в 3 раза меньше, чем в корнях растений, инокулированными исходным штаммом (330 мг никеля/кг массы растений). В надземной части растений содержание никеля было сравнимо при обоих вариантах инокуляции (80-100 мг никеля/кг массы растений) (табл. 4). Поскольку в ризосфере растений численность устойчивого штамма была значительно выше численности чувствительного, возможно, именно это способствовало большей иммобилизации никеля бактериями и уменьшению концентрации свободных катионов в зоне всасывания корней.

4.2 При загрязнении 470 мг никеля/кг торфосмеси (5 ПДК) через 2 недели роста растений было отмечено уменьшение численности интродуцированных бактерий в ризосфере (до 105 КОЕ/см корня) и отсутствие стимулирующего влияния на массу растений (табл. 5). Однако, даже при такой низкой численности клеток содержание никеля в корнях растений, инокулированных штаммом Р. aureofaciens BS1393(pBS501) (1110 мг никеля/кг массы растений), было на 30% меньше, чем в растениях, инокулированных исходным штаммом (1490 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5).

Таблица 5. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 470 мг Ni/кг торфосмеси (5 ПДК)

Надземная Корни Целое

Обработка семян часть растение

сухая масса, мг

Без инокуляции 62±2 18±1 80

Р. аигео/аает ВБ1393 65±2 16±2 81

Р. аигео[ас1ет ВЭ1393(рВЭ501) 69±3 19±2 88

концентрация Ni, мг/кг сухой массы

Без инокуляции 130±20 940±40 535±30

Р. аигео/аыеюЪЪМ)^ 160±20 1490±120 825±70

Р. аагео/аЫем ВЭ1393(рВЭ501) 160±15 1110±80 635±45

Без инокуляции в чистом субстрате 78±4 38±3 116

В надземной части растений, инокулированных как устойчивым, так и чувствительным штаммами, содержание никеля было одинаковым (160 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5). Однако, как видно из рис. 9, штамм Р. аигео/ас1ет В81393(рВ8501) защищал растения от токсического воздействия никеля. При инокуляции устойчивым штаммом количество растений с признаками хлороза (обесцвечивания листьев) на протяжении 4-х недель роста увеличивалось не так стремительно (от 7 до 50%), как при инокуляции исходным штаммом (от 20 до 80%) или в вариантах без инокуляции (от 17 до 80%) (рис. 9).

-*"В81393(рВ8501) -ОВ81393 Без инокуляции

Рис 9. Влияние инокуляции семян ячменя ризосферньши штаммами Р. аигео/ас/е/к ВБ1393 и Р. аигео/ас'1еп5 Вв 1393(рВ8501) на развитие хлороза у растений, выращенных при загрязнении 470 мг №/кг субстрата.

4.3 При загрязнении 940 мг никеля/кг торфосмеси (10 ПДК)

численность штаммов через 2 недели роста была очень низкой (3.2-4.7 х 102 КОЕ/см корня), и ризосферные бактерии не стимулировали рост растений. Только в течение первой недели роста устойчивый штамм Р. аигео/ас'1ет

BS1393(pBS501) обеспечивал защиту растений от токсического действия никеля (29% пораженных растений), в то время как 65% растений, инокулированных чувствительным штаммом, имели признаки хлороза.

5. Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Лег/^/оигояда-деструкторы ПАУ

5.1 Получение двухплазмидных штаммов. Одним из перспективных подходов для биоремедиации почв со смешанными загрязнениями тяжелыми металлами и органическими токсикантами является применение устойчивых к тяжелым металлам штаммов-деструкторов (Weyens et al., 2010, 2011). В настоятдей работе плазмида pBS501 с помощью трансформации была перенесена в штаммы Р. aureofaciens BS1393, Р. chlororaphis PCL1391 и Р. ßuorescens 38а, содержащие природную плазмиду биодеградации нафталина/фенантрена pBS216. В полученных трансформантах визуализированы две плазмиды размером около 65 и 85 т.п.н., соответствующие по размеру pBS501 (65 т.п.н.) и pBS216 (85 т.п.н.) (рис. 10).

1 2 3 4 5

Рис. 10. Электрофореграмма тотальной ДНК в 0.8% агарозном геле: (/) pBS216; (2) pBS501; двухплазмидные штаммы

(J) BS 1393(pBS216,pBS501); {4) PCL 1391(pBS216,pBS501), (5) 38a(pBS216,pBS501).

85 т.п.н;

65 т.п.н.

Кроме того, наличие гена спгА плазмиды рВЭбО 1 и гена паИАс нафталинового оперона плазмиды рВЭ21 б в полученных рекомбинантных штаммах подтверждалось с помощью ПЦР, результаты которой представлены на рис. 11.

(а) (б)

м 7_? Л

500 п.н.

Рис. 11. Электрофореграмма результатов ПЦР гена спгА (а) и пакАс (б): (2) В81393(рВ8216,рВ8501), (5) РСЫ391(рВ8216,рВ8501),

(4) 38а(рВ5216,рВ8501); (а) (/) «-» контроль ВБ1393(рВЭ216), (5) «+» контроль спгХУНСВА:р81!Р202; (б) (/) «+» контроль ВЭ 1393(рВ8216), (5) «-» контроль В81393(рВ8501; М-маркер.

Уровни устойчивости к кобальту и никелю при росте реципиентных штаммов на нафталине не превышали 50 и 100 мкМ, соответственно. У трансформантов Р. аигео/аЫет В81393(рВ8216,рВ8501), Р. сЫогогар!т РСЫ391(рВ8216,рВ8501) и Р.^иогезсепэ 38а(рВ8216,рВ8501) уровни

устойчивости повышались в 4-8 раз к кобальту и в 2-4 раза к никелю и составили 200-400 мкМ, однако были ниже, чем уровни устойчивости штаммов, выращенных на глюкозе или глютамате, (табл. 2).

5.2 Активности ключевых ферментов бнодеградацин нафталина

Известно, что тяжелые металлы ингибируют ферменты клеточного метаболизма, в том числе и специфические оксигеназы (8апс1пп, 2003). При выращивании полученных нами рекомбинантных штаммов на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля, вплоть до стационарной фазы роста сохранялись высокие активности ключевых ферментов биодеградации нафталина нафталиндиоксигеназы, салицилатгидроксилазы, катехол-2,3-диоксигеназы, кодируемых плазмидой рВ8216, и катехол-1,2-диоксигеназы, кодируемой хромосомой штаммов (табл. 6). Из данных, представленных в табл. 6, видно, что у чувствительных штаммов В81393(рВ8216) и РСЫ391(рВ821б) активности исследуемых ферментов понижались почти на порядок, а в штамме 38а(рВ8216) не регистрировались.

Таблица 6. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов, выращенных до стационарной фазы роста на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля

Штамм

Удельная активность ферментов, нмоль/мин мг белка

НО СГ К1,20 К2,30

В81393(рВ8216,рВ8501) 7 30 63 14

ВЭ 1393(рВ8216) 0.3 4.3 7.4 25

РСЫ391(рВ8216,рВ8501) 1.6 36.8 55.3 1.2

РС1Л391(рВ8216) 0.2 4.1 7.5 27.4

38а(рВ8216,рВ8501) 2 62 28 18

38а(рВ8216) н.о. н.о. н.о. н.о.

Примечания: н.о. - активность не определяется. НО - нафталиндиоксигеназа, СГ - салицилатгидроксилаза, К2,30 - катехол-2,3-диоксигеназа, К 1,20 -катехол-1,2-диоксигеназа.

Ранее ингибирующее влияние никеля и цинка на деградацию хлоробифенилов исследовали при высокой плотности культуры устойчивых штаммов-деструкторов (Эрг^ае! й а!., 1993). В настоящей работе влияние никеля (100 мкМ) на биодеградацию нафталина (1 г/л) оценивалось во время роста культуры с низкой плотностью заражения (107 КОЕ/мл), при этом нафталин использовался как единственный источник углерода. Устойчивые штаммы-деструкторы Р. аигео/ас'мпз В81393(рВ8216,рВ8501) и Р. сЫогогарМ.ч РСЫ391(рВ8216,рВ8501) менее чем за сутки культивирования в присутствии

100 мкМ никеля достигали численности бактерий 10 и Ю10 КОЕ/мл, соответственно, и окисляли почти весь нафталин (табл. 7). Численность чувствительных штаммов Р. аигео/ааепз В81393(рВ8216) и Р. сЫогогарМх РСЫ391(рВ8216) (5.0 х 106 и 7.0 * 107 КОЕ/мл, соответственно); в течение 1.5 суток почти не возрастала, а биодеградация нафталина составила около 10% (табл. 7).

Таблица 7. Биодеградация нафталина (1 г/л) ризосферными штаммами-деструкторами при культивировании в присутствии 100 мкМ никеля

Концентрация нафталина в %

Варианты КОЕ/мл среде, мг/л деграда

21 ч 36 ч ции

Контроль испарения среда без 870.0 ±22.0 191.0 ±40.0 -

нафталина бактерий

РСЫ391(рВ8216,рВ8501) 1.2 х Ю10 9.0 ±0.1 не определяли 98

В81393(рВ8216,рВ8501) 1.0 х 108 12.0 ±0.2 не определяли 98.6

РСЬ1391(рВ8216) 7.0 х Ю1 но 168.0 ± 17.0 12

В81393(рВ8216) 5.0 х Юб но 170.0 ± 16.0 10

5.3 Стабильность плазмид. Успешность использования штаммов, содержащих плазмиды с целевыми функциями, в полевых условиях зависит от стабильности этих плазмид. После 10 пассажей штаммов Р. аиге о/ас ¡спя В81393(рВ8216,рВ8501) и Р. Аиогехсепя 38а(рВ8216,рВ8501) в неселективных условиях стабильность обеих плазмид составила 50 и 35%, соответственно, тогда как в штамме Р. сМогогарИи РСЫ391(рВ8216,рВ8501) обе плазмиды сохранялись в 100% клеточной популяции.

6. Рекомбинантный штамм Р. аигео/аает В81393(рВ8216,рВ8501) в вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение

В настоящей работе было показано, что устойчивый штамм Р. аигео/ас'шт В51393(рВ8501) стимулирует рост растений, выращиваемых в условиях загрязнения никелем. Поэтому было важно выяснить, сохраняет ли эту способность двухплазмидный вариант этого штамма Р. аигео/ааепя В81393(рВ8216,рВ8501) в условиях смешанного загрязнения ПАУ и никелем (см. Материалы и методы). Показано, что в отсутствие никеля численность как чувствительного В81393(рВ8216), так и устойчивого В81393(рВ8216,рВ8501) штаммов в ризосфере сорго (при загрязнении нафталином) и ячменя (при загрязнении нафталином и фенантреном) была одинаковой (~104 х КОЕ/см корня). При этом инокулированные растения имели большую массу, чем растения без инокуляции (табл. 8).

Однако в условиях смешанного загрязнения численность устойчивого штамма-деструктора Р. аигео/ас'шт В81393(рВ8216,рВ8501) в ризосфере (2.4 х 104 и 5.2 х 10 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно) была на порядок выше численности чувствительного штамма В81393(рВ8216) (4.0 х Ю3 и 1.3 х

104 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно). При инокуляции семян устойчивым штаммом наблюдалось увеличение массы сорго и ячменя на 70 и 57%, соответственно, по сравнению с массой не ипокулированных растений. Тогда как инокуляция чувствительным штаммом В81393(рВ8216) только на 25% увеличивала массу сорго и не стимулировала рост ячменя (табл. 8).

Таблица 8. Влияние вариантов Р. аигео/аает В81393 на массу растений, выращенных в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем

Масса растения, мг

Обработка семян сорго

чистая почва нафталин нафталин + никель

Без инокуляции 77.6±5.1 36.8±2.4 44.9±2.5

В81393(рВ8216) 64.8±4.2 56.0±3.1 56.2±1.6

В81393(рВ8216,рВ8501) 74.1±5.8 51.6±2.2 77.6±3.4

ячмень

Инокуляция растений чистая почва нафталин/ нафталин/фенантрен

фенантрен + никель

Без инокуляции 42.3±3.5 24.4±2.0 28.4±2.3

В81393(рВ8216) 52.3±2.7 45.3±1.б 28.5±1.7

В81393(рВ8216,рВ8501) 47.4±3.1 39.4±1.5 44.0±2.0

Сравнение растений с различными вариантами инокуляции показало, что штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает большую прибавку массы сорго (на 38%) и ячменя (на 54%) по сравнению с чувствительным штаммом Р. aureofaciens BSI393(pBS2I6).

Таким образом, результаты вегетационных экспериментов показали потенциальную возможность использования бактерий группы PGPR Pseudomonas, содержащих детерминанту устойчивости к кобальту/никелю спг-типа, в качестве биопрепаратов для стимуляции роста и защиты растений при высоком уровне загрязнения никелем (до 5 ПДК), а также при смешанных загрязнениях никелем и полиароматическими углеводородами. Полученные в работе устойчивые ризосфсрные штаммы-деструкторы ПАУ могут быть рекомендованы для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации почв при смешанных загрязнениях ПАУ и тяжелыми металлами.

Депонирование штамма. Штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2501 Д.

выводы

1. Из различных загрязненных источников выделены и охарактеризованы штаммы бактерий, устойчивые к кобальту, никелю, цинку и кадмию. У бактерий рода Comamonas впервые обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Показано, что конъюгативная плазмида pBS501 в штамме, идентифицированном как Comamonas testosteroni, содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную оперону спг из Cupriavidus metallidurans СН34.

2. Получены трансконъюгантные штаммы ризосферных бактерий P. aureofaciens, P. fluorescens, P. chlororaphis, содержащие плазмиду pBS501, способные к колонизации ризосферы, синтезу индольных соединений и супрессии фитопатогенов в присутствии высоких концентраций никеля/кобальта.

3. Трансконъюгантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501), растущий в присутствии 0.5 мМ хлорида кобальта, способен аккумулировать из среды до 17% кобальта, который локализуется на поверхности клеток в виде гранул.

4. В вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем (235 мг/кг субстрата), устойчивый к кобальту/никелю ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивает значительный прирост биомассы ячменя (до 40%) и двукратное снижение аккумуляции никеля в растениях, по сравнению с исходным чувствительным штаммом P. aureofaciens BS1393.

5. Сконструированы ризосферные штаммы P. aureofaciens, P. fluorescens, P. chlororaphis, содержащие две плазмиды - устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации ПАУ, способные полностью окислять нафталин в присутствии 100 мкМ никеля. Инокуляция семян ячменя и сорго штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает увеличение биомассы растений на 50-70% в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем.

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. A.B. Сиунову, к.х.н. М.Г. Шляпникову, к.б.н. Н.Е. Сузиной, к.б.н. A.B. Лисову, вед. инж. ИБК А.Ю. Иванову, м.н.с. Т.О. Анохиной. Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. В.В. Кочеткову. Автор искренне признателен чл,-корр. РАН проф. A.M. Воронину за ценные советы, внимание и постоянную поддержку.

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ №02-04-48708; Программы фундаментальных исследований №13 РАН (проект 4.1.1.), проектов РНП №2.1.1.9321 и №2.1.1/4341; ФЦП ГК №02.512.11.2337, №02.740.11.0682, №02.740.11.0040, №14.740.11.0414, №43.073.1.1.2502; проектов МНТЦ №4033 и IPP ANL-72-0227-RU (DOE-1PP-CRDF RBO-10118).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Анисимова JT.A., Сиунова Т.В., Борони» A.M. Устойчивость к металлам грам-отрицательных бактерий, выделенных из почвы и сточных вод индустриальных регионов // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 5. С. 843848.

2. Иванов АЛО., Гаврюшкин A.B., Сиунова Т.В., Хасанова JI.A., Хасанова З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология. 1999. Т. 68, №3, С. 366-374.

3. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сузила Н.Е., Воронин A.M. Продукция феназиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas aureofaciens, содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю // Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 778-785.

4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Воронин A.M. Влияние ризосферных бактерий на аккумуляцию никеля растениями ячменя // Агрохимия. 2006. № 10. С. 80-84.

5. Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Машукова A.B., Кочетков В.В., Воронин A.M. Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации нафталина в присутствии кобальта/никеля // Микробиология. 2007. Т. 76. С. 212-218.

6. Воронин A.M., Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Сизова О.И. Изменение микробного сообщества ризосферных микроорганизмов под влиянием антропогенного загрязнения окружающей среды и интродукции в ризосферу плазмидосодержащих бактерий / Коллективная монография «Изменение окружающей среды и климата» в 8-ми томах. Т. 4. «Процессы в биосфере: изменения почвенно-растительного покрова и территориальных вод РФ, круговорот веществ под влиянием глобальных изменении климата и катастрофических процессов», Пред. ред. кол. Н.П. Лаверов, РАН.-М. ИФЗ РАН, 2008, С. 113-124.

7. Сиунова Т.В., Сиунов A.B., Кочетков В.В., Воронин A.M. ¿-«/--подобный оперон в штамме Comamonas sp., кодирующий устойчивость к кобальту и никелю // Генетика. 2009. Т. 45, № 3, С. 336-341.

8. T.V.Siunova, Т.О. Anokhina, O.I. Sizova, V.V. Kochetkov, A.M. Boronin. Impact of Plant Growth Promoting Rhizobacteria Pseudomonas in Phytoremediation Process / Handbook of Phytoremediation. Ed. by I.A. Golubev, 2011. Ch. 17, pp. 551-572.

Патент

Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Кочетков В.В., Воронин A.M. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв солями никеля. Патент РФ на изобретение №2396339. Приоритет изобретения 02.07.2008 г.

Тезисы

1. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Мордухова Е.А., Сизова О.И., Анохина Т.О., Балакшина В.В, Воронин A.M. Использование генетически модифицированных ризосферных бактерий рода Pseudomonas в фиторемедиации // Сб. тезисов конференции «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды». Пущино, 2001, С. 85-87.

2. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Балакшина В.В., Воронин A.M. Микробиологические аспекты биоремедиации техногенно-загрязненных территорий // Тезисы докладов. Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках». Санкт-Петербург, 14-19 июня 2001 г., С. 64-65.

3. Сизова О.И., Сиунова Т.В., Берниковская Д.И., Кочетков В.В., Воронин A.M. Использование природных и генетически модифицированных бактерий Pseudomonas aureofaciens для защиты растений и биоремедиации // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология 2003», Сочи, 22-26 сентября, 2003 г., С. 53-54.

4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Сизова О.И., Воронин A.M. Взаимодействие ризосферных бактерий и растений в почве, загрязненной никелем // 1-я Международная геоэкологическая конференция «Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами», Тула, 30-31 октября, 2003 г., С. 457-461.

5. Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Машукова А.В., Воронин A.M. Ризосферные штаммы бактерий рода Pseudomonas для фиторемедиации почв с комплексным загрязнением // Материалы 8-го международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005», Пущино 18-19 ноября 2005 г., С. 143-145.

6. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina Т.О., Sizova O.l., Boronin A.M.. Plant-growth promotion rhizosphere Pseudomonas for phytoremediation of co-contaminated soils // 11 International Symposium on Microbial Ecology-ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006. Book of abstracts, P. 351.

7. Negri M. C., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina Т.О., Sizova O.I., Zyakun A.M., Boronin A.M. Plasmid-Bearing Rhizosphere Pseudomonas for Enhanced Phytoremediation Performance // 41h International Phytoremediation Conference, Denver, Colorado, September, 2007.

8. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina Т.О., Sizova O.I., Boronin A.M. Beneficial Rhizosphere Bacteria for Bioremediation of Oil-Contaminated Soils // 2nd International Conference RHIZOSPHERE, Montpellier, France, August 25-31,2007.

9. Boronin A.M., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina Т.О., Sizova O.I., Vinogradova E.V., Sokolov S.L. Plasmid Bearing Rhizosphere Bacteria Pseudomonas for Phytoremediation // International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS) - «What can microbiology and molecular biology offer oil industry?» Colchester, England, September 16-18, 2007.

Подписано в печать:

21.10.2011

Заказ № 6087 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сиунова, Татьяна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Биологическая роль «условно-летальных» тяжелых металлов.

1.2 Токсическое влияние никеля и кобальта на живые организмы.

1.3 Загрязнение почвы никелем и кобальтом.

1.4 Влияние тяжелых металлов на популяцию почвенных микроорганизмов.

1.5 Влияние тяжелых металлов на свойства ризосферных микроорганизмов.

1.6 Поступление тяжелых металлов в клетку.

1.7 Механизмы устойчивости к тяжелым металлам у бактерий.

1.7.1 Связывание катионов тяжелых металлов.

1.7.2 Специфические белки, участвующие в экспорте тяжелых металлов.

1.8 HME-RND системы экспорта катионов тяжелых металлов.

1.8.1 Механизм вывода катионов тяжелых металлов.

1.8.2 Генетический контроль HME-RND систем.

1.8.3 Регуляция HME-RND систем.

1.8.4 Взаимодействие систем экспорта тяжелых металлов.

1.8.5 Распространение HME-RND систем.

1.9 Устойчивость к тяжелым металлам у Pseudomonas.

1.10 Использование генетического потенциала металлоустойчивых бактерий.

1.10.1 Биосенсоры.

1.10.2 Биореакторы.

1.10.3 Растительно-микробные ассоциации в почве, загрязненной тяжелыми металлами1.

1.11 Использование устойчивых бактерий в ремедиации смешанных загрязнений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Штаммы бактерий и плазмиды.

2.2 Среды и материалы'.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Условия выращивания микроорганизмов.

2.3.2 Выделение бактерий, устойчивых к тяжелым металлам.

2.3.3 Физиолого-биохимические тесты.

2.3.4 Определение параметров роста микроорганизмов.

2.3.5 Определение уровня устойчивости бактерий к тяжелым металлам.

2.3.6 Эксперименты по индукции.

2.3.7 Конъюгационный перенос плазмид.

2.3.8 Получение электрокомпетентных клеток.

2.3.9 Электропорация клеток бактерий.

2.3.10 Определение стабильности плазмид.

2.3.11 Выделение плазмидной ДНК.

2.3.12 Выделение тотальной ДНК.

2.3.13 Очистка препаратов ДНК.

2.3.14 Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.3.15 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.3.16 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.3.17 Препаративное выделение фрагментов ДНК из геля.

2.3.18 Проведение ДНК-ДНК гибридизации.

2.3.19 Секвенирование гена 16S рРНК.

2.3.20 Обработка и анализ последовательности гена16S рРНК.

2.3.21 Электроориентационная спектрометрия (ЭОС) клеток.

2.3.22 Обработка клеток трипсином.

2.3.23 Выделение поверхностных белков бактерий.

2.3.24 Электрофорез в ДСН-ПААГ.

2.3.25 Выделение и идентификация феназин-1-карбоновой кислоты.

2.3.26 Тестирование антагонистической активности PGPR Pseudomonas.

23.27 Определение концентрации индольных соединений.

2.3.28 Количественное определение кобальта в бактериальных клетках.

2.3.29 Электронная микроскопия клеток.ч.

2.3.30 Определение активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина.

2.3.31 Определение концентрации нафталина.

2.3.32 Проведение вегетационного эксперимента, моделирующего загрязнение никелем.

2.3.33 Количественное определение никеля в растительных образцах.

2.3.34 Проведение вегетационного эксперимента, моделирующего смешанное загрязнение.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку, кадмию.

3.1.2 Выявление генетических детерминант устойчивости к тяжелым металлам.

3.1.3 Выяснение плазмидной локализации детерминант устойчивости.

3.2 Идентификация штамма Comamonas testosteroni BS501(pBS501).

3.3 Характеристика детерминанты устойчивости плазмиды pBS501.

3.3.1 Гомология с опероном cnrXYHCBATиз Cupriavidus metallidurans СН34.

3.3.2 Устойчивость цитоплазматической мембраны к катионам кобальта и никеля.

3.3.3 Анализ белков клеточной поверхности устойчивых штаммов.

3.3.4 Индукция устойчивости к кобальту/никелю, детерминируемая плазмидой pBS501.

3.4 Характеристика устойчивых к кобальту/никелю штаммов PGPR Pseudomonas.

3.4.1 Создание плазмидосодержащих штаммов.

3.4.2 Уровни устойчивости к тяжелым металлам.

3.4.3 Стабильность плазмиды pBS501 в штаммах Pseudomonas.

3.4.4 Супрессия фитопатогенов устойчивыми штаммами PGPR Pseudomonas в присутствии кобальта и никеля.

3.4.5 Влияние тяжелых.металлов на продукцию индольных соединений.

3.5 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами.

3.6 Устойчивый ризосферный штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.

3.6.1 Влияние устойчивого штамма Р. aureofaciens BS1393(pBS501) на растения-при загрязнении никелем 2.5 ПДК.

3.6.2 Влияние устойчивого штамма Р. aureofaciens BS1393(pBS501) на растения при загрязнении никелем 5 и 10 ПДК.

3.7 Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Pseudomonas-деструкторы нафталина/фенантрена.

3.7.1 Создание устойчивых штаммов-деструкторов.

3.7.2 Влияние плазмидных систем устойчивости и биодеградации на рост рекомбинантных штаммов при двойном селективном давлении.

3.7.3 Стабильность поддержания плазмид в рекомбинантных штаммах.

3.7.4 Биодеградация нафталина устойчивыми штаммами-деструкторами в присутствии никеля.

3.7.5 Штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений"

Актуальность работы

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами является одной из наиболее актуальных экологических проблем, поскольку затрагивает не только техногенные, но и природные ландшафты. По данным ВОЗ, никель и близкий по свойствам кобальт признаны веществами 2 класса опасности и канцерогенами. Территории, где осуществляется- добыча или обработка металлов- являются зонами чрезвычайной экологической ситуации, для которых характерно образование «биогеохимических провинций» с высоким», содержанием никеля в воздухе, воде, почве и местных продуктах питания. По- данным агрохимической службы Российской Федерации .уровень загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является умеренным, однако почвы, загрязненные никелем, по занимаемой площади превосходят почвы,, загрязненные свинцом; кадмием, цинком, и другими высокотоксичными- металлами (Аристархов, Харитонова; 2002). Основными источниками загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является неконтролируемое применение минеральных удобрений; а также1 осадков промышленных сточных вод, используемых в качестве мелиорантов (Аристархов, Харитонова, 2002).

В последнее десятилетие у производителей сельскохозяйственной продукции возрос-интерес к применению биопрепаратов, разрабатываемых на основе ризосферных бактерий группы, PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенов. Имеющиеся- экспериментальные данные свидетельствуют о том, что инокуляция растений ризосферными бактериями увеличивает риск аккумуляции металлов в растениях, выращиваемых на загрязненных почвах (Kamnev and van der Lelie, 2000; Zaidi et al., 2006; Белимов, 2008; Khan et al., 2009; Белимов, Тихонович, 2011). Устойчивые к тяжелым металлам ризосферные бактерии являются основой для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации загрязненных почв. В связи с этим представляется целесообразным исследовать ризосферные бактерии, обладающие разнообразными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, поскольку бактерии способны оказывать различное влияние на аккумуляцию металлов в растениях. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости к никелю/кобальту у бактерий, является активный экспорт токсичных катионов из клетки в окружающую среду. Роль данного механизма устойчивости исследовалась только в штаммах эндофитных бактерий в фиторемедиационных экспериментах с субстратами, загрязненными никелем (Lodewyckx et al., 2001) или в комплексе с хлорированными ксенобиотиками (Weyens et al., 2010; 2011). Однако исследованные эндофитные штаммы не обладали свойствами, характерными для бактерий^ группы PGPR. К настоящему времени ремедиационный потенциал аналогичных генетических систем устойчивости в ризосферных бактериях не изучен. В связи с этим актуальным является поиск природных или создание рекомбинантных штаммов ризосферных бактерий, обладающих системами экспорта никеля и других металлов. При этом следует учитывать способность бактерий к биосорбции и иммобилизации металлов, что является важным фактором, регулирующим поступление тяжелых металлов в растения. Исследование ризосферных бактерий, обладающих, различными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, позволит понять принципы их взаимодействия с растениями и более эффективно реализовать генетический потенциал бактерий при разработке новых биотехнологий защиты растений и фиторемедиации почв, загрязненных как тяжелыми металлами, так и в комплексе с органическими токсикантами.

Цель и задачи исследования

В соответствии с данной целью решались следующие задачи:

1. Из различных экологических ниш выделить и идентифицировать бактерии, содержащие плазмиды устойчивости- к никелю (кобальту, цинку, кадмию), и определить соответствующие детерминанты устойчивости.

3. Исследовать у полученных ризосферных штаммов; особенности аккумуляции металлов из среды культивирования.

4. Исследовать влияние устойчивых к кобальту/никелю • ризосферных штаммов на аккумуляцию никеля в растениях и на параметры роста растений в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.

Научная новизна

Впервые у бактерий рода Comamonas обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Установлено, что плазмида pBS501 содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную спг оперону плазмиды pMOL28 из Cupriavidus metallidurans GH34 . Впервые показано, что экспрессия системы устойчивости сиг-типа из Comamonas testosteroni в штаммах PGPR Pseudomonas обеспечивает их выживаемость при высоких концентрациях никеля при сохранении комплекса свойств, обеспечивающих стимуляцию роста растений. Сконструированы штаммы PGPR Pseudomonas, содержащие природные- плазмиды биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) и устойчивости к кобальту/никелю. Показана способность г штаммов к полной утилизации модельного ПАУ в> присутствии 100 мкМ- никеля» при периодическом культивировании.

Научно-практическая значимость работы

Получен устойчивый к кобальту/никелю штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), аккумулирующий из. среды до 17%: кобальта при периодическом- культивировании. Полученный штамм может быть использован в биотехнологиях очистки сточных вод от загрязнений« солями кобальта (никеля). Штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), стимулирующий рост ячменя и препятствующий аккумуляции металла в растительной биомассе при 2-5 ПДК никеля, можно использовать в качестве биопрепарата для защиты растений, выращиваемых на умеренно загрязненных почвах. Полученные в работе устойчивые ризосферные штаммы-деструкторы нафталина можно рекомендовать для очистки сточных вод, а также фиторемедиации почв со смешанными загрязнениями полиароматическими углеводородами и солями никеля/кобальта.

Апробация материалов работы

Основные результаты диссертации были представлены на 11 конференциях: Международная научно-практическая конференция «Биологизация зашиты растений: состояние и перспективы», 18—22 сентября1 2000 г., Краснодар; «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды»,

2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в XIX—XXI веках», »

Всероссийская конференция, 14—19 июня 2001, Санкт-Петербург; Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология 2003», 22-26 сентября , 2003 г., Сочи; 1-я Международная геоэкологическая конференция. Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, 30-31 октября 2003 г., Тула; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, научно-практическая конференция, 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 25-31, 2007, Montpellier, France;, 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007, Colchester, England.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Сиунова, Татьяна Вячеславовна

выводы

1. Из. различных загрязненных источников выделены и охарактеризованы штаммы бактерий, устойчивые к кобальту, никелю, цинку и кадмию. У бактерий рода Comamonas впервые обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Показано, что конъюгативная плазмида pBS501 в штамме, идентифицированном как Comamonas testosteroni, содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную оперону спг■ из Cupriavidus metallidurans СН34.

2. Получены трансконъюгантные штаммы ризосферных бактерий Р. aureofaciens, Р. fluorescens, Р. chlororaphis, содержащие плазмиду pBS501, способные к колонизации ризосферы, синтезу индольных соединений и супрессии фитопатогенов в присутствии высоких концентраций никеля/кобальта.

3. Трансконъюгантный штамм Р. aureofaciens BS 1393(pBS501), растущий в присутствии 0.5 мМ хлорида кобальта, способен* аккумулировать, из среды до 17% кобальта, который локализуется на поверхности клеток в виде гранул.

4. В»вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем (235 мг/кг субстрата), устойчивый к кобальту/никелю ризосферный штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивает значительный прирост биомассы ячменя (до 40%) и двукратное.снижение аккумуляции никеля в растениях, по сравнению с- исходным чувствительным штаммом Р. aureofaciens BS1393.

5. Сконструированы ризосферные штаммы Р. aureofaciens, Р. fluorescens, Р. chlororaphis, содержащие две плазмиды — устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации ПАУ, способные полностью окислять нафталин в присутствии 100 мкМ никеля. Инокуляция семян ячменя и сорго штаммом Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает увеличение биомассы растений на 50-70% в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время применение биопрепаратов на основе ризосферных бактерий приобретает все большую актуальность и, являясь одним из основных звеньев экологизации сельского хозяйства, позволяет получать высокие урожаи, обеспечивая при этом восстановление плодородия почвы. В условиях загрязнения почв тяжелыми металлами и органическими токсикантами, одним из перспективных решений этих проблем является внедрение экологически безопасных систем земледелия, основанных на применении микробиологических препаратов комплексного действия.

Среди бактерий группы PGPR привлекательным объектом для создания биопрепаратов являются представители рода Pseudomonas, обладающие широким спектром используемых субстратов, высокой скоростью роста и способностью к колонизации ризосферы растений. Однако ризосферные псевдомонады, выделенные нами из антропогенно-загрязненных источников, не обладали высоким уровнем устойчивости к тяжелым металлам, таким как никель, кобальт, цинк и кадмий. В неризосферном штамме Comamonas testosteroni обнаружена конъюгативная плазмида pBS501, несущая детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную, но не идентичную слг-оперону плазмиды pMOL28 из Cupriavidus metallidurans. До настоящего времени известна только одна плазмида pMOL28, содержащая оперон устойчивости к кобальту/никелю. Обнаруженная нами плазмида pBS501, экспрессируется в различных видах PGPR Pseudomonas: Р. aureofaciens, P.fluorescens и P. chlororaphis. На основе известных ризосферных штаммов Р. aureofaciens BS 1393, P.fluorescens 38а и Р. chlororaphis PCL1391 получены устойчивые к кобальту/никелю трансконъюганты и их двухплазмидные варианты, несущие природную плазмиду биодеградацию ПАУ. В естественных условиях бактерии, содержащие подобные функционально-различные плазмидные системы к настоящему времени не обнаружены. Конструирование таких рекомбинантных штаммов проводилось только на основе не ризосферного штамма Alcaligenes eutrophus и эндофитного штамма Burkholderia cepacia, колонизирующего ткани корней растений: Однако эти рекомбинантные штаммы не обладали способностью к стимуляции роста растений.

Полученные нами устойчивые к кобальту/никелю варианты PGPR Pseudomonas способны супрессировать широкий круг фитопатогенов и значительно увеличивать урожайность растений в условиях загрязнения не только тяжелыми металлами, но и в комплексе с органическими токсикантами (ПАУ). В условиях, моделирующих смешанное загрязнение ПАУ и никелем, двухплазмидные штаммы, эффективно деградируют нафталин в процессе роста: Способность устойчивого к кобальту/никелю штамма- Р: aureofaciens BS1393(pBS501) аккумулировать кобальт из среды культивирования- может быть использована в биотехнологиях очистки промышленных сточных вод. В вегетационных экспериментах получены результаты; показывающие, что* инокуляция; семян-. ячменя этим штаммом препятствует накоплению никеля^ в растительной биомассе при загрязнении, почвы никелем до 5 ПДК. Поэтому штамм Р. aureofaciens BS1393(pBS50l) может быть использован также в качестве биопрепарата; для защиты, растений? от тяжелых металлов и для; увеличения урожайности растений; выращиваемых на загрязненных почвах. Полученные в работе устойчивые ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут быть рекомендованы для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений; а также для биоремедиации. почв при смешанных загрязнениях ПАУ и тяжелыми металлами.

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. A.B. Сиунову, к.х.н. М.Г. Шляпникову, к.б.н. Н.Е. Сузиной, к.б:н. A.B. Лисову, вед. инж. ИБК А.Ю. Иванову, м.н.с. Т.О. Анохиной. Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. В.В. Кочеткову и заведующему лаборатории биологии плазмид чл.-корр. РАН проф. А.М. Воронину.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сиунова, Татьяна Вячеславовна, Пущино

1. Алексеев Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях. Л.: Агропромиздат, 1987. 142 с.

2. Алимарин И.П., Иванов В.М. Практическое руководство по физико-химическим методам анализа. М.: Изд-во МГУ, 1987. 156 с.

3. Андреева И.В., Говорила В.В., Ягодин Б.А., Досимова О.Т. Динамика накопления'и распределения никеля в*растениях овса // Агрохимия. 2000. №4. С. 68-71.

4. Аристархов, А.Н., Харитонова' А.Ф. Состояние: и методология прогнозирования загрязнения' почв1 тяжелыми металлами // А.Н. Аристархов, А.Ф. Харитонова//Плодородие. 2002. №3. Вып. 6. С. 22-24.

5. Балашов C.B. Деструкция сульфоароматических соединений- бактериями родов Pseudomonas и Comamonas. Дисс. . канд. биол. наук. Пущино,• 2007. 168 с.

6. Белимов A.A. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов. Дисс. . докт. биол. наук. С.-Петербург, 2008. 320 с.

7. Белимов A.A., Кулакова A.M., Сафронова В.И., Степанок В.В., Юдкин Л.Ю., Алексеев Ю.В., Кожемяков А.П. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием//Микробиология. 2004. Т. 73. С. 118-125.

8. Белимов A.A., Тихонович И.А. Микробиологические аспекты устойчивости и аккумуляции тяжелых металлов у растений (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2011. №3. С. 10-15.

9. Ю.Бергквист П., Харди К., Оудега Б., Панайотатос Н., Пагсли Э:, Томас К., Янгмен Ф. Плазмиды / под ред. К. Харди. М.: Мир, 1989. 267 с.

10. Беспамятное Т.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде, Справочник. JI.: Химия, 1985. 528 с.

11. Бинтам Ф.Т. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов: Пер. с англ. / под ред. Ф.Т. Бинтам, М. Коста, Э. Эйхенбергер и др. М.: Мир, 1993. 368 с.

12. Благодатская Е.В., Пампура Т.В., Богомолова И.Н. Влияние загрязнения соединениями свинца на микробиологическую активность серой лесной, почвы под сеяным лугом // Агрохимия. 2003. №4. С. 74-78.

13. Вронский В.А. Прикладная экология. Ростов-на-Дону, 1996. 512 с.

14. Гигиенические нормативы ГН 2.1.7.2041-06. Почва, очистка населенных мест, отходы производства и потребления, санитарная охрана почвы. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве (2006 г).

15. Госкомприрода СССР, №02-2333 от 10.12.90. Дополнение №1 к перечню ОДК и ПДК №6229-91 (1991).

16. Григорян К.В. Влияние загрязненных промышленными отходами -оросительных вод на физические, физико-химические свойства и биологическую активность почв. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М., 1980. 25 с.

17. Гузев B.C., Левин C.B. Перспективы эколого-микробиологической экспертизы состояния, почв при антропогенных воздействиях // Почвоведение. 1991. № 9. С. 50-62.

18. Дополнение №1 к перечню ОДК и ПДК №6229-91.

19. Иванов A.JI. Проблемы техногенеза в земледелии.Российской Федерации и системы мероприятий по реабилитации техногенно-нарушенных территорий // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2003. №1. С. 8-11.

20. Иванов А. Ю., Фомченков В. М. Электрофизический анализ повреждения бактериальных клеток Escherichia coli ионами-серебра // Микробиология. 1991. Т. 61. Вып. 3. С. 464-471.

21. Ильин В.Б., Сысо А.И. Микроэлементы и тяжелые металлы в почвах и растениях Новосибирской области. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2001. 229 с.

22. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. Микроэлементы в почвах и растениях. М.: Мир, 1989. 439 с.

23. Колесников С.И. Изменение микробиологической активности чернозема обыкновенного под влиянием загрязнения тяжелыми металлами // Мат. междунар. науч.-практ. конф. «Экология и современность». Ростов-на-Дону, 1995. С. 145.

24. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas // Микробиология. 1997. Т. 66. №2. С. 211-216.

25. Кулакова А.Н., Воронин A.M., Мутанты плазмид биодеградации нафталина, детерминирующие окисление катехола по метапути // Микробиология. 1989. Т. 58. №2. С. 298-304.

26. Макарова В.Г. Экологические и медико-социальные аспекты охраны природной среды и здоровья населения / В.Г. Макарова, А.Р. Цыганов,

27. B.А. Кирюшин. Минск: Хата, 2002. 284 с.

28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 479 с.

29. Методические указания по проведению комплексного мониторинга плодородия почв земель сельскохозяйственного назначения / Под ред. JIM. Державина, Д.С. Булгакова. Mi: ФГНУ «Росинформагротех», 2003. 240 с.

30. Мирошников А.И., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ ^разделение клеток. М.: Наука, 1986. 184, с.

31. Назаров A.B., Иларионов С.А. 2005. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации // Биотехнология. Т. 5.1. C. 54-62.

32. Национальный перечень канцерогенов (перечень» веществ, продуктов, производственных и бытовых факторов, канцерогенных для человека. Москва СССР. №6054-91 от 19:11.1991.

33. Никольский H.H. / Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия. Вып. 17. JI. 1977, С. 23.

34. Оценка степени загрязнения почв химическими веществами. 4.1. Тяжелые металлы и пестициды. М.: Минприроды РФ, 1982.

35. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. 1978. М.: Мир, С. 14-33.

36. Псевдобактерин-2 5 лет на рынке. Пущино: ООО Изд-во «Агрорус», 2003.44:СанПиН 42-128-4433-87.

37. Смирнов В.В. Киприанова Е.А. Бактерии,рода Pseudomonas. Киев: Наук. Думка, 1990. 264 с.

38. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. С.-Петербург, 2009.

39. Черников В.А., Милащенко Н.З., Соколов О.А., Экологическая безопасность и устойчивое развитие // Книга 3. Устойчивость почв к антропогенному воздействию. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2001, 203 с.

40. Alam M.Z., Ahmad S., Malik A. Prevalence of heavy metal resistance in bacteria isolated from tannery effluents and affected soil / Environ. Monit. Assess. 2010. Sep 8. Epub ahead of print.

41. Andersen C. Channel-tunnels: outer membrane components of type I secretion systems and multidrug efflux pumps of Gram-negative bacteria // Rev. Physiol. Biochem. Pharm. 2003. Vol. 147. P. 122-165.

42. Anokhina T.O., Volkova O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., Kochetkov V.V., ,Boronin A.M. Plant growth-promoting Pseudomonas bearing catabolic plasmids: naphthalene degradation and effect on plants // Process Biochemistry. 2006. Vol. 41. P. 2417-2423.

43. Anton A., Grobe C., Reibman J., Pribyl T., Nies D.H. CzcD is a heavy metal ion transporter involved in regulation of heavy metal resistance in Ralstonia sp. strain CH34//J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P: 6876-6881.

44. Azcón R., Perálvarez Mdel C., Roldán A., Barea J.M. Arbuscular mycorrhizal fungi, Bacillus cereus, and Candida parapsilosis from, a multicontaminated soil alleviate metal'toxicity inplants I I Microb. Ecol. 2010. Vol. 59. №4. P. 68-77.

45. Belimov A.A., Dietz K.-J. Effect of associative bacteria on element composition of barley seedlings grown in solution culture at toxic cadmium concentration//Microbiol. Res. 2000. Vol. 155. P. 113-121.

46. Birnboim H.C. and Doly J.A rapid alkaline extraction procedure of screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. Vol. 7. P. 1513.

47. Bose S. and Bhattacharyya'A.K. Heavy metal accumulation in wheat plant grown in soil amended with industrial sludge // Chemosphere. 2008. Vol. 70. №7. P. 1264-1272.

48. Bowen H.J. M. Environmental chemistry of the elements. London: Acad. Press, 1979, 333 p.

49. Bozhkov A., Padalko V., Dlubovskaya V., Menzianova N. Resistance to heavy metal toxicity in organisms under chronic exposure // Indian J. Exp. Biol. 2010. Vol. 48. №7. P. 679-696.

50. Bradley M.J., Chivers P.T., Baker N.A. Molecular dynamics simulation of the Escherichia coli NikR protein: equilibrium conformational fluctuations reveal interdomain allosteric communication pathways // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 378. №5. P. 1155-1173.

51. Bruick R.K. Oxygen sensing in the hypoxic response pathway: regulation of the hypoxia-inducible transcription factor // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 26142623.

52. Bruins M.R., Kapil S., Oehme F.W. Microbial resistance to metals in invironment //Ecotoxicology and Environmental Safety. 2000. Vol. 45. P. 198— 207.

53. Burdon K. Fatty material in bacteria and fungi revealed by staining dried, fixed slide preparations //J. Bacteriology. 1946. Vol. 52. P. 665-668.

54. Cánovas D., Cases I., de Lorenzo V. Heavy metal tolerance and metal homeostasis in Pseudomonas putida as revealed by complete genome analysis I I Environ. Microbiol. 2003, Vol. 5. №12. P. 1242-1256.

55. Cavallo J. D., Plesiat P., Couetdic G., Leblanc F., Fabre R. Mechanisms of b-lactam resistance in Pseudomonas aeruginosa: prevalence of OprM-overproducing strains in- a? French multicentre study // J. Antimicrob. Chemother. 1997. Vol. 50. P. 1039-1043.

56. Chen X.C., Wang Y.P., Lin Q>, Shi J.Y., Wu< W.X., Chen Y.X. Biosorption of copper(II) and.zinc(II) from aqueous solution» by Pseudomonas putida CZ1 // Colloids Surf. Biointerfaces. 2005. Vol. 46. №2 P. 101-107.

57. Chin-A-Woeng T.F., Bloemberg G.V., Mulders I.H., Dekkers L.C., Lugtenberg B.J. //Mol. Plant Microbe Interact. 2000. Vol. 13. №12. P. 1340-1345.

58. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., van der Bij A.J., van der Drift K.M.G.M., Scheffer J., Keel Ch., Bakker P.A.H.M., Tichy H.-V., de Bruijn

59. Davis R.D., Beckett P.H.T., Wollan E. Critical levels of twenty potentially toxic elements injoung spring barley //Plant Soil. 1978. Vol: 49. P. 395.

60. De Boeck M., Kirsch-Volders M., Lison D. Cobalt and antimony: genotoxicity and carcinogenicity//Mutat. Res. 2003. Vol. 533. P. 135-152.73:de Souza M.P., Huang C.P., Chee N., Terry N. // Planta. 1999. Vol. 209. №2. P. 259-263.

61. Diels L., Dong Q., van der Lelie D., Baeyens W., Mergeay M: The czc operon of Alcaligenes eutrophus* CH34: from resistance mechanism to the removal of heavy metals // J. Ind. Microbiol. 1995. Vol! 14. №2. P. 142-153.

62. Dressier C., Kues U., Nies D.H., and Friedrich B. Determinants encoding resistance to several heavy metals in newly isolated copper-resistant bacteria // Appl. Environ. Microbiol: 1991. Vol: 57, №11. P. 3079-3085.

63. Dua D. and Meera S. Purification and characterization' of naphthalene oxygenase from Corynebacterium^ renale II Eur. J. Biochem. 1981. Vol. 120. №3. P." 461-465:

64. Duffus J.Hi "Heavy metals" ^meaningless term? // (IUPAC Technical Report), Pure and Applied Chemistry. 2002. Vol. 74. P. 793-807.

65. Duffy BK, DefagO' G. Environmental- factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas jluorescens biocontrol strains // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. №6. P. 2429-2438.

66. Dunn< N.W., Gunsalus I.C. Trasmissible plasmids coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida I I J. Bacteriol. 1973. Vol. 114. P. 974-979.

67. Edel J., Pozzi G., Sabbioni E. et al. Metabolic and toxicological studies on cobalt // Sci. Total Environ. 1994. - Vol. 150: - P. 233 - 244.

68. Everhart J.L., McNear D.Jr., Peltier E., van der Lelie D., Chaney R. L., Sparks D.L. Assessing nickel bioavailability in smelter-contaminated soils // Science of the Total Environment. 2006. Vol. 367. P. 732-744.

69. Fagan M.J., Saier M.HJr. P-type ATPases of eukaryotes and bacteria: sequence comparisons and construction of phylogenetic trees // J. Mol. Evol. 1994. Vol. 38. P. 57-99.

70. Fan B. and Rosen B.P. Biochemical characterization of CopA, the Escherichia coli Cu(I)-translocating P-type ATPase // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 46987-46992.

71. Feist C.F., Hegeman G.D. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways // J. Bacterid. 1969. Vol. 100. №2. P. 869-877.

72. Gilis A., Corbisier P., Baeyens W., Taghavi S., Mergeay M., van der Eelie D.J. Effect of the siderophore alcaligin E on the bioavailability of Cd to Alcaligenes eutrophus CH34 // Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998. Vol: 20. №1. P. 61-68.

73. Glick B.R., Todorovic B.3 Crazny J., et al., Promotion of plant growth by bacterial4ACC deaminase // Crit. Rev. Plant Sci. 2007. Vol. 27. P. 227-242.

74. Goldberg* M.', Pribyl T., Juhnke S. and Nies D.H. Energetics and1 topology of CzcA, a cation/proton antiporter of the KND protein family // J. Biol. Chem. 1999:Vol. 274. P. 26065-26070.

75. Goldoni M., Catalani S., De Palma G. et al. Exhaled breath condensate as a suitable matrix to assess lung dose and* effects in-workers exposed to cobalt and tungsten//Environ. HealthPerspect. 2004. Vol. 112. P. 1293-1298.

76. Gorbisier P. Bacterial metal-lux biosensors for a rapid determination of the heavy metal bioavailability and toxicity in soil samples //Res. Microbiol. 1997. Vol. 148. P. 534-536.

77. Grass G., Große C., and Nies D.l-I. Regulation of the cnr cobalt and nickel resistancedeteirninantfrom strainîÇH34fi// J. Bàcterioli 2000: Vol: 182. P. 1390-1398.

78. Grass G., Fan Bl, RosenBl P., Lemke K.,.SchlegelH.-G., and Rensing;C. NreB from« Achromobacter xylosoxidans• 31A is a nickel-induced transporter conferring nickel resistance // J. BacterioL 2001. V. 183. №9: P. 2803-2807.

79. Grass G., Fricke B:, Nies D.H. Control of expression of a periplasmic nickel efflux pump by pcriplasmic nickel concentrations // Biometals. 2005. Vol. 18.p. 437-448. ■■. . ■ .'■.■',■•.:.

80. Gupta A., Kumar M., Goel R. Bioaccumulation properties of nickel-, cadmium-, and chromium-resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa NBRI 4014 at alkaline pH //Biol. Trace Elem. Res. 2004. Vol: 99. №1-3. P. 269-77.

81. Gustin J.L., Zanis M.J., Salt D.E. Structure and evolution of the plant cation diffusion facilitator family of ion transporters // BMC Evol. Biol. 2011. Vol. 11. P. 76.

82. Hambuckers-Berhin F., Remacle J. Cadmium sequestration in cells of two strains of Alcaligenes eutrophus II FEMS Microbiol. Ecol. 1990. Vol. 73. P. 309-316.

83. Hassan M.T., van der Lelie D., Springael D., Romling U., Ahmed N. and Mergeay M. Identification-of a gene cluster, czr, involved in cadmium and zinc resistance in Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1999. Vol. 238.' №2. P. 417-425.

84. Hegeman G.D. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by Pseudomonas putida. Synthesis of enzymes by the wild type // J. Bacteriol. 1966. Vol. 91. P. 1140-1154.

85. Herrmann L., Schwan D., Garner R., Mobley H.L.T., Haas R., Schäfer K.P. and Melchers K. Helicobacter pylori cadA encodes an essential Cd(II)/Zn(H)/Go(II) resistance factor influencing urease activity // Mol. Microbiol. 1999. Vol: 33. P. 524-536.

86. Hong J.W., Fomina M., Gadd G:M. F-RISA fungal clones as potential bioindicators of organic and metal contamination in« soil // J. Appl". Microbiol: 2010. Vol. 109. №2. P. 415-430.

87. Ivanov A., Khassanova L., Collery P., Khassanova Z., Choisy C., Etienne J.C. Microorganisms as a tooB of studying copper metal ions-induced changes in electrophysical cell properties // Gcll Mol. Biol. 1996. Vol. 42; №6. P. 825-831.

88. Johnson J.M; and Church G.M: Alignment and structure predictions of divergent protein families' periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps //J. Mol. Biol. 1999: Vol. 287. P: 695-715.

89. Junker F., Cook A.M. Conjugative plasmids and the degradation of arylsulfonates in Gomamonas testosterone II Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. №6. P. 2403-2410. '

90. Kachur. A.V., Koch C!J., Biaglow J.E. Mechanism of copper-catalyzed oxidation of glutathione // Free Radic. Res. 1998. Vol. 28: №3: P. 259-269:

91. KalbfV.F., Bernlohr R.W. Anew spectrophotometric assay for proteinein;cell; extract^/ Anal; Biochem: 1977: Vol? 821 P! 362-367. ;

92. Kaluarachchi H:, Chan Chung K.C., Zamble D.B. Microbial: nickel proteins // Nat. Prod. Rep. 2010. Vol. 27. №5. P: 681-694.

93. Kamashwaran S R. and Crawfbrdi DiE. Mechanisms of cadmium resistance in anaerobic bacterial enrichments degrading pentachlorophenol // Can. J. Microbiol. 2003. Vol. 49. №7. P. 418-424).

94. Kamnev A. A.,.van der Lelie D. Chemical and biological parameters as tools to evaluate and1 improve heavy metal phytoremediation // Biosci. Reports. 2000: Vol: 20. P. 239-258. •

95. Karak T., Bhattacharyya P. Heavy metal accumulation in soil amended with roadside pond sediment and uptake by winter wheat (Triticum aestivum L. cv. PBW 343) I I Scientific WorldJournal. 2010. Vol. 14. №10. P. 2314-2329.

96. Khan M.S., Zaidi A., Wani P.A., et al., Role of plant growth promoting rhizobacteria in the remediation of metal contaminated soils // Environ. Chem. Lett. 2009. Vol. 7. P. 1-19.

97. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. 1954. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // Ji Lab. Clin. Med. Vol. 44. P. 301-307.

98. Kloke A. Content of arsenic, cadmium chromium, fluorine, lead; mercury and nickel in plants grown on contaminated soil / United Nations-EGE Symp. on-Effects of Air-borne Pollution on Vegetation Warsaw, August 20, 1979, P. 192.

99. Koch Di, NieSi D.H. and' Grass G. The RcnRA (YohLM) system of Escherichia colt A connection between nickel, cobalt and iron homeostasis // Biometals. 2007. Vol'. 20. №5. P. 759-771.

100. Koronakis V., Sharff A., Koronakis E., Luisi B. and Hughes C. Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to. multidrug efflux and protein efflux // Nature. 2000. Vol. 405. P: 914-915:

101. Koronakis V., Sharff A., Koronakis E., Luisi B., Hughes C. Crystal structure of the bacterial membrane proteiniTolC central to multidrug efflux and protein export //Nature. 2000. Vol: 405. Pi 914-919.

102. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 227. P. 680.

103. Lai H.Y., Juang K.W., Chen Z.S. Large-area experiment on uptake of metals by twelve plants growing in soils contaminated with multiple metals // Int. J. Phytoremediation. 2010. Vol. 12. №8. P.1 785-797.

104. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing / Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Stackebrandt E., and Goodfellow M. (eds.). Chichester: Wiley Press, 1991. P. 130-141.

105. Lee* S.W., Glickmann E. and Cooksey D.A. Chromosomal locus for cadmium resistance in Pseudomonas putida consisting of a cadmiumtransporting ATPase and a MerR family response regulator // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 1437-1444.

106. Lee Y-K., Chang H-H., Lee H-J., Park H., Lee K. H. and Joe M-H. Isolation,of a-novel plasmid, p№15, from Enterobacter sp. Nil5 containing a nickel resistance gene // FEMS Microbiol. Lett. 2006. Vol. 257. №2: P. 177.

107. Legatzki A., Grass G., Anton A., Rensing C., Nies G.H. Interplay of the Czc system and two P-type ATPases in conferring metal resistance to Ralstonia metallidurans //Biodégradation. 2003. Vole 14. P. 153-168:

108. Liesegang H.K. Lemke R.A. Siddiqui, Schlegel H.-G. Characterization of the inducible nickel and cobalt resistance, determinant- cnr from pMOL28 of Alcaligenes eutrophus CH34 // J. Bacteriol; 1993: Voh 175. P. 767-778

109. Lison D., De Boeck M., Verougstraete V., Kirsch-Volders M. Update on the genotoxicity and carcinogenicity of cobalt compounds // Occup. Environ. Med. 200lr. Vol. 58. P. 619-625.

110. Lortal S., van Heijenoort J., Grubek K., Sleytr B. S-layer of Lactobacillus helveticus ATCC12046: isolation, chemical characterization and reformation after extraction with lithium chloride. J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. №3. P. 611-618.

111. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein-measurement with Folin phenol reagent // J. Biol.- Chem: 1957. Vol. 193. P. 265-275.

112. Ma Y., Rajkumar M., Freitas H. Improvement of plant growth and nickel uptake by nickel resistant-plant-growth promoting bacteria' // J. Hazard Mater. 2009. Vol. 166. №2-3. P. 1154-1161.

113. Malik A. Metal bioremediation through growing cells // Environ. Int. 2004. Vol. 30. №2. P. 261-278.

114. Marrero J., Auling G., Coto O. and Nies D. H. High-level resistance to cobalt and nickel but probably no transenvelope efflux: metal resistance in the Cuban Serratia marcescens strain C-l // Microb. Ecol. 2007. Vol! 53. №1. P. 123-133.

115. McEldowney S. The impact of surface attachment on* cadmium accumulation by Pseudomonas fluorescens H2 // FEMS Microbiol, Ecol. 2000. Vol. 33. №2. p'. 121-128.

116. McGrath S.P., Chaudri A.M., Giller K.E. Long-term effects of metals in sewage sludge on soils, microorganisms and plants // J. Ind. Microbiol. 1995. Vol. 14. №2. P. 94-104.

117. Mengoni A., Barzanti R., Gonnelli: C., Gabbrielli R. and Bazzicalupo M. Characterization of nickel-resistant bacteria isolated from serpentine soil // Environ. Microb. 2001. Vol. 3. №11. P. 69L

118. Mergeay M., Houba C., and Gerits J. Extrachromosomal inheritance controlling resistance to cadmium, cobalt, and zinc ions: evidence from curing in a Pseudomonas II Arch. Int. Physiol.' Biochim. 1978. Vol. 86. №2. P. 440-441.

119. Mergeay M., Nies D:, Schlegel H.G., Gerits J., Charles P. and Van Gijsegem F. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals //J. Bacteriol: 1985. Vol. 162'. P. 328-334.

120. Mikolay A., Nies D.FI. The ABC-transporter AtmA is involved in nickel and cobalt resistance of Cupriavidus metallidurans strain CH34 // Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. Vol. 96. №2. P. 183-191.

121. Mitra B. and Sharma R. The cysteine-rich amino-terminal domain of ZntA, a Pb(II)/Zn(II)/Cd(II)-translocating ATPase from Escherichia coli, is not essential for its function // Biochemisrty. Vol. 40. P. 7694-7699.

122. Moller V. Simplified tests for some amino acid decarboxylases and for arginine dihydrolase system // Acta Pathologica et Microbiological Scandinavica. 1955. Vol. 36. P. 158-172.

123. Nies D.ll. Bacterial transition metal homeostasis / Nies D.H., Silver S. (eds) Molecular microbiology of heavy metals / Springer, Berlin, 2007. P. 118-142.

124. Nies D.H. Biochemistry. How cells control zinc homeostasis // Science. 2007. Vol. 317. P. 1695-1696.

125. Nies D.H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2003. Vol. 27. P. 313-339.

126. Nies D:H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. Vol: 51. №6. P. 730-750.

127. Nies D.H., Nies A., Chu L., Silver S. Expression and nucleotide sequence of a plasmid-determined divalent cation efflux system from Alcaligenes eutrophus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989a. Vol. 86. №19. P. 7351-7355.

128. Nies DH. Heavy metal-resistant bacteria as extremophiles: molecular physiology and biotechnological use of Ralstonia sp. CH34 // Extremophiles. 2000. Vol. 4. №2. P. 77-82.

129. Nwachukwu O.I., Pulford I.D. Microbial respiration as an indication of metal toxicity in contaminated organic materials and soil // J. Hazard Mater. 2011. Vol. 185. №2-3. P. 1140-1147.

130. Ownley B.H., Weller D.M., Tomashow L.S. Influence of in situ and in vitro pH on suppression of Gaeumannomyces graminis var. tritci by Pseudomonasfluorescens 2-79 //Phytopathology. 1992. Vol: 82. P: 178-184.

131. Pastor N., Carlier, E., Andrés J., Rosas S.B., Rovera M. Characterization of rhizosphere bacterial for control of phytopathogenic fungi of tomato // J. Environ. Manage. 2011. Apr 19. Epub ahead of print.

132. Patel J.S., Patel P.C., Kalia K. Isolation and characterization of nickel uptake by nickel resistant bacterial isolate (NiRBI) // Biomed. Environ. Sci. 2006. Vol: \9l №4. P. 297-301.

133. Paulseni I.T., Saier M.H.Jr. A novel family of ubiquitous heavy metal ion transport proteins //J. Membr. Biol: 1997. Vol. 156: P. 99-103.

134. Pereira S.I., Lima A.I., Figueira E.M. Screening possible mechanisms mediating cadmium resistance in Rhizobium leguminosarum bv. viciae isolated from contaminated Portuguese soils // Microb. Ecol. 2006. Vol. 52. №2. P. 176-186.

135. Pulido M.D., Parrish A.R. Metal-induced apoptosis: mechanisms // Mutat. Res. 2003. Vol. 533. №1-2. P. 227-241.

136. Rajkumar M., Vara- Prasad M.N., Freitas H.5 Ae N. Biotechnological applications of serpentine soil bacteria for phytoremediation of trace metals // Crit. Rev. Biotechnol. 2009. Vol. 29. №2. P. 120-130.

137. Rensing C., Pribyl T., Nies D.H. New functions for the three subunits of the CzcCBA cation-proton antiporter // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179. P. 6871-6879.

138. Roane T.M., Josephson K.L., Pepper I.L. Dual-bioaugmentation strategy to enhance remediation of cocontaminated soil // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. №7. P. 3208-3215.

139. Rosen B.P. Transport and detoxification systems for transition metals, heavy metals ands metalloids in eukaryotic and* prokaryotic microbes // Comp. Biochem. Physiol. A Molt Integr. Physiol. 2002: Vol. 133. №3. P. 689-693.

140. Rossbach S., Kukuk M.L., Wilson T.L., Feng S.F., Pearson M:M. and Fisher M.A. Cadmium-regulated gene fusions in Pseudomonas fluorescens II Environ. Microbiol: 2000: Vol; 2. P. 373-382.

141. Rubikas J., Matulis D., Leipus A., Urbaitiene D. Nickel* resistance in Escherichia coli V38 is dependent on the concentration used for induction // FEMS Microbiol. Lett. 1997. Vol. 155. P: 193-198.

142. Rutherford J.C., Cavet J.S., Robinson N.J. Cobalt-dependent transcriptional switching by a dual-effector MerR-like protein regulates a cobalt-exporting variant CPx-type ATPase // J. Biol. Chem: 1999. Vol. 274. №6. P. 25827-25832.

143. Saeki K., Kunito T., Oyaizu H., Matsumoto S. Relationships between bacterial1 tolerance levels and forms of copper and zinc in soils // J. Environ. Qua!. 2002. Vol. 31. №5. P. 1570-1575.

144. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning. New York: Cold: Spring Harbor Lab. Press, 2001. Vol, 1-3.

145. Sandrin T.R., Maier KM! Impact of metalsionithe biodegradation of organic pollutants//Environ. HealthPerspect. 2003 Vol. 111. №8; P. 1093-1101.

146. Schlegel H.G., Cosson J.-P., Baker A.J.M. Nickel-hyperaccumulating plants provide a niche for nickel-resistant bacteria // Bot. Acta: 1991. Vol. 104. P. 18-25.

147. Schmidt T., Schlegel H.G. Combined nickel-cobalt-cadmium resistance encoded by the ncc locus of Alcaligenes xylosoxidancs 31A // J. Bacteriol. 1994. Vol. 176. P. 7045-7054.

148. Schmidt T., Schlegel H.G. Nickel and cobalt resistance of various bacteria isolated from soil and highly polluted domestic and industrial wastes // FEMS Microbiol. Ecol. 1989. Vol. 62. P. 315-328

149. Schmidt T., Stoppel R.D., Schlegel H.G. High-level nickel resistance in Alcaligenes xylosoxydans 31A and Alcaligenes eutrophus KT02 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol. 57. №11. P. 3301-3309.

150. Scott J.A., Palmer S.J. Sites of cadmium uptake in bacteria used for biosorption//Appl. Inviron. Microbiol. 1990. Vol. 33. P. 221-225.

151. Shamsuzzaman K.M., Barnsley E.A. The regulation of naphthalene catabolism in pseudomonads // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. Vol. 60. P. 582-587.

152. Sharma P.K., Balkwill D.L., Frenkel A., Vairavamurthy M.A. A new Klebsiella planticola strain (Od-1) grows anaerobically at high cadmium concentrations and* precipitates cadmium sulfide // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol.- 66. №7. P. 3083-3087.

153. Siddiqui R.A. and Schlegel H.G. Plasmid pMOL28-mediated inducible nickel resistance in Alcaligenes eutrophus strain CH34 // FEMS Microbiol. Lett. 1987. Vol. 43. P. 9-13.

154. Siddiqui R.A. Benthin K. Shlegel H.G. Cloning of pMOL28-encoded nickel resistance genes end expression of the genes in* Alcaligenes eutrophus and Pseudomonas sp. //J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 5071-5078.

155. Sierra G. A simple method for the detection) of lipolytic activity of microorganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates //Antonie van Leeuwenhoek. 1957. Vol1. 23. P. 15-22.

156. Silver S. and Walderhaug M. Gene regulation of plasmid- and chromosome-determined inorganic ion transport in bacteria // Microbiol. Rev. 1992. Vol. 56. №1. P. 195-228.

157. Silver S. Plasmid-determined metal resistance mechanisms to heavy metals II Plasmid. 1992. Vol 27. P. 1-3.

158. Silver S., Phung le T. A bacterial: view of the periodic table: genes and proteins for toxic inorganic ions//J: Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005: Vol. 32. №11-12. P. 587-605.

159. Slininger P.J. and: Jackson M.A. Nutritional factors regulating growth and accumulation' of phenazine-l-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 279 //Appl: Microbiol: Biotechnol: 1992. Vol: 37. P: 388^3921

160. Smith D:L., Tao T., andtMaguire M.E. Membrane topology of a P-type ATPase. The MgtB magnesium transport protein of Salmonella typhimurium II J. Biol: Chem. 1993; Vol. 268; Issue 30. P. 22469-22479:

161. Stanier R.Y., Palleroni N.J., and Doudoroff M. The aerobic, pseudomonads: A taxonomic study // J. Gen. Microbiol. //1966; Vol: 43. P. 159-271.

162. Stefanowicz A.M., Niklinska M., Kapusta P., Szarek-Lukaszewska G. Pine forest and grassland differently influence the response of soil microbial communities to metal contamination // Sei. Total Environ. 2010. Vol. 408. №24. P. 6134-6141.

163. Stoppel R.-D., Schlegel H.G. Nickel-resistant bacteria from antropogenically nickel-polluted and naturally nickel-percolated ecosystems // Appl: Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61. №6. P. 2276-2285.

164. Taghavi S., Delanghe H., Lodewyckx C., Mergeay M., van der Lelie D. Nickel-resistance-based minitransposons: new tools for genetic manipulation ofenvironmental bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. №2. P. 1015-1019.

165. Tibazarwa C., Wuertz S., Mergeay M., Wyns L. Regulation of the cnr cobalt and nickel resistance determinant of Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) CH34 // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 1399-1409.

166. Tikhonovich I.F., Provorov N.A. From plant-microbe interactions to symbiogenetics: an universal paradigm for the interspecies genetic integration // Ann. Appl. Biol. 2009.4 Vol. 154. P. 341-350.

167. Timmusk S., Paalme V., Pavlicek T., Bergquist J., Vangala A., Danilas T., Nevo E. Bacterial distribution, in the rhizosphere of wild barley under contrasting microclimates //PLoS One. 2011. Vol. 6. №3. P. el7968!

168. Timotius K. Schlegel H.G. Microbial megaplasmids. Nickel-resistant bacteria isolated from sewage / Nachrichten der Academie der Wissenschaften in- Gottingen. II Mathematisch-Physikalische Klasse. Schwartz E. ed. 1987. Vol. 3. P. 1-9.

169. Tralau T., Cook A.M., Ruff J. Map of the IncPlbeta plasmid pTSA encoding the widespread genes (tsa) for p-toluenesulfonate degradation in Comamonas testosteroni T-2 // Appl: Environ; Microbiol. 2001 Vol. 67. №4. P. 1508-1516.

170. Tripathi V.N., Srivastava S. Extracytoplasmic storage as the nickel resistance mechanism in a natural isolate of Pseudomonas putida S4 // Can. J. Microbiol. 2006. Vol. 52. №4. P. 287-292.

171. Turgay O.C., Görmez A., Bilen S. Isolation and characterization of metal resistant-tolerant rhizosphere bacteria from the serpentine soils in Turkey //

172. Environ. Moni.t Assess. 2011 Mar 16. Epub ahead of print.

173. Udo E.E., Jacob L.E., Mathew B. A cadmium resistance plasmid, pXU5, in Staphylococcus aureus, strain ATCC25923 // FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 189. №1. P. 79-80.

174. Vahrenkamp H. Metalle in Lebensprozessen // Chemie in Unserer Zeit. 1979. Vol. 7. P. 97-105.

175. Werle E., Schneider C., Renner M., Volker M. and FiehnW. Convenient single-step; one tube purification of PCRproducts for direct sequencing //Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 22. №20: P: 4354-4355.

176. Weyens N., Croes S., Dupae J., Newman L., van der Lelie D., Carleer R., Vangronsveld J. Endophytic bacteria improve phytoremediation of Ni andTCE co-contamination // Environ; Pollut. 2010. Vol. 158. №7. P. 2422-2427.

177. Whiting S.N., de Souza M.P., Terry N. Rhizosphere bacteria mobilize Zn for hyperaccumulation by Thlaspi caerulescens II Environ. Sci. Technol. 2001. Vol. 35. №15. P. 3144-3150.

178. Wu J., Jiang Ch., Wang B., Ma Y., Liu Zh., and Liu Sh. Novel partial reductive pathway for 4-chloronitrobenzene and nitrobenzene degradation in Comamonas sp. strain-CNB-1 // Appl. Environ. Microbiol; 2006. Vol. 72. №3. P. 1759-1765.

179. YamagamiK., Nishimura S., Sorimachi M. Cd2+ and Co2+ at micromolar concentrations mobilize intracellular Ca2+ via the generation of inositol 1,4,5-triphosphate in bovine chromaffin cells // Brain Res. 1998. Vol. 798: №1—2. P. 316-319.

180. Zaidi S., Usmani S., Singh B.R., Musarrat J. Significance of Bacillus subtilis strain SJ-101 as a bioinoculant for concurrent plant growth promotion andnickel accumulation in Brassica jimcea // Chemosphere. 2006. Vol. 64. №6. P. 991-997.

181. Zgurskaya H.I., Nikaido H. Bypassing the periplasm: reconstitution of the AcrAB multidrug efflux pump of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. №13. P. 7190-7195.

182. Zhan J., Sun Q. Diversity of free-living nitrogen-fixing microorganisms in wastelands of copper mine tailings during the process of natural ecological restoration II J. Environ. Sci. (China). 2011. Vol. 23. №3. P. 476-487.

183. Zhang Y., Ma Y.F., Qi S.W., Meng B., Chaudhry M.T., Liu S.Q., Liu S.J. Responses to arsenate stress by Comamonas sp. strain CNB-1 at genetic and proteomic levels // Microbiology. 2007. Vol. 153. Pt. 11. P. 3713-3721.

184. Zhuang X., Chen J., Shim 1L, Bai Z. New advances in plant growth-promoting rhizobacteria for biorcmcdiation // Environ. Int. 2007. Vol. 33. №3. P. 406-413.

Информация о работе

Сиунова, Татьяна Вячеславовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода Pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы