Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде"

ФАДЕЕВА ИРИНА ВАСИЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ РАЗДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ, ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБА ЬЕ1\Т11Чи8 ТЮШГШв ШТАММ ВКМ Р-3616 Б НА ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЕ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 янз

Саранск - 2009

003490679

Работа выполнена в ГОУВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева"

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ревин Виктор Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич

доктор биологических наук, профессор Смирнов Василий Филиппович

Ведущая организация: ГОУВПО «Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова», биологический факультет

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 212. 117. 12 при ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" по адресу: 430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26, корп. "б", конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева".

Автореферат диссертации разослан "/<у " ноября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

С.А. Ибрагимова

Актуальность темы

В последние годы мировая индустрия производства спиртов растет огромными темпами [Pimentel D. et al., 2007; Кухаренко A.A., Дадашев М.Н., 2004], в связи с чем ежегодно образуются миллионы тонн различных органических отходов и побочных продуктов, среди которых самую большую долю занимает по-слеспиртовая барда (около 12 кг на 1 л произведенного спирта). В России около 10-15% от ее общего количества применяется в осенне-зимний период в натуральном виде для откорма скота и около 20% перерабатывается в кормовые препараты для животноводства. Однако большая часть барды, особенно в летний период портится, т.к. из-за высокого влагосодержания не подлежит длительному хранению (не более 1-2 суток) [Кухаренко A.A., Винаров А.Ю., 2001; Сорокоду-мов С.Н. и др., 2005]. В этой связи на спиртзаводах достаточно часто происходит ее бесконтрольный сброс в окружающую среду. Принимая во внимание, что в послеспиртовой барде содержится значительное количество питательных веществ (сырой протеин, липиды, органические кислоты, макро- и микроэлементы), она является биологически нестабильной средой, в которой интенсивно развиваются процессы закисания и гниения. Поэтому сброс послеспиртовой барды без предварительной очистки представляет серьезную экологическую опасность для почвы и водоемов.

Проблема утилизации послеспиртовой барды актуальна практически для всех стран, в т.ч. России, т.к. запрещается сбрасывать барду в водоёмы или в канализацию без предварительной переработки [п.5 ст.8 Федерального закона №171-ФЗ от 22.11.1995]. К настоящему времени в мире барду тем или иным образом перерабатывают, в основном на корма [Kim Y. et al., 2008; Римарева Л.В. и др., 2006] по достаточно энергозатратной технологии, основанной на сочетании процессов центрифугирования, вакуум-выпаривания и сушки. В результате получается сухая барда, выпускаемая за рубежом в виде нескольких продуктов - dried distillers grains (DDG), dried distillers grains and soluble (DDGS), wet wheat distillers' grains (WWDG). Многочисленные исследования показали, что кормовая ценность этих продуктов сопоставима с традиционными кормами [Ham G.A. et al., 1994; Klopfenstein T.J. et al., 2008]. В России полный цикл переработки барды в «DDGS», реализован только на некоторых заводах.

Существует и ряд технологий микробиологической и биохимической биоконверсии барды, путем культивирования на ней дрожжей, молочнокислых бактерий или ассоциаций микроорганизмов с добавлением грубых кормов и ферментов [Клиндкж A.M. и др., 2004; Olstorpe М. et al., 2008; Курзин А.Б., 2005; Vogel R.F. et al., 1999]. Молочнокислые бактерии к тому же обладают антагонистическим действием по отношению к патогенной микрофлоре желудочно-кишечного тракта, от которой ежегодно происходит гибель значительной доли молодняка сельскохозяйственных животных. Кроме того, добавление этих бактерий может способствовать консервированию барды (за счет накопления органических кислот и специфических антибиотиков) и продлить срок ее хранения, а соответственно и срок реализации без дополнительной энергозатратной сушки [Lavermicocca Р. et al., 2000]. Недостатком молочнокислого заквашивания барды является относительно низкое накопление белка, что может быть компенсировано введением

грибных культур, например, базидиальных, характеризующихся высоким (до 56% от сухих веществ) содержанием белка и высокой гидролитической активностью [Решетникова И.А., 1997]. Одновременное выращивание с вышеуказанными бактериями грибов-базидиомицетов, позволяет гидролизовать лигноцеллюлозные комплексы, а также дополнительно обогатить субстрат сахарами, витаминами, белковой массой и ферментами.

Цель и задачи исследования

Цель работы:

Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние условий раздельного культивирования на послеспирто-вой барде и/или ее компонентах на рост пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба Lentinus tigrinus ВКМ F-36I6D;

2. Изучить влияние соотношения инокулятов изучаемых микроорганизмов при совместном культивировании на рост, накопление белка и редуцирующих веществ и биологическую стойкость получаемого продукта;

3. Изучить процессы совместного культивирования на послеспиртовой барде и/или ее компонентах пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба Lentinus tigrinus ВКМF-3616D и молочнокислых бактерий.

Научная новизна.

Впервые изучены возможность совместного культивирования базидиально-го гриба Lentinus tigrinus ВКМ F-3616D и молочнокислых бактерий на нативной барде и ее обезвоженном компоненте, подобраны оптимальные соотношения этих культур, обеспечивающие наибольшее накопление биомассы, белка, редуцирующих веществ. Исследована биологическая стойкость полученных препаратов. Изучены процессы раздельного и совместного полунепрерывного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий, обладающих пробиотической активностью на нативной послеспиртовой барде.

Научно-практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований, разработана и внедряется на ОАО «Мордовспирт» технология производства биопрепаратов на основе послеспиртовой барды и микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены для обсуждения на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева», Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008 г.), XXXVI Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева (Саранск, 2008), VIII республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2009 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в числе которых 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 166 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 52 рисунка и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 184 источника, в том числе 61 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

Глава 1 Обзор литературы

В главе представлен обзор основных работ по характеристике используемого субстрата и микроорганизмов. Представлен обзор основных работ по изучению состава барды, получаемой на предприятиях из различных видов сырья и при различных технологиях. Приведена характеристика основных групп микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами. Описаны примеры практического применения пробиотических препаратов на их основе.

Глава 2 Материалы и методы исследования

Материалами исследований являлись молочнокислые бактерии рода Lactobacillus, пропионовокислые бактерии рода Propionibacterium, бактерии Bifidum-bacterium bifidum, гриб Lentinus (Panus) tigrinus BKMF-36I6D, послеспиртовая зерновая барда, выработанная на ОАО «Мордовспирт», а также препараты, полученные на основе данных микроорганизмов и барды.

В работе использовались методы поверхностного твердофазного и глубинного жидкофазного (периодического и полунепрерывного) культивирования вышеуказанных микроорганизмов на модульном биотехнологическом оборудовании «Biostat» (Sartorius, Германия), спектрофотометрические методы анализа состава барды до и после культивирования микроорганизмов, термогравиметрический метод определения количества биомассы, количественные методы определения числа клеток.

Контроль показателей исходного сырья (барды) осуществлялся параллельно на кафедре и в аккредитованных испытательных лабораториях. Твердый осадок барды получали центрифугированием при 8000об/мин в течение 15 мин. На твердом осадке барды культивирование проводили в тонком слое (толщиной не более 2 см).

Штамм гриба L. (Р.) tigrinus ВКМ F-3616D поддерживали на косяках с сусло-агаром. Для приготовления инокулята гриба штамм выращивали в течение 7 суток на жидкой среде Чапека-Докса. Выращивание инокулята вели в колбах Эр-ленмейера объемом 500 мл, куда наливали 100 мл среды, в перемешиваемых ус-

ловиях на качалках при 200 об/мин, при 26°С. Засев проводили кусочком агара, заросшего культурой гриба (приблизительно 1x1см).

В процессе культивирования контролировали рост микроорганизмов (тер-могравиметрически и количественно, методом Коха [Чурикова В.В., Грабович М.Ю., 2003]), концентрацию белка - по методу [Bradford М.М., 1976] и с амидо-черным [Практикум..., 1984], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин, редуцирующие сахара - феррицианидным методом [Практикум..., 1984], содержание нуклеиновых кислот - по оптической плотности при длине волны 270 нм и 290 нм, после предварительной экстракции хлорной кислотой [Практикум..., 1984].

Опыты проводили в пяти повторностях. Статобработку проводили с использованием статпакета приложения Excel Microsoft Office. Для определения достоверности различий результатов рассчитывали Мср, а, т [Лакин Г.Ф., 1980].

Глава 3 Изучение процессов раздельного и совместного периодического культивирования молочнокислых и лропионовокислых бактерий на фильтрате послеспиртовой барды

3.1 Оптимизация условий культивирования молочнокислых и бифидобакте-puii на послеспиртовой барде

Биологические методы конверсии отходов являются предпочтительными, так как они экологичны и экономически выгодны. Биоконверсия позволяет превращать отходы (например, барду) в высококачественные биопрепараты - кормовые продукты, ферменты, препараты для защиты растений и т.д. [Белова Н.В., Денисова Н.В., 2005]. Ценность лактобактерий и бифидобактерий для животных и человека связаны с их способностью изменять активность микрофлоры кишечника. Накапливая большое количество кислоты, они тем самым противодействуют размножению нежелательных микроорганизмов и их проникновению в другие органы [Яркина Я.А., 2005].

3.1.1 Влияние СаСО} на рост бактерий на послеспиртовой барде

В первой серии экспериментов в качестве добавки в барду использовали СаСОз в различных концентрациях с целью регуляции кислотности и регулирования макроэлементного состава. Было выявлено (рисунок 1), что СаС03 при совместном культивировании молочнокислых и бифидобактерий не приводит к интенсификации роста или накопления кислоты в барде, т.к. углекислый кальций обладает буферными свойствами. Когда рН раствора сильно падает, карбонат распадается с образованием С02. Таким образом, он нейтрализует кислоты, которые появляются в культуре, переводя их в кальциевые соли [Стейниер Р. и др., 1977].

Белок - основной компонент биомассы молочнокислых бактерий. Питательная ценность кормового продукта в большой мере зависит от количества белка в его составе. В исходной барде белок составлял 4,2 мг/мл.

Содержание белка в процессе совместного культивирования молочнокислых и бифидобактерий увеличилось максимально в фильтрате барды при концентрации СаСОз 0,75 г/л -до 19,6 мг/мл.

о

Рисунок 1 - Накопление биомассы в процессе совместного культивирования лактобацилл и бифи-добактерий на послеспиртовой барде с СаС03

о

24

Время культивирования, ч

52

контроль -«-0,5 г/л

-—0,25 г/л -»-0,75 г/л

г/л

В фильтрате барды с концентрацией кальция 0,75 г/л концентрация нуклеиновых кислот также была выше остальных вариантов и составила 1,422 мкг/мл, в фильтрате барды с концентрацией кальция 1 г/л произошло менее значительное увеличение нуклеиновых кислот.

После 48 ч культивирования количество живых клеток совместно культивируемых лактобактерий и бифидобактерий в вариантах с содержанием кальция 0,75 г/л составило 6,3*108 КОЕ/мл. Микроскопия показала, что в препаратах преобладают в основном лактобациллы, в то время как бифидобактерии встречаются сравнительно редко, что, по видимому, обусловлено их плохим ростом на барде. Минимальное количество живых клеток - 5,5* 108 КОЕ/мл было зафиксировано после 48 часов культивирования в образцах с содержанием кальция 1 г/л и в контроле.

Таким образом, максимальное накопление биомассы, белка, живых клеток лактобактерий и в меньшей степени бифидобактерий наблюдалось при их совместном культивировании на барде с содержанием кальция 0,75 г/л.

3.1.2 Определение оптимума рН для культивирования на послеспиртовой барде лактобацилл и бифидобактерий

Для лактобацилл оптимум рН составляет 5,5—5,8, но они могут развиваться при рН 5 и ниже. Для бифидобактерий оптимумом является 5,8 - 6,0, при рН ниже 3,5 они быстро погибают [Определитель бактерий ..., 1997].

При определении оптимума рН для совместного культивирования лактобацилл и бифидобактерий выяснилось, что почти во всех вариантах к концу культивирования рН снижалось практически до 3.5, что связано с активным синтезом органических кислот культурой лактобацилл.

Согласно литературным данным, сбраживая углеводы, гомоферментатив-ные лактобактерий образуют значительное количество кислоты (главным образом Ь (+) молочную кислоту с незначительным количеством Б (-) молочной кислоты) [Аркадьева З.А. и др., 1989]; а гетероферментативные молочнокислые бактерии и бифидобактерии синтезируют одновременно уксусную и молочную кислоты путем необычной системы метаболизма глюкозы [Соколов А.А., 1996].

При совместном культивировании лактобактерий и бифидобактерий макси-

малъный выход биомассы, белка и нуклеиновых кислот был получен при начальном рН 6,5, меньше всего при рН 7,5 (рисунок 2 и 3). При этом количество клеток к концу культивирования также было максимальным при начальном рН 6.5, с преобладанием лактобацилл по числу над бифидобактериями.

Рисунок 2 - Динамика изменения биомассы в процессе совместного культивирования лактобацилл и бифидобактерий на послеспиртовой барде с различными значениями начального рН

Время культивирования, ч

-ж-6,5

О 24

Время культивирования, ч

РН

24 52

Время культивирования, ч рН

-5,5

-6,5

-7,5

-5,5

-6,5

-7,5

Рисунок 3 - Накопление белка (а) и нуклеиновых кислот (б) при совместном культивировании лактобациллами и бифидобактерии при росте на послеспиртовой барде с различными значениями начального рН

Таким образом, максимальное накопление биомассы, белка, клеток преимущественно лактобактерий наблюдалось при совместном их культивировании с бифидобактерями на фильтрате барды при начальном рН 6,5.

3.1.3 Определение оптимума температуры при совместном культивирования на послеспиртовой барде лактобацилл и бифидобактерий

По литературным данным температурным оптимумом для культивирования лактобактерий является 30-40°С, а для бифидобактерий 35-38°С. Наибольший рост ассоциативной культуры лакто- и бифидобактрий наблюдался именно при 37°С - 5,3*108 КОЕ/мл.

3.1.4 Изучение влияния температуры хранения полученных препаратов барды на их качественные и количественные показатели

Срок хранения - важный показатель рентабельности производства того или

иного продукта; от условий хранения зависит сохранение питательной ценности и потребительских характеристик (вкус, цвет, запах, консистенция) товара. Он зависит от множества факторов - температуры и влажности как самого продукта, так и внешней среды, биостойкости продукта и т.д.

Пробиотические продукты, полученные совместным культивированием лак-тобактерий и бифидобактерий на барде хранили при температурах: -4°С, 4°С, 8°С и 20°С. Основной показатель сохранности кормового пробиотического продукта -количество живых клеток бактерий. На конец срока хранения продукта он должен быть не менее 10(> КОЕ/мл [Смирнов В. В. и др., 1992]. В совокупности с органо-лептическими показателями он является показателем конца срока хранения.

Анализируя данные, полученные в результате исследования изменения числа живых клеток (рисунок 4) можно сделать вывод, что во всех образцах, хранящихся при 8°С, наблюдалась явная тенденция к быстрому снижению числа клеток в результате лизиса - до 108 к 18 суткам. При 4°С такие же показатели были достигнуты лишь после 28 суток хранения. При этом микроскопия показала наличие преимущественно лактобацилл к концу срока хранения.

Рисунок 4 - Изменение числа живых клеток в процессе хранения фильтрата барды, обработанной лактобактсриями и бифидобактериями

Органолептические исследования показали, что во всех образцах при исследуемых температурах в течение первых пяти суток хранения цвет, запах и консистенция продукта был неизменными. На последующие сутки органолептика образцов, хранящихся при 8°С, стала меняться и к концу хранения цвет стал боле темным, запах - слегка гнилостных, консистенция - излишне жидкая, что, по-видимому, обусловлено отмиранием клеток бактерий и накоплением продуктов метаболизма. В варианте хранения при температуре 20°С количество живых клеток, уровень биомассы и органолептические показатели резко снижались уже через 5-8 суток, что обусловлено интенсивной жизнедеятельностью микроорганизмов и как следствие лизисом клеток, а также вторичным инфицированием и развитием посторонней микрофлоры (в частности, плесневых грибов).

800

700

о

ь 600

§

5 500

2

а Щ 400

И О

о 300

03

и и 200

з:

п о 100

к

0

4°С

2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Время хранения, сутки -в-4«С

Таким образом, наилучшие показатели сохранения биомассы, живых клеток, цвета, запаха и консистенции были зафиксированы в образцах, хранящихся при 4°С в течение 28 суток. Такие показатели позволяют использовать полученный препарат в качестве пробиотической добавки, поскольку концентрация микроорганизмов в них достаточна для восстановления нормальной микрофлоры в желудочнокишечном тракте животных [Пирузян Л.Ф., Михайловский Е. М., 1992; Смирнов В. В. и др., 1992].

3.2 Изучение роста и развития молочнокислых и протюновокислых бактерий при последовательном культивировании на послеспиртовой барде

На втором этапе проводились исследования по совместному культивированию пропионовокислых и молочнокислых бактерий при различных способах их введения - одновременно с лактобациллами; через 1,5, 3; 4,5 и 6 часов после предварительного культивирования лактобацилл. Наиболее интенсивный рост микроорганизмов наблюдался в образцах с 3-х часовым интервалом внесения пропионовокислых бактерий. В этом варианте значение рН составило 3,17; белок вырос до уровня 19,6 мг/мл (рисунок 5, а), биомасса - до 15 г/л (рисунок 5, б); уровень нуклеиновых кислот - до 1,499 мкгНК/мл, наибольшее количество живых клеток культивируемых бактерий также было отмечено в образцах с 3-х часовой предварительной инкубацией лактобацилл. После 48 ч культивирования их число в среднем составило 6,8*108 КОЕ/мл (рисунок 6).

О 24

Время культивирования, ч Время отсрочки внесения пропионовокислых бактерий, ч — О —1,5 —3 -►-4,5 н-6

О 24 52

Время культивирования, ч Время отсрочки внесения пропионовокислых бактерий, ч

Рисунок 5 - Накопление биомассы (а) и белка (б) при одновременном и последовательном культивировании на послеспиртовой барде молочнокислых и пропионовокислых бактерий

Также мы исследовали срок хранения полученных образцов биомодифици-рованной барды при предварительно выбранных темйературных режимах.

Исследования показали, что и в данных вариантах оптимальной температурой хранения можно считать 4°С; при температуре 8 й особенно 20°С - происходит достаточно быстрая порча продукта; температура -4°С является «пограничной» - продукт можно хранить достаточно длительное время, однако его пробио-

тические свойства (биомасса и количество живых клеток бактерий) уменьшаются с каждым днём заморозки (рисунок 7).

Рисунок б - Число живых клеток при одновременном и по-^ следовательном культивирова-

О 5. __нии на послеспиртовой барде

молочнокислых и пропионовокислых бактерий

О 1,5 3 4,5 б Время отсрочки внесения

пропионовокислых бактерий, ч

О I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 Время хранения, сутки Температура, "С

Рисунок 7 - Изменение биомассы при хранении пробиотического препарата на основе лактобацилл и пропионовокислых бактерий

Таким образом, приведенные в третьей главе результаты показывают, что раздельное культивирование молочнокислых и пропионовокислых бактерий приводит к существенно меньшему накоплению биомассы и белка. При этом содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных как с помощью раздельного, так и с помощью совместного культивирования бактерий не превышает допустимой для животных нормы потребления.

Оптимальной температурой хранения полученных препаратов является 4°С. В этих условиях свойства и максимальное количество живых клеток бактерий сохранялось до 28-30 суток. Из всех исследованных вариантов оптимальным является последовательное культивирование пропионовокислых бактерий после 3-х часов предварительной инкубации лактобацилл.

Глава 4 Изучение процессов полунепрерывного раздельного и совместного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий

Варьирование условий культивирования - это сложный многоэтапный про-

цесс, позволяющий подобрать наиболее подходящие технические и биологические параметры для выращивания микроорганизмов.

Основной задачей нашей работы в этой серии экспериментов являлось изучение возможность полунепрерывного выращивания молочнокислых бактерий на нативной послеспиртовой барде. Известно, что при культивировании бактерий кислотность консервируемой массы постепенно снижается. В такой среде споровая и бесспоровая микрофлора, особенно патогенная угнетается [Stiles М.Е., 1996; Salminen S. et al., 2004]. Барда же обогащается витаминами В2,В„,Вп. При этом в тонне консервируемой массы накапливается до 25 кг органических кислот (молочной, уксусной). Кроме того, обогащение консервируемой массы барды чистыми культурами молочнокислых бактерий также способствует нормализации пищеварения, повышению продуктивности животных, снижению расхода кормов на единицу продукции, улучшению качества животноводческой продукции [Верни-гор В.А., Таранов, М.Т., 1974]. Выросшие культуры молочнокислых бактерий можно отделить от барды ультрафильтрацией, что позволит сэкономить значительную часть электроэнергии [Леденев В.П., Ахунова В.А., 1995]. В связи с этим в своей работе мы исследовали возможность совместного культивирования в разных соотношениях культур лактобактерий и бифидобактерий на нативной барде.

4.1 Подбор концентрации и соотношения инокулята лактобактерий и бифидобактерий в условиях периодического статического культивирования

В первой серии экспериментов мы исследовали возможность совместного культивирования в разных соотношениях культур лактобактерий и бифидобактерий на нативной барде в периодических статических условиях: вариант 1 - 109 лакто- и 5*106 бифидобактерий; вариант 2 - 2*107 бифидобактерий; вариант 3 -2*109 лакто- и 5*106 бифидобактерий; вариант 4 -4*109 лактобактерий.

Проведенные исследования (рисунок 8) показали, что оптимальным вариантом культивирования молочнокислых бактерий на нативной барде является вариант 3. Выход биомассы в данном варианте составляет 3,45 г/л к 3 суткам культивирования, внеклеточного белка 0,069 г/л, выход редуцирующих Сахаров - 0,268 г/л, конечное значение pH среды 3,45.

4

Рисунок 8 - Влияние концентрации и соотношения культур лактобактерий и бифидобактерий на накопление биомассы

0,5 0

1

3

6

9

вариант 1 вариант 2 вариант 3 вариант 4 Время кулътивироЕания, сутки

4.2 Сравнительная характеристика статического и динамического периодического культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий на барде

Поскольку выход биомассы и внеклеточных белков, а также накопление редуцирующих Сахаров было на сравнительно низком уровне (около 10% от сухих веществ барды) на следующем этапе мы модифицировали эксперимент, проведя культивирование в периодических и полунепрерывных условиях с медленным перемешиванием (на уровне вращения мешалки - 150 об/мин), что позволило бы более равномерно распределять культуры в толще питательной среды и одновременно создавало бы более благоприятные условия для массообмена. В первом варианте (рисунок 9а) использовали в качестве инокулята только молочнокислые бактерии в оптимизированной в первой серии опытов концентрации.

1 2

Сутки

- Белок

- Редуцирующие вещества

- Биомасса

3 3 р. 2

1 2 3 Сутки

- Белок

- Редуцирующие сахара -Биомасса

Рисунок 9 - Изменение содержания белка, биомассы и редуцирующих Сахаров в процессе периодического культивирования молочнокислых бактерий (а) и молочнокислых с пропионовокислыми (б) бактериями в условиях медленного перемешивания

Во втором варианте (рисунок 9,6) в качестве инокулята дополнительно к молочнокислым использовали пропионовокислые бактерии в концентрации 2,5*107 КОЕ/мл барды. Внесение дополнительно пропионовокислых бактерий обусловлено их более выраженным консервирующим действием, связаным с синтезом и накоплением пропионовой кислоты, об этом свидетельствуют работы исследователей ряда стран [Воробьева Л.И., 1995; Акагата Н., Такес1а О. е1 а1., 1998]. Рассматривая динамику накопления белка в первом варианте, можно отметить, что рост культуры аналогичен, как и в случае статического культивирования (рисунок 9а). Добавление в среду пропионовокислых бактерий приводит к некоторому повышению выхода биомассы (рис. 9,6).

4.3 Полунепрерывное культивирование молочнокислых и пролионовокислых бактерий на барде

Вариант периодического культивирования в следующей серии экспериментов мы попытались модифицировать, с целью интенсифицировать процесс консервирования барды. Для этого мы использовали полунепрерывное культивирование бактерий на нативной барде.

Сравнительная характеристика полунепрерывного культивирования данного варианта внесения молочнокислых бактерий показала, что на каждом этапе внесения свежей барды с засевным материалом, бактерии проходят характерные им стадии развития с соответствующими максимумами накопления биомассы (рис. 10) во второй и третьей стадии культивирования.

Рассматривая динамику изменения содержания редуцирующих Сахаров в процессе полунепрерывного культивирования, необходимо отметить, что происходит стабильное снижение их концентрации, так как внесение новой порции барды на 3 сутки культивирования после отбора части среды, приводит к расходу редуцирующих Сахаров на рост и развитие вновь внесенных бактерий. При этом рН на всех стадиях культивирования снижалась до уровня 3,4-3,5.

3 этап

о

12 3 0 12 3 Время куцыньирсшгаш. сутки

Рисунок 10-Динамика изменения концентрации биомассы в процессе полунепрерывного культивирования молочнокислых бактерий на послеспиртовой барде

Внесение в состав инокулята дополнительно пропионовокислых бактерий показало аналогичные тенденции - с увеличением числа доливок выход биомассы к третьим суткам увеличивается (рисунок 11).

Так, на первом этапе культивирования, максимальное количество биомассы составляло 4,4 г/л, на втором - уже к первым суткам было достигнуто данное значение, а к третьим суткам количество биомассы увеличилось на 25% и достигло 5,4 г/л.

На третьем этапе культивирования выход биомассы к третьим суткам был максимальный - 7,4 г/л, что на 70% выше, чем на первом и на 40% чем на втором этапе. По-видимому, это обусловлено тем, что в процессе продленного культивирования (а полунепрерывное культивирование относится именно к этому варианту) происходит адаптация культур микроорганизмов к составу барды и условиям, что позволяет им более интенсивно накапливать биомассу.

Времякулмивровтпм, cvini

Рисунок 11 - Динамика изменения концентрации биомассы в процессе совместного полунепрерывного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий на послеспиртовой барде

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее оптимальным вариантом является полунепрерывное культивирование при 30°С и 150 об/мин и внесении 2*Ю7КОЕ/мл барды молочнокислых бактерий, ,5* 105 КОЕ/мл барды бифидобактерий и 2,5*Ю7КОЕ/мл барды пропионовокислых бактерий, что позволяет получить к третьему этапу культивирования выход биомассы на уровне 7,4 г/л. Данный вариант опыта может быть рекомендован для масштабирования в производственных условиях. Учитывая результаты этого варианта опыта мы составили принципиальную технологическую схему производства (рис. 12) и провели предварительный экономический расчет себестоимости (таблица 1).

Рисунок 12 - Технологическая схема организации переработки барды

Таблица 1 - Экономический расчет себестоимости переработки барды в пробиотические препараты

Наименование изм. плановая цена, руб. на 1 м3

кол-во сумма

1 2 3 4 5

Сырье и основные материалы

Послеспиртовая барда 40

Препарат бактерий 350

Итого: руб. 390

Вспомогательные материалы руб. 105,00

Транспортно-заготовительные расходы руб. 110,25

Энергия на технологические цели:

электроэнергия кВтч 2,18 182 1012,50

газ м.куб 2,93 4,4 1471,68

вода артезианская м.куб. 0,0 0,750 6,19

Итого: руб. 2745,62

Основная работа руб. 7000 42 42

Отчисления на соцстрах руб. 1820 11 11

Цеховые расходы руб. 280 1.7 1.7

Общезаводские расходы руб. 400 400 400

Производственная себестоимость руб.

Внепроизводственные расходы руб. 200

Полная себестоимость руб. 3550,32

Проведенный предварительный экономический расчет показал, что полная себестоимость препаратов барды, переработанных по данному варианту будет составлять на уровне 3,5 руб за 1 кг, что намного дешевле стоимости аналогичных препаратов- «Пропиовит», «Бацелл», «Биобардин» и др. Кроме того, внедрение данной технологии на спиртовых заводах позволит диверсифицировать производство и получить дополнительную прибыль.

Глава 5. Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых бактерий и грибов Ьепйпт ¡щг'тт ВКМ Р-3616П

5.1 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых бактерий и грибов на нашивной послеспиртовой барде

Проведенные исследования показали, что совместное культивирование грибов Ь. (Р.) ^ппиз ВКМР-36]6Э и молочнокислых бактерий благоприятно сказывается на росте культур и позволяет получить довольно высокий выход белковой биомассы.

Так в первой серии опытов с нативной бардой в вариантах с вариацией концентрации грибного инокулята (от 0,1 г по а.с.в. - вар.1, до 0,2 г по а.с.в. на 100 мл барды) и инокулята молочнокислых бактерий (от 5*106 до 2*107 на 100 мл барды) наблюдается постепенное увеличение выхода биомассы с увеличением

концентрации последних. Кроме того, в варианте, содержащем только грибной инокулят, наблюдается самый низкий выход биомассы и максимум наблюдается уже на 4 сутки культивирования (рис. 13, а и б).

Положительное влияние совместного культивирования молочнокислых бактерий и грибов может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, бактерии выделяют в среду культивирования молочную кислоту, в результате рН среды снижается, а грибы предпочитают именно кислые области рН [Ганбаров Х.Г., 1989; Решетникова И.А„ 1997]. Положительный эффект подтверждается и данными по изменению растворимого белка (рис.14).

Так при низкой концентрации грибного инокулята (рис.14,а) и постепенном увеличении концентрации инокулята молочнокислых бактерий наблюдается образование большого количества внеклеточного белка уже на 4-6 сутки. Без добавления молочнокислых бактерий количество внеклеточных белков низкое и плавно возрастает в процессе культивирования, достигая максимума на 8 сутки культивирования. Вероятно, это обусловлено тем, что культура гриба - медленно растущая культура (по сравнению с бактериями), а поэтому процесс накопления белков, в том числе и в связи с лизисом клеток растянут во времени. В то же время бактерии быстрее растут, но и быстрее отмирают при достижении стационарной фазы, в связи с чем, вероятно, в этих вариантах наблюдается выход белка уже на 4-6 сутки.

4

слтки

1 - без молочнокислых бактерий

2 - 5*106 КОЕ/100 мл барды 3-107 КОЕ/100 мл барды

4 - 2*107 КОЕ/100 мл барды

Рисунок 13 - Влияние количества внесенного инокулята на накопление биомассы грибом I. (Р.) ^ппиэ ВКМР-36160 и молочнокислыми бактериями на нативной

послеспиртовой барде: а - при концентрации грибного инокулята 0,1 г по а.с.в./100 мл барды; б - при концентрации грибного инокулята 0,2 г по а.с.в. /100

мл барды

0,6 -

«i

I

; 0,4-i

0,21

■!

o —

сутки

cymi

1 - без молочнокислых бактерий

2 - 5*106 КОЕ/100 мл барды

3 - 107 КОЕ/100 мл барды

4-2*107 КОЕ/100 мл барды

Рисунок 14 - Влияние количества внесенного инокулята на накопление белка грибом Lentinus tigrinus BKMF-3616D и молочнокислыми бактериями на нативной

послеспиртовой барде: а - при концентрации грибного инокулята 0,1 г по а.с.в./100 мл барды; б - при концентрации грибного инокулята 0,2 г по а.с.в. /100

мл барды

При этом после достижения максимума наблюдается некоторый спад содержания белка, что возможно связано с потреблением их грибами, т.к. в этих вариантах наблюдается более высокий выход биомассы.

При увеличении концентрации грибного инокулята и варьировании содержания инокулята молочнокислых бактерий характер накопления внеклеточного белка имеет несколько другую картину (рис. 14.6). Так в варианте без добавления инокулята молочнокислых бактерий внеклеточные белки накапливаются в виде двух максимумов - на 4 и 8 сутки культивирования, что может быть обусловлено выходом каких-то внеклеточных ферментов на первых этапах культивирования, когда грибу необходимо питание. А питание данный тип грибов получает, гидро-лизуя полимерные субстраты - целлюлозу и т.д [Белова Н.В., Денисова Н.В., 2005; Гаврилова, В.П. и др., 2002]. Затем эти ферменты утилизируются самой культурой [Белова Н.В.,1992; Kawai М., 1973]. Второй пик накопления белка связан уже, по-видимому, с началом литических процессов в культуре. В случае добавления молочнокислых бактерий картина накопления внеклеточного белка такая же, как и при содержании грибного инокулята 0,1 г по а.с.в./100 мл барды -ранний пик на 4 сутки культивирования (вероятно, вследствие лизиса бактериальных клеток) и постепенное снижение содержания к 8 суткам (вероятно, вследствие их потребления). Это согласуется и с данными, полученными по биомассе -максимальное накопление биомассы наблюдается на 8 сутки культивирования в варианте с 0,2 г грибного и 2*107 КОЕ бактериального инокулята на 100 мл барды.

Второй причиной увеличения выхода биомассы грибов и молочнокислых бактерий при совместном культивировании выступает то, что в барде присутствует довольно большое количество (до 2/3 от сухих веществ) клетчатки, которая разлагается грибами благодаря наличию у них высокоактивного целлюлолитиче-ского комплекса [Кадималиев Д.А., Ревин В.В. и др., 2003; Кадималиев Д.А., Ре-вин В.В. и др.,2004], что обеспечивает поступление дополнительного количества углеводов, используемых кокультурами для роста.

Подтверждение нашего вывода можно проследить по изменению редуцирующих Сахаров - происходит постепенное увеличение их концентрации до 4-6 суток, а затем резким снижение до 8 суток, что, вероятно, связано с двумя фазами роста гриба и бактерий - на первых этапах гриб гидролизует высокополимерные компоненты барды до Сахаров, вырабатывая внеклеточные ферменты (с этим связано и увеличение выхода белков (см. рис. 14). Затем начинается активное потребление Сахаров, одновременно и интенсивный рост культур (см. рис. 13). Т.е., редуцирующие сахара играют роль, прежде всего, питательных компонентов, практически не накапливаясь в среде культивирования.

Проведенные на этом этапе исследования показали, что оптимальным вариантом культивирования на нативной барде с рН доведенным до 7, является вариант 0,2 г по а.с,в./100 мл барды грибного инокулята и 2*Ю7КОЕ/ 100 мл барды инокулята молочнокислых бактерий. Выход биомассы в данном варианте на 8 сутки культивирования составил 6,7 г/л.

Однако полученный вариант биообработанной барды все же был достаточно жидкий, что экономически нерентабельно при перевозке на дальние расстояния, и характеризовался низкой биостойкостью при хранении (признаки плесне-вения и гниения появлялись уже к 7-10 суткам).

5.2 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых бактерий и грибов на твердом осадке послеспиртовой барды

Во второй серии опытов мы проводили совместное культивирование молочнокислых бактерий и гриба на твердом осадке барды, влажностью 70-72%. При этом мы также увеличили и количество вносимых инокулятов до 2 г по а.с.в. грибного на 100 г твердого осадка влажностью 72% и до 108 КОЕ молочнокислых бактерий на 100 г твердого осадка влажностью 72% (рис. 15). Так в вариантах с 0,2 г по а.с.в. грибного инокулята и с разной концентрацией инокулята молочнокислых бактерий наблюдается практически одинаковый выход биомассы с увеличением концентрации молочнокислых бактерий (значения варьируют в пределах ошибки опыта).

В вариантах с постоянным содержанием молочнокислых бактерий (5* 107 КОЕ) и варьированием концентрации грибного инокулята картина накопления биомассы коррелирует с увеличением концентрации последнего. Это связано с высоким содержанием в твердом осадке барды полимерных субстратов (до 15% во влажном и 50 % в сухом), разлагаемых полиферментным комплексом гриба, что обеспечивает интенсивный рост культур. Максимальное накопление биомассы и внеклеточного растворимого белка наблюдается в варианте с 5*107 КОЕ мо-

лочнокислых бактерий и максимальной концентрацией грибного инокулята - 2 % (рис.15).

1 2 3 4 5

1 - гриб 1 % по а.с.в., молочнокислых бактерий 107 КОЕ;

2 - гриб 1 % по а.с.в., молочнокислых бактерий 5*107 КОЕ;

3 - гриб 1 % по а.с.в., молочнокислых бактерий 108 КОЕ;

4 - гриб 0.2 % по а.с.в., молочнокислых бактерий 5*107 КОЕ;

5 - гриб 2 % по а.с.в., молочнокислых бактерий 5*107 КОЕ.

Рисунок 15 - Влияние количества внесенного инокулята на накопление биомассы грибом ЬепИпиз Гщппт ВКМР-36160 и молочнокислыми бактериями на твердом осадке послеспиртовой барды

б

4

сутюг

10

4

СЛ'ТКН

10

Рисунок 16 - Влияние количества внесенного инокулята на накопление белка грибом ЬепИпиз ^гшиэ ВКМР-36160 и молочнокислыми бактериями на твердом осадке барды: а - при концентрации грибного инокулята 1 г. по а.с.в. и различного соотношения молочнокислых бактерий на 100 г твердого осадка барды: 1-107 КОЕ; 2 - 5*107 КОЕ; 3 - 108 КОЕ; б - при концентрации молочнокислых бактерий 5*107 КОЕ и различной концентрации грибного инокулята: 1 - 0,2 г. по а.с.в.; 2 - 1 г. по а.с.в.; 3 - 2 г. по а.с.в.

Сопоставление полученных по биомассе (рисунок 15) и белку (рисунок 16) данных выявило аналогичную картину.

Таким образом, проведенные исследования показали, что оптимальным вариантом культивирования на нативной барде является внесение 0,2 г грибного инокулята/100 мл и 2*107/100 мл барды инокулята молочнокислых бактерий, а на твердом осадке барды является вариант 1-2 г по а.с.в. грибного инокулята и 5*107 КОЕ на 100 г осадка инокулята молочнокислых бактерий. Выход сырой биомассы на нативной барде составляет 6,72 г/л барды, а с твердого осадка 169 г/кг. При этом образцы, полученные твердофазным культивированием гриба и молочнокислых бактерий, характеризовались повышенной биологической стойкостью, по сравнению с нативной бардой и нативной бардой, обработанной грибом и молочнокислыми бактериями. Этот вариант может быть использован для производства кормовых препаратов обогащенных белком и пробиотическими бактериями.

Выводы

1. Совместное культивирование лактобацилл и бифидобактерий на послеспирто-вой барде показало, что максимальное накопление биомассы, белка и числа клеток происходит при начальном значении рН равном 6,5 и температуре - 35-37°С. Раздельное культивирование этих микроорганизмов приводит к существенно меньшему накоплению биомассы и белка.

2. Установлено, что при выращивании бактерий на послеспиртовой барде иноку-лят пропионовокислых бактерий целесообразно вносить после 3-х часов предварительной инкубации лактобацилл.

3. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных как с помощью раздельного, так и с помощью совместного культивирования бактерий не превышает допустимой для животных нормы потребления.

4. Показано, что при хранении полученных препаратов при температуре 4°С свойства и максимальное количество живых клеток бактерий сохранялось до 28-30 суток.

5. Полунепрерывное совместное культивирование бифидо-, молочнокислых и пропионовокислых бактерий позволяет получить выход биомассы живых клеток до 7,4 г/л.

6. Совместное культивирование на барде грибов ЬепНпиз ¡¡'¿г1пш ВКМР-3616В и молочнокислых бактерий приводит к более интенсивному росту культур и обогащению субстрата белком. Оптимальным вариантом для культивирования на нативной барде является - внесение 0,2% (по сухому весу) грибного инокулята и 2*108 КОЕ/л молочнокислых бактерий. Для твердого осадка барды оптимальным является внесение 2% (по сухому весу) грибного и 5*108 КОЕ/кг твердого осадка бактериального инокулята.

Список публикаций по теме диссертации

1. Фадеева И.В., Атыкян H.A., Ревин В.В. Изучение возможности совместного культивирования молочнокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus на твердом осадке барды // Материалы пятого Съезда биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - 2-4 декабря 2008г., Москва.-Москва: ИАЦ, 2008,- С. 296-297.

2. Фадеева И.В.. Шутова В.В., Ревин В.В., Ивинкина Т.И. Культивирование молочнокислых и пропионовокислых бактерий на фильтрате послеспиртовой барды // Материалы пятого Съезда биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - 2-4 декабря 2008г., Москва,- Москва: ИАЦ, 2008,- С. 297-298.

3. Фадеева И.В.. Атыкян Н.А,. Ревин В.В. Изучение процесса совместного культивирования молочнокислых бактерий и базидиального гриба Lentinus (Ра-nus) tigrinus ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде // Вестник ОГУ. - 2009. - Октябрь. - С.492-497

4. Фадеева И.В.. Атыкян H.A., Ревин В.В. Отработка условий биоконверсии отходов спиртовой промышленности с помощью молочнокислых бактерий и ба-зидиальных грибов // Вестник ННГУ,- 2009. - №6. - С. 116-123

Подписано в печать 23.11.09. Объем 1,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1630. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеева, Ирина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства, биохимический состав и кормовая цен- 9 ность послеспиртовой барды

1.2 Технологии переработки послеспиртовой барды

1.3 Общая характеристика микроорганизмов, обладающих пробиотиче- 24 скими свойствами

1.3.1 Бифидобактерии

1.3.2 Лактобактерии

1.3.3 Пропионовокислые бактерии

1.4 Общая характеристика базидиомицетов, используемых для получе- 39 ния кормового белка

1.5 Общая характеристика пробиотических препаратов

1.6 Влияние условий культивирования на рост молочнокислых, пропио- 56 новокислых бактерий и грибных культур

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследования

2.2 Культивирование исследуемых микроорганизмов

2.3 Определение количества живых клеток в препаратах барды, обрабо- 72 танных молочнокислыми и пропионовокислыми бактериями

2.4 Определение концентрации белка

2.5 Определение концентрации нуклеиновых кислот

2.6 Определение редуцирующих Сахаров

2.7 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РАЗДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНО- 77 ГО ПЕРИОДИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ

И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ НА ФИЛЬТРАТЕ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ

3.1 Оптимизация состава среды на основе барды для культивирования 77 молочнокислых, бифидо- и пропионовокислых бактерий

3.1.1 Влияние СаСОз на рост бактерий на фильтрате послеспиртовой 77 барды

3.1.1.1 Влияние СаСОз на рост лактобацилл на фильтрате послеспирто- 78 вой барды

3.1.1.2 Влияние СаСОз на рост бифидобактерий на фильтрате послеспир- 81 товой барды

3.1.1.3 Влияние концентраций СаСОз на совместный рост лактобактерий 84 и бифидобактерий на фильтрате послеспиртовой барды

3.1.2 Определение оптимума рН для культивирования на послеспиртовой 86 барде лактобацилл и бифидобактерий

3.1.3 Определение оптимума температуры при совместном культивиро- 89 > вания на послеспиртовой барде лактобацилл и бифидобактерий

3.1.4 Изучение влияния температуры хранения полученных препаратов 89 барды на их качественные и количественные показатели

3.2 Изучение роста и развития молочнокислых и пропионовокислых бак- 93 терий при последовательном культивировании на послеспиртовой барде

3.2.1 Влияние хлорида кобальта на рост пропионовокислых бактерий на 93 фильтрате послеспиртовой барды

3.2.2 Изучение роста и развития молочнокислых и пропионовокислых 97 бактерий при последовательном культивировании на фильтрате послеспиртовой барды

3.2.3 Хранение препаратов, полученных на основе молочнокислых и про- 100 пионовокислых бактерий

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО РАЗ- 107 ДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ 4.1 Подбор концентрации и соотношения инокулята лактобактерий и 108 бифидобактерий в условиях периодического статического культивирования

4.2 Сравнительная характеристика статического и динамического перио- 115 дического культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий на барде

4.3 Полунепрерывное культивирование молочнокислых и пропионово- 119 кислых бактерий на барде

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ СОВМЕСТНОГО КУЛЬ

ТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ LENTINUS TIGRINUS ВКМ F-3616D

5.1 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых 127 бактерий и грибов на нативной послеспиртовой барде

5.2 Изучение процессов совместного культивирования молочнокислых 136 бактерий и грибов на твердом осадке послеспиртовой барды

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых, пропионовокислых бактерий и гриба Lentinus tigrinus штамм ВКМ F-3616D на послеспиртовой барде"

Актуальность темы

В последние годы мировая индустрия производства спиртов растет огромными темпами [Pimentel D. et al., 2007; Кухаренко A.A., Дадашев М.Н., 2004], в связи с чем ежегодно образуются миллионы тонн различных органических отходов и побочных продуктов, среди которых самую большую долю занимает послеспиртовая барда (около 12 кг на 1 л произведенного спирта). В России около 10-15% от ее общего количества применяется в осенне-зимний период в натуральном виде для откорма скота и около 20% перерабатывается в кормовые препараты для животноводства. Однако большая часть барды, особенно в летний период портится, т.к. из-за высокого влагосодержания не подлежит длительному хранению (не более 1-2 суток) [Кухаренко A.A., Вина-ров А.Ю., 2001; Сорокодумов С.Н. и др., 2005]. В этой связи на спиртзаводах достаточно часто происходит ее бесконтрольный сброс в окружающую среду. Принимая во внимание, что в послеспиртовой барде содержится значительное количество питательных веществ (сырой протеин, липиды, органические кислоты, макро- и микроэлементы), она является биологически нестабильной средой, в которой интенсивно развиваются процессы закисания и гниения. Поэтому сброс послеспиртовой барды без предварительной очистки представляет серьезную экологическую опасность для почвы и водоемов.

Проблема утилизации послеспиртовой барды актуальна практически для всех стран, в т.ч. России, т.к. запрещается сбрасывать барду в водоёмы или в канализацию без предварительной переработки [п.5 ст.8 Федерального закона №171-ФЗ от 22.11.1995]. К настоящему времени в мире барду тем или иным образом перерабатывают, в основном на корма [Kim Y. et al., 2008; Римарева JI.B. и др., 2006] по достаточно энергозатратной технологии, основанной на сочетании процессов центрифугирования, вакуум-выпаривания и сушки. В результате получается сухая барда, выпускаемая за рубежом в виде нескольких продуктов - dried distillers grains (DDG), dried distillers grains and soluble

DDGS), wet wheat distillers' grains (WWDG). Многочисленные исследования показали, что кормовая ценность этих продуктов сопоставима с традиционными кормами [Ham G.A. et al., 1994; Klopfenstein T.J. et al., 2008]. В России полный цикл переработки барды в «DDGS», реализован только на некоторых заводах.

Существует и ряд технологий микробиологической и биохимической биоконверсии барды, путем культивирования на ней дрожжей, молочнокислых бактерий или ассоциаций микроорганизмов с добавлением грубых кормов и ферментов [Клиндюк A.M. и др., 2004; Olstorpe М. et al., 2008; Курзин А.Б., 2005; Vogel R.F. et al., 1999]. Молочнокислые бактерии к тому же обладают антагонистическим действием по отношению к патогенной микрофлоре желудочно-кишечного тракта, от которой ежегодно происходит гибель значительной доли молодняка сельскохозяйственных животных[Ьауегпнсосса Р. et al., 2000]. Кроме того, добавление этих бактерий может способствовать консервированию барды (за счет накопления органических кислот и специфических антибиотиков) и продлить срок ее хранения, а соответственно и срок реализации без дополнительной энергозатратной сушки. Недостатком молочнокислого заквашивания барды является относительно низкое накопление белка, что может быть компенсировано введением грибных культур, например, базиди-альных, характеризующихся высоким (до 56% от сухих веществ) содержанием белка и высокой гидролитической активностью [Решетникова И.А., 1997]. Одновременное выращивание с вышеуказанными бактериями грибов-базидиомицетов, позволяет гидролизовать лигноцеллюлозные комплексы, а также дополнительно обогатить субстрат сахарами, витаминами, белковой массой и ферментами.

Цель и задачи исследования

Цель работы:

Изучение условий раздельного и совместного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий и гриба Lentinns tigrinas штамм ВКМ F-3616D.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние условий раздельного культивирования на послес-пиртовой барде и/или ее компонентах на рост пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба ЬепИпиз И^гтш ВКМГ-3616В;

2. Изучить влияние соотношения инокулятов изучаемых микроорганизмов при совместном культивировании на рост, накопление белка и редуцирующих веществ и биологическую стойкость получаемого продукта;

3. Изучить процессы совместного культивирования на послеспиртовой барде и/или ее компонентах пропионовокислых и молочнокислых бактерий, а также гриба ЬепИпш й^гтш ВКМ¥-3616В и молочнокислых бактерий.

Научная новизна

Впервые изучены возможность совместного культивирования базиди-ального гриба Ьепйпт Н^тиБ В КМ Е-361бО и молочнокислых бактерий на нативной барде и ее обезвоженном компоненте, подобраны оптимальные соотношения этих культур, обеспечивающие наибольшее накопление биомассы, белка, редуцирующих веществ. Исследована биологическая стойкость полученных препаратов. Также изучены процессы раздельного и совместного полунепрерывного культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий, обладающих пробиотической активностью на нативной послеспиртовой барде.

Научно-практическая значимость работы

На основании проведенных исследований, разработана и внедряется на ОАО «Мордовспирт» технология производства биопрепаратов на основе послеспиртовой барды и микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены для обсуждения на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева»,

Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008 г.), XXXVI Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева (Саранск, 2008), VIII республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2009 г).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фадеева, Ирина Васильевна

выводы

1. Совместное культивирование лактобацилл и бифидобактерий на по-слеспиртовой барде показало, что максимальное накопление биомассы, белка и числа клеток происходит при начальном значении рН равном 6,5 и температуре - 35-37°С. Раздельное культивирование этих микроорганизмов приводит к существенно меньшему накоплению биомассы и белка.

2. Установлено, что при выращивании бактерий на послеспиртовой барде инокулят пропионовокислых бактерий целесообразно вносить после 3-х часов предварительной инкубации лактобацилл.

3. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных как с помощью раздельного, так и с помощью совместного культивирования бактерий не превышает допустимой для животных нормы потребления.

4. Показано, что при хранении полученных препаратов при температуре 4°С свойства и максимальное количество живых клеток бактерий сохранялось до 28-30 суток.

5. Полунепрерывное совместное культивирование бифидо-, молочнокислых и пропионовокислых бактерий позволяет получить выход биомассы живых клеток до 7,4 г/л.

6. Совместное культивирование на барде грибов ЬепНпш й^гтт ВКМР-3616Б и молочнокислых бактерий приводит к более интенсивному росту культур и обогащению субстрата белком. Оптимальным вариантом для культивирования на нативной барде является - внесение 0,2% (по сухому весу) грибного инокулята и

2*10 КОЕ/л молочнокислых бактерий. Для твердого осадка барды оптимальным является внесение 2% (по сухому весу) грибного и о

5*10 КОЕ/кг твердого осадка бактериального инокулята.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеева, Ирина Васильевна, Саранск

1. Hugenholtz, J. Nutraceutical production by Propionibacteria / J. Hugenholtz, J. Hunik, H. Santos, E. Smid // Lait. 2002. - V. 82. - P. 103-112.

2. Van Luijk, N., M. P. Stierli, S. M. Schweninger, C. Herve, G. Dasen, J. P. M. Jore, P. H. Pouwels, M. J. van der Werf, M. Teuber, and L. Meile. 2002. Genetics and molecular biology of Propionibacteria.

3. Abadulla ,E. Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Tramies hirsuta /E. Abadulla, T. Tzanov, S. Costa, K.H. Robra, P.A. Cavaco, G.M. Guebitz //Appl.Environ.Microbiol.-2000.-V.66.-P.3357-3362.

4. Akayezu, J. Use of distillers grains and co-products examined / J. Akayezu, J. Linn, S. Harty, J. Cassady // Feedstuffs. 1998. - №12 - P. 11-13.

5. Akazama, H. Production of a mixture of antimicrobial organic acids from lactose by coculture of Bifidobacterium longum and Propionibacterium freudenreichii / H. Akazama, O. Takeda // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. -V.62.-P. 121-127.

6. Anand, S. K. Antibacterial activity associated with Bifidobacterium bifidum / S.K. Anand, R. A. Srinivasan, L. K. Rao // Cult. Dairy Prod. J. 1985. -V.20.-P. 21-23.

7. Annuk, H. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates / H. Annuk, J. Shchepetova, T. Kullisaar, E. Songisepp, M. Zilmer, M. Mikelsaar // J. Appl. Microbiol. 2003. - V. 94. - P. 403-412.

8. Arena, M. Biogenic amine production by Lactobacillus / M. Arena, M. Manca de Nadra //J. Appl. Micribiol. 2001. - V90. - P. 158-162.

9. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-bye binding / M.M. Bradford //Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

10. Bressler. D.C. Oxidation carbazole, iV-ethylcarbazole, fluorine, and dibenzothiophene by the laccase of Coriolopsis gallica / Bressler D.C., Fedorak P.M., Pickard M.A.//Biotech.Lett.-2000.-V.22.-P.l 119-1125.

11. Carneiro, A. Polyoxometalates as promoters of laccase-assisted reaction / A. Carneiro, A. Abreu, D.V. Evtuguin, S.P. Neto, G. Guebitz, A.C. Paulo // J. Mol. Catal. B Enzym.-2000.-V.9.-P.293-295.

12. Cheng, R. Growth characteristics of bifidobacteria species in whey base medium / R. Cheng, W. E. Sandine // J. Dairy Sci. 1989. - V. 72. - P. 148

13. Cibik, R. Characterization of autolytic enzymes in Lactobacillus pentosus / R. Cibik, M.P. Chapot-Chartier // Letters in applied microbiology. -2004. Vol. 38, № 6. - P/ 459-463.

14. De Vuyst, L Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria / L. De Vuyst, B. Degeest // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V.23, №2 - P. 153-177.

15. Deguchi, T. Nylon biodégradation by lignin-degrading fungi / T. Deguchi // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -V.63.-P. 329-331.

16. Faye, T. An antimicrobial peptide is produced by extracellular processing of a protein from Propionibacterium jensenii / T. Faye, D. A. Brede, T. Langsrud, I. F. Nés, H. Holo. // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 3649-3656

17. Feng, X. Propionic acid fermentation by Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 with a fibrous-bed bioreactor / X. Feng, B. Wu, X. Shen, H. Xu // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2008a. - V. 24, №6. - P. 1075-1079.

18. Feng, X., Kinetic analysis and pH-Shifït control strategy for propionic acid production with Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 / X. Feng , H. Xu , J. Yao , S. Li, H. Zhu , P. Ouyang // Appl Biochem Biotechnol. 2008b. -V. 15.-P. 121-132

19. Fukuda, T. Degradation of bisphenol A by purified laccase from Trametesvillosa / T. Fukuda, H. Uchida, Y. acashima, T. Uwajima, T. Kawabata, M. Suzuki // Biochem.Biophys.Res.Commun. 2001. - V.284. - P.704-706.

20. Fuller, R. Probiotics in man and animals. A review. / R. Fuller // J. Appl. Bacteriol. 1989. - V. 66. - P. 365-378.

21. Gill, D. R. The effect of probiotic feeding on health and performance ofnewly-arrived stocker calves / D. R. Gill, R. A. Smith, and R. L. Ball. // Okla. Agrie, Exp. Stn. 1987. - MP-119. - P. 202-204.

22. Gutiérrez A., del Rio J.C., Martinez M.J., Martinez A.T. Fungal degradation of lipophilic extractives in Eucalyptus globulus wood / A. Gutiérrez, J.C. del Rio, M.J. Martinez, A.T. Martinez // Appl.Environ. Microbiol. 1999. -V.65. - №4.-P. 1367-1371.

23. Hammel, K.E. Fungal degradation of lignin / Hammel K.E. In Cadisch G., Giller K.E. eds.Chap.2. Driven by nature: plant litter quality and decomposition.-United Kingdom: CAB International, 1997. P. 33-45.

24. Hosono, A. Characterization of a water-soluble polysacharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidum adolescens M-101-4 / A. Hosono, J. Lee, A. Ametani, M. Hatsume, M. Hirayama //Bisc. Biotech. Biochem. 1997. -V.61. — P.312-316.

25. Ibrahim, S. A. Inhibition of Escherichia coli by bifidobacteria / S. A. Ibrahim, A. Bezkorovainy // J. Food Prot. 1993. - V. 56. - P. 713-715.

26. Klein, G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria / G. Klein, A. Pack, C. Bonaparte, G. Reuter// Int. J. Food Microbiol. 1998. - № 41. -P. 103-125.

27. Klopfenstein, T. J. G Use of distillers by-products in the beef cattle feeding industry / T.J. Klopfenstein, G.E. Erickson, V.R. Bremer // J. Anim Sci. -2008. -V. 86. P. 1223-1231.

28. Krehbiel, C. R. Gilliland. 2003. Bacterial direct-fed microbials in ruminant diets: Performance response and mode of action. / C. R. Krehbiel, S. R. Rust, G. Zhang, and S. E. Gilliland // J. Anim. Sci. 2003. - V. 81. - P. 120132.

29. Lee, Y. Enhancement in ex vivo phagocytic capacity of peritoneal leukocytes in mice by oral delivery of various lactic-acid-producing bacteria / Y. Lee, T.S. Lee // Curr. Microbiol. 2005. - V. 50, № 1. - P. 24-27.

30. Mougin, С. Cleavage of the diketonitrile derivative herbicide isoxaflutole by extracellular fungal oxidases / Mougin C., Boyer F.D., Caminade E., Rama R. // J. Agric. Food Chem.-2000.-V.48.-P.4529-4534.

31. Mustafa, A. Chemical characterization and in vitro crude protein degradability of thin stilläge derived from barley- and wheat-based ethanol production / A. Mustafa, J. McKinnon, D. Christensen // Anim. Feed Sei. Technol. 1999.-V. 80.-P. 247-256.

32. Ojowi, M. Evaluation of weat-based wet distillers grains for feedlot cattle / M. Ojowi, D. Christensen, A. Mustafa, J. McKinnon // Can. J. Anim. Sei. -1997.-V. 77.-P. 447-454.

33. Parvez, S. Probiotics and their fermented food products are beneficial for health / S. Parvez, K.A. Malik, S. Ah Kang, H.Y. Kim // J. Appl. Microbiol. -2006. V. 100, № 6. - P. 1171-1185.

34. Pimentel, D. Ethanol production: energy, economic, and environmental losses / D. Pimentel, T. Patzek, G. Cecil // Rev Environ Contam Toxicol. 2007.-V.189. - P. 25-41.

35. Poypard, J.A. Biology of the bifidobacteria / J.A. Poypard, I. Husain, R. Norris //Bacterid. Rev. 1973. - V.37. -N32. -P.136-165.

36. Raghukumar, C. Lignin-modifying enzymes of Flavodon flavus, a basidiomycete isolated from a coastal marine environment / C. Raghukumar, T.M. D'Souza, R.G. Thorn, C.A. Reddy // Appl. Environ. Microbiol.- 1999.- V. 65.- № 5.- P. 2103-2111.

37. Soares, J.M.B. Decolorization of an anthraquinone-type dye using a laccase formulation / J.M.B. Soares, F.M. Costa, M.T.P. De Amorium //Bioresour.Technol.-2001 .-V.79.-P. 171-177.

38. Spichs M., Whitney M:, Shurson G. Nutrient database for distiller,s dried grains with solubles produced from ethanol plants in Minnesota and South Dakota / M. Spichs, M. Whitney, G. Shurson // J. Anim. Sci. 2002. - V. 80, № 10. -P. 2639-2645.

39. Tsutsumi, Y. Removal of estrogenic activités of bisphenol A and nonylphenol by oxidative enzymes from lignin-degrading basidiomycetes / Y.Tsutsumi, T.Haneda, T.Nishida //Chemosphere.-2001.-V.42.-P.271-276.

40. Vogel, R.F. Non-dairy lactic fermentations: the cereal world / R.F. Vogel, R. Knorr, M.R. Müller, U. Steudel, M.G. Gänzle, M.A. Ehrmann // Antonie

41. Van Leeuwenhoek. -1999. V. 76. -P.403-411.

42. Vorobjeva, L.I. Antimutagenicity of propionic acid bacteria / Vorobjeva L.I. et al. // Mutat.Res. 199К V.251, № 6. - P.233-239.

43. Wu, Y. Fractionation and characterization of protein rich material from barley after alcohol distillation / Wu Y. // Cereal. Chem. - 1986. - V. 63. - P. 142-144.

44. Алешкин, В.А. Микробиология на службе здорового питания /

45. B.А. Алешкин, И.М. Жакевич //Молочная промышленность. 1999. - №11.1. C.14.

46. Алимов, Т.Д. Получение силоса высокого качества / T.JI. Алимов //Зоотехния. 1992. - №9-10. С16-19.

47. Антипов, С.Т. Послеспиртовая зерновая барда. Технология переработки / С.Т. Антипов, A.B. Журавлев // Производство спирта и ликерово-дочных изделий. 2005. - №4. - С.9-11.шпох&ние- I1. УТВЕРЖДАЮ1. Генеральный директор1. АКТ ИСПЫТАНИЯ

48. На основании проведенных исследований получен продукт с пробиотическими свойствами:- содержание живых клеток бактерий 106 КОЕ/мл;- выход биомассы — 7,8 г/л;- оптимальный период хранения при 8 °С 19 суток.

49. Главный технолог ОАО «Мордовспирт»1. Н.А. Кручинина

50. Технический директор ОАО «Мордовспирт»1. В.Н. Хрущалин