Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация новых экзометаболитов некоторых штаммов Pseudomonas spp. и технология биопрепаратов на их основе
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Идентификация новых экзометаболитов некоторых штаммов Pseudomonas spp. и технология биопрепаратов на их основе"
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ НЕКОТОРЫХ ШТАММОВ Pseudomonas spp. И ТЕХНОЛОГИЯ БИОПРЕПАРАТОВ
НА ИХ ОСНОВЕ
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии), 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
1 5 Ш? Z0i2
Уфа 2012
005011793
005011793
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Логинов Олег Николаевич доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Кудоярова Гюзель Радомесовна
доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзинурович
доктор биологических наук, профессор Чернова Ольга Александровна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Защита состоится 30 марта 2012 г. в 14ш часов на заседании Объединенного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69. Тел/факс: 8(347) 235-62-47, e-mail: ib@anrfa.ru
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69, с авторефератом - в сети Интернет по адресу http;//www. anrb.ru/inbio/dissovet/indexiitm и на сайте ВАК Минобрнауки РФ.
Автореферат разослан
/
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент
' к
Р.В. Уразгильдин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Бактерии рода Pseudomonas - одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов и обладающих совокупностью полезных для растений свойств (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Воронин, 1998; Логинов и др., 2001; Weller, 1988; Dowling & O'Gara, 1994; Bloemberg & Lugtenberg ,2001; Whipps, 2001).
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации. В свою очередь, ризосферные бактерии обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений.
Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогенные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция бактериями различных низкомолекулярных веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al„ 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al., 1997; Suzumura et al., 1997; Thrane et al., 1999; Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001; Quail et al., 2002; Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа. Эти антигрибные метаболиты имеют различную химическую структуру и некоторые из них обладают способностью к комплексообразованию с экзометаболитами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста. Однако эта способность для метаболитов бактерий рода Pseudomonas практически не изучена. В тоже время, установление механизмов действия метаболитов бактерий рода Pseudomonas на фитопатогены необходимо для разработки эффективных способов защиты растений.
С другой стороны широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ризосферных бактерий рода Pseudomonas сдерживается отсутствием стандартных технологий их производства. Нужно отметить, что при производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии одной из главных проблем является высокая стоимость питательной среды.
Использование для оптимизации параметров технологии производства биопрепаратов в качестве методического аппарата методов математического планирования эксперимента позволяет не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния. Что в итоге позволит производить высокоэффективные биопрепараты с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностями даже с использованием в качестве компонентов сред вторичного сырья, например, автолизатов отработанных пивных дрожжей.
Учитывая, что потребность сельского хозяйства в средствах защиты растений увеличивается с каждым годом, проблема совершенствования технологии биологической защиты растений также представляется актуальной.
Цель исследования. Целью работы явилось определение биологической роли экзометаболитов бактерий рода Pseudomonas в их взаимодействии с фитопатогенными грибами, установление их химической природы, а также разработка технологии промышленного культивирования псевдомонад для производства сельскохозяйственных биопрепаратов на их основе.
Задачи исследования:
1. Выделить биологически активные метаболиты исследуемых штаммов Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, исследовать их физико-химические свойства, определить состав и структуру.
2. Изучить способность комплексообразования метаболитов штаммов Pseudomonas с различными углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, входящими в комплекс экссудатных выделений корней растений, а также с катионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия, свинца.
3. Установить стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат, метаболит : катион. Оценить комплексообразующую способность триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas как одного из механизмов их ингибирующего воздействия на фитопатогены.
4. Выявить условия максимальной продукции цитокининов штаммом бактерий Р. chlororaphis ИБ 6 в зависимости от состава питательной среды, определить их химическую структуру.
5. Изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов питательной среды на накопление биомассы и продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.
6. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.
Научная новизна.
Впервые показана способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать межмолекулярные комплексы с компонентами, входящими в корневые экссудаты растений: углеводами, органическими кислотами, аминокислотами, тем самым, лимитируя по субстрату фитопатогены. Установлено, что процесс комплексообразования триглицеридпептидов и компонентов экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.
Впервые показано, что метаболиты псевдомонад способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца.
Разработаны новые питательные среды (Патент РФ № 2303061, 2007) и технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
Практическая значимость.
Определены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений.
Разработаны новые экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений.
Установленная комплексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.
Основные положения, выносимые на защиту:
- исследуемые штаммы Pseudomonas spp. синтезируют новые экзометаболиты, обладающие фунгицидной и фитогормональной активностью;
- комплексообразование триглицеридпептидов с компонентами экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений;
- триглицеридпептады способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца;
- новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов сельскохозяйственного назначения на основе бактерий рода Pseudomonas с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток;
- технология промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XV, XIX и XX Международных научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002, 2006, 2008), I и II Международных конгрессах «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003), IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005),. IV Всероссийской научной internet-конференции (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008), 5-м Всероссийском научно-практическом совещании-семинаре, (Анапа, 2008), Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (КНР, Харбин - Санья, 2008).
Публикации. По материалам работы опубликовано 34 научных работы, в том числе 16 работ в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора. Все результаты, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора в период с 1999 по 2011 г. Планирование и проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (три главы), заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 335 ссылок. Работа изложена на 232 страницах машинописного текста и содержит 53 рисунка и 27 таблиц.
Благодарности. Автор выражает огромную признательность всем сотрудникам лаборатории биологически активных веществ Института биологии Уфимского научного центра РАН за постоянную поддержку при выполнении данной работы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами изучения являлись штаммы бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945, 2003), Р. chlororaphis ИБ 6 (Патент РФ № 2260951, 2005) и Р. putida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774,2003) из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, проявляющие антагонистические свойства в отношении ряда грибов - возбудителей болезней растений.
В качестве тест-объектов для анализа фунгицидной активности в работе использовали следующие фитопатогенные грибы: Bipolaris sorokiniana Shoemaker (= Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke), Fusaríum culmorum BKM 844, F. gibbosum BKM 848, F. graminearum BKM 1668, F. nivale BKM 3106, F. oxysporum BKM 137, F. semiteclum BKM 1938, F. solani BKM 142, F. avenaceum BKM 132, а также Alternaría altérnala и Penicillium funiculosum из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.
Культуры Pseudomonas поддерживали на агаризованной среде Кинг В (King et al., 1954). Для поддержания и культивирования микроскопических грибов использовали жидкую и агаризованную среды Чапека (Теппер и др., 1972).
Оптимизацию состава ферментационной питательной среды проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Максимов, Федоров, 1969) в два этапа:
- построение адекватной математической модели процесса путем связывания выходного параметра системы (антигрибная активность, титр клеток) с входными - концентрациями компонентов (факторов) питательной среды в полных факторных экспериментах (ПФЭ) по плану 24 с их варьированием на двух количественных уровнях (верхнем "+" и нижнем "-");
- нахождение собственно оптимального состава среды по схеме "крутого восхождения".
В качестве 4 факторов варьирования были взяты концентрации в питательной среде глицерина (Xt), дрожжевого автолизата (Х2), Na2HP04xl2H20 (Х3), КН2Р04х2Н20 (Х4). Уровни варьирования представлены в табл. 1, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано на постоянном уровне. Культуры выращивали при 28°С и п=180 мин'1 на воздушно-термостатируемой качалке УВМТ-12-250 в течение трех суток.
Таблица 1
Компоненты питательной среды и их уровни варьирования в ПФЭ 24
Компонент среды Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования
Глицерин, г/л X, 11,00 2,00 20,00 9,00
Дрожжевой автолизат, л/л Х2 0,13 0,01 0,25 0,12
Ыа2НР04х12Н?0, г/л X, 5,50 1,00 10,00 4,50
КН2Р04х2Н20, г/л х4 1,50 0,50 2,50 1,00
МЙ804Х7Н20, Г/Л Постоянный уровень - 1,50
РеС1,, г/л Постоянный уровень - 0,01
Оптимизацию условий культивирования проводили в ферментерах АК-210 (СКБ БП, Пушино) с рабочим объемом 6 л, количество посевного материала 2% по объему, аэрация - 0,5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем
среды также с применением метода математического планирования эксперимента на вновь разработанных средах. Для изучаемых штаммов были проведены полные факторные эксперименты по плану 23.
В качестве 3 факторов варьирования были взяты аэрация (Х/), температура (Х2') и продолжительность культивирования (Х3'), уровни варьирования представлены в табл. 2.
Таблица 2
Условия культивирования и их уровни варьирования в ПФЭ 23
Условия культивирования Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования
Перемешивание, об/мин х,1 160 140 180 20
Температура, °С Х2' 28 26 30 2
Продолжительность культивирования Хз1 72 48 96 24
Титр жизнеспособных клеток определяли методом предельных разведений на агаризованной среде Кинг В (King et al., 1954).
Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи подвергали термической обработке при 100 °С в течение 1 часа. Затем дрожжевой автолизат фильтровали и доводили рН до 6,8-7,2.
В качестве модельных компонентов корневых экссудатов растений использовали вещества квалификации ч.д.а. (Sigma, США), представленные в табл. 3.
Таблица 3
Типичные представители корневых экссудатов растений
(Dakora., Phillips, 2002; Haas, Keel., 2003)_
Углеводы Органические кислоты Аминокислоты
Арабиноза Яблочная кислота Алании
Ксилоза Фумаровая кислота Метионин
Фруктоза Янтарная кислота В алии
Глюкоза Лимонная кислота Аргинин
Галактоза Пировиноградная кислота Тирозин
Сахароза Молочная кислота Цистеин
Лактоза Пропионовая кислота Аспарагин
Рафиноза Кетоглутаровая кислота Лизин
Рамноза Щавелевая кислота Пролин
Маннит Триптофан
Выделение метаболитов с антигрибной активностью Pseudomonas проводили следующим образом. После удаления биомассы на центрифуге "К23 D" (3000 g , 20 мин) супернатант подвергали ультрафильтрации на модулях волоконного типа "Amicon ЗР-10 " (США), отбирая фильтрат, содержащий фракцию (< 3 кДа) внеклеточных метаболитов исследуемых штаммов. Фильтрат упаривали на вакуумном роторном испарителе при 35°С, примеси осаждали метанолом и отделяли центрифугированием в тех же условиях. После отгонки метанола из супернатанта, изучаемые вещества осаждали ацетоном.
Чистоту и гомогенность выделенных метаболитов проверяли при помощи ВЭЖХ в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р ("Gasukuro Kogyo", Япония), УФ - детектора ("Du Pont", США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) Zorbax-ODS (250x4,6 мм, "Shímadzu", Япония). Образцы вводили с помощью дозатора модели 7125 ("Rheodyne", США) с петлей объемом 20 мкл. В качестве элюента использовали воду, подвергнутую дополнительной очистке, при скорости элюции 1,0 мл/мин. Регистрировали поглощение при длине волны 254 нм.
Молекулярную массу выделенных метаболитов оценивали при помощи эксклюзионной хроматографии в системе, описанной выше, на колонке TSK G2000SW (300x7,8 мм, "Toyо Soda", Япония) при элюировании смесью 0,1 M фосфата натрия и 0,3 M хлорида натрия (pH 7,0) с расходом 1 мл/мин с УФ -детектированием при 254 нм. В качестве маркеров молекулярной массы использовали инсулин (Mr 5,8 кДа, "Lilly", Франция) и витамин Bi2 (Mr 1355 Да, ЗАО "Верофарм", Россия).
Аминокислотный анализ кислотных гидролизатов (6н. HCl, 24 ч, при 105°С) метаболитов был выполнен на анализаторе Т339М (Чехословакия).
Элементный состав метаболитов определяли на С, H, N - анализаторе HP Model 185 В (США) и по общепринятым методикам (Климова, 1967).
УФ - спектры регистрировали на спектрофотометре Specord М40 ("Carl Zeise", Германия) в области 200-330 нм (в воде), ИК - спектры - на спектрофотометре Specord М80 ("Carl Zeise", Германия) в области 400-4000 см'1 (в вазелиновом масле или в тонком слое).
Масс-спектры химической ионизации были получены электрораспылением (электроспрей) на квадрупольном жидкостном хромато-масс-спектрометре LCMS-2010 EV ("Shimadzu", Япония) (шприцевой ввод, раствор образца в ацетонитриле или в воде при расходе 60 мкл/мин, элюент -ацетоннтрнл/вода в соотношении 50/50).
Спектры ЯМР ПС регистрировали на спектрометре Bruker АМХ-Ш-300 (Германия) (рабочая частота 300,13 МГц), внутренний стандарт -тетраметилсилан (ТМС), растворитель - CD,OD. Расшифровку спектров проводили при помощи программы ChemNMR Pro.
Фитогормональную активность определяли при помощи иммуноферментного анализа (Кудоярова и др., 1986, 1990).
Способность штаммов Pseudomonas к росту и наличие антагонизма в отношении фитопатогенных грибов изначально определяли методом совместного выращивания антагонистов и фитопатогенов в чашках Петри на среде Чапека с различными источниками углерода. Суспензию спор тест-гриба высевали на агаризованную среду, а исследуемую культуру вносили, делая посев уколом поверх газона гриба. Чашки инкубировали в термостате в течение трех суток, при температуре 28 °С. Антагонизм выявляли по наличию вокруг колонии бактерии зоны подавления роста тест-гриба.
Антигрибную активность низкомолекулярных (НМ) фракций метаболитов (< 3 кДа) и очищенных образцов метаболитов определяли методом разведений (Широков и др., 2002). В пробирки вносили 0,25-3,0 мл препарата фракции метаболитов, либо препарата метаболита с концентрацией 1,2 мг/мл, добавляли 1 мл суспензии спор тест-гриба, 1 мл шестикратно концентрированной среды Чапека и дистиллированную воду до общего объема 6 мл. Засеянные пробы инкубировали при 28°С. Подавление роста гриба оценивали микроскопически относительно контроля, представляющего собой вышеописанную систему, но без внесения метаболитов. В качестве единицы активности принимали такое количество фракции метаболитов, при котором гриб не развивался в течение 4 суток. Антигрибную активность метаболитов в зависимости от химической природы экссудатных компонентов оценивали, как описано выше методом разведений, используя в качестве тест-объекта, возбудитель корневой гнили зерновых культур Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (= Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke).
Морфологические изменения, происходящие с микромицетами под воздействием метаболитов псевдомонад, изучали с помощью светового микроскопа "Amplival" 30 - G048a (Carl Zeiss Jena, Германия).
Комплексообразование исследовали спектрометрически в УФ -области по методу Бента - Френча (Бек, Надьпал, 1989), методом изомолярных серий (Булатов, Калинкин, 1976) и поляриметрически (Будников и др., 2003).
Для исследования методом Бента-Френча готовили водные растворы, содержащие постоянное количество метаболита (0,001 моль/дм3) и возрастающее количество модельного экссудатного компонента (далее экссудата), соответствующее мольным соотношениям метаболит : экссудат = 1:1, 1:10, 1:20, 1:50. Спектры поглощения полученных растворов записывали на спектрофотометре SPECORD М 40 (Carl Zeiss, Германия) при длине волны 265 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см. Измерения осуществляли через 15 минут после смешивания реагентов в условиях равновесной реакции. В канале сравнения находился раствор метаболита. После измерения оптической плотности растворов строили графики логарифмической зависимости оптической плотности от концентрации экссудата. Угловой коэффициент этой прямой tg а соответствовал стехиометрическому соотношению в комплексе метаболит: экссудат.
Для исследования вторым методом готовили изомолярную серию с соотношениями метаболит : экссудат от 1:9 до 9:1 (сохраняя неизменным общий объем) и начальными концентрациями веществ 5-Ю"4 моль/дм3. После измерения оптической плотности растворов строили графики зависимости оптической плотности от соотношения концентраций компонентов изомолярной серии:
A = f(C„/(C, + CM)),
где А - оптическая плотность раствора метаболит : экссудат;
С3 - концентрация экссудата в растворе метаболит : экссудат;
См - концентрация метаболита в растворе метаболит : экссудат.
При выявлении точки излома на полученном графике констатировали наличие межмолекулярного взаимодействия в системе, а по расположению точки излома на графике определяли стехиометрический состав образующегося комплекса метаболит : экссудат.
Методом поляриметрии по изменению угла вращения [а] в зависимости от мольного соотношения метаболит:экссудат cjcu на поляриметре Perkin Elmer 341 (США) подтверждали стехиометрию комплексообразования. Углы вращения снимались для водных растворов метаболитов (0,01 моль/дм3) и экссудатов (0,01 моль/дм3) в соотношениях, определенных УФ-спектрометрическими методами, вблизи образования комплекса. Отклонение угла вращения смеси этих растворов от монотонного изменения угла вращения находится в зависимости от мольного соотношения компонентов в смеси и указывает на образование комплекса метаболит : экссудат и его стехиометрию.
Образование межмолекулярных комплексов с катионами металлов и их стехиометрический состав определяли при помощи инверсионной вольтамперометрии на полярографе АВС-1.1 (НТФ «Вольта», Россия) методом изомолярных серий. Изомолярную серию готовили с соотношениями ион метапла:метаболит от 1:9 до 9:1 и начальными концентрациями веществ 10"3моль/дм3.
Вольтамперограммы снимались при температуре 25°С с водных растворов на фоне 0,1 моль/дм3 калия хлорида.
При выявлении точки излома на полученном графике установили наличие межмолекулярного взаимодействия в системе, а по расположению точки излома на графике определяли стехиометрический состав образующегося комплекса метаболит : катион.
Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m) и уравнения статистической значимости (Р) по Стьюденту для нормального типа распределения признаков. Зависимость одной переменной от другой считалась статистически значимой при р <0,05. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерных программ Microsoft Office Excel, STATISTICA V 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ Pseudomonas, ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ И ФИТОГОРМОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Способность штаммов Pseudomonas к росту и их антигрибная активность в средах с различными источниками углерода. Исследуемые штаммы бактерий рода Pseudomonas были способны к росту и секреции антигрибных метаболитов в средах с источниками углерода, представленными в таблице 3, что может положительно сказываться на их интеграции с растением и совместном функционировании в системе бактерии - растение - фитопатогены.
Таблица 4
Размеры зон ингибирования роста фитопатогена штаммами бактерий рода
Pseudomonas в зависимости от источника углерода
Источник углерода Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм
Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17
Аоабиноза 21.20il.16 23.60±1.02 23.20i0.98
Ксилоза 13.40±1.02 13.20±0.75 13.60il.20
Фруктоза 19.20±1.16 14.00±0.89 16.80il.33
Глюкоза 12.60±0.81 21.40±1.02 16.40i0.80
Галактоза 13.80±1.16 13.20±1.67 ll.20il.33
Сахароза 13.20±0.97 14.40±0.80 10.80i0.98
Рафиноза 14.60±0.49 11.20±0.75 12.20i0.75
Рамноза 13.40±1.01 13.80il.17 10.80i0.75
Маннит 13.80±0.74 21.40±1.02 16.60i0.50
Щавелевая кислота 19.60±0.81 13.80il.17 16.40i0.80
Поопионовая кислота 12.60±0.80 21.40il.02 16.40i0.50
Молочная кислота 14.20i0.74 13.20±1.17 10.40i0.80
Яблочная кислота 14.60±0.48 13.80i0.98 10.40i0.50
Пивовиногоадная 13.80±0.74 10.60il.02 12.40i0.80
Фумаровая кислота 13.40±1.01 ll.80i0.75 12.80il.33
Янтарная кислота 20.00±1.41 15.20il.33 16.40il.20
Кетоглутаоовая кислота 13.40il.02 21.80il.47 16.60il.02
Лимонная кислота 19.80Ü.17 14.80il.33 16.20il.17
Алании 14.40il.20 13.20il.17 ll.20il.33
В алии 14.80±0.98 13.60il.02 10.40i0.75
Шолин 15.20±0.75 10.20il.16 14.20i0.98
Метионин 19.20i0.98 14.20Ü.47 16.60il.47
ТоиптосЬан 13.20±0.98 20.60il.36 15.80Ü.17
Тиоозин 14.40il.20 ll.80i0.98 10.20i0.75
Аспаоагин 12.20il.17 12.40i0.49 13.80i0.98
Пистеин 19.40il.02 14.20i0.98 16.40il.41
Лизин 13.80il.47 21.40il.02 17.20i0.98
Аогинин 19.40Ü.02 14.20il.47 16.40i0.80
Глицерин 24,18±1,45 24,67il,19 23,90il,40
При совместном культивировании с микромицетом йгро/агл? эогокгтапа было выявлено, что изучаемые штаммы псевдомонад проявляли фунгистатическое действие специфично, т.е. диаметры зон ингибирования роста фитопатогена сильно варьировали в зависимости от источника углерода (табл. 4).
В условиях непосредственного взаимодействия со штаммами псевдомонад формирование мицелия всех тест-грибов значительно замедлялось по сравнению с контролем (наблюдалась задержка прорастания спор), а формирующийся мицелий грибов отличался ярко выраженными морфологическими изменениями.
Так, под воздействием штаммов-антагонистов происходило ограничение развития ростковых трубок с формированием на кончиках растущих гиф сферопластоподобных структур. Нарушения в развитии гиф приводили в свою очередь к формированию излишне разветвленного, часто септированного мицелия, напоминающего нитку бусин (рис. 1).
Рис. 1. Прорастание конидий и формирование мицелия Bipolaris sorokiniana: а - контроль; б, в - под воздействием метаболитов Pseudomonas-, Увеличение в 400 раз (а, б); в 1600 раз (в).
В нашем эксперименте образование сферопластоподобных структур, связанное очевидно с нарушением формирования стенки гифы под воздействием метаболитов псевдомонад, стимулировало преждевременное
ветвление. В числе других особенностей воздействия псевдомонад на морфогенез грибов следует упомянуть, например, то, что некоторые микромицеты не формировали воздушный мицелий; отсутствовало спорообразование. При этом необходимо подчеркнуть, что степень воздействия на гриб определялась радиальным градиентом концентрации метаболитов бактерий-антагонистов: вне зоны действия веществ формировался обычный мицелий гриба, а чем ближе к колонии бактерии, тем ярче были выражены аномалии в строении мицелия.
Подбор оптимальных условий культивирования и биосинтез метаболитов штаммами бактерий р. Pseudomonas. Сравнительный анализ полученных данных подбора оптимальных условий культивирования показал, что использование в качестве источника углерода различных органических веществ существенно влияет на образование антибиотических веществ культурами Pseudomonas. Было установлено, что максимальное количество низкомолекулярных антибиотических веществ образуется в средах, где в качестве источника углерода фигурирует глицерин. Вторым существенным фактором для накопления в среде наибольшего количества метаболитов с антигрибной активностью является природа источника органического азота. Оптимальным в нашем случае оказалось одинаковое соотношение дрожжевого экстракта и пептона по 0,5 %, что может быть связано со сбалансированностью факторов роста, витаминов и микроэлементов, входящих в их состав.
Оптимальными для секреции метаболитов с антигрибной активностью являлись температуры в диапазоне от 22 до 30 °С. Установлено, что в подобранных оптимальных условиях культивирование при температуре 22°С позволяло штаммам интенсивно накапливать метаболиты с антигрибной активностью на завершающей стадии экспоненциального роста к 28-30 ч, в дальнейшем активность практически не изменялась до окончания культивирования (рис. 2). Причем следовые количества антибиотических веществ обнаруживались в среде уже через 8 ч культивирования.
Повышение температуры культивирования до 30°С отрицательно сказывалось на накоплении метаболитов с фунгицидной активностью. Их секреция в среду начиналась через 30 ч, антигрибная активность была невысокой и не увеличивалась до окончания культивирования.
Снижение температуры культивирования до 15°С также приводило к уменьшению образования метаболитов с фунгицидной активностью и задержке их секреции в среду (через 40 ч), что может быть связано с замедлением роста культур.
При этом, максимальный титр клеток оставался высоким вне зависимости от температуры выращивания и составлял (6,5-7,0)- Ю10 КОЕ/мл КЖпри 22°С и (2,5-3,0yi0'° КОЕ/мл КЖ при 15 и 30°С.
В фазе стационарного роста и при переходе в стадию отмирания культуры секретировали во внешнюю среду ростстимулирующие вещества, что, в принципе, не является новым свойством для псевдомонад. Данные
иммуноферментного анализа по секреции ростстимулирующих веществ представлены в табл. 5.
О 16 32 48 64
Время культивирования, ч.
Рис. 2. Динамика периодического роста и накопления антибиотических веществ штаммом Р. chlororaphis ИБ 51: 1-3 - титр клеток, млрд. КОЕ/мл КЖ, при температуре 22°С (1), 30°С (2) и 15°С (3); 4-6 - антигрибная активность, ед./мл КЖ, при температуре 22°С (4), 30°С (5) и 15°С (6).
Таблица 5
Ростстимулирующие вещества штаммов Pseudomonas
Штамм Концентрация фитогормона, нг/мл КЖ
Цитокининподобные вещества ИУК
Р. chlororaphis ИБ 51 205 878
Р. putida ИБ 17 255 -
Р. chlororaphis ИБ 6 680 511
Определение состава низкомолекулярпых (НМ) фракций метаболитов штаммов Pseudomonas. Хроматографические профили НМ фракций метаболитов Pseudomonas представлены на рис. 3, а-в. При помощи препаративной ВЭЖХ из НМ фракций метаболитов были выделены 6 компонентов у штамма Р. chlororaphis ИБ 51, 10 компонентов у штамма Р. chlororaphis ИБ 6 и 11 - у Р. putida ИБ 17 (табл. 6). Покомпонентный анализ показал, что фунгицидной активностью обладает лишь один компонент из НМ фракции метаболитов каждого изучаемого штамма Pseudomonas. При хроматогафическом разделении эти компоненты первыми выходят с колонки,
они также не имеют ярко выраженного максимума поглощения в УФ -области. Остальные компоненты фракций за некоторым исключением имеют максимумы УФ - поглощения в интервале от 265 до 280 нм, характерные для регуляторов роста растений.
Таблица 6
Характеристики компонентов НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas
Штамм № компонента ^max в УФ, нм Фунгицидная активность Фитогормональная активность
Р. chlororaphis ИБ 51 1 — + -
2 275 - +
3 267 - +
4 267 - +
5 252; 257,5; 263,5 - -
6 267; 280 - +
Р. chlororaphis ИБ 6 1 — + -
2 274 - +
3 267 - +
4 — - -
5 — - -
6 267 - +
7 267 - +
8 252; 257,5; 263,5 - -
9 267 - +
10 272 - +
Р. pulida ИБП 1 — + -
2 263 - +
3 — - -
4 267 - +
5 272,5 - +
6 270 - +
7 268 - +
8 279,5 - +
9 — - -
10 276 - +
11 — - -
В/яг лкцщ ми, gIMt
Рис. 3. Хроматографические профили НМ фракций метаболитов КЖ штаммов Pseudomonas {Р. putida ИБ 17 (а), Р. chlororaphis ИБ 51 (б), Р. chlororaphis ИБ 6 (в)) и выделенных метаболитов этих штаммов, обладающих фунгицидной активностью (г); (ВЭЖХ, 254 нм, колонка Zorbax-ODS (250x4,6 мм, "Shimadzu", Япония), элюент - вода). Цифрами обозначены номера компонентов фракции.
Штамм Pseudomonas chlororapliis И Б 6 - продуцент цитокининов.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 запатентован в качестве продуцента цитокининов. В результате оптимизации условий культивирования показано, что штамм способен синтезировать цитокинины, максимальный выход которых составляет 1117,1 нг/мл КЖ - а это в 1,5 раза превышает заявленные в патенте 680 нг/мл КЖ. Хроматографический профиль низкомолекулярной фракции образца с максимальной фитогормональной активностью представлен тремя компонентами (рис. 4). Один компонент обладает антигрибной активностью, остальные регуляторы роста растений. Причем максимум поглощения одного из исследуемых компонентов находился при длине волны 267 нм, можно было предположить, что это цитокинин зеатин, а максимальная абсорбция другого компонента цитокининовой природы наблюдалась при 257,5 нм (рис. 5).
Рис. 4. Хроматографический профиль низкомолекулярной фракции культуральной жидкости с максимальной фитогормональной активностью штамма Р. сМогогарЫ* ИБ 6 (ВЭЖХ, 254 нм, колонка гогЬах-ООБ (250x4,6 мм, "БЫшаёги", Япония), элюент -вода). Компоненты фракций: 1 - с антигрибной активностью, 2,3- с фитогормональной активностью.
В дальнейшем методом хроматомасс - спектроскопии было подтверждено предположение о том, что один из компонентов с фитогормональной активностью является зеатином, ему соответствует пик с максимумом отношения массы к заряду, равным 220 (рис. 6а). Структура другого компонента представляется более интересной и новой для веществ цитокининовой природы. В результате интерпретации масс - спектра ее можно представить как три - О - пропионил - N6 - (Д2 - изопентенил)аденозин
- новой формой цитокининоподобных веществ (рис. 66) которому соответствует пик с отношением массы к заряду, равным 504. В спектре присутствуют фрагменты оснований цитокининов с m/z 136 (аденин), 204 (N6
- (А2 - изопентенил)аденин). Наличие трипропионилрибозы обусловлено фрагментом с m/z 301, дальнейшее отщепление от которой двух молекул пропионовой кислоты приводит к фрагменту с m/z 153, последующее отщепление метилкетеновой группы - к фрагменту с m/z 97.
оп
оп
^„=257,5 им
Рис. 5. УФ - спектры компонентов с фитогормональной активностью, выделенных из низкомолекулярной фракции метаболитов КЖ штамма Р. сЫогогарЫз ИБ 6: а - компонента 2 из рис. 4, б - компонента 3 из рис. 4.
т г ;ю
£ 70 X
тг
202'*" 188 -
„"бн"'
Н,С'
148-4136*-
ны
119
1М 112 1-й
к
Л
"-5 1М 1
4 | щ а 214
!
• 151
г_1 £1Г1
едсоо оосс,н5
Рис. 6. Масс-спектры компонентов с фитогормональной активностью, выделенных из низкомолекулярной фракции метаболитов КЖ штамма Р. сЫогогарЫа ИБ 6: а - компонента 2 из рис. 4, б - компонента 3. из рис. 4.
Физико-химические свойства HM фракций метаболитов штаммов Pseudomonas. В интервале pH 6-9 уровень фунгицидной активности НМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas оставался максимальным и стабильным, критическими точками стабильности являлись значения pH < 4 и pH > 11, после которых активность падала больше, чем в два раза.
Максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов Pseudomonas наблюдался в диапазоне температур 25 - 60°С, при температуре 70°С происходила значительная термоинактивация, но при этом 20-25 % от начальной активности у штаммов Р. chlororaphis остается даже после инкубации при температуре 100°С! Такая картина может быть обусловлена наличием во фракциях двух компонентов, обладающих фунгицидной активностью, один из которых имеет пептидную природу и денатурирует при температуре, выше 60°С, а второй - антибиотик феназиновой природы в следовых количествах, нехарактерный для вида Р. pulida.
Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих (Ьунгииидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности. Разработана методика выделения метаболитов, обладающих фунгицидной активностью (рис. 7).
КЖ
Центрис^гированпе
Биомасса
___Ультрафильтрация
<—■—
Высокомолекулярные соединения
Концентрирование ультрафильтрата вакуум-упариванием
Осаждение примесеи метанолом
Центрифугирование Примеси" " |
Отгонка метанола из супернатанта
1
Осаждение метаболитов ацетоном
Метаболиты с фунгицидной активностью
Рис. 7. Схема выделения метаболитов штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, обладающих фунгицидной активностью.
Схема выделения метаболитов с антигрибной активностью включала в себя стадии центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования, осаждения примесей и осаждения метаболитов;
- центрифугирование КЖ. Стадия удаления микробных клеток из КЖ -общая стадия для всех методик по выделению экзоцеллюлярных антибиотических веществ;
- ультрафильтрация на модулях волоконного типа. Стадия избавления от высокомолекулярных соединений. Ультрафильтрации подвергаются супернатанты со стадии центрифугирования КЖ с отбором фильтратов, заведомо содержащих низкомолекулярные фракции (< 3 кДа) внеклеточных метаболитов. Эти фракции содержат 6-11 компонентов, причем, как было показано выше, антигрибной активностью обладает только один компонент каждой фракции;
- концентрирование ультрафильтрата. Эта стадия проводилась путем упаривания фильтрата на вакуумном роторном испарителе при 35°С. Степень концентрирования 20 раз;
- осаждение примесей. На этой стадии проводили осаждение солей и других остатков питательной среды в концентрате метанолом до 60 % насыщения с дальнейшим их отделением центрифугированием и отгонкой метанола из супернатанта под вакуумом;
- осаждение метаболитов, обладающих фунгицидной активностью. Заключительная стадия выделения, на которой из супернатанта предыдущей стадии, изучаемые вещества осаждали ацетоном.
В результате применения разработанной оригинальной методики выделения в хроматографических профилях элюции выделенных метаболитов присутствовал лишь один пик (рис. 3, г), по времени выхода соответствующий пикам компонентов, обладающих антигрибной активностью, причем время выхода активного компонента для каждого из штаммов Pseudomonas достоверно не отличалось.
Определение молекулярной массы метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. Определение молекулярной массы метаболитов проводили при помощи эксклюзионной жидкостной хроматографии с использованием маркеров молекулярной массы. В результате чего было установлено, что метаболиты штаммов Pseudomonas близки по молекулярной массе, различие составляет ± 200 Да, и их молекулярная масса варьирует в пределах 2,8 - 3,0 кДа (рис. 8).
Аминокислотный и элементный составы метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. Исходя из того, что активность изучаемых метаболитов штаммов псевдомонад проявлялась в диапазоне температур 25 - 60 °С, а при температуре 70 °С происходила их значительная термоинактивация, можно было предположить, что метаболиты имеют пептидную природу. Это предположение было подтверждено данными аминокислотного анализа гидролизатов метаболитов. Данные аминокислотного и элементного анализов (табл. 7 и 8) также показали, что метаболиты изучаемых штаммов неидентичны по своему составу, различие
составляет в одну аминокислоту, чем и определяется разница в их молекулярных массах.
тУ 20
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время элюции, мин
Рис. 8. Хроматограмма метаболитов Pseudomonas с антагрибной активностью (2, время выхода 15,2±0,1 мин.) и маркеров молекулярной массы (1 - инсулин (Мг 5,8 кДа), время выхода 11,5 мин., 3 - витамин В12 (Мг 1355 Да), время выхода 17,2 мин.). (280 нм, колонка TSK G2000SW (300x7,8 мм), элюент - 0,1 М фосфат натрия, 0,3 М хлорид натрия (pH 7,0), расход 1 мл/мин).
Таблица 7
Эквимолярное содержание аминокислот в структуре метаболитов,
Аминокислота Штамм- продуцент
Р. putida ИБ 17 Р. chloraphis ИБ 51 Р. chloraphis ИБ 6
Аспарагиновая 1 2 1
кислота
Треонин I 2 1
Серин 1 1 1
Глутаминовая 2 2 2
кислота
Пролин 2 2 2
Глицин 4 4 4
Алании 2 2 2
Валин 1 1 1
Метионин 1 1 1
Лейцин 1 - 1
Лизин 1 1 1
Гистидин 1 1 1
Таблица 8
Элементный состав метаболитов бактерий р. Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
Культура Содержание элемента (%)
Углерод Водород Азот Сера
P. chlororaphis ИБ 51 48,6±0,32 6,4±0,0б 16,0±0,11 1,7±0,02
P. putida ИБ 17 50,2±0,33 6,5±0,07 16,1±0,12 1,8±0,02
Р. chlororaphis ИБ 6 50,0±0,33 6,6±0,06 16,1±0,12 1,8±0,02
В состав кислотного гидролизата метаболита штамма P. chloraphis ИБ 51 входит 19 аминокислот, штаммов ИБ 6 и ИБ 17 - 18 аминокислот, в основном составы схожие, за некоторым исключением. В составе гидролизата метаболита штамма ИБ 51 не наблюдается лейцина, который присутствует в составе гидролизатов штаммов ИБ 6 и ИБ 17, а аспарагиновая кислота и треонин присутствуют в удвоенном количестве.
ИК- и ЯМР "С- спектроскопия метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. Анализ данных ИК- и ЯМР 13С-спектроскопии (рис. 9 и 10) показал, что молекулы изучаемых метаболитов содержат глицериновый остов, что характеризуется наличием химических сдвигов (ХС) 65 и 74 м.д. и характерными полосами поглощения в ИК -спектрах на 2968 и 1408 см"1. К молекуле глицерина через эфирные атомы кислорода посредством карбонильных групп (1044 см"1, 170 м.д.) присоединены три полипептидные цепочки, на наличие которых указывает увеличение площади пиков аминогрупп (3100-3200 см'1) и изменение пропускания в области 1500 см'1, характерной для аминных и ацетамидных групп.
Сравнение спектров выделенных метаболитов со спектрами, полученными при помощи программы ChemNMR Pro, позволило сделать вывод, что выделенные метаболиты по своей химической структуре являются трипептидами глицерина и представляют собой новую группу метаболитов бактерий рода Pseudomonas. Также очевидно, что выделенные метаболиты не являются сидерофорами в классическом понимании, т.к. не имеют в своем составе флюоресцентного хромофора. На рис. 11 представлена их химическая структура.
4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 НЮ 600
Рис. 9. ИК-спектр метаболитов с антигрибной активностью, продуцируемых штаммами Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. pulida ИБ 17.
—i— 180
—г— 160
140
120
100 80 РРМ
40
—г~ 20
Рис. 10. ЯМР |3С -спектр метаболитов с антигрибной активностью, продуцируемых штаммами Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. pulida ИБ 17
CH2-o^\Ser-Gly-Pro-Glu-Met-Lys ' II HC-о o^Thr-Glu-Pro-Ala-Val-Gly
II
сн2—о ^Asp-Gly-Leu-Ala-His-Gly
i-/ \
Рис. И. Химическая структура молекулы триглицеридпептида- нового метаболита бактерий р. Pseudomonas
Дополнительное подтверждение структуры было получено путем ферментативного гидролиза с помощью липазы - фермента класса гидролаз, катализирующего гидролиз эфиров глицерина и обычно высших жирных кислот, однако большинство липолитических ферментов может гидролизовать также эфиры с совершенно отличной структурой (Брокерхоф, Дженсен, 1978), как получилось и в нашем случае - триглицеридпептид гидролизовался до глицерина и трех пептидных фрагментов (хроматография в условиях методики определения полипептидов и низкомолекулярных белков микробного происхождения методом нормально-фазовой ВЭЖХ (Логинов и др., 2003)(рис. 12).
Антигрибная активность триглииеридпептидов Pseudomonas. В связи с тем, что выделенные триглицеридпептиды являются новой группой метаболитов бактерий рода Pseudomonas, было интересно определить величину их фунгицидной активности и соотнести ее с таковыми известных метаболитов псевдомонад, обладающих антигрибной активностью.
Методом разведений выявлена минимальная ингибирующая концентрация ряда фитопатогенных грибов (табл. 9), которая является сопоставимой с величинами ингибирования фитопатогенов известными псевдомонадными антибиотиками (Смирнов, Киприанова, 1990; Paulitz et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Lee et al., 2003).
Рис. 12. Хроматографические профили глицерина (а), триглицеридпептида (в) и продуктов ферментативного гидролиза триглицеридпептида с помощью липазы (б). (ВЭЖХ, колонка ШгаБрЬеге (5 мкм ) 250x4,6 мм, злюент - вода с рН 7,4 (доводят раствором аммиака), расход - 0,5 мл/мин, УФ - детектор, 220 нм).
Таблица 9
Спектр фунгицидной активности триглицеридпептидов, продуцируемых бактериями р. Pseudomonas
Штамм -продуцент Минимальная ингибирующая концентрация подавления следующих видов патогенных грибов, мг/мл
Fusarium culmorum Fusarium gibbosum Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium semitectum Fusarium avenaceum Fusarium moniliforme Bipolaris sorokiniana Alternaría altérnala Pénicillium funiculosum
Р. chlororaphis ИБ 51 0,10,2 0,50,6 >1 0,5-. 0,6 0,50,6 0,50,6 0,81,0 0,10,2 0,30,4 0,30,4
Р. chlororaphis ИБ 6 0,10,2 0,50,6 0,50,6 0,10,2 0,50,6 0,20,3 0,81,0 0,10,2 0,30,4 0,30,4
Р. pulida ИБ 17 0,10,2 0,30,4 >1 0,50,6 0,20,3 0,30,4 0,30,4 0,10,2 >1 0,20,3
Антигрибная активность триглицеридпептидов псевдомонад в средах с различивши источниками углерода. Изучение влияния природы экссудатов растений (органических кислот, аминокислот и углеводов) на антигрибную активность метаболитов штаммов псевдомонад показало, что она оставалась высокой вне зависимости от химической природы вносимого в среду экссудатного компонента из выбранного спектра. Наблюдаемые различия в уровне активности были подвержены межвидовой корреляции. Антигрибная активность метаболитов штамма Р. pulida ИБ 17 значительно не различалась в вариантах со всеми химическими типами экссудатов, тогда как активность метаболитов штаммов вида Р. chlororaphis была выше в вариантах с экссудатами углеводной природы (табл. 10).
В условиях непосредственного взаимодействия с метаболитами штаммов псевдомонад по истечении четырех суток конидии фитопатогена, высеянные в среду, не проросли, тогда как в контрольных вариантах, уже через 6 часов, можно было видеть массовое прорастание спор, а через сутки наблюдали сплошной рост гриба. Причем характер воздействия метаболитов на патогены был аналогичен антагонизму, который мы наблюдали в условиях совместного культивирования бактерий и грибов (рис. 1).
Таблица 10
Минимальная ингибирующая концентрация метаболитов псевдомонад в зависимости от источника углерода (мг/мл)
Штамм бактерий
Экссудат Р. chlororaphis Р. chlororaphis Р. putida
ИБ 51 ИБ 6 ИБ 17
М±ш
Углевод 0,1±0,018 0,1±0,017 0,1±0,015
Органическая кислота 0,2±0,010 0,2±0,010 0,1 ±0,018
Аминокислота 0,1±0,015 0,2±0,011 0,1±0,017
Таким образом, установлено, что штаммы Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17 способны к антагонистическому воздействию на фитопатогены, вызывая задержку прорастания спор и нарушение морфогенеза мицелия за счет секреции антибиотических веществ в средах с различными источниками углерода.
Мы предположили, что такой характер проявления антигрибной активности может быть связан с межмолекулярным взаимодействием в системе метаболит : экссудат, в связи с чем далее была исследована способность комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas с экзометаболитами растений.
КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДПЕПТИДОВ Pseudomonas С ЭКССУДАТАМИ РАСТЕНИЙ И ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ
В природных условиях корневая система растений выделяет в ризосферу различные вещества, в том числе и углеводы, органические кислоты, аминокислоты. Борьба за источник питания между бактериями рода Pseudomonas и фитопатогенами может характеризоваться продукцией во внешнюю среду метаболитов, которые, связывая субстрат, ограничивают его доступность для других микроорганизмов. Поэтому хелатообразующая способность по отношению к экссудатам, по всей вероятности, обуславливает дополнительное ингибирующее действие на фитопатогенные грибы в средах, содержащих, в качестве источника углерода, различные сахара, аминокислоты и органические кислоты.
Триглицеридпептиды Pseudomonas не обладают сидерофорной активностью по отношению к ионам Fe+3, но, в тоже время, они способны образовывать комплексы с ионами тяжелых металлов и молекулами различных веществ органической природы - представителей экзометаболитов растений. Причем комплексообразование метаболитов с углеводами, органическими кислотами и аминокислотами у бактерий рода Pseudomonas
является новым свойством, которое ранее не было отмечено другими исследователями.
Комплексообразующая_способность триглицеридпвптидов
Pseudomonas с экссудатами растений органической природы.
На рисунке 13 представлены результаты изучения комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов экссудатов растений с использованием метода Вента-Френча. Из рисунка виден линейный характер логарифмических зависимостей, который указывал на образование комплекса в системах метаболит : экссудат, а значения первых членов в аппроксимирующих уравнениях показывали в первом приближении стехиометрическое соотношение в комплексах метаболит: экссудат.
Рис. 13. Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сМогогарЫ.ч ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в) методом Бента - Френча
Данные изомолярных серий метаболитов псевдомонад с теми же представителями экссудатов (рис. 14) подтвердили наличие комплексообразования в системах метаболит : экссудат и уточнили их стехиометрический состав. Например, из рис. 14а видно, что изомолярная серия метаболита штамма Р. сЫогогарЫя ИБ 51 с фумаровой кислотой имеет четкий излом, расположение которого, определенное по пересечению касательных, отвечает содержанию в комплексе 50 % (мольных) метаболита и 50 % (мольных) фумаровой кислоты. Следовательно, стехиометрический
состав комплекса метаболита штамма ИБ 51 и фумаровой кислоты составлял 1:1.
д 61/арабиноэа
0
-
* .................. _. .
--ы "
0 10 20 30 40 50 во 70 80 90 1 СМ, %
Рис. 14. Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сМогогарЫв ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в) методом изомолярных серий
Таким образом, метод изомолярных серий позволил уточнить и подтвердить данные по комплексообразованию триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов экзометаболитов растений и установлению их стехиометрического состава. Для окончательного уточнения и подтверждения количественных показателей составов комплексов было проведено исследование комплексообразования при помощи метода поляриметрии, который наглядно демонстрировал характерные изломы на графиках зависимости угла вращения [а] от мольного соотношения в системе метаболит : экссудат (рис. 15).
Результаты исследования стехиометрических соотношений в комплексах метаболит: экссудат, проведенные аналогично вышеописанному, для других корневых экссудатов растений представлены в таблице 11.
Рис. 15. Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад с представителями различных классов корневых экссудатов растений на примере штамма Р. сЫогогарЫя ИБ 51 с фумаровой кислотой (а), лизином (б) и арабинозой (в) методом поляриметрии
Таблица 11
Стехиометрические соотношения в комплексе метаболит: экссудат
Штамм бактерий
Экссудат Р. сМогогарЫз ИБ 51 Р. сЫогогарШ ИБ 6 Р. риййа ИБ 17
1 2 3 4
Арабиноза 1:5 1 5 1:18
Ксилоза 1:5 1 5 1:10
Фруктоза 1:6 1 6 1:4
Глюкоза 1:7 ! 7 1:2
Галактоза 1:3 1 4 1:17
_Продолжение таблицы 11
1 2 3 4
Сахароза 1:8 1:8 1:15
Рафиноза 1:13 1:10 1:9
Рамноза 1:3 1:3 1:5
Маннит 1:15 1:14 1:2
Щавелевая кислота 1:2 1:2 1:2
Пропионовая кислота 1:16 1:9 1:21
Молочная кислота 1:17 1:13 1:12
Яблочная кислота 1:20 1:10 1:5
Пировиноградная кислота 1:3 1:3 1:3
Фумаровая кислота 1:1 1:1 1:2
Янтарная кислота 1:17 1:11 1:20
Кетоглутаровая кислота 1:7 1:8 1:6
Лимонная кислота 1:14 1:5 1:11
Алании 1:10 1:15 1:17
Вапин 1:13 1:6 1:16
Пролин 1:14 1:17 1:15
Метионин 1:6 1:3 1:5
Триптофан 1:2 1:2 1:2
Тирозин 1:1 1:1 1:1
Аспарагин 1:11 1:11 1:9
Цистеин 1:9 1:5 1:8
Лизин 1:6 1:4 1:4
Аргинин 1:20 1:9 1:8
Полученные соотношения не коррелировали с величиной антигрибной активности, с молекулярной массой или каким- либо другим физико-химическим свойством экссудата, что, вероятнее всего, можно связать с особенностью строения пептидных компонентов. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали о том, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с различными экссудатами растений: углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, лимитируя по субстрату фитопатогены. Оптимальный стехиометрический состав комплексов метаболит : экссудат для проявления антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas, находился в интервале от 1:1 до 1:20.
Комплексообоазующая способность триглицсридпептидов Pseudomonas с ионами металлов. В данной работе изучена возможность комплексообразования триглицеридпептидов с ионами следующих тяжелых металлов: цинка, меди, кадмия, свинца и определена стехиометрия образующихся комплексов.
В результате исследований изомолярных серий комплексов метаболитов псевдомонад с катионами металлов были получены вольтамперограммы, т.е. графики зависимости величины тока в пике от соотношения метаболит : катион в изомолярной серии (рис. 16). Графически изомолярные серии триглицеридпептидов штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17 с ионом кадмия представлены на рис. 16а, из которого видно, что изомолярные серии имеют четкие изломы, расположение которых отвечает соотношению в комплексе метаболит : катион 50 % (мольных) метаболита и 50 % (мольных) ионов кадмия, причем эти соотношения были одинаковы для метаболитов всех трех исследуемых штаммов. Следовательно, стехиометрической состав комплексов с катионом кадмия определялся соотношением 1:1. Данные изомолярных серий метаболитов псевдомонад с ионами меди, цинка и свинца представлены на рис. 16б-г, стехиометрические составы комплексов с ними представлены в табл. 12.
Рис. 16. - Оценка комплексообразования триглицеридпептидов псевдомонад (штаммы ИБ 51 (1) ИБ 6 (2), ИБ 17 (3)) с ионами металлов: а - кадмий; б -медь; в - свинец; г - цинк методом инверсионной вольтамперометрии
Таблица 12
Стехиометрические соотношения в комплексе метаболит: ион металла
Ион металла Штамм бактерий
Р. chlororaphis ИБ Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17
Цинк 1:1 1:1 1:1
Кадмий 1:1 1:1 1:1
Медь 1:9 1:9 1:9
Свинец 1:4 1:4 1:4
В результате проведенных экспериментов было установлено, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с неорганическими ионами кадмия, меди, свинца и цинка. Оптимальные стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находились в интервале 1:1-1:9.
Таким образом, нами были проведены исследования способности комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas с различными органическими кислотами, аминокислотами и углеводами. Было установлено, что метаболиты бактерий рода Pseudomonas обладают выраженной способностью к образованию комплексов с органическими кислотами, аминокислотами и углеводами. Нами были установлены оптимальные для проявления фунгистатического действия метаболитов стехиометрические соотношения комплексов метаболит : экссудат и метаболит : катион. Полученные результаты необходимы для разработки новых эффективных средств защиты растений от фитопатогенов.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas, ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Определение оптимального состава питательных сред для культивирования бактерий рода Pseudomonas. Для создания оптимальной среды, состав которой мог бы полностью удовлетворять пищевые потребности культуры и способствовать максимальному накоплению антигрибной активности, целесообразно использовать методы математического планирования эксперимента, включающие план полного факторного эксперимента и опыт по методу крутого восхождения.
При широкомасштабном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии основной проблемой является высокая стоимость питательной среды, содержащей в своем составе такие дорогостоящие компоненты, как пептон и дрожжевой экстракт. С целью удешевления состава питательной среды заменили смесь дрожжевого экстракта и пептона на автолизат отработанных пивных дрожжей. При выборе этого компонента
питательной среды мы руководствовались, прежде всего, низкой стоимостью, доступностью и технологичностью сырья.
Отработанные дрожжи трёх разных производителей пивной продукции проанализировали на содержание различных форм азота. Результаты анализа автолизатов пивных дрожжей и пептона представлены в табл. 13.
Таблица 13
Характеристика пептона и полученных дрожжевых автолизатов различных пивоваренных производств
Показатель «ПИТ», г. Новотроицк «Шихан Хайнекен», г. Стерлитамак «Amstar-Efes», г. Уфа Пептон
Азот общий, % в пересчете на АСВ* 5,9±0,3 5,4±0,3 5,2±0,3 7,6±0,4
Азот аминный, % в пересчете на АСВ 2,0±0,1 1,5±0,1 1,6±0,1 3,6±0,2
Белок по Лоури, % в пересчете на АСВ 45,2±2,3 40,7±2,0 41,3±2,1 61,7±3,1
^абсолютно сухие вещества
Из приведённых данных видно, что отработанные дрожжи завода «ПИТ» г. Новотроицк по анализируемым показателям превосходят дрожжи остальных пивоваренных производств, что и послужило основанием для дальнейшей работы с ними по оптимизации питательных сред для культивирования бактерий рода Pseudomonas.
Согласно составленной матрице планирования, было проведено 16 экспериментов по каждому штамму бактерий Pseudomonas с различным варьированием изучаемых факторов (табл. 1). Эксперименты проводились с трёхкратной повторностью.
В результате экспериментов (табл. 14) были вычислены коэффициенты уравнений регрессии - математических моделей зависимости функций Yi (антигрибная активность) и Y2 (титр клеток) от концентрации в ферментационной среде компонентов X,, Х2, Х3, Х4. На основании коэффициентов были получены математические модели зависимости антигрибной активности (Y,) и титра клеток (Y2) от концентраций в ферментационной среде компонентов. Полученные модели по накоплению биомассы и антигрибной активности при 95 % доверительном интервале дают основание утверждать, что статистически значимое действие в изученном диапазоне концентраций для разных штаммов оказывают разные компоненты.
Уравнения регрессии, с учетом значимости коэффициентов, выглядят следующим образом:
для штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51
Yi = 4,60 +0,15Х)+ 1,46Х3, Y2 = 6,47 + 5,50Х2 + 4,78Х3;
для штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 6
Yi = 4,19+0,63Xi+l,52X3+l,06X4, Y2 = 3,41+1,89X2+U9X3;
для штамма Pseudomonas putida ИБ 17
Y, - 3,99+0,93Х2+0,62Хз+1,48Х4, Y2 = 2,11 +0,64Xi -1,59X2+0,49X3.
Основное положительное влияние на антигрибную активность двух штаммов вида Р. chlororaphis оказывает увеличение концентраций глицерина (Х|) и Na2HP04x 12Н20 (Х3), причем на штамм ИБ 6 дополнительное положительное влияние оказывает увеличение концентрации КН2Р04Х2Н20 (Х4), а концентрация дрожжевого автолизата (Х2) соответствует оптимальному значению для штамма этого вида (т.е. изменение его концентрации в выбранных пределах не вызывает заметное, статистически значимое, изменение антигрибной активности). Несколько иначе ведет себя штамм вида Р. putida, где положительное влияние на увеличение антигрибной активности оказывает увеличение концентраций автолизата (Х2), Na2HP04x 12Н20 (Х3) и КН2Р04х2Н20 (Х4).
На основании полученных данных в ПФЭ-24 были поставлены опыты по плану крутого восхождения, в котором осуществляли одновременное изменение концентраций всех значимых факторов по алгоритму, рассчитанному точно в соответствии с величинами коэффициентов регрессии. Восхождение было начато от исходного состава среды (средний уровень ПФЭ 24). Таким образом, были установлены оптимальные составы питательных сред (табл. 15).
ПФЭ и его результаты для штаммов Pseudomonas
Таблица 14
Вариант Фактор Р. chlororaphls ИБ 51 Р. chlororaphls ИБ 6 Р. putida ИБ 17
X, х2 х, X4 V,, ед/мл КЖ y2, млрд КОЕ/мл КЖ Y,, ед/мл КЖ y2, млрд КОЕ/мл КЖ Y„ ед/мл КЖ y2, млрд КОЕ/мл КЖ
1 - - 2,0±0,1 0,79±0,04 2,0±0,1 1,21 ±0,06 2,0±0,1 1,38±0,07
2 + - - 2,0±0,1 0,95±0,05 2,0±0,1 1,43±0,07 2,0±0,1 0,06±0,0
3 - + - - 2,0±0,1 1,42±0,07 2,3±0,1 1,28±0,06 2,0±0,1 5,57±0,28
4 + + - - 2,0±0,1 0,55±0,03 2,0±0,1 1,41 ±0,07 2,0±0,1 2,87±0,14
5 - - + - 5,0±0,25 1,0±0,05 2,2±0,1 2,04±0,1 2,3±0,12 1,69±0,08
6 + - + 9,0±0,45 0,95±0,05 2,3±0,11 1,5±0,07 2,2±0,11 0,05±0,0
7 + + - 4,8±0,24 24,7± 1,23 2,2±0,11 7,73±0,39 2,8±0,14 3,23±0,16
8 + + + - 7,0±0,35 17,57±0,88 10,0±0,5 8,5±0,42 5,0±0,25 2,07±0,1
9 - + 5,8±0,29 0,97±0,05 3,5±0,17 1,19±0,06 3,0±0,13 0,01 ±0,0
10 + - + 7,0±0,35 1,27±0,06 4,5±0,22 1,88±0,09 3,0±0,13 0,64±0,03
11 - + - + 2,0±0,1 2,8±0,14 2,3±0,11 2,43±0,12 6,0±0,26 6,77±0,34
12 + + + 2,3±0,12 4,72±0,24 2,7±0,13 5,33±0,27 7,0±0,35 3,53±0,18
13 - - + + 8,0±0,4 0,94±0,05 9,0±0,45 1,83±0,09 6,0±0,26 0,14±0,01
14 + + + 3,7±0,18 0,84±0,04 9,0±0,45 1,1 ±0,06 4,0±0,2 0,22±0,01
15 + + + 6,0±0,3 23,33±1,17 5,0±0,25 7,67±0,38 9,0±0,45 3,17±0,16
16 + + + + 5,0±0,25 20,67±1,03 6,0±0,3 8,0±0,4 5,5±0,27 2,35±0,12
17 0 0 0 0 7,0±0,35 16,4±0,82 8,0±0,4 6,05±0,3 7,0±0,35 4,80±0,24
ы
-J
Таблица 15
Оптимизированные составы питательных сред__
Компонент среды Оптимальное содержание для штамма
Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ6 Р. putida ИБ 17
Глицерин, г/л 11,30 11,53 11,00
Дрожжевой автолизат, л/л 0,11 0,13 0,16
Ш2НР04*12Н20, г/л 6,96 6,14 6,23
КН2Р04х2Н20, г/л 1,58 1,60 1,89
МЙ504*7Н20, Г/л 1,50
РеС13, г/л 0,01
Антигрибная активность выращенных на данных средах штаммов Pseudomonas в 1,5 раза выше, чем в среднем варианте, в то же время титр клеток на данной среде составил 2,20*1010, 1,46*Ю10 и 5,00 *109 КОЕ/мл культуральной жидкости соответственно для штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17.
Оптимизаиия условий культивирования штаммов Pseudomonas. Оптимизацию условий культивирования штаммов-продуцентов проводили в ферментерах на средах выше приведённого состава (табл. 15).
Результаты ПФЭ 23 показали, что все три исследуемые культуры проявляют максимальную антигрибную активность в рамках выбранной системы ее определения вне зависимости от условий культивирования. Рассчитанные коэффициенты для уравнений регрессии, описывающих зависимость титра клеток от условий культивирования, оказались статистически незначимыми. Однако по результатам ПФЭ 23 были выявлены параметры культивирования, позволяющие повысить титр клеток исследуемых штаммов бактерий рода Pseudomonas в культуральной жидкости, которые мы приняли за оптимальные параметры культивирования штаммов-продуцентов (табл. 16).
Таблица 16
Оптимальные условия культивирования
Условия культивирования Оптимум для штамма
Р. chlororaphis ИБ 51 Р. chlororaphis ИБ 6 Р. putida ИБ 17
Перемешивание, об/мин 180 160 160
Температура, "С 26 26 30
Продолжительность культивирования, ч 48 48 48
Рис. 17. Спектр антигрибной активности штаммов Р. chlororaphis ИБ 51 (а), Р chlororaphis ИБ 6 (б), Р. pulida ИБ 17 (в), выращенных на оптимизированной среде и среде Кинг В, в сравнении.
Таким образом, результаты оптимизации условий культивирования штаммов Pseudomonas показывают, что всем исследуемым штаммам для накопления максимальной антигрибной активности и высокого (3,42* 1010, 1,50* 1010 и 1,25*10®° КОЕ/мл КЖ соответственно для штаммов ИБ 51, ИБ 6 и ИБ 17) титра клеток при культивировании в ферментёрах достаточно 48 ч, в условиях пониженной аэрации и перемешивания, при температуре 26 °С для двух штаммов вида Р. chlororaphis, а для штамма Р. putida необходимо 30 °С. Полученные данные согласуются с данными литературы по биосинтезу антибиотических веществ псевдомонадами.
Оценка антигрибной активности штаммов, выращенных на новых питательных средах. Исследуемые штаммы Р. chlororaphis ИБ 51, Р chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17, выращенные в оптимальных условиях на оптимизированных средах, проверили на аитигрибную активность. Спектр антагонистической активности был оценён зонами подавления гриба в сравнении с зонами подавления фитопатогенов штаммами, выращенными на классической среде Кинг В. По полученным результатам антигрибной активности исследуемых штаммов Pseudomonas видно (рис. 17), что бактерии, выращенные в оптимизированных условиях, по фунгицидной активности не уступают микроорганизмам, выращенным на классической среде Кинг В в тех же условиях.
Выявлено, что антигрибная активность, в отношении почти всех исследуемых тест-грибов штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выращенного на оптимизированной среде (рис. 18), превышает активность двух других штаммов, выращенных также на оптимизированных средах.
Зона подавления, мм
Рис. 18. Спектр антигрибной активности штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, выращенных на оптимизированных средах, в сравнении.
Таким образом, штамм-антагонист Pseudomonas putida ИБ 17 может стать основой микробиологического препарата нового поколения, обладающего широким спектром антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium, Alternaria и Helminthosporium.
Изучение параметров культивирования шталша Pseudomonas chlororaphis ИБ SI в периодических и непрерывных условиях. На основе штамма Р. chlororaphis ИБ 51 ранее был разработан биопрепарат «Елена» (Логинов и др., 2003), наработка которого производится в периодическом режиме культивирования. Учитывая увеличивающуюся потребность в биологических препаратах в сельском хозяйстве, исследовали возможность наработки биопрепарата «Елена» в непрерывных условиях. Для определения максимальной удельной скорости роста рабочего штамма Р. chlororaphis ИБ 51 в непрерывном режиме провели серию ферментации в периодическом режиме культивирования. Кривая роста штамма Р. chlororaphis ИБ 51 представлена на рис. 19.
время культивирования, ч
I —•— тигр клеток аигигрибшя активность Рис. 19. Динамика периодического роста и накопления антибиотических веществ культурой Р. сМогогарЪ'и ИБ 51.
Культивирование в оптимальных условиях позволяет штамму интенсивно накапливать метаболиты с антигрибной активностью на завершающей стадии экспоненциального роста к 12-14 ч культивирования. В дальнейшем антигрибная активность культуры Р. сЫогогарЫз ИБ 51 практически не изменяется до окончания культивирования.
Переход от периодического процесса культивирования к непрерывному провели при помощи графоаналитического метода. Были определены скорости разбавления для нескольких состояний динамического равновесия путем сопоставления зависимости накопления биомассы от времени культивирования с данными о продуктивности процесса по выходу биомассы.
Далее провели серию наработок культуры штамма Р. chlororaphis ИБ 51 в режиме непрерывного культивирования в условиях, определенных расчетно-графически при скоростях разбавления D=0,26; 0,34; 0,5; 0,7 ч"1.
В ходе эксперимента было установлено, что при значении скорости разбавления D=0,7 ч"1 наблюдалось вымывание культуры из ферментера, так как соответствовало максимальной удельной скорости роста штамма (|im„). При установлении скорости разбавления D=0,26 ч'1; 0,34 ч"1; 0,50 ч'1 система достигает стационарного режима при концентрации клеток в интервале от 4*109 до 1,2 *Ю10 КОЕ/мл КЖ (максимум при D=0,5 ч"1). Дальнейшее увеличение скорости протока вызывает уменьшение урожая клеток.
Таким образом, были аналитически рассчитаны и экспериментально подтверждены параметры для промышленного культивирования штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в условиях хемостата с высокой производительностью процесса накопления биомассы.
Питательные среды для промышленного культивирования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред. Исследовав параметры культивирования бактерий на среде с автолизатом отработанных пивных дрожжей, получили технологическое решение производства биопрепарата с использованием вторичного сырья.
Для того чтобы, не быть зависимыми в своем производстве от какой-то одной области промышленности, была предпринята успешная попытка перенести разработанные условия культивирования для производства биопрепарата на родственный субстрат - пекарские дрожжи и его автолизат. Автолизат пекарских дрожжей не уступает по своим характеристикам, таким как, содержание незаменимых аминокислот, аминного (4,47 %, АСВ) и общего азота (5,74%, от АСВ), автолизату пивных дрожжей.
Внедрение в технологический процесс новых питательных сред значительно сократит технологические расходы на стадии приготовления питательной среды, что крайне необходимо в условиях развивающейся агробиотехнологии.
Данные экономического расчета (табл. 17) затрат на питательные среды (в ценах 2009 г.), показали, что наиболее дешёвой питательной средой является оптимизированная среда на основе автолизата пивных дрожжей. Экономический эффект от использования разработанной среды по сравнению с Кинг В составил 146275 руб за один цикл наработки целевого продукта в объёме 10 т. Таким образом, использование оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей значительно сокращает долю производственных затрат на питательную среду в себестоимости готового продукта с 22% до 3,6%.
Таблица 17
Экономический эффект использования питательных сред за один цикл наработки (10 т) биопрепарата «Елена»
Варианты сред Стоимость среды, руб. Себестоимость продукта, руб. Доля среды в себестоимости продукта
Модифицированная Кинг В 168763,21 765000 22%
Оптимизированная на автолизате пекарских дрожжей 23738,18 619975 3,8%
Оптимизированная на автолизате пивных дрожжей 22488,18 618724 3,6%
Нами показана целесообразность использования разработанных оптимизированных питательных сред на основе автолизата пивных дрожжей при производстве биопрепаратов на основе бактерий-продуцентов рода Pseudomonas, которые обеспечивают высокую антагонистическую активность в сочетании с экономической и технологической приемлемостью. В то же время, исходя из соображения соответствия цены и качества в сравнении со средой Кинг В, автолизат пекарских дрожжей, как и сами дрожжи, также могут бьпъ использованы как компонент питательной среды в производстве биопрепарата «Елена».
ВЫВОДЫ
1. Выделены новые метаболиты для трех штаммов Pseudomonas spp., различающихся по видовой принадлежности, обладающие фунгицидной активностью, представляющие по своей химической структуре трипептиды глицерина с молекулярной массой 2,8-3,0 кДа. Определены минимальные ингибирующие концентрации триглицеридпептидов изучаемых псевдомонад для ряда фитопатогенных и фитотоксичных грибов, показывающие, что антигрибная активность выделенных метаболитов сопоставима величине активности известных антибиотиков бактерий рода Pseudomonas.
2. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с компонентами экзометаболитов растений -органическими кислотами, аминокислотами и углеводами, лимитируя по субстрату фитопатогены. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas также способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца.
3. Стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат для триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций
корневых экссудатных экзометаболитов растений находятся в интервале 1:1 - 1:20. Оптимальные для снижения содержания солей металлов стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находятся в интервале 1:1 - 1:9.
4. Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпептидами изученных штаммов бактерий рода Pseudomonas ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления антигрибной активности метаболитов.
5. Выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл, в том числе и три - О - пропионил - N6 - (Д2 -изопентенил)аденозина - новой формой цитокининоподобных веществ.
6. Показано, что антигрибная активность и накопление биомассы при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 главным образом зависят от концентрации дрожжевого автолизата и фосфатов в ферментационной среде.
7. Разработаны новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей, пекарских дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для защиты сельскохозяйственных растений . от грибных фитопатогенов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.
8. Оптимизированы условия периодического и непрерывного промышленного культивирования биопрепарата «Елена» и аналогичных биопестицидов на основе бактерий рода Pseudomonas. Показано, что антигрибная активность штамма Р. putida ИБ 17, выращенного в оптимальных условиях, максимальна среди исследуемых штаммов псевдомонад.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 // Биотехнология. - 2003. -№ 5. -С. 22-25.
2. Логинов О.Н., Четвериков С.П., Гусаков В.Н. Триглицеридпептиды -новая группа антигрибных метаболитов псевдомонад (Pseudomonas) II Доклады Академии Наук. - 2003. - Т. 393, № 5. - С. 715-717.
3. Логинов О.Н., Четвериков С.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Высокоэффективная жидкостная хроматография низкомолекулярных бактериальных метаболитов белковой природы, обладающих фунгицидной активностью // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т. 59, № 3. - С. 310-314.
4. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Триглицеридпептиды псевдомонад -новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - Т. 41, № 1.- С. 90-93.
5. Четвериков С.П., Асабина Е.А., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для промышленного производства биопрепарата «Елена» И Башкирский химический журнал. - 2006. - Т. 13, № 2. - С. 10-13.
6. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas: экологичный механизм взаимодействия с растениями // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2007. - Вып. № 75. - С. 338-340.
7. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas с корневыми эксудатами растений // Башкирский химический журнал. - 2007. - Т. 14, № 3. - С. 47-51.
8. Сулейманова Л.Р., Асабина Е.А., Дубинина О.Н., Логинов О.Н., Четвериков С.П., Черняева Н.Ю., Хузнаризанова Р.Ф., Силишев H.H. Микроорганизм Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и биопрепарат «Елена» // Токсикологический вестник. - 2008. - № 3. - С. 39-41.
9. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Сравнительный анализ математических моделей биосинтеза ингибиторов роста фитопатогенов псевдомонадами. // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2008. -Вып. №86.-С. 122-124.
10. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Отработанные пивные дрожжи - компонент сред для промышленного производства биопрепаратов II Аграрная Россия. - 2009. Специальный выпуск. - С. 115.
11. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразующая способность метаболитов псевдомонад с ионами металлов // Аграрная Россия. - 2009. Специальный выпуск. - С. 130-131.
12. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Оптимизация биосинтеза ингибиторов роста фитопатогенов бактериями рода Pseudomonas Н Биотехнология. - 2009. №3.-С. 67-71.
13. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Новые метаболиты Azotobacter vinelandii, обладающие фунгицидной активностью // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 4. -С. 428-432.
14. Четвериков С.П., Сулейманова Л.Р., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов псевдомонад с корневыми
экссудатами растений как механизм воздействия на фитопатогены // Прикладная биохимия и микробиология. -2009. Т. 45, №5. - С. 506-511.
15. Четвериков С.П., Асабина Е.А. Цитокининподобные вещества Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009,- №10 - С. 512-513.
16. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Новые цитокининподобные метаболиты Pseudomonas chlororaphis // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. -Т. 13, №5 (3). - С. 218-220.
17. Патент РФ № 2260951, 2005. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 - продуцент цитокининов / Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H.
18. Патент РФ № 2303061, 2007. Питательная среда для культивирования бактерий рода Pseudomonas / Логинов О.Н., Силищев H.H., Коршунова Т.Ю., Четвериков С.П., Асабина Е.А.
ТЕЗИСЫ
1. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Разработка методов выделения веществ, обладающих ростстимулирующей и фунгицидной активностью, из культуральной жидкости микроорганизмов рода Pseudomonas И Материалы XV Межд. научно-техн. конф. «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (7-10 октября 2002 г., Уфа). Гос. изд-во научно-техн. лит-ры «Реактив», Уфа, 2002. -Т. 1,-С. 108.
2. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Низкомолекулярные метаболиты Pseudomonas sp., обладающие ростстимулирующей и фунгицидной активностью // Материалы 1 Межд. Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (14-18 октября 2002 г., Москва), М., 2002. - С. 496.
3. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Низкомолекулярные токсины псевдомонад - ингибиторы роста фитопатогенных грибов // Материалы II Российской научно-практ. конф. «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-3 июня 2003 г., Москва), М., РАЕН-МААНОИ. - 2003. - С. 131.
4. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Новые антигрибные метаболиты пептидной природы Pseudomonas, способные к комплексообразованию с углеводами // Материалы II Межд. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003 г., г. Москва). М., 2003.-Ч. 1. - С. 338339.
5. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Четвериков С.П. Агенты биологического контроля рода Pseudomonas, обладающие нитрогеназной активностью // Материалы II Межд. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003 г., г. Москва). М., 2003.-Ч. 1. - С. 226-227.
6. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Четвериков С.П., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С., Силищев H.H. Новые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды // Тез. докл. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (24-25 ноября 2003 г., г. Пущино, ИБФМ). Пущино, 2003. - С. 74-75.
7. Ильина И.Г., Гусаков В.Н., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование метаболитов Pseudomonas с цинком // Материалы XVII
Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (12-14.10.2004 г., Уфа). Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», Уфа. - 2004. - С. 63-64.
8. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования Pseudomonas aureofaciens ИБ 51-продуцента БАВ // Сборник тезисов IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии», Уфа. -2006.- С. 109.
9. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование метаболитов бактерий рода Pseudomonas с простыми углеводами // Сборник тезисов IV Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (1525 декабря 2005 г., Уфа). - Уфа: Реактив, 2006. - С. 131-132.
10. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Оптимизация состава питательной среды для культивирования Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 -продуцента БАВ // Сборник тезисов XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии Реактив-2006», Уфа - 2006. - С.48.
11. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas с эксудатами растений И Материалы XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (2-4.10.2006 г., Уфа). Уфа: Реактив, 2006. -Т. 1. - С. 109-110.
12. Асабина Е.А., Четвериков С.П. , Логинов О.Н. Оптимизация состава питательных сред для культивирования бактерий рода Pseudomonas- продуцентов БАВ // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино 24-25 мая. -2007.- С.7.
13. Асабина Е.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н Отработанные пивные дрожжи компонент сред для промышленного производства биопрепаратов -фунгицидов // Современная микология в России. Том 2. материалы второго Съезда микологов России М.: Национальная академия микологии. - 2008. - С.286.
14. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Влияние бактериальных метаболитов на грибные фитопатогены растений // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. - 2008. - С. 331-332.
15. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Изучение механизма влияния БАВ псевдомонад на фитопатогены // Международная научно-техническая конференция «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» - КНР, Харбин - Санья. 2008. Т. 1. - С. 68-69.
16. Сулейманова Л.Р., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Комплексообразование метаболитов бактерий рода Pseudomonas с ионами металлов II Материалы XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии». - Уфа: Реактив, 2008. - Т. 1. - С. 90-91.
Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», —Х+ заказ №294, тираж 110. 450054, пр. Октября, 71.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Четвериков, Сергей Павлович
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ризобактерии рода Pseudomonas. Функционирование в системе растения - фитопатогены
1.1.1. Антагонистическая активность PGPR Pseudomonas
1.1.2. Метаболиты псевдомонад - агентов биологического контроля фитопатогенных грибов
1.1.2.1. Синтез антибиотиков
1.1.2.2. Продукция сидерофоров
1.1.3. Синтез фитогормонов PGPR Pseudomonas
1.1.4. Биопрепараты на основе бактерий рода Pseudomonas
1.2. Свойства метаболитов бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
1.3. Механизмы комплексообразования метаболитов бактерий с органическими соединениями и ионами металлов
1.4. Оптимизация условий культивирования бактерий рода Pseudomonas
1.4.1. Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseudomonas - продуцентов метаболитов с фунгицидной активностью
1.4.2. Математическое моделирование для оптимизации условий культивирования микроорганизмов
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований
2.2. Условия хранения псевдомонад
2.3. Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов
2.4. Определение динамики роста бактерий в средах с различными источниками углерода
2.5. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
2.6. Оптимизация ферментационной питательной среды и условий культивирования псевдомонад
2.7. Приготовление автолизатов дрожжей
2.8. Определение содержание белка в дрожжевом автолизате
2.9. Определение массовой доли азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в дрожжевом автолизате
2.10. Определение массовой доли общего азота в дрожжевом автолизате
2.1 1. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
2.12. Определение pH - стабильности и термостабильности низкомолекулярных фракций метаболитов Pseudomonas
2.13. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной и фитогормональной активностью
2.14. Определение антигрибной активности штаммов Pseudomonas и их метаболитов, обладающих фунгицидной активностью
2.15. Определение спектра антагонистического действия культур Pseudomonas
2.16. Определение фитогормональной активности метаболитов Pseudomonas
2.17. Исследование комплексообразования метаболитов Pseudomonas с экссудатами растений
2.18. Исследование комплексообразования метаболитов Pseudomonas с ионами металло
2.19. Статистическая обработка результатов
3. структура и свойства экзометаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной и фитогормональной активностью
3.1. Способность штаммов Pseudomonas к росту и их антигрибная активность в средах с различными источниками углерода
3.2. Влияние условий культивирования на биосинтез низкомолекулярных метаболитов штаммами бактерий Pseudomonas
3.2.1. Влияние углеродного и азотного питания на фунгицидную активность штаммов Pseudomonas
3.2.2. Влияние температуры культивирования на фунгицидную активность штаммов Pseudomonas
3.3. Динамика процессов периодического роста и образования антибиотических веществ штаммами Pseudomonas
3.4. Определение состава низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseudomonas
3.5. iii гамм Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 -п ро д у це н т ц ито к и н и н о в
3.6. Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseudomonas
3.7. Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности
3.8. Определение молекулярной массы метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
3.9. Аминокислотный и элементный составы метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
3.10. И К- и ЯМР 'С- спектроскопия метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
3.1 1. Ферментативный гидролиз метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
3.12. Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas 13 1 3.12.1. Характеристика антигрибной активности триглицеридпептидов псевдомонад в средах с различными источниками углерода
4. КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДПЕПТИДОВ Pseudomonas С ЭКССУДАТАМИ РАСТЕНИЙ И ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ
4.1. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas спекгрофотометрическими методами
4.1.1. Определение комплексных соединений методом Бснта-Френча
4.1.2.Определение комплексных соединений методом изомолярных серий
4.2. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas поляриметрическим методом
4.3. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas полярографическим методом
5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas, ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
5.1. Оптимизация питательных сред при культивировании бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
5.1.1. Дрожжевой автолизат - компонент питательной среды
5.1.2. Получение математических моделей для трёх штаммов Pseudomonas
5.1.3. Определение оптимального состава питательных сред для культивирования бактерий Pseudomonas
5.2. Оптимизация условий культивирования грех штаммов Pseudomonas
5.3. Оценка антигрибной активности штаммов Pseudomonas, выращенных в оптимальных условиях
5.4. Изучение параметров культивирования штамма Pseudomonas chlororaphls ИБ 5 1 в периодических и непрерывных условиях
5.5. Питательные среды для промышленного культивирования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред
Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация новых экзометаболитов некоторых штаммов Pseudomonas spp. и технология биопрепаратов на их основе"
Актуальность проблемы. Бактерии рода Pseudomonas - одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов и обладающих совокупностью полезных для растений свойств (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Воронин, 1998; Логинов и др., 2001; Weller, 1988; Dow ling, O'Gara, 1994; Bloemberg, Lugtenberg ,2001; Whipps, 2001).
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации. В свою очередь, ризосферные бактерии обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировагь развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений.
Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогеные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция бактериями различных низкомолекулярных веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al., 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al., 1997; Suznmura et al., 1997; Thrane et al., 1999; Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001: Quail et al., 2002: Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа. Эти антигрибные метаболиты имеют различную химическую структуру и некоторые из них обладают способностью к комплексообразованию с экзометаболитами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста при улучшении роста растений. Также известны антибиотики депсипегггидной природы, выступающие как агенты, образующие комплексы с ионами металлов и транспортирующие их через природные и искусственные мембраны. Однако эта способность для метаболитов бактерий рода Pseudomonas практически не изучена. В тоже время, установление механизмов действия метаболитов бактерий рода Pseudomonas на фитопатогены необходимо для разработки эффективных способов защиты рас тений.
С другой стороны широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ризосферных бактерий рода Pseudomonas сдерживается отсутствием стандартных технологий их производства. Нужно отметить, что при производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии одной из главных проблем является высокая стоимость питательной среды.
Использование для оптимизации параметров технологии производства биопрепаратов в качестве методического аппарата методов математического планирования эксперимента позволяет не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния. Что в итоге позволит производить высокоэффективные биопрепараты с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью даже с использованием в качестве компонентов сред вторичного сырья, например, автолизагов отработанных пивных дрожжей.
Учитывая, что потребность сельского хозяйства в средствах защиты растений увеличивается . с каждым годом, проблема совершенствования технологии биологической защиты растений также представляется актуальной.
Цель исследования. Целью работы явилось определение биологической роли экзометаболитов бактерий рода Pseudomonas в их взаимодействии с фитопатогенными грибами, установление их химической природы, а также разработка технологии промышленного культивирования псевдомонад для производства сельскохозяйственных биопрепаратов на их основе.
Задачи исследования.
1. Выделить биологически активные метаболиты исследуемых штаммов Pseudomonas chJovoraphis ИВ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. put ¡da ИБ 17, исследовать их физико-химические свойства, определить состав и структуру.
2. Изучить способность комплексообразования метаболитов штаммов Pseudomonas с различными углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, входящими в комплекс экссудатных выделений корней растений, а также с катионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия, свинца.
3. Установить стехиометрические составы комплексов метаболит:экссудат, метаболит : катион. Оценить комплексообразующую способность триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas как одного из механизмов их ингибирующего воздействия на фитопатогены.
4. Выявить условия максимальной продукции цитокининов штаммом бактерий Р. chJovoraphis ИБ 6 в зависимости от состава питательной среды, определить их химическую структуру.
5. Изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов питательной среды на накопление биомассы и продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.
6. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.
Научная новизна.
Впервые показана способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать межмолекулярные комплексы с компонентами, входящими в корневые экссудаты растений: углеводами, органическими кислотами, аминокислотами, тем самым, лимитируя по субстрату фитопатогены. Установлено, что процесс комплексообразования триглицеридпептидов и компонентов экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.
Впервые показано, что метаболиты псевдомонад способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца.
Разработаны новые питательные среды (Патент РФ № 2303061, 2007) и технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
П р а кг Ii ч е с к а я з 11 а ч 11 м ость.
Определены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений.
Разработаны новые экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений.
Установленная комплексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.
Основные положения, выносимые на защиту:
- исследуемые штаммы Pseudomonas spp. синтезируют новые экзометаболиты, обладающие фунгицидной и фитогормональной активностью;
- комплексообразование триглицеридпептидов с компонентами экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фигопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений; триглицеридпегггиды способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца; новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов сельскохозяйственного назначения на основе бактерий рода Pseudomonas с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток;
- технология промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XV, XIX и XX Международных научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002, 2006, 2008), I и II Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003), IV Всероссийской научной 1ЫТЕ11ЫР.Т-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), IV Всероссийской научной ¡п1егпе1:-конференции (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008), 5-м Всероссийском научно-практическом совещании-семинаре, (Анапа, 2008), Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (КНР, Харбин - Санья, 2008).
Публикации. По материалам работы опубликовано 34 научных работы, в том числе 16 работ в журналах, рекомендованных ВАК, два патента.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
El. Ризобактерии рода Pseudomonas. Функционирование в системе растения - фитопатогены
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации как внутри корневых тканей, гак и на корневой поверхности (ризогшане), а также в почве, непосредственно окружающей корни (ризосфере). В ризосфере в отличие от свободной от корней почвы доминируют грамотрицательные бактерии, причем преобладают бактерии рода Pseudomonas (Воронин, 1998; Ligon et al., 2000; Danhorn, Fuqua, 2007).
Псевдомонады способны к синтезу целого ряда соединений, стимулирующих рост растений. Стимуляторы роста растений, образуемые псевдомонадами, представлены фитогормонами, такими как ИУК (индолил-3-уксусная кислота) и цитокинины. Кроме того, некоторые штаммы псевдомонад способны улучшать азотное и фосфорное питание растений.
В некоторых публикациях авторы отмечают наличие положительного комплексного действия на растение со стороны бактерий-антагонистов. Речь идет не только о биологическом контроле почвенных инфекций, использование культур штаммов-антагонистов способствует также индукции системной устойчивости растений, благоприятствует раннему росту и увеличению урожая сельскохозяйственных культур (Свешникова и др., 2003; Zehnder et al., 2001; Haas, Defago, 2005).
Известно, что бактерии рода Pseudomonas обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фигопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Четвериков, Сергей Павлович
выводы
1. Выделены новые метаболиты для трех штаммов Pseudomonas spp., различающихся по видовой принадлежности, обладающие фунгицидной активностью, представляющие по своей химической структуре трипегггиды глицерина с молекулярной массой 2,8-3,0 кДа. Определены минимальные ингибирующие концентрации триглицеридпептидов изучаемых псевдомонад для ряда фитопатогенных и фитотоксичных грибов, показывающие, что антигрибная активность выделенных метаболитов сопоставима величине активности известных антибиотиков бактерий рода Pseudomonas.
2. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas способны к образованию межмолекулярных комплексов с компонентами экзометаболитов растений - органическими кислотами, аминокислотами и углеводами, лимитируя по субстрату фитопатогены. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas также способны образовывать ассоциаты с ионами меди, цинка, кадмия и свинца.
3. Стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат для триглицеридпептидов штаммов бактерий Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6, Р. putida ИБ 17 с компонентами различных фракций корневых экссудатных экзометаболитов растений находятся в интервале 1:1 — 1:20. Оптимальные для снижения содержания солей металлов стехиометрические составы комплексов метаболит : катион находятся в интервале 1:1 - 1:9.
4. Образование межмолекулярных комплексов триглицеридпептидами изученных штаммов бактерий рода Pseudomonas ограничивает доступность источников углерода для фитопатогенных грибов и является одним из механизмов проявления антигрибной активности метаболитов.
5. Выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1 100 иг/мл, в том числе и три - О - пропионил - N6 -(А2 - изопентенил)аденозина - новой формой цитокининоподобных веществ.
6. Показано, что антигрибная активность и накопление биомассы при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putidci ИБ 17 главным образом зависят от концентрации дрожжевого автолизата и фосфатов в ферментационной среде.
7. Разработаны новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей, пекарских дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.
8. Оптимизированы условия периодического и непрерывного промышленного культивирования биопрепарата «Елена» и аналогичных биопестицидов на основе бактерий рода Pseudomonas. Показано, что антигрибная активность штамма Р. putida ИБ 17, выращенного в оптимальных условиях, максимальна среди исследуемых штаммов псевдомонад.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ
При производстве биопрепаратов на основе штаммов бактерий Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов, рекомендуется использование питательных сред на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей.
Определены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений.
Установленная комилексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.
Методы современной аналитической химии рекомендуются для оценки характера антигрибной активности метаболитов бактерий рода Pseudomonas при изучении комплексообразования в биологических системах.
По результатам исследований разработана и утверждена в установленном порядке следующая нормативно-техническая документация:
- ТУ 9291 -01 7-22657427-2002. Биопрепарат «Елена», Ж;
- Лабораторный регламент на производство опытной партии препарата «ЕЛЕНА»;
- Временный технологический регламент на получение опытной партии биопрепарата «Елена».
Испытания оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей проводили для биопрепарата «ЕЛЕНА» на производственных площадях ГУН «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан» в условиях спроектированной опытно-промышленной установки по производству биопрепаратов. Было наработано биопрепарата «Елена» 10 тонн.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Болезни культурных растений, вызываемые фитопатогенными грибами, уничтожают до 30% потенциального урожая. Кроме того, заражая культурные растения, грибы загрязняют их продуктами своей жизнедеятельности - микотоксинами, которые ухудшают потребительские качества сельскохозяйственного пищевого сырья, что снижает его биологическую полноценность и безопасность. Применяемые химические фунгициды небезопасны, загрязняют окружающую среду, патогенные грибы вырабатывают к ним устойчивость. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется развитию экологически чистых биологических методов борьбы с болезнями растений, которые рассматриваются как альтернатива традиционным методам защиты растений, связанным с применением химических фунгицидов. Аналогичная тенденция по использованию биопрепаратов в сельском хозяйстве наблюдается во всех развитых странах, где объемы применения химических препаратов в растениеводстве неуклонно снижаются.
Разработка новых типов биопрепаратов для сельского хозяйства, обладающих комплексным действием, сочетающим антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам с продукцией ростстимулирующих веществ является актуальной задачей
Антагонистическая активность изученных бактерий связана с продукцией антибиотиков. Впервые показано, что метаболиты псевдомонад, обладающие фунгицидной активностью, представляют собой триглицеридпепгиды, способные к комплексообразованию с экзометаболигами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста при улучшении роста растений. Комплексообразование с компонентами экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.
Новые штаммы бактерий-антагонистов также способны синтезировать ряд фитогормонов, в том числе и их новые формы, стимулирующих развитие растений. Совокупность положительных свойств изученных штаммов позволяют считать их перспективной основой для создания биопрепаратов нового поколения.
С учетом того, что при производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии одной из главных проблем является высокая стоимость питательной среды, была минимизирована ее доля в стоимости биопрепарата путем создания новых экономичных ферментационных сред на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей с применением методов математического планирования эксперимента.
В условиях разработанных сред реализовано непрерывное культивирование с высокой производительностью процесса накопления биомассы по наработке штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 - основе биофунгицида «Елена», имеющего государственную регистрацию в Минсельхозе Российской Федерации.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Четвериков, Сергей Павлович, Уфа
1. Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Максимов В. Н. Оптимизация состава питательной среды для погруженного культивирования Ccmodermci lucidum II Микробиология. 2006,- том 75, №2,-С. 186-192.
2. Багдасарян З.Н., Алексанян Г. А., Гукасян Г. С., Мирзоян А. М. Оптимизация среды и условий культивирования продуцента фумаразы и аспартазы Erwinia sp Н Прикладная биохимия и микробиология. 2000. -том 36, №5,-С. 545-548.
3. Безбородов А.М., Загустина Н.А., Попов В.О. Ферментативные процессы в биотехнологии. М. : Наука, 2008. - 335 с.
4. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. М. : Мир, 1989.-413 с.
5. Белякова Л.А., Ляшенко Д.Ю. Комплексообразование бензолкарбо-новых кислот с Р-циклодекстрином // Журнал прикладной спектроскопии. 2008. - Т. 75. - № 3. - С. 299-303.
6. Блажевич О.В., Максимова Н.П. Биосинтез флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм у ризосферных бактерий Pseudomonas putida M // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. - № 2. - С. 205-209.
7. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал,- 1998. № 10. - С. 25-31.
8. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М.: Мир, -1978. - 396 с.
9. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. Основы современного электрохимического анализа. М.: Мир: Бином ЛЗ. - 2003. -592 с.
10. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотоколориметриметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. Изд. 4-е. Л. : Химия. 1976. - 376 с.
11. Вебер Э., Фегтле Ф., Хингельфельд Р., Зэнгер В., Крам д. Дж. и др. Химия комплексов «гость хозяин». Синтез, структуры и применения. -М.: Мир, - 1988.- 512С.
12. Ветрова А.,А., Нечаева И., А., Игнатова А., А., Пунтус И.,Ф., и др. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти // Микробиология. 2007.- №3,- С. 354-360.
13. Волчатова И. В., Медведева С. А., Бабкин В. А. Оптимизация состава питательной среды как способ регуляции синтеза лигниназы грибом Coriolus vi/losus II Прикладная биохимия и микробиология. 1997.- том 33, №1,-С.94-97.
14. Гущина Ю.А., Евдокимов E.B. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна // Экология сегодня. 2001.- № 1.- С.65-67.
15. Додзин М. Е., Виноградова К. А., Котова И. Б. Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus II
16. Долгова E.M., Манько О.П., Зубко И .Я. и др. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы // Химия в сельском хозяйстве. 1997.-№Г- С. 13-14.
17. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.- 544 с.
18. Дурынина Е. П., Пахненко О. А., Злотников А. К., Злотников К. М. Влияние биопрепарата альбит на продуктивность ячменя и содержание биофильных элементов в урожае // Агрохимия. 2006 - №1.- С. 49-54.
19. Егорова Н.С. Практикум по микробиологии Учебное пособие. М, 1976. 307с.
20. Ермакова Н.И., Штерншис М.В. Новый биопрепарат РИД против болезней растений // Защита растений. 1994.- № 12,- С. 18.
21. Есипов С.Е., Аданин В.М., Баскунов Б.П. Новый антибиотически активный флороглюцид из Pseudomonas aurantiaca II Антибиотики. 1975. -Т. 20, № 12.-С. 1077-1081.
22. Квасников Е. И., Айзенман Б.Е., Соломко Э.Ф. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на средах с низкомолекулярными н-алканами // Микробиология. 1975 - Т. 44, № 1 .С. 55-60.
23. Киприанова Е.А., Рабинович A.C., Бойко О.И., Каминская Л.Ю. Высокоактивное антибиотическое вещество, выделенное из бактерий рода Pseudomonas // Антибиотики. 1969. - Т. 14, №3. - С. 228-231.
24. Киприанова Е.А., Рабинович A.C., Каминская Л.Ю. Химическая и биологическая характеристика антибиотических веществ, образуемых Pseudomonas aurantiaca П Физиологически активные вещества. 1971. - № 3-С.283-290.
25. Климова В.А. Основные микрометоды онализа органических соединений. М.: Химия, 1967. - 208 с.
26. Кондратьева Т. Ф., Лобачёва Н. А. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования с целью увеличения количества синтезируемого Pullularia pullulans пуллулана // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып 6. - С. 1004-1009.
27. Королёва О.В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. и др. Оптимизация условий глубинного культивирования базидиомицета Coriolus hirsutus -продуцента внеклеточной лакказы // Прикладная биохимия и микробиология . 2000. - том 36, №1. - С. 30-36.
28. Коршунова Т.Ю., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф. Биофунгицид Елена для протравливания семян ячменя ярового и его влияние на урожайность и устойчивость к болезням // Башкирский химический журнал. 2007. - Т. 14. - № 4. - С. 92-94.
29. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. и др. Биопрепарат псевдобактерин-2 для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов // Химия в сельском хозяйстве. 1997. - №1. - С. 15-16.
30. Кравченко Л.В., Азарова Т.С., Леонова-Ерко Е.И. и др. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 1. - С. 48-53.
31. Кравченко Л.В., Шапошников А.И., Макарова Н.М. и др. Динамика численности антифугальных штаммов Pseudomonas в ризосфере огурцов,выращиваемых в условиях гидропоники на минеральном тепличном субстрате // Микробиология. 2006. - Т.75, №3. - С.404-409.
32. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. - Т. 33, вып. 6. - С. 1221 -1227.
33. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каровайко Н.И. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. - Т. 37, вып. 1. - С. 193-199.
34. Кузнецов Л. Е., Ховрычев М. П. Оптимизация синтетической среды для культивирования Bacillus ihuringiensis II Микробиология. 1984. - T.53 вып. 1 С. у54-57.
35. Кузнецова М.А., Филиппов A.B. Ризоплан и фитофтороз картофеля // Защита растений. -1995. № 8. - С. 19-20.
36. Кузьмина Л.10., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф., Свешникова Е.В., Мелентьев А.И. Эффективность бактериальных препаратов при защите растений яровой пшеницы от твердой головни // Сельскохозяйственная биология. 2003. - № 5. - С. 69-73.
37. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский образовательный журнал. 1995. - № 1. - С. 20-27.
38. Куликов С.El., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев C.B., Варламов В. П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибными болезнями картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. -№1 С. 86-92.
39. Ленгелер Й., Дрейвс F., Шлегель Е. // Современная микробиология Прокариоты в 2-х томах. Т. 1.: Мир: 2005. - 656 с.
40. Логинов О.El. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии,- М.: Е1аука. 2005. - 166 с.
41. Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Силищев H.H. и др. Роль бактерий -антагонистов фитопагогенов в защите сельскохозяйственных растений от болезней. Уфа: Г'илем, 2001. - 66 с.
42. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней // Аграрная наука. 2003. - № 7. - С. 24.
43. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Биопрепараты против твердой головни пшеницы // Защита и карантин растений. 2002. - № 9. - С. 39.
44. Логинов О.Н., Четвериков С.Г1. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 // Биотехнология. 2003,-№5.-С. 22-25.
45. Логинов О.Н., Четвериков С.П., Гусаков В.Н. Триглицеридпептиды -новая группа антигрибных метаболитов псевдомонад (.Pseudomonas) // Доклады Академии Наук. 2003. - Т. 393. - № 5. - С. 715-717.
46. Максимов В. IT., Федоров В. Д., О математическом планировании биологических экспериментов // Известия АН СССР, сер. биол. 1966. -№6,
47. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М, 1969;- 126 с.
48. Межераупе В. А. Использование картофельного сока для выращивания микроорганизмов. В кн.: Продуценты аминокислот и ферментов. Рига: Зинатие, 1987, С. 124-177.
49. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразуюицие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. -М.: Наука, 2007. 147 с.
50. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхард Т. 2. М: Мир,1984. - С. 293-295, 356-358.
51. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. Рига: Зинатне, 1988. - 151 с.
52. Мишке И. В., Тевелева М. К., Миклашевиче Э. П. Некоторые свойства микробных цитокининов из Pseudomonas stutzeri II Микробиология. 1985.-вып. 5 - С. 774-777.
53. Монахова О. Ф. и Чернядьев И.И. Протекторное влияние цитокининовых препаратов на фотосинтетический аппарат растений пшеницы при водном дефиците // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. -Т. 43, №6. -С. 720-729.
54. Мордухова Е. А., Скворцова Н. П., Кочетков В. В., Дубейковский А. Н., Воронин А. М. Синтез фитогормона Индол-3- уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas II Микробиология. 1991. -вып З.-С. 494-499.
55. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я. и др. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. -Т.34, № 3. - С.287-292.
56. Назарова Л.Н. Агат-25К на зерновых культурах // Защита и карантин растений. 2002. - № 1. - С. 21 -22.
57. Назарова Л.Н., Наговицин В.А., Черемисина В.Г. Против комплекса болезней озимой ржи // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 18-19.
58. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия». - 2005. - 608 с.
59. Олюнина Л.Н., Шабаев В.П. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста // Микробиология. 1996. -Т.6, №6,-С.813-817.
60. Патент РФ № 2260951, Б.И. № 27, 2005. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 продуцент цитокининов / Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H.
61. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-С. 331.
62. Петренко М.Б., Боровков A.B. Производные феназина из Pseudomonas sp. штамм 2/3 // Химия природ, соединений. 1970. - №6. - С. 779.
63. Поморцева Н.В. Образование пиоцианина на средах с углеводородами // Микробиология. 1965. - Т. 34, № 3. - С. 473-476.
64. Попова Ж.П., Эськин С.Б., Матисова А.Н. О составе антифунгина -сырца // Бюл. ВНИИ с.-х. микробиологии. 1971. - Т. 15. - № 1. - С. 7980.
65. Редди Т.К., Боровков A.B. Moho-, ди- и триацетилфлороглюцины из Pseudomonas ßuorescens И Химия природ, соединений. 1969. - № 2. - С. 133.
66. Рубан E.J1. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука, 1986. - 200 с. С. 864-877.
67. Сакодынский К.П., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 464 с.
68. Свешникова Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas анатагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике: автореф. дисс. . канд. биол. наук. - Уфа, 2003. - 23 с.
69. Сидоренко О.Д., Стороженко В., Кухаренкова О. Применение бактериальных препаратов при выращивании картофеля // Междунар. с-х. ж, 1996.-№ 6.-С.36-38.
70. Силищев H.H., Коршунова Т.Ю., Логинов О.Н. Биопрепарат Елена для защиты тепличных овощей от грибных фитопатогенов и повышения урожайности // Картофель и овощи. 2008. - № 2. - С. 28-30.
71. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Валидов ELI.3. и др. Продукция фенозиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas aureofaciens,содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю // Микробиология.-2002.-Т. 71.-№6.-С. 778-785.
72. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с.
73. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Додатко Т.А., Клюев H.A. Антибиотики ароматической природы из Pseudomonas cepacia II Микробиол. журн. 1991. - Т. 53, № 5. - С. 41-45.
74. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Додатко Т.А., Пиляшенко И.И. Антибиотическая активность и сидерофоры Pseudomonas cepacia II Прикл. биохимия и микробиол. 1990. - Т. 26, № 1. - С. 75-80.
75. Сторожук С.В., Сидоров И.А., Соколов М.С. Высокое качество биопрепарата залог успеха // Защита растений. - 1995. - № 8. - С. 1 7.
76. Струнникова О. К., Шахназарова В., Ю., Вишневская Н., А., Чеботарь В., К., Тихонович И. А. Развитие и взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonas ßuorescens в почве // Микробиология. 2007.-№5.-С. 675-681.
77. Сгыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. - 288 с. Теппер Е.З., Шилыникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: Колос, 1972.-200 с.
78. Титаренко Л.Н., Вяткина Г.Г., Алещенко М.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 17. урожай и качество растений // Агрохимия. - 2008. - №4. - С. 35-42.
79. Хеншен А., Хупе К.-П., Лотшпайх Ф., Вельтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988. - 688 с.
80. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В., Чернин Л.С. Синтез индолилуксусной кислоты некоторыми фитопатогенными инепатогенными бактериями // Докл. АН Беларуси. 1996. - Т.40, № 2. - С. 80-83.
81. Худяков Я.П., Шкляр М.С., Савадеров е.П. Антибиотик антифунгин, образуемый бактериями рода Pseudomonas // Прикл. биохимия и микробиология, 1965.-Т. 1,№2.-С. 186-190.
82. Цевкелова Е. А., Климова С. 10., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - том 42, №2. - С. 133-143.
83. Цевкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Гормоны и гормоноподобные соединения мокроорганизмов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - том 42, №3. - С.261 -268.
84. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Триглицеридпептиды псевдомонад -новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - том 41, №1. - С.90-94.
85. Четвериков С.П., Логинов О.ЕЕ Е1овые метаболиты Azotobacter vinelandii, обладающие фунгицидной активностью // Микробиология. -2009. Т. 78, № 4. - С. 428-432.
86. Шабаев В. П. Влияние инокуляции сахарной свеклы ростстимулирующими ризосферными бактериями рода Pseudomonas на
87. Ia6aeB В.EL, Олюнина Л.EL, Смолин В.Ю. Функциональная активность корней кукурузы при инокуляции стимулирующими рост растений ризосферными бактериями рода Pseudomonas // Изв. РАН.Сер. биол. 1999. - № 1. - С.39-46.
88. Широков А.В., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 ингибиторы роста фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, № 2. - С. 161-165.
89. Ahmadzadeh М, Afsharmanesh Н., Javan-Nikkhah М., Sharifi-Tehrani А. Identification of some molecular traits in fluorescent pseudomonads with antifungal activity // Iranian Journal of Biotechnology. 2006. - V. 4. - P. 245253.
90. Ali Siddiqui I, S.Ehetshamul-Haque, S. Shahid Shaukat. Use of rhizobacteria in the control of root rot-root knot disease complex of mungbean // J.Phytopathol. 2001. - N 6. - P.337-346.
91. Anthony U., Christophersen C., Nielse P.H., Gram L., Petersen B.O. Pseudomonine, an isoxazolidone with siderophoric activity from Pseudomonas fluorescens AH2 isolated from lake Victoria Nile perch // J. Nat. Prod. 1995. -V. 58. - P . 1786-1789.
92. Arima K., Imanaka H., Konsara M. et al. Pyrrolnitrin, a new antibiotic substans, produced by Pseudomonas II Agr. and Biol. Chem. 1964. - V. 28, N 8. - P. 575-582.
93. Balta D.K., Arsu N. Host/guest complex of (3-cyclodextrin/5-thia pentacene-14-one for photoinitiated polymerization of acrylamide in water // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2008. - V. 200. -P. 377-380.
94. Batchelor E., Klinowski Ja., Jones W .Crystal engineering using co-crystallisation of phenazine with dicarboxylic acids // Journal of Materials Chemistry. 2004. - V. 10. - N 4. - P. 839-848.
95. Bawden K., Broadbent J., Ross W. Some simple anthelmintics // Brit. J. Pharmacol, and Chemother. 1965. - V. 24. - P. 714-724.
96. Baysse C., De Vos D., Naudet Y., Vandermonde A., Ochsner U., Meyer J.M. et al. Vanadium interferes with siderophore-mediated iron uptake in Pseudomonas aeruginosa II Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 2425-2434.
97. Becker J.O., Cook R.J. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased growth response of wheat by fluorescent Pseudomonas 11 Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 778-782.
98. Becker J.O., Hepfer C.A., Yuen G.V. et al. Effect of rhizobacteria and metham-sodium on growth root microflora of celery cultivars // Phytopathology-1990. Vol. 80, N2.-P. 206-211.
99. Bisacchi G.S., Hockstein D.R., Koster W.H., Parker W., Rathnum M.L, Unger S.E. Xylocandin: a new complex of antifungal peptides. II. Structural studies and chemical modifications // J. Antibiot. 1987. - V. 40. - P. 1520— 1529.
100. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria // Curr. Opin. Plant. Biol. 2001. -V. 4. - P. 343-350.
101. Bonsall R.F., Weller D.M., Thomashow L. S. Quantification of 2,4 diacetylphloroglucinol produced by fluorescent Pseudomonas spp. in vitro and in the rhizosphere of wheat // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 951-955.
102. Box G. E. P., Hunter J. S. Multifactor experimental designs for exploring response surfaces // Ann. Math. Stat., 28, 1957, N1, 195
103. Box G. E. P., Wilson K. B. On the experimental attainment of optimum conditions//J. Roy. Stat.Soc., ser.B. 13.1951, N1
104. Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 104. - P. 209-228.
105. Budzikiewicz H. Siderophores of fluorescent pseudomonads // Z. Naturforsch. 1997,- V. 52,- P. 713-720.
106. Burkhead K.D., Schisler D.A., Slininger P.J. Pyrrolnitrin production by biological control agent Pseudomonas cepacia B37w in culture and in colonized wounds of potatoes // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2031-2039.
107. Buyer J., Wright J., Leong J. Structure of pseudobactin A 214, a siderophore from a bean-deleterious Pseudomonas II Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 5492-5499.
108. Canesan P., Gnanamanickam S.S. Biological control of Sclerotium rolfsii Sacc. in peanut by inoculation with Pseudomonas fluorescens II Soil Biol. Biochem. 1987. - Vol. 19, N 1. - P. 35-38.
109. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. 2003. - V. 157.-P. 503-523.
110. Choudhury S.D., Basu S. Caging of phenazine by 4,4'-bis(dimethylamino)diphenylmethane: A comparative study with phenazine-N,N-dimethylaniline // Chemical Physics Letters. 2004. - V. 383. - P. 533-536.
111. Clarke P., Ornston N. Metabolic pathways and regulation. Pt 1. In: Genetics and biochemistry of Pseudomonas N. Y.;L., - 1975. - P.366.
112. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement C., Barkal E.A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl Environ Microbiol. 2005. -V. 71.-P. 4951-4959.
113. Corbell N., Loper J. E. A global regulator of secondary metabolite production in Pseudomonas jhiorescens Pf-5 // J. Bacterid. 1995. - V. 177. - P. 6230-6236.
114. Cornelis P., Matthiis S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines // Environ. Microbiol. 2002. - V. 12. - P. 787-798.
115. Cox C.D., Rinehart K.L., Moore M.L., Cook J.C. Pyochelin: novel structure of an iron chelating growth promoter for Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. - V. 78. - P. 4256-4260.
116. Dakora F.D. & Phillips D.A. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments // Plant and Soil. 2002. - V. 245. - P. 35-47.
117. Danhorn T., Fuqua C. Biofilm formation by plantassociated bacteria // Annu Rev. Microbiol. 2007. - V. 61. - P. 401-422.
118. Dao K.H.T., Hamer K.E., Clark C.L., Harshman L.G. Pyoverdine production by Pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress // Ecol. Appl. 2001. - V. 9. - P. 441-448.
119. De Souza J. T., De Boer M., De Waard P., Van Beek T. A., Raaijmakers J. M. Biochemical, genetic, and zoosporicidal properties of cyclic lipopeptide surfactants produced by Pseudomonasßuorescens. II Appl. Environ. Microbiol. -2003.-V. 69.-P. 7161-7172.
120. Dharumaduari D., Thajuddin N., Panneerselvam A. An antifungal compound: 4'phenyl-1-napthyl-phenyl acetamide from Streptomyces sp. DPTB16 // Medicine and Biology. 2008. - Vol. 15, N 1. - P. 7-12.
121. Dowling D.N., O'Gara F. Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - P. 133-141.
122. Dreja M., Kim In.T., Yin Ya., Xia Y. Multilayered supermolecular structures self-assembled from polyelectrolytes and cyclodextrin host-guest complexes // Journal of Materials Chemistry. 2000. - V. 10, N 3. - P. 603605.
123. Duffy B.K., Defago G. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas ßuorescens biocontrol strains // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - V. 65. - P. 2429-2438.
124. Dybas M.J., Tatara G.M., Criddle C.S. Localization and characterization of the carbon tetrachloride transformation activity of Pseudomonas sp. strain KC //Appl. Environ. Microbiol. 1995. -V. 61. - P. 758-762.
125. Elsherif M., Grossmann F. Versuche zur biologischen Bekämpfung einiger phytopathogener Pilze durch fluoreszierende Pseudomonaden unter
126. Anwendung verschiedener Applikationsverfahren HZ. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz.-! 991.- Bd. 98, N 3. S. 236-249.
127. Fakhouri W., Walker F., Vogler B., Armbruster W., Buchenauer H. Isolation and identification of N-mercapto-4-formylcarbostyril, an antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens II Phytochemistry. 2001. V. 58. - P. 1297-1303.
128. Fermeglia M., Ferrone M., Lodi A., Priel S. Host-guest inclusion complexes between anticancer drugs and ß-cyclodextrin: Computational studies // Carbohydrate Polymers. 2003. - V. 53, N 1. - P. 15-44.
129. Flavia P. D., Franga F.P., Lopes M. A.Optimization of culture conditions for exopolysacharides production in Rhizobium sp. using the response surface method // Electronic Journal of biotechnology. 2006. - Vol. 9, N4, July 15. -P. 391-399.
130. Gamard P., Belrhlid R., Labbe C., Belanger R., Paulitz T. Production of multiple antifungal compounds by PGPR strains of Pseudomonas fluorescens and Serratia plymuthica II Can. J. Plant Pathol. 1996. V. 18. - P. 89.
131. Gamard P., Sauriol F., Benhamou N., Belanger R.R., Paulitz T.C. Novel butyrolactones with antifungal activity produced by Pseudomonas aureofaciens strain 63-28 // J. Antibiot. 1997. V. 50. - P. 742-749.
132. Gao El., Wang Y.N., Fan Y.G., Ma J.B. Interactions of some modified mono- and bis-ß-cyclodextrins with bovine serum albumin // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2006. - V. 14, N. 1. - P. 131-137.
133. Garg S. K., Kumar Y.N., Kumar J. Gold-tolerant fluorescent Pseudomonas isolates from Garhwal Elimalayas as potential plant growthpromoting and boicontrol agents in pea // Current science. 2005. - Vol. 89, N12, 25, December. - P. 2151 -2156.
134. Gaur R., Shani N., Kawaljeet Johri B.N., Rossi P., Aragno, M. Diacetyl phloroglucinol-producing Pseudomonas do not influence AM fungi in wheat rhizosphere // Curr. Sei. 2004. - V. 86. - P. 453-457.
135. Ghysels B., Dieu B. T., Beatson S. A., Pirnay J. P., Ochsner U. A., Vasil M. L., Cornelis P. FpvB, an alternative type I ferripyoverdine receptor of Pseudomonas aeruginosa // Microbiology. 2004. - V. 150. - P. 1671-1680.
136. Gordon-Lennox G., Walther D., Gindral D. Utilisation d'antagonistes pour l'enrobage des semences: efficacité et mode d'action contre les agents de la fonte des semis//Bull. OEPP. Oxford etc. 1987. - Vol.l 7, N 4. - P. 631-637.
137. Gould W.D., Hagedorn C., Bardinelli T.R., Zablotowicz R.M. New selective media for enumeration and recovery of fluorescent pseudomonads from various habitats // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. - P. 28-32.
138. Grgurina I., Mariotti P., Fogliano V., Gallo M., Scaloni A., Iacobellis N.S., Cantore P.L. et al. A new syringopeptin produced by bean strains of Pseudomonas syringae pv. Syringae // Biochim. Biophys. Acta. — 2002. V. 1597.-P. 81-89.
139. Guo Ying, Pu Wang et al. Medium optimization for enzymatic production of 1-Cysteine by Pseudomonas sp.Zjwp-M using response surface methodology // Food Technology Biotechnology. 2008,- 46(4). -P. 395-401.
140. Haas D., De'fago G. Biological control of soilbome pathogens by fluorescent Pseudomonads 11 Nat. Rev. Microbiol. 2005. - V. 4. - P. 307-319.
141. Haas D., Keel C. Regulation of antibiotic production in root-colonizing Pseudomonas spp. and relevance for biological control of plant disease. // Annu Rev Phytopathol. 2003. - V. 41. - P. 117-153.
142. Hader R. J., Harward H. E., Mason D. D., Moore D. P. An investigation of some of relationships between copper, iron and molybdenum in the growth and nutrition of lettuce // Proceeding of Am. Soil Sei. Soc.21. 1957,- N 1,59.
143. Hasegawa S., Kodama F., Kaneshima Ii. et al. Biological control of Fusarium diseases, isolation of antagonistic microorganisms and seed bacterization on the control for Fusarium wilt of adzuki-bean // J. Pharmacobic-Dyn. 1987. -Vol. 10, N 3. - P. 57.
144. He Li, Xu Y., Zhang X.H. Medium factor optimization and fermentation kinetics for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-/8G // Biotechnol. Bioeng. 2008. - 100. - P.250-259.
145. Henriksen A., Anthoni (J., Nielsen T. H., Sorensen J., Christophersen C., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide tensin from Pseudomonas fluorescens strain 96.578. // Acta Crystal. 2000. - V. 56. - P. 113-115.
146. Höfte M., Buysens S., Koedam N., Cornelis P. Zinc affects siderophore-mediated high affinity iron uptake systems in the rhizosphere Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 // Bio/Metals. 1993. - V. 6. - P. 85-91.
147. Homma Y., Sato Z., Hirayama F., Konno K., Shirahama H., Suzui T. Production of antibiotics by Pseudomonas cepacia as an agent for biological control of soilborne plant pathogens // Soil Biot. and Biochem. 1989. - V. 21, N 5. - P. 723- 728.
148. Plosseiny Davarani S.S., Fakhari A.R., Shaabani A., Ahmar H., Maleki A., Sheijooni Fumani N. A facile electrochemical method for the synthesis of phenazine derivatives via an ECECC pathway // Tetrahedron Letters. 2008. -V. 49, N 39. - P. 5622-5624
149. Housley L., Anderson T., Sontag N., Song-Hee Han, David W. Britt, Anderson A.J. Pluronics' influence on pseudomonad biofilm and phenazine production // Federation of European Microbiological Societies. 2009. - V. 293. -P. 148-153.
150. James D.W., Gutterson N. 1. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens HV37a and their differential regulation by glucose // Appl. Environ. Microbiol. 1986,- V. 52. - P. 1 183-1 189.
151. Janisiewicz W.J., Roitman J. Biological control of blue mold and gray mold on apple and pear with Pseudomonas cepacia II Phytopathology. 1988. -V. 78. P. 1697-1700.
152. Janisiewicz W.J., Yourman L., Redman J., Mahone L. Postharvest control of blue mold and gray mold of apples and pears by dip treatment with pyrrolnitrin, a metabolite of Pseudomonas cepacia II Plant Dis. 1991. V. 75. -p. 490-494.
153. Jeschke P., Harder A., Etzel W., Schindler M., Thielking G. Synthesis and anthelmintic activity of cyclohexadepsipeptides with cyclohexylmethyl side chains // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2007. - V. 1 7, N 13. - P. 3690-3695.
154. Jiao Y., Yoshihara T., Ishikuri S., Uchino H., Ichihara A. Structural identification of cepaciamide A, a novel fungitoxic compound from Pseudomonas cepacia D-202 // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. - P. 1039-1042.
155. Jones G., Zhou X., Lu L.N. Inclusion by ß-cyclodextrin of a pyrene-labeled dipeptide photoprobe // Tetrahedron Letters. 2002. - V. 43, N 34. - P. 6079-6082.
156. Joseph B., Patra R.R., Lawrence R. Characterization of plant growth promoting rhozobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.) // International Journal of Plant Production. 2007. - 1(2), September. - P. 141152.
157. Kanner D., Gerber N., Bartha R. Pattern of phenazine pigment production by strain of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacterid. 1978. - V. 134, N2. - P. 690.
158. Karakos S., Aksoz N. Some optimal cultural parameters for gibberilic acid biosyntesis by Pseudomonas sp. II Turkey Journal Biology. 2006. - 30. -P. 81-85.
159. Katoh K., Itoh K. New selective media for Pseudomonas strains producing fluorescent pigment // Soil Science and Plant Nutrition. 1983. - V. 29.-P. 525-532.
160. Kim K.K., Kang J.G., Moon S.S., Kang K.Y. Isolation and identification of antifungal N -butylbenzenesulphonamide produced by Pseudomonas sp AB2 //J. Antibiotics.-2000.-V. 53.-P. 131-136.
161. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. 1954. - V. 44. -P. 301-307.
162. Kintaka K., Kitano K., Nosari Y. et al. Sulfazecin, a novel ß- lactam antibiotic of bacterial origin. Discovery, fermentation and biological characterization // J. Fernent. Technol. 1981. - V. 59, N 4. - P. 263-268.
163. Knight M., Elartman Ph., Hartman Z., Young V. A new method of preparation of piocyanin and demonstration of an unusual bacterial sensivity // An. Biochem. 1979.-V. 95, N 1. - P. 19-23.
164. Kuiper I., Lagendijk E.L., Pickford R. et al. Characterization of two Pseudomonas putida lipopeptide biosurfactants, putisolvin I and II, which inhibit biofilm formation and break down existing biofilms. // Mol. Microbiol.2004. V. 51.-P. 97-1 13.
165. MacDonald E.M.S., Powell G.K., Regier D.A., Glass N.L., Roberto F., Kosuge T., Morris R.O. Secretion of zeatin, ribosylzeatin, and ribosyl-1-methylzeatin by Pseudomonas savastanoi II Plant Physiology. 1986. - V 82. P. 742-747.
166. MacDonald J.C. Pyocyanine. Antibiotics. V. 2. Biosynthesis. London; New York: Springer Verl., 1967. - P. 52-65.
167. Manzini B., Flodge P. Polymer-supported syntheses of oxo-crown ethers and derivatives containing a-amino-acid residues // Reactive and Functional Polymers. 2008. - V. 68, N 9. - P. 1297-1306.
168. Mao G.H., Cappellini R.A. Postharvest biocontrol of gray mold of pear by Pseudomonas gladioli: Abstv. Present. 1989 Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc., Richmond, Va, Aug. 20-24, 1989 //Phytopathology.-1989.-Vol. 79, N 10.-P. 1 153.
169. Martin J. Control of antibiotic synthesis by phosphate // Adv. Biochem. Eng. 1977,-V. 6, N 1. - P. 105-127.
170. Masuoka Y., Nagai A., Shin-ya K., Furihata K., Nagai K., Suzuki K.I., Hayakawa Y., Seto H. Spiruchostatins A and B, novel gene expression-enhancing substances produced by Pseudomonas sp. // Tetrahedron Letters. -2001,-V. 42.-N 1. P. 41-44.
171. Matthijs S., Tehrani K.A., Laus G., Jackson R.W., Cooper R.M., Cornelis P. Thioquinolobactin, a Pseudomonas siderophore with antifungal and anti-Pythium activity // Environmental Microbiology. 2007. - V. 9, N 2. - P. 425434.
172. Mc Laughlin R.J., Sequeira L. Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato // Am. Potato J. 1988. - Vol. 65, N 5. - P. 255-268.
173. Mc Laughlin R.J., Sequeira L., Weingartner D.P. Biocontrol of bacterial wilt of potato with an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum: Interactions with root-knot nematodes // Am. Potato J. 1989. - Vol. 67, N 2. -P. 93-107.
174. Mew T.W. Bacterization of rice plants for control of sheath blight caused by Rhizoctonia solani / T.W Mew., A.M.Rosales //Phytopathology. 1986. -Vol. 76, N 1 1. - P. 1260-1264.
175. Meyer J.M. Pyoverdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species II Arch. Microbiol. 2000. - V. 174. - P. 135-142.
176. Meyer J.M., Abdallah M.A. The siderochromes of non-fluorescent pseudomonads: production of nocardamine by Pseudomonas stutzeri // J. Gen. Microbiol. 1980.-V. 1 18.-P. 125-129.
177. Meyer J.-M., Hohnadel D., Halle F. Cepabactin from Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, N 6. -p. 1479-1487.
178. Mislin G.L.A., Hoegy F., Cobessi D., Poole K., Rognan D., Schalk I.J. Binding properties of pyochelin and structurally related molecules to FptA of Pseudomonas aeruginosa // Journal of Molecular Biology. 2006. - V. 357, N 5. -P. 1437-1448.
179. Moon S.-S., Kang P.M., Park K.S., Kim C.H. Plant growt promoting and fungicidal 4-quinolines from Pseudomonas cepacia H Phytochemistry. 1996.-V. 42. - P. 365-368.
180. Mossialos D., Meyer J.M., Budzikiewicz H. et al. Quinolobactin, a new siderophore of Pseudomonas fluorescens ATCC 17400 whose production is repressed by the cognate pyoverdine // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66.-P. 487-492.
181. Narajana K. J., Vijayalakshmi M. Optimization of antimicrobial metabolites production by Streptomyces albidoflavus II Research Journal of Pharmacology.-2008. 2( 1 ). - P.4-7.
182. Nazarov V.B., Avakyan V.G., Vershinnikova T.G., Alfimov M.V. Excimer fluorescence and structures of the inclusion complexes of (3-cyclodextrin with naphthalene and its derivatives // Russian Chemical Bulletin. 2008. - V. 49, N 10. - P. 1699-1706.
183. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 26723-26726.
184. Neilands J.B., Leong S.A. Siderophores in relation to plant growth and disease // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V 37. - P. 1 87-208.
185. Neu T.R., Hartner T., Poralla K. Surface active properties of viscosin: a peptidolipid antibiotic // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 32. - P. 518520.
186. Neuenhaus W., Budzikiewicz H., Korth H., Pulverer G. 8-hydroxy-4-methoxy-monothiochinaldinsàure -eine weitere Thiosaure aus Pseudomonas II Z. Naturforsch. 1980.-V. 35.-P. 1569-1571.
187. Neupert-Laves K., Dobler M. Helv. Chim. Acta. 1975. - V. 58. - P. 432-437.
188. Nielsen Т.Н., Christophersen С., Anthoni U., Sorensen J. Viscosinamide, a new cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas fluorescens DR54 // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87. - P. 8090.
189. Novotnâ J. Antagonisticky vliv baktéric Pseudomonas fluorescens na nêkteré patogenni i saprofytické druhy hub fepky a Inu // Ochr. rostl. 1990. -Vol.26,N2.-P. 113-122.
190. Nowak-Thompson В., Gould S.J., Kraus J., Loper J.E. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol by the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens Pf-5 // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 1064-1066.
191. Nybroe O., Sorensen J. Production of cyclic lipopeptides by fluorescent pseudomonads // Biosynthesis of Macromolecules and Molecular Metabolism. J.-L. Ramos, ed., Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, U.S.A. -2004.-P. 147-172.
192. Ogata K., Minami K., Tani Y. Образование 1-феназинкарбоновой кислоты и оксихлорорафина из углеводородов под влиянием микроорганизмов // J. Ferment. Technol. 1971. - V. 49. -P. 925-934.
193. Ohmori T., Hagiwara S., Ueda A. et al. Production of pyoluteorin and its derivatives from n- paraffin by Pseudomonas aeruginosa S 10B2 // Agr. and Biol. Chem. 1978. - V. 42. - P. 767-771.
194. Osburn R.M., Schroth M.N., Hancook J.G. et al. Dynamics of sugar beet colonization by Pythium ultimum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off// Phytopathology. 1989.-Vol. 79, N6.-P. 709-716.
195. Parker W.L., Rathnum M.L., Seiner V. et al. Cepacin A and cepacin B, two new antibiotics produced by Pseudomonas cepacia // J Antibiot. 1984. -V. 37. - P. 431-440.
196. Parker W.L., Rathnum M.L., Seiner V., Trejo W.H., Principe P.A., Sykes R.B. Cepacin A and cepacin B, two new antibiotics produced by Pseudomonas cepacia II J Antibiot. 1984. - V. 37. - P. 431-440.
197. Paulitz T., Nowak-Thompson B., Garnard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens // J. Chem. Ecol. 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.
198. Paulsen I. T., Press C. M., Ravel J., Kobayashi D. Y., Myers G. S. A. et al. Corrigendum: Biocontrol genome deciphered. // Nat. Bioltechnol. 2006. -Published online.
199. Paulsen I.T., Press C.M., Ravel J., Kobayashi D.Y., Myers G.S.A. et al. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5. // Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 873-878.
200. Pfeifer P. Organische Molekularferbindungen. Stutgart: Ferdinand Huge, 1927.- 288 p.
201. Philson S.B., Llinas M. Siderochromes from Pseudomonas fluoresceins. II. Structural homology as revealed by NMR spectroscopy // J. Biol. Chem. 1982.- V. 257. P. 8086-8090.
202. Pierson III L.S.P., Pierson E.A. Phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureojaciens: role in rhizosphere ecology and pathogen suppression// FEMS Microbiology Letters. 1996.-V. 136.-P. 101-108.
203. Pietr S.J., Kempa R.Cucumber rhizosphere pseudomonads as antagonists of Fusarium // Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil: Proc. Int. Symp., June 22-27, 1987. -Praha, 1989. P. 411-417.
204. Pinkerton M., Steinrauf L.K., Dawkins P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. -V.- 35.-512 p.
205. Quail J.W., Ismail N., Pedras M.S.C., Boyetchko S.M. Pseudophomins A and B, a class of cyclic lipodepsipeptides isolated from a Pseudomonas species II Acta Crystallographica. Section C: Crystal Structure Communications. 2002.- V. 58. P. 268-271.
206. Raaijmakers J. M., Vlami M., de Souza J. T. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. // Antonie Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. -2002,-V. 81.-P. 537-547.
207. Raaijmakers J.M., Weller D. M., Thomashow L. S. Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -V. 63. - P. 881-887.
208. Renato de Freitas J., Germida J.J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as winter wheat inoculants for biocontrol of Rhizoctonia solcini II Can. J. Microbiol. 1991. -Vol. 37, N 10.-P. 780-784.
209. Rhodes D.J., Logan C. Effects of fluorescent pseudomonads on the potato blacked syndrome // Ann. Appl. Biol. 1986. - Vol. 108, N 3. - P. 511-518.
210. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Flarbor Press; 1989. p. A1-A2.
211. Risse D., Beiderbeck H., Taraz K., Budzikiewicz H., Gustine D. Corrugatin, a lipopeptide siderophore from Pseudomonas corrugate II Z. Naturforsch. 1998. - V. 53. - P. 295-304.
212. Roitman J.N., Mahoney N.E., Janisiewicz W.J., Benson M. A new chlorinated phenylpyrrole antibiotic produced by the antifungal bacterium Pseudomonas cepacia // J. Agr. Food Chem. 1990. - V. 38, N 2. - P. 538-541.
213. Rosales A.M., Thomashow L., Cook R.J., Mew T.W. Isolation and identification of antifungal metabolites produced by riceassociated antagonistic Pseudomonas spp. II Phytopathology. 1995. - V. 85. - P 1028-1032.
214. Rossbach S., Wilson T.L., Kukuk M.L., Carty H.A. Elevated zinc induces siderophore biosynthesis genes and a zntA-like gene in Pseudomonas fluorescens II FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 191. - P. 61-70.
215. Rudrappa T., Biedrzycki M.L., Bais FI.P. Causes and consequences of plant-associated biofilms // FEMS Microbiol. Ecol. 2008. - V. 64. - P. 153166.
216. Sakai T, Asai N, Okuda A, Kawamura N, Mizui, Y. Pladienolides, new substances from culture of Streptomyces platensis Mer- 11107.11. Physico-chemical properties and structure elucidation // J. Antibiot. 2004. - V. 57, N 3. -P. 180-187.
217. Savithiry S., Gnanamanickam S.S. Bacterization of peanut with Pseudomonas fluorescent for biological control of Rhizoctonia solani and for enhanced yield//Plant and Soil. 1987.-Vol. 102, N 1,-P. 11-15.
218. Sbrana C., Bagnoli G., Bedini S., Filippi C., Giovannetti M., Nuti M. P. Adhesion to hyphal matrix and antifungal activity of Pseudomonas strains isolated from Tuber borchii ascocarps // Can. J. Microbiol. 2000. - V. 46, N 3. -P. 259-268.
219. Schellenberg B., Bigler L., Dudler R. Identification of genes involved in the biosynthesis of the cytotoxic compound glidobactin from a soil bacterium // Environ. Microbiol. 2007. - V. 9. - P. 1640-1650.
220. Semenova I., Burakov A., Berardone N., Zaliapin I., Slepchenko B., Svitkina T., Kashina A., Rodionov V. Actin Dynamics Is Essential for Myosin-Based Transport of Membrane Organelles // Current Biology. 2008. - V. 18, N 20.-P. 1581-1586.
221. Serino L., Reimmann C., Visca P., Beyeler M., Chiesa V.D., Haas D. Biosynthesis of pyochelin and dihydroaeruginoic acid requires the iron-regulated pchDCBA operon in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 248-257.
222. Sharma A., Bardham D., Patel R. Optimization of physical parameters for lipase production from Arthrobacter sp. BGCC# 490 // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics.-2009. -Vol. 46, April.-P. 1 78-183.
223. Shoji J., Hinoo H, Terui Y., Kikuchi J., Flattori T., Ishii K., Matsumoto K., Yoshida T. Isolation of azomycin from Pseudomonas fluorescens II J. Antibiot. 1989. - V. 42. - P. 1513-1514.
224. Siunova T.V., Kochetkov V.V., Validov Sh.Z., Suzina N.E., Boronin A.M. The production of phenazine antibiotics by the Pseudomonas aureofaciensstrain with plasmid-controlled resistance to cobalt and nickel 11 Microbiology. -2002,- V. 71, N6.-P. 670-676.
225. Slininger P., Shea-Wilbur M.A. Liquid-culture pH, temperature, and carbon (not nitrogen) source regulate phenazine productivity of the take-all biocontrol agent Pseudomoncis fluoresceins 2-79 // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1995,-V. 43.-P. 794-800.
226. Slininger P.J., Jackson M.A. Nutritional factors regulating growth and accumulation of phenazine 1-carboxylic acid by Pseudomonas fluoresceins 2-79 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - V. 37. - P. 388-392.
227. Smith G.D., Duax W.L. Crystallographic studies of valinomycin and A23187. In: Metal-ligand // Interactions in Organic Chemistry and Biochemistry. 1977. - Part 1. - P.291-3 15.
228. Sobiczewski Piotr., Bryk Llanna Mozliwosci i ograniczenia biologicznej ochronny jablek bakteriami Pantoea agglomerans i Pseudomonas sp. przed szara plesnia i mokra zgnilizna // Post. ochr. rosl. 1999. -Nl. - P. 139-147.
229. Sokol P.A., Lewis C.J., Dennis J.J. Isolation of a novel siderophore from Pseudomonas cepacia II J. Med. Microbiol. 1992. - V. 36. - P. 184-189.
230. Sorensen D., Nielsen T.H., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 // Acta Crystallographica. 2001. - Section C: Crystal Structure Communications C 57.- P. 1 123-1 124.
231. Srivastava R., Srivastava S., Bridge V. Antifungal activity of Pseudomonas fluorescens against different plant pathogenic fungi // Electronic
232. Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry. 2008. - V. 7, N 4. - P. 2789-2796.
233. Stolworthy J.C., Paszczynsk A., Korus R., Crawford R.L. Metal binding by pyridine-2,6-bis (monothiocarboxylicacid), a biochelator produced by Pseudomonas stutzeri and Pseudomonas putida // Biodegradation. 2001. - V. 12.-P. 41 1-418.
234. Sugimoto E.E., Hoitink H.A.J., Tuovinen O.H. Oligotro phic pseudomonads in the rhizosphere: Suppressiveness to Pythium damping-off of cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) // Biol, and Fert. Soils -1990. Vol. 9, N 3.-P. 231-234.
235. Suzumura K., Takahashi I. et al. Structural elucidation of YM-75518, a novel antifungal antibiotic isolated from Pseudomonas sp. Q38009 // Tetragedron Lett. 1997. - V. 38, N 43. - P. 7573-7576.
236. Szejtli J. Past, present, and future of cyclodextrin research // Pure Appl. Chem. 2004. - V. 76, N 10. - P. 1 825-1 845.
237. Takeda R. Pseudomonads pigments (II). Two pigments, phenazine-carboxylic acid and oxy chlororaphine, produced by P. aeruginosa T 359 // J. Ferment. Technol. 1958,-V. 36, N2. - P. 286-290.
238. Takeda R. Pseudomonads pigments. IV. The structure of pyoluteorin //Bull. Agr. and Chem. Soc. Jap. 1959. - V. 23, N 3. - P. 165-171.
239. Takemoto J. Y., Brand J. G., Kaulin Y. A., Malev V. V., Schagina L. V., Blasko K. The syringomycins: lipodepsipeptide pore formers from plant bacterium, Pseudomonas syringae II Taylor and Francis. London. England. -2003. P. 260-271.
240. Tambong Ja.T., Flofte M. Phenazines are Involved in Biocontrol of Pythium myriotylum on Cocoyam by Pseudomonas aeruginosa PNA1 // European Journal of Plant Pathology. 2001. - V. 1 07, N 5. - P. 51 1 -521.
241. Taraz K., Seinsche D., Budzikiewicz H. Pseudobactin und Pseudobactin A - Varianten: Neue Peptidsiderophore vom Pyoverdin - Typ aus Pseudomonas fluorescens E2 // Z. Naturforsch. - 1991. - V. 46, N 7-8. - P. 522-526.
242. Teintze M., Leong J. Structure of pseudobactin A, a second siderophore from plant growth promoting Pseudomonas BIO // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6457-6462.
243. Thomashow L.S., Weller D.M. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici II J. Bacteriol. 1988. -V. 170.-P. 3499-3508.
244. Thomashow L.S., Weller D.M., Bonsall R.F., Pierson L.S. Production of the antibiotic phenazine-1-carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas species in the rhizosphere of wheat // Appl. and Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, N 4. - P. 908-912.
245. Thrane C, Nielsen T.H., Nielsen M.N., Sorensen J. Viscosinamide-producing Pseudomonas fluorescens DR54 exerts a biocontrol effect on Pythium ultimum in sugar beet rhizosphere // FEMS Microbiol Ecol. 1999. - V. 33. - P. 139-146.
246. Tjeerd van Rij E., Genevie' ve Girard, Lugtenberg B. J.J., Bloemberg G.V. Influence of fusaric acid on phenazine-1-carboxamide synthesis and gene expression of Pseudomonas chlororaphis strain PCL 1391 // Microbiology. -2005,-V. 151.-P. 2805-2814.
247. Tooney J.I., Nelson C.D., Krotrov G. Isolation and identification of two phenazines from a strain of Pseudomonas aureofasiens II Can. J. Bot. 1965. -V. 43, N 9. - P. 1055-1062.
248. Tosi L., Zazzerini A. Evaluation of some and bacteria for potential control of safflower rust // .1. Phytopathol. 1994. - N 2. - P. 131 -140.
249. Tsuyumu S., Tsuchida S., Nalcano T. et al. Antifungal activiti in cell-free culture fluid o{Pseudomonas solanacearum II Ann. Phytopathol. Soc. Japan.1989,-Vol. 55, N 1. P. 9-15.
250. Uhlig S., Ivanova L. Determination of beauvericin and four other enniatins in grain by liquid chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 2004. - V. 1050, N 2. - P. 173-178.
251. Upadhyay A., Srivastava S. Characterization of a new isolate of Pseudomonas fluorescens strain Psd as a potential biocontrol agent // The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology. 2008. -V. 47.-P. 98-105.
252. Wang J.H., Cai Z. Investigation of inclusion complex of miconazole nitrate with ß-cyclodextrin // Carbohydrate Polymers. 2008. - V. 72, N 2. - P. 255-260.
253. Weller D.M. Biological control of soil-borne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - V. 26. - P. 379407.
254. Weller D.M., Thomashow L.S. Antibiotics: Evidence for their operation and sites where they might by produced // J. Cell. Biochem. 1989. - Suppl. 13A.-P. 154.
255. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. - P. 487-511.
256. Willis D. K., Kinscherf T. G. Global regulation in Pseudomonas syringae. II Virulence and Gene Regulation. J.-L. Ramos, ed. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, U.S.A. 2004. - V. 2. - P. 223-238.
257. Wilson C.L., Chalutz E. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria // Sc. hortic. 1989. - Vol. 40, N 2.-P. 105-1 12.
258. Wright J. Viscosin, a potent peptidolipid biosurfactant and phytopathogenic mediator produced by a pectolytic strain of Pseudomonas fluoresce™ 11 J. Agric. Food Chem. 1991. - V. 39. - P. 483-489.
259. Yan A., Huang X., Liu H., Dong D., Zhang D., Zhang X., Xu Y. An rhl-like quorum-sensing system negatively regulates pyoluteorin production in Pseudomonas sp. M 1 8 // Microbiology. 2007. - V. 1 53. - P. 16-28.
260. Yan Wang DAG, Peigen Zhou PhD, Jianxing Yu MS, Xiaorong Pan MS, et al. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by chitosanase from Pseudomonas CUY // Asia Pac J Clin Nutr -2007.-16 (Suppl 1). C. 174177.
261. Yokokawa F., Inaizumi A., Shioiri T. Synthetic studies of the cyclic depsipeptides bearing the 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp) unit. Total synthesis of the proposed structure of micropeptin T-20 // Tetrahedron. 2005. - V. 61, N 6.-P. 1459-1480.
262. Yuan LL, Li YQ, Wang Y., Zhang XH, Xu YQ. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-I8Q II Journal Biosci. Bioeng. 2008. - March. 105(3). - P. 232-237.
263. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier II Arch. Phytopathol. Pflzschutz. 1989.-Bd. 25, H. 2. - S. 123-130.
264. Zehnder G., J.F. Murphy, E.J. Sikora and Kloepper. Application of rhizobacteria for induced resistance // European Journal of Plant Pathology. -2001. -V. 107. -P. 39-50.
265. Zheng Y., Yanful E., Bassi A. Investigation of effects of culture medium components on polyurethane (Impranil DLM) biodégradation by Pseudomonas chlororaphis II GPEC. 2004. - Paper Abstract #3 1.
-
Четвериков, Сергей Павлович
-
доктора биологических наук
-
Уфа, 2012
-
ВАК 03.01.06
- Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств
- Использование антагонизма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens при создании экспериментального биопрепарата и его влияние на состояние микробоценоза почвы
- Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике
- Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.Coli, Proteus
- Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода Pseudomonas
