Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт"

На правах рукописи

Мордвинова Екатерина Михайловна

БИОКОНВЕРСИЯ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ В БЕЛКОВЫЙ КОРМОВОЙ ПРОДУКТ

Специальность: 03.00.23 - «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п з я ИВ "003

Москва 2009

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».

Научный руководитель: - Сергеева Алла Владимировна,

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: - Градова Нина Борисовна,

доктор биологических наук, профессор - Вольфович Давид Исаакович,

кандидат технических наук

Ведущая организация: ОАО «ГосНИИСинтезбелок» («Государственный Научно-Исследовательский Институт Биосинтеза Белковых Веществ»)

Защита состоится 17 февраля 2009 года в Ю30 на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд.443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан «^>> 2009г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета ДМ 212.204.13 кандидат технических наук

И.В.Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Биоконверсия возобновляемого растительного сырья в топливо, кормовые и пищевые продукты, полупродукты для химической и микробиологической промышленности рассматривается в настоящее время как одна из ключевых отраслей биотехнологии. Ферментативное превращение целлюлозы перспективно не только с точки зрен;:ч создания самостоятельных малоотходных технологий, но и с позиции снижения экологической опасности различных производств, перерабатывающих растительное сырье и образующих большое количество отходов.

Для России утилизация послеспиртовой барды всегда была актуальной проблемой. Получение спирта методами брожения сопровождается образованием в процессе производства послеспиртовой барды. Типовой завод по производству этанола мощностью 3000 дал в сутки должен утилизировать, перерабатывать или реализовывать ежесуточно порядка 340-350 тонн жидкой барды. По экспертным оценкам, в настоящее время в России годовой объем производимой барды составляет примерно 700 млн. дал, причем из них перерабатывается не более 5%. Невостребованную барду большинство предприятий стараются слить в близлежащие водоемы либо на поля, что серьезно ухудшает экологическую ситуацию вокруг спиртовых заводов. Проблема усложняется тем, что барда - это скоропортящаяся жидкость, которая заражается посторонней микрофлорой в течение нескольких часов.

Вопрос переработки послеспиртовой барды сегодня становится не менее важной и экономически привлекательной задачей, чем производство самого спирта. Организация переработки барды в эффективный белково-витаминный продукт будет способствовать организации нового высокорентабельного бизнеса производства кормовых продуктов, спрос на которые в мире превосходит предложение.

Поэтому исследования по решению проблемы биоконверсии послеспиртовой барды в микробный протеин с использованием непатогенных нетоксичных бактерий является весьма актуальным.

Цель работы - разработка технологии переработки послеспиртовой барды в богатый белком кормовой продукт путем культивирования бактерий Се11и1отопав е$и$а.

Основные задачи

- разработать условия культивирования Се!Ыотопаг с//и5'а в лабораторных условиях на цсллюлозосодержащих субстратах;

- разработать оперативный, удобный метод определения целлюлолитической активности у культуры Се11и1отопси е)]та для проведения селекционных работ;

- получить мутанты с увеличенной целлюлолитической активностью;

- разработать технологию выращивания культуры СеШЛотопся е//юа в промышленных условиях на целлюлозосодержащих субстратах с получением белково-витаминного кормового продукта с использованием мутантного штамма;

- разработать аппаратурно-технологическую схему производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.

Научная новизна

- Модифицирована оригинальная методика определения целлюлолитической активности для одновременной проверки большого числа клонов при проведении селекционных работ.

- После обработки исходного штамма мутагеном ^метилмочевиной получен мутгштныи штамм, характеризующийся повышенным синтезом целлюдолитических ферментов.

- Получен мутантный штамм К-27 ПО* , резистентный к 5 мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, и характеризующийся повышенным синтезом целлюдолитических ферментов.

- Впервые в России при микробной переработке послеспиртовой барды использовали непатогенные, не спорообразующие бактерии рода СеИиктопаз, которые эффективно осуществляют биоконверсию целлюлозосодержащих субстратов в микробный протеин.

Практическое значение работы

-Проведена апробация новой технологии переработки послеспиртовой барды и промышленная наработка белково-внтаминного кормового продукта «Мудьтиприн» на спиртовых заводах в г. Ливны (ОАО «Этанол») и в г. Бутурлииовка (ООО Спиртзавод «Пираква»),

- Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология ферментации моп'т быть использованы для организации на спиртовых заводах линий по переработке барды с получением различных кормовых продуктов.

- Разработана аппаратурно-технодогическая схема производства кормового белка на основе послсспиртовой барды.

- Показано, что с помощью разработанной технологии может быть получен высокобелковый кормовой продукт «Мультицрин»

Аиробагцгя работы Результаты диссертационной работы докладывались: на 11-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых: Биотехнология - наука XXI век, Пущшго, 2008 г.; на 2-й Бнотехнологической выставке-ярмарке РосБиоТех - 2008. Результаты работы, представленные на РосБиоТех - 2008, удостоены серебряной медали.

Публикации По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы и 2 патента, из них 1 - статья в реферируемом журнале, 2 - тезисы научных конференций.

Структура и объем работы Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, экономическая оценка применения новой технологии биоконверсии послеспиртовой барды в кормовой продукт, список литературы. Диссертация изложена на 140 страницах текста, содержит 33 таблицы и 24 рисунка; список литературы включает 131 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, указан личный вклад соискателя.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В обзоре литературы описаны микроорганизмы - продуценты микробной биомассы и характеристика белоксодержащей биомассы. Представлена структура и свойства целлюлозосодержащих субстратов. Изложены ферментативная и микробная деструкция целлюлозы. Обобщены и проанализированы работы, посвященные исследованию продукции целлюлаз различными микроорганизмами. Описан биосинтез ферментов цеддюлазного комплекса у бактерий рода Се11и1ототп и

оптимальные условия для продукции целлюлаз и клеточной массы при глубинном культивировании этой культуры. Изложены характеристика и способы утилизации послеспиртовой барды. Анализ литературных данных позволил сформулировать цель и задачи данного исследования.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работу проводили на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология» МГУИЭ.

Объектом исследования являлись штаммы СеШйотопач е/й^а: видовой штамм из ВКПМ В-4465 и полученные на его основе мутанты. Глубинное культивирование проводили в качалочных колбах объемом 750 мл (100 мл) среды на ротационных качалках (220 об/мин), в лабораторном ферментере «ВЮТЕС» объемом 3 л (при перемешивании мешалкой турбинного типа, 400-500 об/мин., расход воздуха 0,5-1,0 об/об) при температуре 30±ГС и в промышленных аппаратах объемом 30 м3 и 100 м3. Мутанты культуры СеШЛотопск е([иха были получены при обработке коллекционного штамма мутагеном Ы-метилмочевиной. На следующей ступени был получен мутант, устойчивый к 5 мг/мл дезоксиглюкозы. Содержание сырого протеина определяли методом Къельдаля. Содержание сырой клетчатки определяли по ГОСТ 13496.2-91. Целлюлолитическую активность тестируемых вариантов Се1Шотопси определяли методом диффузии ферментов в агар с Ыа-карбоксиметилцеллюлозой. Титр жизнеспособных клеток СеИхйотопая е/^а оценивали методом высева на твердые питательные среды (Пименова М.Н.,1971). Аминокислотный анализ культуральной жидкости и проб белково-витаминного препарата проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель 105» (фирма «Люмекс»). Оптимизацию ферментационной питательной среды проводили с использованием метода Бокса-Уилсона. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений (Бирюков В.В., 2004).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Технология культивирования СеПиктопаз е/^а в лабораторных условиях 3.1.1. Подбор состава посевной питательной среды для культивирования Се!1и1отопа.ч еАша и времени выращивания посевного материала

Для выращивания посевного материала I генерации была подобрана посевная среда ПС-1 следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5; №N03 - 1; (Ш4)2НР04 - 1; КС1 - 0,5; А^804><7Н20 - 0,5; глюкоза - 1.

Также было определено оптимальное время выращивания посевного материала в колбах и в ферментере. Установлено, что характер нарастания титра клеток в посевной среде при культивировании в колбах и в ферментере имеет различный характер.

Рис.1. Увеличение титра клеток Се\1и1отопа$ е^ша в посевной среде в зависимости от способа и длительности культивирования.

На рис.1 показано, что в ферментере титр клеток уже к 48 часам роста

достигает своего максимума 1,5хЮ'0КОЕ/мл и в дальнейшем существенно не

меняется, в то время как в колбах тигр нарастает постепенно и достигает своего

максимума !,8хЮ10КОЕ/мл только к 3-м суткам роста.

Время выращивания посевного материала I генерации в колбах составляет 72

часа, в то время как при культивировании в ферментере максимальный титр

жизнеспособных клеток наблюдается через 48 часов культивирования.

3.1.2. Культивирование посевного материала II генерации

Как известно, культура СеПЫотопав е/Хша синтезирует в процессе целлюлазы,

максимум которых при глубинном культивировании определяется после 56-72 часов

роста. Известно, что сигналом к начал}' синтеза целлюлолитических ферментов для

культуры служит присутствие в среде целлюлозосодержащих субстратов. Для

получения качественного посевного материала II генерации была разработана

посевная среда ПС-И следующего состава (%): ЦСС (барда) по сухому весу - 1,0;

(Ш4)2НР04 - 0,3; мочевина - 0,2.

Также было установлено, что оптимальное время выращивания посевного

материала II генерации в колбах и в ферментере составляет 24 часа (табл.1, рис.2).

При засеве 24-часовой посевной культурой II генерации перерабатываемой барды

содержание протеина в культуральной жидкости составляло 34,8%.

Таблица 1. Оптимизации времени выращивания посевного материала

Время, Титр клеток в Сод-ние

часы К.Ж., сырого

хЮ9КОЕ/мл протеина в

К.Ж., %

-./ 24 -М2:.- 34,8

48 4,5 32,5

72 4,6 34,1

96 9 35,0

Рис.2. Рост культуры в лабораторном ферментере в посевной среде II генерации и характеристика ее способности накапливать сырой протеин. 3.1.3. Оптимизация ферментационной питательной среды

Из литературных данных известно, что для культивирования Се11и1отопав наиболее подходящим азотным источником является минеральный азот, предпочтительнее - (>№[4)2804 или мочевина, в качестве источника фосфатов -(Ш4)2НР04и№С1.

Для разработки сбалансированной ферментационной питательной среды (Ф), была проведена оптимизация питательной среды методом крутого восхождения Бокса-Уилсона. Оптимизацию проводили по следующим компонентам ФС: диаммоний фосфат, мочевина и хлористый натрий. Целлюлозосодержаший субстрат - послеспиртовая барда, является основой ферментационной среды, независимо от ее состава и происхождения, поэтому этот компонент, как фактор в матрице не учитывался. Интервал варьирования факторов был выбран таким образом, чтобы разница между верхним и нижним уровнями заметно сказывалась на концентрации образовавшегося сырого протеина в среде. Каждый результат являлся средним арифметическим значением, полученным из 3-х колб. Оптимизацию проводили по концентрации сырого протеина в культуральной жидкости после 3-х суток ферментации. В результате мочевина и диаммоний сульфат оказались значимыми компонентами, изменение концентраций которых в среде влияет на образующийся в культуральной жидкости протеин.

По результатам проведенной оптимизации была выбрана среда, которая обеспечивала накопление сырого протеина до 39%, а клетчатка при этом не

превышала 5,6%.

Разработанная ферментационная среда Ф, способствующая максимальному образованию микробного белка через 3 суток ферментации, содержит следующие соли (%): мочевина - 0,3, (ЫН4)2НР04 - 0,4, барда до 100%. 3.1.4. Предобработка целдюлозосодсржащсго сырья

Реакционная способность природного целдюлозосодсржащсго сырья (ЦСС) при ферментативном гидролизе очень низкак, поэтому возникасг необходимость предварительной обработки ЦСС с целыо разрушения кристаллической структуры целлюлозы и увеличения ее поверхности.

Были исследованы химические (изменение кислотности субстрата и затем воздействие высоких температур) и механические способы предобработки ЦСС.

Как видно из данных, приведенных в таблице 2, кислотная обработка не приводит к увеличению белка в культуралыюй жидкости, и это связано с угнетением роста культуры (низкие титры жизнеспособных клеток). Из литературных источников известно, что при высоких температурах с кислотами лигнин образует токсичные фенольные соединения, угнетающие рост микроорганизмов.

Напротив, щелочная предобработка не приводит к глубокому гидролизу ЦСС, а способствует разрыхлению кристаллической решетки целлюлозы, увеличению доступности целлюлозы , и гемицеллюлозы для ферментов деструктирующих бактерий. Такой способ не требует специального оборудования и дополнительных средств: достаточно в обрабатываемом субстрате довести рН до 9,0-10,0 40%-ным раствором едкого натра и прогреть его в течение 1 часа. Таблица 2.

Влияние кислотности ферментационной среды

Вариант среды К Предобработка НгвС^ Предобработка ЫаОН

рН среды 7,1 2,5 3,5 4,5 8 9 10 11

Титр, *Ю10 КОЕ/мл 5 0,07 0,09 0,1 3 10 9 9

Сырой протеин, % 34,5 29,9 29,8 29,3 36,8 37,4 37,4 37,1

Прим. Доверительный интервал среднего значения: для Т= ±5,6%, доя сырого протеина = ±1,2%.

Подщелачивание барды до рН 9-10 перед тепловой обработкой позволяет увеличить содержание белка в кормовом продукте на 7-8%.

7

Ги^родинамкчесхиЗ генератор акгсыческкг колебаний»

Мономе 1р

Механическая предобработка

заключалась в обработке ЦСС на ультразвуковой установке

/венпыь ........

/рв/ул*рою1«ы1> гидродинамического типа (ГДУ), схема которой представлена на рис.3.

Рис.3. Схематическое изображение гидродинамической ультразвуковой установки.

Результаты обработки барды на ГДУ, показанные в таблице 3, свидетельствуют о механической деструкции целлюлозы, на что указывает снижение клетчатки (с 12,0% до обработки до 10,8% после) и снижение остатка на сите. При этом в барде, обработанной на ГДУ, количество общих редуцирующих веществ повышается за счет высвобождения крахмала, связанного с кристаллической решеткой целлюлозы.

Таблица 3.

Сравнительная характеристика послеспиртовой барды

Послеспиртовая барда СВ, % РВ, % ОРВ, % Ксиланы, % Клетчатка, % Остаток на сите 100 мкм, %

без обработки на ГДУ 6,7 0,3 2,15 1,48 12,0 1,33

после обработки на ГДУ 6,7 од 2,77 1,46 10,8 0,87

На послеспиртовой барде без обработки и после обработки на ГДУ были проведены ферментации. Через трое суток культивирования в культуральной жидкости были определено содержание сырого протеина.

Таблица 4.

Влияние времени предобработки ЦСС на ГДУ при различной кислотности на образование микробного протеина культурой Се11и1отопаз е^та

Суспензия ЦСС с рН = 7,0 Суспензия ЦСС с рН = 10,0

Время, мин. 0 1 5 15 30 0 ] 5 15 30

Содержание сырого протеина в К.Ж., % 33,5 33,5 34,1 34,4 34,3 34,5 36,0 36,7 38,2 37,9

Прим. Доверительный интервал среднего значения для сырого протеина = ±1,3%.

Таким образом, для дальнейшей работы был выбран вариант предобработки на гидродинамической установке в течение 15 минут с предварительным доведением рН до значения 10.

Было проведено ко 2 ферментации в лабораторном ферментере с натипной бардой без обработки па ГДУ и с бардой, предварительно

обработанной на ГДУ в выбранном режиме. Результаты проведенных ферментации показаны на рис.4.

Рис. 4. Влияние обработки послсспиртовой барды на установке ГДУ на накопление сырого протеина и деструкции клетчатки при последующем культивировании Се/Ыотои<м effii.ua в лабораторном ферментере.

Обработка ЦСС на гидродинамической установке в течение 15 минут

приводит к увеличению эффективности деструкции целлюлозы культурой

СеНиЬтопая е$ияа, и способствует дополнительному (10-12%) образованию в

конечном продукте микробного протеина и снижению клетчатки на 7,5%.

3.2. Разработка метода определения целлюлолитической

активности у культуры Се11и1отопаз е//та

Важнейшая роль в деструкции целлюлозы принадлежит эндоглюканазам.

Поэтому было необходимо разработать удобный метод определения

эндоглюканазной активности, позволяющий проверять большое количество

отобранных вариантов.

Известно, что взаимодействие красителя конго-красного с полисахаридом,

содержащим связи Р(1.4) или (3(1.3) дает комплекс насыщенного красного цвета,

образование которого предотвращается действием (З-глюканаз. Этот феномен

приметают в чашечном методе диффузии в агар для выделения мутантов с

целлюлолитической активностью и дифференциации эвдо- и экзоглюканазных

активностей.

3.2.1. Подбор питательных сред для разработки методики определения целлюлолитической активности методом с красителем конго-красным

Для разработки методики определения целлюлолитаческой активности у СеНиЬтопаз еДиьа были подобраны посевная среда ПС-2 состава (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5; №Ы03 - 1; К2НР04 - 1; КС1 - 0,5; МеБО^НяО - 0,5; глюкоза - 1 и ферментационная питательная среда ФС-1, состава (г/л): микрокристаллическая целлюлоза - 10; К2НР04- 1;К'аЖ)3 - 1; КС1 - 0,5; Мё304*7Н20 - 0,5.

Было установлено, что выбранные среды не оказывают влияние на результат-определения эндоглюканазной активности методом с красителем конго-красным. 3.2.2. Подбор оптимальных параметров проведения анализа по определению целлюлолнтической активности

При разработке данного метода были подобраны оптимальные значения дозы культуральной жидкости, закапываемой в лунки, рН агаризованной среды с Ка-КМЦ,

температуры диффузии, времени диффузии, времени

выращивания культуры

Се11и1отопаз еЛ~ша на среде с микрокристаллической целлюлозой. Результаты

представлены на рисунках 5 и 6.

кислотности агаризованной среды для культуры разного возраста.

Следующим шагом после подбора оптимальных условий проведения исследования было предложение заменить чашки Петри на пластиковые лотки фирмы «Coning».

Рис.6. Зависимость величины зон просветления от температуры диффузии.

! в 3 суток роста и 4 суток роста п 5 суток роста

Рис.5. Зависимость диаметра зон просветления от

В результате проведенной работы был предложен новый метод определения целлюлолитмческой активности у Cellulomonas effusa и выбраны следующие параметры проведения анализа:

1. Для культивирования штаммов Cellulomonas effusa выбраны посевная среда IIC-2, и ферментационная среда ФС-i. Культивирование осуществляют при t=30±l°C в колбах в течение 4-х суток;

2. Оптимальное значение рН агаризованнон среды с Na-КМЦ составляет 6,5. Среда готовится на фосфатном буфере; доза супернатаита кудьтуралыюй жидкое™, закапываемой в лунки, составляет 200 мкл; диффузия проводится в термостате при температуре 37°С; время диффузии составляет 16-18 часов.

3. Модифицированная оригинальная методика с применением краен ¡ai я конго-красного для определения целлюлолитичсской активности позволяет одновременно тестировать до 57 вариантов на одном лотке Расчет эндоглюканалюй активности осуществляют с применением компьютерной программы Excel по npoipaMMC разработанной к.т.н. Зубовым Д.В.(МГУИЭ).

3.3. Получение мутантов с увеличенной целлюлолитической активностью 3.3.1. Получение мутантов культуры Cellulomonas effusa с помощью мутагена N-метилмочевинм (NMM)

Для получения мутантов с повышенной целлюлолитичсской активностью применяли мутагенез с различными концентрациями (100, 250, 500, 1000 мкг/мл) N-метилмочевины. После экспозиции клетки дважды отмывали от мутагена и высевали на среду LB, как показано на схеме мутагенеза на рис.7.

Проверку отобранных вариантов с повышенной целлюлолитической активностью проводили по методике с конго-красным. По максимальным зонам просветления были отобраны 3 клона, с которых приготовили мастеры (все после мутагенеза с 1000 мкг/мл NMM), из которых далее осуществлялся отбор мутантов с высокой целлюлолитической активностью.

Приготовление суспензии клеток _Т= 4* 10п КОЕ/мл_

Контроль

Прокаченный

К-метилмочевина

(№/1М), мкг/мл

Чашки

ПК

—«-

II

ж

III

Моноклоновый рассев

Тестирование популяции вариантов, выбор мутанта для дальнейшей работы

Мутант К-27 У

Мутант К-27 ООй Рис.7. Схема проведения мутагенеза.

Культуру вариантов № 1, 2 и 3 рассевали на отдельные колонии и затем тестировали на изменчивость по признаку целлюлолитической активности, данные показаны на рис. 8 а), б), в).

13,0- 13,6- 14,1- 14,6- 15,0- 15,513,5 14 14,5 15 15,5 16 Диаметр зон просветления, мм

15-15,6 15,6-16 16.1-

16,6-

17,1- 17,6-18

16,5 17,0 17,5 Диаметр зон просветления,мм

16,5-17 17,1-17,5 17,6-18 18,1-18,5 18,6-19 Диаметр зон просветления, мм

8)

б)

Таким образом, тестировали по 110 - 130

I

; отобранных колоний из монокяоновых рассевов вариантов №1, 2 и 3. В каждой гистограмме (рис.8) диаметр зон просветления для контроля показан стрелкой. Было обнаружено, что только в моноклоновом рассеве 3 варианта более 90% популяции имеет зоны просветления больше, чем у таковой в контрольном варианте. Для дальнейшей работы отобрали только 3-й вариант.

I Рис.8, Гистограмма изменчивости по признаку активности целлюлолитических | ферментов у вариантов: а) №1, б) №2, в)ЖЗ.

Для характеристики полученного мутанта была определена его чувствительность к ряду антибиотиков по сравнению с исходной культурой (см. таблиц)' 5).

Таблица 5.

Чувствительность к антибиотикам исходного коллекционного штамма и полученного мутанта К-27 Се11и1отопаз еЛГша_

Диски антибиотиков Диаметр зон подавления роста, мм

Исходный штамм Мутант №3

Диаметр зон Чувствит. Диаметр зон Чувствит.

олеандомицин 9Д + 9,79 +

доксициклин 13,5 + 24,66 ++

тетрациклин 8,1 26,02

гентамицин - не чувств. 12,45 +

эритромицин 13,0 + 19,25 +

левомицитин 16,1 + 20,84 +

стрептомицин 9,4 + 18,98 -н-

канамицин - не чувств. - не чувств.

Было установлено, что исходная культура СеПиЬтопая е$[та характеризуется устойчивостью к гентамицину и капамицину. Выделенный мутант сохранил нечувствительность только к канамицину, однако, к ряду антибиотиков чувствительность его увеличилась (тетрациклину, доксициклину и стрептомицину).

Таким образом, отобран мутант Се11и1отопаз е$и.ча К-27, отличающийся от исходного штамма увеличенной целлюлолитичекой активностью и специфической чувствительностью к ряду антибиотиков.

3.3.2. Получение мутантов культуры Се11и1отопаз е/Гма, устойчивых к дезоксиглшкозе

Известно, что наличие в среде легкодоступных источников углерода у культуры рода СеНиЬтопаа репрессирует синтез целлюлолитических ферментов. Поэтому для получения мутанта, способного синтезировать целлюлолитические ферменты в присутствии небольших количеств Сахаров провели селекцию с использованием аналога глюкозы - дезоксиглюкозы методом градиента концентрации на средах М (с глюкозой) и М1(с целлюлозой).

Отбор мутантов с повышенной целлюлолитичекой активностью осуществляли по методике с конго-красным (п.2.9). Данные показаны на рисунке 9 а) и б).

После инкубирования чашек были отколоты отдельные колонии из зоны максимальных концентраций Бв, которые использовали для приготовления «мастеров».

4540 +353025 • 20 ■ 15 ■ 105 ■

16,7-18,2 19,3-19,8 19,3-20,4 20,5-21 Диаметр зон просветления, мм

Для дальнейшей проверки отобраны варианты с диаметром зон большим, чем }' контрольного варианта, а)

50 •

40 • 30 ■

20 •

10 -

18,7-19,2 19,3-19,8 19,9-20,4 20,5-21 21-21,5 Диаметр зон лросаетления, мм

б)

Рие.9. Гистограмма изменчивости по признаку целлюлолитической активности у мутантов: а) среда М; б) среда Ml.

Стрелкой отмечен диаметр зон просветления у контрольного варианта.

Для определения численного значения активности эндоглюканаз использовали коммерческий препарат «Вискозим» с известной целлюлолитической активностью -102 Нд'г. Вискозим — это комплексный ферментный препарат, полученный при культивировании Aspergillus sp.

По максимальной активности эндоглюканаз был выбран вариант, превышающий таковую активность у исходного штамма в 3,8 раза и в 2,3 раза у К-27. Для установления пороговых концентраций глюкозы, угнетающих синтез эндоглюканаз, посевной средой, полученной из исходного штамма, контрольного К-27 и варианта К-27 DG R были засеяны колбы со средой ФС-1 +0,1% глюкозы, ФС-1 + 0,2% глюкозы, ФС-1 + 0,3% глюкозы. После культивирования в течение 4-х суток, супернатант культуральной жидкости использовали для определения эндоглюканазной активности методом с конго-красным.

Отобран мутантный штамм,

устойчивый к дезоксиглюкозе К-

27 ПО1', характеризующийся

активностью эндоглюканаз

9,03* 10"3 Ед/мл. В то время как,

активность исходного

коллекционного штамма была

определена как 2,37x10'3 Ед/мл,

Рис.Ю.Активность эндоглюканаз в присутствии глюкозы у исходного штамма и мутантов Се11и1отопа.ч е//и.ча.

Установлено, что в присутствии 0,1% глюкозы в среде снижается синтез

эндоглюканаз у исходного штамма и мутанта К-27 в 1,4 и 2 раза соответственно, а

концентрация глюкозы 0,3% у этих штаммов практически ингибирует синтез

целлюлолитичсских ферментов. В то время как, мутантный штамм К-27 в

присутствии глюкозы даже 0,3% синтезировал достаточно высокие концентрации

эндоглюканаз, как видно на рис.10.

3.4. Биоконверсия целлюлозных компонентов послеспиртовой барды

с помощью мутантного штамма К-27 ВС11 в микробный белок

3.4.1. Выращивание культуры СеНиЬтопах е/Наа К-27 РОГч в лабораторном

ферментере на послеспиртовой барде, обработанной на гидродинамической установке

Ферментацию проводили в 3-х литровом стерилизуемом аппарате «ВЮТЕС».

Ферментацию вели отьемно-доливным способом.

В пробах в процессе культивирования определяли титр клеток культуры Се11и1отопа.ч е//и.ча, затем пробы высушивали и в них определяли сырой протеин, клетчатку и ксиланы (см. рис. 11 и 12).

Рис.11. Изменение титра клеток культуры СеПиЬтопая е//иаа при отьемно-доливном способе культивирования.

я о

0,1

0,2

---К-27 й 03

.....Исх.штамм

-К-27

0,3

Глюкоза, %

Часы роста

О 8 16 24 32 40 48 56 S4 72 80 88 96

j

Часы роста| - сырой протеин j

- клетчатка---ксиланы

Титр клеток культуры СеИи1отопа$ е$и$а растет на всем протяжении ферментации и достигает на 96 часов роста 1,2*101'КОЕ/мл (рис.11). Содержание белка в культуральной жидкости

повышается с 25,9% до 45,1%. Ксиланы утилизируются культурой практически полностью (с 1,46% до

0,14%). Клетчатка снижается с 6,7% до 4,7%.

Рис.12. Изменение количества сырого протеина, ксилапов и клетчатки при отьемно-доливном способе выращивания культуры Cellulomonas effusa.

3.4.2. Выращивание культуры Cellulomonas effusa К-27 DGR в промышленном аппарате объемом 30 м3 на послеспиртовой барде

Как известно, посдеспиртовая барда, образующаяся в процессе получения этилового спирта, характеризуется низкой питательной ценностью из-за высокого содержания клетчатки и низкого содержания белка и незаменимых аминокислот. Нами была предложена новая технология, позволяющая снизить содержание клетчатки и повысить содержание сырого протеина.

На спиртовом заводе в г.Ливны (ОАО «Этанол) была проведена наработка готового препарата - белково-вигаминного кормового продукта «Мультиприн» в промышленном аппарате объемом 30 м3 (см. таблицу 6).

Как видно из таблицы 6, содержание сырого протеина повысилось до 54,6%, а содержание клетчатки снизилось до 5,6%.

3.4.3.Выращивание культуры Cellulomonas effusa К-27 DGR в промышленном аппарате объемом 100 м3 на послеспиртовой барде

На спиртовом заводе в г. Бутурлиновка ООО «Спиртзавод «Пираква» были проведены испытания разработанной технологии биоконверсии послеспиртовой барды в кормопродукт в промышленном аппарате объемом 100 м3.

В результате двух проведенных фермеатаций была получена партия белково-витаминного кормового продукта «Мультиприн» в количестве 1750 кг (акт о проведении работ прилагается). Образец полученного кормового продукта был

исследован в независимой испытательной лаборатории «ПРОВИЛАБ» ООО «ПРОВИМИ» (протокол испытаний № 1659 от 11.11.2008 г.).

Таблица 6.

Характеристика кормоиродукта «Мультиприн»

№ № пп Показатель ОАО «Этанол» ООО «Пираква»

Исходная барда Мультип рин Исходная барда Мультип рин

1 Влажность, % 93,3 5,2 93,1 8,0

2 Сырой протеин, % 30,4 54,60 29,0 43,93

3 Истинный протеин по методу Барнштейна, % 20,2 33,2 19,9 32,42

4 Сырая клетчатка, % 9,0 5,6 8,4 5,7

5 Массовая доля золы, % 13,5 17,2 5,7 9.9

6 Зола, нерастворимая в кислоте, % - - 0,18 0,33

7 Массовая доля жира, % - 2,8 - 3,08

8 Массовая доля кальция, % 1,25 - 1,57

о J Массовая доля фосфора, % 1,56 1,4

Массовая доля основных аминокислот. %

10 Треонин - 1,10 - 1,36

11 Цистеин - 0,84 - 0,97

12 Метионин - 0,66 0,57

13 Лизин - 1,34 1,52

Сумма аминокислот - 29,08 - 32,74

3.5. Аппаратурно-технологичсская схема процесса получения кормового белка на основе послеспнртовон барды

В результате проведенных лабораторных и промышленных исследований была разработала аппаратурно-технологнческая схема процесса биоконверсии послеспиртовой барды в белково-витамшшый кормовой продукт (см. рис.13).

Рис.13. Технологическая схема (ТФ-твердофазная фракция; ЖФ - фугат).

Предлагаемая технология делает биоконверсию целлюлозосодержащих отходов экономически выгодным процессом, решает экологические задачи по утилизации загрязняющих природу сбросов, а также позволяет рационально использовать возобновляемые растительные ресурсы.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ В КОРМОВОЙ ПРОДУКТ

В таблице 7 представлен расчет годовой прибыли при использовании новой технологии переработки послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт и технологии переработки барды в «ВВС8».

Таблица 7.

Сравнительные технико-экономические показатели переработки барды в «В0С8» и белковый кормопродукт «Мультиприн» по новой технологии для ___спиртовых заводов производительностью 3000 дал/сутки_

Наименование Единицы измерения Сухой продукт

БОвЗ Мультиприн

Суточный выпуск продукции т. 27,2 24,2

Годовой выпуск продукции т. 8296 7381

Себестоимость 1 т. продукции руб. 1850 9650

Рыночная цена 1 т. продукции руб. 3000 16000

Годовой объем реализации в денежном выражении тыс. руб. 24888 118096

Прибыль в год тыс. руб. 9540 46869

Из таблицы 7 видно, что при использовании новой технологии прибыль увеличивается почти в 5 раз по сравнению с использованием технологии получения «БВ08».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Модифицирована оригинальная методика определения активности эндоглюканаз для селекции культуры СеШйотопаи, позволяющая одновременно тестировать большое количество вариантов. Установлены оптимальные параметры проведения анализа по определению эндоглюканазной активности.

2. Разработана питательная среда для получения посевного материала I генерации. Показана целесообразность использования посевной среды II генерации с добавлением целлюлозосодержащего субстрата (как стартера синтеза целлюлаз) для эффективной биоконверсии послеспиртовой барды в кормовой продукт. Подобрана и опгимизирована ферментационная среда на основе барды для культивирования Се11и1отопаз е/Нип в лабораторных и промышленных условиях.

3. Показано, что щелочная предобработка ферментационной питательной среды наиболее результативна для обеспечения лучшей утилизации целлюлозосодержащих субстратов за счет разрыхления целлюлозной структуры. Подщелачивание барды до рН 9-10 перед тепловой обработкой позволяет увеличить содержание белка в кормовом продукте на 7-8%.

4. Продемонстрировано, что предобработка подщелоченной (рН=10) послеспиртовой барды на гидродинамической установке в течение 15 минут способствует при культивировании Се11и1отопа$ е^исг дополнительному (10-12%) образованию микробного белка в кулиуральной жидкости. При этом эффективность деструкции целлюлозы культурой увеличилась на 7,5%.

5. Получен мутант СеШйотопав <$и$а К-27 после мутагенеза с Ы-метилмочевиной, у которого ахтивность эндоглюканаз на 40% выше, чем у исходного штата.

6. Полученный штамм К-27 ШЗК, устойчивый к 5мг/мл дезошгглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, характеризуется активностью эндоглюканаз 9х 10"3 Ед/мл, что в 3,8 раз превышает таковую у исходного штамма.

7. Разработан отьемно-доливной способ переработки послеспиртовой барды культурой СеЛЫотопах К-27 в лабораторном ферментере. Полученная белково-кормовая добавка, характеризуется содержанием 45,1% сырого протеина и 4,7% клетчатки.

8. Проведены промышленные испытания биоконверсии послеспиртовой барды на действующих спиртовых заводах ОАО «Этанол» в г. Ливны в аппарате объемом 30 м3 и ООО Спиртзавод «Пираква»» в г.Бутурлиновка в аппарате 100 м3. Полученный препарат «Мультиприн» содержит 45-54% сырого протеина, 5,6-5,7% клетчатки, незаменимые аминокислоты и микро- и макроэлементы.

9. Предложена безотходная технология переработки нативной послеспиртовой барды без ее предварительного разделения на фракции с использованием мутантного штамма Се1Ыотопа5 е/]та К-27 ОСк, в результате которой получается обогащенный микробным белком кормовой продукт.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мордвинова, Е.М. Использование экспресс-метода определения целлюлолитической активности у изолированных мутантов культуры Cellulomonas sp. / Е.М. Мордвинова, A.B. Сергеева, В.А. Миронов, В.В.Бирюков // Биология - наука XXI века: сб. тезисов 11-й Международ. Путинской школы - конф. молодых ученых. -2007.-С.211.

2. Акопян, В.Б. Обработка ультразвуком оболочек пшеничного зерна / В.Б. Акопян, Е.М. Мордвинова, H.H. Метальникова, A.B. Пасхин, А.В.Сергеева, A.A. Рухман // Научно-технический и производственный журнал «Комбикорма» - №2 - 2008 - С.49-

3. Мордвинова, Е.М. Использование целлюлозоразрушающих бактерий для утилизации послеспиртовой барды с получением белково-витамшшо-минеральной добавки / Е.М. Мордвинова, А.В.Сергеева, Т.А. Жбанова // Доклады молодых ученых и студентов МГУИЭ. - 2008. - С. 18.

4. Заявка на патент № 2007113000/15(014124) Российская федерация, МПК B01F 11/02 (2006.01). Способ получения эмульсий и суспензий. / Рухман A.A., Мордвинова Е.М., Акопян В.Б., Давидов Е.Р., Кузнецова О.В., заяв. от 09.04.2007, положительное решение от 02.06.2008.

5. Заявка на патент РФ № 2008110796. Переработка спиртовой барды в кормовой продукт. / Тулякова Т.В., Мордвинова Е.М., Сергеева A.B., Пасхин A.B. Заяв. от 24.03.2008.

6. Мордвинова, Е.М. Новая технология переработки барды. Биотрансформация в кормопродукт «Мультиприн» / Е.М. Мордвинова, Т.В. Тулякова, A.B. Сергеева, A.B. Пасхин // Ликероводочное производство и виноделие - №2 -2009 - С. ^

50.

Мордвинова Екатерина Михайловна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 30.12.2008 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 3994

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл.13. т. (499) 264-30-73 www.finrablok.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мордвинова, Екатерина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Продукция микробной биомассы.

1.1.1. Микроорганизмы - продуценты микробной биомассы.

1.1.2. Характеристика белоксодержащей биомассы.

1.2. Структура и свойства целлюлозосодержащих субстратов.

1.2.1. Целлюлоза.

1.2.2, Гемицеллюлоза, лигнин и другие, основные компоненты растительной биомассы.

1.3. Ферментативное расщепление целлюлозы.

1.4. Микробная деструкция лигнинцеллюлозы.

1.5. Биосинтез ферментов целлюлазного комплекса у бактерий рода Cellulomonas.

1.6. Регуляция синтеза целлюлаз у бактерий рода Cellulomonas.

1.7. Оптимальные условия для продукции целлюлаз и клеточной массы при глубинном культивировании продуцентов.

1.7.1. Время культивирования.

1.7.2. Влияние рН и температуры.

1.7.3. Роль ростовых факторов для культуры и синтеза ферментов.

1.7.4. Значение дозы посевного материала для роста клеток и синтеза ферментов.

1.7.5. Влияние углеводов на синтез целлюлаз.

1.7.6. Влияние различных источников азота на синтез целлюлаз.

1.7.7. Эффект Твина 80.

1.8. Послеспиртовая барда. Ее характеристика и способы утилизации.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Штаммы, использованные в работе.

2.2. Питательные среды.

2.2.1. Агаризованная среда для проведения селекционных работ, поддержания и хранения культуры

Cellulomonas effusa.

2.2.2. Питательные среды для глубинного культивирования Cellulomonas effusa.

2.2.3. Питательные среды для определения целлюлолитической активности Cellulomonas effusa (ПС-2, ФС-1 и агаризованная среда с Na-КМЦ).

2.2.4. Питательные среды для получения мутации устойчивости к дезоксиглюкозе.

2.3.Хранение, поддержание и глубинное культивирование культуры Cellulomonas effusa.

2.3.1. Культивирование на колбах и в лабораторном ферментере объемом 3 литра.

2.3.2. Получение посевного материала I и II генераций для культивирования в промышленных аппаратах объемом 30 и 100 м

2.4. Приготовление фиксированных мазков.

2.5. Методика проведения мутагенеза для Cellulomonas effusa на растущей культуре.

2.6. Методика получения мутантов, резистентных к дезоксиглюкозе.

2.7. Определение содержания сырого протеина.

2.8. Определение сырой клетчатки.

2.9. Определение целлюлолитической активности.

2.10. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана.

2.11. Определение ксиланов в культуральной жидкости.

2.12. Определение титра клеток культуры Cellulomonas effusa.

2.13. Определение содержания влаги и содержания сухих веществ.

2.14. Контроль стерильности питательных сред.

2.15. Определение аминокислотного состава.

2.16. Оптимизация ферментационной питательной среды.7,

2.17. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Схема экспериментальных исследований.

3.2. Технология культивирования культуры

Cellulomonas effusa в лабораторных условиях.

3.2.1. Подбор состава посевной питательной среды для культивирования Cellulomonas effusa и времени выращивания посевного материала.

3.2.2. Посевной материал II генерации.

3.2.3. Оптимизация ферментационной питательной среды.

3.2.4. Предобработка целлюлозосодержащего сырья.

3.3. Разработка метода определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa.

3.3.1. Подбор питательных сред для разработки методики определения целлюлолитической активности методом с красителем конго-красным.

3.3.2. Подбор оптимальных параметров проведения анализа по определению целлюлолитической активности.

3.4. Получение мутантов с увеличенной целлюлолитической активностью.

3.4.1. Получение мутантов культуры Cellulomonas effusa с помощью мутагена N-метилмочевины (NMM).

3.4.2. Проверка вариантов и отбор мутантов с повышенной целлюлолитической активностью.

3.4.3. Получение мутантов резистентных к дезоксиглюкозе.

3.5. Биоконверсия целлюлозных компонентов послеспиртовой барды с помощью мутантного штамма К-27 DGR в микробный белок.

3.5.1. Выращивание культуры Cellulomonas effusa К-27 DGR в лабораторном ферментере на послеспиртовой барде, обработанной на гидродинамической установке.

3.5.2. Выращивание культуры Cellulomonas effusa K-27DGR в промышленном аппарате объемом 30 м на послеспиртовой барде.

3.5.3. Выращивание культуры Cellulomonas effusa K-27DGR в промышленном аппарате объемом 100 м3 на послеспиртовой барде.

3.6. Аппаратурно-технологическая схема процесса получения кормового белка на основе послеспиртовой барды.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ В КОРМОВОЙ ПРОДУКТ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт"

В последние годы получение новых видов энергии и топлива становится первоочередной задачей для всех стран мира. Биоэтанол (этанол), один из основных видов биотоплива, получают из сахарной свеклы, сахарного тростника, кукурузы, зерновых культур, картофеля и других видов углеродсодержащих растительных субстратов. Мировая потенциальная потребность в биоэтаноле составляет 2 млрд. тонн в год. В настоящее время в мире производится 32 млн. тонн этанола: из них 20 млн. тонн — топливный этанол, 8 млн. тонн — этанол для химической промышленности, 4 млн. тонн — для пищевой промышленности. Химическим синтезом производят 7% этанола, брожением — 93%. Получение спирта методами брожения сопровождается образованием в процессе производства послеспиртовой барды. Так, например, типовой завод по производству этанола мощностью 42000 дал/сут должен утилизировать, перерабатывать или реализовывать ежесуточно порядка 4500-5000 тонн жидкой барды. По экспертным оценкам, в настоящее время, в России годовой объем производимой барды составляет примерно 700 млн. дал, причем из них перерабатывается не более 5%. Невостребованную барду большинство предприятий стараются слить в близлежащие водоемы либо на поля, что серьезно ухудшает экологическую ситуацию вокруг спиртзаводов. Проблема усложняется тем, что барда - это скоропортящаяся жидкость (влажность около 80%) и при температуре 15-30°С становится зараженной посторонней микрофлорой в течение нескольких часов.

Вопрос переработки послеспиртовой барды сегодня становится не менее важной и экономически привлекательной задачей, чем производство самого спирта. Организация переработки барды в эффективный белково-витаминный продукт будет способствовать организации нового высокорентабельного бизнеса производства кормовых продуктов, спрос на которые в мире превосходит предложение.

Можно выделить две основные технологические схемы, которые используются при переработке барды:

Схемы с выпарными станциями для получения «Сухой барды (DDGS)»; Схемы с получением кормовых дрожжей.

Технология «упаривания фугата» в выпарных станциях самая распространенная в мире. Данная технология предлагается, например, шведской компанией «Альфа-Лаваль», датской фирмой «Atlas-Stord», рядом китайских и российских компаний. Однако стоимость выпарных станций и соответственно всего оборудования для утилизации достаточно высокая, процесс выпарки требует значительных энергетических затрат. Не полностью решаются экологические проблемы, т.к. для утилизации «выпара» требуются стационарные очистные сооружения. Все это отрицательно сказывается на себестоимости готовой продукции - сухой барды («DDGS»), главным недостатком которого является несбалансированность получаемого продукта по сырому протеину, так как максимальное его содержание в сухой барде не превышает 24 %. Также высокое содержание клетчатки в сухой барде - до 20%, существенно ограничивает круг его потребителей.

Вторая группа объединяет технологии, предусматривающие предварительную утилизацию Сахаров барды путем культивирования на ней кормовых дрожжей.

Однако, используемые дрожжи рода Candida относятся к условно-патогеннным микроорганизмам с высоким уровнем микологической опасности. Известны случаи заболевания птицы кандидозом при введении в ее рацион питания кормовых дрожжей.

Поэтому исследования по решению проблемы трансформации целлюлозосодержащих компонентов послеспиртовой барды в микробный протеин с использованием непатогенных нетоксичных бактерий является весьма актуальным.

Дели и задачи исследования. Целью работы является разработка технологии переработки послеспиртовой барды в богатый белком кормовой продукт путем культивирования бактерий Cellulomonas effusa. Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи: 1 .Разработать технологию культивирования Cellulomonas effusa в лабораторных условиях на целлюлозосодержащих субстратах;

2.Разработать оперативный, удобный метод определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa для проведения селекционных работ;

3.Получить мутанты с увеличенной целлюлолитической активностью;

4. Разработать технологию выращивания культуры Cellulomonas effusa в промышленных условиях на целлюлозосодержащих субстратах с получением белково-витаминного кормового продукта с использованием мутантного штамма;

5.Разработать аппаратурно-технологическую схему производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.

Научная новизна.

- Модифицирована оригинальная методика определения целлюлолитической активности для одновременной проверки большого числа клонов при проведении селекционных работ.

- После обработки исходного штамма мутагеном N-метилмочевиной получен мутантный штамм, характеризующийся повышенным синтезом целлюлолитических ферментов.

- Получен мутантный штамм К-27 DGR , резистентный к 5 мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, и характеризующийся повышенным синтезом целлюлолитических ферментов.

- Впервые в России при микробной переработке послеспиртовой барды использовали непатогенные, не спорообразующие бактерии рода Cellulomonas, которые эффективно осуществляют биоконверсию целлюлозосодержащих субстратов в микробный протеин.

Практическое значение работы.

- Проведена апробация новой технологии переработки послеспиртовой барды и промышленная наработка белково-витаминного кормового продукта «Мультиприн» на спиртовых заводах в г. Ливны (ОАО «Этанол») и в г. Бутурлиновка (ООО Спиртзавод «Пираква»).

- Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология ферментации могут быть использованы для организации на спиртовых заводах линий по переработке барды с получением различных кормовых продуктов.

- Разработана аппаратурно-технологическая схема производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.

- Показано, что с помощью разработанной технологии может быть получен высокобелковый кормовой продукт «Мультиприн».

Апробация работы.

Работа выполнялась в Московском Государственном Университете

Инженерной Экологии.

Результаты диссертационной работы докладывались: на 11-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых: Биотехнология — наука XXI век, Пущино, 2008 г.; на 2-й Биотехнологической выставкеярмарке РосБиоТех - 2008. Результаты работы, представленные на РосБиоТех - 2008, удостоены серебряной медали.

Публикации.

По материалам работы опубликовано 4 печатные работы, из них 2- тезисы в научных конференциях, 2 - статьи в журналах. Также получено положительное решение о выдаче патента (заявка № 2007113000/15(014124)). Находится на рассмотрении заявка на изобретение «Переработка спиртовой барды в кормовой продукт». Данные работы выполнены с соавторами Сергеевой А.В., Бирюковым В.В., Мироновым В.А., Акопяном В.Б., Туляковой Т.В., Рухманом А.А. и др.

Соискателем были выполнены поставленные задачи исследований, основные экспериментальные исследования, разработаны методики. В определении биохимических характеристик принимали участие Ревякина Т.В., Петрищева О.А. Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой А.В., Бирюковым В.В. Вклад соискателя в работу является определяющим.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мордвинова, Екатерина Михайловна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Модифицирована оригинальная методика определения активности эндоглюканаз для селекции культуры Cellulomonas, позволяющая одновременно тестировать большое количество вариантов. Установлены оптимальные параметры проведения анализа по определению эндоглюканазной активности.

2. Разработана питательная среда для получения посевного материала I генерации. Показана целесообразность использования посевной среды II генерации с добавлением целлюлозосодержащего субстрата (как стартера синтеза целлюлаз) для эффективной биоконверсии послеспиртовой барды в кормовой продукт. Подобрана и оптимизирована ферментационная среда на основе барды для культивирования Cellulomonas effusa в лабораторных и промышленных условиях.

3. Показано, что щелочная предобработка ферментационной питательной среды наиболее результативна для обеспечения лучшей утилизации целлюлозосодержащих субстратов за счет разрыхления целлюлозной структуры. Подщелачивание барды до рН 9-10 перед тепловой обработкой позволяет увеличить содержание белка в кормовом продукте на 7-8%.

4. Продемонстрировано, что предобработка подщелоченной (рН=10) послеспиртовой барды на гидродинамической установке в течение 15 минут способствует при культивировании Cellulomonas effusa дополнительному (10-12%) образованию микробного белка в культуральной жидкости. При этом эффективность деструкции целлюлозы культурой увеличилась на 7,5%.

5. Получен мутант Cellulomonas effusa К-27 после мутагенеза с N-метилмочевиной, у которого активность эндоглюканаз на 40% выше, чем у исходного штамма.

6. Полученный штамм К-27 DGR, устойчивый к 5мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, характеризуется активностью эндоглюканаз 9><10"3 Ед/мл, что в 3,8 раз превышает таковую у исходного штамма.

7. Разработан отъемно-доливной способ переработки послеспиртовой барды культурой Cellulomonas effusa К-27 DGR в лабораторном ферментере. Полученная белково-кормовая добавка, характеризуется содержанием 45,1% сырого протеина и 4,7% клетчатки.

8. Проведены промышленные испытания биоконверсии послеспиртовой барды на действующих спиртовых заводах ОАО «Этанол» в г. Ливны в

-5 аппарате объемом 30 м и ООО Спиртзавод «Пираква»» в г.Бутурлиновка в аппарате 100 м . Полученный препарат «Мультиприн» содержит 45-54% сырого протеина, 5,6-5,7% клетчатки, незаменимые аминокислоты и микро- и макроэлементы.

9. Предложена безотходная технология переработки нативной послеспиртовой барды без ее предварительного разделения на фракции с использованием мутантного штамма Cellulomonas effusa К-27 DGR, в результате которой получается обогащенный микробным белком кормовой продукт.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мордвинова, Екатерина Михайловна, Москва

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. / В.В. Бирюков.-М.: КолосС, 2004. 296 е.: ил. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

2. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. / И.М. Грачева.-2-еизд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1987.-335с.: ил.- (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

3. ГОСТ 13496.2-91. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы анализа.- М.: ИПК Издательство стандартов, 2002.- с. 19-25.

4. Евилевич А.З. Безотходное производство в гидролизной промышленности / А.З. Евилевич, Е.И. Ахмина, М.Н. Раскин. М.: Лесная промышленность, 1982.- с. 4-40.

5. Йиргенсонс Б. Природные органические макромолекулы. М.: Наука, 1965.-с. 556

6. Калунянц, К.А. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов / К.А. Калунянц, Е.Ф. Шаненко, Л.В. Зайцева // Итоги науки и техники: Сер. Химия и технология пищевых продуктов.- М.: ВИНИТИ, 1988.-Т.1.- с. 187.

7. Клесов А.А. Ферментативное превращение целлюлозы / А.А. Клесов // Итоги науки и техники: Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1983.-т. 1.-е. 63150

8. Клесов А.А. Ферментативный катализ / А.А. Клесов М.: Изд-во Московского Университета, 1984. -т.2. - 216 с.

9. Клесов А.А. Ферменты целлюлазного комплекса / А.А. Клесов // Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: МГУ, 1986. - с. 95-136.

10. Комов В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. М.: Дрофа, 2004. -640 с.

11. Кретович B.JI. Введение в энзимологию. / В.Л. Кретович. М.: Наука, 1974.-352 с.

12. Леденев, В.П. Казнить нельзя помиловать. /В.П. Леденев // Ликероводочное Производство и Виноделие.-2007.-№9.-с.10-11

13. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер; под общ. ред. В.А. Энгельгарда, Л.М. Варшанского. В 3-х томах.- М.: Мир, 1986. - с. 1051

14. Лобанок А.Г. Микробиологический синтез белка на целлюлозе / А.Г. Лобанок, В.Г. Бабицкая. Минск: Наука и техника, 1976. -с. 230

15. Марьяновская Ю. В. Микробиологическая деструкция целлюлозосодержащих отходов / Ю.В. Марьяновская, Н.Н. Севастьянова // Учён. зап. института СХПР НовГУ.- 2006.- Т. 14.- в. 3.-Ч.2

16. Никитин В.М. Химия древесины и целлюлозы / В.М. Никитин, А.В. Оболенская, В.П. Щеголев М.: Лесная промышленность, 1978.- с. 367

17. Пименова М.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум) / М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова. Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во Московского Университета, 1971.- с. 223

18. Практикум по биохимии: Учеб. пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. — 2-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во МГУ, 1989.- 509 с.

19. Роговин З.А. Химия целлюлозы / З.А. Роговин М.: Химия, 1972.- с. 520

20. Родионова, Н.А. Ферментативное расщепление целлюлозы / Н.А. Родионова // Сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред В.Л. Кретович). М.: Наука, 1981.- с. 4-40.

21. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов / С.М. Семенов. Справочник.- М.: Агропромиздат, 1990.- с. 240

22. Синицын А.П. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов / А.П. Синицын, А.В. Гусаков, В.М. Черноглазое. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ,1995.- с. 224

23. Фисинин В.И. Рекомендации по применению сухой послеспиртовой барды в рационах сельскохозяйственной птицы / В.И. Фисинин, И.А. Егоров,

24. Н.Н. Паньков, Ш.А. Иманкулов и др. под редакцией В.И. Фисинина, И.А. Егорова, П.Н. Панькова.Сергиев Посад: ВНИТИП,1998 с. 21

25. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель.- М.: Мир, 1972.- с.471

26. Aiba S. Kinetics / S. Aiba, A.E. Humphrey, N.F. Miller // Biochemical Engineering. 2ndEdition.-New York: Academic Press, 1973.-P.92-127

27. Allen, A.L. Cellulase production in continuous and fedbatch culture by Trichoderma reesei MCG 80. / A.L. Allen , R.E. Andreotti //Biotechnol. Bioeng. Symp.-1982- V.12.- P.451-459.

28. Araujo, A. Characterization of cellulolytic enzyme components from Aspergillus terreus and its mutant derivatives. / A. Araujo , J. D'Souza // J. Ferment. Technol.-1986.-V.64.- P.463-467.

29. Biely, P. Microbial xylanolytic systems. / P. Biely // Trends in Biotechnol.-1985.-V.3.-P. 286-290.

30. Boyer, M.H. Carboxymethylcellulase from Erwinia chrysanthemi. Production and regulation of extracellular carboxymethylcellulase. / M.H. Boyer, J.P. Chambost, M. Magnan, J. Cattaneo // J. Biotechnol.- 1984.-V.1.-P. 229-239.

31. Boze, H. Production of food and fodder yeasts. / H. Boze, G. Moulin, P. Galzy // Crit. Rev. Biotechnol.-1992.-V. 12. P.65-86.

32. Breuil, C. Production and localization of cellulases and (3-glucosidase from the thermophilic fungus Thielavia terrestris. / C. Breuil, G.Wojtczak, J.N. Saddler // Biotechnol. Lett.- 1986.-V.8.-P. 673.

33. Brown, J.A. Enhanced enzyme production by the cellulolytic fungus Penicillium pinophilum, mutant strain NTG III/6. / J.A. Brown , S.A. Collin , T.M. Wood // Enzyme Microb. Technol.- 1987.-V.9.-P.176-180.

34. Brown, R.M. Cellulose biosynthesis: model for understanding the assembly of biopolymers./ R.M. Brown, I.M. Saxena // Plant Physiol.Biochem.-2000.-V.38(l).-P.57-67.

35. Chaudhary, P. Purification and characterization of xylanases from Cellulomonas sp. N.C.I.M 2353. / P.Chaudhury, D.N.Deobagkar / /Biotechnol. Appl. Biochem.-1997.-V.25(2).-P. 127-133.

36. Choi, W.Y. Isolation of a cotton wool degrading strain of Cellulomonas: mutants with altered ability to degrade cotton wool. / W.Y. Choi, K.D. Haggett, N.W. Dunn// Aust. J. Biol. Sci.- 1978.-V.31-P.553-564.

37. Chosson, J. Inhibition of cellulolytic activity by lactate in a Cellulomonas uda species. / J. Chosson //Biotechnol. Bioeng. -1987.- V.29 (6).-P.767-769.

38. Choudhury, N. Use of a combined Cellulomonas and Trichoderma cellulose preparation for cellulose saccharification. / N. Choudhury, N.W.Dunn, P.P. Gray // Biotech. Letters-1981 .-V.3(9).-P.493-496.

39. Dekker, R. F. H. Enzymic saccharification of sugarcane bagasse pretrated by autohydrolysis- steam explosion. / R.F.H. Dekker, A. F. A. Wallis // Biotechnol. Bioeng.-1983-V.25-P. 3027-3048.

40. Desai, J.D. Production of cellulase and beta-glucosidase by shake culture of Scytalidium lignicola. / J.D. Desai, N.P. Patel // J. Ferment. Technol.-1982.-V. 60.-P.117-124.

41. Emtiazi, G. Production of thermostable a-Amylase and Cellulase from Cellulomonas sp. / G. Emtiazi, I. Nahvi // Journal of Microbiology and Biotechnology.-2004.- V. 14(6).-P. 1196-1199.

42. Eriksson, K.E. Endo-l,4-/?-gluconases of Sporotrichum pulverulentum. / K.E. Eriksson, B. Petterson // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P. 368-376.

43. Fan, L.T. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose effect of major structural features of cellulose on enzymatic hydrolysis/ L.T. Fan, Y.H. Lee, D.H. Beardmore // Biotechnol.Bioeng.-1980.- V.22.-P. 177-199.

44. Feldman, K.A. Isolation of the cellulase enzymes from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus and regulation of enzyme production. / K.A. Feldman, J.S. Lovett, G.T. Tsao // Enzym. Microb. Technol.- 1988.-V.10.-P.262-272.

45. Fennington, G. Enhanced cellulase production in mutants of Thermomonospora curvata. / G. Fennington, D. Lupo, F. Stutzenberger // Biotechnol. Bioeng.- 1982.-V.24.-P. 2487-2497.

46. Giuliano, C. Conversion of cellulose to sugars by resting cells of a mesophilic anaerobe Bacteriodes cellulosolvens. / C. Giuliano, A.W. Khan //Biotechnol. Bioeng.- 1985.-V.27.-P.980-983.

47. Gokhale, D.V. Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207. / D.V. Gokhale, U.S. Puntambekar, D.N. Deobagkar, J.F. Peberdi //Enzyme Microbial Technol.- 1988.-V.10.-P. 442-445.

48. Golovchenko, N. P. Isolation and characterization of a lichenan-degrading hydrophobic endoglucanase of Clostridium thermocellum. / N. P. Golovchenko, R.N. Singh, G. A. Velikodvorskaya, V.K. Akimenko // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1993.-V.39.-P.7-79.

49. Groleau, D. Cellulolytic activity of the rumen bacterium Bacteroides succinogenes. / D. Groleau, C.W. Forsberg //Can. J. Microbiol.- 1981.-V.27(5).-P. 17-530.

50. Haggett, K.D. Mutants of Cellulomonas which produce increased levels of /?-glucosidase. / K.D. Haggett, W.Y. Choi, N.W. Dunn //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1978.-V.6.-P.189-191.

51. Haggett, K.D. Crystalline cellulose degradation by a strain of Cellulomonas and its mutant derivatives. / K.D. Haggett, P.P. Gray, N.W. Dunn //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1979^-V. 8.-P.183-190.

52. Hitchner, E. V. Use of a cellulase-derepressed mutant of Cellulomonas in the production of a single-cell protein product from cellulose. / E.V. Hitchner, J.M. Leatherwood // Appl. Environmen. Microbiol.-1980.-V. 39(2).-P. 382-386.

53. Ishaque, M. Cellulase complex of mesophilic Streptomyces strain. / M. Ishaque, D. Kluepfel //Can. J. Microbiol.- 1980.-V.26.-P. 183-189.

54. Joglekar, A.V. Studies on cellulose production by Penicillum funicolusum strain in an instrumented fermenter. / A.V. Joglekar, M.C. Srinivasan, A.C. Manchandra, V.V. Vogdand, N.G. Karanth // Enzyme Microbiol. Technol.-1982.-V.5.-P.22-24.

55. Kassim, E.A. Cellulase production by a strain of Myrothecium sp. / E.A. Kassim//J. Ferment. Technol.- 1982.-V.60.-P.381-383.

56. Kassim, E.A. Cellulase activity of Rhisopus species. / E.A. Kassim // Egypt. J. Microbiol. Special Issue-1984.-P. 171-178.

57. Khan, A.W. Use of charcoal to minimize end product ingibition in enzymatic hydrolysis of cellulose./ A.W. Khan, A. Chin, S. Baird // Biotechnol. Lett.-1985.-V. 7(6).- P.447-450.

58. Kim, B.H. Grown and cellulolytic activity of Cellulomonas flavigena. / B.H. Kim, W.T. Wimpenny//Can. J. Microbiol.-1981.-V.27.-P.1260-1264.

59. Kluepfel, D. Characterization of cellulose and xylanase activities of Streptomyces lividans. / D. Kluepfel, F. Schareck, F. Mondou, R. Morosoli //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.230-234.

60. Lansford, M.G. The cellulase system of Cellulomonas fimi. / M.G. Lansford, N.R. Gilkes, D.G. Kilburn, R.C. Miller, R.A.J. Warren // J. Gener. Microbiol.-1984.-V. 130.-P. 11367-1376.

61. Lin, E. Identification of a celE-binding protein and its potential role in induction of the celE gene in Thermomonospora fusca. / E. Lin, D.B. Wilson // J. Bacteriol.-1988.-V.170.- P.3843-3846.

62. Lindner, W.A. Carboxymethylcellulase from Sclerotium rolfsii. / W.A. Lindner//Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P. 376-382.

63. Litchfield, J.H. Single-cell biomass. / J.H. Litchfield // Sciense 1983.-V.219 (4585).-P.740-746.

64. Ljungdahl, L.G. A yellow affinity substance involved in the cellulolytic system of Clostridium thermocellum. / L.G. Ljungdahl, B. Petterson, K.E. Eriksson //Curr. Microbiol.- 1983.-V.9.-P. 195-200.

65. Lynd, L.R. Microbial Cellulose Utilisation: Fundamentals and Biotechnology. / L.R. Lynd, P.J. Weimer, H. Van Zyl Willem, I.S. Pretorius //Microbiol, and Molecul. Biol. Reviews.-2002.-P.506-577.

66. MacKenzie, C.R. Streptomyces flavogriseus cellulose: evaluation under various hydrolysis conditions. /C.R. MacKenzie, D. Bilous, K.G. Johnson //Biotechnol. Bioeng.- 1984.-V.26.-P.590-594.

67. MacKenzie, C.R. Induction of cellulolytic and xylanolytic enzyme systems in Streptomyces spp. / C.R. MacKenzie, D. Bilous, H. Schneider, K.G. Johnson //Appl. Environ Microbiol.- 1987.-V. 53(12).-E\2835-2839.

68. Macris, B. J. Solid state fermentation of straw with Neurospora crass a for CMC-ase and /?-glucosidase production. / B.J. Macris, D. Kekos, X. Evangelidou, M. Galiotou-Panayotou, P. Sodis //Biotechnol. Lett.-1987.-V.9.-P.661-664.

69. Macris, B. J. Production and cross-synergistic action of cellulolytic enzymes from certain fungi mutants grown on cotton and straw. / B.J. Macris, M. Paspaliari, D. Kekos // Biotechnol. Lett.- 1985.-V.7.-P.369-372.

70. Malek, M.A. Bacterial cellulases and saccharification of lignocellulosic materials./ M.A. Malek, N.A. Chowdhury, Q.M. Yousuf, N. Choudhury // Enzyme Microbiol. Technol.-1988.-V.10.-P.750-753.

71. Mandels, M. Application of cellulases. / M. Mandels // Biochemical Society Transactions. -1985.- V.13.-P.414-416.

72. Marchessault, R.H. Cellulose / R.H. Marchessault, P.S. Sundararajan // In G.O. Aspinall (ed.), The Polysaccharides.- New York: Academic Press, 1993.-V.2.-P.ll-15.

73. Margaritis, A. Xylanase, CM-cellulase and avicelase production by the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile. / A. Margaritis, R. Merchant, M. Yaguchi //Biotech. Lett.- 1983.-V.5.-P.265-270.

74. Margaritis, A. Optimization of fermentation conditions for thermostable cellulase production by Thielavia terrestris. / A. Margaritis, R.F. Merchant //. J. Indust. Microbiol- 1986.-V.1.-P.149-150.

75. McCleary, В. V. Purification of P-glucosidase from Aspergillus niger. / B.V. McCleary, J.Harrington //Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P.575-582.

76. Mes-Hartree, M. The nature of inhibitory materials present in pretreated lignocellulosic substrates which inhibit the enzymatic hydrolyses of cellulose. / M. Mes-Hartree, J.N.Saddler//Biotechnol. Letters.-1983.-V. 5 (8).-P. 531-536.

77. MesHartree, M. Influence of growth substrate on production of cellulase enzymes by Trichoderma harzianum E58. / M. MesHartree, C.M. Hogan, J.N. Saddler//Biotechnol. Bioeng.- 1988.-V.31.-P.725-729.

78. Moloney, A.P. Tsolaion and characterization of the endoglucanases of Talaromyces emersonii. / A.P. Moloney, S.I. McCrae, T.M. Wood, M.P. Coughlan // Biochem. J.- 1985.-V.225.-P.365-374.

79. Murao, S. Cellulases of Aspergillus aculeatus. / S. Murao, R. Sakamoto, M. Arai // Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P.274-299.

80. Nakamura, K. Isolation and identification of crystalline cellulose hydrolysing bacterium and its enzymic properties. / K. Nakamura, K. Kitamura // J. Ferment. Technol.- 1982.-V. 60.-P. 343-348.

81. Nakamura, K. Cellulases of Cellulomonas uda. / K. Nakamura, K. Kitamura // Meth. Enzymol.-1988.-V. 160 (1).-P.211-216.

82. Ohmiya, K. Isolation and properties of P -glucosidase from Ruminococcus albus. / K. Ohmiya, M. Shirai, Y. Kurachi, S. Shimizu //J. Bacteriol.-1985.-V.161.-P. 432-434.

83. Ohmiya, K. Purification and properties of endo-(l—»4)- p -D-glucanase from Ruminococcus albus. / K. Ohmiya, K. Maeda, S. Shimizu //Methods Enzymol.-1987.-V.160.-P. 247-299.

84. Panda, T. Effect of culture phasing and a polysaccharide on production of xylanase by mixed culture of Trichoderma reesei Dl-6 and Aspergillus wentii PT2804. / Т. Panda, V.S. Bisaria, Т.К. Ghose //Biotechnol. Bioeng.- 1987.-V.29.-P.868-871.

85. Peiris, S.P. Comparison of the xylanolytic and cellulolytic activities of Cellulomonas. / S.P. Peiris, P.A.D. Rickard, N.W. Dunn // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1982.-V. 14.-P. 169-173.

86. Poulsen, O.M. Growth of Cellulomonas sp. ATCC 21399 on different polysaccharides as sole carbon source. Induction of extracellular enzymes. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1988.-V.29(5).-P.480-484.

87. Poulsen, О. M. Growth and enzyme production of Cellulomonas sp. ATCC 21399 on microcrystalline cellulose. Effects of increasing concentration of a mineral medium. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1989.-V.30(5).-P.535-539.

88. Poulsen, О. M. Degradation of microcrystalline cellulose: Synergism between different endoglucanascs of Cellulomonas sp. ATCC 21399. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Biotechnol. Bioengineer.-1998.-V.39(l).-P.121-123.

89. Poutanen, K. The hydrolysis of steamed birchwood hemicellulose by enzymes produced by Trichoderma reesei and Aspergillus awamori. / K. Poutanen, J. Puis, M. Linko //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V. 23.-P.487-490.

90. Rajoka, M.I. Influence of various fermentation variables on exo-glucanase production in Cellulomonas flavigena. / M.I. Rajoka // Elec. Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458.- 2004.- No. 3, Vol.7.

91. Rajoka, M.I. Double mutants of Cellulomonas biazotea for production of cellulases and hemicellulases following growth on straw of a perennial grass. / M.I. Rajoka // World J. of Microbiol, and Biotechnol.- 2005.- V.21(6-7).-P. 1063-1066.

92. Rajoka, M.I. Cellulase and hemicellulase production by Cellulomonas flavigena NIAB 441. / M.I. Rajoka, K.A. Malik // Biotechnol. Lett.-1984.-V.6(9).-P.597-600.

93. Rajoka, M.I. Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates. / M.I. Rajoka, K.A. Malik //Bioresource Technology.-1997.-V.59( 1 ).-P.21 -27.

94. Rapp, P. Cellulose degradation and monitoring of viscosity decrease in cultures of Cellulomonas uda grown on printed newspaper. / P. Rapp, H. Reng, D.C. Hempel, F. Wagner // Biotechnol. Bioeng. -1984.-V.26(10).-P.1167-1175.

95. Rapp, P. Production and properties of xylan-degrading enzymes from Cellulomonas uda. / P. Rapp, F. Wagner //Appl. Environ. Microbiol.-1986.-V.51 (4).-P.746-752.

96. Ray, A.K. Optimization of fermentation for cellulose production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut. / A.K. Ray, A. Bairagi, K.S. Ghosh, S.K. Sen //Acta Ichthyologica et piscatorial.-2007.- V.37(l).-P.47-53.

97. Reese, E.T. Rolling with the times: production and applications of Trichoderma reesei cellulases. / E.T. Reese, M. Mandels // An. Rep. Ferm. Proc.-1984.-V. 7.-P.1-20.

98. Rickard, P.A.D. Glycosidases of Cellulomonas. / P.A.D. Rickard ., J.A. Ide , M.I. Rajoka//Biotechnol. Lett.-1981.-V.3 (9).-P.487-492.

99. Robson, L.M. Cloning of the Bacillus subtilis DLG beta-1,4-glucanase gene and its expression in Escherichia coli and B. subtilis. / L.M. Robson, G.H. Chambliss // J. Bacteriol.-1986.-V.165(2).-P.612-619.

100. Rodriguez, H. Regulation of cellulolytic activity in Cellulomonas sp. Ilbc./ H. Rodriguez, F. Alea, E. Kyslikova. //Bioresource Technol.-1996.-V.55.-P.79-82.

101. Rodriguez, H. Regulation of xylanase activity in Cellulomonas sp. Ilbc. / H. Rodriguez, F. Alea // Acta Biotechnologica.-2004.-V.12(4).-P.337-343.

102. Rodriguez, H. The localization and activity of Cellulomonas xylanase on sugar cane bagasse pith. / H. Rodriguez, A. Enriquez, O. Volfova //Can. J. Microbiol.-1985.-V. 31.-P.754-756.

103. Rodriquez, H. Formation and localization of cellulases in Cellulomonas culture on bagasse. / H. Rodriquez, O. Volfova //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1984.-V.19.-P. 134-138.

104. Saddler, J. N. Regulation of cellulase synthesis in Acetivibrio cellnlolyticus. / J. N. Saddler, A.W. Khan, S.M. Martin // Microbios.-1980.-V.28.-P.97-106.

105. Sami, A.J. Production of free and substrate-bound cellulases of Cellulomonas flavigena. / A.J. Sami, M.W. Akhtar, N.N. Malik, B.A. Naz // Enzyme Microbiol. Technol.-l 988.-V. 10.-P.626- 631.

106. Sarkar, C. Utilization of bagasse by bacteria. / C. Sarkar, K.A. Prabhu // J. Fermentat. Technol.-1982.-V.60(4).-P.297-303.

107. Schell, M.A. Purification and characterization of an endoglucanase from Pseudomonas solanacearum. / M.A. Schell //Appl. Environ Microbiol.-1987.-V.53.-P.2237-2241.

108. Senior, D.G. Xylanase production by Trichoderma harzianum E58./ D. J. Senior, P. R. Mayers, J. N. Saddler // Appl. Microbiol. Biotechnol.-V.32.-137-142.

109. Sharma, A. Effects of aromatic compounds on hemicellulose-degrading enzymes in Aspergillus japonicus. / A. Sharma, O. Milstein, Y. Vered, J. Gressel, H.M. Flowers // Biotechnol. Bioeng.-1985.-V.27.-P.1095-1101.

110. Sharma, P. Limitation of congo-red staining techniques for the detection of cellulolytic activities. / P. Sharma, S. Pajni, N. Dhillon, D.V. Vadehra, D.K. Dube // Biotechnol. Lett.-1986.-V.8(8).-P.579-580.

111. Shepherd, M.G. Cellulases from Thermoascus aurantiacus. / M.G. Shepherd, A.L. Cole, C.C. Tong // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.300-307.

112. Stewart, B.J. Derepressed synthesis of cellulase by Cellulomonas. / B.J. Stewart, J.M. Leatherwood//J. Bacteriol.-1976.-V.128(2).-P.609-615.

113. Stoppok, W. Formation, Location, and Regulation of Endo-l,4-P-Glucanases and 3-Glucosidases from Cellulomonas uda. / W. Stoppok, P. Rapp, F. Wagner //Appl. Environ Microbiol.-1982.-V.44(l).-P.44-53.

114. Tamada, M. Continuous cellulase production by immobilized Sporotrichum cellulophilum and continuous saccharification of bagasse. / M, Tamada, N. Kasai, I. Kaetsu//Biotechnol. Bioeng.- 1987.-V.29.-P.697-702.

115. Teeri, T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight in to the function of cellobiohydrolases./ T.T. Teeri // Trends Biotechnol.-1997.-V.15.-P.160-167.

116. Tomme, P. Characterization of CenC, an enzyme from Cellulomonas jimi with both endo- and exoglucanase activities. / P. Tomme, E. Kwan, N.R. Gilkes, D.G. Kilbum, R.A.J. Warren//J. Bacteriol.-1996.-V.178(14).-P.4216-4223.

117. Trivedi, S.M. Saccharification of cellulosic wastes by high strength cellulase system of mix-shake cultivated Scytalidium lignicola and Trichoderma longibrachiatum. / S.M. Trivedi, R.M. Ray // J. Fermen. Technol.-1985.-V.63.-P.299-304.

118. Waldron, C.R. Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. / C.R. Waldron, C.A. Becker-Vallone, D.E. Eveleigh // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.477-486.

119. Waldron, Jr.C.R. Saccharification of cellulosics by Microbispora bispora. / Jr.C.R. Waldron,D.E. Eveleigh //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.487-492.

120. Wilson, D.B. Cellulases of Thermomonospora fusca. / D.B. Wilson // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.314-323.

121. Wilson, D. B. Genetics and properties of cellulases. / D. B. Wilson, D. C. Irwin // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.-1999.-V. 65.-P.1-21.

122. Whittle, D.J. Molecular cloning of a Cellulomonas fimi cellulase gene in Escherichia coli. / D.J. Whittle, D.G. Kilburn, R.A.J. Warren, R.C.Jr. Miller // Gene.-1982.-V.17.-P. 139-145.

123. Wood, T.M. Purification and some properties of the extracellular (P-D-glucosidase) of the cellulolytic fungus Trichoderma koningii. / T.M. Wood, S.I. McCrae // J. Gen. Microbiol.- 1982.-V.128.-P.2973-2982.

124. Wood, W. E. 1984. Cyclic AMP levels during induction and repression of cellulase biosynthesis in Thermomonospora curvata. / W. E. Wood, D. G. Neubauer, F. J. Stutzenberger//J. Bacteriol.-1984.-V.160.-P. 1047-1054.

125. Yasui, T. |3-xylosidase and (3-glucosidase of Chaetomium trilaterate. / T. Yasui, K. Matsuo //Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.696-700.

126. Yasui, T. Inducers for xylanase production by Cryptococcus flavus. / T. Yasui, B.T. Nguyen, K. Nakanishi // J. Ferment. Technol.-1984.-V.62.-P.353-359.

127. Yoshikawa, T. Biogenesis of multiple cellulase components of Pseudomonas fluorescens var. cellulose. Effects of culture conditions on the multiplicity of cellulose. / T. Yoshikawa, H. Suzuki, K. Nisizawa //J. Biochem.-1974.-V.3.-P.531-540.139