Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфорорганических пестицидов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфорорганических пестицидов"

На правах рукописи

СЕНЬКО ОЛЬГА ВИТАЛЬЕВНА

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ В ВИДЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

В КРИОГЕЛЬ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА КЛЕТОК МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В ПРОЦЕССАХ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ, БИОЭТАНОЛА, ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И РАЗЛОЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

2 8 НОЯ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

Москва - 2013 005541534

005541534

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Марквичева Елена Арнольдовна,

ведущий научный сотрудник, руководитель группы биокапсулирования лаборатории полимеров для биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор, Рсвии Виктор Васильевич,

декан биологического факультета, заведующий кафедрой биотехнологии Национального исследовательского мордовского государственного

университета имени Н.П.Огарёва

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита сос тои тся «¿У » декабря 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим паукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «

Л. » ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, /У

кандидат химических наук ' Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Па сегодняшний день перед мировым сообществом стоит целый ряд экологических задач, основной из которых является биотехнологическая трансформация различных отходов в менее токсичные соединения, коммерчески значимые продукты для целей химической, топливной и пищевой промышленпостей.

Мировой рынок биотехнологий к 2025 г. может достигнуть уровня в 1,5 триллиона евро. Доля России на рынке биотехнологий составляет на сегодняшний день менее 0,1 %. Научные исследования, результаты которых могут быть использо.ваны для практической реализации новых биотехнологий, являются актуальными и имеют большую практическую значимость. Для целого ряда отраслей модернизация в ближайшее время будет означать переход на биокаталитические методы и продукты. В силу экономических и экологических преимуществ доля химической продукции, производимой на основе возобновляемого сырья, будет увеличиваться [Willke, 2004].

Осуществлять разложение различных отходов и продуцировать коммерчески значимые для целей химической и топливной промышленпостей метаболиты способны, прежде всего, клетки мицелиальных грибов (МГ)*' с их высокоактивными внеклеточными гидролазами. МГ способны секретировать широкий спектр полиферментных комплексов, включающих амилазы, протеазы, целлюлазы, липазы, фосфотазы, пектиназы и другие ферменты [Lourdes, 2013], а также син тезировать такие метаболиты, как органические кислоты, биоэтанол и др. Причем субстрат, доступный для ферментативного разложения клетками МГ, зачастую индуцирует синтез необходимых ферментов. Свойство МГ секретировать комплексы, состоящие из самых разнообразных ферментов, обуславливает такое значимое свойство этих биокатализаторов (БК) как универсальность, с точки зрения широты субстратного спектра.

Использование иммобилизованных форм МГ для решения экологических задач весьма привлекательно и практически значимо, так как наряду с технологическим упрощением реализации процессов с их участием, иммобилизованные клетки МГ' выдерживают значительно более высокие по сравнению со свободными клетками концентрации токсичных веществ [Zhu, 2007]. Такие БК характеризуются более высокими, по сравнению со свободными клетками, периодами полуинактивации и могут

1 * Список используемых сокращений: БК - биокатализаторы, БМ - биомасса, ВС — восстанавливающие сахара, ИБК - иммобилизованные биокатализаторы, МГ - мицелиальные грибы, МК - молочная кислота, НВС - непищевое возобновляемое сырье, ПВС - поливиниловый спирт, ПНФ - п-нитрофенол, ТХП -3,5,6-трихлоро-2-пиридинол, ФК фумаровая кислота, ФОП

фосфорорганические пестициды, ЦСО - целлюлозосодержащие отходы, ХПК -химическое потребление кислорода, Н^б-ОРН - гексагистидин-содержащая органофосфатгидролаза.

длительно храниться без потери активности [Рос^огека, 2004]. Кроме того, наличие иммобилизующей матрицы в целом оказывает положительный эффект на адгезионно-зависимое формирование грибного мицелия.

Таким образом, исследования, связанные с разработкой и изучением свойств новых высокоэффективных БК в виде иммобилизованных клеток МГ, которые могут быть использованы в биотехнологических процессах, являются актуальными, научно и практически значимыми.

Перспективным носителем для иммобилизации клеток микроорганизмов является синтетический, пригодный к реутилизации, не токсичный полимер пищевого назначения - криогель на основе поливинилового спирта (1ШС) [Ьогтэку, 1998]. Для получения БК в виде иммобилизованных в криогель Г1ВС клеток МГ чаще всего используют следующую стратегию: сначала проводят включение спорового материала в матрицу носителя с последующим выращиванием внутри и на поверхности макропористого носителя метаболически активного иммобилизованного мицелия.

Биоконверсия непищевого возобновляемого сырья (НВС) рассматривается в настоящее время как одно из ключевых и перспективных направлений развития биотехнологии. Ресурсы такого сырья исчисляются ежегодно триллионами топи. К ним относятся: целлюлозосодержащие отходы, биомасса (БМ) фототрофных микроорганизмов и макроводорослей, непригодных для использования в пищевой и фармацевтической промышленностей, а также отходы их переработки. Актуальными и экономически значимыми являются задачи, связанные с осуществлением эффективной, минимизированной с затратной точки зрения биоконверсии НВС.

Помимо непосредственного получения ценных коммерчески значимых продуктов актуальными для современной биотехнологии являются вопросы и исследования, связанные с очисткой сточных вод различных отраслей. Перспективным является использование БК в виде иммобилизованных клеток МГ в биотехнологических процессах разложения таких компонентов сточных вод, как белки, жиры и углеводы. Клетки МГ способны эффективно расщеплять эти соединения и усваивать продукты их гидролиза, при этом накапливая значительное количество БМ. Накопленный грибной мицелий, полученный в ходе утилизации отходов, можно рассматривать в качестве источника для получения биогаза и биодизеля.

Применение МГ в иммобилизованном виде также эффективно для решения актуальных научно-практических задач современной биотехнологии, связанных с очисткой сточных вод сельскохозяйственных производств от ксенобиотиков. Клетки МГ благодаря своим полиферментым системам способны осуществлять полную биодеградацию многих токсичных веществ.

Таким образом, разработка и исследование характеристик БК в виде иммобилизованных клеток МГ, а также изучение основных подходов к их использованию и закономерностей их функционирования в различных

биотехнологических процессах, в частности, связанных с биотрансформацией НВС и очисткой сточных вод, являются актуальными, так как направлены на то, чтобы расширить область фундаментальных знаний о свойствах иммобилизованных клеток МГ, а также спрогнозировать условия для наиболее эффективного режима проведения различных биокаталитических процессов с их участием.

Цслыо данной работы являлась разработка, исследование основных закономерностей функционирования и возможностей практического использования иммобилизованных биокатализаторов (ИБК) на основе клеток МГ в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфороргнанических соединений (ФОГТ).

В ходе работы решались следующие основные задачи:

- разработать биокатализатор в виде иммобилизованных клеток МГ R. oryzae для получения фумаровой кислоты (ФК), определить каталитические характеристики и условия его эффективного использования;

- определить основные закономерности функционирования ИБК на основе клеток МГ в процессах получения органических (молочной (МК) и ФК) кислот и этанола (в анаэробных и аэробных условиях) из НВС (целлюлозосодержащих отходов (ЦСО), биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей);

- усовершенствовать существующие подходы к получению и использованию ИБК на основе клеток Ml", продуцирующих гидролитические ферменты;

- разработать ИБК па основе клегок Ml" рода Aspergillus для биодеструкции продуктов ферментативного гидролиза ФОН.

Научная новизна работы. Впервые создан оригинальный высокоэффективный биокатализатор в виде иммобилизованных клеток Ml" Rhizopus oryzae Г1032 для получения ФК из широкого спектра субстратов, включающего как чистые сахара, так и смеси Сахаров, полученные при гидролизе ЦСО, биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей, и функционирующий в широком диапазоне рН. Установлено, что разработанный ИБК превосходит мировые аналоги по количеству производимой ФК в 5-12 pari.

Впервые определены условия применения ИБК на основе клеток Ml" в процессах биотехиологической трансформации НВС в ФК, МК и биоэтаиол (режимы поддержания рН среды, режим предобработки сырья и др.).

Установлена способность ИБК па основе Ml" R. oryzae обеспечивать высокие уровни накопления этанола при концентрациях ацетата аммония в среде 5-10 г/л, что в 2-4 раза превосходит концентрации, ингибирующие метаболическую активность клеток дрожжей - традиционно применяемых п ро ду центо в этан о л а.

Впервые показана эффективность введения индуктора синтеза ферментов в состав гранул ИБК па основе клеток Ml", включенных в криогель ПВС, для продуцентов липаз, нсктипаз, целлюлаз, амилаз, протеаз.

При этом в качестве индукторов используются различные виды НВС. Выбрана оптимальная концентрация вводимого индуктора - 1%, которая обеспечивает максимальное проявление клетками МГ гидролитических активностей.

Впервые созданы оригинальные высокоэффективные ИБК на основе клеток МГ рода Aspergillus для разложения ФОС и продуктов их ферментативного гидролиза: 3,5,6-трихлоро-2 пиридинола (ТХП) и п-нитрофенола (ПНФ). Установлено, что ИБК на основе клеток МГ A. niger F-679 способен эффективно осуществлять разложение такого ФОП как хлорпирифос, а также продукта его гидролиза ТХП, а ИБК на основе клеток МГ A. awamory F-9 осуществляет биодеструкцию ПНФ, продукта гидролиза паратиона, метилпаратиона, параоксона и метилпараоксона.

Практическая значимость работы. Значительно расширен спектр используемых субстратов для получения таких ценных продуктов как МК, ФК и биоэтанол за счет использования различных видов НВС, представляющего собой ЦСО сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности, а также БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей.

Для получения этанола иод действием ИБК на основе клеток МГ из НВС продемонстрированы подходы, позволяющие получать данный продукт, как в аэробных, так и анаэробных условиях, что расширяет возможности технологического оформления процессов.

Проведен скрининг среди МГ по способности продуцировать этанол в присутствии солей уксусной кислоты и анаэробных и аэробных условиях, что важно при трансформации ферментативных гидролизатов ЦСО, которые содержат в своем составе до 7 г/л ацетата. Отобраны лучшие продуценты и установлено, что эффективнее осуществлять накопление этанола при использовании такого сырья в аэробных условиях.

Установлена и продемонстрирована возможность эффективного полифункционального применения одних и тех же ИБК на основе клеток МГ для получения нескольких продуктов из НВС (ФК и этанола) при варьировании условий использования ИБК.

Показано, что одни и те же сформированные ИБК па основе клеток МГ можно использовать для получения различных гидролитических ферментов при смене основного субстрата. При этом время, затраченное на адаптацию клеток МГ в составе ИБК к новой среде различно, но в целом меньше времени, требуемого для формирования новой партии ИБК.

Показана возможность использования сред, содержащих гидролазы и полученных при трансформации сложных по химическому составу субстратов под действием ИБК па основе клеток МГ, для гидролитической обработки тех же субстратов в отсутствии ИБК. Установлено, что в случае ферментативного гидролиза БМ фототрофных микроорганизмов, такой способ позволяет получить до 44 % выхода глюкозы от теоретически возможного уровня.

Показана возможность накопления грибной БМ различного биохимического состава на сточных водах пищевых производств и сельского хозяйства сопряженная с одновременной утилизацией основных компонентов стоков (липидов, углеводов, белков) и снижением уровня химического потребления кислорода (ХПК). Определена возможность использования этой БМ для получения биогаза с выходом до 77,3±3,4% от теоретически возможного уровня.

Показано, что разработанные ИБК на основе клеток МГ рода Aspergillus для разложения ФОП и продуктов их ферментативного гидролиза эффективно осуществляют биодеструкцию этих соединений при значениях pH, характерных для окружающей среды.

Показано, что все разработанные или использованные в работе БК представляют собой клетки МГ в иммобилизованном виде, это позволяет многократно использовать их в течение длительного времени без значительной потери активности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный биокатализатор в виде иммобилизованных клеток МГ Rhizopus oryzae Fl 032 для получения ФК из различных субстратов.

2. Установленные закономерности использования ИБК на основе клеток МГ в процессах трансформации НВС в органические кислоты и биоэтанол.

3. Разработанные подходы к усовершенствованию существующих способов к получению и использованию ИБК на основе клеток МГ, продуцентов гидролитических ферментов.

4. Разработанные ИБК на основе клеток МГ рода Aspergillus для биодеструкции ФОП и продуктов из фермен тативного гидролиза.

Личный вклад ангора состоял в планировании экспериментов, обработке экспериментальных данных, их анализе и трактовке результатов. При этом в ходе выполнения работы автор применил различные современные подходы и методы исследования ферментов и клеток микроорганизмов. Также автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов работы и в их популяризации на международных научных форумах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации работы были представлены на 29 научных форумах, в том числе: 2-ом и 3-ем Москов. междунар. конгр. «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2003, 2005), Всеросс. симпоз. с междунар. участием «Биотехнология микробов» (Россия, Москва, 2004), 8-ой, 9-ой и 12-ой Путинских школах-копф-ях молод, ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2004, 2005, 2008), VI Internat, confer.on environmental pollution - ICEP (Россия, Пермь, Кдзань, 2005), XIII, XIV, XV Internat. Workshops on bioencapsulation (Канада, Кингстон, Онтарио, 2005; Лозанна, Швейцария, 2006; Австрия, Вена, 2007), Росс, коиф-и «Генетика микроорганизмов и биотехнология», (Россия, Москва, Пущино, 2006), Internat. Workshop «New technology in medicinc and experimental biology» (Тайланд, Банког, Папайя, 2007), 8-ой и 12-ой Кжсгод. междунар. молод.

конф-ях «ИБХФ РАН-ВУЗы» (Россия, Москва, 2008, 2012); 5-ом Съезде общ-ва биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Россия, Москва, 2008), 2-ой и 5-ой Междунар. науч. конф-ях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Россия, Ростов-на-Дону, 2008, 2013), III Internat, confer. «Microbial diversity: current situation, conservation strategy and biotechnological potentialities» (Россия, Пермь, Нижний Новгород,

2008), Internat, confer. «Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications» (Россия, Архангельск, 2009), In Asian Mycologyical Congress and 11th International Marine and Freshwater Mycology Symposium (Тайвань, Тайбэй,

2009), 6-ой Междунар. конф-ии «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Украина, Харьков, 2009), Междунар. науч.-практ. конф-ии «Рациональное использование ресурсного потенциала регионов России и сопредельных государств» (Россия, Брянск, 2011), Междунар. конф-ии «Современные проблемы лесного хозяйства и лесоустройства» (Россия, Санкт-Петербург, 2012 г), 8-ой Междунар. науч.-практ. конф-ии «Образование и наука XXI века -2012» (Болгария, София, 2012), Междунар. конф-ции «Возобновляемые лесные ресурсы: инновационное развитие в лесном хозяйстве» (Россия, Санкт-Петербург, 2012), Symposium of marine enzyme and polysaccharides (Вьетнам, Нячанг, 2012), Междунар. науч. конф-ии «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Россия, Саранск, 2012), Internat, confer. «Biocatalysis-2013: Fundamentals and Applications» (Россия, Москва, 2013), IX междунар. науч.-практ. конф-ии «Эффективные инструменты современных паук» (Болгария, София, 2013), Biocatalytic conversion of seaweed biomass to semi-products for chemical industry // Internat, confer. «Asian-Pacific Aquaculture» (Вьетнам, Хошимин, 2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 статей в журналах из Перечня ВАК, 4 главы в книгах международных издательств, 5 Патентов РФ на изобретения и 41 тезисов на международных и российских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 170 страниц печатного текста, 42 рисунка, 41 таблицу, 272 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть

Объекты исследовании. В работе для проведения скрининга и получения ИБК использовалось 23 штамма МГ родов Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Trichoderma, Fusarium, Pénicillium полученные из ВКПМ и ВКМ. Штамм галоалкалофильного гриба Ileleococcum alkalinum получен из коллекции кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Штаммы непатогенны, хранятся и поддерживаются на картофельно-глюкозном агаре при температуре 5°С. В качестве субстрата в работе использовались следующие культуры фототрофных микроорганизмов Arthrospira platensis (NORDST.) GEITL.,

штамм rsemw-l/02-П, Cosmarium sp., Dunaliella salina Teod. штамм rsemsu-D-l, Chlorella vulgaris C-2, Galdieria partita Sentz. штамм rsemsu-G-3, Nannochloropsis sp. штамм rsemsu-N-1, Dunaliella tertiolecta Butch. шт.208, Nostoc sp. полученные из Коллекции института физиологии растений им. Тимирязева РАН и Коллекции института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН. Также для получения биочувствительного элемента для определения токсичности сред, полученных в процессе биодеструкции ФОП, использовались фотобактерии Photobaclerium phosphoreum №311 КМ МГУ.

Методы исследования. Получение БК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток МГ проводилось в две стадии: 1) включение спор в матрицу носителя, 2) последующее формирование БК как такового -проращивание иммобилизованных спор в ¡ранулах криогеля ПВС до стационарной фазы роста клеток или стабильного (максимального) уровня метаболической активности.

Для определения органических кислот, концентрации глюкозы, амилолитической, липолитической и протеолитичсской активностей использовались стандартные ферментативные наборы. Определение восстанавливающих Сахаров (ВС) проводилось по методу Шомоди-Нельсона. Концентрация этанола в жидкой фазе определялась на газожидкостном хроматографе. Определение общей активности по пектину проводилось вискозиметрическим методом. Определение пектинлиазной активности проводилось согласно известной методике [Taragano, 1999]. Пектатлиазная активность определялась по образованию ненасыщенной дигалактуроновой кислоты путем спсктрофотометрического измерения [Агабозорги, 2007]. Определение целлголазных активностей проводились согласно известным методам [Синицыи, 1995]. При определение биохимического состава экстракция липидов проводилась по методу Фолыиа [Polch J, 1957], определение липидов проводилось спектрофлуорометрически (по взаимодействию с флуоресцентным красителем Нильский красный). Экстракция белка проводилась добавлением к осадку 1 мл 4% додецилсульфата натрия в 0,1 М TRIS-I 1С 1 буфере [Досон Р, 1991]. Определение общего содержания углеводов в белковом экстракте и гидролизате осадка проводилось с использованием фенольиого метода [[Dubois М., 1956]. Метаболическая активность иммобилизованных клеток контролировалась путем определения концентрации внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом. Определение ХПК проводилось колориметрическим методом с использованием бихромата калия [Dubber, 2010]. Проведение предварительного ферментативного гидролиза хлорпирифоса и метилпаратиопа проводилось с использованием фермента His6-OPH [Ефременко, 2005]. Концентрации ТХ1Т и Г1НФ определялись спектрофотометрически и хроматографически |Espinosa-Mansilla, 1995, Xua, 2008, Sirotkina, 2012].

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывалось среднее значение и значение стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях.

Результаты и обсуждение

1. Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальных грибов рода Шйгория в процессах получения органических кислот из непищевого возобновляемого сырья

Разработка ИБК на основе клеток МГ рода Юйгорт для получения ФК. При разработке ИБК для получения ФК предварительно проводился скрининг среди МГ по способности трансформировать глюкозу и ксилозу, в результате которого была отобрана культура Я. огугае Б-1032. Для приготовления ИБК на основе выбранного штамма использовалась известная методика [Ефременко, 2005]. Поскольку для получения ФК используется стратегия, при которой исходно осуществляется накопление большого количества метаболически активной БМ, которая далее переносится в среду, лимитированную по содержанию азота и/или фосфора, то был осуществлен подбор среды, используемой на стадии формирования ИБК. Установлено, что максимальный прирост иммобилизованной БМ с высоким содержание внутриклеточного АТФ наблюдался на среде, содержащей -только ячменный солод. При исследовании влияния исходного размера гранул ИБК на эффективность его действия было установлено, что не зависимо от первоначальных линейных размеров все образцы иммобилизованных БК имели сферическую форму, значительно превосходящую исходные размеры и практически одинаковую удельную концентрацию внутриклеточного АТФ.

Исследование влияния исходной концентрации разработанного иммобилизованного катализатора в реакционной среде показало, что 300 г/л наиболее предпочтительна, с точки зрения максимальной продуктивности по ФК. Увеличение концентрации БК в виде иммобилизованных клеток К. огугае П032 свыше 300 г/л создавало технологические затруднения при проведении процесса.

Поскольку ПВС содержит в своем составе различные концентрации углеводов (20-И00 г/л), то было исследовано па примере глюкозы, влияние исходной концентрации субстрата на выход ФК. Установлено, что оптимальной является концентрация 100 г/л.

Поскольку накопление органических кислот сопровождалось значительным понижением рН среды, то был исследован рН-оггтимум действия разработанного ИБК на основе клеток МГ 11. огугае Р1032 (Рис.1). Установлено, что разработанный ИБК имеет рН оптимум действия при значениях 4,9±0,2. Однако, отмечено, что во всем исследованном диапазоне рН среды (от 3 до 7), активность иммобилизованных клеток снижалась не более, чем на 19±3%, тогда как у свободных клеток на 37,6-^62,0%. Важно, что при многократном переносе ИБК после 42 ч культивирования в свежую среду аналогичного состава со значением рН 3,5 уровень АТФ иммобилизованных клеток не изменялся. Также было показано, что процессы, направленные на получение ФК с использованием разработанного ИБК целесообразно проводить без введения в среду каких либо агентов нейтрализующих рН.

Влияние значения pH

pH

Рис. 1

исходного среды на накопление к 42 ч ФК под действием свободных (▲) и иммобилизованных (•) клеток МГ Я. огугае РТ032

Поскольку разработанный ИБК на основе клеток МГ Я. огугае Р1032 предполагалось использовать в процессах трансформации НВС, которое содержит в своем составе самые различные сахара, то для прогнозирования эффективности использования того или иного субстрата с целью получения ФК под действием разработанного ИБК был исследован ряд Сахаров. Эти эксперименты проводились в ранее установленных благоприятных условиях, однако, исходная концентрация всех исследованных субстратов была снижена до 50 г/л (Рис. 2), поскольку в гидролизатах большинства природных субстратов концентрация Сахаров в среднем составляет 50 г/л. Таким образом, было установлено, что разработанный биокатализатор в виде иммобилизованных клеток Я. огугае Г103 2 способен осуществлять конверсию различных Сахаров, входящих в состав гидролизатов НВС.

Рис. 2. Уровень

.5 40

С—.

стГ

ё зо

t=i

о

§ 20

rh

10

s О

гЪ

rin

пп

накопления ФК в среде при

трансформации различных субстратов (50 г/л) под действием разработанного биокатализатора в виде

иммобилизованных клеток МГ Я. о/угае Б1032 (300 г/л)

Трансформация ЦСО под действием БК в виде иммобилизованных клеток МГ рода Rhizopus в органические кислоты. Для трансформации ЦСО в ФК использовался полученный в данной работе ИБК на основе клеток Я. oryzae F1032, а для получения МК применялся ранее разработанный для трансформации кислотных гидролизатов крахмала ИБК на основе клеток Я. oryzae F814 [Ефременко, 2005].

На примере пшеничной соломы было поазано влияние распространенных способов предобработки ЦСО на эффективность их трансформации в органические кислоты. В качестве способов предобработки

использовались: - кислотный гидролиз и термолиз;- делигнификадия и последующая ферментативная предобработка целлюлазным комплексом (10 мг/г субстрата). Установлено, что конверсия Сахаров, входящих в состав ферментативных гидролизатов ЦСО, позволяет получить более высокий выход органических кислот под действием ИБК на основе клеток МГ рода Юпхорт (на 8-^28%), чем в случае кислотных гидролизатов.

Для оценки эффективности использования разных субстратов были приготовлены ферментативные гидролизаты различных образцов ЦСО, которые использовались для получения органических кислот под действием ранее указанных ИБК на основе клеток 11. огугае (Табл. 1).

Табл. 1. Основные характеристики процесса трансформации ферментативных гидролизатов ЦСО под действием БК в виде иммобилизованных клеток МГ рода \lhizopus (300 г/л)

Исходная конц-я Сахаров, г/л Органические кислоты, г/л

ВС Глюкоза ФК МК

Багасса 16,0±0,4 11,6±0,2 8,7±0,2 6,1±0,2

Свекловичный жом Пшеничная солома 22,1 ±0,2 15,1±0,5 0,9±0,05 1,9±0,01

33,2±0,5 20,2±0,3 17,4±0,3 6,1 ±0,1

Осиновые опилки 32,1±0,5 22,3±0,5 19,9±0,2 6,2±0,2

Березовые опилки 29,2±0,4 23,1 ±0,6 17,7±0,2 5,2±0,3

Сосновые опилки 32,4±0,3 25,1 ±0,4 18,9±0,3 0

Клубни топинамбура 37,3±2,3 2,5±0,1 15,8±0,1 2,3±0,2

Стебли топинамбура 31,1±0,7 3,1*0,1 11,3±0,2 2,4±0,1

Из данных Табл. 1 следует, что перечень субстратов эффективно конвергируемых в органические кислоты, оказался шире для ИБК на основе клеток R. oryzae Fl032, предназначенных для получения ФК, чем для МК. Максимальный выход ФК был получен при трансформации ферментативных гидролизатов древесных опилок. Предположительно, это было связано с исходно более высоким содержанием в них моносахаридов. Возможно, для более эффективной трансформации БМ однолетних растений необходимо подобрать другой ферментативный комплекс с целью увеличения выхода моносахаридов. Низкий уровень накопления органических кислот при трансформации Сахаров, содержащихся в ферментативном гидролизате свекловичного жома, особенно при использовании клеток штамма R. oryzae Fl032, вероятно, был обусловлен высокой вязкостью данного субстрата, которая не позволила обеспечить эффективную аэрацию сред при проведении процесса, к которой иммобилизованные клетки МГ весьма чувствительны. Для ИБК на основе клеток R. oryzae F814 в случае конверсии Сахаров из ферментативных гидролизатов сосновых опилок МК в культуральной жидкости обнаружено не было. Возможно, это было

обусловлено наличием эфирных масел в опилках хвойных древесных пород, присутствие которых негативно сказывается на жизнеспособности именно клеток МГ Я. огугае Г814.Таким образом, для конверсии ферментативно предобработанных ЦСО в органические кислоты с помощью БК на основе клеток МГ, иммобилизованных в криогель ПВС, возможно рекомендовать использование багассы, пшеничной соломы и древесных опилок лиственных пород деревьев. При проведении сравнительного анализа, эффективности действия двух ИБК, полученных на основе клеток рода КЫхориь в процессах получения органических кислот, установлено, что существуют различия в их функционировании только в случае трансформации Сахаров в составе ферментативных гидролизатов древесных опилок.

Трансформация БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей под действием БК в виде иммобилизованных клеток МГ рода N И ¡гор их в органические кислоты. Па примере БМ цианобактерии Аг(го$р1га р1а1ет(з (50 г сух. в-в/л) была исследована зависимость эффективности действия разработанных ИБК от способа предобработки биомассы фототрофных микроорганизмов. Установлено, что для эффективной предобработки субстрата достаточно термолиза (100°С, 30 мин). Исходя из этих соображений, были подготовлены термолизаты БМ фототрофных микроорганинизмов и макроводорослей, которые затем использовались в качестве исходных сред для получения органических кислот под действием ИБК на основе клеток фибов рода ЯЫгорт (Табл. 2).

Табл. 2. Характеристики процесса трансформации термолизатов БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей под действием ИБК па основе клеток МГ рода КЫгорш__

Субстрат (БМ) Конц-я субстра та, г/л ФК, г/л МК, г/л

Фототрофные микроорганизмы

Aríhrospira platensis 50 16,9±0,1 6,8±0,0

Dunaliella salina 14,2±0,1 5,8±0,0

100 18,3±0,0 7,3±0,1

Chlorella vulgaris 0,1 ±0,0 0,2±0,0

Nostoc sp. 50 3,1±0,0 1,3±0,0

100 7,1±0,0 2,9±0,0

MaicpoBO/jopocjiH

Fucus vesiculosus 100 0 0,1 ±0,0

Laminaria saccharina 11,3±0,0 4,2±0,0

300 24,2±0,0 9,8±0,1

Gracüaria tenuispiíitata 13,9±0,1 5,3±0,0

Hypnea japónica 12,2±0,1 4,9±0,0

Acanthophora muscoides 50 14,1±0,0 5,8±0,0

Laurencia trópica 15,2±0,0 4,4±0,0

Liagora sp. 16,2±0,1 3,2±0,0

Реализованные биотехнологические процессы трансформации БМ характеризовались различными показателями конечной концентрации накапливаемых продуктов. Впервые была продемонстрирована принципиальная возможность использования БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей для получения ФК и МК с использованием ИБК на основе клеток рода КЫгорив.

Выбор стратегии контроля и поддержания рН кулыпуральной среды в процессах получения органических кислот под действием ИБК на основе клеток МГ рода ЛЫгорю из НВС. Величина рН культуральной жидкости является одним из определяющих параметров, влияющих на продуктивность любых БК. В этой связи применение определенной стратегии контроля и поддержания рН вследствие значительных изменений этого параметра в процессах получения органических кислот является важной задачей при реализации биотехнологических процессов. Поскольку ранее было установлено, что продуцент ФК К. огугае Р1032 характеризуется широким диапазоном рабочих значений рН и может быть эффективно использован для получения ФК без регулирования рН среды, то отработка стратегии контроля и поддержания рН среды проводилась только для ИБК на основе клеток МГ К. огугае Г814, продуцирующего МК. В качестве среды, для получения МК использовались ферментативные гидролизаты пшеничной соломы, приготовленные на основе слабых буферных растворов. Были исследованы следующие стратегии поддержания рН: подтитровка каждые 12 ч 10% раствором 1МИЦОН, внесение добавок 10 г/л Ыа2С03 при каждой смене среды (Рис. 3). Был сделан следующий вывод о том, что для эффективного многократного использования ИБК на основе клеток МГ II. огугае 1-814 в процессах получения МК в средах в виде трансформации гидролизатов НВС целесообразно проводить контроль и поддержание рН среды на уровне значений 6,8±0,2 с использованием 10% раствора ЫН4ОН.

Для сравнения эффективности действия свободных и иммобилизованных клеток МГ рода ЯЫгорш в процессах получения органических кислот были использованы ферментативные гидролизаты пшеничной соломы. Процессы проводились в течение 5 рабочих циклов (каждый по 42ч) (Рис. 4). Для этого эксперимента свободные споры МГ проращивались в тех же условиях, что и иммобилизованные. Уже после первого цикла свободные клетки МГ, несмотря на их высокую продуктивность, было технически очень сложно отделить от субстрата для последующего их переноса в свежую среду аналогичного состава. После второго цикла продуктивность БК в виде свободных клеток снижалась на 41-5-48 %, и внешний вид используемой БМ значительно изменялся -наблюдалось дефрагментация мицелия, были отмечены его морфологические изменения. В свою очередь образцы ИБК обеспечивали в течение 5-ти циклов получение органических кислот без изменения их накапливающихся концентраций. Таким образом, с точки зрения длительности эффективного функционирования, БК на основе

иммобилизованных клеток как минимум в 5 раз превосходили свободные в процессах получения МК и ФК под действием клеток МГ КЫгориз.

я 20

а" Я И л и

О

50 п 100 Время, ч

50 100

Время, ч

150

50

100 150 Время, ч

200

Рис. 3. Изменение основных параметров процесса (А - рН среды; Б - концентрации МК) при использовании

ферментативных гидролизатов пшеничной соломы (50 г сухих веществ/л) для получения МК под действием ИБК на основе клеток МГ" Я. о/угае Р814 (65 г/л) при использовании различных стратегий

поддержания рН: ■ - без поддержания рН среды; А-ноддтитровка каждые 12 ч 10 % раствором N11,ОМ, •- внесение добавок 10 г/л Ыа2С03. Пунктиром указано время замены среды на свежую аналог ичного состава.

Рис. 4. Накопление • - ФК; Ж- МК в процессах трансформации ферментативных гидролизатов пшеничной соломы под действием

свободных (пустые символы) и

иммобилизованных (черные символы) клеток Я. огугае.

250

2. Биокаталнзагори в виде иммобилизованных в крногель ПВС клеток мицелиальных грибов в процессах получения этанола из непищевого возобновляемого сырья

Получение этанола под действием МГ возможно осуществлять в анаэробных и аэробных режимах культивирования.

БК в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток МГ в анаэробных процессах получения этанола из БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей. Ранее были разработаны ИБК на

основе клеток МГ Mucor circinelloides, Aspergillus terreus, Trichoderma atroviride для получения этанола в анаэробных процессах трансформации пентоз [Ефременко, 2010]. Наиболее эффективным способом предобработки БМ фототрофных микроорганизмов оказался термолиз при 1 ати, совмещенный с кислотным гидролизом (1мМ H2S04). Следует отметить, что добавление разбавленной серной кислоты увеличивало выход этанола почти на 20%, и позволяло без дополнительной подтитровки получить среду с величиной рН, оптимальной для культивирования МГ (рН 6,5±0,3). В качестве продуцентов в процессах трансформации БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей использовались ИБК на основе клеток МГ Т. atroviride, A. terreus и М. circinelloides (Табл. 3).

Табл. 3. Концентрация этанола (г/л), накапливающегося в среде в ходе процесса трансформации углеродсодержащей БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей под действием иммобилизованных клеток разных МГ (200 г/л)_______

Источник БМ Мицелиальный гриб

Т. atroviride \ М. circinelloides A. terreus

Фототрофные микрорганизмы

Arthrospira platensis 0,33±0,01 0,36±0,01 0,66±0,01

N annochlor opsis sp. 0,28±0,01 1,50±0,01 0,14±0,01

Dunaliella salina 0,13±0,01 0 0,62±0,01

Dunaliella tertiolecta 0 0,86±0,01 0,24±0,01

Galdieria partita 1,14±0,04 0,16±0,00 0,64±0,01

Chlorella vulgaris 0,36±0,01 0 0

Cosmarium sp. 0,43±0,01 0,45±0,01 0,1±0,04

Макроводоросли

Hypnea japónica 7,25±0,01 8,14±0,02 5,3±0,01

Gigartina skottsbergii 3,27±0,01 2,7±0,02 2,4±0,02

Laminaria saccharina 0,31±0,01 0,04±0 1,2±0,01

Результаты подтвердили факт наличия субстратной преференции у МГ и позволили сделать вывод о том, что для трансформации различных образцов БМ фототрофных микроорганизмов и макроводорослей невозможно выделить универсальный продуцен т среди анаэробных штаммов МГ. Очевидно, это связано с тем, что БМ тех или иных культур содержит в своем составе углеводы, характеризующиеся разной структурой, а в свою очередь МГ способны секретировать различные комплексы гидролитических ферментов, способные осуществлять гидролиз различных полисахаридов и их биотрансформацию в этанол.

БК в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток МГ в аэробных процессах получения биоэтанола из НВС. В ходе экспериментов по разработке ИБК на основе клеток МГ было отмечено, что накопление ФК сопровождалось появлением этанола. В мировой практике обычно стремятся подобрать условия, позволяющие максимально снизить содержание этанола,

как побочного продукта в процессе получения ФК. Научно-практическую значимость имеет исследование возможности сдвига метаболизма в сторону аэробного образования этанола под действием уже разработанного ИБК на основе клеток Я. огугае Р1032 и предназначенного исходно для получения ФК.

Была исследована субстратная специфичность иммобилизованных клеток МГ 11. огугае Р1032 в процессе накопления этанола. Для последующего сравнительного анализа эти эксперименты проводились в анаэробных и аэробных условиях. Исследования максимального накопления этанола продуцентами ФК при биотраисформации различных Сахаров в аэробных условиях, ранее никем не проводились. Установлено, что в результате реализации выбранной стратегии в аэробных условиях под действием разработанного ИБК возможно получение до 14 г/л биоэтанола. Р1аиболее предпочти тельными субстратами для получения биоэтанола (и в анаэробном, и аэробном режимах) под действием ИБК оказались глюкоза и фруктоза, а также дисахариды на их основе (сахароза и мальтоза). Накопление максимальной концентрации этанола в анаэробном режиме культивирования происходило медленнее в 1,5-К? раза, чем в аэробном.

Одной из центральных проблем биотраисформации ферментативных гидролизатов ЦСО под действием клеток микроорганизмов в этанол является присутствие в них до 7 г/л солей уксусной кислоты, оказывающих ингибирующие воздействие па метаболическую активность продуцентов. Был проведен скрининг среди МГ на предмет выделения среди них культуры, наиболее толерантной к присутствию ацетата. Использование клеток МГ в аэробных условиях для получения этанола позволило получить более высокие концентрации целевого продукта в присутствии ацетата, чем в анаэробных. С целью получения максимально возможного выхода этанола при трансформации ферментативных гидролизатов ЦСО было проведено исследование влияния исходной концентрации ацетата на выход этанола в анаэробных условиях ведения процесса (Рис. 5).

Рис. 5. Влияние исходной концентрации ацетата аммония на концентрацию этанола, накапливающегося под действием БК в виде иммобилизованных клеток МГ Я. огугае Г1032 в среде (▲ - 24ч, ■ -48ч).

0

20

5 10 15

Ацетат аммония, г/л

Установлена способность ИБК па основе МГ Я. огугае обеспечивать высокие уровни накопления этанола при концентрациях ацетата аммония в среде 3^-10 г/л, что в 2-4 раза превосходит концентрации, ингибирующие

метаболическую активность клеток дрожжей - традиционно применяемых продуцентов этанола. В качестве перспективного сырья для получения этанола в аэробных условиях под действием разработанного ИБК, как оказалось, можно рассматривать те же субстраты, которые уже были предложены ранее для получения ФК (Табл. 4).

Табл. 4. Характеристики процесса трансформации НВС (50 г сух. в-в/л) под

действием ИБК на основе клеток МГ R. oryzae

Субстрат Исходная коїіц-и ВС, г/л Этанол, г/л Выход от теоретически возможного уровня, %

ЦСО

Багасса 16,0±0,4 6,3±0,1 78,7±1,5

Свекловичный жом 22,1±0,2 4,4±0,1 40,0±1,5

Пшеничная солома 33,2±0,5 12,7±0,3 76,9±1,5

Осиновые опилки 32,1±0,5 14,1±0,4 88,1±1,5

Березовые опилки 29,2±0,4 8,5±0,1 58,6±1,5

Сосновые опилки 32,4±0,3 2,7±0,1 16,8=Ы,5

Клубни топинамбура 37,3±2,3 13,8±0,1 74,5±1,5

Стебли топинамбура 31,1±0,7 13,4±0,1 86,4±1,5

Биомасса фототрофных микроорганизмов

Arthrospira platensis 15,3±1,7 0,3±0,2 4,3±0,7

Dunaliella salina 30,7±1,5 0,1 ±0,02 0,8±0,1

Chlorella vulgaris 22,6±2,3 1,6±0,2 14,1±1,5

Cosmarium sp. 24,4±1,5 0,4±0,03 3,5±1,1

Nostoc sp. 21,3±1,4 0,5±0,02 4,8±0,2

Биомасса макроводорослей

Fucus vesiculosus 17,6±1,2 0 0

Laminaria saccharina 23,8±0,9 5,7±0,2 47,9±1,5

Gracilaria íenuispitilata 20,4±1,3 1,1±0,02 10,9±0,9

Hypnea japónica 24,9±0,4 4,0±0,2 32,2±1,8

Asparagopsis íaxiformis 18,1±1,4 3,2±0,01 35,8±1,9

Laurencia trópica 12,2±0,7 3,7±0,01 61,2±1,4

L ¡agora sp. 24,4±1,3 3,7±0,01 30,7±1,2

Установлено, что ИБК па основе клеток МГ 11. огугае эффективно осуществляет трансформацию всех видов исследуемых субстратов. Из ЦСО

может быть получено до 14 г/л этанола с выходом 88% от теоретически возможного уровня, из БМ фототрофных микроорганизмов - до 1,6 г/л с выходом 14% (это процесс, очевидно, требует дополнительной оптимизации), из БМ макроводорослей - до 5,7 г/л с фактическим выходом 48%> от всей сухой БМ (по данным литературы максимальная концентрация при биотрансформации этого субстрата другими БК в этанол не превышает 3 г/л). Следует отметить, что исследования, касающиеся изучения возможностей использования стратегии получения этанола в аэробных условиях из НВС с использованием ИБК на основе клеток МГ Я. огугае были проведены впервые.

3. Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелнальных грибов — продуцентов гидролитических ферментов

Новые подходы к созданию и использованию ИБК на основе клеток МГ — продуцентов гидролитических ферментов. Ранее было установлено, что в зависимости от состава питательной среды, используемой для проращивания мицелия, из одного и того же иммобилизованного спорового материала, на основе клеток МГ можно использовать БК для получения различных целевых продуктов [Ефременко, 2010]. С нелыо увеличения продуктивности разработанных ИБК на основе клеток МГ была исследована возможность исходного введения индуктора синтеза гидролаз не в состав среды, а в состав гранул получаемых ИБК на стадии включения спорового материала в гранулы криогеля ПВС. Были проведены исследования по оптимизации концентрации индуктора (на примере делигнифицированных измельченных стеблей кукурузы), вводимого в состав получаемого иммобилизованного препарата на основе клеток МГ А. іеггеия. Оптимальным оказалось введение в состав гранул индуктора (измельченных делигнифицированных кукурузных стеблей) в концентрации 1%. Была продемонстрирована возможность широкого применения разработанного подхода для получения различных ИБК па основе клеток МГ (Табл. 5). Использование нового подхода - введение индуктора в состав гранул ИБК на стадии его формирования позволил повысить (от 4 до 75%, а в некоторых случаях в 2 раза) метаболическую активность по уровню синтеза ферментов всех исследованных продуцентов.

Одним из уникальных свойств и ценных преимуществ БК на основе иммобилизованных клеток МГ является их полифункциональность и, как следствие, универсальность. Была протестирована способность одного и того же ИБК секретировать различные гидролазы. Установлено, что для направленного изменения метаболизма синтеза ферментов у иммобилизованных клеток МГ в зависимости от условий проведения процесса требуется от 18 до 32 ч, что в любом случае меньше времени, необходимого для формировании свежей порции ИБК (1,5-^2,7 раза).

Табл. 5. Ферментативные активности ИБК на основе клеток МГ при введении индукторов в состав гранулы

Продуцент Индуктор Ферменты Ферментативная активность, Ед/л

без индуктора с индуктором

R. oryzae Крахмал Амилаза Глкжоамилаза 2500±75 210±8 2800+75 220±8

Измельченные отходы переработки картофеля Амилаза Глкжоамилаза 1800±80 180±15 2100±80 220±15

Измельченная БМ макроводоросли L.saccharina Амилаза Глюкоамилаза Протеаза 1500±60 150±7 600±10 1700±60 190±7 650±Ю

Heleococcum alkalinum Крахмал Амилаза Глюкоамилаза Протеаза 2500±90 180±10 10000±200 2750±90 200±10 12000±200

БМ микроводоросли Chlorella vulgaris Амилаза Глюкоамилаза Протеаза 2200±80 140±30 13000±190 2300±80 190±30 13500±190

R. oryzae БМ микроводоросли N'annochloropsis sp. Липаза Протеаза 4000±70 8000±110 5000±70 8500±110

БМ микроводоросли С. vulgaris Липаза Протеаза 4000±40 9100±60 4500+40 9700±60

A. foetidus Пектин (степень этерификации~70%) Псктиназа Пектин-лиаза 35000±300 32000±190 37500±300 34000±190

Измельченная БМ макроводоросли Zostera marina Пектиназа 7000±100 9300±100

Измельченные яблочные выжимки Пектиназа 21000+250 24000±250

A. terreus Делигнифицированные кукурузные стебли Эндоглюканаза Экзоглюканаза Р-глюкозидаза 4050±100 330±20 290±15 7200±150 590±20 400±15

Измельченная пшеничная солома Эндоглюканаза Экзоглюканаза |3-глюкозидаза 5000±150 280±15 220±15 7200±150 420±20 370±15

Также при исследовании возможности многократного использования ИБК на основе клеток МГ - продуцентов гидролаз было показано, что иммобилизованные клетки в сравнении со свободными являются более эффективными БК для использования в процессах трансформации НВС. Длительность их эффективного использования минимум в 2-3 раза выше, а уровень метаболической активности в отношении синтеза различных гидролаз - в 2-6 раз.

Практическое применение ИБК на основе клеток МГ — продуцентов гидролаз, не предусматривающее выделение ферментов из среды, возможно в процессах очистки сточных вод пищевой промышленности и сельского хозяйства. В работе использовались 8 видов сточных вод, взятых с различных производств (Табл. 6).

Табл.6. Характеристики процессов очистки различных сточных вод под действием ИБК на основе клеток МГ К. огугае____

Исходная сточная пода После очистки 5

Состав, % в су Состав, % >в 5 в в

Источник липиды белки углеводы ч о С липиды белки углеводы Е 5 й Ь Ч С и р X

Производство крахмало- продуктов 5,2±0,2 20,41-0,8 50,7±2 0,3ь0,0 1,2±0,0 2,5±0,1 66,7±2,7

Производство мясных консервов 10,1±0,4 1,1±0,0 35,5±1 ОО 0,5±0,0 0,1 ±0,0 1,8±0,0 77,6±3,1

Сточные воды скотобойни 8,2±0,3 20,1±0,8 30,3±1 Цн 0,4+0,0 1,1 ±0,0 1,5±0,0 60,0±2,4

Переработка сои 0,5±0,0 0,9±0,0 0,1 ±0,0 0 0,1±0,0 0 78,8±3,2

Останкинский 0,5±0,0 0,1 ±0,0 0,5±0,0 67,4±2,7

молочный комбинат 19,1±0,7 2,3±0,0 5,1 ±0,2 ГП 0,5±0,0 0,1 ±0,0 0,5±0,0 70,7±2,8

Молокопера- Е 0,6±0,0 0,1 ±0,0 0 80,0±3,2

батывающее производство 21,1±0,8 0,5±0,0 0,1±0,0 | Р814 1,1 ±0,0 0,1 ±0,0 0 76,4±3,1

Установлено, что использование ИБК на основе клеток МГ оказалось весьма эффективным в процессах биотрансформации отходов различных производств. Гидролиз основных органических компонентов в целом был осуществлен на 90-100% за достаточно короткий период времени (24ч), и это значительно превосходило известные в литературе данные относительно подобных биотехнологических процессов очистки сточных вод. Накапливающаяся БМ иммобилизованных клеток в зависимости от

исходного состава сред имела различный биохимический состав (Табл. 7). Показана возможность использования отработанной иммобилизованной БМ в качестве субстрата для получения биогаза с выходом до 77,3±3,4%.

Табл.7. Биохимический состав иммобилизованной биомассы МГ R. oryzae F8 И, после очистки сточных вод различных производств

Состав, % 1 %

Источник сточных вод i конверсии

лиииды белки углеводы j вбиогаз

Производство крахмалопродуктов 6,0±0,8 33,5±1,8 56,8±4,9 ; 31,4±1,2 ;

Молокоперабатывающее 1 24.3- 7 77,3 13,4

производство ' ' ' ' ' '

; Сточные воды скотобойни 15±1,3 39,5±1,4 43,5±1,1 58,4±2,9

4. Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальиых грибов рода Aspergillus в процессах биоразложеиия фосфорорганических пестицидов

БК в виде иммобилизованных клеток МГ Aspergillus niger для утилизации продуктов гидролиза хлорпирифоса. Продуктом гидролиза хлорпирифоса, а также мстилхлорпирифоса и триклопира, является ТХП.

Для осуществления первой стадии гидролиза пестицида был использован ферментный БК на основе гексагистидин-содержагцей органофосфосфатгидролазы (His6-OPII), который, способен эффективно осуществлять катализ реакции разрыва Р-0 связи (Рис. 6).

His6-OPH S

if + CNHsO— P— OH

ci-^-.v OH OC;H5

H-O

.i, 5,6-TpiLX.iop-2-mipiidiino.7 О. О'-Диэтиттофосф

Рис. 6. Схема разложения хлорпирифоса под действием фермента His6-OPH

Был проведен скрининг среди грибов родов Aspergillus, Fusarium, Mucor, Pénicillium, Trichoderma на способность осуществлять биодеструкцию ТХП, в результате которого был выбран штамм A. niger F-679, на основе клеток которого получен ИБКМаксимальная биодеградационная активность И Б К на основе клеток A. niger в отношении ТХП была установлена при температуре 28-30°С и рН 5,8-6,8.

Для проведения процесса разложения ТХП осуществлялся предварительный гидролиз хлорпирифоса, взятого в концентрации 0,2 мМ под действием фермента IIis6-OPH, полученный ферментативный гидролизат разбавлялся в два раза раствором солей. Установлено, что для 100 % утилизации ТХП необходим 21 ч (Рис. 7А).

А

с

X

ь

75

50

25

20 40 60 Время, ч

80

100

75

= 50

25

-ХП

Рис 7. Изменение степени утилизации хлорпирифоса и продукта его гидрозиза ТХП под действием ИБК на основе клеток МГ А. niger. А - последовательная обработка №56-ОРН и ИБК, Б — только ИБК.

Пунктиром указано время замены питательной среды на свежую аналогичного состава.

25 5 0 75 1 00 -ТХП Время,ч

125 150

При анализе литературных данных было установлено, что клетки А. niger способны осуществлять секрецию таких ферментов, как А-ОРН и лакказа [Singh, 2006, Lui, 2001], поэтому далее было решено исследовать возможность разложения хлорпирифоса без предварительной обработки ферментом His6-OPH под действием ИБК на основе клеток A. niger (Рис. 7Б). Показано что, процесс деструкции хлорпирифоса завершался в течение 1 сут, а деструкция продукта его гидролиза ТХП - за 2 сут. Б К в виде иммобилизованных клеток МГ A. awamory для утилизации ПНФ - продукта гидролиза метилпаратиона, метилпараоксона, паратиона и параоксона. Процесс разложения этих ФОП может быть условно разделен на две основные стадии: 1- гидролиз ФОП под действием фермента hïs6-OPH (Рис. 8), 2- разложение ПНФ под действием клеток микроорганизмов.

/^Х Hisé-OPH \_/-N02 -

ОМе 4-' ,

п-нитрофенол

Метилпаратион

Рис. 8. Схема разложения ФОП на примере метилпаратиона под действием ферментного препарата на основе His6-OPI I

МеО—Р—О

H

no2

На основании проведенного скрининга был выбран штамм A. awamory F9, обладающий максимальной степенью разложения ПНФ. На основе клеток этого МГ был приготовлен ИБК и использован для биодеструкции ПНФ. Максимальная биодеградационная активность иммобилизованных клеток A. awamory в отношении ПНФ была установлена при температурных и рН условиях, соответствующих оптимальным условиям роста данной культуры (28-30°С и 5,5-7,0.).

Для исследования процесса разложения ПНФ под действием ИБК на основе клеток A. awamory в качестве исходного субс трата был взят пестицид метилпаратион. С помощью фермента I-Iisg-OPH был осуществлен его ферментативный гидролиз, далее полученный ферментативный гидролизат разбавлялся в 2 раза раствором солей, необходимых для клеток МГ (Рис.9).

Рис. 9 - Степень утилизации 0,1 мМ ПНФ под действием БК в виде иммобилизованных клеток

A. awamory в периодическом процессе биодеструкции ПНФ. Пунктиром указано время замены питательной среды на свежую аналогичного состава.

Установлено, что при использовании БК в виде иммобилизованных клеток A. awamory за 48 ч возможна полная утилизация ПНФ из среды культивирования. Средняя скорость процесса составляли 2,04±0,04 мкМ/ч. Потеря деградационной активности ИБК в отношении ПНФ за 3 цикла составила всего 8%.

При проведении сравнительного анализа эффективности действия в процессах биодеструкции продуктов ферментативного гидролиза ФОП разработанных ИБК на основе клеток МГ рода Aspergillus и БК в виде иммобилизованных в криогель ПВС бактерий Pseudomonas putida [Efremenko, 2006] показано, что иммобилизованные клетки МГ способны осуществлять утилизацию более широкого спектра субстратов при меньшей концентрации ИБК.

При помощи разработанного биочувствитсльпого элемента на основе клеток фотобактерий Photobacterium phosphoreum была исследована токсичность всех сред, полученных после разложения ФОП и продуктов из гидролиза под действием разработанных ИБК. Все среды оказались не токсичными.

0 25 50 75 100 125 Время, ч

Выводы

1. Разработан ИБК на основе клеток MF R. oryzae для получения фумаровой кислоты, определены условия его эффективного функционирования в ппокозосодержащих средах. Показано, что он в 5-12 раз превосходит известные аналоги по уровню накопления ФК.

2. Впервые продемонстрирована возможность использования в качестве субстратов различных ЦСО сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности, а также биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей для получения молочной и фумаровой кислот.

3. Впервые продемонстрирована возможность использования биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей в качестве субстратов для получения этанола под действием ИБК на основе клеток МГ родов Mucor, Aspergillus, Trichoderma в анаэробных условиях.

4. Впервые показана возможность использования широкого спектра субстратов (ЦСО, биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей) для получения этанола под действием иммобилизованных клеток МГ R. oryzae Fl032 в аэробных условиях. Установлена способность этого ИБК обеспечивать высокие уровни накопления этанола при концентрациях ацетата аммония в среде 5-10 г/л, ч то в 2-4 раза превосходит концентрации, ингибирующис метаболическую активность клеток дрожжей, традиционно применяемых для получения этанола.

5. Усовершенствован метод получения ИБК на основе клеток МГ с повышенной эффективностью действия за счет введения индукторов синтеза гидролитических ферментов непосредственно в состав гранул ИБК, который обеспечивает повышение от 4 до 200% уровня синтеза ферментов иммобилизованными клетками МГ.

6. Установлена возможность использования одного и того же ИБК на основе клеток МГ для получения различных гидролитических ферментов при замене основного субстрата в среде культивирования.

7. Показана возможность накопления грибной биомассы различного биохимического состава на сточных водах пищевых производств и сельского хозяйства, сопряженная с одновременной утилизацией основных компонентов стоков и снижением уровня ХПК. Установлена эффективность использования этой биомассы для получения биогаза со степенью конверсии до 77,3±3,4.

8. Впервые продемопстировано эффективное использование ИБК на основе клеток МГ рода Aspergillus для разложения хлорпирифоса и утилизации продуктов ферментативного гидролиза ФОП (п-нитрофенола и 3,5,6-трихлоро-2-пиридинола).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. E.H. Ефременко, А.Б. Никольская, Ф.Т. Мамедова, О.В. Сенько, Л.И. Трусов. Полунепрерывный и непрерывный процесс накопления биомассы клеток микроводорослей Chlorella vulgaris в минеральной среде. // Альтернативная энергетика и экология, 2013, № 2 (119), с. 44-49. (ВАК)

2. О.В. Сенько, H.A. Степанов, О.В. Маслова, И.В. Лягин, E.H. Ефременко. Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья. // Вестник КузГТУ, 2013, №1, с. 109111. (ВАК)

3. H.A. Степанов, О.В. Сенько, E.H. Ефременко. Трансформация возобновляемых источников энергии в виде целлюлозосодержащих отходов в биоэтанол под действием иммобилизованных клеток микроорганизмов. // Вестник КузГТУ, 2013, №1, с. 111-113. (ВАК)

4. E.H. Ефременко, ILA. Степанов, Д. А. Гудков, О.В. Сенько, В.И. Лозинский, С.Д. Варфоломеев. Иммобилизованные грибные биокатализаторы для получения комплекса целлюлаз, гидролизующего возобновляемое растительное сырьё. // Катализ в пром-ти, 2013, № 1, с. 6877. (ВАК)

5. О.В. Сенько, М.А. Гладченко, И.В. Лягин, А.Б. Никольская, О.В. Маслова,

Н.И. Чернова, C.B. Киселева, Т.П. Коробкова, E.H. Ефременко, С.Д. Варфоломеев Трансформация биомассы фотогрофных микроорганизмов в метан. // Альтернативная энергетика и экология, 2012, № 3, с. 89-94. (ВАК)

6. E.N. Efremenko, A.B. Nikolskaya, I.V. Lyagin, O.V. Sen ko, T.A. Makhlis, N.A. Stepanov, O.V. Maslova, F. Mamedova, S.D. Varfolomeyev. Production of biofuels from pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized Clostridium acetobuiylicum cells. // Biores. Technol., 2012, V. 114, p. 342-348. {IF 4,750)

7. B.B. Куц, К.А. Аленина, О.В. Сенько, E.H. Ефременко, А.Д. Исмаилов. Биолюминесцентный мониторинг экотоксикантов (экологическая люминометрия). // Вода: химия и экология, 2011,№ 10, с. 47-53. (ВАК)

8. E.H. Ефременко, H.A. Степанов, Никольская А.Б., Сенько О.В., О.В. Спиричева, С.Д. Варфоломеев. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола // Катализ в пром-ти, 2010, №5, с. 70-76. (ВАК)

9. E.H. Ефременко, Н.В. Завьялова, Д.А. Гудков, И.В. Лягин, О.В. Сенько, М.А. Гладченко, М.С. Сирогкина, A.B. Холстов, С.Д. Варфоломеев, В.И. Холстов. Экологически безопасная биодщрадация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. хим. ж. (Ж.. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2010, Т. LIV(4), с. 19-24. (ВАК)

10. Е. Efremenko, О. Sen ko, D. Zubaerova, Е. Podorozhko, V. Lozinsky. New biocatalyst with multiple enzymatic activities for treatment of complex food wastewater.// Food Techn. Biotechn., 2008, V. 46 (2), p.208-212. (IF 1,270)

11. О.В. Сенысо, О.В. Спиричева, В.И. Лозинский, Е.Н. Ефременко. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности. И Катализ в пром-ти, 2007, №1, с. 55-61. (ВАК)

12. Е. Efremenko, N. Stepanov, A. Nikolskaya, О. Senko, D. Gudkov, О. Spiricheva, S. Varfolomeev. Immobilized cells of various microorganisms in production of liquid biofuels. // In book: 18th European Biomass Conference and Exibition: From research lo industry and markets, 3-7 May 2010 Lyon, France, (Eds. J. Spitzer, J.F. Dallemand, D. Baxter, II. Ossenbrink, A. Grassi, P.Helm), ETA-Florence Renewable Energies, ISBN 978-88-89407-56-5, p. 1753-1758.

13. E.N. Efremenko, I.V. Lyagin, O.V. Sen ko. D.A. Gudkov, S.D. Varfolomeyev Application of gel systems with various biocatalysts detoxifying neurotoxic agents for pollution control, water purification, and self-defense. // In book: "Sol-gel methods for materials processing" Ser. NATO Science for Peace and Security (Eds: Innocenzi P., Zub Y.L, Kessler V.G.), 2008, ISBN: 978-1-4020-8521-5, p. 77-89.

14. E.N. Efremenko, O.V. Senko, D.IT. Zubaerova, E.A. Podorozhko, Y.I. Lozinsky. Effective immobilized biocatalyst for the treatment of various food wastewaters.// In book: Biotechnology: sate of the art and prospects for development (Ed. G.E.Zaikov), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., 2008, Ch.l 1, p. 103-110.

15. E.N. Efremenko, I.V. Lyagin, O.V. Senko, N.A. Stepanov, O.V. Spiricheva, R.E. Azizov. Modern trends in application of immobilized cells for environmental bioremediation. // In book: Leading-Edge Environmental Biodégradation (Ed.L.E. Pawley), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., 2007, Ch. 1, p. 11 -51.

16. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенысо, В.В. Куц, К.И. Аленина, А.В. Холстов, А.Д. Исмаилов. Люминесцентный биокатализатор для определения токсикантов. // Патент РФ на изобретение № 2394910, опубл. 20.07.2010, Бюл. № 20.

17. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенько, I1.A. Степанов, С.Д. Варфоломеев. Иммобилизованный биокатализатор для получения этанола из пентоз. // Патент РФ на изобретение № 2391402, опубл. 10.06.2010, Бюл. №16.

18. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенысо. О.В. Спиричева, С.Д. Варфоломеев, Б.Л. Шаскольский, В.И. Лозинский. Иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения нектипаз. // Патент РФ на изобретение № 2383618, опубл. 10.03.2010, Бюл. №7.

19. Е.Н. Ефременко, И.В. Лягин, О.В. Сенысо, О.В. Спиричева, С.Д. Варфоломеев. Способ получения лактатсодержащих растворов. // Патент РФ на изобретение № 2355766, опубл. 20.05.2009, Бюл. №14.

20. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенысо, О.В. Спиричева, В.И. Лозинский, С.Д. Варфоломеев. Иммобилизованный биокатализатор для биологической очистки жиросодержащих сточных вод и способ его получения. // Патент РФ на изобретение № 2315102, опубл. 20.01.2007, Бюл. №2.

Подписано к печати 2.ІА!АЪ Trçssst 4ПП Зчутп JñO

Отпечатала a отделе оперативной печэтя физического сраку/лтста МГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Сенько, Ольга Витальевна, Москва

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

химический факультет

На правах рукописи

04201453909

СЕНЬКО Ольга Витальевна

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ В ВИДЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЬ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА КЛЕТОК МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В ПРОЦЕССАХ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ, БИОЭТАНОЛА, ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И РАЗЛОЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: профессор, д.б.н., Ефременко Е.Н.

МОСКВА-2013

содержание

23

24

24

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 9

ВВЕДЕНИЕ 10

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1 Особенности и перспективы использования клеток мицелиальных грибов в

13

биотехнологических процессах

1.2 Непищевое возобновляемое сырье как субстрат для мицелиальных грибов 16

1.3 Некоторые биотехнологические процессы, осуществляемые с участием клеток мицелиальных грибов

1.3.1 Получение органических кислот из непищевого возобновляемого сырья под действием мицелиальных грибов

1.3.1.1 Практическое значение молочной и фумаровой кислот и их производных для химической промышленности

1.3.1.2 Способы получения молочной и фумаровой кислот из отходов пищевой промышленности и сельского хозяйства под действием клеток мицелиальных 30 грибов

1.3.2 Получение биоэтанола из непищевого возобновляемого сырья под действием биокатализаторов в виде клеток мицелиальных грибов

1.3.2.1 Практическое значение биоэтанола для топливной и химической промышленности

1.3.2.2 Способы получения биоэтанола из непищевого возобновляемого сырья под действием мицелиальных грибов

1.3.3 Получение гидролитических ферментов мицелиальных грибов 44

1.3.3.1 Практическое значение гидролитических ферментов для химической и топливной промышленности

1.3.3.2 Получение гидролитических ферментов при использовании непищевого возобновляемого сырья в качестве субстрата для клеток мицелиальных грибов

1.3.3.3 Непосредственное использование грибных продуцентов гидролитических ферментов в различных процессах

1.3.4 Разложение фосфорорганических пестицидов, используемых в сельском хозяйстве, под действием клеток мицелиальных грибов

1.3.4.1 Общая характеристика фосфорорганических пестицидов, используемых в сельском хозяйстве

39

39

40

44

45

48

49

1.3.4.2 Разложение ксенобиотиков под действием клеток мицелиальных грибов 54

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57

2.1 Материалы 57

2.1.1 Химические реактивы 57

2.1.2 Приборы 58

2.1.3 Микроорганизмы 59

2.1.4 Источники углеводсодержащего сырья, использованного в работе 59 2.2. Методы 61

2.2.1 Культивирование клеток различных микроорганизмов 61

2.2.2 Иммобилизация микроорганизмов в криогель поливинилового спирта 62

2.2.3 Биохимический анализ клеток микроорганизмов 62

2.2.3.1 Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток микроорганизмов 62

2.2.3.2 Определение концентрации липидов 62

2.2.3.3 Определение концентрации белков 62

2.2.3.4 Определение концентрации углеводов 63

2.2.3.5 Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминесцентным

63

методом

2.2.4 Проведение и оценка эффективности предварительной предобработки

65

непищевого возобновляемого сырья

2.2.4.1 целлюлозосодержащих отходов 65

2.2.4.2 Предобработка биомассы фототрофных микроорганизмов и

67

макроводорослей

2.2.5 Определение концентрации глюкозы глкжозидазным методом 67

2.2.6 Определение восстанавливающих Сахаров по Шомоди-Нельсону 67

2.2.7 Определение концентрации органических кислот 68

2.2.7.1 Определение концентрации молочной кислоты 68

2.2.7.2 Определение концентрации фумаровой кислоты 68

2.2.8 Определение концентрации этанола 68

2.2.9 Определение концентрации ацетат-ионов 69

2.2.10 Определение гидролитических ферментативных активностей 69

2.2.10.1 Определение липолитической активности 69

2.2.10.2 Определение амилолитических активностей 70

2.2.10.3 Определение протеолитической активности 70

2.2.10.4 Определение пектиназной активностей 70

2.2.10.5 Определение целлюлазных активностей 70

2.2.11 Определение оптической плотности суспензии клеток микроорганизмов

2.2.12 Определение показателя общего химического потребления кислорода 2.2.13. Проведение предварительного ферментативного гидролиза хлорпирифоса и метилпаратиона

2.2.14 Определение концентрации 3,5,6-трихлоро-2 пиридинола и п-нитрофенола 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов рода ЯЫгорт в процессах получения органических кислот из непищевого возобновляемого сырья

3.1.1 Разработка биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов рода КЫгорт для получения фумаровой кислоты

3.1.2 Исследование основных функциональных и каталитических характеристик разработанного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032

3.1.2.1 Исследование влияния концентрации в средах разработанного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032 на эффективность его действия

3.1.2.2 Исследование влияния исходной концентрации субстрата на эффективность действия разработанного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае И1032

3.1.2.3 Определение рН-оптимума действия разработанного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032

3.1.2.4 Исследование возможности многократного использования разработанного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032 в процессе получения фумаровой кислоты

3.1.2.5 Исследование влияния присутствия нейтрализующего агента в среде на накопление фумаровой кислоты под действием разработанного иммобилизованного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032

3.1.2.6 Исследование субстратной специфичности разработанного иммобилизованного биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугае Р1032

86

88

3.1.3 Трансформация возобновляемого непищевого углеродсодержащего сырья под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных 86 грибов рода ЯЫгорш в органические кислоты

3.1.3.1 Трансформация целлюлозосодержащих отходов непищевого возобновляемого сырья под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода ЯЫгорт в органические кислоты

3.1.3.1.1 Выбор способа предобработки целлюлозосодержащих отходов для получения органических кислот под действием биокатализаторов в виде 87 иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Юх'иорт

3.1.3.1.2 Трансформация различных ферментативных гидролизатов целлюлозосодержащих отходов в органические кислоты под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода ЯЫюрт

3.1.3.2 Трансформация биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных 89 клеток мицелиальных грибов рода ЯЫгорт в органические кислоты

3.1.3.2.1 Выбор способа предобработки биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей для получения органических кислот под действием

89

биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода ЯМгорш

3.1.3.2.2 Трансформация гидролизатов биомассы фототрофных микроорганизмов

и макроводорослей в органические кислоты под действием биокатализаторов в 91 виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода КЫгорт

3.1.3.3 Подбор и оценка различных подходов к получению органических кислот с использованием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода ЯЫгорш из непищевого возобновляемого углеродсодержащего сырья

3.1.3.3.1 Выбор стратегии контроля и поддержания рН культуральной среды в процессах получения органических кислот под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода ЛЫгорт из непищевого возобновляемого углеродсодержащего сырья

93

3.1.3.3.2 Выбор стратегии работы с вязкими субстратами в процессах получения органических кислот под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных

клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus из непищевого возобновляемого углеродсодержащего сырья

3.1.3.3.3 Сравнение эффективности действия свободных и иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus в процессах получения органических 96 кислот из непищевого возобновляемого сырья

3.1.3.3.4 Экономическая оценка эффективности использования иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus в процессах 97 получения органических кислот из непищевого возобновляемого сырья

3.2 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения этанола из 100 непищевого возобновляемого сырья

3.2.1 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в анаэробных процессах получения этанола 100 из биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей

3.2.2 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальных грибов в аэробных процессах получения биоэтанола из непищевого 105 возобновляемого сырья

3.2.2.1 Исследование субстратной специфичности иммобилизованных клеток мицелиального гриба R. oryzae в процессе накопления биоэтанола в аэробных 106 условиях

3.2.2.2 Исследование влияния солей уксусной кислоты на эффективность действия биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов в 108 процессах получения этанола

3.2.2.2.1 Скрининг продуцентов этанола среди мицелиальных грибов в

108

присутствии солей уксусной кислоты

3.2.2.2.2 Исследование влияния исходной концентрации ацетата в питательной среде на выход этанола, полученного под действием биокатализатора в виде 110 иммобилизованных клеток мицелиального гриба R. oryzae

3.2.2.3 Получение этанола под действием иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus из различных углеродсодержащих субстратов 112 в аэробных условиях

3.3 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового

спирта клеток мицелиальных грибов - продуцентов гидролитических ферментов

3.3.1 Новые подходы к созданию и использованию биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных 114 грибов - продуцентов гидролитических ферментов

3.3.1.1 Исследование влияния индуктора синтеза гидролитических ферментов, вводимого в состав биокатализатора в виде иммобилизованных клеток 115 мицелиальных грибов

3.3.1.2 Исследование новых возможностей полифункционального использования биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта

118

клеток мицелиальных грибов - продуцентов различных классов гидролитических ферментов

3.3.2 Использование биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель ЛВС клеток мицелиальных грибов - продуцентов гидролитических ферментов в 122 различных процессах экологической направленности

3.3.2.1 Использование биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель поливинилового клеток мицелиальных грибов для многократного получения 122 гидролитических ферментов из непищевого возобновляемого сырья

3.3.2.2 Использование гидролитической активности биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных 128 грибов для разложения различных отходов

3.4 Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов рода Aspergillus в процессах биоразложения 133 фосфорорганических пестицидов

3.4.1 Биокатализатор в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба

133

Aspergillus niger для утилизации продуктов гидролиза хлорпирифоса

3.4.1.1 Скрининг среди мицелиальных грибов по способности утилизировать хлорпирифос и продукты его ферментативного гидролиза

3.4.1.2 Исследование физико-химических и каталитических характеристик биокатализатора клеток в виде A. niger иммобилизованных в криогель 134 поливинилового спирта

3.4.1.3 Применение биокатализатора в виде иммобилизованных клеток

A. niger в процессе последовательного биоразложения фосфорорганического 136 пестицида хлорпирифоса и продукта его гидролиза 3,5,6-трихлоро-2-пиридинола

3.4.1.4 Применение биокатализатора в виде иммобилизованных клеток Aspergillus

nige в процессе биоразложения фосфорорганического пестицида хлорпирифоса

3.4.2 Биокатализатор в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба А. ам>атогу для утилизации продуктов гидролиза метилпаратиона, 139 метилпараоксона, паратиона и параоксона

3.4.2.1 Скрининг среди мицелиальных грибов по их способности утилизировать

паранитрофенол и продукты его разложения

3.4.2.2 Исследование физико-химических и каталитических характеристик биокатализатора в виде иммобилизованных клеток А. ам>атогу для процесса 141 разложения паранитрофенола

3.4.2.3 Применение биокатализатора в виде иммобилизованных клеток А. сматогу

в процессе биотрансформации паранитрофенола и других продуктов гидролиза 141 метилпаратиона и его аналогов

3.4.2.4. Сравнительный анализ биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток различных микроорганизмов для процессов биотрансформации продуктов 143 гидролиза фосфорорганических соединений

140

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

145

149

список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат;

БК - биокатализатор;

БМ - биомассам;

ВБ - влажная биомасса;

ВС - восстанавливающие сахара;

ИБК - иммобилизованный биокатализатор;

МГ - мицелиальные грибы;

МК - молочная кислота;

НВС - непищевое возобновляемое сырье;

ООФ - одновременное осахаравание и ферментация;

Пбк - продуктивность биокатализатора;

Ппроиссса - продуктивность процесса;

ПВС - поливиниловый спирт;

ПНФ - п-нитрофепол;

Со - начальная концентрация;

СВ - сухой вес;

СР - степень разложения;

ТХП - 3,5,6-трихлоро-2-пиридинол;

ФК - фумаровая кислота;

ФОП - фосфорорганические пестициды;

ФОС - фосфорорганические соединения;

ХПК - химическое потребление кислорода;

ЦСО -целлюлозосодержащие отходы;

ЦСС - целлюлозосодержащее сырье;

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;

ц - удельная скорость роста биомассы;

№зб-ОРН - гексагистидин-содержащая органофосфатгидролаза; ОРН - органофосфатгидролаза.

введение

На сегодняшний день перед мировым сообществом стоит целый ряд экологических задач, основной из которых является трансформация различных отходов в менее токсичные соединения - коммерчески значимые продукты для целей химической, нефтехимической, топливной и пищевой промышленностей.

Использование биотехнологических подходов к решению таких задач является весьма перспективным по ряду причин. Это и отсутствие токсичных выбросов в атмосферу, характерных для сжигания или складирования отходов, и более «мягкие» условия, необходимые для реализации способа утилизации, чем в случае химического катализа процессов.

Мировой рынок биотехнологий к 2025 г. может достигнуть уровня в 1,5 триллиона евро. Доля России на рынке биотехнологий составляет на сегодняшний день менее 0,1 %, а по ряду сегментов (биоразлагаемые материалы, биотопливо) практически равна нулю. Таким образом, научные исследования, результаты которых могут быть использованы для практической реализации новых биотехнологий, являются актуальными и имеют большую практическую значимость.

Для целого ряда отраслей (агропищевого и лесного сектора, ряда подотраслей химической и нефтехимической промышленности, фармацевтической отрасли и биомедицинского сектора здравоохранения) модернизация в ближайшее время будет означать переход на биокаталитические методы и продукты.

В силу экономических и экологических преимуществ доля химической продукции, производимой на основе возобновляемого сырья, будет расти и дальше [1]. Методы биотехнологии позволяют проводить глубокую переработку отходов агропромышленного комплекса, и в ряде стран само понятие «отходы» для этого сектора уже перестает существовать. Значительный потенциал для развития биоэнергетики может быть реализован за счет использования целлюлозосодержащих отходов промышленности и сельского хозяйства.

Осуществлять разложение различных отходов и продуцировать коммерчески значимые метаболиты способны, прежде всего, биокатализаторы (БК) в виде клеток мицелиальных грибов (МГ) с их высокоактивными, в большей степени, внеклеточными гидролазами. Известно, что МГ способны секретировать широкий спектр мультиферментных комплексов, включающих амилазы, протеазы, целлюлазы, липазы, фосфотазы, пектиназы и другие [2], а также синтезировать такие метаболиты как органические кислоты, биоэтанол и др. Причем субстрат, доступный для утилизации клеткам грибов, зачастую инициирует синтез необходимого для его разложения ферментного комплекса. Свойство МГ

секретировать комплексы, состоящие из самых раз