Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. Ломоносова Биологический факультет

УУ4613901

ВЕТРОВА АННА АНДРИЯНОВНА

БИОДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ-ДЕСТРУКТОРАМИ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва - 2010

004613901

Работа выполнена в Пущинском государственном университете на базе лаборатории биологии плазмид Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Филонов Андрей Евгеньевич

член-корр. РАН, профессор, доктор биологических наук, Ившина Ирина Борисовна

кандидат биологических наук, Ермакова Инна Тихоновна Ведущая организация: Институт микробиологии имени С.Н.

Виноградского РАН, Москва

Защита диссертации состоится « Ч' г. в ^Г"часов на

заседании Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «. & 010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, /

кандидат биологических наук - Н.Ф. Пискункова

Актуальность темы

Миллионы тонн жидких и твердых отходов ежегодно образуются в результате деятельности нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировке нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятки лет (Оборин и др., 1988).

Способность микроорганизмов к трансформации или деградации углеводородов нефти хорошо известна и позволяет использовать их для биоремедиадии загрязнённых территорий. Имеются два подхода, основанные на использовании эндогенных или интродуцируемых микроорганизмов б местах загрязнения.

В большинстве случаев в основе биотехнологий очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов используются биопрепараты, которые содержат жизнеспособные клетки как отдельных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов («Путидойл», «Олеворин»), так и бактериальный консорциум («Деворойл»). Патентный поиск существующих в настоящее время биопрепаратов показал, что основными их недостатками являются: большое количество микроорганизмов в их составе; часто бактерии, входящие в биопрепарат, являются представителями одного рода; узкий диапазон рН и температур; неспособность микроорганизмов продуцировать биоэмульгаторы; малая эффективность деградации высоких концентраций нефти и нефтепродуктов; отсутствие катаболических плазмид в клетках микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Плазмиды играют важную роль в адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды. Эти генетические детерминанты позволяют содержащим их микроорганизмам катаболизировать устойчивые в окружающей среде соединения, например, ароматические углеводороды, которые неспособны разлагать большинство известных микроорганизмов. Известно, что интродукция микроорганизмов - потенциальных доноров плазмид биодеградации ароматических углеводородов, может интенсифицировать процессы очистки и, кроме того, повышать биодеградативный потенциал микробных популяций в местах, загрязненных полициклическими ароматическими соединениями, путем передачи плазмид и генов биодеградации в эндогенные микроорганизмы (Ахметов, 2006).

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование биодеградации углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами и разработка микробного консорциума как основы биопрепарата для очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) сравнить изменение численности микроорганизмов, содержащих плазмиды биодеградации ароматических углеводородов, и их бесплазмидных вариантов в

1

процессе деструкции нефти, а также оценить степень деградации нефти исследуемыми бактериями в лабораторных условиях;

2) провести отбор наиболее эффективных плазмидосодержащих штаммов-деструкторов углеводородов нефти, обладающих способностью к деградации высоких концентраций нефти и нефтепродуктов (до 30%) в присутствии соли (до 5% NaCI) в широком температурном диапазоне (4-42°С) при pH от 4 до 10; а также, образующих биоэмульгаторы;

3) составить микробный консорциум из отобранных штаммов, обладающих вышеперечисленными свойствами, для эффективной очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов;

4) сравнить эффективность деструкции нефти составленной микробной ассоциацией с ранее разработанными коммерческими биопрепаратами в лабораторных и полевых условиях.

Научная новизна

Впервые продемонстрировано, что присутствие катаболических плазмид в штаммах-деструкторах увеличивает степень деградации нефти, и способствует приросту биомассы плазмидосодержащих штаммов по сравнению с системами инокулированными бесплазмидными бактериями. Полученные результаты показывают, что важным аспектом катаболического потенциала микроорганизмов в процессе деструкции нефти является комбинация «бактериальный хозяин - плазмида».

Интродукция микроорганизмов, содержащих плазмиды биодеградации, интенсифицирует процессы очистки, повышает численность и биодеградативный потенциал микробных популяций нефтезагрязненных сайтов.

Создана микробная ассоциация «ВиО» как основа биопрепарата для биоремедиации почвенных и водных экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, состоящая из штаммов-деструкторов родов Rhodococcus, Pseudomonas и Acinetobacter, содержащих катаболические плазмиды. Бактерии этого микробного консорциума способны к деградации углеводородов нефти при концентрации до 30% в температурном диапазоне 4 - 42°С в присутствии 5% соли при pH от 4 до 10.

Научно-практическая значимость работы

На основании . скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН и коллекции бактерий ЗАО «Биоойл» были отобраны и охарактеризованы бактерии, которые вошли в состав микробной ассоциации «ВиО», способной эффективно деградировать углеводороды нефти. В качестве критериев отбора штаммов-деструкторов были выбраны свойства: способность к деградации нефти и нефтепродуктов (концентрация до 30%) в присутствии соли (до 5% NaCI) в широком температурном диапазоне (4-42*С) при pH от 4 до 10; присутствие в штаммах катаболических плазмид; синтез биоэмульгаторов. Комбинация вышеперечисленных свойств, наиболее важных для эффективной деградации углеводородов нефти, не присутствует ни в одном из известных биопрепаратов.

В условиях лабораторных экспериментов показана более высокая эффективность созданного микробного консорциума для очистки почвенных и

водных экосистем от нефти и нефтепродуктов в сравнении с биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл».

Преимущество ассоциации «ВиО» также заключалось в увеличении скорости утилизации нефтяных загрязнений. Эффективность опытного образца биопрепарата микробной ассоциации «ВиО» в полевых испытаниях по очистке грунта от нефти на территории Пограничного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа составила 80% в течение периода с июня по август 2008 г., что превысило показатели, полученные при использовании биопрепаратов ЗАО «Биоойл».

Получены положительные заключения ЗАО «Биоойл» и ООО «Газпромнефть-Ноябрьскнефтегаз» об эффективности деградации нефти ассоциацией «ВиО» в полевых испытаниях. Кроме того, эффективность деградации нефти и нефтепродуктов микробным консорциумом «ВиО» продемонстрирована в лабораторных испытаниях ООО «Газпромнефть-Восток» и ООО «Сибнефть Восток».

Подготовлена заявка на патент РФ «Способ очистки водоемов и почв от нефти и нефтепродуктов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов». Подана патентная заявка № 2010121688 «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами».

Апробация работы

Материалы Материалы диссертации докладывались на 18 конференциях: Биология-наука 21 века, 10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных, 17-21 апреля 2006, Пущино; Школа-конференция «Современная биотехнология — защите окружающей среды», 12 сентября, 2006, Пущино; Forth International Conference on Science and Business, 15-18 October, 2007, Pushchino; Школа-семинар «Современные наукоемкие технологии: от идеи к внедрению» 29 октября - 4 ноября, 2007, Белгород; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 7-11 апреля 2008, Москва; ISTC Workshop at the International Conference on Contamination Soil, ConSoil, Milan, Italy, 3-6 June, 2008; XII Internetional Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, 5-9 August 2008, Istanbul; III International Conference on Microbial Diversity, 28 September - 05 October 2008, Perm; Fifth international conference «Science and Training for Biosafety», 6-9 October, 2008, Pushchino; Международная школа-конференция, посвященная 40-летию создания ГосНИИгенетика, 21-24 октября, 2008, Москва - Пущино; Биология-наука 21 века, 12-я Пущинская школа-конференция молодых учёных, 10-14 ноября, 2008, Пущино; Российский молодежный инновационный конвент. 9-10 декабря 2008, Москва; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 13 - 18 апреля, 2009, Москва; Системная биология ПНЦ РАН апрель 2009, Пущино; 3rd Congress of European Microbiologists «Microbes and Man - Interdependence and Future Challenges», June 28 - July 2, 2009, Gothenburg, Sweden; Современные биоаналитические системы, методы и технологии. 26-30 октября 2009, Пущино-Тула; ISTC Workshop at the International Conference on Contamination Soil, ConSoil Austria, 21-25 September, 2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 5 статей, заявка на получение патента РФ на изобретение и 18 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 25 таблиц и 42 рисунка. Библиография насчитывает 255 наименований, из них 109 отечественных и 146 зарубежных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использовали 60 штаммов микроорганизмов из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина г. Пущине и 10 бактериальных штаммов из коллекции коммерческой фирмы ЗАО «Биоойл», выделенных из территорий загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Среды. В качестве полноценной среды использовали среды Лурия-Бертани (ЛБ, Carhart, Hegeman, 1975) и Кинга Б (КБ, King et al., 1954), в качестве минеральной - среду Эванса (Evans, 1970).

Культивирование штаммов проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл минеральной среды Эванса с добавлением нефти или дизельного топлива до конечной концентрации 2%, 10%, 15%, 20%, 30% или 40% весовых (по объёму). Инокулирование колб проводили суспензией микроорганизмов (посевная доза 1-5x107 кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и выращивали микроорганизмы в течение 7-30 суток при 24°С и в течение 10-30 суток при 4°С.

Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике (Francy et al., 1991) по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта культуры, выращенной на среде с гексадеканом, согласно методике (Cirigliano et al., 1984).

Индекс эмульгировапия определяли по методике, описанной в работе (Cooper and Goldenberg, 1987).

Определение эффективности очистки нефтезагрязиениых систем.

1) Деградацию нефти исследуемыми штаммами оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия) (Другое и Родин, 2007).

2) Для определения общего содержания углеводородов нефти использовали метод ИК-спектроскопии. Подготовку, анализ и измерение водных и почвенных образцов проводили в соответствии с методическими указаниями «Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометричесим методом» (ГОСТ Р 8.563-96) и «Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии» (МУК 4.1.1956-05).

Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly,

1978).

Коньюгационный перенос плазмид осуществляли, используя метод Данна и Гонзалеса (Dunn, Gunsalus, 1973).

Элиминацию плазмид осуществляли путем длительного культивирования в богатой среде ЛБ. Отбирали колонии по отсутствию роста на среде Эванса с добавлением в качестве источников углерода и энергии нафталина или гексадекана.

Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле по стандартной методике (Sambrook et al., 1989).

Определение влагоемкости почвы проводили согласно методике, описанной Вадюниной и Корчагиной, 1986.

Определение рН почвы в соответствии с методикой ГОСТ 26423-85.

Для приготовления модельных почвенных систем использовали лугово-аллювиальную почву, взятую у р. Ока вблизи г. Пущино Московской области. Перед использованием почву просеивали через сито с диаметром отверстий 2,0 мм. Для приготовления стерильных модельных систем почву трижды стерилизовали (1 атм. 30 мин при 121°С) с интервалом в 1 сутки. Затем навеску почвы массой 0,5 кг тщательно перемешивали с нефтью (10 г). Приготовленную таким образом почву с пефтъю помещали в пластиковые контейнеры (толщина слоя почвы 10 см). Модельные почвенные системы инкубировали при температуре 18-25°С.

Внесение инокулята в почву. Бактерии выращивали в жидкой среде ЛБ до конца экспоненциальной фазы роста (1x109 кл/мл среды). Затем, используя стандарт мутности, суспензию бактерий разводили фосфатным буфером до концентрации 1-5x108 кл/мл. Количество вносимой бактериальной суспензии рассчитывали так, чтобы конечная концентрация составляла 5х106 микроорганизмов на 1 г сухой почвы. Повторные инокуляции проводили через две недели.

В качестве биогенных источников азота, фосфора и калия

использовали минеральное удобрение «Нитроаммофоска» (ООО «Фаско+», Россия), которое вносили в количестве 1,5 г на 1 кг почвы.

Отбор проб в модельных почвенных системах. Для определения общей численности микроорганизмов и содержания нефти отбирали усредненные пробы (1 г и 5 г, соответственно) из 3-4 разных участков почвы. Пробы весом 1 г суспендировали в 9 мл фосфатного буфера и перемешивали на миксере "Paramix 2" (Германия) в течении 1 минуты при комнатной температуре и после соответствующих стандартных разведений высевали на соответствующие агаризованные среды.

Мониторинг штаммов в почве осуществляли по культурально-морфологическим признакам, маркерам антибиотикорезистентности и флюоресценции под ультрафиолетом на агаризованпой среде КБ.

Условия полевого эксперимента. Полевые испытания проводились на территории Ямало-Ненецкого автономного округа, на участках Пограничного нефтяного месторождения в период с июня по август 2008 г. В качестве дополнительных питательных веществ вносили минеральные удобрения -мочевину (150 кг/га). Для определения степени восстановления физико-

химических характеристик почвы, ранее загрязненной сырой нефтью, в результате естественных разливов, использовали смесь ячменя и многолетних трав в качестве биоиндикатора. Уровень начального загрязнения грунта нефтью составлял 15 - 110 г нефти на 1 кг почвы. Площадь загрязненного участка составляла 0,826 га.

Отбор проб в полевом эксперименте. Среднюю смешанную пробу составляли из 2 - 3 десятков первоначальных проб (50-100г). Отбирали по 3 средние смешанные пробы с участка площадью 0,33 га. Отбор проводили с учетом вертикальной структуры, неоднородности покрова почвы, рельефа и климата местности, а также учитывали особенности свойств загрязнителя. Пробы отбирали с условием, чтобы в каждом случае проба являлась типичной для данной точки отбора. Пробы, отобранные для проведения химического анализа, упаковывали в емкости из химически нейтрального материала.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Биодеградацкя углеводородов нефти плазмндосодержащими микроорганизмами по сравнению с бесплазмидными вариантами.

Описано много примеров участия плазмидных генов в деградации углеводородов, в том числе короткоцепочечных алканов, замещенных и незамещенных ароматических углеводородов и других ксенобиотиков (Sayler, 1990; Wallace et.al., 1992; Harayama et.ai., 1990). Ароматические соединения обычно составляют 10 - 30% углеводородов нефти, однако они являются наиболее токсичными и трудноразлагаемыми компонентами данного загрязнителя. На первом этапе работы проводили оценку эффективности деградации нефти штаммами-деструкторами рода Pseudomonas, содержащими плазмиды биодеградации ароматических соединений, по сравнению с бесплазмидными вариантами тех же бактерий.

Деградацию нефти исследованными штаммами оценивали по суммарному показателю её убыли в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия). При оценке

эффективности процесса деградации через 7 суток было выявлено, что наличие плазмиды деградации нафталина pBS216 в штамме Р. chlororaphis PCL 1391 приводило к существенному увеличению (в 10 раз) Рис. 1. Степень деструкции нефти степени деструкции нефти по природными плазмндосодержащими сравнению с бесплазмидным

штаммами и их бесплазмидными микроорганизмом, в то время как вариантами за 7 суток роста при 24° С. наличие плазмид pOV17 и

(плазмида pNF142::TnAtoi-OTc обозначена как рМ)

pNF i 42:: TaMod-OTc в этом же штамме не оказывало такого значительного эффекта (Рис. 1). Известно, что плазмиды pBS216 и pOV17 структурно

аналогичны, но существенно отличаются уровнем активности катехол-2,3-

диоксигеназы (АпокЫпа е!.а1., 2006). Гены, кодирующие данный фермент, часто

имеют плазмидную локализацию, что может влиять на эффективность

деградации нефти одним и тем же бактериальным хозяином, несущим

различные плазмиды. Полученные результаты показывают, что важным

аспектом катаболического потенциала микроорганизмов в процессе деструкции

нефти является комбинация «бактериальный хозяин - плазмида». Присутствие

плазмиды рВ81141 в штамме Р. риНскл ВБ3701 также приводило к увеличению

(в 4 раза) убыли углеводородов нефти по сравнению с элиминантом В53701Е.

Как видно из данных рисунка 2,

плазмидосодержащие бактерии имели

больший прирост биомассы клеток при

росте на нефти по сравнению с

бесплазмидными микроорганизмами.

Наличие плазмидных генов

биодеградации расширяет спектр

утилизируемых субстратов бактерии-

хозяина, что подтверждалось

способностью утилизировать различные

ароматические углеводороды

(нафталин, фенантрен и т.д.)

плазмидосодержащими бактериями по Рис. 2. Отношение конечной численности с

сравнению с бесплазмидными микроорганизмов к исходной концентрации 1

клеток через 7 суток. штаммами. Например, нафталин

диоксигеназа, кодируемая генами, входящими в состав плазмиды биодеградации нафталина, катализирует порядка 76 реакций, (реакции диоксигенирования, монооксигенирования, дегидратации, О- и Ы- деалкилирования и сульфоокисления).

При сравнительном изучении влияния плазмид биодеградации нафталина на изменение фракционного состава в остаточном количестве нефти было обнаружено увеличение степени деструкции гексановой, бензольной и бензольно-спиртовой фракций, по сравнению с результатами, полученными при использовании бесплазмидных штаммов. Наибольшая деструкция парафинонафтеновых, моно- и полиароматических углеводородов, асфальтенов и смол обнаружена в образце со штаммом Р. сМогогарЫв РСЬ1391(рВБ216), где степень деградации трех фракций составила 38%, 31% и 26%,

соответственно, что обусловило наивысший показатель степени деструкции нефти (47,7%) в данном эксперименте.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наличие плазмид биодеградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в штаммах-хозяевах приводит к увеличению степени деструкции нефти этими микроорганизмами и приросту биомассы клеток бактерий по сравнению с их бесплазмидными вариантами. Результаты, полученные в аналогичных экспериментах, со штаммами, содержащими плазмиды деградации толуола или камфары, также показали преимущество плазмидосодержащих

микроорганизмов в процессе деградации нефти по сравнению с элиминатами данных бактерий.

Изучение процесса биодеградации нефти плазмидосодержащими штаммами-деструкторами по сравнению с бесплазмидными бактериями проводили также в модельных стерильных и нестерильных почвенных системах (микрокосмах) в течение 8 недель. Микрокосмы инокулировали следующими штаммами микроорганизмов рода Pseudomonas: BS3701(pBSl 141, pBS1142), BS3701 E(pBS 1142) - элиминант, PCL1391 - бесплазмидный штамм, PCL1391(pOV17) и PCL1391(pBS216). Для оценки испарения и абиотической деградации нефти использовали стерильную почву (микрокосм 1). Вклад аборигенных микроорганизмов в деградацию оценивали по убыли нефти в нестерильной почвенной системе (микрокосм 2). Исследование популяционной динамики интродуцированных и аборигенных микроорганизмов проводили в микрокосмах 8 - 12. Исследование популяционной динамики интродуцированных бактерий проводили в микрокосмах 3-7.

Таблица 1.

Модельные почвенные эксперименты с добавлением минерального удобрения во все микрокосмы ___

№ микрокосма Эксперимент со стерильной почвой № микрокосма Эксперимент с нестерильной почвой

1 контроль без микроорганизмов 2 контроль с аборигенными бактериями

3 PCL 1391 8 PCL 1391

4 PCL 1391(pOV17) 9 PCL 1391(pOV17)

5 PCL 1391(pBS216) 10 PCL 1391(pBS216)

6 BS3701E(pBS1142) 11 BS3701E(pBS1142)

7 BS3701(pBSI141, pBSl 142) 12 BS3701(pBSl 141, pBSl 142)

Определение числа КОЕ показало, что исходная концентрация нефтедеструкторов в почве была 5,23* 103 КОЕ/г сухой почвы, при общей численности гетеротрофов - 4,87*106 КОЕ/г сухой почвы. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов к концу эксперимента в контрольной системе (нестерильной почве с аборигенными микроорганизмами) составила 9,43x105 КОЕ/г сухой почвы, а общее число гетеротрофов - 3,81x10 КОЕ/г сухой почвы. Таким образом, количество бактерий-деструкторов углеводородов нефти увеличилось на 2 порядка, а титр общего числа гетеротрофов остался практически на том же уровне к концу эксперимента.

Исходная концентрация внесенных микроорганизмов составляла 5x106 бактерий в 1 г сухой почвы. Титр интродуцированных плазмидосодержащих штаммов к концу эксперимента увеличился приблизительно на 1 порядок относительно исходной численности клеток. Причем в нестерильных системах разница между исходным и конечным количеством интродуцированных плазмидосодержащих бактерий была на 0,5 порядка выше, чем в стерильных микрокосмах. Через 8 недель численность бесплазмидных микроорганизмов в нестерильных условиях была практически сопоставима с исходным титром клеток, такой же эффект наблюдался и в стерильной почве. Таким образом, наличие плазмидных генов биодеградации ароматических соединений

обеспечивает преимущество в приросте биомассы плазмидосодержащих штаммов по сравнению с их бесплазмидными вариантами.

При оценке динамики численности микроорганизмов в нестерильной почве было выявлено, что количество плазмидосодержащих бактерий превышало численность бесплазмидных микроорганизмов на 12-22 % от общего числа гетеротрофов. Результаты определения общего титра углеводородокисляющих микроорганизмов в нестерильной почве показали, что численность нефтедеструкторов в системах с интродуцированными длазмидосодержащими штаммами на 1 порядок выше, по сравнению с системами, инокулированными бесплазмидными вариантами бактерий. Это позволяет предположить наличие процессов переноса генов катаболических плазмид, способствующего адаптации почвенных бактерий к изменяющимся условиям среды (Brokamp and Schmidt, 1991).

Как видно из данных рисунка ЗА, в процессе деградации нефти в стерильной почвенной системе наблюдался значительный эффект при внесении плазмидосодержащих штаммов BS3701(pBS1141, pBS1142), PCL1391(pOV17) и PCL1391(pBS216) и минерального удобрения (нитроаммофоски).

А Б

Рис. 3. Степень деградации нефти в стерильной (А) и нестерильной (Б) почве через 8

недель

В нестерильной почве степень деградации нефти интродуцированными плазмидосодержащими микроорганизмами была выше по сравнению со стерильной почвой, инокулированной теми же бактериями (рис. ЗБ). Данный факт можно объяснить наличием и активностью аборигенных микроорганизмов в почве, возможным горизонтальным переносом плазмид между интродуцированными плазмидосодержащими микроорганизмами и аборигенными бактериями, что ранее было описано в работах (Тор et.al., 1999; Ахметов с соавт., 2006). Ранее было показано, что интродукция ассоциации микроорганизмов, включающих плазмидосодержащие штаммы, ускоряет процессы деградации 11АУ (Пунтус с соавт., 2008) и нефти (Filonov et.al., 2007) в почве. Однако в этих работах не проводилось сравнения степени деструкции с бесплазмидными вариантами исследуемых штаммов. В результате проведённых нами модельных почвенных экспериментов установлено, что при интродукции плазмидосодержащих микроорганизмов степень деструкции

нефти увеличивалась в 2 - 3 раза, по сравнению с интродукцией бесплазмидных штаммов.

Таким образом, в лабораторных условиях было показано, что использование плазмидосодержащих микроорганизмов в процессе очистки нефтезагрязненных систем способствует приросту биомассы бактерий и увеличению степени деградации нефти по сравнению с бесплазмидными бактериями. Обобщая результаты, полученные на первом этапе, представляется целесообразным использование в составе биопрепаратов для очистки окружающей среды от нефти микроорганизмы-деструкторы, содержащие плазмиды биодеградации ароматических соединений.

2. Биодеструкция нефти наиболее активными штаммами-нефтедеструкторами и составление ассоциации плазмидосодержащих бактерий для биодеградации нефти и нефтепродуктов

Известно, что при применении ассоциаций микроорганизмов биодеградация нефти происходит более эффективно и за меньшие сроки, чем при использовании индивидуальных бактерий (Сидоренко, 2002). Этот факт можно объяснить тем, что, обладая разными ферментными системами, при совместном действии микроорганизмы, входящие в состав ассоциации способны деградировать углеводороды с большей эффективностью. Для составления эффективной микробной ассоциации для биоремедиации нефтезагрязненных территорий были исследованы 7 штаммов микроорганизмов из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН и 10 бактерий из коллекции коммерческой фирмы ЗАО «Биоойл».

Все исследуемые микроорганизмы были способны к росту на нефти, дизельном топливе, мазуте. Использование нафталина или салицилата в качестве единственного источника углерода и энергии было обнаружено у штаммов 142ОТ и Б701. Штаммы Б25, Б67, Р701, 5 и 1В обладали способностью использовать толуол в качестве единственного источника углерода и энергии. Деструкция декана, нонана, гексадекана не была выявлена у микроорганизмов 1 А, 142№ и Р701. Разрушение бензоата было обнаружено у штаммов бактерий 867, Х5, Х25, 142ОТ и Р701. Приведенные данные иллюстрируют избирательную способность изученных штаммов-деструкторов к деградации различных углеводородов, что необходимо для составления эффективных ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов. Исследуемые бактерии были проверены на устойчивость к различным антибиотикам, что необходимо для мониторинга отдельных штаммов в составе смешанной популяции.

Устойчивость к 5% морской соли при загрязнении жидкой минеральной среды 2% дизельного топлива была выявлена у всех 17 бактерий. Причем, штаммы 142ОТ и 2В утилизировали дизельное топливо в присутствии 7% соли, а микроорганизм Х5 - 10%. Кроме того, штаммы из коллекции лаборатории биологии плазмид способны деградировать дизельное топливо в диапазоне рН среды 5-7, причем микроорганизмы 825, 826 и Р701 устойчивы к рН 8. Практически все бактерии из коллекции ЗАО «Биоойл», за исключением штаммов 2С, 3, 4 и 5, были способны к росту в жидкой минеральной среде, загрязненной 2% нефтепродуктов (дизельное топливо) в диапазоне рН 5 - 9.

10

Для микроорганизмов 1В, 2 А, 6 и 7, из данной коллекции, наблюдался рост при более кислых (рН 4) и более щелочных (рН 10) показателях рН. Почти все изучаемые микроорганизмы способны деградировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо) (2%) в температурном диапазоне 4-30 °С, кроме штаммов 4, 2В и 2С, которые росли при температуре 14 - 30°С. Разрушение загрязнителя (нефть или дизельное топливо) при температуре 42°С было выявлено у штаммов бактерий Р701, 1В, 6, 7, Б26 и 825.

Была проведена оценка роста бактерий в жидкой минеральной среде Эванса с добавлением различных концентрации нефти при температурах 24°С и 4 °С. При росте микроорганизмов в жидкой минеральной среде при температуре 24СС в течение 10 суток с концентрацией нефти 40% наилучшие показатели были отмечены только у штаммов Б25, 826, 1В, 6 и Р701, а при 4°С в аналогичных условиях наилучший рост был отмечен только у микроорганизма 826. Бактерии 825, Э26, 1В, 6, Р701, Х25 и 7 минерализуют нефть в концентрации 30% при комнатной температуре, а штаммы 7, 6 и Б26 деградируют аналогичную концентрацию нефти и при 4°С. В условиях культивирования микроорганизмов в жидкой минеральной среде с дизельным топливом в концентрации 40% и с добавлением 3% морской соли при температуре 24°С наилучшие результаты были получены для штаммов Р701,1В, 826, 2С и 6, а при 4 °С микроорганизмы 1В и 826 были способны к росту в данных условиях. Бактерии Р701, 1В, Б26, 2С, 7 и 6 минерализовали дизельное топливо при его концентрации 30% в присутствии 3% морской соли при 24°С, а в аналогичных условиях при пониженной положительной температуре деструкция дизельного топлива наблюдалась у штаммов Р701, 1В, 826, 7 и 6.

Таким образом, микроорганизмы 826, 825, Х25, 2С, 1В, 6, Р701, 7 минерализовали высокие концентрации нефти и нефтепродуктов (до 30%) в присутствии 3% морской соли в диапазоне температур 4 - 42°С и рН 4-10. Это предполагает возможность их использования в засоленных природных условиях (например, на территории нефтеразлива, где кроме нефти присутствуют минерализованные пластовые воды). В связи с тем, что нередко встречаются кислые почвы, требующие очистки от нефтяных загрязнений (ветшеП, ЮитЫ, 2000), выявленная у исследуемых штаммов способность к деструкции нефтяных углеводородов в кислой среде может использоваться для биоремедиации нефтязагрязненных объектов, характеризующихся повышенной кислотностью.

Одной из причин высокой устойчивости нефтепродуктов в окружающей среде является их ограниченная растворимость в воде. Поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации. Однако известно, что при культивировании в минеральных средах с использованием в качестве источника углерода и энергии различных нефтепродуктов, некоторые микроорганизмы синтезируют биоэмульгаторы, повышающие биодоступность углеводородов (Ившина, 1993). Рассматривая физиологическое значение биосурфактаптов, важно подчеркнуть, что они продуцируются широким спектром микроорганизмов, их молекулы имеют различную химическую структуру и физико-химические свойства. Были обнаружены биосурфактанты экзо-типа, не связанные с клсточпой стенкой,

11

выделяемые штаммами 2В, Б26, 867,142ЫР, Х25, Р701 и 5 (Табл.2). Остальные исследованные в данной работе микроорганизмы-деструкторы, синтезировали биоэмульгаторы, относящиеся к эндо-типу и в результате оптическая плотность культуральной жидкости после центрифугирования в присутствии гексадекана была низкой, поскольку продуцируемые ими биоэмульгаторы были связаны с клеточной стенкой. Разные типы биосурфактантов играют различную роль в физиологии продуцирующих их микроорганизмов. Вполне вероятно, что одни биосурфактанты могут обеспечивать преимущество их продуцентов в трофических цепях определенной экологической ниши, тогда как другой тип биоэмульгаторов может способствовать увеличению эффективности защитных механизмов в лимитированных или экстремальных условиях (Воёоиг, 2003). Известно, что существует возможность передачи высокомолекулярных биоэмульгаторов от представителя одного бактериального вида или даже рода к другому, что имеет большое значение в природных микробных сообществах.

Таблица 2.

Эмульгирующая активность микроорганизмов при 24°С._

Штамм Поверхностная активность Индекс эмульгирования, % через 24 часа

Визуально Оттгическая плотность супсрнагата, при Х=540нм

1А 3 0,03 21,8

Acinetobacter baumannii 1В 3 0,03 •16,7

2А 4 0,08 10,9

2В 4 1,01 10,6

2С 2 0,01 17,0

3 4 0,04 14,6

4 1 0,01 1,8

5 4 0,71 22,8

Serratia sp. 6 1 0,01 10,5

Acinetobacter baumannii 7 3 0,05 51,3

Rhodococcus sp. X5 4 0,167 43,2

Rhodococcus sp. X25 4 0,640 21,3

Rhodococcus sp. S25 4 0,135 8,8

Rhodococcus erythropolis S26 4 2,280 - - 47,4

Rhodococcus sp. S67 3 1,663 '47,5 . •

Pseudomonas sp. 142NF 4 1,590 2,5

Pseudomonas putida F701 4 1,033 50,1

При определении индекса эмульгирования, который выражался в процентном соотношении высоты эмульгированного слоя к общей высоте жидкости в пробирке, были выявлены штаммы, продуцирующие наибольшее количество биологических поверхностно-активных веществ: 1В, 7, Х5, 826, 867 и Р701 (Табл. 2). Поскольку углеводородокисляющие микроорганизмы растут на границе раздела фаз «углеводород/вода», синтез эмульгаторов при высокой клеточной плотности увеличивает площадь поверхности углеводородных капель, создавая оптимальные условия питания для большего числа бактерий. В то же время, при использовании такого сложного субстрата, как нефть, по окончании процесса ферментативного окисления её легкодеградируемых

фракций наличие эмульгатора позволяет бактериям, отсоединяться от «использованной» нефтяной капли и переходить к «свежему» субстрату (Ron, Rosenberg, 2001).

После определения основных физиолого-морфологических характеристик штаммов, была проведена идентификация наиболее активных микроорганизмов-нефтедеструкторов (Табл. 2 колонка 1).

Нефть и нефтепродукты являются сложными, многокомпонентными загрязнителями окружающей среды, содержащими несколько сотен различных химических соединений. Нефтедеградирующую активность исследованных микроорганизмов оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом. При биодеструкции нефти происходит не только количественное (уменьшение содержания нефти), но и качественное изменения (изменение фракционного состава). Т.е. наблюдается избирательная деградация или трансформация отдельных компонентов нефти микроорганизмами. Применение фракционирования на силикагеле позволяет разделить остаточную нефть на три условные фракции: гексановая - содержит парафинонафтеновые и ароматические углеводороды, бензольная -полициклические ароматические углеводороды; спирто-бензольная нафтеновые кислоты, спирто-бензольные смолы (Сафонова, 1984).

Наибольшая убыль гексановой фракции при температуре 24 °С наблюдалась у штаммов Rhodococcus erytropolis S26, Rhodococcus sp. S25, Serratia sp. 6 и Acinetobacter baumannii 7. В этих же условиях бактерии Acinetobacter baumannii 1В и Pseudomonas putida F701 эффективно разлагали асфальтено-смолистые компоненты нефти. При температуре 24 °С бактерии рода Pseudomonas F701 и 142NF также эффективно разлагали углеводороды бензольной фракции. При пониженной положительной температуре (4 °С) способность к деградации бензольно-спиртовой фракции была отмечена у микроорганизмов Rhodococcus erytropolis S26, Rhodococcus sp. S25, Serratia sp. 6 и Acinetobacter baumannii IB, а у штамма Acinetobacter baumannii 7 была выявлена способность к деструкции в первую очередь лёгких фракций нефти. Различия фракционного состава остаточного количества нефти в экспериментальных образцах, возможно, свидетельствуют о способности изученных микроорганизмов использовать ту или иную фракцию загрязнителя в качестве источника углерода и энергии.

Рис. 4. Электрофореграмма плазмидных ДНК штаммов-

Щ деструкторов

II 1 - Rhodococcus sp. Х25 (35,21, 17 т.п.н.)

j| 2 - Rhodococcus Sp. S2S (77,55,36,20 т.п.н.) Л г-Pseudomonas putida F701 (96,36 t.ilh.) В 4-Acinetobacter baumannii 7 (50,42,20, 12,6 т.п.н.) '" $-Serratia sp. 6(14,7т.п.н.)

6 -Acinetobacter baumannii 1B (67,48,34 т.п.н.)

7 - Rhodococcus erythropolis S26 (48,30,15 т.п.н.)

8 - штамм 4 (30, 8, 6 т.п.н.)

I т.п.н. ДНК-маркер. Я Ladder PFC маркер

123* 5 «7«

Так как на первом этапе работы было показано влияние плазмид биодеградации ПАУ на эффективность деструкции нефти, поэтому важным критерием отбора микроорганизмов для составления ассоциации было наличие в них катаболических плазмид. В результате скрининга 17 штаммов, обнаружены плазмиды у 8 штаммов-деструкторов: Rhodococcus sp. Х25, Rhodococcus sp. S25, Pseudomonas putida F701, Äcinetobacter baumannii 7, Rhodococcus sp. S67, Äcinetobacter baumannii 1B, Rhodococcus erythropolis S26, штамм 4 (рис. 4). Плазмида биодеградации нафталина pNF142 в штамме Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), описана ранее (Ахметов, 2006). Как видно из данных рисунка 4, присутствие плазмид было выявлено в штаммах 1В, 4, 6, 7, S26, Х25, S25 и F701.

Для установления возможности локализации генов биодеградации нафталина (F701) или гексадекана (1В, 4, 6, 7, S26, Х25, S25) на плазмидах, выявленных у исследуемых бактерий, были проведены эксперименты по спонтанной элиминации плазмид путем культивирования штаммов в неселективных условиях (ЛБ-среда). Длительное культивирование в богатой среде Pseudomonas putida F701 и штамма 4 приводило к появлению в популяциях бесплазмидных клеток. Элиминанты Р. putida F701 и штамма 4 были не способны к росту на нафталине и гексадекане, соответственно. Выявленные плазмиды стабильно наследовались у штаммов 1В, 6, 7, S26, Х25 и S25. В результате инкубации клеток бактерий 1В, 6, 7, S26 и S25 в присутствии бромистого этидия (10 мкг/мл) были получены элиминанты, утратившие способность расти на средах, содержащих гексадекан. Высокая частота элиминации признака деградации алканов при обработке элиминирующие агентом позволила предположить плазмидный контроль деградации поллютанта. Для определения возможной конъюгативности плазмид были поставлены эксперименты по скрещиванию, где в качестве доноров использовали деструктор нафталина F701 и деструкторы гексадекана 1В, 4, 6, 7, S26 и S25, а реципиентом был бесплазмидный штамм Pseudomonas putida КТ2442. В результате было обнаружено, что микроорганизмы 7 и F701 содержат конъюгативныс катаболические плазмиды и, таким образом, способны увеличивать деградативный потенциал почвенных микробных популяций за счет распространения генов среди аборигенных бактерий. Даже в том случае, если эти микроорганизмы после интродукции в окружающую среду окажутся неконкурентоспособными, и постепенно будут элиминироваться, тем не менее, они могут быть донорами катаболических генов посредством коньюгационного переноса плазмид. Вопрос о конъюгативности плазмид микроорганизмов 1В, 4, S25, 6 и S26 остается открытым, однако они также могут участвовать в распространении катаболических генов, например, путем трансформации. При этом клетка-хозяин погибает и лизируется, ДНК с катаболическими генами попадает в окружающую среду и некоторое время может в ней сохраняться, а при контакте с подходящим новым бактериальным хозяином путем трансформации ДНК может встраиваться в генетическую систему микробной клетки (Прозоров, 1999). Поэтому, включение в состав биопрепарата микроорганизмов, содержащих конъюгативные или

неконъюгативные плазмиды биодеградации, представляется новым и перспективным аспектом при разработке новых технологий биоремедиации.

Составление ассоциации для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

Для составления ассоциации штаммов-деструкторов углеводородов нефти были последовательно использованы два подхода: 1) на основании анализа и последующего комбинирования физиологических, метаболических и деструктивных свойств микроорганизмов, а также, наличия плазмид в штаммах бактерий, 2) селекция при периодическом культивировании смешанной ассоциации наиболее активных микроорганизмов в жидкой минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии.

Таблица 3.

Критерии отбора микроорганизмов для составления ассоциации_

критерии отбора микроорганизмов микроорганизмы

рН среды 5-8 1А, 1В, 2А, 2В, 6, 7, S25, S26 и F701

5% №01 I A, IB, 2А, 2В, 1С, 3,4,5,б, 7, Х5, Х25, S25, S26, S67,142NF и F701

температура 4 - 42°С 1В, 6,7, S25, S26 и F701

концентрация нефти 30% при 24°С 1В, 6,7, Х25, S25, S26 и Г701

концентрация нефти 20% при 2 - 4°С 6, 7, S25, S26 и F701

концентрация дизельного топлива 30% при 24°С IB, 2С, 6,7, S26 и F701

концентрация дизельного топлива 30% при 4°С 1В, 6,7,826 и F701

активный продуцент биосурфакгантов 1В, 7, Х5, S26, S67hF701

наличие катаболических плазмид 1В, 4,6,7, S26, S67, Х25, S25 и F701

Примечание: жирным шрифтом выделены штаммы, с наилучшими показателями критериев отбора

На основании вышеперечисленных свойств (Табл. 3), были отобраны следующие бактерии Rhodococcus erytropoHs S26, Rhodococcus sp. S25, Acinetobacter baumannii IB, Serratia sp. 6, Pseudomonas putida F701, Acinetobacter baumannii 7. Выбранные микроорганизмы были инокулированы в жидкую минеральную среду (pH среды 4), загрязненную 15% нефти при температурах 4°С или 24°С. Бактерии Rhodococcus erytropolis S26, Acinetobacter baumannii IB, Acinetobacter baumannii 7 и Pseudomonas putida F701 имели преимущества в скорости роста и доминировали в смешанной популяции. В результате, перечисленные микроорганизмы вошли в состав ассоциации, которая получила название консорциум «ВиО». Следует отметить, что бактерии Acinetobacter baumannii IB, Rhodococcus erytropolis S26, Acinetobacter baumannii 7 содержат плазмиды биодеградации гексадекана, а штамм Pseudomonas putida F701 имеет гены биодеградации нафталина, входящие в состав конъюгативной плазмиды pF701a. Таким образом, была отобрана перспективная ассоциация плазмидосодержащих штаммов-деструкторов для очистки почвенных и водных экоситем от нефти, в том числе и в условиях высокой концентрации нефтепродуктов, в широком температурном и pH -диапазонах.

3. Оценка эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов «ВиО» при культивировании консорциума в жидкой минеральной среде

Для оценки эффективности деградации нефти отобранным консорциумом штаммов «ВиО» были проведены эксперименты в жидкой минеральной среде при температурах 4°С, 24°С и 50°С. В ходе проведенных лабораторных испытаний максимальная скорость снижения концентрации

15 суток (Рис. 5). Данный эффект достигался, возможно, за счет деградации микроорганизмами, в первую очередь, н-алканов (до С|2) и циклических соединений с одним ароматическим кольцом легких фракций нефти. Вероятно, снижение скорости деградации во второй половине эксперимента обусловлено разрушением тяжелых (асфальтеновых) фракций поллютанта, которые являются более трудноусваиваемыми компонентами нефти. Наибольшая степень деградации наблюдалась в системе при температуре 4°С и составила 44,05% относительно контроля без микроорганизмов. Однако, деградацию нефти в исследуемых системах оценивали относительно контроля, в котором происходили процессы абиотической убыли. Причем абиотическая убыль при температуре 4°С была меньше, чем при 24°С. Соответственно, остаточная концентрация нефти в контроле при низкой положительной температуре была больше, чем количество нефти при 24°С. Оценивая возможное соотношение фракций в контроле при 4°С, количество летучих биодоступных и легкоусваиваемых бактериями углеводородов превышало содержание этих соединений в контроле при температуре 24°С. Несмотря на то, что при комнатной температуре микроорганизмы ассоциации «ВиО» находились в оптимальных условиях, им были доступны в основном средние и тяжелые фракции нефти, требующие более длительного периода окисления.

Наименьшая убыль нефти была выявлена в жидкой минеральной среде при 50°С - 0,93%. При температуре 50°С бактерии ассоциации находились в лимитированных условиях, таких как высокая температура; отсутствие легкоусваиваемых углеводородов легких фракций, которые испарялись в первые дни эксперимента, при этом происходило концентрирование более тяжелых соединений, входящих в состав загрязнителя. Таким образом, проведенные лабораторные исследования продемонстрировали высокую эффективность деградации нефти консорциумом «ВиО» при пониженной и умеренной температурах.

4. Сравнительная эффективность деструкции нефтн и дизельного топлива ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл» в жидкой минеральной среде

В качестве объектов сравнения были выбраны: биопрепарат «МикроБак», который ранее был создан сотрудниками лаборатории биологии плазмид

16

нефти наблюдалась уже через

р Температура в нсследуемш системах, °С

Рис. 5. Степень деструкции нефти ассоциацией «ВиО» при температурах 4°С, 24°С и 50 "С в жидкой минеральной среде с 15% нефти в течение 30 дней (серые столбцы - через 15 суток, темные столбцы -через 30 суток)

НБФМ РАН и биопрепарат «Биоойл», предоставленный ЗАО «Биоойл» для анализа деградативной активности. В состав биопрепарата «МикроБак» входят бактерии родов Pseudomonas и Rhodococus , а биопрепарат «Биоойл» состоит из микроорганизмов родов Bacillus, Sacharomyces, Acinetobacter, Enterobacter. А) Оценка эффективности отобранной ассоциации «ВиО» по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» была проведена в жидкой минеральной среде с нефтью (15%) в качестве единственного источника углерода и энергии. На рисунке 6 представлены результаты анализа степени деструкции нефти, полученные методом ИК-спектрометрии, в условиях культивирования ассоциации ВиО и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 15% нефти при температурах 4°С и 24 °С в течение 30 дней. При температуре 4°С использование ассоциации «ВиО» привело к наибольшей убыли углеводородов нефти (44%) через 30 суток, в то время как, значение степени деструкции в системах, инокулированных биопрепаратом «Биоойл» в течение первых 15 суток было незначительным (8%), а к концу эксперимента (через 30 суток) этот параметр достиг показателя 36%, сравнимого с максимальной деградацией биопрепаратом «МикроБак» -40% (Рис. 6А).

А) при температуре 4 "С Б) при температуре 24 °С

Рис. 6. Степень деструкции нефти при культивировании ассоциации ВиО и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 15% нефти в течение 30 дней (серые столбцы - через 15 суток, темные столбцы - через 30 суток)

При температуре 24°С использование ассоциации «ВиО» привело к наибольшей убыли углеводородов нефти как через 15 суток - 31%, так и через 30 суток - 39% (Рис. 6Б). Сравнение степени деструкции биопрепаратов «Биоойл» 36 % и «МикроБак» 34% показало, что оба биопрепарата проявляли себя практически одинаково в отношении деструкции нефти. Потребление нефти бактериями, входящими в состав биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» по сравнению со штаммами ассоциации «ВиО» (Рис. 6) происходило медленнее, что, возможно, связано с более длинным периодом адаптации микроорганизмов-деструкторов, что подтверждалось результатами определения динамики численности бактерий.

Б) Была проведена оценка эффективности отобранной ассоциации «ВиО» по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 3% морской соли и нефтью (15%) в качестве единственного источника углерода и энергии. Результаты анализа показали, что максимальная степень деструкции (33 % ) была достигнута при культивировании ассоциации «ВиО» в жидкой минеральной среде с 15% нефти и 3 % морской соли при 4 °С в течение 30 дней (Рис. 7А). Показатели убыли нефти в системах,

17

инокулированных биопрепаратами «МикроБак» (23%) и «Биоойл» (18%) были ниже на 10 - 15%. В результате проведения аналогичных экспериментов при температуре 24°С в течение 30 дней (Рис. 7Б), наибольшая эффективность процесса деградации (около 20%) наблюдалась при интродукции ассоциации «ВиО» или биопрепарата «МикроБак», в то время как в случае биопрепарата «Биоойл» этот показатель достиг всего лишь 3 %.

о* 35,00 | Ш = 25,011

Ь '

п ИМЮ

г

' ассоциации ВиО Бкоойл МикроБак

А) при температуре 4 °С

35,0(1 ¿.30,00

V

- 25,00

5 20,00:.....

ьг

о) 15,00 — % 10,00!

5 .....

с

2 ».по

¡¡г

зссоцкаиия ВиО Биоойл Б) при температуре 24

МикроБак

'С

Рис. 7. Степень деструкции нефти при культивировании ассоциации ВиО и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 15% нефти и 3 % морской соли в течение 30 дней

При сравнении данных рисунков 7А и 7Б видно, что процент деградации нефти разработанной ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами выше при пониженной положительной температуре. Сравнение данных рисунков 6 и 7 показало, что присутствие морской соли в среде снижало эффективность деградации нефти.

В) Оценка эффективности разработанной ассоциации «ВиО» по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 3% морской соли и дизельным топливом (15 %) в качестве единственного источника углерода и энергии. При температуре 4 °С (Рис. 8А) через 30 дней степень деструкции достигла 63 % в случае использования ассоциации «ВиО», тогда как этот показатель для биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» составил 42% и 52 %, соответственно. Следует отметить, что максимальная скорость убыли загрязнителя для систем, инокулированных биопрепаратом «Биоойл» и консорциумом «ВиО», была выявлена в первой половине эксперимента (через 15 суток).

-2 = | 20,00

§§ 1(1.«II -

щияпмяВиО Биоойл МикроБак Б) при температуре 24 °С

нссолшшин ВнО Биоойл МикроБак А) при температуре 4 °С

Рис. 8. Степень деструкции дизельного топлива при культивировании ассоциации ВиО и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 15% дизельного топлива и 3 % морской соли в течение 30 дней

(серые столбцы - через 15 сугок, темные столбцы - через 30 суток)

При температуре 24 "С, по результатам ИК-спектрометрии, степень деградации дизельного топлива достигла максимума на 30 сутки культивирования для ассоциации «ВиО» и составила 61% (Рис. 8Б), значения

степени деструкции через 15 и 30 суток для биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» практически не изменились и составили примерно 30 и 37%, соответственно. При использовании в качестве загрязнителя дизельного топлива наблюдалась увеличение степени деструкции этого поллютанта во всех системах (Рис. 8) по сравнению с результатами по убыли нефти в аналогичных экспериментах (Рис. 6 и Рис. 7) при пониженной температуре. По-видимому, это связано с тем, что в состав дизельного топлива входят более легкоутилизируемые микроорганизмами углеводороды, по сравнению с многокомпонентным составом нефти. В мезофильных условиях (24 °С) только при использовании консорциума «ВиО» наблюдались более высокие показатели деструкции дизельного топлива (61%), чем нефти (38% - Рис. 6Б и 22% - Рис. 7Б в присутствии морской соли). Возможно, микроорганизмы биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» менее устойчивы к токсичным низкомолекулярным соединениям, входящим в состав дизельного топлива.

В целом можно отметить, что при культивировании биопрепаратов «МикроБак», «Биоойл» и консорциума «ВиО» в жидкой минеральной среде с нефтью, была выявлена наибольшая эффективность деградации поллютанта при низкой комнатной температуре. Тем не менее, во всех проведенных экспериментах в жидкой минеральной среде консорциум «ВиО» был наиболее эффективен в отношении деградации нефти и дизельного топлива 5. Сравнительная эффективность деструкции нефти ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл» в модельных почвенных системах

Оценка эффективности отобранной ассоциации «ВиО» по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» также была проведена в модельных нестерильных почвенных системах, загрязненных 2% нефти:

• вклад аборигенных микроорганизмов в деградацию углеводородов оценивали по убыли нефти в модельной нестерильной почвенной системе (микрокосмы 1, 2 (где стимуляция деградации нефти аборигенными микроорганизмами происходила за счет внесения минеральных удобрений));

• исследование степени деструкции нефти и популяционной динамики шпродуцированных и аборигенных микроорганизмов проводили в микрокосме 3 (почва загрязненная нефтью с добавлением нитроаммофоски и биопрепарата «МикроБак»); микрокосм 4 (почва загрязненная нефтью с добавлением нитроаммофоски и биопрепарата «Биоойл»), микрокосм 5 (почва загрязненная нефтью с добавлением нитроаммофоски и ассоциации «ВиО»).

Внесение в почву бактериальных препаратов «МикроБак», «Биоойл» и исследуемой ассоциации «ВиО» способствовало повышению степени деградации загрязнителя и увеличению численности углеводородокисляющих микроорганизмов по отношению к контрольной нефтезагрязненной почве. Аналогичные результаты были получены в работе Биккининой (Биккинина с соавт., 2006).

Известно, что легкие фракции обладают наибольшей токсичностью по отношению к живым организмам, но влияние их достаточно кратковременно вследствие быстрого испарения, биодеградации, рассеивания. Тяжелые фракции менее токсичны, но они значительно ухудшают свойства почв,

19

затрудняя водо- и газообмен. Эти компоненты очень устойчивы и могут сохраняться в земле продолжительное время. Наиболее опасна группа ПАУ, являющихся продуктами неполного сгорания ископаемого топлива и органических веществ (Панченко и др., 2003).

Таблица 4.

Убыль нефти в модельных системах с 2% нефти через 42 дня._

Микрокосмы Убыль нефти, %

1 Контроль без внесенных микроорганизмов и нитроаммофоски 22,83±3,25

2 Контроль без внесенных микроорганизмов + нитроаммофоска 30,59±2,53

3 «МикроБак» + нитроаммофоска 51,23±4,26

4 «Биоойл» + нитроаммофоска 44,48±2,51

5 Ассоциация «ВиО» + нитроаммофоска 58,71±1,59

По данным фракционного анализа, микроорганизмы ассоциации «ВиО» способны к деструкции разных фракций нефти (бактерии рода Acinetobacter 1В и 7, Rhodococcus erytropolis S26 минерализуют в первую очередь углеводороды гексановой фракции, а штамм Pseudomonas putida F701 - бензольной), что возможно, и обеспечило максимальную убыль нефти в данном эксперименте 59% (Табл. 4). Кроме того, присутствие катаболических плазмид во всех штаммах ассоциации «ВиО» также давало преимущество в деградации нефти в модельных системах, по сравнению с системами, обработанными другими биопрепаратами.

Ранее было показано, что углеводородокисляющие микроорганизмы, входящие в основу биопрепарата и вносимые в почву, должны обладать высокой жизнеспособностью (Гузев, Звягинцев, 1998). Видимо, это требование справедливо для штаммов ассоциации «ВиО», поскольку их численность находилась примерно на одном уровне в течение всего эксперимента (микрокосм 5).

В результате проведенной агротехнической обработки (рыхление, внесение минеральных удобрений, увлажнение) в искусственных нефтезагрязненных почвенных системах наблюдалось увеличение численности в первую очередь углеводородокисляющих микроорганизмов. Так как известно, что загрязнение нефтью обуславливает флуктуацию среды, снижает видовое разнообразие микроорганизмов за счет отбора немногочисленных видов с повышенной метаболической активностью (Исмаилов, 1988). В наших экспериментах максимальный прирост биомассы нефтедеструкторов был достигнут к 28 дню от начала проведения эксперимента. Наблюдалось увеличение общей численности нефтедеструкторов на 1 порядок в модельных системах 3-5 за счет физиологической и метаболической активности интродуцированных штаммов-деструкторов, входящих в состав биопрепаратов и ассоциации «ВиО», по сравнению с контролем (микрокосм 1). В целом, проведенные лабораторные испытания продемонстрировали более эффективную утилизацию углеводородов нефти консорциумом «ВиО» по сравнению с биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл».

6. Полевые испытапия ассоциации «ВиО» и коммерческих биопрепаратов ЗАО «Биоойл»

На основе отобранной микробной ассоциации «ВиО» была приготовлена опытная партия лиофильно высушенного препарата. Эффективность опытного образца ассоциации «ВиО» была продемонстрирована при проведении сравнительных полевых испытаний с биопрепаратами «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» на территории Ямало-Ненецкого автономного округа на участках Пограничного нефтяного месторождения в период с июня по август 2008 г. В процессе работы были созданы благоприятные условия для роста и развития микроорганизмов за счет внесения минеральных и органических удобрений (мочевина), рыхления и полива.

Было установлено, что через 2 месяца после внесения ассоциации «ВиО» и минеральных удобрений в опытном участке степень очистки грунта от нефти составила 80%, по сравнению с участками обработанными биопрепаратами ЗАО «Биоойл» (50-70%). Следует отметить, что наибольшая скорость убыли нефти была выявлена на всех участках уже через 1 месяц, но при этом, максимальная скорость удаления нефти обнаружена на сайте, обработанном ассоциацией «ВиО». Таким образом, особенности композиции отобранной ассоциации «ВиО» дают очевидное преимущество в эффективности деградации углеводородов нефти уже на первых этапах очистки нефтезагрязненных сайтов. Полученные результаты подтверждаются данными микробиологического анализа, демонстрирующими завершение экспоненциальной фазы роста микроорганизмов к концу первого месяца эксперимента. Так, до начала испытаний концентрация аборигенных почвенных нефтедеструкторов была низкой 5,2* 101 КОЕ/ г почвы, так как нефть негативно влияет на численность почвенных микроорганизмов при содержании нефтяных углеводородов более 10% от массы почвы. Однако, что после обработки биопрепаратами ЗАО «Биоойл» и микробным консорциумом «ВиО» численность углеводородокисляющих микроорганизмов увеличилась на 3 порядка, что способствовало интенсификации биодеградации нефти и подтверждено данными по определению остаточной концентрации нефти в почве (Рис.9).

Это связано, в первую очередь, с адаптацией биогеоценозов к нефтяному загрязнению, что приводит к перестройке ферментативного аппарата бактерий и

повышению, таким образом,

углеводородокисляющей способности почвы (Киреева к др., 2001).

Химическая токсичность нефти по Рис. 9. Изменение степени деструкции отношению к биологическим объектам не нефти в течение 2 месяцев. в а очевидна (Шковский, 2003). Зачастую

(серые столбцы - через 1 месяц, ,

темные столбцы-через 2 месяца) восстановление нефтезагрязненных почв

часто отслеживается по изменению концентрации загрязнителя в почве, убыль которого иногда не отражает снижение его токсичности для живых организмов. Известно, что почва служит резервуаром, где загрязнения могут накапливаться в большом количестве в силу наличия адсорбирующей поверхности. Таким образом, почва может быть сильнозагрязненной, но не токсичной и, наоборот, -слабозагрязненной, но сильнотоксичной для биологических объектов. Поэтому,

21

Бксюил СН ассоциации ВиО Бшнш.! КНра

целесообразно вести контроль за биоремедиацией не только по содержанию остаточных нефтепродуктов, но и по показателям токсичности (Knoke et al, 1999; Phillips et al., 2000). Поэтому в наших полевых экспериментах проводилась визуальная оценка фитотоксичности и фотосъемка почвы через 2 месяца, которая выявила больший прирост биомассы растений на участке, обработанном ассоциацией «ВиО» по сравнению биопрепаратами ЗАО «Биоойл». Таким образом, при проведении испытаний in situ наибольшая степень деградации нефти наблюдалась на участке, обработанном ассоциацией «ВиО».

Были получены положительные заключения ЗАО «Биоойл» и ООО «Газпромнефть-Ноябрьскнефтегаз» об эффективности деградации нефти ассоциацией «ВиО» в полевых испытаниях. Кроме того, эффективность деградации нефти и нефтепродуктов микробным консорциумом «ВиО» была продемонстрирована в лабораторных испытаниях ООО «Газпромнефть-Восток» и ООО «Сибнефть Восток».

7. Депонирование штаммов, изучение их патогенности, подготовка патентной заявки

7.1. Депонирование штаммов

Штаммы микроорганизмов были депонированы в коллекции культур микроорганизмов Научно исследовательского института Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» под следующими номерами: Acinetobacter baumanni IB - В1075; Acinetobacter baumanni 7 -B1073; Rhodococcus erythropolis S26 - B1072; Pseudomonasputida F701 - B1074.

Свидетельства о депонировании прилагаются.

7.2. Изучение патогенности микроорганизмов

Штаммы, входящие в состав ассоциации «ВиО», прошли санитарно-гигиеническую оценку в Отделе изучения и мониторинга зоонозных инфекций Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор». Ассоциация была испытана в соответствии с МУ Минздрава СССР №4263-67, №2620-82 и с учетом рекомендаций ВОЗ (Бюл. ВОЗ 1981, №6, с.20-27) и не оказала отрицательного влияния на лабораторных животных.

7.3. Патентование ассоциации для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами

Подана заявка на патент РФ №2010121688 «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». Приоритет 27.05.2010.

Подготовлена патентная заявка в Российское агентство по патентам и товарным знакам на «Способ очистки водоемов и почв от нефти и нефтепродуктов ассоциацией гогазмидосодержащих штаммов».

ВЫВОДЫ

1) Впервые показано, что наличие плазмид биодеградации ароматических углеводородов в штаммах-хозяевах приводит к увеличению биомассы плазмидосодержащих бактерий, степени деструкции нефти в жидкой

22

минеральной среде и в почвенных микрокосмах по сравнению с их бесплазмидными вариантами.

2) Создана эффективная ассоциация «ВиО», состоящая из плазмидосодержащих бактерий Rhodococcus erytropolis S26, Acinetobacter baumannii 1B, Pseudomonas putida F7Q1, Acinetobacter baumannii 7, обладающих способностью к росту в широком диапазоне температур (4 - 42°С) в присутствии высоких концентраций нефти (до 30%) при значениях рН от 4 до 10, синтезирующих биосурфактанты.

3) Сравнительные лабораторные испытания микробной ассоциации «ВиО» и биопрепаратов «МикроБак», «Биоойл» в жидкой минеральной среде и в модельных почвенных системах, загрязненных нефтью или дизельным топливом, показали большую эффективность деградации этих поллютантов созданным консорциумом.

4) При проведении полевых испытаний на территории Пограничного нефтяного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа в период июнь-август 2008 г. наибольшая степень деструкции нефти (80%) была выявлена на участке, обработанном ассоциацией «ВиО» по сравнению с биопрепаратами ЗАО «Биоойл» (60-70%).

5) Подана заявка на патент РФ №2010121688 «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». Приоритет 27.05.2010.

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-99019-р_офи, РФФИ 08-04-90028-Бел_а, РФФИ-06-04-96318, а также гос. контрактов РНП 2.1.1.612, РИЛ 02.740.11.0296, РНП 02.740.11.0040, РНП 2.1.1.7789, РНП 2.1.1.9290 u CRDF RUB2-010001-PU-05.

Список публикаций по теме диссертации

1. А. А. Ветрова, И.А. Нечаева, А.А. Игнатова, И.Ф. Пушус, М.У. Аринбасаров, А. Е. Филонов, А. М. Воронин. Влияние катабояических плазиид иа физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти. Микробиология, 2007, №3, с. 354-360.

2. А.А. Ветрова, А.А. Овчинникова, И.Ф. Пушус, А. Е. Филонов, А. М. Воронин. Интенсификация биодеградации нефти плазмидосодержащнми штаммами Pseudomonas в модельных почвенных системах. Биотехнология, 2009, Л»4, с. 82-90.

3. А.А. Ветрова, А.А. Овчинникова, А. Е. Филонов, И.Ф. Пунтус, А. М. Воронин Деструкция нефти бактериями рода Pseudomonas, содержащими различные плазмиды биодеградации. Известия ТулГУ. Серия Химия. 2008, Выпуск № 2, с. !86 -193.

4. А.А. Овчинникова, А.А. Ветрова, А. Е. Филонов, А. М. Воронин. Взаимодействие штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов: колонизация корней и защита растений от токсического действия фенантрена. Известна ТулГУ. Серия Химия. 2008, Выпуск № 1, с. 211-220.

5. А.А. Овчинникова, А.А. Ветрова, А. Е. Филонов, А. М. Воронин. Биодеградация фенантрена и взаимодействие Pseudomonas putida BS3701 и Burkholderia sp. BS3702 в ризосфере растений. Микробиология, JÉ4, том 78, 2009, с.484-490.

6. Петриков К.В., Овчинникова А.А., Ветрова А.А., Филонов А.Е., Понаморева О.Н., Самойленко В.А, Якшииа Т.В., Воронин А.М. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ ФОРМЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ТЕРРИТОРИЙ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ. Заявка на патент Российской Федерации №2010121688. Приоритет 27.05.2010.

7. A. Filonov, 1. Nechaeva, A. Vetrova, A. Ovchinnikova., A. Gafaiov., 1. Puntus., L. Akhmetov. Psychrotrpphic Microorgsnisms and Catabolic Plasmids for Oil Spills Bioremediation. ISTC Workshop at the International Conférence on Contamination Soi), ConSoil 2008. 3 -6 June 2008, Milan, Italy, 2008, p. 61-69.

8. A. Filonov, A Ovchinnikova, A Vetrova, I. Nechaeva, Г. Puntus., L. Akhmetov, V. Zabelin, A. Boronin. Remediation of oil-spilled territories, using a biopreparation "MicroBac", a consortium of plasmid-bearing strains "V&O" and associated plants. ISTC Workshop at the International Conference on Contaminafion Soil, ConSoi) 2010.21-25 September 2010, Salzburg, Austria, 2010, p. 222-223.

9. Ветрова A.A., Игнатова AA., Ахмегов Л.И., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Исследование влияния катаболических плазмид на деградацию полициклических ароматических углеводородов // Сборник статей. Росийская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология-современные биоаналитические системы, методы и технологии» 28 октября-З ноября 2006, Пущино, с. 54.

10. Ветрова А А, Пырченкова И. А, Игнатова АА., Филонов А.Е. Изучение влияния катаболических плазмид на физиологические параметры псевдомонад и эффективность биодеструкции нефти// Биология-наука 21 века. 10-я Путинская школа-конференция молодых учёных. 17-21 апреля 2006 г., Пущино, с.360.

11. Ветрова А.А. Исследование влияния катаболических плазмид на эффективность биодеструкции углеводородов нефти псевдомонадамп. Всероссийская молодежная школа-конференция «Современная биотехнология - защите окружающей среды». 12 сентября, 2006, Пущино.

12. Vetrova A.A, Ovchmnikova А.А., Filonov А.Е., Boronin AM. The influence of catabolic plasmids of Pseudomonas strains on oil destruction degree. Materials of the Forth International Conference on Science and Business, Pushchino, 15-18 October, 2007. P. 247-249.

13. Ветрова А А. Повышение эффективности биодеградации углеводородов нефти путем переноса катаболических плазмид в бактериальные штаммы-деструкторы. Устный доклад на школе-семинаре «Современные наукоемкие технологии: от идеи к внедрению», Белгород, 29 октября по 4 ноября 2007 года.

14. Ветрова АА., Овчинникова А.А., Филонов АЕ. Стимуляция биодеградации нефти плазмидосодержащими микроорганизмами рода Pseudomonas. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 7-11 апреля, 2008.

15. Anna Vetrova, Anastasia Ovchinnikova. Influence of catabolic plasmids on the efficiency of crude oil hydrocarbons biodégradation by gram-negative bacteria. XIJ. International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology 5-9 August 2008, Istanbul. P 100.

16. Filonov A.E., Nechaeva 1.А., Vetrova A.A., Ovchinnikova AA.f Vlasova E.P., Petrikov K.V., Gafarov A.B., Puntus l.F, Akhmetov L.I. Oil spill bioremediation in cold climates: development of biopreparations and their application. Icomid-2008. Ш International Conference on Microbial diversity. Perm. 28 September - 05 October 2008. P. 149 - 150.

17. Vetrova A.A, Ovchinnikova A.A Filonov A.E, Boronin A.M. Increase of the efficiency remediation of oil soil by plasmid-bearing strains association. Fifth international conference «Science and Training for Biosafety», 6-9 October, 2008, Pushchino, P. 204 - 206.

18. Ветрова A.A., Овчинникова АА., Филонов А.Е. Стимуляция биодеградации нефти ассоциацией плазмидосодержащих микроорганизмов-деструторов в лабораторных и полевых модельных почвенных системах. Генетика микроорганизмов и биотехнология. Международная школа -конференция, посвященная 40-летию создания ГосНИИгенегака. Москва - Пущино, 21-24 октября 2008г., стр. 28.

19. Ветрова А. А, Овчинникова А.А., Филонов А.Е. Интенсификация биодеградации нефти ассоциацией плазмидосодержащих штаммов в моддьных почвенных системах. Биология-наука 21 века. 12-я Путинская конференция молодых учёных, Пущино, 10-14 ноября 2008г., стр. 199-200.

20. Nechaeva 1.А., Vetrova А.А, Ovchinnikova А.А Filonov A.E. Development of biopreparation for soil purification from oil pollution. Russian Young innovative convent, Moscow, 2008, p. 158 -159.

21. Vetrova A.A., Ovchinnikova A.A., Filonov A.E., Boronin A.M. Oil polluted soil remediation by association of plasmid-bearing degrader strains. 3ri Congress of European microbiologists «Microbes and Man - Interdependence and Future Challenges» (Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2,2009).

22. Ветрова A.A, Овчинникова АА Ремеднация нефтезагрязненных почв и грунтов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 13-18 апреля, 2009.

23. Ветрова А.А., Овчинникова А. А., Филонов А Е., Воронин А. М. Ремедиация нефтезагрязненных почв ассоциацией плазмидосодержащих штаммов. Экотоксикология 2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии. 26-30 октября 2009г. Пущиио-Тула с. 112-113.

24. Ветрова А.А., Овчинникова А.А, Филонов А. Е. Ремедиация нефтезагрязненных почв ассоциацией плазмидосодержащих штаммов. Системная биология ПНЦ РАН апрель 2009г. Стр. 1314.

Подписано в печать:

01.11.2010

Заказ № 4426 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ветрова, Анна Андрияновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Влияние загрязнения нефти на окружающую среду

Глава 2. Общий углеводородный состав нефти

Глава 3. Деградация углеводородов нефти

3.1 .Микробная деградация парафинов и циклопарафинов

3.2. Биодеградация ароматических углеводородов

3.2.1. Биодеградация моноциклических ароматических углеводородов

3.2.2. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов

3.3. Микробное окисление асфальтенов

Глава 4. Плазмиды биодеградации

4.1. Плазмиды биодеградации парафинов и циклопарафинов

4.2. Плазмиды биодеградации ароматических углеводородов

4.2.1. Плазмиды биодеградации моноциклических ароматических углеводородов

4.2.2. Плазмиды биодеградации полициклических ароматических углеводородов

Глава 5. Распространение катаболических плазмид в природе 39'

Глава 6. Роль катаболических плазмид в деградации углеводородов нефти

Глава 7. Методы очистки нефтезагрязненных территорий

Глава 8. Коммерческие препараты на основе углеводородокисляющих 44 микроорганизмов для очистки почвенных и водных экосистем от нефти и нефтепродуктов

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Питательные среды, источники углерода и энергии, антибиотики

2.3. Условия культивирования

2.4. Определение эмульгирующей активности

2.5. Измерение индекса эмульгирования

2.6. Определение поверхностного натяжения

2.7. Определение эффективности очистки нефтезагрязненных систем '

2.7.1. Гравиметрический метод анализа

2.7.2. Определение общего содержания углеводородов нефти и. нефтепродуктов 54 (дизельное топливо) методом инфракрасной (ИК) спектроскопии

2.7.3. Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах относительно исходного состава

2.8. Конъюгационный перенос бактериальных плазмид

2.9. Элиминация бактериальных плазмид

2.10. Выделение плазмидной ДНК микроорганизмов

2.11. Полимеразная цепная реакция

2.12. Определение влагоемкости почвы

2.13. Определение рН почвы

2.14. Приготовление модельных почвенных систем

2.15. Внесение инокулята в почву в лабораторных модельных системах

2.16. Отбор проб

2.17. Мониторинг штаммов-деструкторов в процессе деградации нефти в 59 модельных почвенных системах

2.18. Условия проведения полевого эксперимента

2.19. Отбор проб в полевом эксперименте 61 2.20.0пределение численности микроорганизмов методом стандартных серийных 61 разведений

2.21 .Статистическая обработка результатов

III. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими 64 микроорганизмами по сравнению с бесплазмидными вариантами

3.1.1. Характеристика штаммов и био деградация нефти бесплазмидными 64 бактериями и плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами полициклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде

3.1.2. Био деструкция нефти охарактеризованными бесплазмидными бактериями и 70 плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами моноциклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде

3.1.3. Характеристика природных штаммов, содержащих плазмиды биодеградации 78 нафталина, толуола, камфары и их элиминантов, и биодеградация нефти исследуемыми микроорганизмами в жидкой минеральной среде

3.1.4. Биодеградация нефти и динамика численности бесплазмидных штаммов и 82 плазмидосодержащих вариантов в модельных почвенных системах

3.2. Биодеструкция нефти наиболее активными штаммами-деструкторами и 89 составление эффективной ассоциации плазмидосодержащих бактерий для биодеградации нефти и нефтепродуктов

3.2.1. Физиологическая характеристика штаммов-нефтедеструкторов

3.2.2. Составление ассоциации для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов 98 3.3; Оценка эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов ассоциацией 99 плазмидосодержащих штаммов «ВиО» при культивировании консорциума, в жидкой минеральной среде

3.3.1. Оценка убыли нефти при культивировании ассоциации «ВиО» при 99 температурах 2-4°С и 24°С в жидкой минеральной среде с 15% нефти и при 50 °С в жидкой минеральной среде с 2% нефти в течение 30 дней

3.3.2. Изучение динамики численности микроорганизмов ассоциации «ВиО» при 101 температурах 2-4°С и 24°С в жидкой минеральной среде с 15% нефти и при 50 °С в жидкой минеральной среде с 2% нефти в течение 30 дней

3.4. Сравнительная эффективность деструкции нефтепродуктов ассоциацией «ВиО» 102 и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл»

3.4.1. Сравнительная эффективность деструкции нефти; ш дизельного топлива . 102 ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл» в жидкой; минеральной среде

3.4.2. Сравнительная эффективность деструкции нефти ; ассоциацией - «ВиО» и 106 биопрепаратами «МикроБаю> и «Биоойл» в модельных почвенных системах

3.5. Полевые испытания ассоциации «ВиО» и коммерческих биопрепаратов ЗАО' 1091 «Биоойл» '

3.6. Депонирование штаммов, изучение их патогенности, подготовка. патентной 114 заявки

3.6.1. Депонирование штаммов;

3.6.2. Изучение патогенности микроорганизмов

3.6.3. Патентование ассоциации для очистки почв от загрязнений нефтью и 113 нефтепродуктами

IV. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1.Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами 114 по сравнению с бесплазмидными вариантами

4.2. Биодеструкция нефти наиболее активными штаммами-нефтедеструкторами: и 124 составление эффективной ассоциации1 плазмидосодержащих бактерий' для биодеградации нефти и нефтепродуктов

4.3; Оценка эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов ассоциацией, 129 плазмидосодержащих штаммов «ВиО» в лабораторных условиях

4.4. Сравнительная эффективность деструкции нефтепродуктов ассоциацией «ВйО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл»

4.5. Полевые испытания ассоциации «ВиО» и коммерческих биопрепаратов ЗАО

Биоойл»

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами"

Миллионы тонн жидких и твердых отходов ежегодно образуются в результате деятельности нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности (http://www.ecoportal.ru). Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировке нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. Попадая в окружающую среду, ископаемые углеводороды, в частности, нефть и продукты ее переработки, не только негативно влияют на флору и фауну, но и наносят прямой вред здоровью человека. При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятками лет, кроме того, естественная способность окружающей среды к самовосстановлению с каждым годом снижается (Оборин и др., 1988). Как следствие, остро встает вопрос о необходимости проведения максимально эффективной очистки загрязненных территорий с учетом состава загрязнителей, экономических и экологических и факторов.

Среди широкого спектра методов ликвидации последствий углеводородных загрязнений биологические методы признаны в мире наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными (Ягафарова, 2001). Разработка и совершенствование технологий ремедиации, особенно почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в настоящее время является областью активных фундаментальных и прикладных исследований.

Способность микроорганизмов к трансформации или деградации углеводородов нефти хорошо известна и позволяет использовать их для биоремедиации загрязнённых территорий. Такая очистка редко приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, однако необходимы предварительные исследования (Жолобов, 1995). Имеются два подхода, основанные на использовании эндогенных или интродуцируемых микроорганизмов в местах загрязнения. Первый называется эндогенной биоремедиацией (intrinsic bioremediation) и предполагает активацию аборигенной микрофлоры, адаптированной к конкретным условиям данной загрязнённой территории. Второй подход основан на внесении активных микроорганизмов — деструкторов в виде биопрепарата в места загрязнения и называется биоулучшением (bioaugmentation).

Внесение в загрязненную почву культур микроорганизмов, способных осуществлять окисление алифатических, ароматических и других углеводородов, приводит, как правило, к ускорению очистки почвы и позволяет обеспечить стабильность процесса биологического распада при относительно невысокой стоимости очистки (Сидоренко, 2002). Спектр используемых микроорганизмов для деструкции углеводородов нефти в почве включает в себя бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Aeromonas, Arthrobacter. Rhodococcus, дрожжи рода Candida, микромицеты Fusarium, Mucor, Trichoderma, Rhizopus, Penicilium. В большинстве случаев в основе биотехнологий используются биопрепараты, которые содержат жизнеспособные клетки как отдельных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов: («Путидойл», «Олеворин»), так и бактериальные консорциумы, например «Деворойл». Из литературных данных известно, что для повышения эффективности биодеградации углеводородов нефти целесообразно использовать смешанные культуры, состоящие из двух и более микроорганизмов (Сидоров, 1996). Следует отметить, что четких критериев составления «искусственных» ассоциаций штаммов - нефтедеструкторов до настоящего времени не предложено и в состав биопрепаратов включают штаммы по принципу их совместимости и высокой нефтеразлагающей активности. Патентный поиск существующих в настоящее время биопрепаратов показал, что основными их недостатками являются: большое видовое разнообразие микроорганизмов в их составе, часто бактерии, входящие в биопрепарат, являются представителями одного рода; узкий рабочий диапазон pH и температур; неспособность микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов, продуцировать биоэмульгаторы; малая эффективность деградации высоких концентраций нефти и нефтепродуктов; отсутствие катаболических плазмид в клетках микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Плазмиды играют важную роль в адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды. Эти генетические детерминанты позволяют содержащим их микроорганизмам катаболизировать необычные и устойчивые в окружающей среде соединения, такие, как ароматические углеводороды, которые неспособны ¡разлагать большинство известных микроорганизмов! (Балашова- 1997). Способность микроорганизмов к деградации ароматических углеводородов является предметом особого внимания исследователей, прежде всего, с точки» зрения использования микроорганизмов-деструкторов для очистки загрязненной окружающей среды. Известно, что интродукция микроорганизмов-потенциальных доноров плазмид биодеградации ароматических углеводородов может интенсифицировать процессы очистки и, кроме того, повышать биодеградативный-потенциал микробных популяций сайтов, загрязненных полициклическими ароматическими соединениями, путем передачи плазмид и генов биодеградации в эндогенные микроорганизмы (Ахметов, 2006). Поэтому возможно, что горизонтальный перенос плазмид может способствовать появлению новых катаболических путей, необходимых для разрушения нефти и нефтепродуктов. Известно, что в загрязненных почвах сильное селективное давление благоприятствует конъюгационному переносу соответствующих плазмид (на примере плазмид биодеградации ПАУ) фе ЬлрШау е1 а1., 2001).

Целью данной работы являлось исследование биодеградации углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами и разработка микробного консорциума как основы биопрепарата для очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) сравнить изменение численности микроорганизмов, содержащих плазмиды биодеградации ароматических углеводородов, и их бесплазмидных вариантов в процессе деструкции нефти, а также оценить степень деградации нефти исследуемыми бактериями в лабораторных условиях;

2) провести отбор наиболее эффективных плазмидосодержащих штаммов-деструкторов углеводородов нефти, обладающих способностью к деградации высоких концентраций нефти и нефтепродуктов (до 30%) в присутствии соли (до 5% №С1) в широком температурном диапазоне (4-42°С) при рН от 4 до 10; а также, образующих биоэмульгаторы;

3) составить микробный консорциум из отобранных штаммов, обладающих вышеперечисленными свойствами, для эффективной очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов;

4) сравнить эффективность деструкции* нефти составленной микробной ассоциацией с ранее разработанными коммерческими биопрепаратами в лабораторных и полевых условиях.

Научная новизна

Впервые продемонстрировано, что присутствие катаболических плазмид в штаммах-деструкторах увеличивает степень.деградации нефти, и способствует приросту биомассы плазмидосодержащих штаммов по сравнению с системами инокулированными бесплазмидными бактериями. Полученные результаты показывают, что важным аспектом катаболического потенциала микроорганизмов в процессе деструкции нефти является комбинация «бактериальный хозяин — плазмида».

Интродукция микроорганизмов, содержащих плазмиды биодеградации, интенсифицирует процессы очистки, повышает численность и биодеградативный потенциал микробных популяций нефтезагрязненных сайтов.

Создана микробная, ассоциация «ВиО» как основа биопрепарата для биоремедиации почвенных и водных экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, состоящая из штаммов-деструкторов родов Rhodococcus, Pseudomonas и Acinetobacter, содержащих катаболические плазмиды. Бактерии этого микробного консорциума способны к деградации углеводородов нефти при концентрации до 30% в температурном диапазоне 4 — 42°С в присутствии 5% соли при pH от 4 до 10.

Научно-практическая значимость работы

На основании скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН и коллекции бактерий ЗАО «Биоойл» были отобраны и охарактеризованы бактерии, которые вошли в состав микробной ассоциации «ВиО», способной эффективно деградировать углеводороды нефти. В качестве критериев отбора штаммов-деструкторов были выбраны свойства: способность к деградации нефти и нефтепродуктов (концентрация до 30%) в присутствии соли (до 5% NaCl) в широком температурном диапазоне (4-42°С) при pH от 4 до 10; присутствие в штаммах катаболических плазмид; синтез биоэмульгаторов. Комбинация вышеперечисленных свойств, наиболее важных для эффективной деградации углеводородов нефти, не присутствует ни в одном из известных биопрепаратов.

В условиях лабораторных экспериментов показана более высокая эффективность созданного микробного консорциума для очистки почвенных и водных экосистем от нефти и нефтепродуктов в сравнении с биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл».

Преимущество ассоциации «ВиО» также заключалось в увеличении скорости утилизации нефтяных загрязнений. Эффективность опытного образца биопрепарата микробной ассоциации «ВиО» в полевых испытаниях по очистке грунта от нефти на территории Пограничного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа составила 80% в течение периода с июня по август 2008 г., что превысило показатели, полученные при использовании биопрепаратов ЗАО «Биоойл».

Получены положительные заключения ЗАО «Биоойл» и ООО «Газпромнефть-Ноябрьскнефтегаз» об эффективности деградации нефти ассоциацией «ВиО» в полевых испытаниях. Кроме того, эффективность деградации нефти и нефтепродуктов микробным консорциумом «ВиО» продемонстрирована в лабораторных испытаниях ООО «Газпромнефть-Восток» и ООО «Сибнефть Восток».

Подготовлена-заявка на патент РФ «Способ очистки водоемов и почв от нефти и нефтепродуктов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов». Подана патентная заявка № 2010121688 «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами».

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на 18 конференциях: Биология-наука 21 века, 10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных, 17-21 апреля 2006, Пущино; Школа-конференция «Современная биотехнология - защите окружающей среды», 12 сентября, 2006, Пущино; Forth International Conference on Science and Business, 15-18 October, 2007, Pushchino; Школа-семинар «Современные наукоемкие технологии: от идеи к внедрению» 29 октября - 4 ноября, 2007, Белгород; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 7-11 апреля 2008, Москва; ISTC Workshop at the International Conference on Contamination Soil, ConSoil, Milan, Italy, 3-6 June, 2008; XII Internetional Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, 5-9 August 2008, Istanbul; III International Conference on Microbial Diversity, 28 September — 05 October 2008, Perm; Fifth international conference «Science and Training for Biosafety», 6-9 October, 2008, Pushchino; Международная. школа-конференция, посвященная 40-летию- создания ГосНИИгенетика, 21-24 октября, 2008, Москва* -Пущино; Биология-наука 21 века, 12-я Пущинская школа-конференция молодых учёных, 10-14 ноября, 2008, Пущино; Российский молодежный инновационный конвент. 9-10* декабря 2008, Москва; Международная научная конференция, студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 13-18 апреля, 2009, Москва; Системная биология ПНЦ РАН апрель 2009, Пущино; 3rd Congress of European Microbiologists «Microbes and Man -Interdependence and Future Challenges», June 28 - July 2, 2009,- Gothenburg, Sweden; Современные биоаналитические системы, методы и технологии. 26-30 октября 2009;, Пущино-Тула; ISTC Workshop at the International Conference on Contamination Soil, ConSoil Austria, 21-25 September, 2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, в-том числе 5' статей, заявка на получение патента РФ на изобретение и 18 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 25 таблиц и 42 рисунка. Библиография насчитывает 255 наименований, из них 109 отечественных и 146 зарубежных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Ветрова, Анна Андрияновна

выводы

1) Впервые показано, что наличие плазмид биодеградации ароматических углеводородов в штаммах-хозяевах приводит к увеличению биомассы плазмидосодержащих бактерий, степени деструкции нефти в жидкой минеральной среде и в почвенных микрокосмах по сравнению с их бесплазмидными вариантами.

2) Создана эффективная ассоциация «ВиО», состоящая из плазмидосодержащих бактерий Rhodococcus erytropolis S26, Acinetobacter baumannii 1B, Pseudomonas putida F701, Acinetobacter baumannii 7, обладающих способностью к росту в широком диапазоне температур (4 — 42°С) в присутствии высоких концентраций нефти (до 30%) при значениях pH от 4 до 10, синтезирующих биосурфактанты.

3) Сравнительные лабораторные испытания микробной ассоциации «ВиО» и биопрепаратов «МикроБак», «Биоойл» в жидкой минеральной среде и в модельных почвенных системах, загрязненных нефтью или дизельным топливом, показали большую эффективность деградации этих поллютантов созданным консорциумом.

4) При проведении полевых испытаний на территории Пограничного нефтяного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа в период июнь-август 2008 г. наибольшая степень деструкции нефти (80%) была выявлена на участке, обработанном ассоциацией «ВиО» по сравнению с биопрепаратами ЗАО «Биоойл» (60-70%).

5) Подана заявка на патент РФ №2010121688 «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». Приоритет 27.05.2010.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ветрова, Анна Андрияновна, Москва

1. Авчиева П.Б. Консорциум дрожжей Candida maltosa для биодеградации нефтезагрязнений // Патент РФ 2114174, 1997.

2. Андресон Р.к., Хазиев Ф.Х., Дешура B.C., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Новоселова Е.И. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Патент РФ 2077397, 1992. .

3. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок: Автореферат дис,. канд. техн. наук. М., 2007. 21 с.

4. Ахметов Л.И. Роль горизонтального переноса плазмид биодеградации в микробной деструкции полициклических ароматических углеводородов: Дис. . канд. биол. наук. Пущино, 2006. 163 с.

5. Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов P.P., Воронин A.M. Штамм Pseudomonas putida BS3701 — деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. 1997. Т.66. С. 488-493.

6. Барышникова Л.М. Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Воронин А.М. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде//Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. С.542-548

7. Белонин М.Д., Рогозина Е.А., Свечина P.M., Хотянович A.B., Орлова H.A. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов// Патент РФ 2053205, 1996.

8. Бельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации // Биотехнология. 2001. №2. С. 70-76.

9. Беляев С.С., Борзенков И.А., Назина Т.Н., Розанова Е.П., Глумов И.Ф., Ибатуллин P.P., Иванов М.В. Использование микроорганизмов- в биотехнологии повышения нефтеизвлечения // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 687-697.

10. Борисоглебская А.Н., Воронин А.М. Популяционные изменения штамма Pseudomonas putida BSA202, содержащего плазмиду NPL-1, по способности к катаболизму нафталина // Микробиология. 1983. №52. С. 301.

11. Бородавкин П.П. Охрана окружающей среды при строительстве и эксплуатации магистральных трубопроводов//-М.: Недра, 1981.-308 с.

12. Воронин A.M. Биология плазмид // Успехи микробиологии. 1983. Вып. 18. С.143-163.

13. Воронин А.М., Скрябин Г.К, Кочетков В.В. Старовойтов И, И, Еремин A.A., Перебитюк А.Н. рВБ4-новая плазмида биодеградации нафталина //Докл. АН СССР. 1980.

14. Бузмаков С.А., Ладыгин И.В. Влияние нефтепромыслов на растительный и животный мир Камского Предуралья: Тез. докл. межгос. научн. конф., Пермь, май 1993 //Пермь: 1993. ч. 1, С. 201-205.

15. Вадюнина А. Ф., Корчагина 3. А. Методы исследования физических свойств почв // 3-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1986.- 416 с.

16. Габбасова И.М., Сулейманов P.P., Хазиев Ф.Х., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Фердман В.М., Ханисламова Г.М. Рекультивация серой лесной почвы, загрязненной нефтяным шламом//Нефтяное хозяйство. 2001. №7. С.81-84

17. Гайнутдинов- М.З., Самосова С.М., Артемьева Т.И., Гилязов М.Ю., Храмов И.Т., Гайсин И.А., Фильченкова В.И., Жеребцова А.К. Рекультивация нефтезагрязненныхземель лесостепной зоны Татарии // Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. С. 177197.

18. Головлев E.JI. Проблема интродукции микроорганизмов — деструкторов //Новые направления биотехнологии. Тез. докл. VI конф. РФ. Пущино, 24-26 мая, 1994. С. 9.

19. Градова Н.Б., Гориова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий рода Azotobacter при биорсмсдиации нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. и микробиол. -2003. Т. 39. №3. С. 318-321.

20. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г., Кочетков В.В., Филонов А.Е., Воронин А.М. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. № 4. Т.ЗЗ, С. 423-427.

21. Другов Ю.С., Родин A.A. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов // Практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. 270с.

22. Емельянова Е.К. Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами. Автореферат дис. . канд. биол. наук, Кольцово, 2009.

23. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Биологические характеристики штамма микобактерий, выделенного из нефти Ухтинского месторождения //Микробиология. 1997, Т.66. №5. С. 650-654.

24. Жолобов B.JL, Новохватко Т.Н., Шумская Г.И.//Тез.докл. конф. «Проблемы, способы и средства защиты окружающей ерды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». М., 1995, с.73-74.

25. Жуков Д.В. Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений, автореферат, Москва, 2008

26. Звягинцев Д.Г., Гузеев С.А., Левин С. В. Диагностические признаки различных уровней загрязнений почвы нефтью // Почвоведение. 1998. Т. 1. С 72-78.

27. Зеленкова Н.Ф, Аринбасаров М.У. Анализ продуктов микробиологической деградации толуола методом обращено-фазной жидкостной хроматографии // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39. - № 2. - С. 199-201.

28. Зубайдуллии A.A. К вопросу рекультивации нефтезагрязненных земель на верховых болотах // Биологические ресурсы и природопользование. Сборник научных трудов. -Нижневартовск: Изд-во Нижневарт. пед. ин-та, 1998. Вып. 2.-С. 106-116.

29. Ившина И. В., Куюкина М. С, Рычкова М. И. Экологические аспекты использования алканотрофных родококков — новых продуцентов биосурфактантов // Тез. докл. сем. «Экол. безопас. зон градопром. агломераций Зап. Урала» Перм.ГУ. Пермь. 1993. С. 29-30

30. Измалкова Т.Ю. Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад: Дис. канд. биол. наук. Пущино, 2004. 129 с.

31. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов СЛ., Кошелева И.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 342 -348.

32. Исмаилов Н.И., Пиковский Ю.И. Современное состояние методов рекультивации нефтезагрязненных земель // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. -М.: Наука. 1988.-С. 222-236

33. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв// Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. - С. 42-57.

34. Ихсанов В.Б., Ихсанова H.A. Способ обработки призабойной зоны нефтедобывающей скважины. Патент РФ 2156353, 2000.

35. Квасников Е.И., Ключникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев; Наукова думка. 1981. 165 с.

36. Киреева H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах: Автореф. дис.-.д-ра биол. наук- СПб, 1996. 25 с.

37. Киреева H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: Издательство БашГУ, 1995. 172 с.

38. Киреева H.A., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M., Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа.: Гилем. 2001. - 376с.

39. Кобзев E.H., С.Б. Петрикевич, А.Н. Шкидченко. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов нефтедеструкторов в открытой системе. Прикладная биохимия и микробиология, 2001, Т.37, №4, С. 413-417.

40. Кожанова Г.А. Способ получения бактериального препарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами. Патент РФ 2033975, 1991.

41. Коломынцева М.П., Соляникова И.П., Головлев E.JL, Головлева Л.А. Гетерогенность Rhodococcus opacus 1СР как ответ на стрессовое воздействие хлорфенолов. Т.41, №5, 2005, стр. 541-546.

42. Коронелли Т.В. Микробиологическая деградация углеводородов и ее экологические последствия. Биологические науки. 1982г. №3. С. 5-12.

43. Коронелли Т.В, Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов//Успехи микробиологии. 1980.Вып. 15. С.99-111

44. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 6. С. 579 585.

45. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 5. С 917-923.

46. Кочетков В.В. Плазмиды биодеградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas. // Дисс. канд. биол. наук. -Пущино, 1985.

47. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А., Воронин A.M. Плазмиды, кодирующие биодеградацию нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas II Микробиология. 1997. Т. 66. №2. С. 211-216.

48. Кочетков В.В., Старовойтов И.И., Воронин A.M., Скрябин Г.К. 1985. Плазмида pBS241 Pseudomonas putida, контролирующая деградацию бифенила. Докл. АН СССР.

49. Кошелева И.А., Цой Т.В., Ивашина Т.В., Селифонов С.А. Старовойтов И.И., Воронин A.M. Мутации плазмиды pBS286, блокирующие первичные этапы окисления нафталина, индуцированные Тп5 // Генетика. 1988. № 24. С. 396.

50. Кулакова А.Н. Природа генетического контроля деградации нафталина и салициловой кислоты у штамма Pseudomonas putida BSA202. // Дисс. канд. биол. наук. — Пущино, 1988.

51. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Коростина O.A. Модель нефтеотмывания загрязненного почвогрунга под действием -й/грс/ососсмя-биосурфактаита // Российский журнал биомеханики. 2006. - Т. 10. -№ 1. - С. 59-67.

52. Логинов О. Н., Силищев H. Н., Бойко Т. Ф., Галимзянова Н. Ф. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от технологических загрязнений / Уфа: Гос. изд. науч.-техн. лит. Реактив. 2000. - 100 с.

53. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков СП., Силищев H.H. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2004. - № 1. - С. 77-82.

54. Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом. Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (РОСГИДРОМЕТ). Ростов-на Дону. 2007. 28с.

55. Мурзаков' Б.Г., Заикина А.И., Рогачева P.A., Семенова Е.В. Способ микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений. Патент РФ 2067993, 1993.

56. Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный C.B. Биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2174496, 1999.

57. Новоселова Е.И. Структурно-функциональная трансформация биогеоценоза при нефтяном загрязнении и пути его восстановления: Монография. Уфа: РИО БашГУ. 2004. - 126с.

58. Оборин A.A., Калачникова И.Г., Масливец Т.А., Базенкова Е.И., Плещева О.В., Оглоблина А.И. // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. С. 140-159.

59. Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии: Методические указания. Под. Ред. Кучурова Л.С., Максакова Е.И. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. 16с

60. Панченко Л.В., Турковская О.В., Дубровская Е.В., Муратова А.Ю. Методические рекомендации по биорекультивации нефтезагрязненных земель. Изд-во Саратовского Унта. 2003. - 28 с.

61. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. «Мир». 1978. С. 14-33

62. Петров A.A. Углеводороды нефти. М.: Наука, 1984. - 264 с.

63. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде/ М.: Изд-во МГУ, 1993. - 182 с.

64. Пиковский Ю.И., Геннадиев А.Н., Чернянский С.С., Сахаров Г.Н. Проблема диагностики и нормирования почв нефтью и нефтепродуктами/ Почвоведение. 2003. -№9.-С. 1132-1140

65. Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Тураковская О.В. Биодеградация нефтяных углеводородов штаммом Dietzia Maris, ее генетические особенности. Известия саратовского университете. Серия Биология, химия, экология, вып.1. 2007. С. 54-57.

66. Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградация минерального масла штаммом Acinetobacter calcoaceticus // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т. 37.№ 4. С. 398-405.

67. Плешакова Е.В., Позднякова H.H., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путём стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41. № 6. С. 634-639.

68. Поконова Ю.В. Нефть и нефтепродукты, 2003, 902с.

69. Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / Под ред. Нетрусова А.И. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.

70. Прозоров A.A. Горизонтальный перенос у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики. Микробиология, 1999, Т. 68, №5, с. 635-646.

71. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Ахметов Л.И., Карпов A.B., Воронин А.М. Деградация фенантрена бактериями родов Pseudomonas и Burkholderia в модельной почве. Микробиология, 2008, С. 398-405.

72. Саксон В.М., Кузнецов С.А., Кретов A.B., Хромых Д.П., Бойкова И.В., Новикова И.И., Конев Ю.Е., Чумакова А.Я. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2138451, 1997

73. Сафонова Г.И.//Современные методы исследования нефтей/ Под ред. Богомолова А.И. Л.:Недра, 1984, с. 153-156

74. Сергиенко С. Р., Таимова Б. А., Талалаев Е.И. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти, М., 1979, с. 263-313.

75. Сидоров Д.Г., Борзенков М.Б., Мелехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В.//Прикл. Биохимия и микробиология.1998. Т.34.№3, с.281-286.

76. Сидоров Д.Г.//Современные методы очистки территорий от нефтяных загрязнений (мат. конф.).М.: НТЦ ЛУКойл, 1996. С.50-54.

77. Скрябин Г. К., Головлева Л. А. Биотехнология очистки окружающей среды от ксенобиотиков. //Изв. АН СССР: Сер. Биологическая. 1986. - № 6. - С. 805 - 813.

78. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. -№5.-С. 534-539

79. Стадницкий Г.В. Экология: Учеб. пособие/ Г.В, Стадницкий, А.И. Радионов. — М.: Высш. шк., 1988. -272 с.

80. Станкевич Д.С. Использование углеводородокисляющей бактерии Pseudomonas для биоремидиации нефтезагрязненных почв /Автореф, дис. канд. биол. наук. Москва, 2002.

81. Суржко Л. Ф., Финкелыптейн 3. И., Баскунов Б. П., Янкевич М. И., Яковлев В. И., Головлева Л. А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 3. - С.393-398.

82. Хабибуллин P.A., Коваленко М.В. Состояние исследований по оценке и ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью по её фитотоксичности // Рекультивация земель в СССР: Тез. докл. всесоюзн. науч.-техн. конф. М., 1982. -Т.2. С. 149-152.

83. Хазиев Ф.Х., Кольцова Г.А., Рамазанов Р.Я., Мукатанов А.Х., Габбасова И.М., Хамидуллин М.М., Хабиров И.К. Почвы Башкортостана. Т.2: Воспроизводство плодородия: зонально-экологические аспекты / Под ред. Ф.Х. Хазиева. Уфа: Гилем, 1997. - С.288-299

84. Хомякова Д. В., Ботвинко И. В., Нетрусов А. И. Выделение психроактивных углеводородокисляющих бактерий из нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим и микробиол. 2003. - Т. 39. - № 6. - С. 661 - 664.

85. Хомякова Д.В. Состав углеводородокисляющих микроорганизмов нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми: Диссертация . кандидата биологических наук: 03.00.07, Москва, 2003, 114 с.

86. Черников В.А. Алексахин P.M., Голубев A.B. и др. Агроэкология. Под ред. В.А. Черникова, А.И. Чекереса. -М.: Колос. 2000. 536с.

87. Чугунов В.А., Ермоленко З.М., Жиглецова СН. и др. Создание и применение жидкого биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий //Прикладная биохимия и микробиология. 2000.- Т. 36.- №6.- С. 666-671.

88. Шестопалов А.М., Забелин В.А., Алексеев А.Ю. Препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2337069, 2007.

89. Шилова И.И. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях' таежной зоны // Восст. нефтезагр. почв. экое. -М.: Наука, 1988. — С. 112-122.

90. Шкидченко А.Н., Аринбасаров М.У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. -Т. 38.-№5.-С. 509-512.

91. Штина Э.А. Особенности почвенной альгофлоры в условиях техногенного загрязнения // Почвоведение. 1985. -№10. - С. 97-106.

92. Штина Э.А., Некрасова К.А. Водоросли загрязненных нефтью почв: состояние вопроса и задачи исследования // Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. - С. 5781.

93. Щеблыкин И.Н., Битгеева М.Б., Бирюков В.В.//Трубопроводный транспорт нефти. 1995. №3, с. 19-28.

94. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности. Учеб. Пособие. - Уфа, 2001. -213с.

95. Ягафарова Г.Г., Хлесткий Р.Н., Ягафаров И.Р. Испытания биопрепарата "Родотрин" для ликвидации нефтяных загрязнений на территории Татарстана // Нефтепереработка и нефтехимия. 1998. - №7. - С. 45-47.

96. Aislabie J., Foght J., Saul D. Aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from soil near Scott Base, Antarctica. // Polar. Biol. 2000. - Vol. 23. - P. 183-188.

97. Anokhina T.O., Volkova O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., Kochetkov V.V., Boronin A.M. Plant growth-promoting Pseudomonas bearing catabolic plasmids: naphthalene degradation and effect on plants // Process Biochemistry. 2006. V.41. №12. P.2417-2423.

98. Baird C. Polynuclear Aromatic Hydrocarbons (PAHs). In: Enviromental chemistry. University of Western Ontario. W.N. Freeman and Company. New York. 1995. - P. 272-274.

99. Baraniecki C.A., Aislabie J., Foght M. Characterization of Sphingomonas Ant-17, an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium isolated from Antarctic soil // Microbial ecol. 2002. -V. 43.-No 1.-P. 44-54.

100. Bentley W. E., Mirjalili N., Andersen D.C., Davis R.H., Kompala D.S. Plasmid-encoded protein: the principal factor in the "metabolic burden" associated with recombinant Bacteria. Biotechnology and Bioengineering. 1990. V. 35. P. 668-681.

101. Birnboim H.C., Doly J.A. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmids DNA //Nucl. Acid. Res. 1979. V. 7. N 6. P. 1513.

102. Bodour A., Drees K. P., and Maier R. M., 2003. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid southwestern soils. Appl. Environ. Microbiol., 2003, v. 69, № 6, pp. 3280-3287.

103. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies// Bioresource Technology. -2000. V.74. P.63-67

104. Boronin A. M., Grinshchenkov V.G., Karpov A.V. Seleznev S.G., Tokarev V.G., Arinbasarov M.U., Gajazov R.R., Kuzmin N.P.//Process Biochemistry. 1997.V.32.#1.P. 13-19.

105. Britton L.N. Microbial Degradation of Aliphatic Hydrocarbons. In: Microbial Degradation of Organic Compounds. Gibson D.T. (Ed.). Marcel Dekker, New York. 1984.-P. 89-129.

106. Burton N.F., Day M.J., Bull A.T. Distribution of bacterial plasmids in clean and polluted sites in a South Wales river. Appl Environ Microbiol. 1982 V. 44. № 5. P. 1026-1029.

107. Canosa I., J. M. Sanchez-Romero, L. Yuste, and F. Rojo. A positive feedback mechanism controls expression of AlkS, the transcriptional regulator of the Pseudomonas oleovorans alkane degradation pathway. Mol. Microbiol. 2000. V.35. P. 791-799.

108. Castaldi F. Tank-based bioremediation of petroleum waste sludges// Environmental Progress. V. 22. Issue 1. 2003. - P. 25-36

109. Cerniglia C.E. Microbial Metabolism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Laskin A (Ed) Advances in Applied Microbiology. Academic Press. New York. 1984. V. 30. P.31-37.

110. Chaillan F. Factors inhibiting bioremediation of soil contaminated with weathered oils and drill cuttings / F. Chaillan, C.H. Chaineau, V. Point, A. Saliot, J. Outdot // Environmentall Pollution. 2006. V. 144. - N. 1. - P. 255-265.

111. Chakrabarty AM. Plasmids in Pseudomonas. Annu Rev Genet. 1976; Y.10, P.7-30.

112. Cheng Q., Thomas S.M., Kostichka K., Valentine J.R., Nagarajan V. Genetic Analysis of a Gene Cluster for Cyclohexanol Oxidation in Acinetobacter sp. strain SEI9 by In Vitro Transposition // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - №. 17. - P. 4744 - 4751.

113. Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolitica // Appl. And Environ. Microbiol. 1984. P. 747-750.

114. Connors M.A., Barnsley E.A. Naphthalene plasmid in Pseudomonas. 1982. V. 149. P. 1096.

115. Cooper D.G. and Goldenberg B. G. Surface-active agents from.two Bacillus species // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. P. 224-229.

116. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonas. The ring-fission mechanism// Biochem. J. 1964. - V. 91. - P. 251-261.

117. De Lipthay J.R., Barkay T., S0rensen S.J. Enhanced degradation of phenoxyacetic acid in soil by horizontal transfer of the tfdA gene encoding a 2,4-dichlorophenoxyacetic acid dioxygenase // FEMS Microbiol. Ecol. 2001 V. 35. P: 75-84.

118. Dean-Ross D., Moody J.D, Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Metabolism of anthracene by aRhodococcus species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 204. -No l.-P. 205211.

119. Desai J, Banat I. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. №1. P. 47-64

120. Di Gioia D., Peel M., Fava F., Wyndham R.C. Structures of homologous composite transposons carrying cbaABC genes from Europe and North America // Appl Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1940-1946.

121. Diaz E., Ferrandez A., Prieto M.A., Garcia J.L. Biodégradation of Aromatic Compounds by Escherichia colill Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65. - No. 4. - P. 523-569.

122. Dockyu Kim, Young-Soo Kim, Seong-Ki Kim, Si Wouk Kim, Gerben J/ Zylstra, Young Min Kim, Eungbin Kim. Monocyclic aromatic hydrocarbon degradation by Rhodococcus sp. Strain DK1 111 Applied and environmental Microbiology// July. P. 3270-3278. 2002

123. Dombek P.E., Jonson L.K., Zimmrley S.T., Sadowsky M.J. Use of repetitive DNA sequences and the PCR To differentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources. // Appl. and Environ. Microbiol. 2000. Y.66. № 6. P. 2572-2577.

124. Don R.H., Pemberton J.M., Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus //J. Bacteriol. 1981. V. 145. P. 681-686.

125. Dunn N.W., Dunn H.W., Austen R.A. Evidence for the existence of two catabolic plasmids coding for the degradation of naphthalene // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117. P. 529.

126. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation inPseudomonasputida. J. Bacteriol. 1973. V.l 14. P. 974-979.

127. Dutta T. K. and Harayama S. Biodégradation of n-Alkylcycloalkanes and n-Alkylbenzenes via New Pathways in Alcanivorax sp. Strain MBIC 4326 //Appl. Envir. Microbiol., 2001. V. 67. № 4. P. 1970 1974.

128. Ensly B.D., Gibson D.T. Naphthalene Dioxygenase: Purification and Properties of a Terminal Oxygenase Component // J. Bacteriol. 1983. - Vol. 155, № 2. - P. 505-511.

129. Evans CGT, Herbert D, Tempest DW. The continuous cultivation of microorganisms: II.

130. Construction of a chemostas // Methods Microbio. 1970. V.2. P. 277 327.

131. Ferrari M.D., Neirotti E., Albornoz C. Occurrence of heterotrophic bacteria and fungi in an aviation fuel handling system and its relationship with fuel fouling // Rev. Argent. Microbiol. -1998. V. 30,-No 3.-P. 105-114.

132. Francy D., Thomas J., Raymond R., Ward C. Emulsification of hydrocarbons by subsurface -bacteria //J. Industrial Microbiol. 1991. V. 8. №4. P. 237-246.

133. Frantz B, Ngai KL, Chatterjee DK, Ornston LN, Chakrabarty AM. Nucleotide sequence and expression of clcD, a plasmid-borne dienelactone hydrolase gene from Pseudomonas sp. strain B13. J Bacterid. 1987. V. 169(2). P.704-709.

134. Fredrickson J.K., Hicks R.J., Li S.W., Brockman F.J. Plasmid Incidence in Bacteria from Deep Subsurface Sediments. Appl Environ Microbiol. 1988 V. 54. № 12. P. 2916-2923.

135. Fuchs G. Oxidation of organic compounds. In: Biology of the Prokaryotes. (Ed. by J. W. Lengelar, G. Drews, H. G. Schlegel), Stuttgart: Georg Verlag, 1999. p. 187-233.

136. Gallego J.L., Loredo J., Llamas J.F., Vazquez F., Sanchez J. Bioremediation of diesel-contaminatcd soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation // Biodegradation.- 2001. V. 12. - No 5. - P. 325 - 335.

137. Gray P. H., Thornton H.G. Soil Bacteria that can decompose certain aromatic compounds. Zentralblatt fiir Bakteriologie. -1928. -Vol.73. P.74 -79.

138. Greated A., Lambertsen L., Williams P.A., Thomas C.M., Complete sequence of the IncP-9 TOL plasmid pWWO from Pseudomonas putida II Environ. Microbiol. 2002. V. 2. P. 856-871.

139. Gregersen T. Rapid method for distinction of Gram-negative from Gram-positive bacteria // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. V. 5. P. 123.

140. Grimm A. C., Harwood C. S. Chemotaxis of Pseudomonas sp. to the polyaromatic hydrocarbon naphthalene // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 4111-4115.

141. Hada H. S., Sizemore R. K. Incidence of Plasmids in Marine Vibrio spp. isolated from an Oil Field in the Northwestern Gulf of Mexico. Appl Environ Microbiol. 1981 V. 41. № 1. P. 199-202.

142. Hallier-Soulier S, Ducroco V, TrufFaut N. Conjugal transfer of a TOL-like plasmid and extension of the catabolic potential of Pseudomonas putida Fl, Can J Microbiol. 1999. V. 45(11). P. 898-904.

143. Hamamura N., C. M. Yeager, and D. J. Arp. Two distinct monooxygenases for alkane oxidation in Nocardiodes sp. strain CF8. Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4992-4998.

144. Hamer G., Al-Awadhi N. Biotechnological applications in the oil industry// Acta Biotechnologica.- V. 20, Issue 3-4. 2000. - P. 335-350

145. Hanson K.G., Nigam A., Kapadia M., Desai A.J. News & Notes: Bioremediation of Crude Oil Contamination with Acinetobacter sp. A3 // Curr. Microbiol. Issue. -1997. V. 35. - No 3. -P. 191 - 193.

146. Harayama S., Rekik M.The meta cleavage operon of TOL dcgradative plasmid pWWO comprises 13 genes.//Mol.Gen Genet. 1990. V.221. № 1. P. 113-120.

147. Heath DJ., Lewis C.A., Rowland S.J.//Org. Geochem, 1997, V. 26, N. 11 12, P. 769.

148. Hill K.E., Top E.M. Gene transfer in soil systems using microcosms // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 25. P. 319-329.

149. Hogan D.A., Buckley D.H., Nakatsu C.H., Schmidt T.M., Hausinger R.P. Distribution of the tfdA gene in soil bacteria that do not degrade 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) // Microb. Ecol. 1997. V. 34(2). P. 90-96.

150. Huang X.-D., El-Alawi Y., Gurska J., Glick B., Greenberg B. A multi-process phytoremediation system for decontamination of persistent total petroleum hydrocarbons (TPHs) from soils / // Microchemical Journal. 2005. - V. 81. - P. 139-147.

151. Ionata E., De Blasio P., La Cara F. Microbiological degradation of pentane by immobilized cells of Arthrobacter sp. //Biodégradation. 2005. - V. 16. - No 1. -P. 1-9.

152. Ishige T., A. Tani, Y. Sakai, and N. Kato. Long-chain aldehyde dehydrogenase that participates in n-alkane utilization and wax ester synthesis in Acinetobacter sp. strain M-l. Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3481-3486.

153. Jirasripongpun K. The characterization of oil-degrading microorganisms from lubricating oil contaminated (scale) soil // Letters in Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. No 4.-P. 296-300.

154. Kim D, Kim YS, Kim SK, Kim SW, Zylstra GJ, Kim YM, Kim E. Monocyclic aromatic hydrocarbon degradation by Rhodococcus sp. strain DK17. Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68(7). P. 3270-3278.

155. King E., Ward M., Raney D. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. 1954. V. 44. № 2. P. 301-307.

156. Knoke K.L., Marwood T.M., Cassidy M.B., Liu D., Seech A.G., Lee H., Trevors J.T. A comparision of five bioassay to monitor toxity during bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil// Water, Air and Soil Pollution. 1999. V.l 10.- P. 157-169

157. Kramer U., Chardonnens A.N. The use of transgenic plants in the bioremediation of soils contaminated by trace elements// Appl Microbiol Biotechnol. 2001. - №55. - P.661-672

158. Krasowiak R., Smalla K., Sokolov S., Kosheleva I., Titok M., Thomas C.M. PCR primers for detection and characterization of IncP-9 plasmids. FEMS Microbial. Ecol. V. 2(2), 2002. P. 217-225.

159. Leahy J G and Colwell R R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol Rev. 1990 September; 54(3): 305-315.

160. Lee N., M. Hwang, G. Jung, Y. Kim, and K. Min. Physical structure and expression of alkBA encoding alkane hydroxylase and rubredoxin reductase from Pseudomonas maltophilia. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 218. P. 17-21.

161. Liu Y., Zhang J., Zhang Z. Isolation and Characterization of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons-Degrading Sphingomonas sp. Strain ZL5 // Biodégradation. 2004. -V. 15.-No 3.-P. 205-212.

162. Malachovsky K. J., Phelps T.J., Teboli A.B., Minnikin D.E. White D.C. Aerobic mineralization of trichloroethylene, vinyl chloride, and aromatic compounds by Rhodococcus species. Appl. Environ. Microbiol. -1994. Vol. 60. -P. 542-548.

163. Marchai R., Penet S., Solano-Screna F., Vandecasteele J.P. Gasoline and Diesel Oil Biodégradation // Oil & Gas Science and Technology. 2003. - V. 58. - No. 4. -P. 441-448.

164. Margesin R., Labbe D., Schinner F., Greer C.W., Whyte L.G. Characterization of Hydrocarbon-Degrading Microbial Populations in Contaminated and Pristine Alpine Soils // J. Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69. - No. 6. - P. 3085-3092.

165. Margesin R., Schinner F. Bioremediation (Natural Attenuation and Biostimulation) of Dicsel-Oil-Contaminated Soil in an Alpine Glacier Skiing Area // Appl. Environ. Microbiol. -2001. -V. 67. No 7. - P. 3127-3133.

166. Marin J. A., Hernandez T., Gagcia C .Bioremediation of oil refinery sludge by landfarming in semiarid conditions: Influence on soil microbial activity // Environmental Research. 2005. -V. 98.-P. 185-195.

167. Mishra S., Jyot J., Kuhad R.C., Lai B. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludge-contaminated soil // Appl. and Environ. Microbiol. 2001. - V.4. -P. 1675-1681.

168. Mohn W.W., Radziminski C.Z., Fortin M.-C, Reimer K.J. On site bioremediation of hydrocarbon-contaminated Arctic tundra soils in inoculated biopiles//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.57. -P. 242-247

169. Murygina V., Arinbasarov M., Kalyuzhnyi S. Bioremediation of oil polluted aquatories and soils with novel preparation "Rhoder". // Biodégradation. 2000. -Vol. 11. No 6.-P. 385-389.

170. Murygina V.P., Markarova M.Y., Kalyuzhyi S.V. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic //Environ Int.-2005.-V. 31.-No2.-P. 163-166.

171. Olsen R. H., Kukor J. J., Kaphammer B. A novel toluene-3-monooxygenase pathway cloned from/5, pickettiiPKOl. J. Bacteriol. 1994. -Vol. 176. -P.3749-3756.

172. Osterreicher-Ravid D., Ron E.Z., Rosenberg E. Horizontal transfer of an exopolymer complex from one bacterial species to another // Environ. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 366-372.

173. Panke S., A. Meyer, C. M. Huber, B. Witholt, and M. G. Wubbolts. An alkane-responsive expression system for the production of fine chemicals. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P. 2324-2332.

174. Phillips T.M., Liu D., Seech A.G., Lee H., Trevors J.T. Monitoring bioremediation in creosote-contaminated soil using chemical analisis and toxity tests// Journ.of industrial microbiology &Biotechnology. 2000. - №24. - P. 132-139.

175. Pineda-Flores G. and Mesta-Howard A.M. Petroleum asphaltenes: generated problematic and possible biodégradation mechanisms // Rev. Latinoam. Microbiol. 2001. V.43. №3. P. MS-ISO.

176. Pineda-Flores G., Boll-Arguello G., Lira-Galeana C, Mesta-Howard A.M. A microbial consortium isolated from a crude oil sample that uses asphaltenes as a carbon and energy source // Biodégradation. 2004. - Vol. 15. - No 3. - P. 145-151.

177. Piskonen R., Nyyssonen M., Rajamaki T., Itavaara M. Monitoring of accelerated naphthalene-biodegradation in a bioaugmented soil slurry // Biodégradation. 2005. -Vol. 16.-No. 2.-P. 127-134.

178. Porits AL, Boronin AM, Skriabin GK. A strain of Pseudomonas aeruginosa growing on petroleum hydrocarbons. Prikl Biokhim Mikrobiol. 1983. V. 19(3). P. 347-52.

179. Rahman K.S, Thahira-Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I.M. Towards1 efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. // Bioresour. Technol. 2002 a. -Vol. 85.-No3.-P. 257-261.

180. Rahman K.S., Rahman T., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I. M. Occurrence of crude oil degrading bacteria in gasoline and diesel station soils // J. Basic Microbiol. 2002 b. - Vol. 42. -No 4. - P. 284-291.

181. Ron E.Z. Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants // Environ. Microbiol. 2001. - V. 3. - P. 229-236.

182. Rossello-Mora R.A., Laluoat J., Garoia—Valdes E. Comparative Biochemical and Genetic Analysis of Naphthalene Degradation among Pseudomonas stutzeri Strains // Appl. Environ. Microbiol. 1994.-V. 60. P. 212-219.

183. Rouviere P.E. and Chen M.W. Isolation of Brachymonas petroleovorans CHX, a novel cyclohexane-degrading beta-proteobacterium // FEMS Microbiol Lett. 2003. V.227. №1. P. 101106.

184. Saboo V.M., Gealt M. A. Gene sequences of the pcpB gene ofpentachlorophenol-degrading Sphingomonas chlorophenolica found in nondegrading bacteria // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44(7). P. 667-675.

185. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. 480 p.

186. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralisation of naphtalene, phenanthrene and untracene // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 19311937.

187. Sayler G.S. The use of DNA: DNA colony hybridization in the rapid isolation of 4-chlorobiphenyl degradative bacterial phenotypes // Microb. Ecol. 1990. V. 19. №1. P. 1 20.

188. Schwartz E., Scow K.M. Repeated inoculation as a strategy for the remediation of low concentrations of phenanthrene in soil // Biodegradation. 2001. - V. 12. - No 3 .-P. 201-207.

189. Seo J. H., Bayley J.E. Effect of recombinant plasmid content on growth properties and cloned gene product formation in E.coli. Biotechnology and Bioengineering. 1985. V. 27, P. 1668-1674.

190. Sharma S.L., Pant A. Biodegradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus // Bio degradation Issue. 2000. - V. 11. - No. 5. - P. 289 -294.

191. Shukla O.P. Bio degradation for environmental management // Everyman's Sei. 1990. V. 25. №2. P. 46-50.

192. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Bacterial Degradation of Low Concentration of Phenanthtrene and Inhibition by Naphthalene // Microb. Ecol. -1996. Vol. 31. - P. 305-317.

193. Sim L. Production and characterization of a biosurfactant isolated from Pseudomonas aeruginosa UW1 //J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1997.V.19. P. 232-238.

194. Sims J.I., Sims R.N., Matthews J.E. Approach to bioremediation of contaminated soil// Haz. Waste Haz. Matter. 1990. V. 7. P. 117-149.

195. Smith M.R. The physiology of aromatic hydrocarbon degrading bacteria. Biochemistry of microbial degradation. 1994. -P. 347-378.

196. Smits T.H.M., Balada S.B., Witholt B., van Beilen J.B. Functional analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and gram-positive bacteria // J. Bacterid. -2002.-V, 184.-No. 6.-P. 1733-1742.

197. Sutherland J.B., Rafll F., Khan A.A., Cerniglia C.E. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. In: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals. Willey-Liss, Inc. 1995. P. 269-306.

198. Tadashi F., Tatsuya N., Koji T., Junichi K. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. - V. 68. -№. 10. - P. 2171 - 2177.

199. Tagger S., Truffaut N., Le Petit J. Physiological and genetic features of naphthalene metabolism by two bacteria isolated from a matine sediment // J. Bacteriol. Marine. 1984. V. 331. P. 191.

200. Tan H.M., Joannou C.L., Cooper C.E., Butler C.S., Cammack R,, Mason J.R. The effect of ferredoxin(BED) overexpression on benzene dioxygenase activity in Pseudomonas putida ML2. J Bacteriol. 1994. V. 176(9). P. 2507-2512.

201. Thouand G., Bauda P., Oudot J., Kirsch G., Sutton C., Vidalie S. Laboratory evaluation of crude oil biodégradation with commercial or natural microbial inocula // Can. J. Microbiol. 1999. V.45. P.106-115.

202. Toledo F.L., Calvo C, Rodelas B., Gonzalez-Lopez J. Selection and identication of bacteria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities // Syst. and Appl. Microbiol. 2006 - Vol. 29. - No 3. - P. 244-252.

203. Van Beilen J. B., Wubbolts M. G. and B. Witholt. Genetics of alkane oxidation by Pseudomonas oleovorans. Biodégradation 1994. V.5. P. 161-174.

204. Van Beilen J.B., Li Z., Ductz W.A., Smits T.H.M., Witholt B. Diversity of Alkane Hydroxylase Systems in the Environment // Oil & Gas Science and Technology. -Rev. IFP. -2003. Vol. 58. - No. 4. - P. 427-440.

205. Van Hamme J. D., Ajay Singh and Owen P. Ward. 2003. Recent Advances in Petroleum Microbiology. Microbiology and molecular biology reviews. Vol. 67. No. 4. P. 503-549.

206. Wallace W.H., Sayler G.S. Catabolic plasmids in the environment. // Encyclopedia of Microbiology. 1992. V. 1. P. 417-430.

207. Warhurst A.M., Fewson C.A. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus. CRC Crit. Rev. Biotechnol. -1994. -Vol.14. -P. 29-73.

208. Watanabe K., Kodama Yu., Kaku N. Diversity and abundance of bacteria in an anderground oil-storage cavity// BMC Microbiol. — 2002. — V. 2. No 23. P. 1471-1481.

209. Weisburg W.G., Barnes S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study//Journal ofBacteriology.1991. V.73. P.697-703.

210. Whyte L. G., Hawari J., Zhou E., Bourbonniere L., Inniss W., Greer C.W. Biodégradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - No. 7.-P. 2578-2584.

211. Worsey M. J., Williams P. A. Metabolism of toluene and xylenes by P. putida (arvillajmt-2; evidence for a new function of the TOL plasmid. J. Bacteriol. -1975. Vol. 124. -P. 7-13.

212. Wouter A. Duetz, Johan G. van Andel. Stability of TOL plasmid pWWO in Pseudomonas putida mt-2 under non-selective conditions in continuous culture. Journal of General Microbiology. 1991. V. 137. P. 1369-1374.

213. Yen K.M., Serdar C.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1988. -V. 15. P. 1983-1990.

214. Ylihonko K., Hakala J., Niemi J., Lundell J., Mantsala P. Isolation and characterization of aclacinomycin A-non-producing Streptomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants // Microbiology. 1994. V. 140. P. 1359-1365.

215. Yuste L., and F. Rojo. Role of the crc gene in catabolic repression of the Pseudomonas putida Gpol alkane degradation pathway. J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6197-6206.