Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические особенности гриба PANUS TIGRINUSВКМ F-3616D и свойства ферментов лигнолитического комплекса, продуцируемого им

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физиологические особенности гриба PANUS TIGRINUSВКМ F-3616D и свойства ферментов лигнолитического комплекса, продуцируемого им"

На правах рукописи

ЯГ5 ОД

7 5 СЕН 7пп*

А'ГЫКЯН

НЕЛЛИ АЛЬБЕРТОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИБА РАШБ тютмде ВКМ Е-36160 И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ ЛИГНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ИМ.

03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж 2000

Работа выполнена в лабораториях общей и промышленной микробиологии и спектрального анализа кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.В. Ревин. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Т. Епринцев. кандидат биологических наук, доцент Т.Н. Тертычная.

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится « » u.«XtJZ, 2000 г. в «IJ » час. на заседании Диссертационного Совета Д 063.48.11 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693 Воронеж, Университетская площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета. Автореферат разослан «

2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета лопор биологических наук,

профессор

Т. А. Ковалева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

Лигнин - сложный, трехмерный, нестереорегулярный полимер ароматической природы. Он является обязательным структурным компонентом всех высших сосудистых растений и составляет от 20 до 35 % сухого веса их биомассы. Широкое распространение лигнина неизбежно вовлекает его в сферу хозяйственной деятельности человека. Сложное строение лигнина обуславливает его устойчивость к химическому и микробиологическому разложению и создает ряд проблем при переработке лигноцеллюлозного сырья.

Интенсивные поиски путей переработки и утилизации лигиинсодержащих отходов выявили, что к полной биодеградации лигнина способны лишь так называемые грибы "белой гнили". Биодеградация лигнина, осуществляемая ими, многоступенчатый и полиэнзиматический процесс, зависящий от множества факторов, в котором участвуют как окислительные, так и гидролитические ферменты. Основные исследования по энзимологии разложения лигнина был:? проведены с грибом Phanerochaete chrysosporium, из глубинной культуры которого были выделены, очищены и охарактеризованы ферменты, инициирующие процесс деградации лигнина: лигнинпероксидаза, Mn-зависимая пероксидаза, а также ряд вспомогательных ферментов, например, псрекись-генерирующие (глюкозооксидаза, гли-оксальоксидаза и др.). При этом роль ключевого фермента отводилась лигнинпе-роксидазе. Однако, накопленные за последнее десятилетие данные по другим лигнинразрушающим грибам - Coriolus (Trametes) versicolor, Pleurotos ostreatus, Lentinus edodes, Panas (Lentinus) tigrinus и ряд др., свидетельствуют о том, что, помимо лигнинпероксидазы, роль ключевого фермента может выполнять Мп -пероксидаза, лакказа или пероксидаза.

На кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета был выделен высокоактивный лигнолитический гриб Panus (Lentinus) tigrinus BKM-F-3616D. Однако механизмы биодеградации лигнина данным грибом и ферменты, вовлеченные в лигнолизис, практически не исследовались.

Цели и задачи исследования.

Изучить состав, а также динамику и характер биосинтеза ферментов внеклеточного лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus при различных условиях культивирования. Выделить и охарактеризовать физико-химические свойства лакказы и пероксидазы гриба Panus tigrinus.

' В задачи исследования входило:

1. Провести сравнительный анализ биосинтеза отдельных ферментов грибом

3

при твердофазном и глубинном культивировании.

2. Изучить динамику биосинтеза лигнолитических ферментов грибом при твердофазном культивировании на природных и модифицированных лигноцел-люлозных субстратах.-

3. Разработать условия для максимального биосинтеза этих ферментов при глубинном культивировании.

4. Выделить и охарактеризовать лигнолитические ферменты гриба Рапиэ Ц-^¡пия.

Научная новизна.

Впервые исследован состав лигнолитического ферментного комплекса гриба Рати й^тив штамм ВКМ-Р-36160. Показано, что данный гриб синтезирует Мп-пероксидазу, пероксидазу и лакказу, а также перекись-генерирующий фермент -глюкозооксидазу, в условиях глубинного культивирования. При твердофазном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно пероксидазу и лакказу. Из глубинной культуры гриба выделены и охарактеризованы два фермента лигнолитического комплекса - лакказа и пероксида-за. Показано, что гриб синтезирует, по крайней мере, две изоформы оксидаз, одна из которых относится к желтым оксидазам. Впервые для грибов 1'агшх ^Нтк выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. -

Начно-практическая значимость работы.

Результаты исследования позволяют расширить представления о внеклеточном лигнолитическом ферментном комплексе грибов Рапиз ^¡пш.

Данные могут быть использованы для получения ферментов лигнолитического комплекса гриба Ратк Нлгшш» ВКМ Б-3616 Б. Активная культуральная жидкость может быть использована для модификцин лигноиеллюлозного материала с целью дальнейшего производства древесных пластиков.

Публикация и апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Рациональное использование лесных ресурсов» и на Всероссийской конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья». По материалам исследований опубликованы 2 тезиса и 1 статья принята в печать журналом «Биохимия».

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора ли-

тературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения и списка литературы. Библиографический указа1сль включает асе источника.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гриб Panus tigrinus ВКМ F-3616 D обладает высокой лигнолитиче-ской активностью, что делает перспективным использование его для биодеградации лигнина и биомодификации древесного сырья для производства древесных пластиков.

2. Лигнолитический ферментный комплекс гриба включает набор окислительных ферментов - пероксидаз и оксидаз и перекись-генерируюший фермент глюкозооксидазу.

3. При культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно лакказу и пероксидазу. Лакказа, вероятно, играет ведущую роль в процессах лигнолизиса данным грибом. Пе-роксидаза дополняет действие лакказы и, вероятно, участвует в де-токсикации продуктов деградации лигнина.

4. Разработаны оптимальные условия для биосинтеза лигнолитических ферментов грибом в условиях культивирования на жидких питательных средах.

5. Гриб Panus tigrinus ВКМ F-3616 D синтезирует несколько изоформ оксидаз, одна из которых, вероятно, относится к желтым лакказам.

6. Впервые для грибов Panus tigrinus охарактеризована пероксидаза, подобная пероксидазам растений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Микроорганизм и условия культивирования.

В работе использовали штамм Panus tigrinus ВКМ F-3616 D, выделенный сотрудниками нашей кафедры из сухих плодовых тел, растущих на березовом валежнике в окрестностях города Саранска и депонированный в ВКМ РАН под номером штамм ВКМ F-3616 D [Ревин В.В. с соавт., 1998].

Гриб поддерживали на косяках с сусло-агаром. Для приготовления инокулята гриба P.tigrinus культивировали в течение 4 суток на жидкой среде Чапека-Докса, содержащей 20 г/л кукурузного экстракта. Глубинное культивирование проводили на питательной срсде [Eggert С. et al, 1996] с добавлением витаминного раствора [Kirk Т.К. et al, 197В]. Выращивание культуры гриба в экспериментах по оптимизации условий культивирования проводили, варьируя концентрацию азота при фиксированной концентрации глюкозы; источники азота; источники углерода; конце»'!рации полимерных субстратов; концентрацию Твина-80; буферы для сред при различных значениях pH, а также использовали температурный сдвиг в

5

процессе культивирования. При твердофазном культивировании использовали различные природные и модифицированные лигноцеллюлозные субстраты. Стерилизацию жидких питательных сред проводили при 1 атм 20 мин, лигноцеллю-лозных субстратов - 1 атм 1 час.

Методы определения активности лигнолитических ферментов гриба.

Для приготовления препаратов ферментов культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение Юмин. Супернатант фильтрован! для полного освобождения от частиц субстрата или мицелия и использовали для определения активностей внеклеточных ферментов.

Для приготовления препаратов ферментов при твердофазном культивировании проросший субстрат заливали дистиллированной водой или ацетатным буфером рН 5,0, оставляли на 30 мин, периодически перемешивая. Далее центрифугировали (6000 об/мин, Юмин), супернатант фильтровали для полного освобождения от частиц субстрата или мицелия и использовали для определения лигполитической активности.

Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически с использованием специфических субстратов. За единицу активности принимали окисление 1 мкмоля субстрата или образование 1 мкмоля продукта в минуту. Удельную активность определяли как мкМ/мин/мг белка.

Выделение ферментов и изучение их свойств.

В экспериментах по выделению и изучению свойств пероксидазы и лакказы, гриб выращивали на среде того же состава с добавлением 5% березовых опилок в течение 8 суток.

Пероксидаза. Пероксидазу выделяли по методу, предложенному в работе [Газарян И.Г. с соавт., 1995] с использованием ТЭАЭ-целлюлозы. Влияние рН на скорость ферментативных реакций изучали в диапазоне рН 6-8. Влияние температуры на скорость ферментативных реакций определяли в интервале температур 20-40°С. Субстратную специфичность фермента оценивали с использованием следующих субстратов: АБТС, гваякола, ферроцианида, о-фенилендиамина, о-дианизидина.

Лакказа. Внеклеточную лакказу выделяли из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония (до 70% насыщения). Очистку лакказы проводили методами анионообменной хроматографии на ТЭАЭ-целлюлозе и гельфильтра-ции на Сефадексе С-25. Влияние рН на скорость ферментативных реакций изучали в диапазоне рН 5,5-8,4. Влияние температуры на скорость ферментативных реакций определяли в интервале температур 25 - 70"С. Субстратную специфичное 1ь фермента оценивали с использованием следующих субстратов: АБТС, гваякола,

6

о-фенилендиамина, RBBR, пирокатехина, сирингалдазина. Спектры поглощения лакказ снимали в 5 мМ K-фосфатном буфере pH 6,0 в диапазоне длин волн от 185 до 900 нм на спекорде М-40 при концентрации белка 0,3 мг/мл.

Белок в культуральной жидкости и ферментных препаратах определяли по методу Бредфорд [Bradford M.M., 1976]. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Биомассу определяли весовым методом

Аналитические методы.

Содержание лигнина в опилках определяли весовым методом [Zadrazil F., Brunnert H., 19В0]. Целлюлозу определяли по Апдеграфу [UpdegratT D.M., 1969]. Редуцирующие сахара определяли при помощи феррицианидного реактива [Си-ницын А.П. с соавт., 1990].

Все результаты подвергали статистической обработке на персональном компьютере IBM Р266. Использовались - электронные таблицы Microsoft Exel 2000, статистический пакет программ STAT2.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для определения состава внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса (ВЛФК) гриба P. tigrinus BKJVI F-3616 D и изучения характера лигнолитического процесса, осуществляемого им, исследования проводили в условиях

твердофазного культивирования на природных и модифицированных растительных субстратах. Было выявлено, что в процессе роста гриба наблюдается преимущественное потребление лигнина, что характерно для грибов данного вида [Головлева JI.A., Леонтьевский A.A., 1998]. Скорость потребления отдельных компонентов лигноцеллю-лозных субстратов разная. До 46 суток культивирования более активно идет потребление целлюлозы, а с 4 по 10 - лигнина (рис. 1 ).

Время культивировали«, сутки

Рис. 1. Динамика потребления лигнина(1) и иеллюлочы(2) в процессе роста гриба на осрсчовых опилках

Такой характер потребления компонентов лигноцеллюлоз связан, по мнению Кирка, с разным механизмом их утилизации и вкладом в метаболизм грибов [Kirk Т.К.., 1981]. Разрушение целлюлозы восполняет ростовые и энергетические потребности организма, тогда как лигнин, вероятно, не следует рассматривать как источник энергии. После 10 суток культивирования наблюдается некоторое снижение интенсивности потребления лигнина. Убыль целлюлозы, напротив, интенсифицируется. Вероятно, это связано как с накоплением продуктов деградации лигнина, временно подавляющих активность лигниназ, так и с увеличением доступной целлюлозы, вследствие разрушения лигнина субстрата.

Характер потребления лигнина менялся также в зависимости от лигноцеллюлозного субстрата. В работе использовали опилки мягкой (береза), твердой (бук) и хвойной (сосна) древесины, а также пшеничную солому. Убыль лигнина была выше при культивировании гриба на березовых опилках (рис 2.).

Такой характер потребления лигнина, вероятно, связан как с долей в субстрате лигнина, целлюлозы, гемицеллюлоз, так и со строением самого лигнина [Занрометов М.Н., 1993].

Исследование характера проявления лигнолитической активности культурой P. tigrinus при твердофазном культивировании показало соответствие представлениям об этом процессе, известном для грибов белой гнили. Лигнолитическая активность детектировалась, начиная с 4 суток культивирования, и достигала максимальных значений на 8 сутки (рис. 3.), что совпадало с периодом интенсивного потребления лигнина. Синтез лакказы грибом при твердофазном культивировании на березовых опилках совпадал с проявлением лигнолитической активности и потреблением лигнина. Это позволяет предположить ведущую роль лакказы в биодеградации лнгнина изучаемым грибом. 11ероксидазная же активность гриба дезекшро-валась лишь после 10 суток культивирования.

8

О березовые опилки В сосновые опилки

В буковые опилки □ пшеничная солома

Рис. 2. Уровень потребления лигнина при росте гриба на природных и модифицированных лигноцсллюлозных субстратах

Мы предположили, что пероксидаза в составе ВЛФК Р. Пшгшб играет вспомогательную роль, дополняя действие лакказы и участвуя в детоксикации продуктов деградации лигнина.

Как показано в работах [Напечет К й а1., 1976; Ганбаров Х.Г., СамедоваР., 1989] это позволяет сняп> фенолы шш барьер в среде обитания дереворазрушаю-гцих грибов Характер проявления лигнолитической активности н синтеза ферментов ВЛФК зависел от вида лигноцеллюлозного

При культивировании на сосновых опилках лигнсшитическая акптность и синтез ферментов были в несколько раз шоке. Нами была исследована возможность повышения лигнолитической активности гриба при росте на растительных субстратах. Для этого мы провели химическую и физическую модификацию субстрата. Химическая модификация субстратов изменила, прежде всего, соотношение отдельных компонентов в субстрате. Модификация сосновых и березовых опилок водным раствором аммиака привела к частичной деяигнификации. На таких субстратах гриб довольно интенсивно рос, вероятно, за счет низкомолекулярных и легкодоступных продуктов деструкции компонентов опилок [Го-ловлева Л.А., Черменский Д.Н., 1983], но с метшей скоростью потреблял лиг-шш (рис. 2). Кислотная обработка субстратов напротив вызвала частичный гидролиз гемицеллюлоз и увеличение относительной доли лигнина и целлюлозы в огаетках. Рост гриба и потребление им лигнина на таких субстратах были менее интенсивными. Лишь физическая модификация (воздействие ультразвуком в течение 10 минут) привела к увеличению убыли лигнина. Вероятно, ультразвук уменьшил кристалличность целлюлозы, увеличив ее доступность воздействию целлюлошггических ферментов, а также модифицировал лигнин, изменив его структуру, разрушив связи между лигнином и целлюлозой или гемицеллюлозой.

Модификация субстратов изменила и характер проявления лигнолитической

210 п

140 ■

70-

3

Г ТО ¡1

4 6 8 10 12 14 Время культивировали*, сутки лакхгиа

—лигнолитическая активность —•—пероксидаза «-

Рис. 3. Динамика проявления лигнолитической активности в синтеза отдельных ферментов ВЛФК грибом при культадированни на березовых опилках

3 и

о

Й о

4 п

г. с-

ТХ и

Я О

£

о"

1 -

активности, а также синтез отдельных ферментов ВЛФК грибом. Максимальные значения лигнолитической активности наблюдались при культивировании на сосновых опилках, модифицированных ультразвуком (рис. 4).

Б то же время, синтез пе-роксидазы грибом был выше при культивировании на химически модифицированных березовых опилках. Лакказ-ная активность увеличилась лишь при использовании модифицированных сосновых опилок, однако по максимальным значениям она совпадала с уровнем синтеза данного фермента грибом при культивировании на не-модифицированных березовых огогаках. Таким образом, модификация субстрата привела к повышению уровня пероксидазной активности, что вероятно, связано с индукцией синтеза фермента

Л к

П с;

Р

и

I

а ■§• э- ч

5 о £ 2

а. 2 я

ь = л

о 5 -е-5 §

» о

И пероксидаза, березовые опилки Ш пероксидаза. сосновые опилки Влакказа. березовые опилки П лакката. сосновые пипки Рис. 4 Биосинтез пероксидаэы и лакклзы грибом при твердофазном

культивировании на модифицированных субстратах

низкомолекулярными продуктами деструкции лигнина [Ахмедова З.Р., 1992].

Использование твердофазного культивирования для получения лигноли-тиче-ских ферментов имеет один существенный недостаток. Водные или буферные экстракты ферментов проросшего субстрата содержит большие количества водорастворимого лигнина, который затрудняет последующую очистку. Альтернативным способом является получение ферментов из жидкой культуры гриба. Грибы белой гнили характеризуются высокой требовательностью к условиям культивирования, рН, температуре, концентрации азота и углерода и их источникам. Условия, оптимальные для синтеза лигнолитических ферментов одним штаммом, приводят к полному ингибированию синтеза ферментов у других штаммов. Поэтому следующий этап нашей работы заключался в оптимизации условий глубинного культивирования гриба Р. с целью увеличения выхода лигнолитических ферментов.

Важный фактор синтеза лигнолитических ферментов и роста гриба - что рН среды культивирования. В литературе описано несколько довольно дорого-тоящих буферных систем, стимулирующих лигниназную активность гриба РИ.

chrvsosporium - фталатная [Kirk Т.К. et al., 1978], диметилсукщшатная [Tien M., ] 987] и др. Позднее была показана возможность их замены на более дешевые -ацетатную [Dass S.В., Reddy С.А., 1990], тартратную или пиромелитов\то (Мя-соедова Н.М., 1993] и др. В своей работе мы исследовали влияние ряда буферных систем при рН 4,5. Оптимальными для биосинтеза и пероксидазы, и лакка-зы грибом были тартратная буферная система и среда без буфера. Оптимальным рН при использовании данных вариантов был рН 3,0.Однако, такой высокий уровень синтеза пероксидазы наблюдался лишь на 4 сутки культивирования, затем активность резко снижалась. Для биосинтеза лакказы оптимальным был рН 4,5 при росте гриба на среде, не содержащей буфера. В данном варианте наблюдалась и довольно высокая пероксидазная активность. Поэтому данный вариант - рН 4,5, без буфера, был использован для дальнейших экспериментов.

Нами была исследована возможность увеличения выхода лигноттгческих ферментов при температурном сдвиге в процессе культивирования. Сдвиг температуры культивирования при переходе культуры ко вторичному метаболизму мало повлиял на биосинтез лигнолитическкх ферментов. Лишь в случае пероксидазы сдвиг температуры до 20-22°С привел к увеличению синтеза в 2.5 раза к 12 суткам. Однако содержание белка в культуралыюй жидкости было очень низкое (28 мг/л), что затруднило бы лолуче!ше ферментов при данных условиях.

105

ЕЗ Mn-псроксндаза ВЛакказа ПI (сроксидаза □ ГлкжоюоконЬна Рис. 5. Влияние Твина-80 на биосинтез ферментов лигнолитичсского комплекса | pm'j l'anus 1 igrinu.s

поиграл!. 0,025 0,05 0,1 0.2

Коицектраиня Твина-80, %

Увеличить выход белков, а, следовательно, и лиг-нолитических ферментов, можно, вводя в среды определенные вещества, например, детергенты. Это позволяет также избегать сбивания культуры в комок и инакпгвации лигно.титиче-ских ферментов [АБШег е1 а1., 1997: Уепка1а<1п Я., Ьтте Я., 1990]. Мы вводили в среды Твин-80 (рис. 5). На средах с варьированием концентрации Твина-80 максимум биосинтеза лакказы и Мп-пероксидазы наблюдался на среде, содержащей 0.025% детергента. На биосинтез

И

пероксидазы и глюкозооксидазы грибом наиболее благоприятное воздействие оказала более высокая концентрация Твина-80 - 0,1 %. Таким образом, введение низких концентрации детергента от 0,025 до 0,1 % стимулирует биосинтез лиг-нолитиче-ских ферментов [Asther et al., 1987] и их секрецию из клетки [Сар-devila С et al., 1990]. Однако, несмотря на то, что введение Твина-80 позволило повысить выход ферментов, применение этого варианта для получения фермента затруднено, так как при этом в культуральной жидкости гриба присутствуют балластные внеклеточные белки, препятствующие выделению и очистке лигнолитических ферментов.

Лигнолигическая активность грибов белой гнили носит конститувный характер, и ее проявление не зависит от наличия лигнина или его производных. Однако, уровень активности, включая титр отдельных ферментов, может быть повышен внесением лигнина или специфических индукторов в культуральную среду [Faison B.D., Kirk Т.К., 1985]. В качестве индукторов можно использовать растительные субстраты, присутствие которых в среде многократно повышает синтез лигнолитических ферментов [Ахмедова З.Р., 1994]. В своей работе в качестве индукторов мы использовали естественный лигноцеллюлозный субстрат - березовые опилки, а также отход производства фурфурола - целлолигнин, в концентрации от 0,5 до 5 %. При добавлении в питательные среды различных концентраций березовых опилок, синтез Mn-пероксидазы увеличится почти в 5

¡15

Концентрации березовых опилок, %

В пероксидага В Мл-пероксидаза □ лакказа □ глюкозооксидаза

Рис. 6 Биосинтез лигнолитических ферментов грибом в присутствии березовых опилок в среде

контроль 12 5

£

2

5

.раз (рис. 6). Более высокие концентрации березовых опилок (5%) вызван; увеличение биосинтеза пероксидазы и лак-казы. Благоприятное влияние на биосинтез лигнолитических ферментов березовых опилок, вероятно, связано с индукцией низкомолекулярными продуктами деградации лигнина. Возможно также, что целлюлоза является кометаболизируе-мым субстратом и источником энергии для биосинтеза лигнолитических ферментов [Kirk Т.К., 1981].

Синтез лигнолитических ферментов на средах с варьиро

ванием концентрации целлолигнина был в несколько раз ниже, чем в контрольной среде и вариантах с добавлением березовых опилок. Неблагоприятное действие целлолигнина на биосинтез пероксидаз и лакказы грибом, вероятно, обусловлено наличием каких-то ингибирующих веществ, переходящих в культуральную среду из целлолигнина.

Было обнаружено, что лигнолитические ферменты синтезируются в ответ на азотное [Keyser P. et al, 1978] или углеродное голодание [Jeffries T.W. et al, 1981] при переходе культуры гриба ко вторичному метаболизму. Увеличение концентрации углерода или азота в питательной среде полностью подавляет синтез как лигнинпероксидазы, так и Mn-пероксидазы [Buswell J.A., Odier Е., 1987; Tien M.", Kirk Т.К., 1988]. В своей работе мы исследовали влияние соотношения азота и углерода в питательной среде на биосинтез ферментов грибом (таблица 1).

Таблица 1. Влияние соотношения азота и углерода на биосинтез ферментов Р.

tigrinus.

Соотноше- Пероксидазная Мп- перокси- Лакказная ак- Глюкозоокси-

ние C/N (в активность. дазная актив- тивность, дазная актив-

мМ) ед/мл ность, ед/мл ед/мл ность, ед/мл

5,6:1,2 2,71 1,57 0,061 0,16

5,6:2,4 0,68 1,80 0,069 0,91

5,6:12 0,43 0,76 0,015 0,19

5,6:24 0,64 1,11 0,092 0,28

17: 1,2 0,03 0,82 0,138 0,37

17:2,4 0,12 1,17 0,184 0,17

17:12 0,09 17,20 0,092 0,11

17:24 0 6,59 0,107 0,52

28 : 1,2 0,77 1Д7 0,276 0,81

28: 2,4 0,34 17,20 0,207 0,67

28 : 12 0,30 3,56 0,138 0,23

28 : 24 4,05 2,33 0,046 0,21

56 : 1,2 0,07 1,17 0,046 0,13

56 : 2,4 0,23 1,34 . 0,115 0,17

56: 12 1,94 7,99 0,115 0,12

56:24 0,59 3,85 0.122 0,20

84 : 2,4 0.36 3,73 0,483 0,72

112 :2,4 0,18 12,71 0,161 0,39

Было выявлено, что максимальный синтез Мп-пероксидазы наблюдается при содержании в среде 28 мМ глюкозы и 2,4 мМ азота - соотношение С/Ы=12:1, пероксидазы - при содержании в среде 28 мМ глюкозы и 24 мМ азота - соотношение С/Ы = 3:2, лакказы - на среде, содержащей 84 мМ глюкозы и 2.4 мМ азота. На биосинтез той или иной пероксидазы большее влияние оказывает концентрация азота в питательной среде - максимум Мп-пероксидазы наблюдается на средах с низкой и средней концентрацией азота (2,4 или 12 мМ), а пероксидазы - при высокой (24 мМ). На биосинтез же лакказы большее влияние оказывает концентрация глюкозы в питательной среде.

Регулирующим эффектом обладает не только концентрация азота или углерода в питательной среде, но и их источник. В нашей работе были использованы пяти и шести-членные моносахариды (арабиноза, фруктоза, манноза, глюкоза), дисахариды (мальтоза, целлобиоза, сахароза), глицерин, полисахариды (крахмал, КМЦ) в качестве источников углерода. В контрольном варианте источником углерода служила глюкоза. Сахара добавляли в концентрации 5 г/л при концентрации азота 2,4 мМ (сульфат аммония). Из проверенных Сахаров на биосинтез пероксидазы и лакказы наибольшее влияние оказал крахмал (рис. 7).

йлероксидаза ВМп-нерокслдаза Олакказа

Рис. 7. Влияние различных источников углеродного питания на синтез лш поэтических фермснюв грибом

Вероятно, в результате его постепенного гидролиза происходит более медленное накопление кислоты, чем при потреблении глюкозы [Решетникова И.А., 1997]. Пероксидазная и лак-казная активности на средах с различными сахарами достигали максимальных значений на 6 сутки роста. Максимум синтеза Мп-пероксидазы был отмечен на среде с целлобиозой, а глюкозооксидазы - на среде с мальтозой и крахмалом. Из источников азота наиболее оптимальным для био-сишеза ферментов был сульфат аммония (кон-

троль). Другие источники азота, как органические, так и неорганические, не оказывали существенного влияния на уровень биосинтеза ферментов ВЛФК.

Анализ экспериментального материала, полученного при изучении влияния физиологических условий и условий культивирования на биосинтез отдельных ферментов ВДФК - пероксидазы, Мп-пероксидазы и лакказы показал, что наиболее благоприятное влияние оказывает введение индукторов (березовых опилок) в питательные среды. Среда, содержащая 5 % березовых опилок, была использована нами для выделения двух ферментов ВЛФК - лакказы и пероксидазы.

Пероксидазу Р. И%гти5 выделяли из культуральной жидкости в период ее максимальной активности методом анионообменной хроматографии с предварительным отделением пигментов. Результаты выделения и очистки пероксидазы на данном носителе показали, что происходило концентрирование фермента в узкой зоне, в диапазоне пятой-десятой фракций, что может свидетельствовать о биосинтезе грибом одной изоформы пероксидазы. Чтобы определить, к какой группе пе-роксидаз относится выделенный нами фермент, мы изучали его свойства, субстратную специфичность (рис. 8) и сравнивали его с растительными и грибными пероксидазами, описанными в литературе. Было выявлено, что оптимум рН выделенной пероксидазы при окислении о-дианизидина соответ-. ствовал 7,0, а оптимум температуры 25°С. Наиболее специфичным субстратом для пероксидазы гриба являлся гваякол (рис. 8). Добавление Мп(Н) при измерении активности с АБТС не вызывало активации, характерной для Мп-зависимых пероксидаз. Таким образом, пероксидаза гриба Р. П^ппт шт. В КМ Р-36160, по-видимому, относится к секреторным пероксидазам, подобным пероксидазам растений.

Выделение лакказы - второго фермента лигнолитического комплекса гриба РагшБ ^ппиБ методом гель-фильтрацин привело к получению нескольких фракций с высокой оксидазной активностью. Мы обозначили выделенные ферменты как оксидаза 1, оксидаза 2 и

15

360

ш

<

1 0 ЛВТБ

2 ¡3 гваякол

3 0 ферроцнанид

4 0 о- фенилендиамнн

5 0о-днаннзндин

Рис. 8. Субстратная специфичность пероксидазы гриба Рапдо (¡йгтиэ

оксидаза 3.

Изучение субстратной специфичности выделенных ферментов показало, что оксидазы 1 и 3 практически не окисляют ABTS и имеют сравнительно низкую активность по отношению к пирокатехину (рис. 9).

Оксидаза 2 окисляет все использованные субстраты, причем по отношению к

ABTS и пирокатехину актив-

1600

ABTS

пирокатехин

ность была наибольшей по сравнению с другими фракциями. Изучение рН и температурной зависимости этих ок-сидаз показало, что, оптимальными при окислении пирокатехина является рН 7,0 и температура 65°С. Анализ полученных данных позволяет предположить, что оксидаза 3 является изоформой оксидазы 1 и их однозначно нельзя отнести к классическим лакказам. А оксидазу 2 с большой долей вероятности можно считать

фенил ендиамин

В оксидаза 1 ЕЗ оксидаза 2 В оксидаза 3 1'нс. 9. Субстратная специфичность окснла) гриба Panus tigrinus

лакказой. Т.е. гриб Panus tigrinus продуцирует по крайней мере 2 изоформы нетипичных высокостабильных оксидаз. Для того чтобы отнести выделенный фермент к той или иной группе лакказ, а также оценить состояние атомов меди в активном центре мы снимали спектр поглощения очищенной лакказы (рис. 10).

Анализ полученного спектра показал наличие нескольких пиков поглощения: при 280 нм (максимум поглощения белка), а также плечи при 329 нм и 341 им. Плечо при 329 нм свидетельствует о том, что выделенная лакказа содержит медь третьего типа. Плечо при 341нм, вероятно, связано с поглощением продуктами деградации лигнина присутствующими в препарате лакказы. В тоже время в спектре поглощения отсутствует пик при 610 нм, характерный для классических голубых лакказ.

Сравнивая полученный нами спектр со спектрами поглощения желтой оксидазы гриба Panus tigrinus 8/18 и лакказы из Coriolus versicolor ВКМ F-116, можно сделать предположение, что выделенная нами лакказа относится к желтым окси-дазам [Леонтьевский A.A. с соавт., 1990].

3,0

185 328 471 614 757 900

Рис. 10. Спектр поглощения лакказы фиоа Рамия ^нния ВК.М Р-3616Э

Таким обрачом, результаты наших экспериментов покачали, что гриб Рашк и^шш синтезирует несколько ферментов лигнолитического комплекса - оксида-зы и псроксидазы в условиях твердофазного культивирования на естественных или модифицированных лигнопеллюлозных субстратах и мри пофуженном культивировании. Нами были подобраны оптимальные условия для биосинтеза отдельных ферментов, а также выделены два лигнолитических фермента - иерокси-даза и лакказа. На основании изучения свойств этих ферментов было показано, что гриб Рашк ^^шия синтезирует несколько изоформ оксидаз, одна из которых близка к желтой лакказе. Также впервые для грибов Рапив ^птк была выделена и охарактеризована пероксидаза подобная растительным пероксидазам.

3. ВЫВОДЫ.

1. Лакказа в составе ферментного комплекса гриба Рапиэ ^ппиБ играет ведущую роль в процессах деградации лигнина.

2. Пероксидаза в составе лигнолитического комплекса гриба дополняет действие лакказы и участвует в дстоксикацпп продуктов деградации лигнина.

3. При различных условиях глубинного культивирования гриб Рапия ^ппия

синтезирует несколько ферментов лигнолитического комплекса - Мп-пероксидазу, лакказу и пероксидазу, а также перекись-генерирующий фермент глюкозооксидазу.

4. Максимальный синтез лигнолигических ферментов наблюдается при глубинном культивировании гриба на синтетической среде с добавлением березовых опилок (естественного лигноцеллюлозного субстрата).

5. В состав внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса Panus ti-grinus ВКМ F-3616 D входит иероксидаза растительного типа.

6. Изучение физико-химических свойств лакказ гриба показало наличие в лиг-нолитическом комплексе, по крайней мере, двух ферментов оксидазной природы, один из которых, вероятно, относится к "желтым" оксидазам.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Получение активного инокулята гриба Panus tigrinus штамм ВКМ F-3616 D для биомодификации древесного сырья. / соавт. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Ситкин Б.В., Смирнов A.B. // Материалы международной научно-практической конференции «Рациональное использование лесных ресурсов» 20-22 апреля 1999 года. - Йошкар-Ола, 1999. - С. 71-72.

2. Изучение ферментов лигнолитического комплекса ксилотрофного гриба Panus tigrinus штамм ВКМ F-3616 D, участвующих в биодеградации отходов древесины. I соавт. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Лафуткина Т.Т. // Материалы Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья» 27-30 сентября 1999 года. -Саранск, 1999. - С. 125 - 128.

3. Выделение и свойства пероксидазы, продуцируемой грибом Panus tigrinus. / соавт. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Ситкин Б.В., Самуилов В.Д. // статья находится в печати.