Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств

Лукаткин, Андрей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств"

На правах рукописи

Лукаткин Андрей Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЖИДКОЙ ФРАКЦИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО АНТИФУНГАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Саранск-2010

004609104

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева"

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ревин Виктор Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Лихачев Александр Николаевич

на заседании диссертационного совета Д 212.117.12 при ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" по адресу: 430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26, корп. "б", конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева".

доктор биологических наук, профессор Смирнов Василий Филиппович

Ведущая организация: Башкирский государственный университет

Защита диссертации состоится " 30 " "_2010 г. в " // " часов

Автореферат диссертации разослан "<?. ? " 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета е

кандидат биологических наук С.А. Ибрагимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интенсификация сельскохозяйственного производства предполагает широкое применение пестицидов, что увеличивает опасность загрязнения продуктов растениеводства и негативно влиянет на функционирование агроэкосистем (Логинов, 2004). В отличие от химических средств защиты сельскохозяйственных растений, биопрепараты экологически безопасны, оказывают избирательное действие, их применение не нарушает взаимосвязь между элементами агроэкосистемы и не вызывает резистентности у фитопатогенных микроорганизмов (Акимова, 2007). Современное развитие биотехнологии способствует появлению высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, не только эффективно применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства, но и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты (Логинов, 2004; Васильева, 2005). Актуальным способом борьбы с фитопатогениой микрофлорой является использование ризобактерий, обладающих способностью активно заселять ризосферу растений, используя питательные вещества, поставляемые растениями в составе корневых экзометаболитов (Capoalgro, 1986; Bahme, Schroth, 1987; Гарагуля и др., 1988; Kapulnik, 1996; Whipps, 2001; Шапошников, 2003). Бактерии рода Pseudomanas - одна из наиболее эффективных групп микроорганизмов с позиции биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Weller, Cook, 1988; Смирнов, Киприанов, 1990; Dowling, O'Gara, 1994; Воронин, 1998; Логинов, 2001; Bloemberg, Lugten-berg, 2001; Whipps, 2001; Четвериков, 2003); они входят в группу PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), обладают полезными для растений свойствами - способствуют улучшению роста и развития растений (Pietr, 1989; Renato de Freitas, Germida, 1991; Максимов, 1996; Свешникова, 2003) и способны контролировать развитие фитопатогенов в ризосфере растений как за счет конкуренции за экологическую нишу - источник углерода и энергии (Lugtenberg, 1994 Bolwerk, 2003), так и продуцируя различные антифунгальные метаболиты (Thomashow, Weller, 1996) или гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки грибов (Shapira et al., 1989; Dunne, 1998; Шапошников, 2003).

При разработке технологии получения биопрепаратов важно подобрать питательные среды, обеспечивающие не только максимальный выход биомассы, но и снижение себестоимости готового продукта (Логинов, 2003). Перспективным является использование отходов пищевого производства. Одним из таких отходов является послеспиртовая барда, содержащая белки, минеральные соли, остатки полисахаридов (Антипов, 2005). Использование барды в качестве основы питательной среды позволит снизить себестоимость готового продукта и будет способствовать улучшению экологического состояния, поскольку барда представляет опасность для окружающей среды вследствие слабой утилизации, низкого рН и высокого содержания нуклеиновых кислот (Антипов, 2005).

Цель работы - оптимизация условий культивирования бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды (ЖФПСБ) с

целью получения нового биопрепарата для защиты растений от фитопатоген-ных грибов.

Задачи исследования:

1 изучить культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства бактерий Р. aureofaciens 2006 при культивировании на средах различного состава;

2 подобрать оптимальные условий культивирования Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды и изучить влияние отдельных компонентов питательной среды на выход биомассы бактерий;

3 определить влияние Р. aureofaciens 2006 на рост фитопатогенов при совместном твердофазном и глубинном культивировании;

4 разработать технологию получения биопрепарата на базе Р. aureofaciens 2006, выращиваемого на ЖФПСБ, исследовать его характеристики и дать оценку экономической эффективности производства и применения биопрепарата;

5 изучить влияние обработки посадочного материала и растений томата биопрепаратом на их устойчивость к фитопатогенам.

Научная новизна. Впервые исследованы характеристики роста Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды и подобраны необходимые для этого компоненты среды. Показана возможность выращивания бактерий Р. aureofaciens 2006 на среде с хитином в качестве единственного источника углерода. Охарактеризованы культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма 2006 бактерии Р. aureofaciens. Выявлены оптимальные параметры твердофазного и глубинного культивирования Р. aureofaciens 2006. Разработана технологическая схема получения биопрепарата при культивировании Р. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ и изучены характеристики полученного препарата. Показано сохранение высокого титра бактерий в течение длительного времени. Детально исследовано влияние обработки семян и растений томата биопрепаратом на их рост и поражаемость фитопатогенными грибами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новый штамм 2006 бактерий Pseudomonas aureofaciens способен успешно расти на модифицированной послеспиртовой барде, что способствует ее частичной утилизации.

2. На основе культивирования Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды разработана технология получения антифунгального биопрепарата.

3. Использование полученного биопрепарата стимулирует прорастание семян и защищает сельскохозяйственные растения от фитопатогенных грибов.

Научно-практическая значимость работы.

Выявлены оптимальные параметры культивирования бактерий на жидкой фракции послеспиртовой барды для максимального выхода биомассы. Разработана технология получения и практического использования нового вида биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов на основе культуральной жидкости бактерий Р. aureofaciens 2006. Показана высокая экономическая эффективность производства и использования биопрепарата, полученного при культивировании Р. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены и представлены на международных научно-практических конференциях «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007; 2008; 2009), «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008); на 2-м Международном Конгресс-Партнеринге и Выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010» (Москва, 2010); на междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010); на Втором съезде микологов России (Москва, 2008); на Всероссийских научно-практической конференциях «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2007), «Управление качеством образования, продукции и окружающей среды» (Бийск, 2008), «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2010); на Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); на научных конференциях «Первые чтения памяти профессора O.A. Зауралова» (Саранск, 2007), «Экология, природные ресурсы и развитие Московского региона» (Москва, 2009), «XXXVII Огаревские чтения» (Саранск, 2009), «Вторые чтения памяти профессора O.A. Зауралова» (Саранск, 2010); на школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); на VII Республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2008); XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 2008); Республиканской конференции молодых ученых «Развитие биотехнологии в республике Мордовия» (Саранск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в числе которых 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 40 рисунков и 23 таблицы. Список цитируемой литературы включает 240 источников, в том числе 157 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, изложены цель и задачи исследования, научная новизна и научно-практическая значимость проведенных исследований, апробация работы.

Глава 1. Общая характеристика и применение ризосферных бактерий рода Pseudomonas. Обобщены имеющиеся в литературе сведения о бактериях рода Pseudomonas, их использовании в сельскохозяйственной практике, механизмах биологического контроля фитопатогенов, современных биопрепаратах для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов.

Глава 2. Объект и методы исследования. Объектом исследования служили бактерии Pseudomonas aureofaciens штамма 2006, отселекционированного на ка-

федре биотехнологии Мордовского государственного университета. В качестве тест-объектов при скрининге бактерий-антагонистов служили фитопатогенные грибы Fusarium culmorum и Botrytis cinerea, предоставленные сотрудниками кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова. Культуру микроорганизмов поддерживали путем периодических пассажей на агаризованных средах.

В работе применяли среды следующего состава, г/л (Теппер с соавт., 1993; Чурикова с соавт., 2003; Нетрусов с соавт., 2005):

1) модифицированная пептонно-дрожжевая среда (для получения иноку-лята): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, сахароза 20 (pH 7.0 ± 0.3);

2) среда Чапека-Докса: сахароза 30, NaN03 3, КН2Р04 1, MgS04 0.5, KCl 0.5, FeS04x7H20 0.01, агар-агар 20 (pH 6.0 ± 0.5);

3) кукурузно-мучная среда: кукурузная мука 10, пшеничная мука 10, К2НР041, сахароза 15, агар-агар 10 (pH 6.0 ± 0.3);

4) глюкозо-пептонная агаризованная среда (ГПА): глюкоза 5, пептон 5, К2НР042, агар-агар 20 (pH 7.2 ± 0.2);

5) картофельно-глюкозная агаризованная среда (КГА): картофель 200, глюкоза 2.5, агар-агар 20 (pH 7.2 ± 0.2);

6) модифицированная среда Luria-Bertrani (LB): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 8, MgS04x7H20 2.5 (pH 6.9 ± 0.2);

7) среда Кинга (KB): пептон 15, глицерин 10, MgS04x7H20 1, КН2Р04 1 (pH 6.8 ±0.2);

8) минеральная среда (ММ): КН2Р04 1, MgS04*7H20 0-2, NaCl 0.1, K2HP04 0.1, (NH4)2S04 0.1 (pH 7.0 ± 0.2);

9) жидкая фракция послеспиртовой барды (ЖФПСБ), полученная из ОАО «Мордовспирт», состав (%): вода 97.1, сухое вещество 2.9, в т.ч. (% от сухого вещества): сырой протеин 17.9, жиры 1.4, безазотистые вещества 3.2, зола 43.9 (pH 4.3 ±0.2).

Культивирование P. aureofaciens 2006 осуществляли поверхностным способом на агаризованных средах Чапека-Докса, кукурузно-мучной, модифицированной пептонно-дрожжевой, КГА и ГПА, а также на жидких средах ММ, КГА, LB, Кинга и ЖФПСБ (глубинное культивирование) и в полунепрерывных условиях на ЖФПСБ в лабораторном биореакторе ОКА-MI МФ-05К.

При изучении роста P. aureofaciens в среду ММ дополнительно вносили разные источники углеродного (глюкоза, сахароза, фруктоза, лактоза, маннит, крахмал, рамноза, все в концентрации 30 г/л) и азотного (NaN03, (NH4)2S04 или NH4NO3 в дозе 1 г/л) питания. Для изучения роста Р. aureofaciens в присутствии хитина бактерии выращивали на минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода 5% коллоидный хитин или хитозан, с периодическим определением биомассы бактерий гравиметрическим методом (Нетрусов с соавт., 2005) и динамики внеклеточного белка по методу Бредфорда (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Для оптимизации культивирования P. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ варьировали начальный pH барды (от 4.3 до 8.0), скорость перемешивания (от 100 до 180 об/мин), количество добавляемого КН2Р04 (от 0.5 до 1.5 г/л), сте-

пень насыщения среды кислородом (от 20 до 60%, что соответствует 48-144 мкмоль/мл), периодически отбирая пробы и определяя сухую биомассу.

При изучении хитинолитической активности бактерии засевали штрихом на среду КГА с 5% коллоидного хитина или хитозана, культивировали 7 суток и измеряли зону просветления (образуемую в результате потребления бактериями хитина), используя краситель Конго красный (Воробьев, 2007).

Получение биопрепарата и изучение его характеристик. При глубинном культивировании бактерий P. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ получали биопрепарат, представляющий концентрированную суспензию бактерий. Изучали длительность сохранения биологически активных свойств в динамике хранения препарата при температурах 4 и 25 °С и титр клеток P. aureofaciens 2006 методом Коха (Егорова, 1976).

При изучении влияния бактерий на развитие фитопатогенов проводили совместное поверхностное (на КГА) и глубинное (на ММ) культивирование Р. aureofaciens 2006 с Fusarium culmorum или Botrytis cinerea с последующей оценкой морфологических изменений грибного мицелия (используя цифровую фотомикроскопическую систему на базе микроскопа «UNICOM»), а также измерением диаметра и определением культурально-морфологических свойств грибной колонии. Для микроскопирования готовили фиксированные препараты, окрашенные по Граму и метиленовым синим.

Культурапьно-морфологические характеристики бактерии определяли по стандартным методикам идентификации бактерий рода Pseudomonas (Сквор-цова с соавт., 1981; Смирнов, Киприанова, 1990; Определитель..., 1997).

Вегетационные опыты проводили с томатом (Lycopersicon esculentum L.) сорта Дубок. Семена томата замачивали в биопрепарате (контроль - водопроводная вода), проращивали во влажной камере и определяли энергию прорастания (на 3-й сутки), всхожесть (на 6-е сутки), рост осевых органов. Во второй серии опытов обработанные биопрепаратом семена высаживали в грунт и выращивали растения. После появления всходов проводили обработку растений томата биопрепаратом путем опрыскивания (контроль опрыскивали водопроводной водой). Спустя 30 суток после всходов растения обрабатывали фитопа-тогенными грибами Fusarium culmorum или Botrytis cinerea, после чего регулярно определяли состояние растений томата, их выживаемость и степень повреждения патогеном. На 10-е сутки после обработки растений томата культу-ральной жидкостью фитопатогенов проводили обработку биопрепаратом опытных растений (повторно) и контрольных растений, с последующим определением состояния растений.

Все результаты получены не менее чем в двух последовательных опытах, каждый из которых включал от пяти до пятнадцати биологических повторно-стей. Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически по общепринятым в биологии методам (Лакин, 1980) с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel 2007 и STAT2. Сравнение вариантов опытов проводили при 5% уровне значимости по t-критершо Стьюдента. В таблицах и па графиках представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками.

Глава 3. Исследование культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006.

При культивировании бактерий Р. aureofaciens 2006 на агаризованных средах изучали культурально-морфологические свойства и скорость роста в зависимости от состава среды. Выявлено, что на разных питательных средах бактерии образовывали колонии округлой формы, с ровными краями, плотной консистенции, цвет варьировал от молочного до желто-оранжевого. С увеличением времени культивирования бактерии накапливали оранжевый пигмент и колонии приобретали слизистую консистенцию. При микроскопировании отмечено, что бактерии изучаемого штамма представляют собой мелкие одиночные грам-отрицательные палочки (по длине не превышающие 5 мкм, а по толщине - 1 мкм), не образуют спор. В зависимости от условий культивирования размер палочек изменялся.

Анализ данных по влиянию различных источников углеродного и азотного питания показал, что их использование существенно влияет на выход биомассы. Установлено, что наибольшая бактериальная масса образуется при внесении в среду соответственно нитратной формы азота (10.7 г/л) и крахмала (22.1 г/л). Рост исследуемой культуры на средах с разными источниками азота и углерода характеризовался не только разным уровнем биомассы, но и неодновременным максимумом ее образования (к 72 и 48 ч, соответственно). Это может быть связано с участием в катаболизме источников С и N разных ферментных систем, характеризующихся различной степенью активности в клетках Р. anerofaciens 2006.

В ходе глубинного культивирования на минеральных средах с добавлением хитина или хитозана в качестве источника углерода изучали динамику содержания биомассы (рис. 1). Отмечено, что максимум биомассы наблюдался к 18-му ч культивирования (8.1 и 6.6 г/л в средах с хитином и хитозаном, соответственно).

9 .

2 - ......

О 2 4 е 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время культивирования, часы —»—С хитином —«—С хитозаном

Рисунок 1. Динамика биомассы Р. аиего/аЫет 2006 при культивировании на минеральной среде с хитином и хитозаном

При глубинном культивировании Р. аиего/аает 2006 скорость гидролиза хитина бактериями была наиболее высокой в первые часы роста, когда в среде недостаточно легкоусвояемого углеродного компонента питания (рис. 2). При этом на среде с хитозаном она в начальный период культивирования была выше, что, по-видимому, обусловлено большей его доступностью для ферментов бактерий (Ргапс1Ье^, БсЬпигег, 1998).

0,18 1 Ц0.-16 ш с0,14

1 "о0,12 •г <0

5 г о,1 : а

6 г о.ов 1" §0,06

I §0,04 ^ &

3 £0,02 и ь

Время культивирования, часы

♦ С хитином «— С хитозаном

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Рисунок 2. Динамика скорости ферментативного гидролиза хитина и хи-тозана при глубинном культивировании бактерий

В процессе глубинного культивирования бактерий Р. аиего/аскш 2006 обнаружено увеличение содержания внеклеточного белка с максимумом к 21 ч (табл. 1); это может быть связано с активным синтезом внеклеточных ферментов.

Таблица 1

Динамика содержания внеклеточного белка при глубинном культивиро-

Время культивирования, ч Вариант среды

хитин хитозан

1 40 ±2 40 ±2

2 38 ±2 38 ±2

3 53 ±3 40 ±2

4 42 ±2 42 ±2

5 70 ±4 53 ±3

6 96 ±5 70 ±4

7 100 ±6 111 ±6

8 109 ±6 120 ±5

17 114 ± 6 152 ±8

19 137 ± 7 160 ±8

21 148 ±7 177 ±9

23 145 ±7 175 ±9

При этом выявлено три пика образования внеклеточного белка в исследуемых вариантах сред: 1 ч, 6-7 ч (хитин и хитозан, соответственно) и 17-19 ч (хитозан и хитин, соответственно). Максимальное количество внеклеточного белка в среде с добавлением хитина составило 148 мкг/мл, а в среде с хитозаном - 177 мкг/мл.

В ходе определения хитинолитической активности бактерий P. auerofa-ciens 2006 при поверхностном культивировании на минеральной среде выявлено, что в чашках с коллоидным хитином активность была небольшой, отношение зоны просветления к размеру колонии составило лишь 1,0 мм/мм. Однако в опыте с хитозаном выявлены большие размеры зоны просветления, ее отношение к поперечному размеру колонии составило 3,3 мм/мм (рис. 3). Результаты этого опыта, как и предыдущих, свидетельствуют о наличии хитинолитической активности у бактерий P. auerofciciens 2006 и подтверждают ее большее проявление в присутствии хитозана.

Рисунок 3. Рост Pseudomonas aureofaciens 2006 на агаризованной среде с коллоидным хитозаном (окрашено Конго красным, 7-е сутки роста)

При изучении роста Р. auerofaciens 2006 в условиях глубинного культивирования использовали различные среды, в т.ч. жидкую фракцию послеспиртовой барды. Это связано с тем, что барда представляет собой высокообогащенный питательными веществами субстрат, в нее переходит около трети питательных веществ, содержащихся в исходном сырье (кроме сахара и крахмала), в том числе протеины, жиры и другие. В связи с этим послеспиртовая барда является ценным и дешевым субстратом для культивирования бактерий. Обнаружено, что бактерии образовывали наибольшую биомассу именно на ЖФПСБ (табл. 2).

Представленные исследования показали, что уровень образуемой на ЖФПСБ биомассы Р. auerofaciens 2006 превосходит результаты, полученные на стандартных средах. Поэтому мы посчитали целесообразным ее использо-

вание в качестве основного субстрата для культивирования Р. аиего/ааепз 2006 при создании биопрепарата.

Таблица 2

Динамика биомассы Р. аиего/аает 2006 при глубинном культивировании на средах разного состава, г/л_

Время культивирования, ч Питательные среды

минеральная КГА LB ЖФПСБ Кинга

0 1.5±0.1 1.5±0.1 1.5±0.1 1.5±0.1 1.5±0.1

24 1.4±0.1 10.1 ±0.2 11.3±0.4 14.0±0.1 10.0±0.4

32 1.7±0.1 10.2±0.3 8.3±0.2 9.5±0.1 9.6±0.3

48 2.5±0.2 3.4±0.1 2.6±0.1 6.5±0.1 8.5±0.3

Глава 4. Использование отходов спиртового производства для культивирования бактерий P. auerofaciens 2006.

В настоящее время острой экологической и экономической проблемой в спиртовой промышленности России является утилизация отходов, образующихся при производстве этилового спирта. Барда утилизируется с трудом и представляет опасность для окружающей среды вследствие низкого pH (4.3 и ниже) и высокого содержания нуклеиновых кислот (Антипов, 2005). Одним из технологических подходов, позволяющих кардинальным способом решить проблему утилизации послеспиртовой барды, могло бы стать выращивание бактерий рода Pseudomonas на субстрате, в основе своей имеющем барду, с последующим использованием культуральной жидкости для обработки растений с целью защиты от фитопатогенов. Однако широкому использованию такого подхода к утилизации барды препятствует слабая изученность технологических элементов, связанных с активацией роста бактерий на субстрате.

Для решения данного вопроса подбирали оптимальные условия культивирования Р. auerofaciens 2006 на ЖФПСБ с целью получения максимальной биомассы в условиях лабораторного эксперимента и полупромышленного биореактора.

На первом этапе изучали влияние исходного pH на выход биомассы Р. auerofaciens 2006. Во всех вариантах опыта отмечено максимальное увеличение биомассы к 21-25 ч роста бактерий. Максимальный рост P. aureofaciens 2006 отмечен на ЖФПСБ с pH, доведенным до 7.0. В то же время возможно выращивание культуры бактерий на немодифицированной барде, без введения дополнительных реагентов. Поэтому во всех последующих экспериментах использовали среду с двумя значениями исходного pH: близким к оптимальному (7.0) и pH нативной барды (4.3).

При изучении влияния скорости перемешивания на рост Р. aureofaciens 2006 максимальный выход биомассы на ЖФПСБ наблюдали при 150 об/мин. с максимумами на 23 ч и 19 ч при pH 4.3 и 7.0, соответственно (табл. 3). Увеличение и снижение числа оборотов приводит к снижению уровня биомассы. Отмечено, что наибольший прирост биомассы был при pH 7.0.

Для оптимизации условий получения культуральной жидкости Р. aureofaciens 2006 изучено влияние аэрации на прирост биомассы при культивировании на ЖФПСБ в лабораторном биореакторе (ОКА-MI МФ-05К). Во всех вари-

антах опыта насыщения среды кислородом максимальный уровень биомассы при рН 4.3 зафиксирован через 19 ч роста, а при рН 7.0 - спустя 21 ч культивирования (рис. 4). Наблюдалась прямая зависимость динамики накопления биомассы от степени насыщения среды кислородом. Максимальное образование биомассы в биореакторе зафиксировано при 144 мкмоль/мл (60%) кислорода.

Таблица 3

Динамика накопления биомассы бактерий Р. аигео/аЫепэ 2006 при культивировании на ЖФПСБ с рН 4.3 и 7.0 в статических и динамических условиях, г/л

Время культивирования, ч Динамические условия, об/мин. Статические условия

100 150 180

Среда с рН 4,3

0 1.5 ± 0.1 1.5 ± 0.1 1.5 ± 0.1 1.5 ±0.1

2 3.1 ±0.1 11.7 ±0.4 2.5 ±0.1 4.2 ±0.1

17 3.9 ±0.1 13.2 ±0.4 6.0 ± 0.2 4.2 ±0.1

19 4.6 ±0.1 13.9 ±0.4 7.3 ± 0.2 5.0±0.1

21 7.0 ± 0.4 13.9 ±0.4 8.2 ±0.2 6.0 ± 0.2

23 9.1 ±0.5 14.8 ±0.4 10.3 ±0.5 6.1 ± 0.2

25 8.1 ±0.4 13.3 ±0.4 7.1 ±0.2 4.7 ±0.1

27 7.2 ± 0.4 5.8 ±0.2 6.1 ±0.2 2.7 ±0.1

Среда с рН 7,0

0 1.5 ±0.1 1.5 ±0.1 1.5 ±0.1 1.5 ±0.1

2 2.8 ±0.1 5.6 ±0.2 3.1 ±0.1 6.4 ±0.2

17 3.5 ±0.1 16.6 ±0.6 9.5 ± 0.3 7.6 ± 0.2

19 14.1 ±0.2 17.3 ±0.8 14.3 ± 0.4 7.7 ±0.2

21 10.0 ±0.2 16.3 ±0.6 13.0 ±0.4 11.4 ±0.4

23 9.2 ±0.1 13.3 ±0.4 11.5 ±0.3 13.8 ±0.4

25 8.1 ±0.1 12.4 ±0.4 10.8 ±0.3 8.6 ±0.2

27 4.0 ±0.1 10.3 ±0.3 8.6 ± 0.4 5.8 ±0.1

В глубинном режиме культивирования бактерий на ЖФПСБ выявлено, что для получения большей биомассы P. aureofaciens 2006 в состав барды необходимо добавлять однозамещенный фосфорнокислый калий в количестве 1,0 - 1,5 г/л. Возможно, что именно недостаток К и Р в жидкой фракции барды негативно влияет на рост P. aureofaciens 2006.

Таким образом, опыты по оптимизации условий культивирования бактерий P. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды показывают необходимость доведения начального рН до 7.0, внесения 1.5 г/л фосфорнокислого калия и перемешивания при 150 об/мин или насыщении среды кислородом 144 мкмоль/мл (при культивировании в лабораторном биореакторе). Во всех дальнейших исследованиях мы использовали оптимизированную ЖФПСБ.

Время культивирования, ч

).......46нкмоль/мл----96 мкмоль/мп -144 мкмопь/мл';

Рисунок 4. Динамика содержания биомассы Р. аигео/аЫет 2006 при культивировании в биореакторе на барде с рН 7.0 при различном насыщении среды кислородом.

Глава 5. Получение и характеристика биопрепарата на основе Р. аигео/аает 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды.

На предыдущих этапах работы была показана принципиальная возможность выращивания бактерий Р. аигео/аает 2006 на ЖФПСБ. Полученные результаты положены в основу создания биопрепарата. Принципиальная технологическая схема получения биопрепарата представлена на рис. 5.

После отделения спирта барда с брагоректификационной установки поступает в сборник сырой барды, откуда подается в сборник над центрифугами.

Оттуда самотеком барда поступает на центрифугу, где происходит отделение жидкой фракции (зерновая барда содержит 7,5...8,5% СВ, из них 2,3...2,5% - в растворе). Для уменьшения затрат отделить жидкую фракцию можно с помощью фильтрации.

Далее сырой остаток направляется на упаривание в выпарную установку, где повышается концентрация сухих веществ. Сухой остаток барды можно использовать на корм скоту, как в нативном виде, так и после обогащения микробным белком.

В жидкую фракцию послеспиртовой барды с рН 7.0 вносят 1.5 г/л одно-замещенного фосфорнокислого калия и 5% хитина (от количества среды). Субстрат стерилизуют, далее засевают предварительно подготовленным инокуля-том бактерий Р. аигео/аЫет 2006 в количестве 10%. Проводят культивирование в динамических условиях (ферментер) в течение 23 ч.

После окончания культивирования проводят контроль титра живых клеток. Для приготовления качественного биопрепарата титр клеток должен составлять 108 - 1010 КОЕ/мл.

Хранение при температуре 4±2°С

Рисунок 5. Технологическая схема получения биопрепарата

На следующем этапе проводится розлив полученного биопрепарата в тару объемом 50-200 мл. Хранение рекомендуется при температуре 4 ± 2°С в течение 45-50 суток. При соблюдении оптимальных условий создаваемый биопрепарат получается в виде мутной, густой жидкости светло-коричневого цвета, с pH 4.3—4.7. Количество живых клеток бактерий 101'-1013 КОЕ/мл.

После создания биопрепарата проводили оценку его фунгитоксических свойств. Для этого осуществляли глубинное и твердофазное культивирование фитопатогенных грибов (Fusarium culmorum и Botrytis cinerea) с бактериями Р. aureofaciens 2006. Показано антагонистические воздействие бактерий на развитие исследуемых грибов, при этом отрицательное воздействие на В. cinerea выражено в большей степени (табл. 4).

Таблица 4

Диаметр колоний фитопатогенов при совместном твердофазном культивировании с Р. aureofaciens 2006, мм_

Длительность культивирования, сут Патогенный гриб

Fusarium culmorurn Botrytis cinerea

контроль опыт контроль опыт

1 5 ± 1 5 ± 1 5 ± 1 5 ± 1

2 15 ±3 12 ±3 8± 1 5 ± 1

3 19±3 15 ± 3 11±1 7± 1

8 78 ±4 55 ±4 29 ±3 24 ±3

9 87 ±5 70 ±5 31 ±3 28 ±3

10 95 ±1 95 ±1 33 ±3 28 ±3

Подавление роста фитопатогенных грибов при их совместном культивировании с Р. aureofaciens 2006 свидетельствует о высоком потенциале полученного биопрепарата как фунгитоксичного объекта, применение которого возможно на сельскохозяйственных культурах. Однако промышленно получаемый препарат перед использованием некоторое время хранится, поэтому исследовали влияние длительности и температуры хранения культуральной жидкости бактерий на их жизнеспособность (табл. 5).

Таблица 5

Титр клеток Р. aureofaciens 2006 в процессе хранения, КОЕ/мл

Время хранения, сут Температу ра хранения, °С

4 25

0 1.3 *10* 1.9*10"

10 3.3*10,и 4.7*10"

20 7.5*10" 1.4*10"

30 1.5* 1012 2.7*10"

40 2.6 * 10й 1.8*10"

50 2.1 *10" 3.6*10'°

При хранении биопрепарата в условиях температуры 4 °С количество живых клеток постепенно увеличивалось, достигая максимума на 40-е сутки хранения. На 50-е сутки хранения отмечено снижение титра клеток, что может быть обусловлено старением культуры и снижением содержания питательных компонентов. В ходе хранения культуральной жидкости при температуре 25 °С также наблюдалось увеличение титра клеток в ходе хранения. Однако максимальное количество клеток наблюдалось спустя 20 сут хранения, в дальнейшем отмечено постепенное снижение.

Все показатели, полученные в динамике хранения объекта, удовлетворяют требованиям, предъявляемым к биопрепаратам, согласно которым количество активных клеток должно быть не менее 10 -109 (Логинов, 2004). При нормальных условиях и отсутствии контаминации посторонней микрофлорой в чашках Петри на твердой агаризованной среде вырастали округлые колонии, диаметр которых увеличивался в процессе роста и в среднем составлял 1-3 мм.

Таким образом, длительное хранение биопрепарата при положительных температурах не оказало существенного отрицательного влияния на динамику содержания активных клеток. Выдерживание биопрепарата при пониженной положительной температуре способствовало сохранению максимального количества живых клеток в течение 40 суток.

Внесение хитинсодержащего сырья при культивировании бактерий является одним из принципиальных способов продления жизнеспособности бактерий: Полисахарид хитин может служить индуктором бактериальных хитиназ и источником питания, а также выступать в качестве адсорбента для бактериальных клеток и тем самым повышать их жизнеспособность. Поэтому в основную технологическую схему получения биопрепарата в питательную среду введен хитин ракообразных. В следующей серии опытов исследовали жизнеспособность бактерий, выращенных на этой основе, в ходе хранения при 4 и 25 °С (табл. 6).

Таблица 6

Динамика количества активных клеток Р. аигео/ааепя 2006 в процессе хранения (вариант биопрепарата с модифицированным хитином), КОЕ/мл

Длительность хранения, сутки Температу ра хранения, °С

4 25

1 2.2*109 2.0*10"

10 1.4*10" 2.2 *1012

20 7.0*10" 7.4 *10п

30 8.8* 1013 1.0*10"

40 3.5* Ю" 4.0 *1012

50 2.6 *1012 1.4 *10'2

Максимальный титр живых клеток при температуре 4 °С достигался к 30-м суткам хранения и оставался довольно высоким в течение всего периода хранения. Это, очевидно, обусловлено замедлением метаболических процессов при более низкой температуре. При 25 °С максимальный титр биопрепарата

наблюдался уже на 20 сутки, что связано с ускорением метаболических процессов. В дальнейшем происходило снижение, обусловленное как исчерпанием питательных компонентов, так и старением культуры. Следует отметить, что, по сравнению с предыдущей серией опыта, добавление хитина способствовало увеличению количества живых клеток и сохранению их жизнеспособности в течение более продолжительного времени.

Глава 6. Исследование микопаразнтических свойств биопрепарата в процессе хранения при различных условиях.

При изучении влияние бактерий на рост фитопатогенных грибов в условиях длительного хранения биопрепарата проводили высев препарата, хранившегося при температурах 4°С и 24 °С, через каждые 10 суток. Выявлено, что микопаразитическая активность биопрепарата сохранялась на протяжении 50 суток, независимо от температуры хранения (табл. 7).

Таблица 7

Время полного зарастания чашки (F. culmorum ) и прекращения роста {В, cinerea) при культивировании с Р. aureofaciens 2006, сут_

Срок хранения биопрепарата, сут

Температура хранения биопрепарата 4 °С_

F. culmorum

В. cinerea

Температура хранения био_препарата 25 °С_

F. culmorum

В. cinerea

1 10 20 30 40 50

11 10 12

10 10

10 12

14 13 10

14 12 17

15 12

Сдерживание роста F. culmorum выражено сильнее в случае использования бактериальной жидкости, хранившейся при 25°С; в этом варианте мицелий был гораздо тоньше и развитие гриба происходило медленнее. По мере увеличения срока хранения бактериальной суспензии ингибирующее действие псевдомонад усиливалось, и зарастание чашек происходило медленнее. По отношению к В. cinerea максимальная микопаразитическая активность исследуемых бактерий отмечена на 30-40-е сутки хранения. Прекращение роста колонии гриба происходило быстрее в варианте хранения биопрепарата при 25°С.

При исследовании биопрепарата, полученного с добавлением хитина, выявлено антагонистическое воздействие, аналогичное предыдущему опыту (табл. 8). В большей степени губительное действие проявлялось в отношении В?cinerea. При воздействии биопрепарата, хранившегося в течение 30 суток, гриб полностью прекращал свое развитие уже на ранних стадиях культивирования. Действие биопрепарата на F. culmorum практически не зависело от варианта хранения биопрепарата. Максимальный период зарастания чашки отмечен при исследовании суспензии бактерий через 30 суток хранения.

Таблица 8

Время полного зарастания чашки (F. culmorum) и прекращения роста (В. cinerea) при культивировании с Р. aureofaciens 2006, сут_

Срок хранения биопрепарата,сут Температура хранения биопрепарата 4 °С Температура хранения биопрепарата 25 °С

F. culmorum В. cinerea F. culmorum В. cinerea

1 8 10 10 12

10 8 9 12 14

20 9 4 13 12

30 11 6 14 17

40 10 10 13 15

50 8 ' 10 10 12

При глубинном культивировании Р. аигео/ааепя 2006 с фитопатогенами на протяжении всего срока хранения биопрепарата (до 50 суток) отмечено высокое литическое воздействие бактерий на мицелий грибов, которое проявлялось уже на ранних сроках совместного культивирования. Это косвенно свидетельствует о высокой ферментативной активности бактерий, которые использовали грибной мицелий в качестве питательного субстрата.

Глава 7. Использование биопрепарата для защиты растений от фи-топатогенных грибов.

Исследовали влияние замачивания семян томата сорта Дубок в разных вариантах биопрепарата (с хитином и без, хранившимся при температуре 4 или 25°С) на скорость прорастания семян и рост молодых растений. Наличие хитина в биопрепарате тормозило прорастание семян, независимо от температуры хранения (табл. 9). Возможно, присутствие полисахарида создает определенный барьер для поступления воды внутрь семян, и в начале проращивания более медленное прорастание семян этих вариантов обусловлено разницей осмотических потенциалов.

Таблица 9

Прорастание семян томата при замачивании в биопрепарате из различных вариантов хранения_

Время прорастания, сутки % проросших семян

вариант 1 вариант 2 вариант 3 вариант 4 контроль

3 85 ±5 90 ±2 80 ± 10 80 ± 10 70 ± 10

6 85 ±5 95 ±2 85 ±5 85 ±5 70 ± 10

Примечание: вариант 1 - биопрепарат с хитином, хранившийся при 25°С;

вариант 2 - биопрепарат без хитина, хранившийся.при 25°С; вариант 3 - биопрепарат с хитином, хранившийся при 4°С; вариант 4 - биопрепарат без хитина, хранившийся при 4°С

По мере развития проростков томата большое значение имели выделяемые Р. аигео/аает 2006 ростовые факторы, в частности индолилуксусная кислота (Логинов, 2004). Отмечен ускоренный рост побегов в варианте 2, который показывал тенденцию к превышению контроля (различия между вариантами опыта недостоверны). В остальных вариантах не выявлена зависимость роста от варианта опыта (табл. 10). Таким образом, замачивание семян в биопрепарате, хранившемся при температуре 25°С, способствовало хорошему прорастанию семян и росту растений томата.

Таблица 10

Длина побегов томата после предпосевной обработки биопрепаратом из различных вариантов хранения_

Время проращивания, сутки Длина проростков, см

вариант 1 вариант 2 вариант 3 вариант 4 контроль

6 1.4 ±0.2 4.0 ±1.0 2.9 ±0.5 2.4 ± 0.8 2.8 ±0.8

7 3.2 ±0.8 6.8 ± 1.2 6.0 ± 1.0 5.0 ± 1.8 6.3 ± 0.9

8 6.8 ± 1.0 9.3 ±1.0 6.8 ± 1.2 6.0 ±1.5 8.8 ±1.2

9 8.0 ±0.5 10.5 ± 1.5 8.0 ±1.0 7.0 ±1.0 10.0 ±1.0

Примечание: варианты опыта - как в табл. 9

В вегетационном опыте семена, обработанные биопрепаратом, были высажены в почву (20 штук/сосуд). Семена, обработанные биопрепаратом, проросли на 3-4-е сутки с момента посадки в грунт, всхожесть составила 85-90%. В контрольном варианте (обработка водой) на 4-е сутки проросло лишь 70%. Проводимые в течение месяца наблюдения показали, что растения томата, обработанные биопрепаратом, отличались ускоренным ростом и лучшим габитусом по сравнению с контролем. Лучшее развитие растений в опыте объясняется влиянием на томаты ростовых факторов бактерий Р. aureofaciens 2006.

На 30-е сутки после появления всходов все сосуды с растениями были обработаны культуралыюй жидкостью фитопатогенных грибов F. culmorum и В. cinerea путём внесения в прикорневую зону растений по 1 мл. В ходе визуального наблюдения за томатами заражения опытных растений фитопатогенными грибами не отмечено. При этом степень поражения контрольных растений постепенно увеличивалась, и спустя 8 сут после обработки фитопатогенами часть растений погибла.

На 10-е сутки после обработки растений томата культуральной жидкостью фитопатогенов провели обработку биопрепаратом опытных растений (повторно) и контрольных растений. На опытные растения повторное внесение биопрепарата существенного эффекта не произвело. Однако при обработке поражённых фитопатогенами контрольных растений удалось добиться снижения площади поражения грибами и уменьшения гибели растений.

Таким образом, обработка семян и растений томата биопрепаратом на основе Pseudomonas aureofaciens 2006 может значительно снизить потери растений от вредного действия фитопатогенных грибов, в частности Fusarium и Botrytis. В контроле погибло 72% растений, тогда как гибель растений, обработанных биопрепаратом, не превысила 10% (рис. 6).

90 -

ВО •| 70

I 60

о.

| 50 -чэ

€ 40

ÜL

.гЬ.

Г*! П ^ i ' j

вариант опыта

Рисунок 6. Доля растений томата, погибших при заражении фитопатоге-нами, в результате обработки биопрепаратом. Варианты опыта: 1 - биопрепарат с хитином, хранившийся при 25°С; 2 - биопрепарат без хитина, хранившийся при 25°С ; 3 - биопрепарат с хитином, хранившийся при 4°С; 4 - биопрепарат без хитина, хранившийся при 4°С; 5 - биопрепарат с хитином, хранившийся при температуре 4°С в течение 45 суток.

Расчет экономических затрат на производство биопрепарата показал, что суммарная стоимость производства 1 м3 составляет 48106,29 руб., т.е. себестоимость 1 дозы препарата (100 мл) - всего лишь 4,81 руб. (табл. 11). Это существенно ниже, чем стоимость всех производимых в настоящее время биопрепаратов для защиты растений.

. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современное развитие биотехнологии способствует появлению высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, не только эффективно применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства, но и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты.

В работе показано принципиально новое решение проблемы утилизация жидкой фракции послеспиртовой барды посредством выращивания на ней бактерий Pseudomonas aureofaciens штамм 2006, с последующим использованием культуральной жидкости в качестве биопрепарата, защищающего сельскохозяйственные растения от фитопатогенных грибов. Проведенными опытами доказано преимущество барды над традиционными средами при выращивании штамма Р. aureofaciens 2006, проведена оптимизация параметров выращивания культуры бактерий, показана антифунгальная активность штамма.

Таблица 11

Экономические затраты на производство биопрепарата

Наименование Ед. изм. Плановая цена, руб. на 1 м3

кол-во Сумма, руб

Сырье и основные материалы

Агар-агар кг 4186 2 8372.00

Хитинсодержащее сырье кг 3500 0.5 1750.00

Глюкоза кг 346 1.8 622.8

Пептон кг 1356 0.5 678.00

Дрожжевой экстракт кг 1298 1.5 1947.00

Послеспиртовя барда т 2.4 0.1 0.24

Цитокининовый препарат г 300 0.00001 0.003

Итого: руб. 13370.043

Вспомогательные материалы руб. 345.00

Транспортно-заготовительные расходы руб. 350.25

Энергия на технологические цели:

электроэнергия кВтч 1.59 500 795.00

пар Гкал 336.00 4.4 1471.68

вода артезианская м.куб. 8.25 0.750 6.19

воздух высокого давления т.м.куб. 590.00 0.168 99.12

Итого: руб. 2371.99

Основная работа руб. 501.54

Отчисления на соцстрах руб. 71.22

Цеховые расходы руб. 906.00

Общезаводские расходы руб. 906.00

Производственная себестоимость руб. 18821.743

Упаковочные материалы

Флакон медицинский шт. 4.3 62500 26875.00

Маркировка шт. 0.35 62500 2187.5

Итого: 29062.5

Внепроизводственные расходы руб. 222.05

Полная себестоимость руб. 48106.293

родного средства защиты растений от фитопатогенных грибов. Применение этого биопрепарата имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими средствами защиты сельскохозяйственных растений, главным из которых является то, что использование биопрепарата не будет нарушать взаимосвязь между элементами агроэкосистемы и не сможет вызвать резистентность у фитопатогенных микроорганизмов.

выводы

1. Изучены культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма 2006 бактерий Pseudomonas aureofaciens. Исследовано влияние углеродного и азотного питания на образование биомассы бактерий Pseudomonas aureofaciens штамм 2006. Внесение хитинсодержащего сырья в качестве единственного источника углерода способствует увеличению скорости роста бактерий. Выявлена хитинолитическая активность Р. aureofaciens 2006, сильнее выраженная в присутствии хитозана.

2. Культивирование Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспирто-вой барды показало высокую интенсивность роста бактерий. Для улучшения роста необходима оптимизация состава барды: начальный pH 7.0 и добавление 1.5 г/л фосфорнокислого калия. Максимальное образование биомассы в ходе глубинного культивирования получено при скорости перемешивания 150 об/мин„ а во время культивирования в биореакторе - при 60% насыщении кислородом.

3. Р. aureofaciens 2006 характеризуется наличием антифунгальных свойств. Выявлено подавление роста фитопатогенных грибов Fusarium cul-тогит и Botrytis cinerea при воздействии на них полученным биопрепаратом, при этом отрицательное воздействие на В. cinerea выражено в большей степени.

4. Разработана технологическая схема получения биопрепарата на основе культивирования Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды. Применение биопрепарата имеет высокую экономическую эффективность, основанную на низкой стоимости его производства и высоком защитном эффекте для сельскохозяйственных культур.

5. Проверка свойств биопрепарата в процессе длительного хранения (до 50 сут) при различных температурах (4 и 25°) показала сохранение высокого титра клеток (1012 - 1013) и антифунгальной активности. Внесение хитинсодержащего сырья в состав биопрепарата способствовало увеличению титра активных клеток, который сохранялся на протяжении всего периода хранения. При глубинном культивировании Р. aureofaciens 2006 с фитопатогенами независимо от сроков хранения биопрепарата отмечено высокое литическое воздействие бактерий на мицелий грибов.

6. Предпосевная обработка семян томата биопрепаратом способствовала увеличению энергии прорастания и всхожести семян. Растения томата, выращенные из обработанных биопрепаратом семян, отличались ускоренным ростом и лучшим габитусом по сравнению с контролем. Обработка семян и молодых растений приводила к снижению площади поражения грибами и существенному (в 7 - 10 раз) уменьшению гибели растений, обработанных культуральной жидкостью фитопатогенных грибов Fusarium culmorum и Botrytis cinerea.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

(* - статья в журнале, рекомендованном ВАК)

1*. Лукаткин A.A. Исследование антифунгальных свойств Pseudomonas aureofaciens 2006 / A.A. Лукаткии, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - № 6. - С. 211-213.

2. Лукаткин A.A. Влияние начального pH послеспиртовой барды на рост бактерий Pseudomonas aureofaciens / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Биомика - наука XXI века: Матер, школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии, посвящ. памяти директора-основателя Ин-та биохимии и генетики д.б.н., проф., акад. РАСХН В.Г. Конарева (19152006 гг.). Уфа, 9-15 сентября 2007 г. - Уфа, 2007. - С.81-82.

3. Лукаткин А. А. Культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития: Матер. Всеросс. науч.-практич. конф. с междунар. участием, Киров, 27-29 ноября 2007 г. - Киров, 2007. - Вып. 5, Ч. 2. - С. 359-360.

4. Лукаткин A.A. Изучение влияния степени перемешивания на рост бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Первые чтения памяти профессора O.A. Заура-лова: Матер, науч. конф. (Саранск, МГУ им. Н.П.Огарева, 16 мая 2007г.). - Саранск, 2007. - С.69-71.

5. Лукаткин A.A. Изучение роста Pseudomonas aureofaciens на среде с хитинсодержащими субстратами / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, Ю.В. Овечкина // Управление качеством образования, продукции и окружающей среды: Матер. 3-й Всеросс. науч.-практич. конф., 25-26 сентября 2008 г. -Бийск, 2008.-С. 103-104.

6. Лукаткин A.A. Совместное культивирование бактерий Pseudomonas aureofaciens с фитопатогенными грибами / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, Ю.В. Овечкина // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины: Мат-лы II Междунар. науч. конф., Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008 г. -Ростов-на-Дону, 2008. - С. 154-155.

7. Лукаткин A.A. Влияние микопаразитических микроорганизмов на рост фитопатогенных грибов / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Матер. II Междунар. науч.-практич. конф., Казань, 15-16 сентября 2008 г. - Казань, 2008. — С. 74-75.

8. Лукаткин A.A. Влияние фосфата калия на рост бактерий рода Pseudomonas при культивировании на послеспиртовой барде / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): Матер, междунар. науч. конф., Саранск, 15-18 мая 2008 г. - Саранск, 2008. - С. 400.

9. Лукаткин A.A. Изучение микопаразитических свойств микроорганизмов - антагонистов фитопатогенных грибов / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // Современная микология в России: Матер. 2-го Съезда микологов России-М.: Национальная академия микологии, 2008. - Т.2. - С. 189-190.

10. Лукаткин A.A. Оптимизация условий культивирования бактерий рода Pseudomonas / А.А.Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Материалы XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева: в 2 ч. 4.2: Естественные и технические науки. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008. -С. 34—35.

11. Лукаткин A.A. Оптимизация условий культивирования бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Первая международная научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине»: Сб. материалов. - Ростов-на-Дону: ЦВВР, 2007. - С.144-145.

12. Лукаткин A.A. Влияние сроков хранения на жизнеспособность бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006 / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Мат-лы III Меж-дунар. науч. конф., Ростов-на-Дону, 1-4 октября 2009 г. - Ростов-на-Дону: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2009. - С. 17-18.

13. Лукаткин A.A. Оценка жизнеспособности клеток Pseudomonas aureofaciens в процессе хранения / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. - 2009. - Т.114, вып.З. - Прил. 1. - Ч. 2. - С.37-39.

14. Лукаткин A.A. Влияние хитинсодержащего сырья на рост бактерий рода Pseudomonas / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // XXXVII Огаревские чтения: Матер, науч. конф. - Саранск, 2009. - С. 3.

15. Лукаткин A.A. Получение биопрепарата на основе флуоресцирующих бактерий рода Pseudomonas / A.A. Лукаткин, В.В. Ревин // Молодежный инновационный форум Приволжского федерального округа (УлГТУ, 12-14 мая 2009 г.). - Ульяновск, 2009. - С.194-196.

16. Лукаткин A.A. Исследование образования белка бактериями Pseudomonas aureofaciens 2006 / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // II Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов. -Пермь,2009.-С. 78.

17. Бурова Ю.А. Влияние хитина на свойства биопрепарата /Ю.А.Бурова, A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин, В.М. Грошев // 2-й Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010». - М., 2010. - С. 37-38.

18. Лукаткин А. А. Влияние биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas aureofaciens на развитие растений / A.A. Лукаткин, Ю.А. Бурова, С.А. Ибрагимова //Экология родного края: проблемы и пути их решения: Матер. Всеросс. науч.-практич. конф. с междунар. участием, Киров, 26-27апреля 2010 г. - Киров, 2010. - С. 63-64.

19. Лукаткин A.A. Изучение взаимодействия Pseudomonas aureofaciens с botrytis cinerea при совместном глубинном культивировании / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // Междисциплинарный микологический форум. - Москва, 2010.-С.114.

20. Симкина H.A. Влияние сроков хранения культуральной жидкости Pseudomonas aureofaciens 2006 на развитие томата / H.A. Симкина, Ю.А. Бурова, A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова // Вторые чтения памяти профессора O.A. Зауралова: Материалы научной конференции. - Саранск, 2010. - С. 73-74.

Подписано в печать 13.07.10. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1057. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лукаткин, Андрей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ

РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS

1.1 Характеристика рода Pseudomonas

1.2 Использование бактерий рода Pseudomonas в сельскохозяйственной практике

1.3 Механизмы биологического контроля фитопатогенов бактериями рода Pseudomonas

1.3.1 Конкуренция за источники питания и экологические ниши

1.3.2 Синтез антибиотических веществ

1.3.3 Индуцирование системной устойчивости

1.4 Ризосфера - среда обитания бактерий рода Pseudomonas

1.5 Использование биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений

1.6 Физико-химическая характеристика послеспиртовой барды и ее использование

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

2.2 Реактивы, субстраты и материалы

2.3 Постановка эксперимента

2.4 Методы исследования

2.5 Математическая и статическая обработка результатов

ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS А UREOFACIENS

3.1 Изучение культурально-морфологических признаков бактерий при культивировании на средах различного состава

3.2 Влияние источников углеродного и азотного питания на рост бактерий

3.3 Влияние хитинсодержащих субстратов на рост бактерий Р. аигео/аЫепя

3.4 Исследование роста Р. ангео/аыет 2006 при глубинном культивировании на средах различного состава

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОТХОДОВ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ Р. АиШОРАСШЖ

4.1 Оптимизация условий культивирования бактерий на жидкой фракции послеспиртовой барды

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Р. АиШОРАСША^ 2006 НА ЖИДКОЙ ФРАКЦИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ

5.1 Технологическая схема получения биопрепарата

5.2 Оценка фунгитоксических свойств биопрепарата, полученного при культивировании Р. аигео/аЫет 2006 на ЖФПСБ

5.3 Исследование влияния длительности хранения биопрепарата на жизнеспособность бактерий

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКОПАРАЗИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОПРЕПАРАТА В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ

6.1 Влияние биопрепарата на рост фитопатогенов при твердофазном культивировании

6.2 Влияние биопрепарата на развитие фитопатогенов в условиях глубинного культивирования

ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ

РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

7.1 Исследование влияния биопрепарата на прорастание семян томата

7.2 Исследование влияния бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006 на развитие томата в вегетационном опыте

7.3 Изучение устойчивости томата, обработанного биопрепаратом, к воздействию фитопатогенов

7.4 Экономическая эффективность производства биопрепарата на основе Р. aureofaciens

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств"

Актуальность темы. Интенсификация сельскохозяйственного производства предполагает широкое применение пестицидов, что увеличивает опасность загрязнения продуктов растениеводства и негативное влияние на функционирование агроэкосистем. (Логинов, 2004). В отличие от химических средствами защиты сельскохозяйственных растений биопрепараты экологически безопасны, оказывают избирательное действие и их применение не нарушает взаимосвязь между элементами агроэкосистемы и не вызывает резистентности у фитопатогенных микроорганизмов (Акимова, 2007). Современное развитие биотехнологии способствует появлению высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, не только эффективно применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства, но^и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты (Логинов, 2004; Васильева, 2005). Актуальным способом борьбы с фитопатогенной микрофлорой является использование ризобакте-рий, обладающих способностью активно заселять ризосферу растений, используя питательные вещества, поставляемые растениями в составе корневых экзометаболитов (Capoalgro, 1986; Bahme, Schroth, 1987; Гарагуля*и др., 1988; Kapulnik, 1996; Whipps, 2001; Шапошников, 2003). Бактерии рода Pseudomonas — одна из наиболее эффективных групп микроорганизмов с позиции биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Weller, Cook, 1988; Смирнов, Киприанов, 1990; Dowling, CTGara, 1994; Воронин, 1998; Логинов, 2001; Bloemberg, Lugtenberg, 2001; Whipps, 2001; Четвериков, 2003); они входят в группу PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), обладают полезными для растений свойствами — способствуют улучшению роста и развития растений (Pietr, 1989; Renato de Freitas, Germida, 1991; Максимов, 1996; Свешникова, 2003) и способны контролировать развитие фитопатогенов в ризосфере растений как за счет конкуренции за экологическую нишу — источник углерода и энергии (Lugtenberg, 1994 Bolwerk, 2003), так и продуцируя различные антифунгальные метаболиты (Thomashow, Weller,

1996) или гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки грибов (Shapira et al., 1989; Dunne, 1998; Шапошников, 2003).

При разработке технологии получения биопрепаратов важно подобрать питательные среды, обеспечивающие не только максимальный выход биомассы, но и снижение себестоимости готового продукта (Логинов, 2003). Перспективным является использование отходов пищевого производства. Одним из таких отходов является послеспиртовая барда, содержащая белки, минеральные соли, остатки полисахаридов (Антипов, 2005). Использование барды в качестве основы питательной среды позволит снизить себестоимость готового продукта и будет способствовать улучшению экологического- состояния, поскольку барда представляет опасность для окружающей среды вследствие слабой утилизации, низкого pH и высокого содержания нуклеиновых кислот (Антипов, 2005).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось оптимизация условий культивирования бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006< на жидкой фракции послеспиртовой барды (ЖФПСБ) с целью получения нового биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных грибов.

Задачи исследования:

Научная новизна.- Впервые исследованы характеристики роста Р. aureofa-■ciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды и подобраны необходимые для этого компоненты среды. Показана возможность выращивания бактерий Р. aureofaciens 2006 на среде с хитином в качестве единственного источника углерода. Охарактеризованы культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма 2006 бактерии Р. aureofaciens. Выявлены оптимальные параметры твердофазного и глубинного культивирования Р. aureofaciens 2006. Разработана технологическая схема получения^ биопрепарата при культивировании Р. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ и изучены* характеристики полученного препарата. Показано сохранение высокого титра бактерий в течение длительного времени. Детально исследовано влияние обработки семян и растений-томата биопрепаратом на их рост и поражаемость фитопатогенными грибами.

Научно-практическая значимость работы.

Выявлены оптимальные параметры культивирования бактерий на жидкой фракции послеспиртовой барды для максимального выхода биомассы. Разработана технология получения и практического использования нового вида биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов на основе культу-ральной жидкости бактерий Р. aureofaciens 2006. Показана высокая экономическая эффективность производства и использования биопрепарата, полученного при культивировании Р. aureofaciens 2006 на ЖФПСБ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены и представлены на международных научно-практических конференциях «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007; 2008; 2009), «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008); на 2-м Международном Конгресс-Партнеринге и Выставке по биотехнологии и биоэнергетике «Евра-зияБио-2010» (Москва, 2010); на междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010); на Втором съезде микологов России (Москва, 2008); на Всероссийских научно-практической конференциях «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2007), «Управление качеством образования, продукции и окружающей среды» (Бийск, 2008), «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2010); на Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); на научных конференциях «Первые чтения памяти профессора O.A. Зауралова» (Саранск, 2007), «Экология, природные ресурсы и развитие Московского региона» (Москва, 2009), «XXXVII Огаревские чтения» (Саранск, 2009), «Вторые чтения памяти профессора O.A. Зауралова» (Саранск, 2010); на школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); на VII Республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2008); XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 2008); Республиканской конференции молодых ученых «Развитие биотехнологии в республике Мордовия» (Саранск, 2009).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Лукаткин, Андрей Александрович

выводы

1. Изучены культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма 2006 бактерий Pseudomonas aureofaciens. Исследовано влияние углеродного и азотного питания на образование биомассы бактерий Pseudomonas aureofaciens штамм 2006. Внесение хитинсо-держащего сырья в качестве единственного источника углерода способствует увеличению скорости роста бактерий. Выявлена хитинолитическая активность Р. aureofaciens 2006, сильнее выраженная в присутствии хитозана.

2. Культивирование Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспир-товой барды показало высокую интенсивность роста бактерий. Для улучшения роста необходима оптимизация состава барды: начальный pH 7.0 и добавление 1.5 г/л фосфорнокислого калия. Максимальное образование биомассы в ходе глубинного культивирования получено^ при скорости перемешивания. 150 об/мин„ а во время культивирования в биореакторе - при 60% насыщении кислородом.

3. Р. aureofaciens 2006 характеризуется наличием антифунгальных свойств. Выявлено подавление роста фитопатогенных грибов Fusarium- cul-тогит и Botrytis cinerea при воздействии на них полученным биопрепаратом, при этом отрицательное воздействие на В. cinerea выражено в большей степени.

4. Разработана технологическая схема получения биопрепарата на основе культивирования Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспирто-вой барды. Применение биопрепарата имеет высокую экономическую эффективность, основанную на низкой стоимости его производства и высоком защитном эффекте для сельскохозяйственных культур.

5. Проверка свойств биопрепарата в процессе длительного хранения (до 50 сут) при различных температурах (4 и 25°) показала сохранение высо

12 13 кого титра клеток (10'" - 10,J) и антифунгальной активности. Внесение хи-тинсодержащего сырья в состав биопрепарата способствовало увеличению титра активных клеток, который сохранялся на протяжении всего периода хранения. При глубинном культивировании Р. aureofaciens 2006 с фитопато-генами независимо от сроков хранения биопрепарата отмечено высокое ли-тическое воздействие бактерий на мицелий грибов.

6. Предпосевная обработка семян томата биопрепаратом способствовала увеличению энергии прорастания и всхожести семян. Растения томата, выращенные из обработанных биопрепаратом семян, отличались ускоренным ростом и лучшим габитусом по сравнению с контролем. Обработка семян и молодых растений приводила к снижению площади поражения грибами и существенному (в 7 — 10 раз) уменьшению гибели растений, обработанных куль-туральной жидкостью фитопатогенных грибов Fusarium culmorum и Botrytis cinerea.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биопрепарат, полученный при выращивании штамма Р. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды, может широко использоваться в качестве экологически безопасного, избирательного по способу действию природного средства защиты растений от фитопатогенных грибов. Применение этого биопрепарата имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими средствами защиты сельскохозяйственных растений, главным из которых является то, что использование биопрепарата не будет нарушать взаимосвязь между элементами агроэкосистемы и не сможет вызвать резистентность у фитопатогенных микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лукаткин, Андрей Александрович, Саранск

1. Адамовская В.Г. Изменение протеиназно-ингибиторной системы озимой пшеницы под действием салициловой кислоты и Fusarium / В.Г. Адамовская, Е.А. Касчковская, О.О. Молодченкова, C.B. Вовчук // Фи-зиол. раст. 2000. - Т. 47, № 2. - С. 210-215.

2. Акимова Е.Е. Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения./Е.Е. Акимова Диссертация канд. биол. наук. Москва. 2007. - 134 с.

3. Актуганов Г.Э. Хитинолитическая активность бактерий Bacillus — антагонистов фитопатогенных грибов / Г.Э. Актуганов, А.И. Мелентьев, Л.Ю. Кузьмина // Микробиология. 2003. - Т. 72; №3. - С. 356 - 360.

4. Антипов С.Т. Проблемы комплексной переработки послеспиртовой зерновой барды / С.Т. Антипов, A.B. Журавлев // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2005, № 2. - С. 36-38.

5. Аркадьева З.А. Взаимодействие кукурузы с некоторыми бактериями корневой микрофлоры / З.А. Аркадьева // Микробиология. 1963. -Т.32, №1. - С. 79-85.

6. Бажанов Д.П. Колонизация корней ячменя диазотрофильными Pseudomonas sp., генетически измененными по признаку фиксации азота / Д.П. Бажанов, Е.В. Рудова, H.A. Троицкий // Докл. АН Беларуси. -1995. Т. 39, №1.- С. 84-87.

7. Белимов Л.А. Характеристика и интродукция новых штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий, доминирующих в ризоплане проростков ячменя / Л.А.Белимов, А.Ю. Иванчиков, Л.В. Юдкин // Микробиология. 1999. - Т. 68, №3. - С. 392-397.

8. Беренштейн А.Ф. Комплексное использование барды спиртовых заводов / А.Ф. Беренштейн, И.К. Сиволап // М.: Пищепромиздат. - 1960.95с.

9. Берестецкий O.A. Фитотоксины почвенных микроорганизмов и их экологическая роль / O.A. Берестецкий // Фитотоксические свойства микроорганизмов. Л. 1978. С. 7-30.

10. Брынза А.И. Фитотоксичность и гидролитическая активность грибов рода Fusarium, выделенных с озимой пшеницы на разных фазах развития' // Болезни сельскохозяйственных культур и их антагонисты / Кишинев. 1982. - С. 15.21.

11. З.Быкова В.М. Сырьевые источники и способы получения хитина и хито-зана. / В.М. Быкова // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение М.: Наука. - 2002. - С. 7-23.

12. Н.Васильева Н.С. Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов ленойл, елена, азолен. /Н.С. Васильева. Автореферат дис. канд. биол. наук. Щелково. 2005. - 26 с.

13. Воробьев A.B. Состав хитинолитического микробного комплекса и его влияние на разложение хитина при различных уровнях влажности / A.B. Воробьев, H.A. Манучарова, A.M. Яраславцев // Микробиология. -2007. Т.76, № 5. с. 632 - 640.

14. Гарагуля А.Д. Способность различных видов бактерий рода Pseudomonas к колонизации корней пшеницы / А.Д. Гарагуля, Л.В. Бабич, Е.А. Киприанова // Микробиол. журн. 1988. - Т. 50, № 6. - С. 77-81.

15. Геллер H.A. Фитотоксичные микроорганизмы в различных типах почви их роль в процессах окультуривания / И.А. Геллер, H.A. Калмыкова // Фитотоксические свойства микроорганизмов. JL: -1978. - С. 76-80.

16. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшалк. М.: Мир, 1982.310 с.

17. Гусев М.В. Микробиология: учебник / М.В. Гусев, JI.A. Минеева // 3-е изд., перераб. и доп. -М.: Изд-во МГУ, 1992.-448 с.

18. Долгих Ю.Р. Микрофлора ризосферы риса и ее связь с корневыми выделениями // Повышение плодородия почв рисовых полей / М.: Наука. - 1977.-С. 144-150.

19. Долгова Е.М. Препараты псевдобакерин 2 и псевдобакерин - 3 против болезней пшеницы / Е.М. Долгова, О.П. Манько, И.Я. Зубко // Химия в сельском хозяйстве. — 1997, № 1. — С. 61.

20. Дудце М.Э. Сырье и питательные субстраты для помышленной биотехнологии / М.Э. Дудце // Рига: Знание. - 1986. - 34с.

21. Егорова Н.С. Практикум по микробиологии / Н.С. Егорова // М.: Изд-во Московского гос. универ. - 1976. - 308с.

22. Ермаков Н.И., Штершинс М.В. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений / Н.И. Ермаков, М.В. Штершинс // Защита растений. -1994, № 12.-С. 18.

23. Звягинцев Д.Г. Экологическая характеристика ризосферы / Д.Г. Звягинцев, П.А. Кожевин, И.П. Кириллова // Проблемы почвоведения. -М.: Наука. 1982. - С. 66-70.

24. Климашевский Э.Л. Оценка кислотоустойчивости растений. / Э.Л. Климашевский // Л.: ВИР. - 1988. - С. 97-100.

25. Кожевин П.А. Экология микроорганизмов: эксперименты в природе / П.А. Кожевин // Природа. 1985, № 7. - С. 78.

26. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе / П.А. Кожевин // М.: МГУ.- 1989.- 171с.

27. Кочетков В.В. Защита растений биопрепаратами в защищенном грунте / В.В. Кочетков, А.Г. Чигалейчик, С.Б. Петрикевич // Химия в сельском хозяйстве. 1997, № 1. - С. 16-17.

28. Кравченко Л.В.Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas II Л.В. Кравченко, Т.С. Азарова, Е.И. Леонова-Ерко // Микробиология. — 2003. Т. 72, №1. С. 48-53.

29. Красильников Н.Ф. Микроорганизмы почвы и высшие растения / Н.Ф. расильников // М.: Изд. АН СССР. - 1958. - 463с.

30. Куваев Е.А. Использование отходов мелассно-спиртовых заводов в производстве гипсоволокнистых изделий / Е.А. Куваев, А.Г. Заброд-ский // Техника и технология. 1990. - Вып. 1. - С. 8-11.

31. Кузнецова М.А. Ризоплан и фитофтороз картофеля / М.А. Кузнецова, A.B. Филиппов // Защита растений. 1995, №8. - С. 19-20.

32. Курдиш И.К. Выживаемость и фнтагонистическая активность Pseudomonas aureofaciens УКМ В-111 при хранении в высокодисперсных материалах / И.К. Курдиш, A.A. Рой, А.Д. Гарагуля // Микробиология. -1999. Т. 68, № 3. - С. 387-391.

33. Логинов О.Н. Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды. Диссертация д-ра биол. наук. УФА: Институт биологии УНЦ РАН, 2004. 299 с.

34. Лукаткин A.A. Исследование антифунгальных свойств Pseudomonas aureofaciens 2006 / A.A. Лукаткин, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Вестник Оренбургского государственного университета. 2009, № 6. — С. 211-213.

35. Лукин С.А. Конъюгация между азоспириллами в ризосфере ячменя и в почве / С.А. Лукин, A.A. Прозоров // Микробиология. 1994. - Т. 63. -Вып. 2. - С. 247-254.

36. Лутова Л.А. Генетика развития растений / под ред. чл.-кор. РАН С.Г.Инге-Вечтомова// Спб.: Наука. - 2000. - 539с.

37. Мавроди Д.В. Структурно-функциональная организация генов Pseudomonas ßuorescens, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты / Д.В. Мавроди, В.Н. Ксензенко, Б.М. Чатуев // Молекуляр. биология. 1997. - Т. 31. - С. 76-82.

38. Мандреа А.Г. Спиртовая барда. Технология утилизации / А.Г. Мандреа //- М.: Пищевая промышленность. 2004, № 3. - С. 54-55.

39. Маринченко В.А. Технология спирта / В.А. Маринченко, В.А. Смирнов, Б.А.Устинников // -М.: Легкая и пищевая промышленность. 1981. -416с.

40. Мелентьев А.И. Роль хитиназы в проявлении антигрибной активности штаммом Bacillus sp. 739 / А.И. Мелентьев, Г.Э. Актуганов, Н.Ф. Га-лимзянова // Микробиология. 2001. - Т. 70, №5. - С. 636 - 641.

41. Мордухова Е.А. Влияние силицилата натрия на популяционную динамику ризосферного штамма Pseudomonas aureofaciens в почве и на корнях пшеницы / Е.А. Мордухова, В.В. Кочетков, Е.В. Лобанова // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 6. - С. 844-849.

42. Мюллер Э. Микология / Э. Мюллер, В. Леффлер// М.: Мир. - 1995. - 343 с.

43. Назарова Л.Н. Против комплекса болезней озимой ржи / Л.Н. Назарова,

44. B.А. Наговицин, В.Г.Черемисина \\ Защита растений. 1995, №8. - С. 18-19.

45. Ненайденко Н.Г. Агрохимическая оценка новых органических удобрений отходов производства спирта / Н.Г. Ненайденко // Вестник Рос-сельхозакадемии. — 2002, №6. - 176с.

46. Нетрусов А.И. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. Вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко // М.: Издательский центр «Академия». - 2004. - 272 с.

47. C.Т. Олийничук, М.И. Кошель, Ю.А. Каранов // Техника и технология. -2006. Т.2. - С.42-43.

48. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. /Под ред. Дж. Хоулта с соавт. // -М.: Мир.- 1997.-Т. 1.

49. Патент 2147181 РФ. А 01 N 63/00, С 05 F 11/08. Препарат для повышения урожая растений и защиты их от болезней / А.К. Злотников, И.К. Злотникова, И.И. Санцевич с соавт. // Заявлено 07.09.99.

50. Полянская JI.M. Популяционная экология актиномицетов в почвах и ее роль в управлении комплексом почвенных микроорганизмов / JT.M. Полянская, Д.Г. Звягинцев // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1984, № 5. -С. 746-753.

51. Разумовская З.Г. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. -Л.: Изд. Ленингр. унив. i960. — 184 с.

52. Рабинер Б.М. Состав последрожжевой барды / Б.М. Рабинер // Ферментная и спиртовая промышленность. 1985, № 2. - С. 6-7.

53. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas / Е.Л. Рубан // М.: Наука. 1986. - 200 с.

54. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве / Л.И. Рубенчик // Киев: АН УССР. - 1960. - 328 с.

55. Свешникова Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas антагонисты фи-топатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике : диссертация . канд. биол. наук УФА: Институт биологии УНЦ РАН, 2003. 154 с.

56. Сидоренко О.Д. Применение бактериальных препаратов при выращивании картофеля / О.Д. Сидоренко, В.А. Стороженко, О.Р. Кухаренкова

57. Междунар. с-х. журн. 1996, № 6. - С. 36-38.

58. Скворцова И.Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas / И.Н. Скворцова // М.: Изд. Моск. унив. — 1981.-78 с.

59. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas продуценты новых антибиотиков / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова // М.: Наука. - 1986. - 166 с.

60. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas / B.B. Смирнов, Е.А. Киприанова // Киев: Наук. Думка. 1990. - 264с.

61. Смирнов В.В. Влияние ионов железа на антифунгальную активность бактерий рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова, О.И. Бойко, Э.А. Колесова, А.Д. Гарагуля // Микробиол. Журнал. — 1991. — Т. 53, №3.-С. 80-87.

62. Сотников В.А. Производство спирта и ликероводочных изделий / В.А. Сотников, Г.П. Марченко // М.: Пищепромиздат. - 2004. - 312 с.

63. Струнникоа O.K. Развитие и взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonasßuorescens в почве / O.K. Струнникоа, В.Ю. Шахназарова, H.A. Вишневская // Микробиология. 2007. - Т. 7, № 8. - С675-684.

64. Тарасов A.JI. Использование Н2О2 в качестве источника кислорода бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus / A.JI. Тарасов, И.А. Бор-зенков, Е.И. Милехина, И.С. Мысякина // Микробиология. 2004. - Т. 73, №4. - С. 465-471.

65. Тахтаджян A.JI. Жизнь растений: в 7 т. Т.2. Бактерии / Под ред. A.JI. Тахтаджян // М.: Просвещение. 1991. - 480 с.

66. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, Г.И. Шильни-кова, Г.И. Переверзева // М.: Колос. - 1993. - 175 с.

67. Титаренко JI.H. Применение ризоплана на Северном Кавказе / JI.H. Ти-таренко, Г.Г. Вяткина, М.Н. Алещенко // Защита растений. 1995, № 8.- С. 17.

68. Титова В.И. Обоснование использования отходов в качестве вторичного материального ресурса в сельскохозяйственном производстве / В.И. Титова, М.В. Дабахов, Е.В. Дабахова // Нижегородская гос. с.-х. академии. Н.Новгород; изд-во ВВАГС. - 2009. - 178с.

69. Тригер Е.Г. Межмикробные взаимодействия в почве (на примере некоторых популяций стрептомицетов и бактерий) / Е.Г. Тригер, JI.M. Полянская, П.А. Кожевин // Микробиология. 1990. - Т.59Б №4. - С.688-694.

70. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация / М.М. Умаров // М.: Изд. Моск. Унив. - 1986. - 131с.

71. Четвериков С.П. Новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas ингибиторы роста фитопатогенных грибов / С.П.Четвериков. Автореферат дис. канд. биол. наук. М. 2005. — 26 с.

72. Чурикова В.В. Морфология и культивирование микроорганизмов: Малый практикум по микробиологии / В.В. Чурикова, М.Ю. Грабович // -Воронеж: Изд-во ВГУ. 2003. - 55 с.

73. Шапошников А.И. Механизмы антагонистического действия бактерий на фитопатогенный грибы в ризосфере овощных культур. Диссертация канд. биол. н. Спб.: Всерос. науч.-исслед. ин-т с.-х. микробиологии РАСХН, 2003.- 163 с.

74. Яровенко B.JT. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А.Смирнов // М.: Колос. - 1999. - 464 с.

75. Aliken R.M. Root system regulation of whole plant growth / R.M. Aliken, A.J.M. Smucker // Annu. Rev. Phytopathol. 1996. - V. 34. - P. 325-346.

76. АЫ P. Iron bound-siderophores, cyanic acid and antibiotics involved in suppression of Thielaviopsis basicola by a Pseudomonas fluorescens strain / P. Ahl, C. Voisard, G. Defago // Phytopathol. J. 1986, № 2. - P. 121-134.

77. AH Siddiqui I. Use of rhizobacteria in the control of root rot-root knot disease complex of mungbean /1. Ali Siddiqui, S. Ehetshamul-Haque, S. Sha-hid Shaukat // J. Phytopathol. 2001, № 6. - P. 337-346.

78. Bahme J.B. Spatial-temporal colonization patterns of a rhizobacterium on underground organs of potato / J.B. Bahme, M.N. Schroth // Phytopathology. 1987. - V. 77, № 7. - P. 1093-1100.

79. Barber D.A. Microbial growth in the rhizosphere / D.A. Barber, J.M. Lynch // Soil. Biol. Biochem. 1977. - V. 9,№5. - P.305-308.

80. Bandoni E. Impact of growth stage on the bacterial community structure along maize mots, as determined by metabolic and genetic fingerprinting / E. Bandoni, E. Benizri, A. Guckert // Appl. Soil. Ecol. 2002. - V. 19, №2. -P. 135-143.

81. Becker J.O. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased-growth response of wheat by fluorescent pseudo-monads / J.O. Becker, R.J. Cook // Phytopathology. 1988. - v. 78,№ 6. -P. 778-782.

82. Becker J.O. Effect of rhizobacteria and methan-sodium on growth root microflora of celery cultivars / J.O. Becker, C.A. Hepfer, G.V. Yuen // Phytopathology. 1990. - Vol. 80, № 2. - P. 206-211.

83. Bennet R.A. Colonization potential of bacteria in the rhizosphere / R.A. Bennet, J.M. Lynch//Curr. Microbiol. 1981. V. 6, № 3. - P. 137-138.

84. Berg G. Plant-depeadent genotypic and phenotypic diversity of antagonistic rhizobacteria isolated from different Verticillum host plants / G. Berg, N. Roskot, A. Steidle // Appl.Environ. Microbiol. 2002. - V. 68, №7. - P. 3328-3338.

85. Bisacchi G.S. Xylocanndin: a new complex of antifungal peptides. Structural studies and chemical modifications /G.S. Bisacchi, D.R. Hockstein, W.H. Koster, W. Parker, M.L. Rathnum, S.E. Unger // J. Antibiot. 1987. -V. 40.-P. 1520-1529.

86. Bossier P. Ecological significance of siderophores in soil / P. Bossier, M. Hofte, W. Verstraete // Adv. Microb. Ecol. 1988. - V. 10. - P. 385-414.

87. Bradley D.A. Function of Pseudomonas aeruginosa polar pili: twitching motiliti / D.A. Bradley // Can. J. Microbiol. 1980. - Vol. 26, № 1. - P. 146 - 154.

88. Campbell R. The search for biological control agents against plant pathogens: a pragmatic approach / R. Campbell // Biol. Agr. And Hort. 1986. -V. 3,№ 2-3. P. 317-327.

89. Canesan P. Biological control of Selerotium rolfsii Sacc. in peanut by inoculation with Pseudomonas fluorescens / P. Canesan, S.S. Gnanamanickam // Soil. Biol. Biochem. 1987. - Vpl. 19, № 1. - P. 35-38.

90. Caponigro V. Coloizzazione radicale di tobacco con Pseudomonas fluorescens / V. Caponigro, R. Contillo // Ann. 1st. Sper. Tabacco. Scafoti (Salerno).- 1986.-V. 12.-P. 49-64.

91. Chet I. Mechanisms of biocontrol of soil-bome plant pathogens by rhizobacteria/1. Chet, A. Ordentlich, R. Shapira, A. Oppenheim // Plant and Soil.- 1990.-V. 129.-P. 85-92.

92. Chin-a-Woeng T.F.C. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria / T.F.C. Chin-a-Woeng, G.V. Bloemberg, B.G.G. Lugtenberg // New Phytologist. 2003. - V. 157, № 3. - P. 503-523.

93. Colin J.E. Caracterisation spectrophotometrique et activité biologique de siderophores de Pseudomonas fluorescents, antagonists de bacteries phy-topathogenes / J.E. Colin, H. Maraite // Parasitica. 1987. - V. 43, № 4. - P. 168-175.

94. Conway K.E. Inhibition by Pseudomonas cepacia a protential biocontrol agent of selected soilbome pathogens / K.E. Conway, C.J. Foor, D. Malvick// Abstr. Present. 1989 Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc.,

95. Richmond, Va, Aug. 20-24, 1989 // Phytopathology. 1989. - V. 79, № 10. -P. 1159.

96. Dong X. SA, JA, ethylene and disease resistance / X. Dong // Curr. Opin. Plant Biol. 1998.-V.l.-P. 316-323.

97. Duffy B.K. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains / B.K. Duffy, G. Defago // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 2429-2438.

98. Dunlap C. Biological control of Pythium ultimum by Stenotrophomo-nas mahophiha W81 is mediated by an extracellular proteolytic activity / C. Dunlap, J.J. Crowley, Y. Moenneloccoz // Microbiology Uk. 1997. - V. 143.-Part 12.-P. 3921-3931.

99. Dunne C. Combining proteolytic and phloroglacinol-producing bacteria for improved biocontrol of Pythium mediated damping-off of sugar beet / C. Dunne, L.Y. Moenne, J. Mc Carthy // Plant pathology. - 1998. -V. 109.-P. 299-307.

100. Fakhouri W. Isolation and identification of X-mercapto-4-formylcarbostyril, an antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens / W. Fakhouri, F. Walker, B. Vogler, W. Armbruster, H. Buchenauer // Pheto-chemistry. -2001. V. 58. - P. 1297-1303.

101. Foster R.C. Ultrastructure of the wheat rhizosphere / R.C. Foster, A.D. Rovira // New Phitol. 1976. - V. 76. - P. 343-352.

102. Frandberg E.Antifungal activity of chitinolytic bacteria isolated from airtight stored cereal grain / E. Frandberg, J. Schnurer // Can. J. Microb. -1998.-V. 44.-P. 121-127.

103. Fravel D.R. Role of antibiosis in the biocontrol of plant diseases / D.R. Fravel // Annu. Rev. Phytopathology. 1988. - V. 26. - P. 75-91.

104. Georgakopoulos D. Analysis of expression of a phenazine biosyn-thetic locus of Pseudomonas aureofaciens PGS12 on seeds with a mutant carrying a phenazine biosynthesis locus-ice nucleation reporter gene fusion /

105. D. Georgakopoulos, Mi Hendson, N.J. Panopolus, M.N. Shroth // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60. - P. 4573-4579.

106. Gibson J. Nutritional aspects of microbial ecology / J. Gibson // Microbial. Ecology. Cambrige Univ. press. — 1957. P. 22-29.

107. Gordon-Lennox G. Utilisation d'antagonistes pour l'enrobage des semences: efficacité et mode d'action contre les agents de la fonte des semis / G. Gordon-Lennox, D. Walther, D. Gindral // Bull. OEPP Oxford etc. -1987.-Vol. 17, №4.-P. 631-637.

108. Griffiths B.S. Soil microbial community structure effects of substrste loading rales / B.S. Griffiths, K. Ritz, N. Ebblewhite, G. Dobson // Soil. Biol. Biochem. — 1999. — V. 31. P. 145-153.

109. Gupta C.P. Plant growth enchancement and suppression of Macro-phomina phaseolina causing charcoal rot of peanut by fluorescent Pseudomonas / C.P. Gupta, R.C. Dubey, D.K. Maheshwari // Biol. Fertil. Soils. -2002. V. 35, №6. - P. 399-405.

110. Haas D. Biocontrol ability of fluorescent pseudomonads genetically dissected importance of positive feedback regulation / D. Haas, C. Blumer, C. Keel // Cuit. Opin. Biothechnol. 2000. - V. 11. - P. 290-299.

111. Handelsman J. Biocontrol of soilborne plant pathogens / J. Handels-man, E.V. Stabb // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 1855-1869.

112. Haware M.P. The role of chickpea root exudates in resistance to Fusarium wilt / M.P. Haware, Y.L. Nene // Int. Chickpea Newlett. 1984. - V. 10.-P. 12-13.

113. Henry M.B. Role of siderophores in the biocontrol of Pseudomonas tolasii by fluorescent pseudomonad antagonists / M.B. Henry, J.M. Lynch, T.R. Fermor// J. Appl. Bacteriol. 1991. -V. 70, № 2. - P.104-108.

114. Hiltner L. Uber neuere Erfahrungen und problem auf gebeit der bodenbakteriologie und umer besonderer berucksichtigung der grundungung und brache / L. Hiltner // Arh. Dtsch. Landwirt. Ges. 1904. - V. 98. - P. 59-78.

115. Howard M. B. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes / M. B. Howard, N. A. Ekborg, R.M. Weiner, S. W. Hutcheson // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 627635.

116. Ikeda K. Effect of bacterial colonization of tomato rots on subsequent colonization by Pseudomonas fluorescens MclRC2Rif / K Ikeda, K. Toyota, M. Kimura // Can. J. Microbiol. 1998. - V.44, №7. - P. 630-636.

117. Inbar J.Evidence that chitinase produced by Aeromonas caviae is involved in the biological control of soil-borne plant pathogens by this bacterium / J. Inbar, I. Chet // Soil Biol, and Biochem. 1991. - V. 23. - P. 973978.

118. Jacque P. Production of siderophores in antagonistic and non-antagonistic strains of Pseudomonas / P. Jacque, M. Ongena, P. Delfosse // 5-th Eur. Congr. On Biotechnology, July 8-13, 1990. Copengagen. - 1990. -V. l.-P. 150-152.

119. James D.W. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens Hv37a and their differential regulation by glucose / D.W. James, N.J. Gutterson // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 27. - P. 1183-1189.

120. Janisiewicz W.J. Biological control of blue mold and gray mold on apple and peer with Pseudomonas cepacia / W.J. Janisiewicz, J. Roitman // Phytopathology. 1988. -V. 78, № 12. -Pt. 2. - P. 1697-1700.

121. Johanson P.M. Low-temperature isolation of disease-suppressive bacteria and characterization of a distinctive group of Pseudomonas / P.M. Johanson, S.A.I. Wright // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 6464-6474.

122. Kanner D. Pattern of phenazine pigment production by strain of Pseudomonas aeroginosa / D. Kanner, N.N. Gerber, R. Bartha // J. Bacteriol. -1978.-V. 134.-P. 690-692.

123. Kapulnik Y. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria / Y. Ka-pulnik // Plant Root the hidden half. Edited by Waisel Y., Eshel A., Kafkafi U./ Marcel Dekker Ink. New York, Basel, Hong Kong. 1996. - P: 769780.

124. Katznelson H. The "rhizosphere effect" on certain groups of soil microorganisms / H. Katznelson // Soil. Sci. 1946. - V.62, № 5. p. 343354.

125. Kloepper J.W. Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity / J.W. Kloepper, R. Lifshitz, R.M. Zabolotowiez // Trends. Bio-technol. 1989. V.7. - P. 39-43.

126. Kraus J. Lack of role for fluorescent sideropheore production in the biological control of Pythium dumping-off of cucumber by a strain of Pseudomonas putida / J. Kraus, J.E. Loper // Phytopathology. — 1992. V. 82. — P. 261-264.

127. Lee C. Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic produced be Pseudomonas cepacia / C. Lee, S. Kim, B. Hyun, J. Suh, C. Yen // J. Antibiot. -1994.-V. 47.-P. 1402-1418.

128. Leeman M. Biocontrol of Fusarium wilt of radish in commercial greenhouse trials by seed treatment with Pseudomonas fluorescens WCS374 / M. Leeman, J.A. van Pelt, M.J. Hendricks // Phytopathology. 1995. - V. 85, №10. - P. 1301-1305.

129. Leong J. Siderophores: Their Biochemistry and possible role in the biocontrol of plant pathogens / J. Leong // Ann. Rev. Phytopathol. V. 24. -P. 187-209.

130. Levy E. Suppression of Septoria tritiei and Puccinia recondite of wheat by an antibiotic-producing fluorescent pseudomonad / E. Levy, Z. Eyal, S. Carmely// Plant Pathol. 1989. - Vol. 38, № 4. - P. 564-570.

131. Liang X.Y. Control of damping-off of safflower by bacterial seed treatment / X.Y. Liang, H.C. Huang, L.J. Yanke // Can. J. Pathol. 1996, № l.-P. 45-49.

132. Liao C.H. Antagonism of Pseudomonas putida strain PP22 to phyto-pathogenic bacteria and its potential use as a biocontrol agent / C.H. Liao // Plant Disease. 1989. - Vol. 73, № 3. - P. 223-226.

133. Lim H.-S. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot / H.-S. Lim, Y.-S. Kim, S.-D. Kim // Appl. and Envir. Microb. 1991. - V. 57.-P. 510-516.

134. Loper J.F. Role of fluorescent siderophore production in biological control of Pythium ultimum by a Pseudomonas fluorescens strain /J.F. Loper // Phytopathology. 1988. - V. 78, № 2. - P. 166-172.

135. Lugtenberg B.J.J. Molecular determinants of the rhizosphere colonization by Pseudomonas / B.J.J. Lugtenberg, L. Dekkers, G.V. Bloemberg // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. - V. 39. - P. 461-490.

136. Lynch J.M. The rhizosphere / J.M. Lynch // Wiley-Interscience, Chichester, England. 1990. - P. 34-37.

137. Mahaffee W.F. Temporal changes in the bacterial communities of soil, rhizosphere, and endorhiza associated with field-growth cucumber (Cucu-mus sativus L.) / W.F. Mahaffee, J.W. Kloepper // Microb. Ecol. 1997. -V. 34.-P. 210-223.

138. Maloney P.F. Bacterial community structure in relation to the carbon environments in lettuce and tomato rhizospheres and a bulk soil /P.F. Maloney, A.H.C. van Brüggen, S. Hu // Microbial. Ecology. 1997. - V. 34. -P. 109-117.

139. Maloy O. C. Plant Disease Control: Principles and Practice / Eds. J. Wiley & Sons, Chichester. 1993. - 354p.

140. Mao G.H. Postharvest biocontrol of gray mold of pear by Pseudomonas gladioli: Abstr. Present. 1989 Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc., Richmond, Va, Aug. 20-24, 1989 / G.H. Mao, R.A. Cappellini // Phytopathology. 1989. - Vol. 79, № 10.-P. 1153.

141. Meyers E. Xylocandin: a new complex of antifungal peptides. Taxonomy, isolation, and biological activity / E. Meyers, G.S. Bisacchi, L. Dean, W.C. Liu // J. Antibiot. 1987. - V. 40. - P. 1515-1529.

142. Mew T.W. Bacterization of rice plants for control of sheath hight caused by Rhizoctonia solani / T.W. Mew, A.M. Rosales // Phytopathology. 1986. - V. 76, №11. - P. 1260-1264.

143. Mc Laughlin R.J. Biocontrol of bacterial wilt of potato with an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum: Interactions with root-knot nematodes / R.J. Mc Laughlin, L. Sequeira, D.P. Weingartner // Am. Potato J. -1989. Vol. 67, № 2. - P. 93-107.

144. Mc Laughlin R.J. Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato / R.J.Mc Laughlin, L. Sequeira // Am. Potato J. 1988. - Vol. 65, № 5. - P. 255-268.

145. Mitchell R. The mycolytic phenomenon and biological control of Fusarium in soil / R. Mitchell, M. Alexander//Nature. 1961. -V. 190. -P. 109-110.

146. Mitchell R. Lysis of soil fungi by bacteria / R. Mitchell, M. Alexander // Can. J. Microb. 1963. - V. 9. - P. 169-177.

147. Miyazaki H. A positive regulatory gene, pvdS, for expression of py-overdin biosynthetic genes in Pseudomonas aeruginosa PAO / H. Miyazaki, H. Kato, T. Nakazawa, M. Tsuda // Mol. Gen. Genet. 1995. - V.248, №1. -P. 17-24.

148. Munoz-Garcia Andres A. The population dynamics of maize rhizoplane inoculated with Pseudomonas and Azospirillum / A. Munoz-Garcia Andres, V. Maria // Rev. latinoamer. Microbial. 1995, № 4. - P. 305-313.

149. Nehl D.B. Deleterious rhizosphere bacteria an integrating perspective / D.B. Nehl, S.J. Allen, J.F. Brown // Appl. Soil. Ecol. - 1997. - V.5, №1.-P. 1-20.

150. Nelson E.B. Exudate molecules initiating fungal responses to seeds and roots / E.B. Nelson // Plant and soil. 1990. - V. 129. - P. 61-73.

151. Nowak-Thompson B. Production of 2,4 diacetylphloroglucinol by the biocontrol agent Pseudomonas ßuorescens Pf-2 / B. Nowak-Thompson, S.J. Gould, J. Kraus, J.E. Loper // Can. J. Microbiol. - 1994. - V. 40. - P. 1064-1066.

152. Okon Y. Agronomic applications of Azospirillum / Improving plant productivity with rhizosphere bacteria. Ed by M.H. Ryder A, P.M. Stephens, G.D. Bowen // Commonwealth Sei. and Industrial Res. Organization, Adelaide, Australia. 1994. -P.274-278.

153. Ordentlich A. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii / A. Ordentlich, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. — 1988. V. 78.-P. 84-88.

154. Ortas I. Determination of the extent of rhizosphere soil /1. Ortas // Commun. Soil. Sei. Plant. Anal. 1997. -V. 28. - P. 1767-1776.

155. Osburn R.M. Dynamics of sugar beet colonization by Pythium ultimum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off / R.M.

156. Osburn, M.N. Schroth, J.G. Hancook // Phytopathology. 1989. - Vol. 79, №6. -P. 709-716.

157. O'Sullivan D.J. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens / D.J. O'Sullivan, F. O'Gara // Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 662-676.

158. Paulitz T.C. Biological control of root pathogens in soilless and hy-droponic sysrems / T.C. Paulitz // Hort Science. 1997. - V. 32. - P. 193196.

159. Polonenko D.R. Microbial responsws to salt-induced oamotic stress.1.. A model of a root region / D.R. Polonenko, C.I. Mayfield, E.B. Dum-broff// Plant Soil. 1984. - V.80, № 3. - P. 363-371.

160. Polyanskay L.M. The growth-promotion effect of Beijerinckia mobilis and Clostridium sp. cultures on some agricultural crops / L.M. Polyanskay, O.T. Vedina, L.V. Lysak, D.G. Zvyagintsev // Microbiology. 2002.1. V.71, №1. -P. 109-115.

161. Renato de Freitas J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as winter wheat inoculationts for biocontrol of Rhizoctonia solani / J. Renato de Freitas, J.J. GermidaJ I Can. J. Microbiol. 1991. - Vol. 37, № 10. - P. 780-784:

162. Rhodes D.J. Effects of fluorescent pseudomonads on the potato blacked syndrome / D.J. Rhodes, C. Logan // Ann. Appl. Biol. — 1986. -Vol. 108, №3.-P. 511-518.

163. Riviere J. La rhizososphere / J. Riviere, M.Chalvignac // La vie dans les sols.-Paris. 1971.-P. 391-413.

164. Rouatt J.W. Initiation of Rhizosphere effect / J.W. Rouatt // Can. J. Microbiol. 1959.-V. 5.-P. 67-71.

165. Rovira A.D. Plant rool excretion in relation to the rhizosphere effect. II. / A.D. Rovira // Plant Soil. 1956. - V.7. - P. 195-208.

166. Ruy C.M. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis / C.M. Ruy, M.A. Farag, C.H. Hu // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100, № 14.-P. 8607.

167. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. / J. Sam-brook, E.F. Fritsch, T.A. Maniatis // Cold Spring Harbor. 1989. - 349 p.

168. Savithiry S. Bacterization of peanut with Pseudomonas fluorescent for biological control of Rhizoctonia solani and for enhanced yield / S. Savithiry, S.S. Gnanamanickam // Plant and Soil. 1987. - Vol. 102, № 1. -P. 11-15.

169. Schippers B. Beneticial and deleterious effect of HCN-producing pseudomonads on rhizosphere interasetions / B. Schippers, A.W. Bakker, P.A.H.M. Bakker, R. van Peer // Plant and Soil. 1990. - V. 129. - P. TS-SS.

170. Shapira R. Control of plant diseases by chitinase expressed from cloned DNA in Escherichia coli I R. Shapira, A. Ordentlich, I. Chet, A.B. Oppenheim // Phytopathology. 1989. - V. 79. - P. 1246-1249.

171. Short G.E. Carbohydrate exudation from Pea seeds effect of cultivar, seed age, color, and temperature / G.E. Short, M.L. Lacy // Phytopathology. 1976. - V. 66.-P. 182-187.

172. Singh U.P. Effect of plant growth-promoting Rhizobacteria and culture filtrate of Sclerotium rolfsii on phenolie and salicylic acid contents in chickpea / U.P. Singh, B.K. Sarma, D.P. Singh II Curr. Microbiol. 2003. -V. 46, №2.-P. 131-140.

173. Sobiezewski Piotr. Mozliwosci i ograniezenia biologicznej ochronny jablek bakteriami Pantoea agglomerans i Pseudomonas sp. Przed szara plesnia i mokra zgnilizna / Piotr. Sobiezewski, H. Bruk II Post. ochr. rosl. -1999, № l.-C. 139-147.

174. Sundheim L. Biocontrol of Fusarium oxysporum with a chitinase cloning gene from Serratia marcescens on a stable plasmid in Pseudomonas. /L. Sundheim//J. Cell Biochem. 1990. - V. 13A.-P. 171-176.

175. Swinburne T.R. Stimulation of disease development by siderophores and inhibition by chelated iron / T.R. Swinburne // Iron. Siderophores and plant Diseases: Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Wye, July 1-5, 1985. -New York; London. 1986. - P. 217-226.

176. Takeda R. Pseudomonads pigments. IV. The structure of pyoluteorin. / R. Takeda // Bull. Agr. And Chem. Soc. Jap. 1959. - V.23, № 3. - P. 161-171.

177. Tam L. Functional diversity and community structure of microorganisms in rhizosphere and non-rhizosphere Canadian arctic soils / L. Tam, A.M. Derry, P.G. Kevan, J.T. Trevors // Biodiversity and Conservation. — 2001.-v. 10,№ 11.-P. 1933-1947.

178. Thomashow L.S. Production of the antibiotic phenazine-l-carboxylie acid by fluorescent Pseudomonas spp. in the rhizosphere of wheat / L.S. Thomashow, D.M. Weller, R.F. Bonsall, L.S. Pierson // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 908-912.

179. Tilman D. Forecasting agriculturally driven global environmental change / D.Tilman, J. Fargione, B. Wolff, C. D'Antonio, A. Dobson, R. Howarth //Science.- 2001, № 3 P. 281-284.

180. Torres L. Isolation and characterization of an Fe (3) chelating compound produced by Pseudomonas syringae /L. Torres// Appl. and Environ. Microbiol.- 1986.-52, № 1.-P. 157 - 160.

181. Tosi L. Evolution of some and bacteria for potential control of saf-flower rust / L. Tosi, A. Zazzerini // J. Phytopathol. 1994, № 2. - P. 131140.

182. Trolldenier G. Effect of aeration statud of nutrient solution on microorganisms, mucilage and ultrastructure of wheat root / G. Trolldenier, Ch. Hecht-Buchhols//Plant. Soil. 1984. - V. 80.-P. 381-390.

183. Vasantha D.T. Biological control of sheath-blight of rice in India with antagonistic bacteria / D.T. Vasantha, V.R. Malar, N. Sakthivel // Plant and Soil. 1989. - V. 119, № 2. - P. 325-330.

184. Viswanathan R. Induced systemic resistance by fluorescent pseudo-monads against red rot disease of sugarcane caused by Colletotrichum falca-tum / R. Viswanathan, R. Samiyappan // Crop Protection. 2002. V.21, №1. -P. 1-10.

185. Watanabe T. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution / T. Watanabe, R. Kanai, T. Kawase, T. Tanabe, M. Mitsutomi, S. Sakuda // Microbiology. 1999. - V. 145. - P. 3353-3363.

186. Wei G. Induction of systemic resistance of cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of growth-promoting rhizobacteria / G. Wei, J.W. Kloepper, S. Tuzun // Phytopathology. 1991. - V.81. - P. 15081512.

187. Weller D.M. Antibiotics: Evidence for their operation and sites where they might be produced / D.M. Weller, L.S. Thomashow // J.Cell. Biochem. 1989. — Suppl. 13A.-P. 154.

188. Weller D.M. Microbial populations responsible for specific soil sup-pressiveness toplant pathogens / D.M. Weller, J.M. Raaijmakers, B.B. Mc Spadden Gardner, L.S. Thomashow // Annu. Rev. Phytopathol. 2002. - V. 40.-P. 309-348.

189. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere / J.M. Whipps // J. Experim. Botany. 2001. - V. 52. - P. 487-511.

190. Wilson C.L. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria / C.L. Wilson, E. Chalutz // Sc. Hortic. 1989. - Vol. 40, №> 2. - P. 105-112.

191. Wieland G. Variation of microbial communities in soil rhizosphere, and rhizoplane in response to crop species, soil type, and crop development / G. Wieland, R. Neumann, H. Backhaus // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. V. 67, №12. P. 5849-5854.

192. Yang C-H. Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status / C-H. Yang, D.E. Crowley // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 345-351.

193. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas — Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier / J. Zaspel// Arch. Phytopathol. Pflzschutz. 1989. - Bd. 25, H. 2. -S. 123-130.

Информация о работе

Лукаткин, Андрей Александрович
кандидата биологических наук
Саранск, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение бактериального препарата на основе жидкой фракции послеспиртовой барды и исследование его антифунгальных свойств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы