Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды

Анохина, Татьяна Орестовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды"

На правах рукописи

АНОХИНА ТАТЬЯНА ОРЕСТОВНА

РИЗОСФЕРНЫЕ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИЕ БАКТЕРИИ РОДА PSEUDOMONAS, СТИМУЛИРУЮЩИЕ РОСТ РАСТЕНИЙ И ДЕГРАДИРУЮЩИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2011

4851708

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и в Пущинском государственном университете, г. Пущино

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Владимир Васильевич Кочетков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Нина Васильевна Доронина

кандидат биологических наук, Илья Витальевич Евдокимов

Ведущая организация:

Филиал Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино

Защита диссертации состоится itsi /CiL- 2011 г. В

часов ЗО мин, на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино

Автореферат размещен на сайте http://vyww.ibpm.ru Автореферат разослан ^¿¿(.сС^ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук Вагабов В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время в биосфере циркулирует огромное число токсичных соединений природного и техногенного происхождения. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются приоритетными загрязнителями вследствие своего повсеместного распространения и отрицательного влияния на живые организмы. Серьезную проблему представляют комплексно загрязненные почвы, когда наряду с органическими поллютантами в почвах присутствуют тяжелые металлы и/или металлоиды. Скорость деградации органических соединений на таких территориях существенно замедляется (Springael et al., 1993; Sokhin et al., 2001).

Одним из современных и многообещающих подходов для очистки загрязненных почв является фиторемедиация — совместное применение растений и ассоциированных с ними микроорганизмов (Lucy et а/., 2004). Получение экспериментальных данных, касающихся взаимодействия растений и ризосферных бактерий на загрязненных почвах, является основой для повышения эффективности фиторемедиационных технологий. Поскольку при загрязнении ухудшаются физико-химические свойства почвы, и как следствие, снижается накопление растительной биомассы, представляется актуальным применение штаммов, способных не только утилизировать токсичные соединения, но и стимулировать рост растений.

Было показано, что гибель и угнетение роста растений на загрязненной почве может происходить не только из-за токсического действия на них вещества-загрязнителя, но и вследствие сильного повреждения растений фитопатогенными грибами и накоплением в почве грибных метаболитов (Киреева с соавт., 2006). Таким образом, для очистки загрязненных почв необходимо использование штаммов, способных деградировать органические загрязнители и подавлять рост фитопатогенных грибов.

Известно, что некоторые представители ризосферных бактерий рода Pseudomonas способны улучшать рост растений за счет различных механизмов (Haas and Defago, 2005). Наиболее ярким примером положительного влияния псевдомонад является синтез фитогормонов и защита растений от фитопатогенов. Такие полезные для растений бактерии в настоящее время объединяют в специфическую группу, которую принято обозначать как PGPR Pseudomonas (PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, стимулирующие рост растений). В природных условиях численность PGPR Pseudomonas не велика и составляет менее 1% от общего числа культивируемых штаммов, изолированных из ризосферы (Raaijmakers et al., 1999). Использование таких бактерий представляется весьма перспективным подходом для оптимизации процессов очистки загрязненных почв.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - получение плазмидосодержащнх вариантов PGPR Pseudomonas, совмещающих фитостимулирующие и защитные свойства со способностью к биодеградации ПАУ.

В соответствии с целью работы были определены следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать новые ризосферные штаммы бактерий, совмещающие способность утилизировать ПАУ, подавлять фитопатогенные грибы и бактерии и стимулировать рост растений. Провести в выделенных штаммах поиск плазмид биодеградации.

2. Выявить в ризосферных штаммах-антагонистах фитопатогенов наличие генетических систем, вовлеченных в биосинтез антибиотически активных соединений.

3. Сконструировать штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas, содержащие плазмиды биодеградации нафталина и устойчивости к тяжелым металлам.

4. Изучить ростовые характеристики плазмидосодержащих штаммов при культивировании на ПАУ, удельную активность ключевых ферментов деградации нафталина и стабильность поддержания плазмид биодеградации и резистентности к тяжелым металлам.

5. Оценить деградацию нафталина и фенантрена ризосферными штаммами в модельных растительно-микробных ассоциациях.

Научная новизна работы

Выделены и сконструированы новые плазмидосодержащие штаммы PGPR Pseudomonas, совмещающие способность деградировать ПАУ, подавлять рост фитопатогенов и продуцировать индолил-3-уксусную кислоту. Впервые выделен штамм Р. aureofaciens OV17(pOV17), содержащий плазмиду биодеградации нафталина.

Показано, что наиболее активные ризосферные штаммы-антагонисты фитопатогенов содержат несколько генетических систем, необходимых для биосинтеза антибиотиков. У четырех штаммов Р. fluorescens обнаружены гены, необходимые для биосинеза пиолютеорина, пирролнитрина и 2,4-диацетилфлороглюцина. Шесть штаммов Р. aureofaciens и один штамм Р. chlororaphis содержат гены, участвующие в биосинтезе пирролнитрина и феназин-1-карбоновой кислоты.

Плазмиды биодеградации нафталина pOV17 и pBS216 могут поддерживаться в различных видах PGPR Pseudomonas, включая Р. fluorescens, Р. aureofaciens, Р. chlororaphis и Р. putida. Стабильность поддержания плазмид биодеградации зависит от видовой принадлежности штамма. Наиболее стабильно плазмиды поддерживаются в штаммах Р. chlororaphis PCL1391 и Р. putida 53 а.

Плазмидосодержацие штаммы PGPR Pseudomonas защищают растения от токсичного действия ПАУ (нафталин или фенантрен), осуществляя деградацию этих соединений в ризосфере растений. Эффективность деградации нафталина (200 мкг/мг песка) полученными плазмидосодержащими штаммами в стерильных условиях в ризосфере рапса составляет около 100%. В модельных экспериментах с торфо-смесью, загрязненной фенантреном (5 мг/г) максимальная (выше 50%) биодеградация осуществляется при инокуляции семян ячменя штаммами Р. fluorescens 38a(pBS216) и Р. aureofaciens OV17(pOV17). Однако, в результате рекомбинационных событий могут быть

получены плазмидосодержащие варианты, не способные к полной деградации ПАУ, продуцирующие токсичные интермедиаты, приводящие к гибели растений (штамм Р. putida 53a(pBS216*)).

Получены новые штаммы ризосферкых бактерий рода Pseudomonas, способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов. Показано, что устойчивый двуплазмидный штамм Р. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.

Научно-практическая значимость работы

Создана коллекция плазмидосодержащих штаммов PGPR Pseudomonas, эффективно деградирующих ПАУ. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтверждены патентами РФ на изобретение № 2352629, № 2396339, № 2396338.

Показано, что подбор штаммов-деструкторов ПАУ для фиторемедиационных технологий должен основываться как на изучении степени колонизации ризосферы того или иного растения, так и на тщательном выяснении взаимодействий плазмида-бактериальный хозяин и оценке конкурентоспособности данной комбинации в определенных природных условиях.

Полученные в работе плазмидосодержащие штаммы PGPR Pseudomonas могут использоваться для разработки на их основе нового поколения биопрепаратов для защиты и стимуляции роста растений, а также очистки почв с комплексным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и тяжелыми металлами.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на 13 конференциях: «Биология -наука XXI века», 5-я, 8-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2001, 2004, Пущино; «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках», Всероссийская конференция, 14-19 июня 2001, Санкт-Петербург; «Биотехнология-2003», научно-практическая конференция, 24-25 ноября 2003, Пущино; «Экология 2004: Эстафета поколений», 3-я Пущинская международная школа-семинар по экологии, 27-29 апреля 2004, Пущино; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино; «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 3-я межрегиональная конференция молодых ученых, 1012 октября 2006, Саратов; «Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants», International symposium, 28-30 July 2003, Saratov; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 25-31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on

Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007, Colchester, England.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 5 статей, 15 тезисов и 3 патента РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждения», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 37 рисунков. Библиография насчитывает 235 наименований, из них 37 отечественных и 198 зарубежных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использовали три группы ризосферных бактерий рода Pseudomonas: 1) штаммы-деструкторы ПАУ, изолированные из ризосферных образцов, 2) бесплазмидные штаммы-антагонисты фитопатогенов и 3) полученные на их основе плазмидосодержащие варианты, несущие плазмиды pBS216, pOV17 и pBS501.

Среды и условия культивирования. Культивирование бактерий проводили при 30°С, используя среду М9, LB (Маниатис с соавт., 1984) и ТМС (Mergeay et al., 1985) Для культивирования растений в стерильных модельных системах использовали среду Мурашиге-Скуга (Murashige and Skoog, 1962).

Определение физиологических параметров роста штаммов проводили в периодической культуре на нафталине (1 г/л) и фенантрене (0.2 г/л) как единственных источниках углерода и энергии. Рост микроорганизмов контролировали путем измерения оптической плотности (ОП) и подсчета КОЕ в культуральной жидкости. Количество клеток определяли методом стандартных серийных разведений с последующим высевом на чашки с агаризованной средой LB. Удельную скорость роста (ц) рассчитывали по формуле n=ln(x/x0)/t, где хо - биомасса в начальный момент времени t0, х -биомасса в конечный момент времени, t - время роста культуры. Время одной генерации (g) рассчитывали как g=(t-t0)/n, где t - время культивирования бактерий, п-число генераций (Перт, 1978).

Антагонистическую активность ризосферных штаммов определяли при совместном культивировании фитопатогенных грибов (Gaeumannomyces graminis var. tritici, Fusarium oxysporum, F. graminearum, Rhizoctonia solani) и бактерий по наличию зоны подавления роста мицелия.

Конъюгационный перенос бактериальных плазмид осуществляли согласно (Dunn and Gunsalus, 1973).

Стабильность плазмид биодеградации определяли после последовательных пересевов бактерий в жидкой среде LB в течение 10 суток.

Удельную активность ферментов биодеградации нафталина определяли в бесклеточных экстрактах. Культуры выращивались на минимальной среде с

нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки осаждали центрифугированием, отмывали буфером и разрушали на ИБФМ-прессе (Россия). Активность нафталин диоксигеназы определяли согласно (Dua and Meera, 1981), активность салицилат гидроксилазы - согласно (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974), активность катехол-2,3-оксигеназы -(Hegeman, 1966), активность катехол-1,2-оксигеназы - согласно (Feist and Hegeman, 1969). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (Kalb and Bernlohr, 1977).

Определение содержания нафталина, фенантрена и продуктов их деградации проводили с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Определение фенантрена проводили на ВЭЖ хроматографе 2150 («LKB», Швеция) в следующих условиях: обращенно-фазная колонка Nucleosil С-18 («Marcherey-Nagel», США); предколонка - HPLC Column («Serva», США); носитель - октадецил Si-60 (20-40 мкм, 4.6 мм х 75 мм); элюент - 83%-ный метанол, 17%-ная деионизованная дистиллированная вода. Содержание нафталина определяли в следующих условиях: колонка С18, Nova Pak Waters, система: 50% метанол -50% вода, УФ детектор, 254 нм, скорость протока 1 мл/мин. Салициловую кислоту и катехол определяли в тех же условиях, но в системе 100% вода.

Определение уровня продукции индолил-З-уксусной кислоты (ИУК) проводили колориметрическим методом при добавлении реактива Сальковского (Gordon and Weber, 1951).

Качественный и количественный анализ антибиотически активных соединений проводили на ВЭЖ хроматографе LKB 2150. Была использована колонка 15 см х 4.6 мм I.D.; стационарная фаза - Sup-Rs Spcrísorb ODS2.5 мкм (Prolabo, Франция). Температура колонки - 25°С; мобильная фаза - метанол: 50 мМ Н3Р04 (66:34, v/v); УФ детектор, 210 нм, скорость протока - 1.3 мл/мин; Масс-спектры метаболитов регистрировали на масс-спектрометре высокого разрешения Финниган МАТ 8430 (Германия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплификаторе «HyBaid PCR Express» (Hybaid Limited, Ashford, Англия). Амплификацию фрагмента phzCO (1150 п.н.) феназинового оперона проводили с использованием праймеров РСА2а (5'-TTGCCAAGCCTCGCTCCAAC-3') и РСАЗЬ (5'-CCGCGTTGTTCCTCGTTCAT-3') (Raaijmakers et al, 1997). Праймеры Phl2a (5'-GAGGACGTCGAAGACCACCA-3') и Phl2b (5'-ACCGCAGCATCGTGTATGAG-3') (Raaijmakers et al, 1997) использовали для амплификации фрагмента гена phlD (745 п.н). Амплификацию фрагмента гена pltB (440 п.н.) проводили с использованием праймеров Pltl (5'-ACTAAACACCCAGTCGAAGG-3') и Plt2 (5'-AGGTATCCATGCCCAGC-3') (Mavrodi et al, 2001). Праймеры PrnCf (5'-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3') и PrnCr (5'-GAGAAGAGCGGGTCGATGAAGCG-3') использовали для определения гена prnC (719 п.н.) (Mavrodi et al, 2001). Амплификацию nahAc-гена проводили с помощью праймеров Acll4F (5'-CTGGC(T/A)(T/A)TT(T/C)CTCAC(T/C)CAT-3') и Ac596R (5'-C(G/A)GGTG(C/T)CTTCCAGTTG-3') (482 п.н.) (Wilson et al, 1999). Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с праймерами 27fm (5'-

AG AGTTTG ATCCTGGCTC AG-3') и 1492r (5'-

TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') (Weisburg et al, 1991).

Микровегетационные эксперименты в присутствии нафталина

проводили в стерильных условиях согласно (Simons et al, 1996). Стерильные проростки растений инокулировали суспензией штаммов плотностью около 108 КОЕ/мл в течение 15 мин. Выращивание растений проводили в закрытых пластиковых сосудах в 150 г песка при влажности 10% в присутствии нафталина (200 мкг/г песка). На 3, 7, 10 и 14 сутки определяли численность внесенных штаммов, стабильность плазмид биодеградации, содержание нафталина и биометрические показатели растений.

Микровегетационные эксперименты в присутствии фенантрена (5 мг/г торфо-смеси) проводили в нестерильных условиях. Определение содержания фенантрена в ризосфере растений ячменя (Hordeum sativum), инокулированных штаммами-деструкторами, проводили на 28 сутки эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг ризосферных штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов на наличие генов, вовлеченных в биосинтез антибиотиков различных групп

Ризосферные штаммы лабораторной коллекции, принадлежащие к видам P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens и P. putida (табл. 1), проявляли антагонистическую активность по отношению к широкому ряду фитопатогенных грибов и бактерий. Данные штаммы были выбраны для анализа на наличие генов, вовлеченных в биосинтез различных антибиотиков. Скрининг штаммов проводили с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров, разработанных для детекции генов, вовлеченных в биосинтез 2,4-диацетилфлороглюцина (phlD), пирролнитрина (ртС), пиолютеорина (pith) и феназин-1-карбоновой кислоты (p/zzCD), которые проявляют антибиотичекую активность и являются фунгицидными и бактерицидными соединениями. Результаты амплификации представлены в таблице 1.

Исходя из таблицы, штаммы лабораторной коллекции можно разделить на 2 группы. В первую входят представители вида P. fluorescens (штаммы 38а, 70а, 7Н, 90Н), которые содержат гены, необходимые для биосинтеза трех антибиотиков: 2,4-диацетилфлороглюцина, пирролнитрина и пиолютеорина. Данные изоляты сходны с использованным в работе штаммом P. fluorescens Pf-5, который выступал как положительный контроль. Во второй группе представлены штаммы Р aureofaciens BS1393, Н16, В1249, Кг31 и Р. chlororaphis SPB1217, содержащие гены, необходимые для биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты и пирролнитрина. Штамм P. fluorescens р54 обладает генами, ответственными только за биосинтез 2,4-диацетилфлороглюцина. Штамм P. putida 53а не показал положительного ответа ни с одной парой использованных праймеров.

Таблица 1. Амплификация генов, необходимых для биосинтеза различных антибиотиков, у PGPR Pseudomonas

Штамм

phlD

phzC D prnC

Описанные ранее PGPR Pseudomonas Р. ßuorescens Pf-5 + - +

Р. fluorescens Q2-87 +

Р. fluorescens 2-79 +

Р. chlororaphis PCL1391 - +

Использованные в работе PGPR Pseudomonas Р. fluorescens 38a Р. fluorescens 70a P. fluorescens 7H P. fluorescens 90H P. aureofaciens BS1393 P. aureofaciens Hl6 P. aureofaciens В1249 Р. aureofaciens КгЗ 1 Р. chlororaphis SPB12I7 Р. fluorescens p54 Р. putida 53 a_

pltB

+ + + +

+ + + + +

+ + + + + + + + +

+ + + +

(+) - хорошая эффективность амплификации, (-) размера не амплифицировался.

фрагмент предсказанного

В экстрактах культуральной жидкости штамма Р. аигеоАас1ет ВЭ1393 было обнаружено 3 мажорных метаболита: феназин-1-карбоновая кислота, 2-оксифеназин и 2-оксифеназин-1-карбоновая кислота. Пирролнитрин при данных условиях культивирования штамма не был обнаружен. Известно, что синтез антибиотиков напрямую зависит от метаболического статуса клетки, наличия питательных веществ, микро- и макро- элементов, температуры и рН. Возможно, данные условия культивирования не являлись оптимальными для синтеза пирролнитрина.

В экстрактах культуральной жидкости штамма Р. Аиогеясем 38а был обнаружен пиолютеорин. Из литературных данных известно, что в контрольном штамме Р. Аиоге5сет Р1-5 2,4-диацетилфлороглюцин и пиолютеорин взаимно репрессируют синтез друг друга. Возможно, именно по этой причине в штамме Р. Аио^сею 38а также был обнаружен только один антибиотик.

2. Выделение ризосферных бактерий-деструкторов полициклических ароматических углеводородов

Поскольку штаммы-антагонисты лабораторной коллекции, не были способны утилизировать ПАУ, был проведен поиск новых ризосферных штаммов бактерий, совмещающих фитостимулирующие свойства со способностью к биодеградации различных ароматических углеводородов.

Из ризосферы растений, растущих на почве, загрязненной нефтепродуктами были выделены 22 штамма, способных к росту на ПАУ и

продуктах их деградации. Для дальнейшей работы были выбраны 12 штаммов, способных к росту на фенантрене, антрацене, флюорене, аценафтене, нафталине, 2-метилнафталине и салицилате. На основании определения морфологических и физиолого-биохимических признаков, а также рестрикционного анализа гена 16S рРНК данные штаммы могут быть отнесены к Р. ßuorescens: IC7(pIC7), OV29(pOV29), VBl(pVBl), IID5(pIID5); Р. aureofaciens: OV17(pOV17), Ю1; и Pseudomonas sp.: OV19(pOV19), OV25(pOV25), OV26(pOV26), OV9(pOV9), OV27(pOV27) и Asl5(pAsl5).

Выделенные штаммы несли плазмидную ДНК размером около 80 т.п.н. Определение группы несовместимости плазмид с помощью ПЦР показало, что плазмиды из 8-ми выделенных штаммов IC7(pIC7), OV29(pOV29), VBl(pVBl), IID5(pIID5), OV17(pOV17), OV19(pOV19), OV25(pOV25), OV26(pOV26) относятся к P-9 группе несовместимости. Группа несовместимости плазмид у трех штаммов OV9(pOV9), OV27(pOV27) и Asl5(pAs 15) не была определена. Положительный ответ не был получен с праймерами, разработанными для Р-1, Р-7 и Р-9 групп. В штаммах, несущих плазмиды Р-9 группы несовместимости, nah гены имели плазмидную локализацию, что было доказано либо с помощью конъюгационного переноса, либо с помощью экспериментов по элиминации плазмид. Выделенный плазмидосодержащий штамм Р. aureofaciens OV17(pOV17) представлял особый интерес, поскольку ранее плазмиды биодеградации нафталина в штаммах, принадлежащих к виду Р. aureofaciens не были описаны.

Рестрикционный анализ плазмид Р-9 группы несовместимости показал, что плазмиды из неродственных штаммов были сходны, но не идентичны между собой и плазмидой pBS216, и значительно отличались от архитипической плазмиды NAH7 (рис. 1, эндонуклеаза рестрикции £coRl). Данный факт согласуется с литературными данными, говорящими о преобладании определенного типа плазмид в микробной популяции (Stuart-Keil et al., 1998).

10.0 т.п.н.

12 34 5 6 7 8 9 10 11 12 М

Рис. 1. Электрофореграмма плазмидной ДНК в ризосферных штаммах-деструкторах ПАУ, обработанной эндонуклеазами рестрикции EcoRl (1-6), Xho\ (7-12). 1,7- pBS216, 2, 8 - pIC7, 3,9- pOV17, 4, 10-pOV25, 5, 11 - pOV29, 6, 12 - NAH7. M - 1 т.п.н. ДНК маркер (СибЭнзим, Россия).

Выделенные штаммы обладали сходными ростовыми параметрами при культивировании на ПАУ (табл. 2). Продолжительность лаг-фазы составляла 34 ч при культивировании на нафталине и не более 24 ч - на трех кольцевых ПАУ. Максимальная удельная скорость роста (цтах, ч'1) варьировала от 0.3-0.41 ч'1 на нафталине до 0.01-0.05 ч"1 на трех кольцевых ПАУ. При использовании фенантрена и антрацена как единственных источников углерода и энергии, в культуральной жидкости штаммов накапливались, соответственно, 1-гидрокси-2-нафтойная и 2-гидрокси-З-нафтойная кислоты.

Таблица 2. Ростовые характеристики ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ

Штамм Субстрат Идентифицирован Лаг-период, Цтах» Ч

ные метаболиты ч

Р. aureofaciens фенантрен 1Г2Н 24 0.03

OV17(pOV17) антрацен 2ГЗН 24 0.03

нафталин - 3 0.41

Р. ßuorescens фенантрен 1Г2Н 24 0.03

IC7(pIC7) антрацен 2ГЗН 24 0.05

нафталин - 4 0.32

Р. ßuorescens фенантрен 1Г2Н 24 0.02

OV29(pOV29) антрацен 2ГЗН 24 0.02

нафталин - 4 0.30

Pseudomonas spp. фенантрен 1Г2Н 24 0.01

OV25(pOV25) антрацен 2ГЗН 24 0.01

нафталин - 4 0.31

Все выделенные штаммы обладали примерно одинаковым уровнем синтеза нафталин диоксигеназы (2-15 нмоль/мин мг белка) и салицилат гидроксилазы (4-18 нмоль/мин мг белка). Наиболее высокая удельная активность катехол-1,2-диоксигеназы (ор/ио-путь расщепления катехола) была выявлена у штаммов Р. ßuorescens IC7(pIC7), IID5(pIID5), VBl(pVBl), а катехол-2,3-диоксигеназы (мета-путь расщепления катехола) - у Pseudomonas sp. OV9(pOV9) и Asl5(pAsl5). Штамм Р. aureofaciens OV17(pOV17) обладал высокими удельными активностями как катехол-1,2-диоксигеназы, так и катехол-2,3-диоксигеназы (57.8 и 305.3 нмоль/мин мг белка, соответственно).

Определение антагонистической активности показало, что 5 штаммов (3 штамма Р. ßuorescens IC7(pIC7), VBl(pVBl), IID5(pIID5) и 2 штамма Р. aureofaciens OV17(pOV17) и IG1) подавляли рост фитопатогенных грибов родов Gaeumannomyces, Fusarium и Rhizoctonia. Наибольшую антагонистическую активность, сходную с контрольным штаммом Р. aureofaciens BS1393, показали изоляты OV17(pOV17) и IG1.

С использованием специфических праймеров РСА2а и РСАЗЬ, комплементарных последовательности феназинового оперона phzCD, были амплифицированы идентичные фрагменты ДНК у пяти вышеуказанных

штаммов и контрольного штамма Р. Аиотехсет 2-79 (рис. 2,А). Положительный ПЦР ответ был также получен у штаммов ОУ17 и Ю1 для гена ргпС, необходимого для биосинтеза пирролнитрина (рис. 2, Б). Генов, необходимых для синтеза пиолютеорина и флороглюцинов амплифицировано не было.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента феназинового оперона phzCD (А) и гена ргпС, необходимого для синтеза пирролнитрина (Б) у ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ. М - ДНК маркер (СибЭнзим, Россия).

А: 1 - P. fluorescens 2-79 (положительный контроль), 9 - P. fluorescens Q2-87 (отрицательный контроль); Б: 1 - P. fluorescens Pf-5 (положительный контроль), 9 - P. fluorescens 2-79 (отрицательный контроль); 2 - 1С7(р1С7), 3 - IID5(pIID5), 4 - VBl(pVBl), 5 - ОV9(pOV9), 6 - ОV29(pOV29), 7 - OV17(pOV17), 8 - IG1.

Было показано, что штаммы P. fluorescens IC7(pIC7), VBl(pVBl), IID5(pIID5) синтезируют только феназин-1-карбоновую кислоту, a P. aureofaciens OV17(pOV17) и IG1 - феназин-1-карбоновую кислоту, 2-оксифеназин и 2-оскифеназин-1-карбоновую кислоту.

Способность ризосферных бактерий к синтезу фитогормонов может положительно влиять на эффективность фиторемедиации за счет увеличения вегетативной массы растений. Все штаммы-деструкторы синтезировали индолил-3-уксусную кислоту в количестве около 2-6 мкг/мг сухих клеток.

Таким образом, изолированы новые плазмидосодержащие штаммы, принадлежащие к видам P. fluorescens и P. aureofaciens, совмещающие способность деградировать ПАУ, подавлять рост фитопатогенов и продуцировать индолил-3-уксусную кислоту. Впервые выделен штамм Р. aureofaciens OV17(pOV17), содержащий плазмиду биодеградации нафталина.

3. Взаимодействие ризосферных плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas с растениями

В работе использовали штаммы PGPR Pseudomonas, продуцирующие различные антибиотики и фитогормоны. Штамм Р. fluorescens 38а синтезировал пиолютеорин, Р. chlororaphis PCL1391 - феназин-1-карбоксамид, Р. aureofaciens BS 1393 и Р. aureofaciens OV17(pOV17) - окси-производные феназин-1-карбоновой кислоты, Р. putida 53а - индолил-3-уксусную кислоту. В

указанные штаммы были переданы две плазмиды биодеградации нафталина pOV17 и pBS216. Плазмида pBS216 относится к Р-9 группе несовместимости и содержит полный набор генов, необходимых для биодеградации нафталина (Кочетков с соавт., 1997). Все полученные комбинации «ризосферный штамм -плазмида биодеградации», за исключением варианта Р. putida 53a(pBS216), были способны эффективно использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 3).

Таблица 3. Физиологические параметры роста плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas при выращивании на минеральной среде с нафталином (1 г/л)

Штамм Р-тах) 4 g в лог- KOEmax

периоде, ч

Штаммы, несущие плазмиду pOV17

Р. aureofaciens OV17(pOV17) 0.41 1.7 7.4xl08 ± 2.2xl07

Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) 0.30 2.3 l.OxlO9 ±6.0xl05

Р. aureofaciens BS1393(pOV17) 0.33 2.1 7.5x108 ±5.8xl06

Р. putida 53a(pOV 17) 0.31 2.2 1.5xl09 ± 1.8xl07

Штаммы, несущие плазмиду pBS216

Р. chlororaphis PCL1391(pBS216) 0.45 1.5 2.0x10' ±6.7x107

Р. aureofaciens OV17(pBS216) 0.27 2.6 1.9xl08 ± 1.3X107

Р. aureofaciens BS1393(pBS216) 0.36 1.9 2.1 x 108 ±2.0xl07

P. putida 53a(pBS216) 0.13 5.3 2.9x10б ±2.3xl05

P. flúorescens 38a(pBS216) 0.39 1.8 1.3xl09 ±5.1xl07

Цшах - максимальная удельная скорость роста, ч"1, рассчитанная согласно изменению КОЕ в культуральной жидкости.

g - время одной генерации, ч, в логарифмической фазе роста культуры.

Максимальная скорость роста была обнаружена у природного штамма Р. aureofaciens OV17(pOV17) - 0.41 ч'1 и полученного трансконъюганта Р. chlororaphis PCL1391(pBS216) - 0.45 ч"1. Штамм Р. putida 53a(pBS216) характеризовался самой низкой максимальной удельной скоростью роста (цтах = 0.13 ч'1) и наименьшей максимально достижимой концентрацией бактерий (КОЕ = 2.89 х 10б). При культивировании Р. putida 53a(pBS216) в жидкой среде с нафталином в культуральной жидкости накапливался катехол и ряд неидентифицированных соединений. Ни салицилат, ни катехол не обнаруживались в культуральной жидкости остальных штаммов.

При использовании плазмидосодержащих штаммов в ремедиации почв большое значение имеет стабильность поддержания плазмид и сохранение фенотипа интродуцируемых микроорганизмов. Определение стабильности исследуемых плазмид биодеградации нафталина выявило, что плазмида pOV17 более стабильно поддерживается в плазмидосодержащих штаммах, чем pBS216. Лучшими штаммами хозяевами плазмид являлись Р. chlororaphis PCL1391 и Р. putida 53а. После 7 суток культивирования стабильность обоих плазмид в этих штаммах составляла около 100%. В штаммах Р. aureofaciens

BS1393(pBS216) и OV17(pBS216) стабильность плазмиды pBS216 была очень низкой. На 3 сутки культивирования плазмидосодержащие варианты составляли не более 40%, практически полностью исчезая к 7 суткам.

Сравнение стабильности плазмид у одного и того же варианта штамма показало, что на среде М9 стабильность, как правило выше, чем на LB. Это может быть связано с более продолжительным временем генерации штаммов на бедных средах. Например, для P. aureofaciens BS1393(pBS216) время одной генерации в экспоненциальной фазе роста на среде LB составляло около 40 мин, а на М9 с глицерином -1.5 ч.

Помимо стабильности поддержания, важной характеристикой плазмид является их структурная стабильность. Низкая скорость роста и накопление продуктов неполного окисления нафталина у штамма P. putida 53a(pBS216) могло быть результатом неспособности плазмидных генов катаболизма нафталина эффективно экспрессироваться в результате структурных изменений плазмиды, происходящих при ее переносе в данный штамм.

На рис. 3 приведен пример рестрикционного анализа плазмидной ДНК из штаммов P. putida BS394(pBS216) (донора плазмиды pBS216), полученного трансконъюганта P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. putida 53a(pBS216). Показано, что некоторые фрагменты плазмиды pBS216 из P. putida 53a(pBS216) имели меньший молекулярный вес, чем фрагменты исходной плазмиды. (В дальнейшем плазмида из штамма P. putida 53a(pBS216) будет обозначаться как pBS216*).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рис. 3. Электрофореграмма ДНК плазмид биодеградации, выделенных из штаммов Р. putida BS394(pBS216), Р. aureofaciens BS1393(pBS216) и Р. putida 53a(pBS216*) и обработанных эндонуклеазами рестрикции. 1 - 1 т.п.н. ДНК маркер; 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 - плазмидная ДНК из исходного штамма Р. putida BS394(pBS216); 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24 -плазмидная ДНК из штамма Р. aureofaciens BS1393(pBS216); 4,7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 - плазмидная ДНК из штамма Р. putida 53a(pBS216*). Плазмидная ДНК была обработана следующими ферментами: 2-4 - £coRI, 5-7 - Pipi24ВI, 8-10 -ВатШ, 11-13-ЛД, 14-16-SM, \l-\9-BglW, 20-22 -Smal, 23-25 - tfpal.

Исходя из данных таблицы 4 видно, что произошедшие структурные перестройки повлияли на экспрессию «а/г-оперона плазмиды pBS216*. У штамма Я. putida 53a(pBS216*) уровень удельных активностей нафталин диоксигеназы и салицилат гидроксилазы был сравним с исходным штаммом Р. putida BS394(pBS216), в то время как удельные активности катехол диоксигеназ вообще не регистрировались. Полученные результаты подтверждают, что произошедшие структурные перестройки плазмиды pBS216* инактивировали ген nahW (кодирует катехол-2,3-диоксигеназу), который имеет плазмидную локализацию.

Таблица 4. Удельная активность ключевых ферментов деградации нафталина в исходных и полученных штаммах на минеральной среде с нафталином

Штамм Удельная активность ферментов, нмоль/мин мг белка

НО СГ К120 K230

BS394(pBS216) 1.99 ± 0.01 3.98 ± 0.01 14.64 ± 1.83 41.31 ±3.22

PCL1391 (pBS216) 2.76 ± 0.01 4.41 ± 0.02 34.31 ±3.34 63.49 ±3.62

53a(pBS216*) 3.79 ± 0.01 4.20 ± 0.01 0 0

OV17(pOV17) 8.83 ± 0.03 10.79 ±0.08 57.77 ±3.50 305.28 ± 11.33

PCL1391(pOV17) 3.55 ± 0.01 4.46 ± 0.01 30.97 ±2.18 200.51 ±8.45

53a(pOV17) 5.21 ± 0.01 5.20 ± 0.01 0 224 ± 6.45

НО - нафталин диоксигеназа, СГ - салицилат гидроксилаза, К120 - катехол-1,2-диоксигеназа, К230 - катехол-2,3-диоксигеназа.

Изучение влияния плазмидосодержащих штаммов на рост растений (двудольных: рапс, горчица, табак, однодольных: ячмень, пшеница) и деградацию ПАУ проводили в стерильных микровегетационных экспериментах в присутствии нафталина и фенантрена (рис. 4).

BS1393(pBS216) BS1393

Рис. 4. Влияние различных вариантов штамма Р. аигео/ас1еп$ В81393 на рост растений пшеницы в присутствии нафталина (200 мкг/г).

Нафталин оказывал выраженное токсичное действие на растения. Длина растений, выращенных без инокуляции, была в среднем на 80% меньше, чем у контрольных растений, выращенных без добавления нафталина. Исходные бесплазмидные варианты штаммов не оказывали защитного влияния на развитие растений (рис. 4). Инокуляция проростков полученными плазмидосодержащими ризосферными бактериями, за исключением штамма Р. pulida 53a(pBS216*), оказывала защитный эффект во всех вариантах (рис. 5).

В случае Р. putida 53a(pBS216*) прорастание отсутствовало, что явилось худшим результатом даже по сравнению с небактеризованным контролем в присутствии нафталина (рис. 5). У всех проростков, обработанных Р. putida 53a(pBS216*) корневая система не развивалась и чернела. Такое отрицательное влияние штамма на развитие растений было выявлено только в присутствии нафталина. В модельных системах с песком без загрязнителя все варианты штамма Р. putida 53а не отличались между собой по влиянию на рост растений.

Рис. 5. Влияние плазмидосодержащих штаммов на длину проростков рапса в присутствии нафталина (200 мкг/г) в стерильном микровегетационном эксперименте.

^ - положительный контроль, проростки выращивались без добавления нафталина и без инокуляции; Ш - отрицательный контроль, проростки выращивались в присутствии нафталина (200 мкг/г) и без инокуляции; □ - штаммы, несущие плазмиду pBS216; - штаммы, несущие плазмиду pOV17.

Структурное изменение плазмиды pBS216* в этом штамме привело к выключению гена катехол-2,3-диоксигеназы и накоплению продуктов неполного окисления катехола, которые оказали токсичное действие на растения.

Численность бактерий, колонизирующих ризоплану растений, варьировала в зависимости от видовой принадлежности штамма, наличия плазмид биодеградации и присутствия нафталина в модельной системе.

В модельных системах без добавления нафталина, все штаммы колонизировали корни примерно одинаково. Численность увеличивалась на порядок с 2-4х108 (0 сут выращивания растений) до 8><108-1.5х109 КОЕ/г корней (7-10 сут). Штамм Р. chlororaphis PCL1391 колонизировал ризоплану несколько лучше, чем исследуемые штаммы других видов.

9.0Е+09 8.0Е+09 7.0Е+09

'§ 6.0Е+09

§ 5.0Е+09

W 4.0Е+09

^ 3,0Е+09 2.0Е+09 1.0Е+09 1.0Е+07

0 сут 3 сут 7 сут 10 сут 14 сут

—PCL1391 контроль -B-PCL1391 nah

-*- PCL 1391 (pBS216) контроль -ь- PCL 1391 (pBS216) nah

-»- PCL 1391 (pOVI 7) контроль -s- PCL 1391 (pOV 17) nah

Рис. 6. Динамика численности различных вариантов штамма Р. chlororaphis PCL1391 в ризосфере растений рапса.

контроль - растения выращивали без добавления нафталина, nah - растения выращивали в присутствии нафталина.

В присутствии нафталина численность как бесплазмидных, так и плазмидосодержащих штаммов увеличивалась в 3-5 раз по сравнению с теми же вариантами без нафталина (рис. 6). Сравнение численности вариантов одного и того же штамма, содержащих разные плазмиды биодеградации показало, что штаммы, обладающие большей скоростью роста в периодической культуре, колонизировали корни несколько лучше, чем медленно растущие варианты.

Стабильность плазмид биодеградации нафталина pBS216 и pOV17 у исследуемых штаммов, колонизирующих ризоплану, была значительно выше по сравнению со стабильностью при периодическом культивировании. На 14 сутки плазмидосодержащие варианты составляли 75-100%. Как и в случае периодического культивирования, наиболее стабильно плазмиды поддерживались в штаммах Р. chlororaphis PCL1391 и Р. pulida 53а. Стабильное поддержание плазмид биодеградации в микровегетационном эксперименте можно объяснить низкой скоростью роста штаммов, и, следовательно, более продолжительным временем генерации. Например, время одной генерации Р. aureofaciens BS1393(pBS216) в модельных системах составляло около 30 ч, а в среде LB - около 40 мин.

Все исследуемые плазмидосодержащие штаммы были способны к деградации нафталина в модельных системах (табл. 5). Содержание нафталина при внесении плазмидосодержащих штаммов уменьшалось в 10-30 раз (в зависимости от штамма) по сравнению с контрольным вариантом без инокуляции проростков. Наименьшее содержание нафталина было выявлено в вариантах с инокуляцией штаммами OV17(pBS216), OV17(pOV17) и 38a(pBS216) - 2.83, 3.44 и 2.40 мкг/г песка соответственно.

Варианты одного и того же штамма, содержащие плазмиду pBS216 или pOV17, не различались между собой по эффективности деградации. Штамм Р. pulida 53a(pBS216*) деградировал нафталин наравне с остальными плазмидосодержащими вариантами. Можно предположить, что его ингибирующее влияние на растения связано с накоплением продуктов неполного окисления катехола. В модельных системах с внесением бесплазмидных штаммов содержание нафталина было сходно с контрольным вариантом «нафталин + растение без инокуляции».

Таблица 5. Содержание нафталина (мкг/г) в песке в стерильных модельных системах через 7 суток выращивания растений по результатам ВЭЖХ

Вариант Содержание нафталина, мкг/г песка

Растения без инокуляции 95.66±3.19

Р. chlororaphis PCL1391(pBS216) 7.13±0.62

Р. chlororaphis PCL1391(pOV17) 7.95±0.58

Р. aureofaciens BS1393(pBS216) 9.85±0.85

Р. aureofaciens BS1393(pOV17) 8.25±1.13

Р. aureofaciens OV17(pBS216) 2.83±0.43

P. aureofaciens OV17(pOV17) 3.44±0.30

P. pulida 53a(pBS216*) 4.85±0.21

P. pulida 53a(pOV17) 4.53±0.23

P. fluorescens 38a(pBS216) 2.40±0.10

Изучение деградации фенантрена показало, что инокуляция семян ячменя плазмидосодержащими бактериями оказывала положительное влияние на рост растений в торфо-смеси, содержащей фенантрен (5 мг/г). На всем протяжении эксперимента (28 суток) небактеризованные растения отставали в

росте от контроля и от растений, обработанных штаммами-деструкторами. Существенных различий между природными и трансконъюгантными штаммами не наблюдалось. Численность штаммов составляла около 105 КОЕ/г корней, незначительно уменьшаясь в пределах порядка. В конце эксперимента в варианте, где семена бактеризовались штаммом P. aureofaciens OV17(pOV17), содержание фенантрена было наименьшим и составляло около 0.4 мг/г, эффективность деградации в этом случае достигала 67%. Штамм P. fluorescens 38a(pBS216) способствовал снижению содержания фенантрена на 50% (рис. 7).

мг/г

1,61-

1,4 -.....Т.......................................................................................................................................................

12 - Г] rb............т...............................................................................................................

1 - 1....................................................т......................................................................

0,8 - rh т т

0,6" ii Fl F1

0,4" r£i •

0,2 -..............................................

0 И I , J , U I 1,-1.1,1 I 1

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Содержание фенантрена (мг/г) в торфо-смеси через 28 суток по результатам ВЭЖХ.

1 - контроль, торфо-смесь без ячменя, 2 - небактеризованный ячмень, 3 -BS1393(pBS216), 4 - 38a(pBS216), 5 - IC7(pIC7), 6 - OV29(pOV29), 7 -OV17(pOV17), 8 - OV25(pOV25).

4. Ризосферные штаммы PGPR Pseudomonas, способные к деградации ПАУ в присутствии тяжелых металлов

На заключительном этапе работы были получены полифункциональные штаммы ризосферных псевдомонад, способные деградировать ПАУ в присутствии тяжелых металлов. Основным принципом конструирования устойчивых штаммов являлось сочетание в одной клетке двух природных плазмид - плазмиды биодеградации нафталина (pBS216 или pOV17) и плазмиды резистентности к кобальту/никелю (pBS501). Плазмида pBS501, изолированная из штамма Comamonas sp. BS501(pBS501), содержит сиг-подобный оперон, детерминирующий индуцибельную устойчивость к никелю и кобальту (Сиунова с соавт, 2009).

Для получения полифункциональных штаммов плазмидой pBS501 были трансформированы полученные ранее штаммы-деструкторы ПАУ. Селекцию клонов проводили на среде LB с 2 мМ C0CI2. В устойчивых штаммах обнаруживались две плазмиды (65 и 85 т.п.н.), по молекулярной массе соответствующие плазмидам pBS216/pOV17 (85 т.п.н.) и pBS501 (65 т.п.н.).

[Ь

¿1

rfi

1 2 3 4 5 6 7

В полученном варианте Р. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) обе плазмиды стабильно поддерживались и сохраняли детерминируемый фенотип Nah , Cor/Nir на уровне 100% после 10 суток культивирования в неселективных условиях. Стабильность признака устойчивости к тяжелым металлам и деградации нафталина в других двуплазмидных штаммах была значительно ниже.

Уровень устойчивости к кобальту/никелю, в двуплазмидных вариантах был в 4-5 раз выше по сравнению с чувствительными штаммами. Все двуплазмидные штаммы были резистентны к 400 мкМ никеля и 200 мкМ кобальта при культивировании в трис-минеральной среде с нафталином (1 г/л).

При выращивании двуплазмидных штаммов на нафталине в присутствии 100 мкМ Ni2+ или 50 мкм Со2+ штамм Р. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) показал лучшие ростовые параметры и был отобран для дальнейшей работы.

Из таблицы 6 видно, что никель не оказывал отрицательного влияния на жизнеспособность устойчивого штамма PCL1391(pBS216,pBS501). Как в контроле, так и в присутствии металла при одинаковой плотности культуры число КОЕ совпадали и возрастали. В конце экспоненциального роста титр клеток составил около 1.2 х Ю10 КОЕ/мл по сравнению с начальным значением 1.5х107 КОЕ/мл.

Увеличение ОП чувствительного штамма PCL1391(pBS216) было связано с накоплением окрашенных метаболитов и образованием бурого преципитата в среде культивирования. Только через 36 часов роста чувствительный штамм достигал ОП 0.2, количество жизнеспособных клеток при этом увеличивалось незначительно. При дальнейшем нарастании ОП наблюдалась гибель бактерий, КОЕ уменьшались на 2 и 4 порядка (КОЕ0по4= 1.4 х Ю5 и КОЕопо б= 2.0 х 103).

Таблица 6. Динамика численности (КОЕ/мл) различных вариантов штамма Р. сЫогогарЫя РСЫ391 в ТМС с нафталином в присутствии 100 мкМ никеля

ОП540 PCL1391(pBS216) PCL1391 (pBS216,pBS501)

нафталин нафталин + Nr+ нафталин нафталин + Ni2+

0.03 1.6 х Ю'(О)1 3.7 х ю7(0) 3.5 х ю'(0) 1.5 х Ю7(0)

0.2 1.3 х Ю8 (9) 7.0 х Ю' (36) 4.0 х Ю8 (9) 2.4 х Ю5 (7)

0.4 2.1 х 10" (12) 1.4 х 105 (54) 3.0 х Юы (15) 1.0 х 10" (11)

0.6 1.3 х Ю|и (18) 2.0 х Ю3 (69) 8.2 х 1010 (21) 1.2 х Ю'° (21)

'В скобках указано время выращивания в часах.

Удельную активность ферментов деградации нафталина измеряли при достижении бактериальными культурами ОП 0.2, что соответствовало количеству клеток около 108 КОЕ/мл (табл. 7). При культивировании чувствительного штамма Р. сЫогогарЫз РСЫ391(рВЭ216) в присутствии никеля удельная активность ферментов была сходна с чувствительным штаммом, выращенным без металла. Снижение жизнеспособности штамма и

падение его титра в присутствии никеля было в большей степени связано с общим токсичным действием металла на клеточный метаболизм, чем с ингибированием исследуемых ферментов деградации. Поскольку даже через 54 ч культивирования чувствительного штамма в присутствии никеля, при количестве жизнеспособных клеток около 1.4 х 105 КОЕ/мл регистрировалась активность данных ферментов.

Таблица 7. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации нафталина (нмоль/мин мг белка) у различных вариантов штамма Р. сМогогарМя РС1Л391

Фермент РСЬ1391(рВ8216) РСЫ391(рВ8216,рВ8501)

нафталин нафталин + №2+ нафталин нафталин +

нафталин диоксигеназа 4.6 4.6 4.0 3.4

салицилат гидроксилаза 32.0 32.8 26.8 44.6

катехол-1,2-диоксигеназа 97.7 84.4 56.5 87.1

катехол-2,3-диоксигеназа 8.5 4.1 1.8 0

Ингибирующее влияние никеля отразилось на эффективности биодеградации нафталина. В присутствии 100 мкМ никеля штамм РСЫ391(рВ8216) при плотности 7.0*107 КОЕ/мл за 36 часов окислял только 12% нафталина (табл. 8). При дальнейшем нарастании ОП культуры наблюдалось уменьшение численности штамма, и убыль нафталина в среде зависела только от его испарения.

Таблица 8. Биодеградация нафталина вариантами штамма Р. сМогогарЫз РСЫ391 в различных условиях роста

Штаммы РСЫ391(рВ8216,рВ8501) РСЫ391(рВ8216)

Условия роста нафталин нафталин + N1 нафталин нафталин + N1

Время, ч 21 21 18 36

Нафталин, мг/л 59.0 ±0.1 9.0 ±0.1 9.0 ±0.1 168.0 ± 17.0

Контроль1 870.0 ±22.0 870.0 ±22.0 900.0 ± 15.0 191.0 ±40.0

% деградации 93 98 99 12

'Концентрация нафталина в среде без бактерий, мг/л.

Преимущество устойчивого штамма по сравнению с чувствительным было очевидным. В присутствии никеля устойчивый штамм РСЫ391(рВ8216,рВ8501), достигший за 21 час плотности 1.2хЮ10 клеток/мл, окислял 98% нафталина, столько же, сколько чувствительный штамм РСЫ391(рВ8216), выращенный без металла (табл. 8).

Рис. 8. Антагонистическая активность плазмидосодержащих вариантов штамма Р. aureofaciens BS 1393 in vitro. А - подавление роста F. graminearum, Б — Я. solani.

1 - Р. aureofaciens BS1393, 2 - Р. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), 3 - Р. aureofaciens BS 1393(pOVl7), 4 - Р. aureofaciens BS1393(pBS216).

Количество ИУК у плазмидосодержащих вариантов было сходно с родительскими бесплазмидными штаммами, а в некоторых случаях продукция незначительно увеличивалась. Таким образом, плазмиды не влияли на основные физиологические свойства штаммов, необходимые для подавления фитопатогенов и улучшения роста растений.

Полученные нами результаты демонстрируют возможность совмещения плазмид катаболизма ПАУ, плазмид резистентности к тяжелым металлам и систем стимуляции роста/защиты растений. Такой подход может быть использован при создании полифункциональных штаммов PGPR Pseudomonas, эффективных для фиторемедиации почв, загрязненных нефтью в комплексе с ПАУ и тяжелыми металлами.

Депонирование штаммов. Штаммы микроорганизмов были депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под следующими номерами: Р. aureofaciens OV17(pOV17) - ВКМ В-2391 Д, Р. aureofaciens BS 1393(pBS216,pBS501) - ВКМ B-2501 Д.

При получении плазмидосодержащих вариантов PGPR Pseudomonas необходимо учитывать возможное отрицательное влияние плазмид на фитостимулирующие и защитные свойства штаммов. В полученных штаммах наличие плазмид биодеградации нафталина и устойчивости к тяжелым металлам не уменьшало продукцию феназиновых антибиотиков и пиолютеорина. Антагонистическая активность штаммов сохранялась на прежнем уровне (рис. 8).

А Б

выводы

1. Выделены и охарактеризованы новые штаммы бактерий рода Pseudomonas, совмещающие способность подавлять развитие фитопатогенов, стимулировать рост растений и деградировать ПАУ. Впервые у бактерий Р. aureofaciens обнаружены плазмиды биодеградации нафталина.

2. Показано, что наиболее активные штаммы, являющиеся антагонистами широкого круга фитопатогенов, содержат одновременно генетические системы необходимые для биосинтеза пиолютеорина, пирролнитрина и 2,4-диацетилфлороглюцина (4 штамма Р. fluorescens), и пирролнитрина и феназин-1-карбоновой кислоты (6 штаммов Р. aureofaciens, 1 штамм Р. chlororaphis).

3. Полученные плазмидосодержащие штаммы различаются по эффективности деградации нафталина и стабильности поддержания плазмид биодеградации и резистентности к тяжелым металлам. Плазмиды не влияют на основные физиологические свойства штаммов, необходимые для подавления фитопатогенов и улучшения роста растений.

4. Полученные плазмидосодержащие штаммы защищают растения от токсичного воздействия ПАУ. Эффективность деградации нафталина (200 мкг/г) в стерильных условиях составляет около 100%. В торфо-смеси, загрязненной фенантреном (5 мг/г) максимальная биодеградация (выше 50%) осуществляется штаммами Р. fluorescens 38a(pBS216) и Р. aureofaciens OV17(pOV17).

5. Сконструированы штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas, способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов. Устойчивый к тяжелым металлам двуплазмидный штамм Р. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.х.н. Н.Ф. Зеленковой, к.б.н. В.М. Аданину, к.б.н. A.B. Лисову, к.б.н. С.Л. Соколову, м.н.с. Т.В. Сиуновой, а также всем сотрудникам лаборатории биологии плазмид.

Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. В.В. Кочеткову.

Работа была выполнена при поддержке гос. контрактов: РНП № 2.1.1/4341, ФЦП ГК № 02.512.11.2337, ФЦП ГК № 02.740.11.0682, ФЦП ГК № 02.740.11.0040, ФЦП ГК № 14.740.11.0414 и проекта МНТЦ № 4033.

Статьи

1. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Зеленкова Н.Ф., Балакшина В.В., Воронин А.М. 2004. Биодеградация фенантрена ризосферными плазмидосодержащими бактериями рода Pseudomonas в модельных растительно-микробных ассоциациях // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 40. № 6. С. 654-658.

2. Волкова O.B, Анохина Т.О., Пунтус И.Ф, Кочетков В.В, Филонов А.Е, Воронин А.М. 2005. Влияние плазмид биодеградации нафталина на физиологические характеристики ризосферных бактерий рода Pseudomonas // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 41. № 5. С. 1-5.

3. Anokhina Т.О., Volkova O.V, Puntus I.F, Filonov А.Е, Kochetkov V.V, Boronin A.M. 2006. Plant growth-promoting Pseudomonas bearing catabolic Plasmids: naphthalene degradation and effect on plants. Process Biochemistry // V. 41. P. 2417-2423.

4. Сиунова T.B, Анохина Т.О., Машукова A.B., Кочетков B.B, Воронин A.M. 2007. Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации нафталина в присутствии кобальта/никеля // Микробиология. Т. 76. № 2. С. 212218.

5. Воронин А.М, Кочетков В.В, Сиунова Т.В, Анохина Т.О., Сизова О.И. «Изменение микробного сообщества ризосферных микроорганизмов под влиянием антропогенного загрязнения окружающей среды и интродукции в ризосферу плазмидосодержащих бактерий», стр. 113-124. Коллективная монография «Изменение окружающей среды и климата» в 8-ми томах. Т. 4. «Процессы в биосфере: изменения почвенно-растительного покрова и территориальных вод РФ, круговорот веществ под влиянием глобальных изменении климата и катастрофических процессов» Пред. ред. кол. Н.П. Лаверов, РАН-М.: ИФЗ РАН, 2008.

Патенты

1. Анохина Т.О., Кочетков В.В, Воронин А.М. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д для защиты и улучшения роста растений, растущих на почвах, загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами. Патент РФ на изобретение № 2352629. Приоритет изобретения 12.04.2006 г.

2. Анохина Т.О., Сиунова Т.В, Сизова О.И, Кочетков В.В, Воронин А.М. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв солями никеля. Патент РФ на изобретение № 2396339. Приоритет изобретения 02.07.2008 г.

3. Сизова О.И, Анохина Т.О., Сиунова Т.В, Кочетков В.В, Воронин А.М. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв арсенитом натрия. Патент РФ на изобретение № 2396338. Приоритет изобретения 02.07.2008 г.

Тезисы

1. Анохина Т.О., Кочетков В.В, Воронин А.М. Варианты ризосферного штамма Pseudomonas aureofaciens BS 1393, способные к биодеградации нафталина и фенантрена. Сб. тезисов 5-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2001, с. 196.

2. Кочетков В.В, Валидов Ш.З, Сиунова Т.В, Мордухова Е.А, Сизова О.И, Анохина Т.О., Балакшина В.В, Воронин А.М. Использование генетически модифицированных ризосферных бактерий рода Pseudomonas в

фиторемедиации. Сб. тезисов конференции «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды». Пущино, 2001, с. 85-87.

3. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Балакшина В.В., Воронин А.М. Микробиологические аспекты биоремедиации техногенно-загрязненных территорий. Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках». Тезисы докладов. 14-19 июня 2001, Санкт-Петербург, с. 64-65.

4. Anokhina Т.О., Validov Sh.Z., Kochetkov V.V., Boronin А.М. Characterization and identification of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrade bacteria from plant rhizosphere. Abstract book International symposium «Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants». 28-30 July 2003, Saratov, Russia, p. 3.

5. Анохина Т.О., Волкова O.B., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е, Воронин А.М. Взаимодействие ризосферных бактерий и штамма-деструктора полициклических ароматических углеводородов в ризосфере рапса. Сб. тезисов конференции «Биотехнология 2003». 24-25 ноября 2003, Пущино. С. 101-102.

6. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е. Влияние комбинаций «плазмида биодеградации-ризобактерия Pseudomonas» на развитие растений в условиях загрязнения почвы ПАУ. Сб. тезисов III Пущинской международной школы-семинара по экологии «Экология 2004: Эстафета поколений». 27-29 апреля 2004, Пущино, с. 8-9.

7. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е. Исследование комбинаций «плазмида-бактериальный хозяин» в ризосферных бактериях рода Pseudomonas. Сб. тезисов 8-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». 17-21 мая 2004 г., Пущино, с. 254.

8. Пунтус И.Ф., Игнатова А.А., Анохина Т.О., Филонов А.Е., Кочетков В.В., Воронин А.М. Взаимодействие PGPR и микроорганизмов-деструкторов в ризосфере и ризоплане растений в условиях загрязнения модельной почвы полициклическими ароматическими углеводородами. Материалы 8-ого международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005». 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино.

9. Филонов А.Е., Ветрова А.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Волкова О.В., Анохина Т.О., Воронин А.М. Влияние плазмид биодеградации на ростовые характеристики различных штаммов рода Pseudomonas и степень деструкции нефти. Материалы 8-ого международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005». 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино.

10. Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Машукова А.В., Воронин А.М. Ризосферные штаммы бактерий рода Pseudomonas для фиторемедиации почв с комплексным загрязнением. Материалы 8-го международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005», 18-19 ноября 2005, Пущино, с. 143-145.

11. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina Т.О., Sizova O.I., Boronin А.М. Plant-growth promotion rhizosphere Pseudomonas for phytoremediation of co-

contaminated soils. 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006. Book of abstracts, P. 351.

12. Анохина Т.О., Кочетков В.В, Воронин A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогеных грибов и деструкторы полициклических ароматических углеводородов. Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 10-12 октября 2006, с. 21.

13. Negri М.С, Kochetkov V.V, Siunova T.V, Anokhina Т.О., Sizova O.I, Zyakun A.M., Boronin A.M. Plasmid-Bearing Rhizosphere Pseudomonas for Enhanced Phytoremediation Performance. 4th International Phytoremediation Conference, Denver, Colorado, September, 2007.

14. Kochetkov V.V, Siunova T.V, Anokhina Т.О., Sizova O.I, Boronin A.M. Beneficial rhizosphere bacteria for bioremediation of oil-contaminated soils. 2nd International Conference «Rhizosphere», Montpellier, France, August 25-31, 2007.

15. Boronin A.M., Kochetkov V.V, Siunova T.V, Anokhina Т.О., Sizova O.I, Vinogradova E.V, Sokolov S.L. Plasmid bearing rhizosphere bacteria Pseudomonas for phytoremediation. International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), Colchester, England, September 16-18, 2007.

Подписано в печать:

05.05.2011

Заказ №> 5478 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анохина, Татьяна Орестовна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений

1.1 Механизмы положительного влияния ризосферных псевдомонад на растения

1.2 Феназиновые антибиотики ризосферных псевдомонад

1.2.1 Общая характеристика феназиновых антибиотиков

1.2.2 Биосинтез феназиновых антибиотиков

Глава 2. Деградация полициклических ароматических углеводородов

2.1 Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов

2.2 Деградация полициклических ароматических углеводородов растениями

2.2.1 Поглощение полициклических ароматических углеводородов растениями

2.2.2 Влияние ароматических углеводородов на структурную организацию клетки

2.2.3 Пути превращения полициклических ароматических углеводородов в растительной клетке

2.3 Деградация полициклических ароматических углеводородов бактериями рода Pseudomonas

2.3.1 Бактериальное окисление нафталина

2.3.2 Биохимические пути окисления фенантрена

2.3.3 Гены катаболизма полициклических ароматических углеводородов у бактерий рода Pseudomonas

Глава 3. Использование бактерий-деструкторов и растений для биоремедиации почв

3.1 Биологические способы очистки почв

3.2 Взаимодействие растений и микроорганизмов на загрязненных почвах 44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы

4.1 Микробиологические методы

4.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе

4.1.2 Питательные среды и условия роста

4.1.3 Выделение ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ

4.1.4 Определение способности роста бактерий на различных ПАУ

4.1.5 Определение антагонистической активности ризосферных штаммов

4.1.6 Конъюгационный перенос плазмид

4.1.7 Элиминация плазмид

4.1.8 Стабильность плазмид биодеградации

4.2 Биохимические методы

4.2.1 Определение активностей ферментов биодеградации нафталина

4.2.2 Определение содержания ПАУ и продуктов их деградации

4.2.3 Определение уровня продукции индолил-3-уксусной кислоты

4.2.4 Идентификация антибиотически активных соединений

4.2.5 Определение масс-спектров метаболитов штамма P. fluorescens 38а

4.3 Методы работы с ДНК

4.3.1 Выделение плазмидной ДНК

4.3.2 Выделение хромосомной ДНК

4.3.3 Электрофорез в агарозном геле

4.3.4 Визуализация плазмидной ДНК по методу Экхардта

4.3.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

4.3.6 Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции

4.3.7 Трансформация клеток Pseudomonas плазмидной ДНК (электропорация)

4.4 Методы работы с растениями

4.4.1 Стерилизация семян и бактеризация семян/проростков

4.4.2 Микровегетационный эксперимент в стерильных условиях

4.4.3 Микровегетационный эксперимент в нестерильных условиях 63 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 5. Скрининг ризосферных штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов на наличие генов, вовлеченных в биосинтез антибиотиков различных групп

5.1 Амплификация генов, необходимых для продукции антибиотиков

5.1.1 Амплификация гена phlD, вовлеченного в биосинтез ароматического антибиотика 2,4-диацетилфлороглюцина

5.1.2 Амплификация гена ртС, вовлеченного в биосинтез антибиотика пирролнитрина

5.1.3 Амплификация гена pltB, вовлеченного в биосинтез антибиотика гаголютеорина

5.1.4 Амплификация фрагмента phzCD, вовлеченного в биосинтез гетероциклического антибиотика феназин-1-карбоновой кислоты

5.2 Биохимический анализ продуцируемых антибиотиков

Глава 6. Выделение ризосферных бактерий-деструкторов полициклических ароматических углеводородов

6.1 Определение субстратной специфичности ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ

6.2 Определение локализации nah генов у ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ

6.3 Определение фитостимулирующих свойств у ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ

6.4 Тестирование ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ на видовую принадлежность

6.5 Определение ростовых характеристик ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ

6.6 Определение удельной активности ключевых ферментов деградации нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ

Глава 7. Взаимодействие ризосферных плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas с растениями ^

7.1 Ростовые характеристики PGPR Pseudomonas и стабильность плазмид биодеградации нафталина

7.2 Рестрикционный анализ плазмиды pBS

7.3 Удельная активность ключевых ферментов катаболизма нафталина у плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas

7.4 Влияние плазмид на взаимодействие PGPR Pseudomonas и растений

7.5 Деградация нафталина плазмидосодержащими PGPR Pseudomonas

Глава 8. Деградация фенантрена ризосферными штаммами в микровегетационном эксперименте

Глава 9. Ризосферные штаммы PGPR Pseudomonas, способные к деградации ПАУ в присутствии тяжелых металлов

9.1 Получение полифункциональных штаммов PGPR Pseudomonas

9.2 Характеристика полифункциональных штаммов

9.3 Влияние никеля па жизнеспособность вариантов штамма Р. chlororaphis PCL

9.4 Влияние никеля на активность ферментов деградации нафталина в вариантах штамма Р. chlororaphis PCL

9.5 Биодеградация нафталина

Глава 10. Обсуждение результатов

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды"

Актуальность работы

Масштабы загрязнения окружающей среды токсичными соединениями различной химической природы возрастают год от года. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются приоритетными загрязнителями вследствие своего повсеместного распространения и отрицательного влияния на живые организмы. ПАУ входят в состав тяжелых фракций нефти (около 5-10%) и попадают в окружающую среду в результате аварийных разливов нефтепродуктов, транспортировки и переработке нефти. Большое количество ПАУ образуется при неполном сгорании органических соединений и постоянно присутствует в выбросах ТЭЦ, коксо-, газо- и нефтехимических производств. В загрязненных почвах содержание индивидуальных ПАУ могут превышать ПДК в десятки, сотни, и даже тысячи раз (Juhasz and Naidu, 2000). Действие ПАУ на живые организмы связано с их токсичными, мутагенными и канцерогенными свойствами. Серьезную проблему представляют комплексно загрязненные почвы, когда наряду с органическими поллютантами (ПАУ, нефтепродукты, пестициды, хлорорганические соединения), присутствуют тяжелые металлы (кобальт, никель, цинк, медь, свинец, хром) и/или металлоиды (мышьяк). Скорость деградации органических соединений на таких территориях существенно замедляется (Springael et al., 1993; Sokhin et al., 2001).

Одним из современных и многообещающих подходов для очистки загрязненных почв является фиторемедиация — совместное применение растений и ассоциированных с ними микроорганизмов (Gerhardt et al., 2009). Получение экспериментальных данных, касающихся взаимодействия растений и ризобактерий на загрязненных почвах, является основой для повышения эффективности фиторемедиационных технологий. Особый интерес вызывает изучение динамики численности интродуцированных штаммов, стабильности поддержания плазмид биодеградации/устойчивости к тяжелым металлам, в случае плазмидосодержащих штаммов, эффективности деградации поллютантов, а также влияния образующихся продуктов деградации на рост растений.

Поскольку при загрязнении ухудшаются физико-химические свойства почвы, уменьшается содержание доступных соединений азота и фосфора для растений, и как следствие снижается накопление растительной биомассы, представляется актуальным применение штаммов, способных не только утилизировать токсичные соединения, но и стимулировать рост растений за счет улучшения минерального питания растений или синтеза фитогормонов.

Известно, что некоторые представители ризосферных бактерий рода Pseudomonas способны улучшать рост растений за счет различных механизмов (Haas and Defago, 2005). Наиболее ярким примером положительного влияния псевдомонад является синтез фитогормонов и защита растений от фитопатогенов. Такие полезные для растений бактерии в настоящее время объединяют в специфическую группу, которую принято обозначать как PGPR Pseudomonas (от англ. PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria -ризобактерии, стимулирующие рост растений). В природных условиях численность PGPR Pseudomonas не велика и составляет менее 1% от общего числа культивируемых штаммов, изолированных из ризосферы (Raaijmakers et al., 1999).

Совмещение генетических систем деградации полициклических ароматических углеводородов, резистентности к тяжелым металлам и стимуляции роста/защиты растений является одним из подходов в создании полифункциональных штаммов ризосферных бактерий для фиторемедиации почв с комплексным загрязнением органическими поллютантами и тяжелыми металлами. Ранее было показано, что в штаммах Alcaligenes eutrophus, содержащих плазмиды металлорезистентности и плазмиды биодеградации полихлорбифенилов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, в присутствии никеля или цинка увеличивалась эффективность деградации данных ксенобиотиков по сравнению с чувствительным штаммом (Springael et al., 1993; Collard et al., 1994). Однако, до настоящего времени отсутствуют данные относительно взаимодействия' генетических систем деградации ПАУ и металлорезистентности, их влияния на физиологию, эффективность биодеградации, активность ключевых ферментов в полифункциональных штаммах.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - получение плазмидосодержащих вариантов PGPR Pseudomonas, совмещающих фитостимулирующие и защитные свойства со способностью к биодеградации ПАУ.

В соответствии с целью работы были определены следующие задачи: 1. Выделить и охарактеризовать новые ризосферные штаммы бактерий, совмещающие способность утилизировать ПАУ, подавлять фитопатогенные грибы и бактерии и стимулировать рост растений. Провести в выделенных штаммах поиск плазмид биодеградации.

5. Оценить деградацию нафталина и фенантрена ризосферными штаммами в модельных растительно-микробных ассоциациях: определить динамику численности штаммов в ризосфере растений, стабильность поддержания плазмид биодеградации, влияние штаммов на рост и развитие растений, убыль субстратов в процессе деградации.

Научная новизна работы

Получены новые штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas, способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов. Показано, что устойчивый двуплазмидный штамм Р. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.

Научно-практическая значимость работы

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на 13 конференциях: «Биология - наука XXI века», 5-я, 8-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2001, 2004, Пущино; «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках», Всероссийская конференция, 14-19 июня 2001, Санкт-Петербург; «Биотехнология-2003», научно-практическая конференция, 24-25 ноября 2003, Пущино; «Экология 2004: Эстафета поколений», 3-я Пущинская международная школа-семинар по экологии, 27-29 апреля 2004, Пущино; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, научно-практическая конференция, 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино; «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 3-я межрегиональная конференция молодых ученых, 1012 октября 2006, Саратов; «Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants», International symposium, 28-30 July 2003, Saratov; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 25-31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007, Colchester, England.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 5 статей, 15 тезисов и 3 патента РФ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Анохина, Татьяна Орестовна

ВЫВОДЫ

2. Показано, что наиболее активные штаммы, являющиеся антагонистами широкого круга фитопатогенов, содержат одновременно генетические системы необходимые для биосинтеза пиолютеорина, пирролиитрина и 2,4-диацетилфлороглюцина (4 штамма Р. fluorescens), и пирролнитрина и феназин-1-карбоновой кислоты (6 штаммов Р. aureofaciens, 1 штамм Р. chlororaphis).

4. Полученные плазмидосодержащие штаммы защищают растения от токсичного воздействия ПАУ. Эффективность деградации нафталина (200 мкг/г) в стерильных условиях составляет около 100%. В торфо-смеси, загрязненной фенантреном (5 г/кг) максимальная биодеградация (выше 50%) осуществляется штаммами Р. fluorescens 38a(pBS216) и Р. aureofaciens OV17(pOV17).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анохина, Татьяна Орестовна, Пущино

1. Воронин A.M., Кочетков В.В. 2000. Биологические препараты на основе псевдомонад. Arpo XXI. 3:3-5.

2. Воронин A.M., Кулакова А.Н., Цой Т.В., Кошелева И.А., Кочетков В.В. 1988. Молчащие гены мета-иутп окисления катехола в составе плазмид биодеградации нафталина. Докл. АН СССР. 299: 237-240.

3. Воронин A.M., Скрябин Г.К., Кочетков В.В., Старовойтов И.И, Еремин A.A., Перебитюк А.Н. 1980. pBS4- новая плазмида биодеградации нафталина. Докл. АН СССР. 250:212.

4. Геннадиев А.Н., Пиковский Ю.М., Флоровская В.Н., Алексеева Т.А., Козин И.С., Оглоблина А.И. и др. 1996. Геохимия полициклических ароматических углеводородов в горных породах и почвах. М.: Изд-во МГУ, 196 с.

5. Демидиенко А.Я., Демурджан В.М., Шеянова А.Д. 1983. Изучение питательного режима почв, загрязненных нефтью. Агрохимия. 9: 100-103.

6. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JI., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. 2001. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Изд-во Общество фитопатологов, 302 с.

7. Заалишвили Г.В., Хатисашвили Г.А., Угрехелидзе Д.Ш., Гордезиане М.Ш., Квеситадзе Г.И. 2000. Детоксикационный потенциал растений (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 36(5): 515-524.

8. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М.: Изд-во АН СССР, 1963. 242 с.

9. Квеситадзе Г.И., Хатисашвили Г.А., Садунишвили Т.А., Евстигнеева З.Г. 2005. Метаболизм антропогенных токсикантов в высших растениях. М.: Наука, 199 с.

10. Киреева H.A., Бакаева М.Д., A.M. Мифтахова. 2006. Литическая активность микромицетов нефтезагрязненных почв как один из факторов фитотоксичности. Агрохимия. 9: 75-81.

11. Киреева H.A., Галимзянова Н.Ф., Мифтахова A.M. 2000. Микромицеты почв, загрязненных нефтью, и их фитотоксичность. Микология и фитопатология. 1:36-41.

12. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А., Воронин A.M. 1997. Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas. Микробиология. 66(2): 211-216.

13. Кошелева И.А., Балашова Н.В., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соков С.Л., Слепенькин A.B., Воронин A.M. 2000. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина. Микробиология. 69(6): 783-789.

14. Кошелева И.А., Цой Т.В., Кулакова А.Н., Воронин A.M. 1986. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных. Генетика. 22: 2383.

15. Мавроди Д.В., В.Н. Ксензенко, Б.М. Чатуев, Л.С. Томашев. 1997. Структурно-функциональная организация генов Pseudomonas ßuorescens, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты. Молекулярная биология. 31: 74-80.

16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 479 с.

17. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я., Воронин A.M. 1998. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина. Прикл. биохимия и микробиология. 34(3): 287-292.

18. Назаров A.B. 2000: Микробно-растительное взаимодействие при нефтяном загрязнении дерново-подзолистых почв южной тайги Предуралья. Диссертация канд. биол. наук. Пермь.

19. Назаров A.B., Иларионов С.А. 2005. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации. Биотехнология. 5: 54-62.

20. Овчинникова A.A. 2011. Взаимодействие микроорганизмов-деструкторов в ризосфере и ризоплане растений в присутствии углеводородов нефти. Диссертация канд. биол. наук. Пущино. 135 с.

21. Определитель бактерий Берджи. В 2 томах. Т. 1. Пер. с англ. / Под ред. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др. Издательство: М.: Мир, 1997. 432 с.

22. Перт С.Дж. 1978. Основы культивирования-микроорганизмов и клеток. М.: Мир, с. 14-33.

23. Пунтус И.Ф. 2000. Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах. Диссертация канд. биол. наук. Пущино, 121с.

24. Сиунова Т.В., Сиунов A.B., Кочетков В.В., Воронин A.M. 2009. сиг-Подобный оперон в штамме Comamonas sp., кодирующий устойчивость к кобальту и никелю. Генетика. 45(3): 336-341.

25. Скрябин Г.К., Старовойтов И.И. 1975. Альтернативный путь катаболизма нафталина Pseudomonas fluorescens. Докл. АН СССР. 221: 493.

26. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. 1990. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук. Думка.- 264 с.

27. Соколов C.JL, Кошелева И;А., Филонов А.Е., Воронин A.M. 2005. Влияние транспозонов на экспрессию генов биодеградации нафталина у штамма Pseudomonas putida BS202(NPL-1) и его производных. Микробиология. 74(1): 1-8.

28. Трутко С.М., Гарагуля А. Д., Киприанова Е.А., Акименко В.К. 1989. Физиологическая роль феназиновых пигментов, синтезируемых Pseudomonas aureofaciens. Биохимия. 54(8): 1329-1336.

29. Турковская О.В. 2005. Приемы ускорения деградации ксенобиотиков в окружающей среде. Сборник статей: Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. Саратов, с. 12-24.

30. Чрикишвили Д.И., Заалишвили Г.В., Митаишвили Т.И., Ломидзе Э.П. 2006. Пептидные конъюгаты метаболитов бензола и толуола в райграсе английском. Физиология растений. 53(4): 511-517.

31. Штарк О.Ю., Шапошников. А.И., Кравченко А.И. 2003. Продуцирование антифунгальных метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания. Микробиология. 72(5): 645-650.

32. Aken B.V., Correa P.A., Schnoor J.L. 2010. Phytoremediation of polychlorinated biphenyls: new trends and promises. Environ. Sei. Technol. 44(8): 2767-2776.

33. Alvey S., Crowley D.E., 1996. Survival and activity of an atrazine-mineralizing bacterial consortium in rhizosphere soil. Environ. Sei. Technol. 30: 1596-1603.

34. Anderson B.E., and T. Henrysson. 1996. Accumulation and degradation of dead-end metabolites during treatment of soil contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons with five strains of white-rot fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:647-652.

35. Anzai Y., Kim H., Park J., Wakabayashi H., and Oyaizu H. 2000. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1563— 1589.

36. Aprill W., Sims R.C. 1990. Evaluation of the use of prairie grasses for stimulating polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil. Chemosphere. 20: 253-65.

37. Arcand M.M. and Schneider K.D. 2006. Plant- and microbial-based mechanisms to improve the agronomic effectiveness of phosphate rock: a review. Annals of the Brazilian Academy of Sciences. 78(4): 791-807.

38. Arshad M., Saleem M., Hussain S. 2007. Perspectives of bacterial ACC deaminase in phytoremediation. Trends Biotechnol. 25(8): 356-362.

39. Audenaert K., Pattery T., Cornelis P. and Hofte M. 2002. Induction of systemic resistance to Botrytis cinerea in tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2: role of salicylic acid, pyochelin, and pyocyanin. Mol. Plant Microbe Interact. 15:1147-1156.

40. Babalola O.O. 2010: Beneficial bacteria of agricultural importance. Biotechnol. Lett. 32(11): 1559-1570.

41. Babu-Khan S., T.C. Yeo, W.L. Martin, M.R. Duron, R.D. Rogers, and A.H. Goldstein. 1995. Cloning of a mineral phosphate-solubilizing gene from Pseudomonas cepacia. Appl. Environ. Microbiol. 61(3): 972-978.

42. Baek K.H., Kim H.S., Oh H.M., Yoon B.D., Kim J., Lee I.S. 2004. Effects of crude oil, oil components, and bioremediation on plant growth. J. Environ. Sci. Health. A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 39(9): 2465-72.

43. Bakker M.I., Koerselman, J.W., Tolls J., Kolloffel C. 2001. Environ. Toxicol. Chem. 20(5): 1112-1116.

44. Barbas J.T., Sigman M.E. and Dabestani R. 1996. Photochemical oxidation of phenanthrene sorbed on silica-gel. Environ. Sci. Technol. 30: 1776-1780.

45. Bateman J.N., B. Speer, L. Feduik and R.A. Hartline. 1986. Naphthalene association and uptake in Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 166(1): 155-161.

46. Becker J.O., and Cook R.J. 1988. Role of siderophores in suppression of Pythium species. Phytopathology. 78: 778-782.

47. Berti W.R., Cunningham S.D. 2000. Phytostabilization of metals. In Phytoremediation of Toxic Metals. Using Plants to clean up the Environment, ed. I. Raskin, B.D. Ensley, pp. 71-88. New York: Wiley.

48. Blaylock M.J., Huang J.W. 2000. Phytoextraction of metals. In Phytoremediation of Toxic Metals. Using Plants to Clean up the Environment, ed. I. Raskin, B.D. Ensley, pp. 53-70. New York: Wiley.

49. Blumer C., Haas D. 2000. Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial cyanide biosynthesis. Arch. Microbiol. 173(3): 170-177.

50. Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. 2000. Degradation and mineralization^ of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1007-1019.

51. Boronin A.M., Filonov A.E., Gayazov R.R., Kulakova-A.N., Mshensky Yu.N. 1993. Growth and plasmid-encoded naphthalene catabolism of Pseudomonas putida in batch culture. FEMS Microbiol. Lett. 113: 303-308.

52. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. 1999. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene-degradation upper pathway from Pseudomonas stutzery AN10. Gene. 236: 149-157.

53. Brodhagen M., Henkels M.D., Loper J.E. 2004. Positive autoregulation and signaling properties of pyoluteorin, an antibiotic produced by the biological control organism Pseudomonasfluorescens Pf-5. Appl. Environ. Microbiol. 70(3): 1758-1766.

54. Bugg T., J.M. Foght, M.A. Pickard and M.R. Gray. 2000; Uptake and active efflux of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens LP6a. Appl. Environ. Microbiol. 66(12): 5387-5392.

55. Burken J.G. 2003. Uptake and metabolism of organic compounds: green-liver model. In Phytoremediation: Transformation and Control of Contaminants, ed. S.C. McCutcheon, J.L. Schnoor, pp. 59-84. New York: Wiley.

56. Cane P.A. and Williams P.A. 1982. The plasmid-coded metabolism of naphthalene and 2-methylnaphthalene in Pseudomonas putida strains: Phenotypic changes correlated with structural modification of the plasmid pWW60-l. J. Gen. Microbiol. 128: 2281-2290.

57. Cheema S.A., Imran K.M., Shen C., Tang X., Farooq M., Chen L., et al. 2010. Degradation of phenanthrene and pyrene in spiked soils by single and combined plants cultivation. J. Hazard. Mater. 177(1-3): 384-389.

58. Collard J.M., Corbisier P., Diels L., Dong Q., Jeanthon C., Mergeay M., et.al. 1994. Plasmids for heavy metal resistance in Alcaligenes eutrophus CH34: mechanisms and applications. FEMS Microbiol. Rev. 14(4): 405-414.

59. Costa R., van Aarle I.M., Mendes R., van Elsas J.D. 2009. Genomics of pyrrolnitrin biosynthetic loci: evidence for conservation and whole-operon mobility within gram-negative bacteria. Environ. Microbiol. 11(1):159-175.

60. Davies J.I. and Evans W.C. 1964. Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonas: The ring-fission mechanism. Biochem. J. 91: 251-261.

61. Dec J., Bollag J.M. 1994. Use of plant material for the decontamination of water polluted with phenols. Biotech. Bioeng. 44: 1132-1139.

62. Delaney Sh., Mavrodi D., Bonsall R., Thomashow L. 2001. phzO, a gene for biosynthesis of 2-hydroxylated phenazine compounds in Pseudomonas aureofaciens 30-84. J. Bacteriol. 183: 318-327.

63. Dennis J.J., Zylstra G.J. 2004. Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4. J. Mol. Biol. 341(3): 753-68.

64. Dong Y.H., Zhang X.F., Xu J.L., Zhang L.H. 2004. Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference. Appl. Environ. Microbiol. 70(2): 954-60.

65. Dua D. and Meera S. 1981. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale. Eur. J. Biochem. 120(3): 461-465.

66. Duffy B., Schouten A. and Raaijmakers J.M. 2003. Pathogen self-defense: mechanisms to counteract microbial antagonism. Annu. Rev. Phytopathol. 41: 501-538.

67. Duffy B.K. and Defago G. 1997. Zinc improves biocontrol of Fusarium crown and root rot by Pseudomonas fluorescens and repress the production of pathogen metabolites inhibitory to bacterial antibiotic biosynthesis. Phytopathology. 87:1250-1257.

68. Duffy D.K. and G. Defago. 1999. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2429-2438.

69. Dunn N.W., Gunsalus I.C. 1973. Transmissible plasmids coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida. J. Bacteriol: 114: 974-97.

70. Dunne C., I. Delaney, A. Fenton, F. O'Gara. 1996. Mechanisms involved in biocontrol by microbial inoculants. Agronomy. 16: 721-729.

71. Eckhardt T. 1978. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid. Plasmid. 1: 584-588.

72. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. 1970. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a Chemostat. Methods in Microbiology. 2: 277-327.

73. Evans W.C., Fernley H.N., and Griffiths E. 1965. Oxidative metabolism of phenanthrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring fission mechanism. Biochem. J. 95: 819-821.

74. Fang C., Radosevich M., Fuhrmann JJ. 2001. Atrazine and phenanthrene degradation in grass rhizosphere soil. Soil Biology and Biochemistry. 33: 671-678.

75. Feist C.F. and Hegeman G.D. 1969. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways. J. Bacteriol. 100(2): 869-877.

76. Fenton A.M., Stephens P.M., Crowley J., O'Callaghan M., O'Gara F. 1992. Exploitation of gene(s) involved in 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis to confer a new biocontrol capability to a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3873-78.

77. Fismes J., C. Perrine-Ganier, P. Empereur-Bissonet and J.L. Morel. 2002. Soil-to-root transfer and translocation of PAHs by vegetables grown on industrial contaminated soils. J. Environ. Qual. 31: 1649-1656.

78. Flether J.S., Hedge R.S. 1995. Release of phenols by perennial plant roots and they potential importance in bioremediation. Chemosphere. 31: 3009-16.

79. Flowers-Geary L., Bleczinki W., Harvey R.G., Penning T.M. 1996. Cytotoxity and mutagenicity of policiclic aromatic hydrocarbon orto-quinones produced by dihydrodiol dehydrogenase. Chem. Biol. Interact. 5: 55-72.

80. Fridlender M., Inbar J., Chet I. 1993. Biological control of soilborne plant pathogens by a p-l,3-glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biology and Biochem. 25: 1211-1221.

81. Fuenmayor S.L., Wild M., Boyes A.L., Williams P. 1998. A gene cluster encoding steps in conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2. J. Bacteriol. 180: 25222530.

82. Gao Y.Z., Zhu L.Z. 2005. Phytoremediation for phenanthrene and pyrene contaminated soils. J. Environ. Sci. 17(1): 14-18.

83. Gerhardt K.E., Huang X.-D., Glick B.R., Greenberg B.M. 2009. Phytoremediation and rhizoremediation of organic soil contaminants; Potential and challenges. Plant Sci. 176: 20-30.

84. Glick B.R. 2003. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotechnol. Adv. 21(5): 383-93.

85. Goldstein R.M., Mallory L.M. and Alexander M. 1985. Reasons for possible failure of inoculation to enhance biodégradation. Appl. Environ. Microbiol. 50: 977-983.

86. Gordon S.A., Weber R.P. 1951. Colorimetric estimation of indole-acetic acid. Plant Physiol. 26: 192-195.

87. Goyal A.K., and Zylstra G.J. 1997. Genetics of naphthalene and phenanthrene degradation by Comamonas teststeroni. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 19: 401-407.

88. Graf W. and Nowak W. 1966. Promotion of growth in lower and higher plants by carcinogenic polycyclic aromatics. Arch. Hyg. Bacteriol. 150: 513-528.

89. Greated A., Thomas C.M. 1999. A pair of PCR primers for Incp-9 plasmids. Microbiology. 145(11): 3003-3004.

90. Greiner R., Haller E., Koniezny U., Jany K.D. 1997. Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena. Arch. Biochemistry and Biophysics. 341: 201-206.

91. Grimm A.C., and Harwood C.S. 1999. NahY, a catabolic plasmid-encoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene. J. Baceriol. 181:3310-3316.

92. Guengerish F.P. 1992. Metabolic activation of carcinogens. Pharmacol. Ther. 54: 17-61.

93. Haas D., and Défago G. 2005. Biological control of soil-born pathogens by fluorescent pseudomonads. Nat. Rev. Microbiol. 3(4): 307-19.

94. Haas D., and Keel C. 2003. Regulation of antibiotic production in root-colonizing Pseudomonas spp. and relevance for biological control of plant disease. Annu. Rev. Phytopathol. 1: 117-53.

95. Habe H., and Omori T. 2003. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria. Biosci. Biotechnol. Biohem. 67(2): 225-243.

96. Hammer P.E., Burd W., Hill S.D., Ligon J.M. and K.-H. van Pée. 1999. Conservation of the pyrrolnitrin gene cluster among six pyrrolnitrin-producing strains. FEMS Microbiol. Lett. 180:39-44.

97. Hegeman G.D: 1966. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by Pseudomonas putida. Synthesis of enzymes by the wild type J. Bacteriol. 91: 1140-1154.

98. Heitzer A. and Sayler G.S. 1993. Monitoring the efficacy of bioremediation. Tibtech. 11 : 334-343.

99. Howell C.R. and R.D. Stipanovic, 1980. Suppression of Pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescence and its antibiotic, pyoluteorin. Phytopathology. 70: 712-715.

100. Howell C.R., Stipanovic R.D. 1979. Control of Rhizoctonia solani on cotton seedlings with Pseudomonas fluorescens and with an antibiotic produced by the bacterium. Phytopathology. 69: 480-82.

101. Hunt M.D., U.H. Neuenschwander, T.P. Delaney, K.B. Weymann, L.B. Friedrich, K.A. Lawton, H.Y. Steiner and J.A. Ryals. 1996. Recent advances in systemic acquired resistance a review. Gene. 7: 89-95.

102. Hutchinson S.L., Schwab A.P., Banks M.K. 2003. Biodégradation of petroleum hydrocarbons in the rhizosphere. In Phytoremediation: Transformation and Control of Contaminants, ed. S.C. McCutcheon, J.L. Schnoor, pp. 355-86. New York: Wiley.

103. Iavicoli A., Boutet E., Buchala A., Metraux J.-P. 2003. Induced systemic resistance in Arabidopsis thaliana in response to root inoculation with Pseudomonas fluorescens CHAO. Mol. Plant Microbe Interact. 16: 851-858.

104. Jijakli M.H. and P. Lepoivre. 1998. Characterization of an exo-beta-l,3-glucanase produced by Pichia anomala strain K, antagonist of Botrytis cinerea on apples. Phytopathology. 88:335-343.

105. Juhasz A.L., Naidu R. 2000. Bioremediation of high molecular weight PAHs: a review of the microbial degradation of benzoa.pyrene. International Biodeterioration and Biodégradation. 45: 57-88.

106. Karlovsky P. 1999. Biological detoxification of fungal toxins and its use in plant breeding, feed and food production. Nat. Toxins. 7(1): 1-23.

107. Kerovuo J., Lauraeus M., Nurminen P., Kalkkinen N., Apajalahti J. 1998. Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2079-2085.

108. Kirner S., P.E. Hammer, D.S. Hill, A. Altmann, I. Fischer, L.J. Weislo, et al. 1998. Functions encoded by pyrrolnitrin biosynthetic genes from Pseudomonas fluorescens. J. Bacteriol. 180(7): 1939-1943.

109. Kishore G.K., Pande S., Podile A.R. 2005. Biological control of collar rot disease with broad-spectrum antifungal bacteria associated with groundnut. Can. J. Microbiol. 51(2): 123132.

110. Kiyohara H., and Nagao K. 1978. The eatabolism of phenantrene and naphthalene by bacteria. J. Gen. Microbiol. 105: 69-75.

111. Kiyohara H., Nagao K., and Nomi R. 1976. Degradation of phenanthrene through o-pthalate by an Aeromonas sp. Agric. Biol. Chem. 40: 1075-1082.

112. Korte F., Kvesitadze G., Ugrekhelidze D., Gordeziani M., Khatisashvili G., et al. 2000. Organic toxicants and plants. Ecotoxicol. Environ. Saf. 47(1): 1-26.

113. Kuhn A., Ballach H.J., Witting R. 2004. Studies in the biodégradation of 5 PAHs (phenanthrene, pyrene, fluoranthene, chrysene und benzo(a)pyrene) in the presence of rooted poplar cuttings. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 11(1): 22-32.

114. Kuiper I., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. 2001. Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. Mol. Plant Microbe Interact. 14: 1197-1205.

115. Laurie A.D., and Lloud-Jones G. 1999. The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon eatabolism. J. Bacteriol. 181:531-540.

116. Leeman M., J.A. van Pelt, F.M. Denouden, M. Heinsbroek, P.A.H.M. Bakker, B. Schippers. 1995. Induction of systemic resistance against Fusarium wilt of radish by lipopolysaccharides of Pseudomonas fluorescens. Phytopathology. 85: 1021-1027.

117. Leong J. 1986. Siderophores: their biochemistry and possible role in the biocontrol of plant pathodens. Ann. Rev. Phytopathol. 24: 187-209.

118. Liste H.H., and Alexander M. 2000. Plant-promoted pyrene degradation in soil. Chemosphere. 40(1): 7-10.

119. Liu H., Dog D., Peng H., Zhang X., Xu Y. 2006. Genetic diversity of phenazine- and pyoluteorin-producing pseudomonads isolated» from green pepper rhizosphere. Arch. Microbiol. 185(2): 91-98.

120. Liu S. and Suflita J.M. 1993. Ecology and evolution of microbial populations for bioremediation. Tibtech. 11: 344-352.

121. Lucy M., Reed E., Glick B.R. 2004. Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria. Antonie van Leeuwenhoek. 86(1): 1-25.

122. Lugtenberg B., Kamilova F. 2009. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu. Rev. Microbiol. 63: 541-556.

123. Lynch J.M., Whipps J.M. 1990. Substrate flow in the rhizosphere. Plant soil. 129: 1-10.

124. Manjula K., Kishore G.K., Podile A.R. 2004. Whole cells of Bacillus subtilis AF 1 proved effective than cell free and chitinase-based formulations in biological control of citrus fruit rot and groundnut rust. Can. J. Microbiol. 50: 737-744.

125. Maurhofer M. 1998. Salicylic acid biosynthetic genes expressed in Pseudomonas fluorescence strain P3 improved the induction of systemic resistance in tobacco against tobacco necrosis virus. Phytopathology. 88: 678-684.

126. Mavrodi D.V., Blankenfeldt W., Thomashow L.S. 2006. Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp. biosynthesis and regulation. Annu. Rev. Phytopathol. 44: 417445.

127. Mavrodi D.V., Bonsall R.F. Delaney S.M., Soule M.J., Phillips G. and L.S. Thomashow. 2001. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAOl. J. Bacteriol. 183(21): 6454-6465.

128. Mavrodi D.Y., Peever T.L., Mavrodi O.V., Parejko J.A., Raaijmakers J.M., Lemanceau P., et al. 2010. Diversity and evolution of the phenazine biosynthesis pathway. Appl. Environ. Microbiol. 76(3): 866-879.

129. Mavrodi O.V., B.B. McSpadden Gardener, D.Y. Mavrodi, R.F. Bonsall, D.M Weller and L.S. Thomashow. 2001. Genetic diversity of pltD from 2,4-diacetylphloroglucinol-producing fluorescent Pseudomonas spp. Phytopathology. 91(1): 35-43.

130. Mergeay M., Nies D:, Schlegel H. G., Gerits J., Charles P., Van Gijsegem F. 1985. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals. J. Bacteriol. 162: 328-334.

131. Messenger A.J. and J.M. Turner. 1983. Phenazine- 1,6-dicarboxylate and its dimethyl ester as precursors of other phenazines in bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 18: 65-68.

132. Miller E.C., Miller J.A. 1981. Searches for ultimate chemical cancirogens and their reactions with cellular macromolecules. Cancer. 47: 2327-2345.

133. Mithaishvili T, Scalla R, Ugrekhelidze D, Tsereteli B, Sadunishvili T, Kvesitadze G. 2005. Degradation of aromatic compounds in plants grown under aseptic conditions. Z Naturforsch. 60(1-2): 97-102.

134. Molla M., and Chowdhury AA. 1984. Microbial mineralization of organic phosphate in soil. Plant Soil. 78: 393-399.

135. Mordukhova E.A., Sokolov S.L., Kochetkov V.V., Kosheleva I.A., Zelenkova N.F., Boronin A.M. 2000. Involvement of naphthalene dioxygenase in indole-3-acetic acid biosynthesis by Pseudomonasputida. FEMS Microbiol. Letters. 190: 279-285.

136. Murashige T., Skoog F. 1962. Revised medium for growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

137. Muratova A., Hübner T., Tischer S., Turkovskaya O., Möder M., Kuschk P. 2003. Plant-rhizosphere-microflora association during phytoremediation of PAH-contaminated soil. Int. J. Phytoremediation. 5(2): 137-151.

138. Muratova A., Pozdnyakova N., Golubev S., Wittenmayer L., Makarov O., Merbach W., Turkovskaya O. 2009. Oxidoreductase activity of Sorghum root exudates in a phenanthrene-contaminated environment. Chemosphere. 74(8): 1031-1036.

139. Nzengung V.A. and Jeffers P. 2001. Sequestration, phytoreduction and phytooxidation of halogenated organic chemicals by aquatic and terrestrial plants. International Journal of Phytoremediation. 3(1): 13-41.

140. Olson P.E., Castro A., Joern M., DuTeau N.M., Pilon-Smits E.A., Reardon K.F. 2007. Comparison of plant families in a greenhouse phytoremediation study on an aged polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil. J. Environ. Qual. 36(5): 1461-1469.

141. Olson P.E., Reardon K.F., Pilon-Smits E.A.H. 2003. Ecology of rhizosphere bioremediation. In Phytoremediation: Transformation and Control of Contaminants, ed. S.C. McCutcheon, J.L. Schnoor, pp. 317-54. New York: Wiley.

142. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. 1988. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii. Phytopathology. 78: 84-88.

143. Park K.S., Sims R.C., Dupont R.R., Doucette W.J., Matthews J.E. 1990. Fate of PAH compounds in two soil types: influence of volatilization, abiotic loss, and biological activity. J. Environ. Toxicol. Chem. 9(2): 187-195.

144. Park W., Jeon C.O., Cadillo H„ DeRito C., Madsen E.L. 2004. Survival of naphthalene-degrading Pseudomonas putida NCIB 9816-4 in naphthalene-amended soils: toxicity of naphthalene and its metabolites. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 429-435.

145. Patten C.L., Glick B.R. 2002. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system. Appl. Environ. Microbiol. 68(8): 3795-3801.

146. Peng R.H., Xiong A.S., Xue Y., Fu X.Y., Gao F., Zhao W., Tian Y.S., Yao Q.H. 2008. Microbial biodégradation of polyaromatic hydrocarbons. FEMS Microbiol. Rev. 32(6): 927-955.

147. Peng R.H., Xu R.R., Fu X.Y., Xiong A.S., Zhao W., Tian Y.S., et al. 2011. Microarray analysis of the phytoremediation and phytosensing of occupational toxicant naphthalene. J. Hazard. Mater. 189(1-2): 19-26.

148. Pepper I.L., T.J. Gentry, D.T. Newly, T.M. Roane and K.L. Josephson. 2002. The role of cell bioaugmentation and gene bioaugmentation in the remediation of co-contaminated soils. Environ. Health Perspectives. 110(12): 943-946.

149. Pfender W.F., J. Kraus, and J.E. Loper. 1993. A genomic region from Pseudomonas fluorescens Pf-5 required for pyrrolnitrin production and inhibition of Pyrenophora tritici-repens in wheat straw. Phytopathology. 83: 1223-1228.

150. Pierson L.S. 3rd, Pierson E.A. 2010. Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of bacteria in the environment and biqtechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 86(6): 1659-1670.

151. Pilon-Smits E. 2005. Phytoremediation. Annu. Rev. Plant Biol. 56:15-39.

152. Price-Whelan A., Dietrich L.E.P., Newman D.K. 2006. Rethinking "secondary" metabolism: physiological roles for phenazine antibiotics. Nature Chemical Biol. 2(2): 71-78.

153. Raaijmakers J., D.W. Weller, L.S. Thomashow. 1997. Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 63: 881-887.

154. Raaijmakers J.M., and D.W. Weiler. 1998. Natural plant protection by 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas spp. in take-all decline soils. Mol. Plant Microbe Interact. 11: 144-152.

155. Raaijmakers J.M., Bonsall R.E. and D.W. Weiler. 1999. Effect of population density of Pseudomonas fluorescens on production of 2,4-diacetylphloroglucinol in the rhizosphere of wheat. Phytopathology. 89: 470-475.

156. Raaijmakers J.M., I. Sluis, M. Koster, P.A.H.M. Bakker. 1995. Utilization of geterologous siderophores and rhizosphere competence of fluorescent Pseudomonas spp. Can. J. Microbiol. 41: 126-135.

157. Ramos J.L, E. Duque, P. Godoy and A. Segura. 1998. Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonasputida DOT-TIE. J. Bacteriol. 180: 3323-3329.

158. Raskin I., Smith R.D., Salt D.E. 1997. Phytoremediation of metals: using plants to remove pollutants from the environment. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 221-26.

159. Reineke W., Jeenes D.J., Williams P.A. and Knakmuss H.J. 1982. TOL plasmid pWWO in constructed halobenzoate degrading Pseudomonas strains: prevention of meta pathway. J. Bacteriol. 150: 195-201.

160. Rodriguez H., Fraga R. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnol. Adv. 17(4-5): 319-39.

161. Rodriguez H., Vessely S., Shah S., Glick B.R. 2008. Effect of a nickel-tolerant ACC deaminase-producing Pseudomonas strain on growth of nontransformed and transgenic canola plants. Curr. Microbiol. 57(2): 170-174.

162. Sacherer P., G. Defago, and D. Haas. 1994. Extracellular protease and phospolipase C are controlled by the global regulatory gene gacK in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescence CHAO. FEMS Microbiol. Lett. 116: 155-160.

163. Salt D.E., Smith R.D., and Raskin I. 1998. Phytoremediation. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 643-668.

164. Sandrin T.R. and Maier R.M. 2003. Impact of metals on biodégradation of organic pollutants. Environ. Health Perspectives. 111(8): 1093-1101.

165. Sanseverino J., Applegate B.M., Henry King J.M. and Saler G.S. 1993. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene, and anthracene. Appl. Environ. Microbiol. 6: 19311937.

166. Scher F.M., J.W. Kloepper and C.A. Singleton. 1985. Chemotaxis of fluorescent Pseudomonas spp. to soybean seed exudates in vitro and in soil. Can. J. Microbiol. 31: 570-574.

167. Schneierson S.S., Amsterdam D., Perlman E. 1960. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa pigment formation by chloramphenicol and erythromycin. Antibiotics and Chemotherapy. 10: 30-33.

168. Sevastsyanovich Y.R., Krasowiak R., Bingle L.E., Haines A.S., Sokolov S.L., Kosheleva I. A., et al. 2008. Diversity of IncP-9 plasmids of Pseudomonas. Microbiology. 154: 2929-2941.

169. Shamsuzzaman K.M. and Barnsley E.A. 1974. The regulation of naphthalene catabolism in pseudomonads. Biochem. Biophys. Res. Communs. 60: 582-587.

170. Siciliano S.D., Germida J.J., Banks K., Greer C.W. 2003. Changes in microbial community composition and function during a polyaromatic hydrocarbon phytoremediation field trial. Appl. Environ. Microbiol. 69(1): 483-489.

171. Simons M., A.J. van der Bij, J. Brand, L.A. de Weger, C.A. Wijffelman, B.J. Lugtenberg. 1996. Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria. Mol. Plant Microbe Interact. 9: 600-607.

172. Simons M., H.P. Permentier, L.A. de Weger, C.A. Wijffelman, BJ.J. Lugtenberg. 1997. Amino acid synthesis is necessary for tomato root colonization by Pseudomonas fluorescence WCS365. Mol. Plant Microbe Interact. 10: 102-106.

173. Sims J.L., Sims R.C., and Matthews J.E. 1990. Approach to bioremediation of contaminated soil. Hazard. Waste Hazard. Mater. 7:117-149.

174. Slininger P.J., and Jackson M.A. 1992. Nutritional factors regulating growth and accumulation of phenazine-l-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 2-79. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37:388-92.

175. Sokhin J., De Leij F.A.A.M., Hart T.D., Lynch J.M. 2001. Effect of copper on degradation of phenanthrene by soil microorganisms. Letters in Appl. Microbiology. 33: 165168.

176. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol Rev. 31(4): 425-448.

177. Springael D., Diels L., Hooyberghs L., Kreps S., Mergeay M. 1993. Construction and characterization of heavy metal-resistant haloaromatic-degrading Alcaligenes eutrophus strains. Appl. Environ. Microbiol. 59: 334-339.

178. Sutherland J.B., Rafll F., Khan A.A. and Cerniglia C.E. 1995. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. In: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals. Willey-Liss, Inc, pp. 269-306.

179. Terry N., Carlson C., Raab T.K., Zayed A.M. 1992. Rates of selenium volatilization among crop species. J. Environ. Qual. 21: 341-44.

180. Thomashow L.S., D.M. Weiler, R.F. Bonsall and L.S. Pierson III. 1990. Production of antibiotic phenazine-1 -carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas species in the rhizosphere of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 56: 908-912.

181. Thomashow L.S., Weller D.M. 1988. Role of phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici. J. Bacteriol. 170: 3499-3508.

182. Tilak K.V.B.R., Ranganayaki N., Pal K.K., De R., Saxena A.K., Nautiyal C.S., et al. 2005. Diversity of plant growth and soil health supporting bacteria. Current Science. 89: 136150.

183. Turner J.M., and A.J. Messenger. 1986. Occurrence, biochemistry and physiology of phenazine pigment production. Adv. Microb. Phisiol. 27: 211-275.

184. Van Rij E.T., Girard G., Lugtenberg B.J., Bloemberg G.V. 2005. Influence of fusaric acid on phenazine-l-carboxamide synthesis and gene expression of Pseudomonas chlororaphis strain PCL1391. Microbiology. 151(8): 2805-14.

185. Van Wees S.C., Van der Ent S., Pieterse C.M. 2008. Plant immune responses triggered by beneficial microbes. Curr. Opin. Plant Biol. 11(4): 443-448.

186. Vessey J.K. 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil. 255: 571-586.

187. Volkering F., Breure A.M., Sterkenburg A. and van Angel J.G. 1992. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons: effect of substrate availability on bacterial growth kinetics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 548-552.

188. Wang S.L., Chang W.T. 1997. Purification and characterization of two Afunctional chitinase/lysozymes extracellulary produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium. Appl. Environ. Microbiol. 63: 380-386.

189. Watanabe T., Kanai R., Kawase T., Tanabe T., Mitsutomi M., Sakuda S., et al. 1999. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution. Microbiology. 145: 3353-3363.

190. Wei G., Kloepper J.W and Tuzun S. 1991. Induction of systemic resistance of cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth promoting rhizobacteria. Phytopathology. 81: 1508-1512.

191. Weisburg W.G., S.M. Barns, D.A. Pelletier, and D.J. Lane. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173: 697-703.

192. Weisman D., Alkio M., Colon-Carmona A. 2010. Transcriptional responses to polycyclic aromatic hydrocarbon-induced stress in Arabidopsis thaliana reveal the involvement of hormone and defense signaling pathways. BMC Plant Biol. 10: 59.

193. Whistler C.A. and L.S. Pierson III. 2003. Repression of phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens 30-84 strain by RpeA. J. Bacteriol. 185(13): 3718-3725.

194. Wild E., Dent J., Thomas G.O., Jones K.C. 2005. Direct observation of organic contaminant uptake, storage, and metabolism within plant roots. Environ. Sci. Technol. 39(10): 3695-702.

195. Williams P.A., Worsey M.J. 1976. Ubiquity of plasmids in coding for toluene and xylene metabolism in soil bacteria: evidence for soil existence of new TOL plasmids. J. Bacteriol. 125(3): 818-823.

196. Wilson M.S., C. Bakermans, E.L. Madsen. 1999. In situ, real-time catabolic gene expression: extraction and characterization of naphthalene dioxygenase mRNA transcripts from groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 65: 80-87.

197. Woodward A.W., Bartel B. 2005. Auxin: regulation, action and interaction. Ann. Bot. (Lond). 95(5): 707-35.

198. Xu S.Y., Chen Y.X., Wu W.X., Wang K.X., Lin Q., Liang X.Q. 2006. Enhanced dissipation of phenanthrene and pyrene in spiked soils by combined plants cultivation. Sci. Total Environ. 363(1-3): 206-215.

199. Xue W., Warshawsky D. 2005. Metabolic activation of polycyclic and heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage: a review. Toxicol. Appl. Pharmacol. 206(1): 73-93.

200. Yee D.C., Maynard J.A., and Wood T.K. 1998. Rhizoremediation of trichloroethylene by a recombinant, root-colonizing Pseudomonas fluorescens strain expressing toluene ortho-monooxygenase constitutively. Appl. Environ. Microbiol. 64: 112-118.

201. Yen K., Cerdar C. 1988. Genetics of naphthalene metabolism in Pseudomonas. Crit. Pev. Microbiol. 5(3): 247-268.

202. Zhang Y., Fernando W.G., Kievit T.R., Berry C., Daayf F., Paulitz T.C. 2006. Detection of antibiotic-related genes from bacterial biocontrol agent with polymerase chain reaction. Can. J. Microbiol. 52(5): 476-481.

203. Zylstra G.J., Kim E., Goyal A.K. 1997. Comparative molecular analysis of genes for polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. Genet. Eng. 19: 257-269.

Информация о работе

Анохина, Татьяна Орестовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы