Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков"

На правах рукописи

ЕЛЬКИН Андрей Анатольевич

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ТИОАНИЗОЛА СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ

03.02.03 Микробиология 4854454

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 ОЕВ 2011

Пермь-2011

4854454

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,

профессор Ившина Ирина Борисовна

кандидат химических наук Гришко Виктория Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Соловых Галина Николаевна кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович

Ведущая организация: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань.

Защита состоится февраля 2011 г. часов на заседании

диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:(342)2808111.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://vvww.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) органические сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра, способного с высокой степенью стереоселективности определять направление химических реакций. В современной медицине используются антибактериальные, противоязвенные, противовоспалительные и анальгетические препараты на основе сульфоксидсодержащих соединений. С учётом различия в скорости метаболизма (S)- и (Л)-энантиомерных сульфоксидов антисекреторных средств (пантопразола, рабепразола, лансопразола, омепразола, тенатопразола и др.) разработаны современные эффективные лекарственные препараты на основе индивидуальных энантиомеров (Захарова, 2008; Cotton et al., 2000; Andersson et al., 2001).

Получение оптически активных сульфоксидов осуществляется в основном методами химического синтеза. Однако при получении энантиомерно чистых сульфоксидов химическим путем не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций (Толстиков и др., 2003). Альтернативой многостадийному химическому синтезу оптически активных соединений выступают биологические технологии, позволяющие существенно повысить уровень регио- и стереоселективности реакций (Careno, 1995; Solladie et al., 1995; Holand et al, 2002, 2003). В качестве биокатализаторов процесса окисления прохиральных сульфидов используются ферментные препараты (оксигеназы, пероксидазы) и целые микробные клетки. Однако промышленное использование чистых ферментов, несмотря на их высокую регио- и стереоселективность, ограничивается из-за проблем, связанных с очисткой, препаративным выделением и сохранением стабильности индивидуальных ферментов. Кроме того, спектр веществ, которые могут превращаться интактными микробными клетками, намного

шире. Специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем, отсутствие проблемы с добавкой оксиданта и регенерацией кофермента, устойчивая активность в экстремальных условиях внешней среды обусловливают технологическую перспективность использования целых клеток микроорганизмов в процессах асимметрического окисления сульфидов.

В настоящее время в реакциях окислительной биотрансформации многих органических соединений - алифатических и ароматических углеводородов, изопреноидов, стеринов, стероидов и их структурных аналогов всё чаще используются актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой активностью оксигеназных ферментных комплексов (Larkin, Kulakov, Allen, 2006; Martinkovä et al., 2009). Родококки успешно применяются в качестве биокатализаторов процесса десульфуризации серосодержащих компонентов нефти, начальным этапом которого является образование сульфоксидов. Недавно показана технологическая перспективность использования цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ родококков в реакциях селективного биокаталитического синтеза арилалкилсульфоксидов (Liu et al., 2006; Jackson et al., 2007; Zhang et al., 2010). Вместе с тем, известны лишь единичные примеры использования представителей R. equi и R. erythropolis в реакциях окисления прохиральных сульфидов в оптически активные сульфоксиды. Низкая эффективность таких реакций обусловлена высокой концентрацией используемых субстратов и патогенностью культур R. equi (Ohta et al., 1984, 1985), либо низкой концентрацией трансформируемых сульфидов при высокой нагрузке биокатализатора (Holand et al., 2003). В связи с этим поиск новых культур родококков, катализирующих целевые реакции биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды является весьма актуальным.

Цель настоящей работы - исследование возможностей использования актинобактерий рода Ююс1ососст для эффективной окислительной биотрансформации прохирального фенилметилсульфида (тиоанизола).

Основные задачи исследования

1. Исследовать окисляющую активность коллекционных штаммов родококков разных видов в отношении арилалкилыюго сульфида тиоанизола.

2. Выявить оптимальные условия для окислительной биоконверсии тиоанизола с использованием свободных клеток родококков.

3. Провести сравнительное исследование каталитической активности свободных и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков при биотрансформации тиоанизола.

4. На основе иммобилизованных клеток родококков разработать эффективный биокатализатор для окисления тиоанизола и его гомологов в оптически активные арилалкилсульфоксиды.

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ биокаталитической активности коллекционных культур актинобактерий рода Мос^ососсиз в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола. Выявлено, что родококки разных видов катализируют образование как (К)-, так и (5)-сульфоксида тиоанизола. Показано, что сульфидокисляющая активность родококков не является видоспецифичной и реализуется в присутствии дополнительных источников углерода. Наиболее эффективными ростовыми субстратами в процессе окислительной биотрансформации тиоанизола являются глицерин и н-гексадекан. Обнаружена обратная зависимость сульфидокисляющей активности родококков от концентрации н-гексадекана в среде их культивирования. Определены оптимальные условия направленного окисления тиоанизола в оптически активный (5")-сульфоксид с использованием иммобилизованных в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС-криогеля) клеток родококков. Экспериментально подтверждено, что иммобилизованные клетки родококков

характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о возможности использования бактерий для регио- и стереоселективной биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды. В результате проведенных исследований выявлены штаммы ЮкнЬзсоссш Брр., активно катализирующие направленное образование энантиомерно обогащенных сульфоксидов. На основе иммобилизованных в ПВС-криогеле клеток родококков разработан эффективный биокатализатор с высокой сульфидокисляющей активностью, обладающий длительной сохранностью функциональной стабильности и возможностью многократного использования для биотрансформации тиоанизола. Полученные экспериментальные данные представляют интерес для разработки биотехнологических способов получения практически значимых соединений - сульфоксидсодержащих интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, а также биокатализаторов процессов селективного извлечения сероорганических примесей из различных фракций нефти. Полученная информация о наиболее активных бактериальных биотрансформаторах тиоанизола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в каналах сети Интернет (www.iegm.ru/iegmcol).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Свободные клетки родококков катализируют селективное окисление тиоанизола с образованием целевого (/?)- или (5)-сульфоксида в соокислительных условиях. Сульфидокисляющие свойства родококков не являются видовой характеристикой, а определяются специфичностью штаммов и условиями их культивирования.

2. Родококки наиболее активно трансформируют тиоанизол в присутствии «-гексадекана (0,1 об.%) при щелочных значениях рН (8,0) и оптимуме температуры 28°С.

3. Иммобилизация родококков в матрицу ПВС-криогеля повышает сульфидокисляющую активность бактериальных клеток при использовании тиоанизола и его гомологов и одновременно сокращает продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола по сравнению со свободными клетками в 4 раза.

4. Разработанный на основе иммобилизованных клеток родококков биокатализатор характеризуется высокой сульфидокисляющей активностью, возможностью эффективного использования для получения оптически активных (5)-арилалкилсульфоксидов на протяжении четырех последовательных циклов и высокой устойчивостью при хранении в течение 12 месяцев при пониженной температуре +4°С.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал", Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008; VI и VII Международных конференциях "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2008 и 2010; V Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2009; II Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2009", Пермь, 2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009; III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2010", Н. Новгород, 2010.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах "Прикладная биохимия и микробиология" и "Вестник Пермского университета".

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 128 наименований работ, в том числе 46 отечественных и 82 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека" (номер госрегистрации 01.9.70 005279), Работа поддержана грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Биологическое разнообразие" (№ 09-П-4-1034, номер госрегистрации 01200963679), Президента РФ "Ведущие научные школы" (№ НШ-64403.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (№ 1004-96032), а также Стипендией Пермского края для молодых ученых.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рабочая коллекция бактериальных культур составила 146 штаммов родококков, принадлежащих к видам R. erythropolis (43), "R. longus" (7), R.fascians (20), R. opacus (15), R. rhodochrous (14) и R. ruber (47), поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур #768, www.iegm.ru/iegmcol).

Условия культивирования. Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 100 мл минеральной среды. Культивирование проводили на орбитальной качалке Сейота! 1Б ("БаЛопиз", Германия) (160 об/мин). В опытах по биотрансформации тиоанизола использовали минеральную среду следующего состава г/л: КЖ)3 - 1,0; К2НР04 - 1,0; КН2Р04 - 1,0; ЫаС1 - 1,0; 1^04-7Н20 - 0,2; СаС12-2Н20 - 0,02; РеС13 - 0,001 (Каталог штаммов..., 1994). В среду добавляли 0,1% дрожжевого экстракта ("Микроген", Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). В качестве источника углерода и энергии использовали глюкозу (0,1 и 1,0 %), или ацетат аммония (0,1 и 1,0 %), или н-гексадекан, н-декан, н-нонан, н-ундекан или н-додекан (0,1 и 1,0 об.%). Кроме того, использовали глицеринсодержащую среду, которая включала г/л: (Шд^Од - 2,0; К2НР04 - 2,0; СаС12-2Н20 - 0,01; Ре804-7Н20 -0,01; MgS04•7H20 - 0,1; глицерин - 1,0 или 10,0; дрожжевой экстракт - 4,0 (Бо]о ею1., 1997). Тиоанизол (0,5, 1,0, 1,5 г/л) в культуральную среду добавляли в виде раствора в изопропаноле (1:10 у/у). В качестве посевного материала использовали клетки родококков, выращенные на МПА и отобранные в экспоненциальной фазе роста, при этом начальная концентрация составляла 5,0±0,7х10б клеток/мл. Продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола составляла от 1 до 5 сут.

Для индукции сульфидокисляющей активности родококков бактериальные клетки предварительно выращивали в глицерин- или гексадекансодержащей среде с добавлением 0,02 г/л тиоанизола. Через 2 сут культивирования клеточную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Осажденную биомассу трижды промывали 50 мМ Иа-фосфатным буфером (рН 7,0), ресуспендировали в физиологическом растворе и использовали в качестве инокулята в экспериментах по биотрансформации тиоанизола.

Зависимость сульфидтрансформирующей активности штаммов родококков от температуры изучали при 18, 28, и 37°С; кислотности среды -в диапазоне значений pH от 6,0 до 9,0; аэрации - на орбитальной качалке 120, 160 и 200 об/мин. При оценке влияния физиологического состояния клеток родококков на их сульфидокисляющую активность тиоанизол вносили в среду в концентрации 0,5 г/л одновременно синокулумом и в моменты времени, соответствующие стадиям роста культур: лаг-фазе (3 ч), экспоненциальной (24 ч), ранней стационарной (48 ч) и поздней стационарной (72 ч). Пробы отбирали каждые 24 ч в течение 120 ч культивирования родококков после добавления тиоанизола.

Цитоморфологические исследования проводили с помощью системы визуализации микроскопического изображения, включающей световой микроскоп Axiostar plus ("Carl Zeiss", Германия), персональный компьютер, цветную цифровую систему ввода изображения PRO-150ES ("Pixera", США).

Условия иммобилизации и определение дыхательной активности клеток родококков. В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС). В работе применяли ПВС производства ПО "Азот", Невинномысск, Россия. Для иммобилизации использовали клеточные суспензии R. rhodochrous ИЭГМ 66, полученные в глицерин- или гексадекансодержащей среде. Остаточное содержание глицерина или н-гексадекана составляло 0,1 об. %. Иммобилизацию родококков, выращенных в гексадекансодержащей среде, осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС согласно методике, описанной в работе (Kuyukina et al., 2006). Для иммобилизации родококков, выращенных в глицеринсодержащей среде, 2 сут культуру предварительно трижды промывали 50 мМ Na-фосфатным буфером (pH 7,0) и ресуспендировали в физиологическом растворе. Клеточную суспензию и раствор ПВС смешивали в соотношении 1:2 v/v. Последующие этапы гранулирования, замораживания и оттаивания осуществляли согласно

указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и добавляли из расчета 200 гранул (5,0±0,6х10б клеток/мл) на 100 мл среды.

Дыхательную активность свободных и иммобилизованных в гелевом носителе клеток родококков оценивали с помощью респирометра Columbus ("Micro-Oxymax", США).

Исследование продуктов биотрансформации. Продукты биотрансформации тиоанизола экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенные этилацетатные вытяжки обезвоживали над Na2S04. Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя ("Heidolph", Германия). Качественный состав продуктов биотрансформации контролировали методом ТСХ на пластинах с флуоресцентной добавкой ("Sigma-Aldrich", США), фиксируя наличие продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными соединениями, в качестве которых использовали тиоанизол ("Sigma-Aldrich", США) и его гомологи - фенилэтил- ("Alfa Aesar", США), и-толилметил- ("Alfa Aesar", США), бензилметилсульфид ("Acras", Бельгия). Образцы продуктов окисления тиоанизола и его гомологов - соответствующие сульфоксиды и сульфоны синтезировали с помощью метода химического окисления, используя перекись водорода в качестве окислителя.

Анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа 6890N, Agilent, США с кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и квадрупольным масс-спектрометром MSD 5973N в качестве детектора.

Продукты биоконверсии арилалкилсульфидов выделяли с использованием методов препаративной тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинах ("Sigma-Aldrich", США) или колоночной хроматографии на силикагеле ("Merck", Германия) при соотношении вещества и сорбента » 1 : 12. В качестве элюента использовали смесь гексана с градиентом 5-40% этилацетата. Оптическое вращение [aD] образцов

арилалкилсульфоксидов в хлороформе, ацетоне или этаноле измеряли на поляриметре модели 341 ("Perkin-Elmer", США) при длине волны 589 нм на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc., 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью /-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование сульфидокисляющей активности родококков.

По нашим данным, исследуемые культуры родококков не используют тиоанизол (0,5 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии, о чем свидетельствует сохранение на постоянном уровне величины оптической плотности культуральной жидкости и содержания тиоанизола на протяжении 5 сут. Попытки индуцировать оксигеназный ферментный комплекс родококков в результате предварительного культивирования бактериальных клеток в присутствии 0,02 г/л тиоанизола не привели к положительному результату.

При подборе условий повышения биодоступности тиоанизола было установлено, что сульфидокисляющая активность исследуемых штаммов родококков индуцируется в присутствии дополнительных ростовых субстратов (ацетат аммония, глицерин, н-гексадекан, глюкоза). Скрининг сульфидокисляющей активности интактных клеток родококков осуществляли в соокислительных условиях с глицерином, при этом тиоанизол вносили через 2 сут роста бактериальной культуры. Установлено, что из исследованных культур родококков 48 штаммов в присутствии глицерина осуществляют полную биоконверсию тиоанизола с выходом от 36 до 100% соответствующего сульфоксида (рис. 1).

о о

СП

го с-

43 го

Рис. 1. Дендрограмма распределения штаммов ШюйососсиБ врр. по кластерам в зависимости от их сульфидокисляющей активности.

В процессе исследований не выявлено зависимости сульфидокисляющей активности родококков от их видоспецифичности. Как видно из представленной дендрограммы (рис. 1), среди исследованных культур наиболее часто сульфидокисляющая активность регистрируется при анализе представителей видов Л. гкоЛоскгоия и Я. ораст (в сумме составляющие 74% кластера I). При этом исследованные штаммы родококков катализируют образование (К)- или (5)-сульфоксида тиоанизола (рис. 2).

о.

У

сн3

[О]

S [О]

си3

V СНз

(Л)-Сульфоксид тиоанизола

Тиоанизол (5)-Сул ьфоксид тиоанизола

СН3

Рис. 2. родококками.

Сульфон тиоанизола Окислительная биотрансформация тиоанизола

В табл. 1 представлены данные об оптической чистоте сульфоксида тиоанизола, образующегося в процессе биотрансформации соответствующего сульфида наиболее активными представителями родококков. По данным поляриметрии, высокой степенью стереоселективности в отношении тиоанизола характеризуются штаммы Я. гко<1осНго№ ИЭГМ 66 и Я. ораст ИЭГМ 60.

Таблица 1

Биотрансформация тиоанизола клетками родококков в присутствии глицерина

Содержание, %

Конфигура-

Штамм сульфоксида сульфона Md ция сульфоксида, р*

R. erythropolis ИЭГМ 682 100,0 - +5,6° (R), 3,8%

R. opacus ИЭГМ 60 85,8 14,2 -98,6° OS), 73,2%

R. ruber ИЭГМ 94 89,4 10,6 +17,5° (R), 12,0%

R. ruber ИЭГМ 381 76,5 23,5 +2,1° (R), 1,4%

R. rhodochrous ИЭГМ 66 87,0 13,0 -118,9° OS), 81,4%

Примечание. * р~ Оптическая чистота.

В дальнейших экспериментах использовали штамм Л. гЬодоскгот ИЭГМ 66, выбор которого был обусловлен наилучшим соотношением между

химическим выходом (более 85,0 %) и оптической чистотой (81,4 %) сульфоксида тиоанизола (см. табл. 1), которые достигаются в течение 5 сут в глицеринсодержащей среде после добавления тиоанизола (0,5 г/л) через 2 сут после начала инкубации родококков.

Таблица 2

Биотрансформация тиоанизола клетками /?. г/юс/ос/г го ия ИЭГМ 66

Субстрат Концентрация, % Содержание в сумме продуктов реакции, %

Тиоанизол Сульфоксид Сульфон

Биотический контроль 100,0 - -

Глицерин 1,0 0,1 — 87,3 84,2 12.7 15.8

Ацетат аммония 1,0 0,1 100,0 100,0 — —

н-Гексадекан 1,0 0,1 41,2 56,7 93,6* 2,1 6,4

Глюкоза 1,0 0,1 30,0 43,7 40,2 38,7 29,8 17,6

«-Додекан 1,0 0,1 62,7 55,3** 25,8 32,1 11.5 12.6

н-Ундекан 1,0 0,1 44,9 32,1** 30,9 40,2 24,2 29,7

н-Декан 1,0 0,1 78,2 54,6** 12,6 32,1 9,2 13,3

н-Нонан 1,0 0,1 50,7 42,9** 37,2 39,8 12,1 17,3

*Показатели статистически достоверно отличаются от результатов остальных вариантов опыта, р<0,05. **Данные достоверно отличаются от результатов, полученных при использовании 1% концентрации питательного субстрата, /><0,05.

Влияние условий культивирования на сульфидокисляющую активность Я. гИойвсИгоия ИЭГМ 66. При исследовании влияния природы и концентрации ростового субстрата на эффективность процесса биоконверсии тиоанизола при внесении сульфида через 2 сут роста бактериальных клеток выявлено, что наиболее высокий уровень

сульфидокисляющей активности родококков регистрируется в присутствии глицерина и н-гексадекана (табл. 2).

Следует отметить, что в случае использования в качестве ростовых субстратов н-алканов, наблюдается тенденция обратной зависимости сульфидокисляющей активности родококков от концентрации питательного субстрата. При этом наиболее выраженный характер данной зависимости проявляется при снижении содержания в среде культивирования н-гексадекана.

Как видно из рис. 3, снижение уровня концентрации н-гексадекана приводит к 20 % увеличению сульфидокисляющей активности. Полная конверсия тиоанизола в соответствующий сульфоксид достигается в присутствии 0,1 об. % н-гексадекана на 5 сут инкубации родококков после добавления сульфида. Регистрируемый при этом уровень дыхательной активности бактериальных клеток обратно пропорционален концентрации н-гексадекана в среде культивирования (рис. 4).

Тиоанизол, %

III Ш 100 TXLL

7 суг

Рис. 3. Биотрансформация тиоанизола (0,5 г/л) свободными клетками родококков в присутствии «-гексадекана в концентрации

(об.%): 1-0,1; II-0,5; III-1,0. Тиоанизол вносили через 2 сут роста бактериальных клеток. *Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта,

р<0,01.

Рис. 4. Респираторная активность свободных клеток родококков при окислении тиоанизола (0,5 г/л) в присутствии и-гексадекана в концентрации (об. %): I -ОД; II - 0,5; III - 1,0. IV - Биотический контроль. V - Абиотический контроль. Стрелкой указано время внесения тиоанизола.

Изучение влияния рН среды на эффективность процесса окисления тиоанизола родококками свидетельствует о том, что полная конверсия сульфидного субстрата протекает в условиях соокисления с н-гексадеканом при щелочной реакции среды (рН 8,0) в течение 4 сут при условии внесения тиоанизола через 2 сут (рис. 5).

6 6,5 7 7,5 8 8,5

рН

■ н-гексадекан □ глицерин

Рис. 5. Влияние уровня рН среды на степень окисления тиоанизола (0,5 г/л) клетками Д. гкойоскгоиь ИЭГМ 66 в присутствии: ■ «-гексадекана, ■ глицерина.

Приведены данные после 4 сут культивирования родококков в присутствии тиоанизола. * Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, р< 0,05.

При исследовании каталитической активности интактных клеток родококков при повышении концентрации тиоанизола в 2-3 раза установлено, что тиоанизол в концентрации 1,0 или 1,5 г/л ингибирует трансформирующую активность родококков при выращивании их в глицеринсодержащей среде. По данным ТСХ и хромато-масс-спектрометрии, на 7 сут культивирования в такой среде регистрируется лишь тиоанизол.

Ог, мкл

Рис. 6. Респираторная активность свободных клеток Я. г/гос1ос/ггоиэ ИЭГМ 66 в присутствии глицерина и тиоанизола, используемого в концентрации (г/л): I - 0,5, II - 1,0, III - 1,5. IV - Биотический контроль. V - Абиотический контроль. Стрелкой указано время внесения тиоанизола.

Ингибирование биотрансформационного процесса высокими концентрациями сульфида сопровождается угнетением респираторной активности родококков (рис. 6) и формированием клеточных агрегатов (рис. 7).

Рис. 7. Клетки Л. гко<1ос11гои$ ИЭГМ 66 в глициринсодержащей среде с добавлением 0,5 (А), 1,0 (Б) или 1,5 (В) г/л тиоанизола (фазово-контрастная микроскопия, хЮОО).

Так, если при добавлении 0,5 г/л тиоанизола распределение клеток в среде остается однородным на протяжении всего инкубационного периода, то использование более высоких концентраций (1,0; 1,5 г/л) тиоанизола

приводит к появлению в жидкой среде неоформленных агрегатов или агрегированных хлопьев (рис. 7).

В присутствии н-гексадекана реакция бактериальных клеток на введение тиоанизола в высоких концентрациях проявляется в снижении биотрансформирующей и респираторной активности родококков. Как видно из табл. 3, при внесении 1,0 и 1,5 г/л тиоанизола уровень биоконверсии сульфида через 4 сут составляет 18-25 %, и даже при увеличении продолжительности инкубации до 12 сут конверсия тиоанизола не превышает 50 %.

Таблица 3

Биоконверсия тиоанизола свободными клетками Д. гкойоскгою ИЭГМ 66 в присутствии н-гексадекана

Тиоанизол, г/л Степень биоконверсии тиоанизола, %

4 сут 8 сут 12 сут

0,5 100,0* -

1,0 24,7 35,4 49,8

1,5 18,6 24,2 37,3

*Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, р<§,05.

Иммобилизация клеток родококков в криогеле на основе ПВС. Для

оптимизации процесса биоконверсии тиоанизола использовали прием иммобилизации клеток родококков в криогеле на основе ПВС. Необходимо отметить, что применение для иммобилизации клеток, предварительно выращенных в глицеринсодержащей среде, приводит к потере сульфидокисляющей активности родококков. Данный факт не находит объяснения, тогда как, по данным хромато-масс-спектрометрии, полная биоконверсия тиоанизола (0,5 г/л) в целевой сульфоксид достигается при использовании иммобилизованных бактериальных клеток, предварительно выращенных в присутствии н-гексадекана.

При использовании полученного биокатализатора уже через 1 сут регистрируется образование в минеральной среде целевого сульфоксида исульфона тиоанизола в соотношении 3:1. Как видно из рис. 8А, в течение 1 сут параллельно с процессом окисления тиоанизола в целевой сульфоксид тиоанизола протекает активное окисление образующегося сульфоксида в сульфон. Почасовая динамика процесса окисления тиоанизола свидетельствует о том, что накопление сульфона протекает параллельно с образованием сульфоксида. При этом максимальная степень биоконверсии тиоанизола в сульфон достигается через 4 сут после начала эксперимента.

%

100 80 60 40 20 0

%

100 80 1 60 40 20 0

п

а

I

4 суг

4суг

100

60 -40

20

4суг

4суг

■ I, в - II, □ - III

Рис. 8. Биотрансформация тиоанизола (А, Б - 0,5 г/л, В - 1,0 г/л, Г - 1,5 г/л) иммобилизованными клетками Я. гкойоЫггоиэ ИЭГМ 66 в присутствии н-гексадекана (А) и глицерина (Б-Г): I - тиоанизол, II - сульфоксид тиоанизола, III - сульфон тиоанизола.

Характер каталитической активности иммобилизованных клеток родококков меняется в условиях использования глицеринсодержащей среды. При этом направленное окисление сульфида (0,5 г/л) в сульфоксид происходит через 1 сут, уровень образования побочного продукта окисления составляет не более 7% (рис. 8Б).

В глицеринсодержащей среде иммобилизованные клетки Я. гЬойоскгож ИЭГМ 66 эффективно трансформируют тиоанизол в концентрации 1,0 и 1,5 г/л. При добавлении 1,0 г/л тиоанизола через 1 сут в среде культивирования регистрируется смесь целевого сульфоксида и остаточного тиоанизола в соотношении 4:1, на 2 сут в качестве продуктов реакции - лишь целевой сульфоксид и побочный сульфон тиоанизола. На момент полного исчезновения тиоанизола концентрация сульфона не превышает 8% (рис. 8В).

При увеличении концентрации тиоанизола до 1,5 г/л полная биоконверсия сульфида достигается через 3 сут. При использовании данной концентрации сульфида среди продуктов реакции соответствующий сульфон не обнаруживается (рис. 8Г).

Оценка влияния срока хранения на функциональную активность биокатализатора и возможности его повторного использования. В результате исследования сохранения сульфидокисляющей активности иммобилизованных клеток родококков в зависимости от продолжительности консервации гранул биокатализатора при пониженной температуре (4°С) установлено, что иммобилизованные в ПВС-криогеле клетки родококков сохраняют стабильную биокаталитическую активность в отношении сульфида после 12 мес хранения (табл. 4). Более длительная (24 мес) консервация приводит к увеличению продолжительности процесса трансформации тиоанизола в соответствующий сульфоксид. При этом в сумме продуктов реакции регистрируется более 10% сульфона тиоанизола.

Таблица 4

Влияние продолжительности консервации на биокаталитическую активность клеток Я. гИойоскгоих ИЭГМ 66, включенных в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта

Продолжительность консервации, месяцы Время достижения полной конверсии тиоанизола*, сутки (5)-Сульфоксид, % Сульфон, % Р,%

- 3 100,0 - 82,1

12 3 100,0 - 81,9

24 4 89,1 10,9 82,6

Примечание. *Содержание тиоанизола 1,5 г/л.

По нашим данным, биокатализатор на основе иммобилизованных клеток родококков может быть использован многократно. Установлено, что биоконверсия тиоанизола наиболее эффективно протекает в течение первых 4-х циклов (рис. 9). Последующая эксплуатация закрепленных в матрице ПВС-криогеля клеток родококков не целесообразна ввиду резкого снижения окислительной активности биокатализатора на 5 цикле замены сульфидного субстрата. Полная инактивация биокатализатора регистрируется после 7 циклов его применения.

Цикл

Рис. 9. Сульфидокисляющая активность биокатализатора на основе иммобилизованных клеток Я. гкойосЪгот ИЭГМ 66 при его многократном использовании в процессе биотрансформации тиоанизола.

Исследование эффективности биокатализатора в отношении гомологов тиоанизола. По нашим данным, разработанный биокатализатор на основе иммобилизованных в ПВС-криогеле родококков проявляет высокую эффективность в отношении гомологов тиоанизола - фенилэтил-, я-толилметил- и бензилметилсульфидов. При этом химический выход и птическая чистота образующихся арилалкилсульфоксидов достигает 68-75% и 48-85% соответственно (табл. 5). Следует отметить, что использование биокатализатора, полученного на основе иммобилизованных клеток Л. гкойоскгот ИЭГМ 66, обеспечивает направленное образование арилалкилсульфоксидов с (^-конфигурацией асимметрического центра.

Таблица 5

Энантиоселективное окисление арилалкилсульфидов (Я'-З-Я2) с использованием биокатализатора на основе иммобилизованных клеток Я. гЬойосИгоиь ИЭГМ 66

Я1 я2 Выход, % Р, % Конфигурация сульфоксида Выход сульфона, %

С6н5 СНз 100,0 82,1 (5) -

с6н5 С2н5 73,0 54,7 (5) 17,0

и-СН3СбН4 СНз 68,0 48,3 (5) 9,0

СбН5СН2 СНз 75,0 84,6 (5) 21,0

Таким образом, при исследовании сульфидокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток Я. гкоЛоскгоия ИЭГМ 66 установлено, что максимальную окислительную активность в отношении прохирального органического сульфида тиоанизола (0,5 г/л) свободные клетки родококков проявляют в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана при добавлении сульфида через 2 сут роста бактериальных клеток. Использование более высоких концентраций сульфида приводит к подавлению сульфидокисляющей активности родококков. Применение иммобилизованных бактериальных клеток исключает двухдневную стадию подготовки биокатализатора и позволяет достичь полной биоконверсии

тиоанизола в течение 24 ч при одновременном введении биокатализатора и 0,5 г/л тиоанизола. Иммобилизованные в гелевом носителе клетки родококков обеспечивают конверсию тиоанизола и его гомологов в соответствующие (5)-сульфоксиды при использовании более высоких концентраций сульфидных субстратов (1,5 г/л) по сравнению с планктонными клетками. Разработанный биокатализатор перспективен для биотехнологического получения оптически активных органических сульфоксидов - ключевых интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, для процесса селективной десульфуризации нефти и, возможно, утилизации запасов различных токсических серосодержащих соединений.

25 Выводы

1. Установлено, что родококки видов Л. ораси.ч и К г1юс1осЬгот обладают выраженной способностью к окислению тиоанизола, которая проявляется в присутствии дополнительных ростовых субстратов. Наиболее высокий выход целевого (5)-сульфоксида тиоанизола достигается в присутствии н-гексадекана или глицерина.

2. Показано, что на эффективность процесса окисления тиоанизола родококками существенное влияние оказывают уровень рН среды и концентрация дополнительного ростового субстрата. Наиболее активно свободные клетки родококков трансформируют тиоанизол (0,5 г/л) в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана в течение 6 сут культивирования.

3. Обосновано, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные в криогеле на основе поливинилового спирта, характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола, На основе иммобилизованных клеток Я. г1юс1ос11гош ИЭГМ 66 разработан эффективный биокатализатор, при использовании которого достигается полное окисление тиоанизола (1,5 г/л) в целевой (5)-сульфоксид в течение 3 сут.

4. Разработанный биокатализатор проявляет высокую сульфидокисляющую активность в отношении гомологов тиоанизола -фенилэтил-, н-толилметил- и бензилметилсульфидов, характеризуется функциональной стабильностью в течение 12 месяцев хранения и возможностью его повторного эффективного использования на протяжении 4 циклов биотрансформации исследованных сульфидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Елькин A.A., Гришко В.В., Лозинский В.И., Ившина И.Б. Биотрансформация арилалкилсульфидов с использованием целых клеток родококков//Материалы III Международной конференции "Микробное разхнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал". - Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008. - С. 147.

2. Гришко В.В., Елькин A.A. Биотрансформация тиоанизола клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66, иммобилизованными в криогеле поливинилового спирта: материалы//Материалы VI Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии". - Минск, 2008. - Т. 2. - С. 234-236.

3. Елькин A.A., Гришко В.В., Ившина И.Б. Оптимизация процесса получения сульфоксида тиоанизола с использованием клеток алканотрофных родококков//Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2009". - Пермь, 2009.-С. 21-25.

4. Елькин A.A., Гришко В.В., Ившина И.Б. Окислительная биотрансформация тиоанизола актинобактериями рода RhodococcusllМатериалы V Молодежной школы-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии". - Москва, 2009. - С. 107-108.

5. Елькин A.A., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б. Биокаталитический синтез оптически активных арилалкилсульфидов//Материалы III Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия 2010". - Н. Новгород, 2010. -С. 53-54.

6. Елькин A.A., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б. Биотрансформация арилалкильных сульфидов целыми клетками Rhodococcus

rhodochrous ИЭГМ 66//Вестник Пермского университета. Серия Биология. -2010.-Вып. 1 (1).-С. 27-31.

7. Елышн A.A., Кылосова Т.П., Гришко В.В., Ившина И.Б. Энантиоселективное окисление тиоанизола иммобилизованными клетками родококков//Материалы VII Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии". -Минск, 2010. - С. 285-287.

8. Елышн A.A., Гришко В.В., Ившина И.Б. Окислительная биотрансформация тиоанизола клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66//Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46. № 6. -С. 637-643.

ЕЛЬКИН Андрей Анатольевич

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ТИОАНИЗОЛА СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ

Автореферат

Подписано в печать 18.01.2011. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1. Формат 60x90/16. Набор компьютерный. Заказ № 79/2011.

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елькин, Андрей Анатольевич

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Селективное окисление органических сульфидов в оптически 12 активные сульфоксиды

1.1. Характеристика органических сульфидов: структура, 12 химические свойства, биологическая активность

1.2. Оптически активные органические сульфоксиды: структура, 14 химические свойства, регио- и стереоселективность реакций синтеза, биологическая активность

1.3. Биологическое окисление органических сульфидов в хиральные 19 сульфоксиды как альтернатива химическим методам синтеза оптически активных сульфоксидов

1.4. Иммобилизация как возможный путь оптимизации процесса 34 окислительной биотрансформации сульфидов в оптически активные сульфоксиды

1.5. Перспективы использования актинобактерий рода ЯЬоойососст 50 для направленной биоконверсии органических сульфидов ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Рабочая коллекция, условия культивирования родококков

2.2. Условия культивирования

2.3. Контрольные эксперименты

2.4. Условия иммобилизации и определение дыхательной активности 63 клеток родококков

2.5. Качественный и количественный анализ продуктов 64 биотрансформации органических сульфоксидов

2.6. Исследование продуктов биотрансформации

2.7. Химический синтез продуктов окисления арилалкилсульфидов

2.8. Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. Исследование сульфоксидирующей активности коллекцион- 68 ных культур родококков (на примере тиоанизола), поиск активных биотрансформаторов арилалкильных сульфидов

Глава 4. Разработка оптимальных условий и получение эффективного 76 биокатализатора процесса окисления органических сульфидов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков"

Актуальность проблемы. Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) органические сульфоксиды* находят широкое применение в химической и фармацевтической! практике. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра; способного с высокой степенью стереоселективности определять направление химических реакций. В современной медицине используются антибактериальные, противоязвенные, противовоспалительные и анальгетические препараты на основе сульфоксидсодержащих соединений. С учётом различия в скорости метаболизма (S)- и (Я)-энантиомерных сульфоксидов антисекреторных средств (пантопразола, рабепразола, лансопразола, омепразола, тенатопразола и др.) разработаны современные эффективные лекарственные препараты на основе индивидуальных энантиомеров (Захарова, 2008; Cotton et al., 2000; Andersson et al., 2001).

Получение оптически активных сульфоксидов осуществляется в основном методами химического синтеза. Однако при. получении энантиомерно чистых сульфоксидов химическим путем не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций (Толстиков и др., 2003). Альтернативой многостадийному химическому синтезу оптически активных соединений выступают биологические технологии, позволяющие существенно повысить уровень регио- и стереоселективности реакций (Careno, 1995; Solladie et al., 1995; Holand et al., 2002, 2003). В качестве биокатализаторов процесса окисления прохиральных сульфидов используются ферментные препараты (оксигеназы, пероксидазы) и целые микробные клетки. Однако промышленное использование чистых ферментов, несмотря на их высокую регио- и стереоселективность, ограничивается из-за проблем, связанных с очисткой, препаративным выделением и сохранением стабильности индивидуальных ферментов. Кроме того, спектр веществ, которые могут превращаться интактными микробными клетками,, намного, шире. Специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем, отсутствие проблемы с добавкой, оксиданта и регенерацией кофермента, устойчивая активность в экстремальных условиях внешней^ среды обусловливают технологическую перспективность использования целых клеток микроорганизмов в процессах асимметрического окисления сульфидов.

В настоящее время в реакциях окислительной биотрансформации многих органических соединений — алифатических и ароматических углеводородов, изопреноидов, стеринов, стероидов и их структурных аналогов всё чаще используются актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой активностью оксигеназных ферментных комплексов (Larkin, Kulakov, Allen, 2006; Martinkova et al., 2009). Родококки успешно применяются в качестве биокатализаторов процесса десульфуризации серосодержащих компонентов нефти, начальным этапом которого является образование сульфоксидов. Недавно показана технологическая перспективность использования цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ родококков в реакциях селективного биокаталитического синтеза арилалкилсульфоксидов (Liu et al., 2006; Jackson et al., 2007; Zhang et al., 2010). Вместе с тем, известны лишь единичные примеры использования представителей R. equi и R. erythropolis в реакциях окисления прохиральных сульфидов в оптически активные сульфоксиды. Низкая эффективность таких реакций обусловлена высокой концентрацией используемых субстратов и патогенностью культур R. equi (Ohta et al., 1984, 1985), либо низкой концентрацией трансформируемых сульфидов при высокой нагрузке биокатализатора (Holand et al.2003). В связи с этим поиск новых культур родококков, катализирующих целевые реакции биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды (рис. 1) является весьма актуальным.

Рис. 1. Окислительная биотрансформация арилалкилсульфидов на примере тиоанизола).

Цель настоящей работы — исследование возможностей использования актинобактерий рода Ююскэсоссш для эффективной окислительной биотрансформации прохирального фенилметилсульфида (тиоанизола).

Основные задачи исследования

1. Исследовать окисляющую активность коллекционных штаммов родококков разных видов в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола.

2. Выявить оптимальные условия для окислительной биоконверсии тиоанизола с использованием свободных клеток родококков.

3. Провести сравнительное исследование каталитической активности свободных и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков при биотрансформации тиоанизола.

-Сульфоксид тиоанизола

Тиоанизол (£)-Сульфоксид тиоанизола

Сульфон тиоанизола

4. На основе иммобилизованных клеток родококков разработать эффективный биокатализатор для окисления; тиоанизола и его гомологов в оптически активные арилалкилсульфоксиды.

Научная новизна: Проведен сравнительный? анализ биокаталитической активности« коллекционных культур» актинобактерий рода! Шос1ососсш в отношении арилалкильного сульфида; тиоанизола. Выявлено, что родококки разных видов.катализируют образование как (#)->• так; и (5)-сульфоксида тиоанизола. Показано, что сульфид окисляющая активность г родококков: не является видоспецифичной и реализуется в присутствии дополнительных источников углерода. Наиболее эффективными ростовыми субстратами в процессе* окислительной биотрансформации тиоанизола являются; глицерин и н-гексадекан. Обнаружена обратная^ зависимость сульфидокисляющей активности родококков от концентрации ; н-гексадекана в среде их.культивирования. Определены оптимальные условия направленного окисления тиоанизола в оптически; активный; (5)-сульфоксид с использованием иммобилизованных в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС-криогеля) клеток родококков; Экспериментально подтверждено, что иммобилизованные клетки родококков характеризуются« высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о возможности использования бактерий для регио- и стереоселективной биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды. В результате проведенных исследований выявлены штаммы Якойососст Брр., активно катализирующие направленное образование энантиомерно обогащенных сульфоксидов. На. основе иммобилизованных в ПВС-криогеле клеток родококков разработан эффективный биокатализатор с высокой сульфидокисляющей активностью, обладающий длительной сохранностью функциональной стабильности и возможностью многократного использования для биотрансформации тиоанизола. Полученные экспериментальные-данные представляют интерес для разработки^ биотехнологических способов получения практически значимых соединений — сульфоксидсодержащих интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, а также биокатализаторов процессов селективного извлечения сероорганических примесей из различных фракций нефти. Полученная информация о наиболее активных бактериальных биотрансформаторах тиоанизола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в каналах сети Интернет (www.iegm.ru/iegmcol).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Свободные клетки родококков катализируют селективное окисление тиоанизола с образованием целевого {Д)- или (5)-сульфоксида в соокислительных условиях. Сульфидокисляющие свойства родококков не являются видовой характеристикой, а определяются специфичностью штаммов и условиями их культивирования.

2. Родококки наиболее активно трансформируют тиоанизол в присутствии м-гексадекана (0,1 об.%) при щелочных значениях рН (8,0) и оптимуме температуры 28°С.

3. Иммобилизация родококков в матрицу ПВС-криогеля повышает сульфидокисляющую активность бактериальных клеток при использовании тиоанизола и его гомологов и одновременно сокращает продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола по сравнению со свободными клетками в 4 раза.

4. Разработанный на основе иммобилизованных клеток родококков биокатализатор: характеризуется высокой;; сульфидокисляющей активностью, возможностью эффективного использования для получения;, оптически? активных (б^-арилалкилсульфоксидов на протяжении четырех последовательных циклов? и высоко® устойчивостью при хранении в течение 12 месяцев при пониженной температуре +4°С.

Апробация работы« и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены; на III Международной« конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический- потенциал", Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008; VI и VII Международных конференциях "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2008 и 2010; • «

V Всероссийской молодежной; школе-конференции с:, международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва;, 2009; II Всероссийском конгрессе с, международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2009", Пермь, 2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Казань, 2009; III;Всероссийском, конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2010", Н; Новгород, 2010.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах, "Прикладная биохимия и микробиология" и "Вестник Пермского университета".

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержат 11 таблиц и 24 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов; и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 128

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Елькин, Андрей Анатольевич

Выводы

1. Установлено, что родококки видов К орасш и Я. гкосЬскгош обладают выраженной способностью к окислению тиоанизола, которая проявляется в присутствии дополнительных ростовых субстратов. Наиболее высокий выход целевого (5)-сульфоксида тиоанизола достигается в присутствии н-гексадекана или глицерина.

2. Показано, что на эффективность процесса окисления тиоанизола родококками существенное влияние оказывают уровень рН среды и концентрация дополнительного ростового субстрата. Наиболее активно свободные клетки родококков трансформируют тиоанизол (0,5 г/л) в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана в течение 6 сут культивирования.

3. Обосновано, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные в криогеле на основе поливинилового спирта, характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола, на основе иммобилизованных клеток Я. гЬсхЛоскгош ИЭГМ 66 разработан эффективный биокатализатор, при использовании которого достигается полное окисление тиоанизола (1,5 г/л) в целевой (5)-сульфоксид в течение 3 сут.

4. Разработанный биокатализатор проявляет высокую сульфидокисляющую активность в отношении гомологов тиоанизола — фенилэтил-, и-толилметил- и бензилметилсульфидов, характеризуется функциональной стабильностью в течение 12 месяцев хранения и возможностью его повторного эффективного использования на протяжении 4 циклов биотрансформации исследованных сульфидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о способности родококков к окислению, тиоанизола в условиях соокислительной трансформации. Аналогичная . закономерность в проявлении родококами сульфидокисляющей активности показана в работах зарубежных исследователей (Ohta et al., 1984, 1985; Holland et al., 2003). Наиболее высокие результаты в этом направлении достигнуты в начале 80-х гг. прошлого века японскими специалистами (Ohta et. al., 1984, 1985), которые при использовании интактных клеток штамма R. equi IFO 3730 осуществили 100%-ную биоконверсию тиоанизола (2 г/л) в соответствующий (Я)-сульфоксид в присутствии н-гексадекана. В»качестве основных недостатков описанного процесса необходимо отметить высокую (2 об.%) концентрацию используемого м-гексадекана, который как балластный компонент осложняет стадию очистки оптически активного (^)-сульфоксида, а также патогенную природу представителей R. equi. Попытка H.L. Holland с .соавт. (2003) получить целевой сульфоксид тиоанизола с использованием свободных клеток R. erythropolis IGTS ВКО-53 в присутствии глюкозы (2%) привела к образованию рацемического сульфоксида. Несмотря на выявленную авторами высокую каталитическую активность R. erythropolis IGTS ВКО-53 в отношении арилалкильных гомологов тиоанизола, применение данного штамма для биоокисления сульфидов ограничивается ввиду низкой концентрации трансформируемых сульфидных субстратов (0,5 г/л) и высокой плотности используемых бактериальных суспензий (20,0 г клеток/л).

По результатам наших исследований, биоконверсия тиоанизола (0,5 г/л) клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66 в оптически активный (^-сульфоксид тиоанизола (р 81,4%) достигается в ростовых условиях в присутствии 0,1 об.% //-гексадекана. Использование более высоких концентраций сульфида приводит к подавлению сульфидокисляющей активности родококков. Применение иммобилизованных бактериальных клеток исключает двухдневную стадию подготовки биокатализатора и позволяет достичь полной биоконверсии тиоанизола в течение 24 ч при одновременном! введении биокатализатора и 0;5 г/л тиоанизола.

Следует отметить, что публикации по применению иммобилизованных микробных клеток для, получения оптически активных сульфоксидов ограничены примерами» использования культур мицелиальных грибов. При этом продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола (не более 0,5 г/л) иммобилизованными клетками Mortierella isabellina АТСС 42613 (Holland et al., 1992) и Aspergilus terreus CCT 3320 (Porto et al., 2002) составляет 3 сут.

Разработанный нами- биокатализатор на основе целых клеток непатогенного штамма R. rhodochrous ИЭГМ 66, иммобилизованных в ПВС-криогель, позволяет проводить направленное окисление тиоанизола и его гомологов (фенилэтил-, и-толилметил- и бензилметилсульфидов) в более высокой (до 1,5 г/л) концентрации по сравнению с планктонными клетками. При этом химический выход и оптическая чистота образующихся (5)-арилалкилсульфоксидов достигают 75% и 85% соответственно. Клетки родококков, иммобилизованные в ПВС-криогеле, характеризуются высокой функциональной стабильностью в течение 12 месяцев хранения и возможностью повторного эффективного использования биокатализатора на протяжении 4 циклов биотрансформации исследованных сульфидов.

Разработанный биокатализатор перспективен для биотехнологического получения оптически активных органических сульфоксидов — ключевых интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, для процесса селективной десульфуризации нефти и, возможно, утилизации запасов различных токсических серосодержащих соединений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елькин, Андрей Анатольевич, Пермь

1. Абелян В.А. Новый метод иммобилизации клеток микроорганизмов поперечной сшивкой // Прикл. биохим. и микробиол. — 2000. Т. 36. — № 3. — С. 359-364.

2. Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулах агарового геля / В.И. Корженевич, О.В. Игнатов, А.Д. Миронов и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 1991. - Т. 27.-№3.-С. 365-368.

3. Аристархова, В.И. Нокардиоподобные микроорганизмы / Под. ред. E.H. Мишустин. М.: Наука, 1989. - 248 с.

4. Биотрансформация изопимаровой, и дегидроабиетиновой кислот с использованием бактерий1 рода Rhodococcus / B.B. Гришко, A.B. Воробьев, И.Б. Ившина и др. // Химия в интересах устойчивого развития. — 2000. № 8. - С. 693-698.

5. Гришко В.В., Ившина И.Б., Толстиков А.Г. Биотрансформация тиоанизола актинобактериями Rhodococcus sensu stricto II Биотехнология. — 2004. -№5. -С. 49-56.

6. Донова M.B. Биоконверсия стероидных соединений актинобактериями. -Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2009. 195 с.

7. Жубанова A.A., Шигаева М.Х. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Биотехнология. Теория и практика. 1997. - № 2. - С. 35-38.

8. Захарова Н.В. Лансопразол: особенности клинической фармакологии ИПП // Клин, гастроэнтерол. гепатол. 2008. - Т. 1. - № 3. - С. 205-211.

9. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, иммунодиагностика, детекция,: дис. .: д-ра. биол. наук. / И.Б. Ившина — Пермь, 1997.- 197 с.

10. Ившина И.Б., Пшеничнов P.A., Оборин A.A. Пропанокисляющие родококки. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 с.

11. Ившина И.Б. Уральская профилированная коллекция микробиологических ресурсов: разнообразие генофонда, реализация потенциала, стратегия сохранения // Наука. Общество. Человек. / Информ. вестник УрО РАН. 2004. - № 1. - С. 11-19.

12. Илялетдинов А.Н., Алиева P.M. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод иммобилизованными клетками микроорганизмов-деструкторов // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987. — С. 62-72.

13. Иммобилизация на углеродных сорбентах штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего нитрилгидратазной активностью / А.Ю. Максимов, Ю.Г. Максимова, М.В. Кузнецова и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 2007. -Т. 43. -№ 2. - С. 193-198.

14. Иммобилизация уксуснокислых бактерий на углеродных волокнах и использование их для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведева, Ю.А. Гриднева, A.A. Лысенко и др. // Биотехнология. — 2001. № 5. - С. 51-57.

15. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский и др. // М.: Изд-во МГУ, 1994. С. 288-294.

16. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Ред. И.Б. Ившина. М.: Наука, 1994. 163 с. (www.iegm.ru/iegmcol/index.html).

17. Кощеенко К. А., Суходольская Г.В. Иммобилизация клеток микроорганизмов // Сб. науч. трудов. «Иммобилизованные клетки в биотехнологии». Пущино, 1987. - С. 4-15.

18. Кукушкин Ю.Н. Химия вокруг нас. М.: Высшая школа, 1992. - 192 с.

19. Ладыгин A.B. Сорбент для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрязнений "Москат" / A.B. Ладыгин // Патент РФ. № 2143947. -2000.

20. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул // Биотехнология. 1995. — № 1-2. - С. 32-37.

21. Лозинский, В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Успехи химии. 1998. — Т. 67. — № 7. - С. 641-652.

22. Максимова Ю.Г. Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus: Автореф. дисс. . .канд. биол. наук / Ю.Г. Максимова. — Пермь, 2006. 22 с.

23. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и каринеподобные бактерии. Киев: Наук. Думка, 1985. - 336 с.

24. Оаэ С. Химия органических соединений серы. / пер с япон. — М.: «Химия», 1975.-512 с.

25. Оборин A.A., Стадник Е.В. Нефтегазопоисковая геомикробиология // отв. ред. Л.М. Зорькин. Екатеринбург: УРО РАН, 1996. - 407 с.

26. Образование водорода термофильными анаэробными бактериями Clostridium thermosaccharolyticum, иммобилизованными в криогель поливинилового спирта / O.A. Никитина, С.С. Зацепин, C.B. Калюжный и др. // Микробиология. 1993. - Т. 62. - № 3. - С. 477-489.

27. Пешкур Т.А., Ившина И.Б. Особенности аккумуляции цезия бактериальными клетками Rhodococcus ruber при росте на н—гексадекане // Экология. 2003. - № 1. - С. 69-71.

28. Практикум по микробиологии : учебн. пособие для студ. высш. учеб, заведений / А.И. Нетрусов и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издат. центр "Академия", 2005. - 608 с.

29. Препарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В.М. Кондратенко, В.П. Холоденко, И.А. Дунайцев и- др. // Патент РФ. -№2191753.-2002.

30. Прилежаева E.H. Химия сульфоксидов и сульфонов // Получение и свойства органических соединений" серы. / Под ред. Л.И. Беленького. М.: Химия, 1998.-С. 115-259.

31. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Изменение реологических характеристик гелевой матрицы в результате включения в нее клеток дрожжей / В.И. Лозинский, Е.С. Вайнерман, А.Л. Зубов и др. // Биотехнология. 1990. - № 5. - С. 32-35.

32. Романенко В. И., Кузнецов С. И. Экология микроорганизмов пресных вод. Лабораторное руководство. -М.: «Наука», 1974. — 194 с.

33. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под. ред. Н.С. Егорова. 2 изд. - М.: Моск. ун-т, 1983. - 215 с.

34. Семенов A.A. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 2000. - 664 с.

35. Сироткин A.C., Шагинурова Г.И., Ипполитов К.Г. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы Казань: Изд-во "Фэн" АН РТ, 2007. - 160 с.

36. Системы с иммобилизованными клетками для получения биогаза и этанола / М.Е. Бекер, А.П. Гринберг, Я.Э. Блумберг и др. // Сб. Науч. Труд. Пущино. 1987. - С. 73-81.

37. Стероидтрансформирующая активность диссоциативных вариантов Rhodococcus sp. / Н.Е. Войшвилло, A.M. Турута, A.B. Камерницкий и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. - Т. 27. - № 3. - С. 424-430.

38. Стоянович Ф.М. Сульфиды, // Получение и свойства органических соединений серы. / Под ред. Л.И. Беленького. М.: Химия, 1998. - С. 47-80.

39. Уждавини Э.Р. Гигиенические аспекты применения органических соединений серы в народном хозяйстве // Получение и свойства органических соединений серы / Под ред. Л.И. Беленького. М.: Химия, 1998. - С. 548-557.

40. Шеховцова Н.В., Звягинцев Д.Г., Паников Н.С. Кинетика роста Arthrobacter globiformis и Pseudomonas fluorescens на средах со стекловолокном // Микробиология. 1992. - Т. 61. - № 6. - С. 995-1004.

41. Штильман М.И. Успехи в использовании полимеров для иммобилизации клеток // Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Сб. науч. труд. — Пущино, 1987.-С. 105-111.

42. Юнусов С.Ю. Алкалоиды. Ташкент: ФАН, 1981. - 420 с.

43. N.N. Karpyshev, S.A. Fominsky et al. //J. Mol. Catal. A: Chem. 2001. - V. 171.-P. 73-80. .

44. A highly enantioselective biocatalytic sulfoxidation by the topsoil bacterium Pseudomonas frederiksbergensis / W. Adam, F. Heckel, C.R. Saha-Möller et al. //Tetrahedron: Asymmetiy. 2004. - V. 15. - P. 983-985.

45. A widely useful chiral stationary phase for the high-performance liquid chromatography separation of enantiomers / W.H. Pirkle, J.M. Finn, J.L. Schreiner et al. //J. Am. Chem. Soc. 1981. -V. 103. - P. 3964-3966.

46. Allenmark S.G., Andersson M.A. Chloroperoxidase-induced asymmetric sulfoxidation of some conformationally restricted sulfides // Chirality. 1998. - V. 3. -№. 3. - P. 246-252.

47. An efficient asymmetric oxidation of sulfides to sulfoxides / P. Pitchen, T. Dunach, N.N. Desmukh et al. //J. Am. Chem. Soc. 1984. - V. 106. - P. 81888193.

48. Angelova B., Schamauder H. Lipophilic compounds in biotechnology-interactions with cells and technological problems // J. Biotechnol. 1999. - V. 67. -P. 13-32.

49. Argoudelis A.D., Mason D.J. Production of sulfoxide and 1-demethylthio-l-hydroxylincomycin by S. lincolnensis //J. Antibiot. — 1969 V. 22. - №. 6. - P. 289-291.

50. Aspergillus terreus CCT 3320 immobilized on chrysotile or cellulose/TiC^ for sulfide oxidation / A.L.M. Porto, F. Cassiola, S.L.P. Dias et al. II J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002. - V. 19-20. - P. 327-334.

51. Asymmetric synthesis of esomeprazole / H. Cotton, T. Elebring, M. Larsson et al. II Tetrahedron Lett. 2000. - V. 11. - № 18. - P. 3819-3825.

52. Bakers' yeast oxidation of methyl para-tolylsuifide: Synthesis of a chiral intermediate in the preparation of the mevinic acid-type hypocholestemic agents /

53. J. Tang, I. Brackenridge, S.M. Roberts et al. // Tetrahedron. 1995. - V. 51. - № 48.-P. 13217-13238.

54. Bayer T., Wagner H. Zwiebelanes: novel biologically active 2,3-dimethyl-5,6-dithiabicyclo2.1.1.hexane 5-oxides from onion // J. Âm. Chem. Soc. — 1989. -V. 111.-P. 3085-3086.

55. Biocatalytic scrubbing of gaseous acrylonitrile using Rhodococcus ruber immobilized in synthetic silicone polymer (ImmobaSil™) rings / P.C.J. Roach, D.K. Ramsden, J. Hughes et al. // Biotechnol. Bioeng. 2003. - V. 85. - № 4. -P. 450-455.

56. Biodégradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martinkovâ, B. Uhnakova, M. Patek et al. II Environ. Int. 2009. - Y. 35. - P. 162-177.

57. Bioepoxidation of propylene by non-growing cells of Rhodococcus sp. / G.A. Kovalenko, I.B. Ivshina, E.V. Kuznetsova et al. II Chemistry for Sustainable Development. 2003. - V. 11. - P. 117-121.

58. Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land farming techniques / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.I. Ritchkova et al. II Soil Sediment Contamination. 2003. - V. 12. - P. 8599.

59. Biotransformation of nitriles by Rhodococcus equi A4 immobilized in LentiKats® / D. Kubâc, A. Cejkovâ, J. Masâk et al. II J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. -2006. Y. 39. - P. 59-61.

60. Biotransformation of sulfides by Rhodococcus erythropolis / H.L. Holland, F.M. Brown, A. Kerridge et al. II J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2003. - V. 22. -№3-4.-P. 219-223.

61. Biotreatment of industrial wastewater by selected algal-bacterial consortia / E. Safonova, K.V. Kvitko, M.I. Iankevitch et al. II Eng. Life Sci. 2004. - V. 4, №4.-P. 347-353.

62. Block E., Ahmad S., Catalfamo J.L. The chemistry of alkyl thiosulfinate esters. Antithrombotic organosulfur compounds from garlic: structural, mechanistic, and synthetic studies // J. Am. Chem. Soc. 1986. - V. 108. - P. 7045-7055.

63. Buist P.H., Marecak D.M. Stereochemical analysis of a quasisymmetrical dialkyl sulfoxide obtained by a diverted biodehydrogenation reaction // J. Am. Chem. Soc. 1991.-V. 113.-P. 5877-5878.

64. Careno M.C. Applications of sulfoxides to asymmetric synthesis of biologically active compounds // Chem. Rev. 1995. - V. 95. - № 12. - P. 17171760.

65. Cell-linked and extracellular cholesterol oxidase activities from Rhodococcus erythropolis. Isolation and physiological characterization / M. Sojo, R. Bru, D. Lopes-Molina et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 542589.

66. Chen G., Rockhold M., Strevett K.A. Equilibrium and kinetic adsorption of bacteria on alluvial sand and surface thermodynamic interpretation II Res. Microbiol.-2003.-V. 154.-P. 175-181.

67. Chloroperoxidase catalyzed oxidations in t-butyl alcohol/water mixtures / M.P.J, van Deurzen, IJ. Remkes, F. van Rantwijk et al. II J. Mol. Catal. A: Chemical.-1997.-V. 117.-№ 1-3.-P. 329-337.

68. Chloroperoxidase—catalysed asymmetric synthesis: enantioselective reactions of chiral hydroperoxides with sulfides and bromohydration of glycols /

69. H. Fu, H. Kondo, Y. Ichikawa et al. II J. Org. Chem. 1992. - V. 57. - №. 26. -P. 7265-7270.

70. Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications / J. MacLachlan, A.T.L. Wotherspoon, R.O. Ansell et al. II J. Steroid Biochem. Mol. Biol.-2000.-V. 72.-P. 169-195.

71. Cholesterol side-chain cleavage by immobilized cells of Rhodococcus equi DSM 89-133 / S. Ahmad, P.K. Roy, S.K. Basu et al. II Indian J. Experim. Biol. -1993. -V. 31, № 4. P. 319-322.

72. Colonization of surfaces by phenolic compounds utilizing microorganisms / J. Masak, A. Cejkova, V. Jirku et al. II Environ. International. 2005. - V. 31. -№2.-P. 197-200.

73. Conversion of clindamycin to l'-demethylclindamycin and clindamycin sulfoxide by Streptomyces sp. / A.D. Argoudelis, J.H. Goats, D.J. Mason et al. II J. Antibiot. 1969 -V. 22. -№ 7. - P. 309-314.

74. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV—1 immobilized on Biolite® in packed-bed reactor / M.B. Prieto, A. Hidalgo, J.L. Serra et a/. // J. Biotechnol. 2002. - V. 97. - P. 1-11.

75. Drug interaction studies with esomeprazole, the (5)-isomer of omeprazole. T. Andersson, M. Hassan-Alin, G. Hasselgren et al.. II Clin. Pharmacokinet. —2001. -V. 40.-№6.-P. 411-426.

76. Effect of portionwise addition of oxidant in asymmetric vanadium-catalyzed sulfide oxidation / N.N. Karpyshev, O.D. Yakovleva, E.P. Talsi et al. II J. Mol. Catal. A: Chem. 2000. - V. 157. - P. 91-95.

77. Effects of substrate structure on the enantioselectivity and stereochemical course of sulfoxidation catalyzed by cyclohexanone monooxygenase / G. Carrea, B. Redigolo, S. Riva et al. // Tetrahedron: Asymmetry. 1992. - V. 3. - № 8. -P. 1063-1068.

78. Enantioselective dioxygenase-catalysed formation and thermal racemisation of chiral thiophene sulfoxides / D.R. Boyd, N.D. Sharma, S.A. Haughey et al. II Chem. Commun. 1996. -№ 20. - P. 2363-2364.

79. Exploring the biochemical properties and remediation applications of the unusual explosive-degrading P-450 sistem XplA / R.G. Jackson, E.L. Rylott, D. Fournier et al. I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V. 104. - P. 1682216826.

80. Finnerti R. W. The biology and genetics of the genus Rhodococcus II Ann. Rev. Microbial. 1992. -V. 46. - P. 193-218.

81. Ganguly S. Enhanced stabilization of nitrile hydratase enzyme from Rhodococcus sp. DAP 96253 and Rhodococcus rhodochrous DAP 96622: A Diss. . .Degree of PhD / S. Ganguly Tbilisi: Georgia State University, 2005. - 119 p.

82. Goodfelow M., Alderson G., Chun J. Rhodococcal systematics: problems and developments // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. — V. 74. - №. 1-3. - P. 320.

83. Holland H.L., Ihasz N., Lounsbery B.J. Formation of single diastereomers of (3-hydroxy sulfoxides by biotransformation of P-ketosul fides using Helminthosporium species NRRL 4671 // Can. J. Chem. 2002. - V. 80. - № 6. -P. 640-642.

84. Holland H.L., Poddar S., Tripet B. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxylation byMortierella isabellina II J. Ind. Microbiol.- 1992.-V. 10.-№3-4.-P. 195-197.

85. Horseradish-peroxidase catalyzed sulphoxidation is enantioselective / S. Colonna, N.Gaggero, G. Carrea et al. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. — 1992. — №4.-P. 357-358.

86. Huang, W.H., Wilcox R.E., Davis P.J. Comparative molecular field analysis (CoMFA) for sulfoxidation reactions in Mortierella isabellina ATCC 42613 and Helminthosporium sp. NRRL 4671 // J. Mol. Model. 2002. - V. 8. - № 1. - P. 823.

87. Imboden C., Renaud P. Preparation of optically active ortho-chloro— and or/7zo-bromophenyl sulfoxides // Tetrahedron: Asymmetry. 1999. - V. 10. - P. 1051-1060.

88. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant /M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, A.Y. Gavrin et al. II J. Microbiol. Methods. 2006. - V. 65. - P. 596-603.

89. Jones A., Goodfelow M. Genus II. Rhodococcus (Zopf 1891) emend Goodfelow et al. 1998 // Bergey's Manual of Systemstic Bacteriology. 2nd edn. -2010.-V. 4.-P. 1-65.

90. Kerridge A., Willetts A., Holland H. Stereoselective oxidation of sulfides by cloned naphthalene dioxygenase // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1999. — V. 6. -№ 1-2. -P. 59-65

91. Kuyukina M.S., Ivshina I.B. Rhodococcus biosurfactants: Biosintesis, Properties, and Potential Applications // Biology of Rhodococcus / ed. H.M. Alvarez. Berlin: Springer, 2010. - P. 292-313

92. Lameiras S., Quíntelas C., Tavares T. Biosorption of Cr (VI) using a bacterial biofilm supported on granular activated carbon and on zeolite // Bioresour. Technol. 2008. - V. 99. - P. 801-806.

93. Larkin, M.J., Kulakov, L.K., Allen, C.C.R. Biodegradation by members of the genus Rhodococcus: Biochemistry, physiology, and genetic adaptation // Adv. Appl. Microbiol. 2006. - V. 59. - P. 1-29

94. Lee K., Brand J.M., Gibson D.T. Stereospecific sulfoxidation by toluene and naphthalene dioxygenases // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1995. V. 212. -№ l.-P. 9-15.

95. Liu L., Schmid R.D., Urlacher V.B. Cloning, expression, and characterization of a self-sufficient cytochrome P450 monooxygenase from Rhodococcus ruber DSM 44319 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 72. -P. 876-882.

96. Long-term repeated biodesulfurization by immobilized Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 cells / M. Naito, T. Kawamoto, K. Fujino et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 55. - P. 374-378.

97. Lopez A., Lazaro N., Marques M. The interphase technique: a simple method of cell immobilizationin gel-beads // J. Microbiol. Methods. — 1997. V. 30. - P. 231-234.

98. Lozinsky V.I. Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: preparation, properties and applications // Rus. Chem. Rev. — 2002. № 6. - P. 489-511.

99. Masuda Y., Nakayama N. Protective effect of diethyldithiocarbamate and carbon disulfide against liver injury induced by various hepatotoxic agents // BiochemPharmacol. 1982.-V. 31.-№ 17.-P. 2713-2725.

100. Microbial synthesis of a proton pump inhibitor by enantioselective oxidation of a sulfide into its corresponding sulfoxide by Cunninghamella echinulata MK40 / T. Yoshida, M. Kito, M. Tsujii et al. // Biotechnol. Lett. 2001. - V. 23. - P. 1217-1222.

101. Monticello D.J. Biodesulfiirization and the upgrading of petroleum distillates // Curr. Opin. Biotech. 2000. - V. 11. - №. 6. - P. 540-546.

102. New packing materials for bioreactors based on coated and fiber-reinforced biocers / D. Fiedler, A. Thron, U. Soltmann et al. // Chem. Mater. 2004. -V. 16.-P. 3040-3044.

103. Ohta H., Okamoto Y., Tsuchihashi G. Asymmetric synthesis of chiral sulfoxides via microbial oxidation of sulfides // Chem. Lett. 1984. - V. 13. - № 2.-P. 205-208.

104. Ohta H., Okamoto Y., Tsuchihashi G. Microbial oxidation of allylic sulfides to the corresponding optically active sulfoxides // Agric. Biol. Chem. 1985. - V. 49.-№3.-P. 671-676.

105. Okrasa K. Guibe-Jampel E., Therisod M.J. Tandem peroxidase-glucose oxidase catalysed enantioselective sulfoxidation of thioanisoles // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2000. - № 7. - P. 1077-1079.

106. Ozaki S. de Montellano P.R.O. Molecular engineering of horseradish peroxidase. Highly enantioselective sulfoxidation of aryl alkyl sulfides by the phe-41 .fwdarw. Leu mutant // J. Am. Chem. Soc. 1994. - V. 116. - № 10. - P. 44874488.

107. Patai S., Rappoport L., Stirling C.J.M. The Chemistry of Sulfoxides and Sulfones. -N.Y.-Z,.: J. Willey a Sons, 1988. 1200 p.

108. Recent biotechnological developments in the use of peroxidases / S. Colonna, N. Gaggero, G. Richelmi, // Trends Biotechnol. 1999. - V. 17. - № 4. - P. 163168.

109. Rehfuss M., Urban J. Rhodococcus phenolicus sp. nov., a novel bioprocessor isolated actinomycete with the ability to degrade chlorobenzene, dichlorobenzene and phenol as sole carbon sources // Syst. Appl. Microbiol. 2005. — V. 28. -P. 695-701%

110. Sequence analysis and heterologous expression of a new cytochrom P450 monooxygenase from Rhodococcus sp. for asymmetric sulfoxidation / J.-D. Zhang, A.-T. Li, Y. Yang et al.ll Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. - V. 85. - P. 615-624.

111. Solladie G., Carreno M.C. In Organosulphur chemistry. Synthetic aspects. (Ed. P.C.B.Page). // Academic Press, New York. 1995. - P. 1.

112. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system Actinobacteria classis nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - № 2. - P. 479-491.

113. Stereoselectivity of microbial oxygenation of metallocene sulphides with different substituent size and central atom / Y. Yamazaki, C. Hesse, H. Okuno et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 45. - P. 595-599.

114. Substrate Specificity and Enantioselectivity of 4-Hydroxyacetophenone Monooxygenase / N.M. Kamerbeek, J. Arjen, J. Olsthoorn et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2003. -V. 69. -№ 1. P. 419-426.

115. The genus Rhodococcus / K.S. Bell, J.C. Philip, D.W.J. Aw et al. // J. Appl. Microbiol. 1998. -V. 85. - P. 195-210.

116. Titanium-Catalyzed, Asymmetric Sulfoxidation of Alkyl Aryl Sulfides with Optically Active Hydroperoxides / W. Adam, M.N. Korb, K.J. Roschmann et al. //J. Org. Chem. 1998. -V. 63. -№ 10. - P. 3423-3428.

117. Toluene and naphthalene dioxygenase-catalysed sulfoxidation of alkyl aryl sulfides / D.R. Boyd, N.D. Sharma, S.A. Haughey et al. II J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1998. -№. 12.-P. 1929-1933.

118. Yun S., Ohta Y. Removal of volatile fatty acids with immobilized Rhodococcus sp. B261 // Bioresour. Technol. 2005. - V. 96. - № 1. - P. 41-46.