Липиды мицелиальных грибов как основа для создания биодизельного топлива

Ивашечкин, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Липиды мицелиальных грибов как основа для создания биодизельного топлива
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Липиды мицелиальных грибов как основа для создания биодизельного топлива"

На правах рукописи

Ивашечкин Алексей Александрович

Липпды мнцелиальных грибов как основа для создания биодизельного топлива

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 ОКТ 2015

Москва-2015

005563281

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель:

Д.б.н., засл. деятель науки РФ, профессор Феофилова Елена Петровна Официальные оппоненты:

Белов A.A., д.т.н., доц. каф. биотехнологии Российского химико-технологического университета Д.И. Менделеева

Краснопольская JI.M. д.б.н., академик РАЕН, зав. лаб. биосинтеза биологически активных веществ Института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Защита состоится "22" сентября 2015 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1. Тел.: 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ и на сайте биологического факультета МГУ: http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан__2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Пискункова Н.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Мицелиальные грибы широко распространены в природе, и в настоящее время полагают, что число их видов достигает одного миллиона. Грибы представляют собой гетерогенную по физиолого-биохимическим свойствам группу и сходны как с растениями, так и с животными. Особый интерес представляют лнпиды грибов, которые контролируют наиболее важные функции клеток: образуют полунепронициаемую мембрану, являются матриксом для белков, участвуют в генерировании энергии, передаче сигналов, обеспечивают транспорт веществ и репликацию ДНК, регулируют активность ферментов. Помимо выполнения этих функций липиды служат одним из главных энергетических ресурсов клетки, что заставляет изучать олеагенные штаммы грибов с целью получения биодизельного топлива, представляющего собой смесь моноалкпловых эфиров жирпых кислот. Актуальность данной проблемы подтверждается как истощением запасов горючих ископаемых, так и влиянием сжигания различных видов топлив на экологическое состояние окружающей среды.

В настоящее время разработаны способы получения биодизельного топлива из различных видов масличных растений, например, рапса, разрабатываются подходы к использованию микроводорослей и грибов. Но каждый из предлагаемых продуцентов для получения биодизеля имеет свои недостатки. Так, выращивание масличных культур приводит к повышению цен на продовольствие и загрязнению пахотных земель пестицидами, выращивание водорослей требует ферментеров сложной конструкции, и состав липидов водорослей не в полной мере удовлетворяет требованиям, предъявляемым к жирнокислотному составу организмов-продуцентов международными стандартами.

Поэтому особую актуальность приобретает проблема поиска подходящего олеагенного продуцента для получения биодизельного топлива.

По сравнению с другими возможными продуцентами биодизельного топлива мицелиальные грибы имеют ряд преимуществ:

1. Липиды грибов почти не отличаются по составу основных жирных кислот от липидов высших растений.

2. Мицелиальные грибы обладают одной из наибольших скоростей накопления биомассы.

3. Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и величины посевных площадей, возможно круглогодичное получение продукта.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение лшщдов мицелиальных грибов как возможной основы для получения биодизельного топлива.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг коллекционных штаммов с целью отбора наиболее активного организма-продуцента лшщдов.

2. Определить основные характеристики липидов организма-продуцента, а также биодизельного топлива из них полученного, и соответствие характеристик международному стандарту EN 14214.

3. Оптимизировать схему получения липидов продуцентом для снижения себестоимости производства:

а) заменить источники азота и углерода более дешевыми веществами, в том числе и отходами различных производств;

б) изучить влияние возраста посевного материала на липогенную активность мицелия; установить тип покоя и активаторы прорастания спор организма-продуцента;

в) подобрать экологически безопасные условия процесса экстракции липидов. Научная новизна и практическая значимость работы. Теоретическая ценность

проведенных исследований состоит в установлении новых закономерностей в области липидообразования:

1) установлена прямая зависимость между содержанием липидов в спорах и в выросшем из них мицелии;

2) впервые обнаружен концентрационный эффект действия экзогенной трегалозы на рост, липогенную активность и состав липидов С. japónica;

3) впервые получены данные, свидетельствующие о ряде отличий грибов рода Cimninghamella от других мукоровых грибов в отношении липидообразования гетероталличных штаммов, в частности, способность (+) и (-) штаммов С. japónica синтезировать линоленовую кислоту (С18:з), что может свидетельствовать о другом типе гормональной регуляции полового процесса.

4) впервые показана роль антиоксидантов в биодеградации лигнина L. tigrintis в сравнении с грибами неспособными использовать лигнин и высказывается предположение о смене мессенджера - фосфатидной кислоты - на фосфатидидинозит при добавлении в среду с лигнином антиоксидантов.

С практических позиций новизна настоящей работы определяется следующим: 1) найден активный продуцент липидов, способный образовывать до 50% липидов.

2) определены основные характеристики липидов организма-продуцента и биодизеля, полученного на их основе, установлено соответствие биодизеля принятым международным стандартам.

3) с целью снижения стоимости среды культивирования апробирована замена источника азота на легкодоступный и дешевый нитрат аммония, а глюкозы - на ряд отходов других производств, в том числе, отход от производства биодизеля - глицерин;

4) показан стимулирующий эффект экзогенной трегалозы на рост гриба и выход липидов;

5) рекомендована замена растворителей на стадии экстракции липидов на сверхкритический С02;

6) разработан и получен патент на изобретение RUS 2468077 "Способ получения липидов" 11.02.2011г.;

7) разработана принципиальная схема получения липидов С. japónica как основы для биодизельного топлива, позволяющая получать одновременно с этим глицерин и противоожоговые препараты на основе обезжиренных клеточных стенок.

Апробация результатов диссертационной работы. Основные результаты работы были представлены в виде докладов и публикации тезисов на научных конференциях и молодежных научных школах, среди которых: 7я всероссийская научная молодежная школа с международным участием "Возобновляемые источники энергии" (Москва, 2010 г.), XXIII международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биолопш и биотехнологии" (Москва, 2011 г.), конкурс молодежных инновационных научно-технических проектов "УМНИК-2012".

Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и 7 тезисов, получен патент на изобретение.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов,_глав собственных

результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы,

включающего_источников, в том числе_иностранных. Работа выполнена на_

страницах машинописного текста, имеет иллюстрированное приложение с _

таблицами и_рисунками.

Материалы и методы исследования Объекты исследования. Основным объектом исследования служил представитель низших мицелиальных грибов Cimninghamella japónica ВКМ F-1204 (-) (syn. Cunninghamella echinulatá). В работе всего было использовано 25 штаммов мицелиальных грибов, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов, коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ и коллекции культур лаборатории экспериментальной микологии ИНМИ РАН.

Культивирование на жидких питательных средах. Глубинное культивирование с целью сбора биомассы осуществляли на круговой качалке при 220 об/мин при 27-28°С в колбах объемом 250 мл с 50 мл питательной среды. Инокулятом служили 7-суточные конидии, полученные смывом культуры со скошенного сусло-агара. Водную суспензию клеток вносили в питательную среду в количестве 2-2,5% об..

Питательные среды, использовавшиеся в работе. В качестве исходной среды использовали среду Гудвина следующего состава (%): глюкоза - 5,0, аспарагин - 0,2, КН2РО4 - 0,1, MgS04 • 7Н20 - 0,025, дрожжевой экстракт - 0,1. Состав остальных сред, использовавшихся в работе, приведен в рукописи.

Экстракцию линидов проводили по методу Фолча (Folch et al., 1957) с модификациями. Состав фракций нейтральных липидов (НЛ) и полярных липидов (ПЛ) анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали методом кислотного метанолиза. Качественный и количественный анализ состава жирных кислот (ЖК) общих липидов (OJI) проводили на газожидкостном хроматографе Хроматэкс Кристалл 5000.1 (Россия).

Степень ненасыщенности (СН) липидов рассчитывали по формуле:

£ % моноеновых ЖК + 2 х £ % диеновых ЖК + 3x2% триеновых ЖК

СН = "----

100

Йодное число рассчитывали по формуле (Глушенкова и др., 1970):

V"1 dl X (Ú!

ИЧ= > ' '

Z_i 100

t=n

где а, - коэффициент для каждой ЖК; ш,- содержание данной кислоты в сумме ЖК. Цетановое число рассчитывали согласно (Bamgboye, 2008) по формуле: ЦЧ=61,1 +(0,088 х С14:0) +(0,133 х С16:0) +(0,152 х С,*,)-(0,101 * С18:0)-(0,039 х С,s:i) - (0.243 х CIM) - (0,395 х С18:3), где С - содержание каждой кислоты.

Результаты были получены в 3-5 кратной повторноети, при изучении прорастания спор обсчитывали не менее 100 спор, обработку результатов проводили с применением метода медианы (Ашмарин, Воробев, 1962).

Результаты исследований н их обсуждение

Глава 1. Скрининг олеагенных штаммов грибов и выбор наиболее активного продуцента липидов

Целью первого этапа исследования был выбор активного продуцента липидов среди представителей мицелиальных грибов. Всего было проанализировано 19 штаммов, относящихся к 3 классам мицелиальных грибов (Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes) (табл. 1). Из приведенных результатов видно, что представители мукоровых грибов, в частности сем. Cunninghamellaceae, в отличие от представителей высших грибов были способны накапливать значительные количества липидов - 43,050,7% от сухой биомассы, а максимальный выход липидов составил 5,3 г/л у С. japonica ВКМ F-1204(-). Несмотря на то, что представители аскомицетов обладали активным ростом (до 15,3 г/л), исследованные штаммы имели невысокую способность к образованию липидов (до 22,78%). Хотя многие аскомицетные грибы давно и широко применяются в биотехнологии, многие их представители обладают феноменом вторичного роста, в результате которого синтезированные липнды повторно используются для поддержания ростовых процессов, что ограничивает применение аскомицетных грибов для получения липидов как конечного продукта.

Таблица. 1. Исследуемые штаммы мицелиальных грибов и их способность к липидообразованию

Организм Биомасса, г/л Липиды

% г/л

Zygomycetes

Absidia caerulea ВКМ F-858(+) 6,2 12,8 0,79

Cunninghamella echinulata ВКМ F-470(-) 7,1 43,0 3,05

С. echinulata ВКМ F-626(-) 6,9 47,1 3,23

С japonica ВКМ F-1204(-) 10,5 50,7 5,32

Ascomvcetes

Aspergillus niger BKM F-33 10,0 11,2 1,12

A. japonicus BKM F-2632D 8,6 13,5 1,16

Penicillium chrysogenum МГУ 15,3 5,3 0,81

P. lanosum BKM F-297 7,0 22,8 1,56

Basidiomycetes

Lenthinus tigrimis BKM F-160 2,3 9.8 0,23

Pleurotus ostreatus ИНМИ 3,4 5,0 0,17

Определение состава и содержания жирных кислот липндов у представителен р. Cunninghamella.

На втором этапе скрининга мы изучили накопление биомассы и лшшдооборазование, а также качественный и количественных состав лшшдов и ЖК нескольких штаммов С. japónica и родственных видов.

На 5-е сутки культивирования для всех исследуемых штаммов (табл. 2) величина накопленной биомассы на среде Гудвина превышала 14 г/л, при этом наибольшая величина (19,16 г/л) отмечена для штамма F-1204 (-). Все штаммы характеризовались высокой липогенной активностью, и содержание лшшдов находилось в пределах 37-47%.

Таблица 2. Накопление биомассы и способность к липидообразованию исследованных штаммов СиптпфатеПа (среда Гудвина, 5 сут.) _

Штамм -----, —j Биомасса, г/л Липиды

% г/л

С japónica ВКМ F-1204(-) 19,16 42,37 8,12

С. echinulata ВКМ F-626(-) 16,44 41,92 6,89

С. echinulata ВКМ F-657(-) 14,15 47,73 6,75

С. homotallica ВКМ F-930 20,49 44,08 9,03

С. echinulata ВКМ F-470(-) 15,54 44,23 6,87

С. echinulata ВКМ F-471(+) 15,44 40,58 6,26

С. echinulata ВКМ F-775(-) 18,35 43,21 7,93

С. echinulata ВКМ F-776(+) 16,02 37,82 6,06

С. echinulata ВКМ F-775(-) + ВКМ F-776(+) 20,49 44,08 9,03

В составе ЖК липидов исследуемых штаммов р. СиттщИатеИа (табл. 3) присутствовали насыщенные и ненасыщенные ЖК с четным числом атомов углерода от Си до С24, с преобладанием пальмитиновой (С^о), олеиновой (С^О, линолевой (С18:з) и линоленовой (С18:з) жирных кислот.

Таблица 3. Жирнокислотный состав исследованных штаммов Cunninghamella

F-1204 F-626 F-657 F-470 F-471 F-776 F-775 F-930

ЖК (-) (") (-) (-) (+) (-) (+)

С 16:0 16,0 20,2 16,6 24,4 17,2 22,4 14,8 19,9

С 18:0 7,8 5,4 5,5 14,2 4,6 8,3 3,4 8,2

С 18:1 51,0 41,3 43,6 42,8 44,9 45,0 42,4 44,7

С 18:2 14,4 19,0 16,3 10,1 17,1 14,7 19,8 14,9

С 18:3 8,3 10,4 15,3 7,0 15,0 7,6 17,4 9,7

Другие ЖК 1,9 3,7 2,7 1,6 1,2 2,0 2,3 2,6

СН 0,96 1,00 1,07 0,77 1,09 0,90 1Д7 1,04

Таким образом, показано, что все исследованные штаммы обладают высокой липогенной активностью, и содержание лшшдов в клетках достигает 50%, по составу и содержанию ЖК рассмотренные липиды можно отнести к маслам олеинового типа. Изучение состава липпдов гетероталличных штаммов представителей р. Cunninghamella.

Некоторые разнополые штаммы мукоровых грибов, например Blakeslea trispora, способны при совместном культивировании (+) и (-) штаммов образовывать в несколько раз больше лшшдов, чем при раздельном выращивании. Таким образом, задачей этого этапа было проверить способность разнополых штаммов Cunninghamella к синтезу липпдов при копуляции (+) и (-) штаммов. В качестве объектов исследования были взяты разнополые пары штаммов С. echinulata 470 (-) и 471 (+), 775 (+) и 776 (-), и гомоталличный штамм С. homotallica 930.

Все исследованные штаммы грибов на 5-е суши роста накапливали более 15 г/л биомассы (табл. 2). Содержание липпдов в мицелии всех штаммов превышало 35%, но совместное культивирование разнополых пар штаммов не приводило к увеличению содержания липидов в мицелии продуцентов.

При анализе состава ЖК липидов исследуемых штаммов (табл. 3) отмечена большая ненасыщенность липидов у (+) штаммов. Гомоталличный штамм F-930 проявлял определенное сходство с (-) штаммами.

Отметим, что все штаммы, независимо от их половой принадлежности, синтезировали линоленовую кислоту (С^з), при этом содержание данной кислоты в липидах (+) штаммов превышало соответствующий показатель (-) штаммов более чем в 2 раза. Более того, в отличие от других мукоровых грибов, например В. trispora, (+) штаммы Cunninghamella синтезировали больше Ci8:3, чем (-) штаммы. Для многих представителей Mucorales, в частности В. trispora, линоленовая кислота рассматривается в настоящее время как надежный критерий при определении половой принадлежности гетероталличных штаммов, при этом отличительной особенностью (-) штаммов В. trispora является неспособность синтезировать у-лнноленовую кислоту.

Таким образом, впервые показано существование различий в метаболизме лшшдов у гетероталличных штаммов Cunninghamella. В отличие от других Choanephoraceae, у представителей рода Cunninghamella не увеличивается выход нейтральных липидов при копуляции разнополых штаммов; (+) штаммы Cunninghamella синтезируют больше С^з, чем (-) штаммы.

Глава 2. Основные характеристики биодизеля на основе липидов С. japónica

В странах Европы наиболее часто для получения биодизеля используется рапс (Brassica napas). Поэтому целью следующего этапа исследований было проведение сравнительного анализа состава липидов рапса и гриба-продуцента, а также определение и сравнение основных характеристик биодизельного топлива, полученного на основе липидов организмов-продуцентов.

Как видно из приведенных диаграмм (рис. 1) качественный состав ЖК ОЛ исследуемых организмов практически идентичен. Основным отличием в ЖК составе является меньшее содержание насыщенной С16:0 кислоты, и большее - ненасыщенных CT ig; i и С18;2 кислот в составе липидов рапса, что отразилось на СН липидов: СБ липидов мукорового гриба составила 1.06, липидов рапса - 1.34. В составе липидов обоих организмов следует отметить отсутствие полиненасыщенных ЖК (ПНЖК). Стоит отметить, что меньшая СН и отсутствие ПНЖК положительно влияют на окислительную устойчивость биодизельного топлива.

С. japónica В. париs ■ С 14:0

■ С 16:0

■ С 16:1

■ С 18:0

■ С 18:1

■ С 18:2 С 18:3 С 20:1

Минорные ЖК

Рис. 1. Жирнокислотый состав общих липидов С. japónica и В. napus.

Сравнение некоторых характеристик биодизеля, полученного на основе липидов мукорового гриба С. japónica F-1204 и рапса В. napus.

Йодное число (ИЧ) - величина, характеризующая содержание двойных связей в ненасыщенном соединении, и определяющая, в частности, общую ненасыщенность жиров. ИЧ тесно связано с таким показателем как химическая стабильность топлива.

На основании данных о количественном и качественном составе ЖК были рассчитаны ИЧ для липидов мукорового гриба и рапса (табл. 4), которые составили 90,81 и 114,91 соответственно. В России нет принятых стандартов для биодизеля,

поэтому мы ориентировались на европейский стандарт ЕЫ 14214, согласно которому для биодизеля величина показателя ЙЧ не должна превышать 120 единиц.

Удельная теплота сгорания является одной из важнейших характеристик топлива, служащих для оценки его энергетических возможностей и экономической эффективности. Эта физическая величина показывает какое количество теплоты выделяется при полном сгорании 1 кг топлива в кислороде.

Величина низшей теплоты сгорания биодизеля, полученного из лшгадов гриба, рассчитанная теоретически составила 37,27 МДж/кг, а биодизеля, полученного на основе рапсового масла — 37,31 МДж/кг, что полностью удовлетворяло требованиям стандарта EN 14214, согласно которому минимальная граница данного показателя составляет 35 МДж/кг. Помимо теоретического расчета, низшая теплота сгорания биодизеля на основе липидов гриба была определена экспериментально (в РГТУ нефти и газа им. И.М. Губкина) и составила 37,13 МДж/кг, т.е. расхождение теоретически рассчитанной и экспериментально полученной величины составило менее 1%.

Цетановое число (ЦЧ) - показатель, характеризующий воспламеняемость дизельного топлива, который также влияет на запуск двигателя, жесткость его работы, расход топлива и дымность отработавших газов.

Величина ЦЧ биодизеля, полученного из липидов гриба, составила 55,68, а биодизеля, полученного на основе рапсового масла — 51,74. В требованиях европейских стандартов установлена минимальная граница данного показателя — 51 единица.

Таблица 4. Основные характеристики биодизельного топлива полученного из разных источников __

Источник Йодное число Цетановое число Теплота сгорания (МДж/кг) Источник

Дизельное топливо 47 45,3 The Lipid Handbook, 2007

Биоднзель (EN14214) < 120 >51 >35 The Biodiesel Handbook, 2005

Brassica napus 94-120 54,4 40,4 The Lipid Handbook, 2007

114,90 51,74 37,31 собственные данные

Cunninghamella Japónica F-1204 (-) 90,81 55,68 37,27 собственные данные

Таким образом, биодизель, полученный на основе липидов С. japónica, по ряду важнейших показателей соответствует требованиям европейских стандартов для биодизеля и аналогичен наиболее широко используемому в странах ЕС биодизелю на основе рапсового масла (табл. 4).

Глава 3. Влияние компонентов питательной среды на рост С. japónica и выход липидов.

Исследование возможности замены источника азота в питательной среде

Скрининг и начальные ферментации грибов для получения биодизеля проводили на среде Гудвина, в которой источником азота является аминокислота аспарагин, а источником углерода - глюкоза, что, в конечном счете, и определяет высокую стоимость этой среды, поэтому основные усилия по оптимизации среды были направлены на поиск более дешевых источников азота и углерода.

Задачей этого этапа исследований было проведение опытов по изучению возможности замены аспарагина на другие источники азота, взятые в эквивалентном по азоту количестве: нитрат натрия, нитрат аммония, хлорид аммония, мочевину.

Замена аспарагина на испытанные источники азота (кроме хлорида аммония) благоприятно влияла на активность ростовых процессов (табл. 5). Наибольший выход липидов, превысивший контроль почти на 40%, был отмечен при культивировании на среде, содержащей нитрат аммония.

Таблица 5. Показатели роста и липидообразования С. japónica F-1204 (-) на средах с использованием разных источников азота

Источник азота Биомасса, г/л Липиды

% г/л

Аспарагин 10,8 50,68 5,48

Нитрат натрия 17,04 28,34 4,83

Нитрат аммония 16,1 46,59 7,50

Хлорид аммония 5,2 32,45 1,69

Мочевина 12,9 26,23 3,38

Поскольку замена одного из компонентов питательной среды может привести к изменению жирнокислотного состава, было проведено сравнительное исследование состава ЖК липидов, полученных при культивировании гриба на средах с аспарапшом и нитратом аммония. Полученные результаты (рис. 2) свидетельствуют о том, что замена источника азота в среде привела к увеличению содержания пальмитиновой кислоты и к снижению содержания олеиновой кислоты, в остальном же состав ЖК был практически идентичным.

■ С 16:0

■ С 18:0

■ С 18:1

■ С 18:2

■ С 18:3

■ Прочие ЖК

Рис. 2. Сравнение ЖК состава С. japónica F-1204 (-) при культивировании на средах с разными источниками азота.

Замена аспарагина на нитрат аммония не влияла на величину теплоты сгорания, которая составила 37,19 МДж/кг и на величину цетанового числа - 56,54.

Полученные результаты указывают на то, что замена аспарагина на нитрат аммония вызвала интенсификацию ростовых процессов у всех исследованных штаммов, накопление биомассы превышало контроль более чем в 1,5 раза, и практически не влияла на липогенную активность культур. Таким образом, наиболее благоприятным для роста гриба и накопления клеточных липидов из всех испытанных источников азота является нитрат аммония, и выбор данного вещества в качестве истоника азота позволил снизить себестоимость среды на 38%. Замена источника углерода

В процессе поиска замены глюкозы в среде на подходящий источник углерода были изучены отходы различных производств: картофельные отходы (мезга 1 -только картофельная мезга вместо глюкозы; мезга 2 - картофельная мезга и 0,5% глюкозы; очистки 1 - картофельные очистки; очистки 2 - картофельные очистки и 1,2% NH4NO3; шелуха 1 - картофельная шелуха; шелуха 2 - картофельная шелуха и 0,5% глюкозы, а также среда с крахмалом), и другие виды сельскохозяйственных отходов: белый лепесток (пищевой соевый шрот), кофейный шлам, свекольный жом, лузга подсолнечника, сточные воды маслодавилен; и побочный продукт при получении биодизеля - глицерин (Г-2 - 2% глицерина; Г-4 - 4% глицерина; М+Г -глицерин с дополнительным внесением мезги: М+Г (2с) - среда с картофельной мезгой с дополнительным внесением к 48-часовой культуре). Контролем служила модифицированная среда Гудвина с 1,2% NH4NO3

Гриб оказался способен утилизировать все испытанные виды отходов (рис. 3). Количество биомассы, образуемой грибом на этих средах составляло от 36 до 120% от

Аспарагин Нитрат аммония

контрольной величины, а продуктивность гриба (г липидов/л среды) - от 8 до 93% от величины контроля.

25 -,-

fSSSSSSS * ^ШУУ

¿Г jO5-

<f у

□ Биомасса, г/л

□Лшшды, г/л

Рис. 3. Показатели роста и липидообразования С. japónica F-1204 (-) на средах с использованием разных отходов в качестве источника углерода.

Наиболее перспективными источниками углерода оказались картофельная мезга (в обеих модификациях среды), сточные воды маслодельных заводов, кофейный шлам и крахмал (60-93% от величины продуктивности контрольного варианта).

Также было изучено влияние замены глюкозы на картофельную мезгу на характеристики конечного продукта. Данная замена практически не влияла на состав ЖК, а, следовательно, и на величину низшей теплоты сгорания биодизеля (37,17 МДж/кг) и величину цетанового числа (56,58).

Подходы к использованию лигнина для производства биодизеля

В последние годы все чаще при обсуждении проблемы биодизельного топлива высказывается предположение, что решение данного вопроса непосредственно связано с решением проблемы биоконверсии одного из самых масштабных отходов промышленности - лигнина. В природных условиях главными деструкторами лигнина являются базидиальные грибы - возбудители белой гнили. Несмотря на то, что изучением деградации лигнина дереворазрушающими грибами занимаются с 18-го столетия, имеющиеся в литературе данные о деградации лигноцеллюлозных субстратов являются далеко не полными. Поэтому нами была предпринята попытка уточнения процессов проходящих на начальных этапах разложения лигнина.

На предварительном этапе работы был проведен скрининг следующих штаммов лигнинразрашающих грибов: ЬепИпив ^гтт ВКМ Г-160, 57егеит ЫюиПт ВКМ 1449, КиеУтеготусев тШаЫНя МГУ, Сегаропа \iridians МГУ, Непсшт согаИо^ез МГУ, Р1еигоШ озП-еаНи МГУ. Скрининг проводили на природных лигноцеллюлозных субстратах: сосновых опилках и лузге подсолнечника. Для дальнейшей работы был отобран штамм ЬепНпт tigt■inus ВКМ Р-160.

Основные опыты проводили на жидких питательных средах. В опытных вариантах в качестве источника углерода использовали лигносульфонат натрия (ЛСН) или же в среду с ЛСН дополнительно вносили 0,5 % глюкозы для интенсификации ростовых процессов и индукции лигнолитических ферментов ("затравка"). Выращивание Ь. ^нтк проводили в условиях глубинного культивирования с интенсивным перемешиванием (8,0-8,2 мг 02/л) и поверхностной культуры (2,5-2,6 мг 02/л).

Установлено, что количество кислорода в среде оказывало значительное влияние на рост гриба. В условиях глубинной культуры для каждого варианта среды был характерен более высокий выход липидов по сравнению с поверхностным культивированием (рис. 4). Также, как видно из диаграммы, добавление "затравки" имело больший стимулирующий эффект на количество биомассы при большей аэрации среды.

I П Ш I п ш

Вариант опыта Вариант опыта

Рис. 4. Показатели роста (7) и липогенеза (2) при культивировании!, tigrimis на средах с различными источниками углерода и различной степенью аэрации: а - глубинное культивирование; б - поверхностное культивирование. Варианты опытов: I -глюкоза - 5%; II -лигносульфонат натрия - 2%; III -лигносульфонат натрия - 2% и глюкоза - 0.5%.

Присутствие ЛСН в среде оказывало значительное влияние на состав фосфолипидов (ФЛ) мембраны (рис.5). Основным отличием было резкое повышение уровня фосфатидной кислоты (ФК), которая принимает важное участие в

-13-

информационных каскадах клетки (является "мессенджером"), на среде с ЛСН в качестве единственного источника углерода. Стоит отметить, что внесение "затравки" в определенной степени снимало данный эффект.

а б

Вариант опыта Вариант опыта

Рис. 5. Состав и содержание индивидуальных классов полярных липидов (% от суммы) при культивировании Ь. Н^пти на средах с различными источниками углерода и различной степенью аэрации: а - глубинное культивирование; б — поверхностное культивирование; 1 - СМ; 2 - ФС; 3 - ФИ; 4 - ФХ; 5 - ФЭА; б - ФК; 7 - ФГ; 8 - суммарные гликолипиды.

Мы предположили, что проверить значение реакций свободнорадикального окисления (СРО) в деградации лигнина грибами можно ингибируя генерацию свободных радикалов путем введения антиоксидантов (АО), так как известно, что имеются два основных пути гашения СРО: ферментный - супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза, и наличие АО. Присутствие АО должно повлиять на рост гриба, так как затруднит потребление лигнина, что отразится на выходе биомассы. В качестве антиоксиданта применяли 3-гидрокси-6-метил-2-этил-гидрохлорид, который в концентрации 2 х 10"4 М вносили в 48 ч культуру гриба Ь.Н%гтш.

При внесении АО в среду с ЛСН в качестве единственного источника углерода происходило ингибирование роста гриба (рис.6). Добавление же "затравки " приводило к значительной интенсификации ростовых процессов и снимало ингибирующий эффект.

Введение АО также влияло на состав ФЛ (рис.7) - содержание ФК несколько уменьшалось, уровень ФЭА оставался практически без изменений, но почти вдвое

-14-

уменьшалось содержание ФХ на фоне значительного увеличения ФИ. Изменения в составе ФЛ позволяют предположить, что внесение АО к среде с ЛСН влияет на состав мессенджеров и кроме ФК передача сигналов осуществляется по инозитидному пути.

м о и м 3 О 5 Ш

12 3 4

Рис. б. Влияние АО (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин гидрохлорид) на рост и накопление биомассы гриба Ь. ^пти при культивировании на средах с ЛСН: 1 - ЛСН 2%; 2 - ЛСН 2% + 2 х 10"4 М АО; 3 - ЛСН 2% + 0.5% глюкозы; 4 - ЛСН 2% + 0.5% глюкозы + 2 х

Рис. 7. Влияние АО на содержание отдельных фракций ФЛ I. Н^пив при культивировании на средах с ЛСН: 1 - суммарные гликолипиды; 2 - ФК; 3 - ФЭА; 4 - ФХ; 5 - ФС; 6 - ФИ; 7 - СМ (сфингомиелин). Варианты сред: I - ЛСН 2%; II - ЛСН 2% + 2 * 10"4 М АО; III - ЛСН 2% + 0.5% глюкозы; IV - ЛСН 2% + 0.5% глюкозы + 2 х Ю"4 М АО.

Таким образом, в проведенном исследовании установлено положительное действие кислорода на биоконверсию лигнина, и впервые показано, что внесение АО в культуру Ь.Иgrinus. растущего на ЛСН, приводит к подавлению ростовых процессов и изменению состава липидов.

Глава 4. Оптимизация получения спорового посевного материала С. japónica ВКМ F-1204 (-)

В современных опытно-промышленных регламентах обычно указывается скорость прорастания посевного материала и процент его всхожести, но очень редко приводятся данные о типе покоя спор, активаторах прорастания и возрастной активности спорового посевного материала. Между тем, эти данные позволяют значительно увеличить выход конечного продукта. Таким образом, целью данного этапа работы было изучение процесса прорастания спор гриба - продуцента биодизеля, связи этого процесса с продолжительностью хранения посевного материала, с энергетическим запасом клетки - нейтральными липидами, и их составом, изучение закономерностей изменения состава липидов с целью увеличения выхода конечного продукта.

Установление типа покоя спор С. japónica ВКМ F-1204 (-)

В ходе работы было установлено, что для выхода из состояния покоя спорам С. japónica не требуется каких-либо дополнительных факторов, кроме присутствия воды. Так, уже через 1 ч. после помещения спор в дистиллированную воду происходит активное формирование тонких разветвленных гиф, к 3-му ч. почти все (99%) споры прорастают (рис. 8). Т.е. в спорах С. japónica есть запасы питательных веществ, необходимые для прорастания.

- .¡■Ф* - ■ щтщ ------- ш щ

ш Щ ■

itFrv 1 vv» --Л щ

Ж;-

А (х200) Б (х400)

Рис. 8. Прорастание спор С. japónica ВКМ F-1204 (-) в дистиллированной воде. (А - 1 ч. после начала опыта, Б - спустя 3 ч.)

Была выявлена зависимость способности к прорастанию спор гриба от их возраста: отмечено снижение способности прорастания по мере увеличения возраста спор, особенно резко это снижение выражено между 21 и 28 сут. (рис. 9).

сут

Рис. 9. Сохранение способности к прорастанию спор С. japónica ВКМ F-1204 (-) в зависимости от их возраста.

Изучение влияния экзогенных источников азота и углерода, а также цАМФ на прорастание спор С. japónica ВКМ F-1204 (-)

Было изучено влияние следующих добавок: цАМФ (сАМР) (250 мкл/мл), глюкоза (Glc) (0,2%), манноза (Man) (0,2%), трегалоза (Тге) (0,2%), пролин (Pro) (0,2%), пептон (Pep) (0,2%), глюкоза совместно с пролином (Glc+Pro) (по 0,2%). Полученные результаты показали, что при добавлении Glc, Pro, Тге и Pep проросшие споры С. japónica появлялись уже на 2-ой ч., а к 3-му ч. прорастало больше 50% спор. При добавлении сАМР, Man, Glc+Pro прорастание спор начинается после 2 ч. (рис.10).

0 2 4 6 8

Время, ч

Рис. 10. Динамика прорастания спор С. japónica ВКМ F-1204 (-) при внесении различных добавок.

Таким образом, установлено, что споры С. japónica ВКМ F-1204 (-) находятся в

состоянии экзогенного покоя 1-ого типа (для выхода из него необходимо только

присутствие воды). Процесс прорастания продолжается до стадии появления

-17-

ростковых трубочек и не требует присутствия источника углерода и/или азота. Процесс прорастания до стадии ветвления ростковых трубочек занимает менее 5 часов.

Исследование содержания и состава липидов спор С. japónica ВКМ F-1204 (-)

Количество липидов в спорах С. japónica зависело от возраста спор и составляло от 3 до 6% (рис. 11). Максимальное содержание липидов, отмеченное в самых молодых из исследованных спор (возраста 7 сут.), составило 6,4%. Следует отметить, что к 28 сут. содержание липидов в спорах возрастает, что, возможно, вызвано частичной дегидратацией спор старой культуры.

ё? б

I 4

2 -

О --т-Т-1-т-

О 7 14 21 28

Время, сут

Рис.11. Содержание липидов в спорах С. japónica ВКМ F-1204 (-) в зависимости от возраста спор.

Было установлено, что в составе липидов спор преобладающей фракцией являются ТАГ, содержание которых снижалось с увеличением возраста спор. Отмечена зависимость содержания свободных (ССт) и этерифицированных стеринов (ЭСт) в зависимости от возраста спор. Так, содержание ССт в период с 7 до 21 сут. увеличивалось более чем в 2 раза (с 6,0 до 14,7%) и далее к 28 сут. оставалось практически неизменным (13,6%). Содержание ЭСт увеличивалось более резко: с 2,1% у 7-суточных спор до 9,7% у 28-суточных.

Преобладающими фракциями ПЛ являлись ФЭА, содержание которого резко снижалось в период с 7 до 28 сут. с 24,8% до 7,5%, и ФХ содержание которого оставалось практически неизменным в период с 7 до 21 сут. (в среднем на уровне 25%) и несколько снижалось к 28 сут. (15,2%). Следует отметить довольно высокое содержание гликолипидов в составе спор - более 25%.

Соотношения ЭСт/Ст и ФХ/ФЭА (рис. 12) могут рассматриваться в качестве критериев сохранения способности спор к прорастанию (критерия жизнеспособности) при увеличении возраста спор.

т i х в

2,0

1,5 i

1,0

0,5

0,0

0,1

0,6

0,4 а

-ФХ'ФЭА -ЭСт/ССт

0,2

Время, сут

Рис. 12. Изменение соотношения ФХ/ФЭА и ЭСт/ССт в зависимости от возраста спор С. japónica ВКМ F-1204 (-).

Как было сказано выше, установлено, что при хранении спор падает их

способность к прорастанию, что сопровождается изменениями в составе липидов. В

качестве критериев всхожести можно использовать соотношение ФХ/ФЭА, ЭСт/Ст

Для спор, потерявших всхожесть, характерно высокое соотношение ФХ/ФЭА и

ЭСт/Ст.

Исследование содержания и состава липидов мицелия С. japónica ВКМ F-1204 (-).

При изучении влияния возраста посевного материала на содержание липидов мицелия, выращенного из спор разного возраста, обнаружена корреляция (г=0,8319) между количеством липидов в спорах и максимальным количеством липидов в биомассе, образующейся из этих спор. Максимальное содержание липидов в мицелии гриба, независимо от возраста посевного материала, достигалось на 4 сут. культивирования (рис. 13). При этом наибольшее содержание липидов было отмечено для биомассы, полученной из спор 7-суточной культуры.

• 14 сут ■ 21 сут —•—28 сут

■ 7 сут

Время, сут

Рис. 13. Динамика содержания липидов в мицелии в зависимости от возраста спор С. japónica ВКМ F-1204 (-).

Таким образом, учитывая полученные результаты по выживаемости спор в зависимости от их возраста, впервые обнаруженной взаимосвязи между содержанием липидов в спорах и выросшего из них мицелия, соотношению ФХ/ФЭА и ЭСт/ССт, можно сделать вывод, что для проведения качественных ферментаций необходимо использовать споры не старше 14 сут.

Влияние трегалозы на рост и липогенную активность С. japónica ВКМ F-1204 (-)

Постановка задачи была обусловлена тем, что обычно процессы синтеза и дальнейшего накопления трегалозы связаны с прекращением ростовых процессов. Также присутствие Тге в стационарной фазе связывают помимо протекторного действия с интенсификацией липидообразования.

При исследовании влияния экзогенной трегалозы на процессы роста и липогенеза было испытано две концентрации данного соединения: 0,25 и 1%. При проведении исследований использовали культуры, находящиеся на двух стадиях развития: стадии активного роста (трофофазы) и стационарной стадии (шшофазы), что совпадало с 48 и 96 ч., соответственно.

Присутствие трегалозы в среде культивирования гриба С. japónica вызывало стимуляцию ростовых процессов, при этом данный эффект являлся дозозависимым (т.е. более ярко был выражен при большей из испытанных концентраций). Также экзогенная трегалоза дозозависимо стимулировала липогенную активность гриба (рис. 14), находящегося на стадии идиофазы.

5 20

^ 20

g зо

0.25

концентрация Тге, %

0 0,25

концентрация Тге, %

□ 2 с Q4 с

Рис. 14. Влияние различных концентраций трегалозы (Тге) на величину биомассы и липидов С. japónica.

В результате данного опыта был установлен дозозависимый характер действия экзогенной трегалозы на рост и липогенную активность С. japónica. К практическим результатам можно отнести возможность интенсификации липидообразования у С. japónica под действием экзогенной трегалозы.

Глава 5. Экстракция липидов из биомассы С. japónica сверхкритическим С02.

В последнее десятилетие получила большое развитие экстракция различных веществ при помощи сверхкритических флюидов. При экстракции липидов принятым способом по методу Фолча используется хлороформ, обладающий канцерогенным действием. Было проведено извлечение липидов сверхкритическим диоксидом углерода при следующих параметрах экстракции (80-100°С, 50 МПа) из биомассы С. japónica F-1204(-). Количество извлеченных липидов составило 45% (от сухого веса) при 80°С и 60% при 100°С. Количество липидов, извлекаемых по методу Фолча с применением растворителей, не превышало 45%. ГЖХ анализ состава жирных кислот подтвердил идентичность липидному составу, экстрагированному по методике Фолча.

Таким образом, применение экстракции сверкритическим ССК позволяет не только исключить использование хлороформа, но и обеспечивает более полное извлечение липидов из биомассы.

Выводы

1. Отобран олеагенный штамм CtmninghameUa japónica ВКМ F-1204 (-), накапливающий до 50% липидов от сухой биомассы, который может стать основой для получения биодизельного топлива. Разработан и запатентован способ получения липидов из биомассы гриба-продуцента (патент RUS 2468077).

2. Сравнение липидного и жирнокислотного состава Cunninghamella japónica и Brassica napus показало практическую идентичность, как липидов организмов, так и биодизеля из них полученного. Биодизель, полученный из липидов мицелиального гриба, соответствует принятому международному стандарту EN14214.

3. Оптимизирована среда культивирования Cunninghamella japónica: источник азота - аспарагин - заменен на более дешевый и доступный нитрат аммония без потери качества продукта; предложено использование картофельной мезга, кофейного шлама и других отходов в качестве источника углерода. Использование спор 7-суточной культуры обеспечивает наиболее высокий выход липидов. Установлены критерии жизнеспособности спор. Для увеличения выхода липидов рекомендовано внесение в среду культивирования 1% трегалозы.

4. Применение сверхкритического СОг при извлечении липидов из биомассы организма-продуцента позволяет достичь более полной экстракции липидов по сравнению с принятыми методами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в репетируемых журналах рекомендованных ВАК:

1. Феофилова Е.П., Сергеева Я.Э., Ивяшечкпн A.A., Биодизельное топливо: состав, получение, продуценты, современная биотехнология (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2010, Т. 46, №4, С. 405-415.

2. Феофилова Е.П., Ивашечкин A.A., Алехин А.И., Сергеева Я.Э., Споры грибов: покой, прорастание, химический состав и значение для биотехнологии (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2012, Т.48, №1, С. 5-17

3. Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Мысякина И.С., Ивяшечкпн A.A., Богдан В.И., Феофилова Е.П., Получение биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Прикладная биохимия и микробиология, 2013, Т. 49, №1, С. 1-8.

4. Богдан В.И., Коклин А.Е., Красовский В.Г., Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Ивашечкин A.A., Феофилова Е.П., Получение метиловых эфиров жирных кислот - основы биодизельного топлива - из липидов мицелиальных грибов, экстрагированных сверхкритическим С02, Сеерхкритические флюиды: теория и практика, 2013, Т.8, №4, С. 46-52

5. Ивяшечкпн A.A., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Сорокин В.В., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П. Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Lentinus tigrinus. Прикладная биохимия и микробиология, 2014, Т. 50, № 3, С. 318-323.

6. Ивяшечкпн A.A., Сергеева Я.Э., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние антиоксиданта на рост и липидообразование базидиомицетного гриба Lentinus tigrinus, растущего на среде с лигносульфонатом. Прикладная биохимия и микробиология, 2015, Т. 51, № 3, С. 355-359.

Патент на изобретете:

1. Сергеева Я.Э., Ивашечкии A.A., Алехин А.И., Андриянова Д.А., Мысякина И.С., Гальченко В.Ф., Галанина Л.А., Феофилова Е.П., Лунин В.В., Патент на изобретение RUS 2468077 Способ получения липидов 11.02.2011.

Участие в научны! конференциях:

1. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А, Меморская A.C., Ивашечкпн A.A., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Новые биотехнологии получения биодизеля на основе липидов мицелиальных грибов, материалы Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, 15-17 марта. 2010 г.), с. 295-296.

2. Ивашечкпн A.A., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Биотехнология получения нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Материалы седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием "Возобновляемые источники энергии" (24-26ноября 2010года, Москва), с. 168-171.

3. Ивашечкии A.A., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В .В., Феофилова Е.П., Новая биотехнология получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Тезисы докладов и стендовых cooôuteHuù XXII международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (7-10 февратя 2011 г., Москва), с. 147.

4. Сергеева ЯЗ., Галанина Л.А., Ивашечкии A.A., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Производство биодизеля на основе инновационной биотехнологии и получение активного посевного материала, Материали за VII международна научна прктична конференция "Найновите постижения на европейската наука - 2011 " (17-25 июня 2011), Том 32. Ветеринарна наука. Биологии, София "Бял ГРАД-БГ" ООД, 2011, с. 41-43.

5. Ивашечкпн АЛ., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Получение нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов. Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., r.XII, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

6. Сергеева Я.Э., Ивашечкпн АЛ, Богдан В.И., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Lentinus tigrinus, , Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., т.ХН, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

7. Ивашечкпн A.A., Сергеева Я.Э., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Изучение закономерностей лииидообразования у мицелиальных грибов, как основа для создания новой отрасли биотехнологии - микробной олеобиотехнолопш, Липидология - наука XXI века, I международная научно-практическая Интернет-конференция: материалы конф. (Казань, 26 ноября 2013 г.), 2014

Список принятых сокращений

ГЖХ (GLC) - газожидкостная хроматография

ЖК (FA) - жирные кислоты

JICH - лигносульфонат натрия

ПЛ (PL) - полярные липиды

ССт - свободные стерины

ТАГ (TAG) - триацилглицерины

ТСХ (TLC) - тонкослойная хроматография

ФК (РА) - фосфатидная кислота

ФЛ (PL) - фосфолипиды

ФХ (PC) - фосфатидилхолин

ФЭА (PEA)- фосфатидилэтаноламин