Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеструкция дротаверина гидрохлорида актинобактериями рода Rhodococcus

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биодеструкция дротаверина гидрохлорида актинобактериями рода Rhodococcus"

На правах рукописи

Мухутдинова Анна Наилевна

БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИИА ГИДРОХЛОРИДА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА ШОООСОСЫ/Б

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 ЯНВ 2015

005558207

Пермь-2014

005558207

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна,

доктор фармацевтических наук Вихарева Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии химико-биологического факультета ФГБОУ Оренбургского государственного университета Дерябин Дмитрий Геннадьевич,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник филиала ФГУП "НПО Микроген" МЗ РФ "Пермское НПО "Биомед" Грязнова Диана Васильевна

Ведущая организация: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт фундаментальной медицины и биологии, кафедра микробиологии (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18)

Защита состоится 27. 02. 2015 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http: www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат разослан января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^аКСИМОва ^лня Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время остро стоит проблема загрязнения окружающей среды фармполлютантами - высокостабильными соединениями с разнообразной химической структурой и выраженной биологической активностью. Они обнаруживаются в почве, донных осадках водоемов, сточных, грунтовых водах и даже питьевой воде (Баренбойм, Чиганова, 2012; Гетьман, Наркевич, 2013; Celiz et al., 2009; Nikolaou, 2013). Известно, что аккумуляция фармполлютантов в природных экосистемах и их долговременное воздействие на живые организмы может сопровождаться развитием раковых клеток и нарушением функций работы почек у млекопитающих, снижением репродуктивной активности у рыб, а также другими патологическими изменениями (Bessems, Vermeulen, 2001; Lalumera et al., 2004; Triebskom et al., 2004). Загрязнение объектов природной окружающей среды отходами фармацевтической промышленности обусловлено тотальным применением лекарственных средств населением и в различных отраслях хозяйственной деятельности человека, неэффективностью способов их утилизации (сжигание, слив в промышленную канализацию, размещение на санитарных полигонах), а также несовершенством методов очистки сточных вод от фармполлютантов (озонирование, хлорирование, сорбирование углем и др.) (Цхе и др., 2013; Bedner, Maccrehan, 2006; Zvveiner, 2007).

Понимание процессов, происходящих с фармполлютантами в окружающей среде, требуют поиска эффективных способов нейтрализации данных опасных соединений, выяснения взаимосвязи между систематической принадлежностью микроорганизмов и их способностью деградировать лекарственные средства, изучения степени биодоступности и токсического действия новых соединений на микроорганизмы-деструкторы, особенностей начальных этапов их разложения и кометаболизма.

Вопросы взаимодействия "фармполлютант - микроорганизм" привлекают все большее внимание исследователей (Quintana et al., 2005; de Gusseme et al., 2011; Santos et al., 2012). Среди экологически значимых групп микроорганизмов, способных чутко реагировать на изменения в среде обитания и инициировать соответствующие адаптивные реакции, особое место занимают актинобактерии рода Rhodococcus. Алкано- и олиготрофный образ жизни родококков, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к повреждающим клетку воздействиям, высокая сопротивляемость конкурентам, склонность к клеточной агрегации, способность к росту на минимальных средах с усвоением различных ксенобиотиков, высокая катаболическая активность в экстремальных условиях внешней среды свидетельствуют об исключительной пластичности их генома (Ившина, 1997; 2012; Larkin et al., 2006; de Carvalho et al., 2014). Эти свойства родококков делают их наименее зависимыми от внешней среды и обеспечивают широкое распространение в природе, сохранение относительно стабильной численности особей в занимаемой экологической нише и приуроченность к специфическим местообитаниям. Однако примеры биодеструкции фармполлютантов

с использованием актинобактерий рода Rhodococcus пока не многочисленны (Yoshimoto et al., 2004; Ившина и др., 2006; Kim et al., 2007; Gauthier et al., 2010).

Среди фармполлютантов, детектируемых в окружающей среде, большое число представлено азотсодержащими гетероциклическими соединениями, в том числе изохинолинового ряда (Duca, Boldescu, 2001). На настоящий момент накоплен значительный экспериментальный материал по биодеструкции водными и почвенными бактериями хинолиновых и изохинолиновых соединений, не являющихся лекарственными препаратами (Zhu et al., 2008; Li et al., 2010; Wang et al., 2010). При этом имеется лишь немногочисленная информация о биодеструкции лекарственных соединений данной группы (Niknam et al., 2010; Zhao et al., 2011). Одним из распространенных устойчивых фармполлютантов изохинолинового ряда является дротаверина гидрохлорид (C24H31NO4, CAS: 985-12-6, 1 -(3,4-диэтокси-бензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин в форме гидрохлорида, син. Но-шпа), обладающий спазмолитическим, миотропным и сосудорасширяющим действием. Ежегодное потребление его в развитых странах составляет сотни тонн, что неизбежно приводит к попаданию и аккумуляции дротаверина в природной окружающей среде (Duca, Boldescu, 2001; Tiwari et al., 2011). Есть данные, указывающие на эмбрио- и общетоксическое действие дротаверина в отношении млекопитающих (Демушкин и др., 2011; Endreffy, Boda, 1983).

Цель настоящей работы — исследование возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биодеструкции дротаверина гидрохлорида.

Основные задачи исследования

1. Исследовать каталитическую активность коллекционных культур актинобактерий в отношении дротаверина гидрохлорида. Отобрать штаммы -активные биодеструкторы дротаверина. Разработать оптимальные условия процесса биодеструкции дротаверина.

2. Определить условия тестирования культуральной жидкости штаммов-биодеструкторов на присутствие данного фармполлютанта. Исследовать динамику процесса биодеструкции дротаверина родококками методом кинетического моделирования.

3. Изучить физико-химические и морфофизиологические характеристики родококков в условиях биодеструкции дротаверина.

4. Сравнить дротавериндеструктирующую активность свободных и иммобилизованных родококков.

5. Определить основные продукты и возможные пути разложения дротаверина.

Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерий рода

Rhodococcus к использованию дротаверина гидрохлорида в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Посредством респирометрического метода подтверждена дыхательная активность родококков в отношении дротаверина. Установлено, что представители видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber характеризуются наиболее выраженной (МПК>200 мг/л) толерантностью

к дротаверину и демонстрируют различную способность к его разложению в зависимости от используемого инокулята, температуры и присутствия глюкозы в качестве дополнительного энергетического субстрата. Подобраны оптимальные условия биодеструкции 20 мг/л дротаверина (28 °С, рН 6,8, внесение 5 г/л глюкозы, чередование скорости механического перемешивания культуральной жидкости 160 и 60 об/мин, использование родококков, предварительно выращенных при низких (2 мг/л) концентрациях дротаверина). Экспериментально обосновано, что иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород) родококки характеризуются наиболее высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию дротаверина по сравнению с таковыми свободных клеток, а также иммобилизованных в гелевом носителе (криогеле на основе поливинилового спирта). В сравнительных исследованиях каталитической активности вегетативных и дормантных клеток при биодеструкции дротаверина установлена возможность повыщения (более чем в 3 раза) деструктирующего потенциала родококков с использованием цистоподобных покоящихся клеток при неоптималыюй (35±2 °С) температуре. В условиях воздействия дротаверина выявлены характерные изменения физико-химических (повышение дзета-потенциала и степени гидрофобности клеток) и морфофизиологических (увеличение шероховатости, изменение размеров и агрегация клеток) характеристик родококков. Определены возможные пути разложения дротаверина гидрохлорида. Установлено, что биологическое превращение дротаверина сопровождается образованием простых ароматических соединений - производных протокатеховой кислоты, не обладающих выраженной токсичностью по сравнению с таковой дротаверина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биодеструктирующей способности актинобактерий рода Rhodococcus и их возможном вкладе в деконтаминацию природных экосистем от фармполлютантов. В результате проведенных исследований отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326 - активные биодеструкторы дротаверина.

Впервые разработана методика хроматографического определения дротаверина в культуральной жидкости актинобактериальных штаммов в процессе его биодеструкции, пригодная для использования в лабораторных условиях при поиске новых штаммов-биодеструкторов. Создана кинетическая модель процесса биодеструкции дротаверина, позволяющая оптимизировать планирование исследований по биодеструкции фармполлютанта, сократить продолжительность эксперимента за счет теоретического прогноза, оценить воспроизводимость и определить время окончания процесса биодеструкции дротаверина. Способ биодеструкции дротаверина свободными и иммобилизованными клетками штамма R. rhodochrous ИЭГМ 608, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1931, защищен Патентом РФ 2496866. Среди промежуточных продуктов биодеструкции дротаверина детектировано соединение предполагаемой структуры 1-оксо-6,7-диэтокси-1,2,3,4-

тетрагидроизохинолин (m/z=235,2), являющееся структурным аналогом производных изокарбостирила. Замещенные 1(2Н)-изохинолоны перспективны в синтезе веществ с различной биологической активностью. Результаты исследований используются в лекционном курсе "Биоразнообразие и систематика микроорганизмов" для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета (ПГНИУ). Информация о наиболее активных штаммах-биодеструкторах дротаверина гидрохлорида включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет (http://wvm.iegm.ru/iegmcol/strain).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Rhodococcus способны к использованию дротаверина гидрохлорида в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Наиболее выраженной (МПК>200) толерантностью к дротаверину характеризуются представители экологически значимых видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber. Полное разложение 20 мг/л дротаверина родококками достигается в присутствии глюкозы в течение 15 сут при предварительном выращивании родококков в условиях низких (2 мг/л) концентраций дротаверина, 28 °С, рН 6,8 и чередовании скоростей (160 и 60 об/мин) механического перемешивания культуральной жидкости.

2. Разработанная методика количественного определения дротаверина в культуральной жидкости родококков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии пригодна для изучения динамики разложения фармполлютанта. Кинетическое моделирование, параллельное во времени проводимым экспериментам, позволяет сократить продолжительность процесса за счет теоретического прогноза и определить время окончания процесса биодеструкции дротаверина.

3. Характерной особенностью родококков, выращенных в присутствии дротаверина, является повышение дзета-потенциала и степени гидрофобности клеток, их шероховатости, а также формирование клеточных агрегатов разных размеров.

4. Родококки, иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород), характеризуются наиболее высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию дротаверина по сравнению с таковыми свободных клеток, а также иммобилизованных в гелевом носителе (криогеле на основе поливинилового спирта). Использование цистоподобных покоящихся клеток в качестве инокулята способствует повышению (более чем в 3 раза) дротавериндеструктирующего потенциала родококков при неоптималыюй (35±2 °С) температуре.

5. Биодеструкция дротаверина с использованием родококков сопровождается образованием устойчивых метаболитов, среди которых детектируются простые ароматические соединения - производные 3,4-диоксибензойной (протокатеховой) кислоты, не обладающие выраженной токсичностью по сравнению с таковой дротаверина гидрохлорида.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных "Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии", Пермь, 2011; XVI, XVII Международной Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2012, 2013; V и VII Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз - Россия", Тверь, 2012, Екатеринбург, 2014; Российской научно-практической конференции студентов и молодых ученых "Современные проблемы фармацевтической науки", Пермь, 2012-2014; VII Студенческом конкурсе научных проектов по программе УМНИК, Пермь, 2013; Региональной научно-практической конференции "Междисциплинарные исследования", Пермь, 2013; Международной научно-практической конференции "Проблемы развития биотехнологии в аграрной сфере", Екатеринбург, 2013; 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, 2013.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 - в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий (Вестник Уральской медицинской академической науки, Журнал аналитической химии, Фундаментальные исследования) и 2 - в изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus (World J. Microbiol. Biotechnol., Current Microbiol.). Способ биодеструкции дротаверина защищен Патентом РФ 2496866.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 48 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 200 наименований работ, в том числе 61 отечественных и 139 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека" (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана грантами Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-5589.2012.4), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН (проект № 12-П-4-1044, номер госрегистрации 01201256869) и молодежным научным грантом по программе УМНИК (номер договора 685 ГУ/2013).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Суспензии покоящихся форм родококков предоставлены д.б.н. Мулюкиным A.JI. (старший научный сотрудник лаборатории выживаемости микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН). Математическое моделирование процесса биодеструкции дротаверина выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой - д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе использовали 92 штамма актинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, номер 768 во Всемирной федерации коллекции культур, www.iegm.ru/iegmcol/strains), принадлежащих к Dietzia maris (5 штаммов), Gordonia rubriperctirtcta (5 штаммов), G. terrae (5 штаммов), R. erythropolis (14 штаммов), R. fascians (11 штаммов), 'R. longus' (14 штаммов), R. opacus (12 штаммов), R. rhodochrous (12 штаммов), R. ruber (14 штаммов). Дротаверина гидрохлорид (ДГ) использовали в виде фармацевтической субстанции (светло-желтый с зеленоватым оттенком кристаллический порошок без запаха, чистота - 98,5 %, умеренно растворимый в воде, производства Ирбитского химико-фармацевтического завода, Россия), таблеток Но-шпа или р-ра для инъекций (Хиноин, Венгрия). ДГ вносили в среду культивирования из стерильного концентрированного (0,1 %) раствора до конечной (0,002 %) концентрации. Использованные в экспериментах химические реагенты, в том числе ацетонитрил, хлороформ и этанол имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч. (Россия; Merck, Германия; Sigma-Aldrich, США).

Микробиологические методы. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) ДГ в отношении исследованных культур определяли методом микротитрования с использованием полистироловых планшетов стандартной конфигурации 8x12 (96) лунок (Cuenca-Estrella et al., 2002). В экспериментах по биодеструкции ДГ применяли минеральную среду RS (г/л): К2НРО4 - 2,0; КН2РО4 - 2,0; KNO3 - 1,0; (NH4)2S04 - 2,0; NaCl - 1,0; MgS04x7H20 - 0,2; СаС12х2Н20 - 0,02; FeChx7H20 - 0,001. В качестве источника углерода и энергии использовали ДГ в концентрации 20 мг/л, а инокулята - отмытые дважды 50 тМ фосфатным буфером (рН 7,0) клетки, предварительно выращенные в течение 3-х сут в мясопептонном бульоне (МПБ) (Оболенск, Россия), которые вносили в среду культивирования до конечной концентрации 2,3х107 клегок/мл. В экспериментах по оценке способности родококков использовать ДГ в качестве источника азота бактериальные клетки выращивали в безазотной среде RS. В отдельных экспериментах культуры предварительно выращивали в МПБ в присутствии низких (2 мг/л) концентраций ДГ. Биодеструкцию ДГ исследовали также при дополнительном внесении косубстратов: D-глюкозы (0,5 %), D-сахарозы (0,25 %), этанола (0,01 %) или глицерина (0,1 %). Процесс биодеструкции ДГ вели при разных показателях температуры (18, 28, 35 °С), кислотности (рН 5,0; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6; 6,8; 7,0), интенсивности (60, 160, 180 об/мин) перемешивания среды культивирования. Во избежание фотодеградации и фотоинициированного окисления ДГ содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала.

Получение иммобилизованных клеток. Иммобилизацию предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ родококков осуществляли по ранее разработанным способам с использованием различных носителей - адсорбента на основе древесных пород (опилки, 1-3 мм) из отходов деревообрабатывающего

производства (Podorozhko et al., 2008) и гетерофазного криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС) производства ПО "Азот", Невинномысск, Россия (Kuyukina et al., 2006). Носитель на основе древесных пород гидрофобизовали (для повышения сродства поверхности адсорбента к бактериальным клеткам) с помощью олифы на основе льняного масла (Московский лакокрасочный завод "Оливеста", Россия). Количество иммобилизованных на носителе клеток составляло 22,5±1,8 мг сухих клеток/г носителя. Бактериальную суспензию (ОПбоо 0,2) и раствор ПВС (120 г/л) смешивали в соотношении 1:2 v/v. Этапы замораживания и оттаивания осуществляли согласно указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5 %-ном р-ре NaCl в течение 24 ч и добавляли в среду культивирования из расчета 100 гранул (2,3х107 клеток/мл) на 100 мл среды. Хранение полученных иммобилизованных клеток осуществляли при +5 °С. В сравнительных экспериментах по биодеструкции ДГ использовали одинаковое количество свободных и иммобилизованных бактериальных клеток.

В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор ДГ в минеральной среде RS (для оценки абиотической деструкции экотоксиканта); (2) стерильный раствор ДГ в минеральной среде RS с инактивированными бактериальными клетками (для оценки степени адсорбции экотоксиканта на бактериальных клетках), при этом бактериальные клетки инактивировали автоклавированием при 1,0 атм. трехкратно в течение 20 мин; (3) минеральную среду RS с бактериальными клетками без ДГ, содержащую глюкозу (контроль для разграничения метаболитов, появляющихся в результате разложения экотоксиканта). Ввиду большой продолжительности лабораторных экспериментов во времени полученные значения корректировали с учетом поправки на испарение воды с помощью уравнений, приведенных в работе H. Gauthier с соавт. (2010). Численность жизнеспособных бактериальных клеток в инкубационной среде определяли методом точечных высевов на МПА (Веслополова, 1995).

Получение цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК). Под термином ЦПК неспорообразующих актинобактерий понимаем клетки, образующиеся в онтогенезе неспорулирующих микробных культур, не обладающие метаболической активностью и характеризующиеся повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды. Получение длительно (7 мес) хранящихся ЦПК осуществляли по способу (Мулюкин, 2010). Родококки культивировали в минеральной среде SRI с пятикратно сниженным источником азота, содержащей (г/л): глюкозу - 20,0; KNOj — 0,2 (в полноценной среде - 1,0); К2НРО4- 0,5; MgS04x7H20 - 0,5; NaCl - 0,5; СаСОз -3,0 или СаСЬ - 0,2; рН 7,2 - 7,4. Инокулят - 3 сут культуру, выращенную в LB-бульоне при 28 °С, вносили в объеме 500 мкл на 50 мл среды. Родококки выращивали в течение 7 сут, а затем выдерживали в течение 7 мес при комнатной температуре в статических условиях (без принудительной аэрации). Термоустойчивость ЦПК определяли как численность клеток, оставшихся жизнеспособными (по титрам КОЕ/мл) после прогревания клеточных суспензий (0,3 мл) при температурах от 55 до 90 °С (с интервалом 10 °С) в течение 10 мин.

Микроскопические методы. Микроскопические наблюдения в режиме фазового контраста проводили с использованием микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия). Клеточные суспензии прокрашивали красителем LIVE/DEAD fiacLight Kit (Molecular Probes Inc) для дифференциации живых и мертвых клеток. Фотодокументирование полученных изображений осуществляли с помощью фотокамеры Pixera (США) и компьютерной программы ВидеоТест, Размер 5,0 (Санкт-Петербург, Россия). Морфологию и рельеф клеток исследовали на базе Rhodococcus-центра ПГНИУ с использованием атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D (Asylum Research, США). Сканирование препаратов осуществляли в полуконтакгном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 N/m. Морфо-метрический анализ полученных АСМ-изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа IgorPro 6,22А (WaveMetrícs).

Определение гидрофобных свойств. Степень гидрофобности бактериальных клеток определяли методом Solt Aggregation Test (Krepsky et al., 2003). Визуализацию контрольных (нативных) и агрегированных под действием 0,2-2,ОМ сульфата аммония (в 0,001 M натрий-фосфатном буфере) клеток осуществляли с использованием светового микроскопа Оценку степени гидрофобности бактериальных клеток проводили по предложенной N. Krepsky с соавт. (2003) шкале: высокая гидрофобность - показатель солености р-ра сульфата аммония от 0 до 0,8М; умеренная - от 1,0 до 2,ОМ; слабая - от 2,2 до 3,8М.

Измерение поверхностного электрокинетического (дзета) потенциала бактериальных клеток проводили методом динамического светорассеяния с помощью анализатора ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) с программным обеспечением Malvern ZetaSizer, v. 2,2. Выращенные в МПБ и минеральной среде в присутствии ДГ клетки отбирали в стационарной фазе роста, дважды отмывали и ресуспендировали в 0,1 M KNO3 (рН 7,0) до достижения ОПбоо 0,2. Измерения проводили в U-образной кювете с позолоченными электродами при температуре 25 "С и рН 7,0.

Определение общего содержания липидов гравиметрическим методом. Сравнительное определение суммарных клеточных липидов в бактериальных клетках, выращенных в МПБ в течение 3 сут, и клетках, выращенных в минеральной среде в присутствии ДГ в течение 5, 10 и 15 сут, проводили согласно методу, описанному в Большом практикуме по микробиологии (Ившина, 2014).

Определение дыхательной активности. Дыхательную деятельность вегетативных клеток и ЦПК оценивали по скорости выделения и количеству СО2 с помощью высокоточного респирометра Micro-Oxymax® (Columbus Instruments, США). Эксперименты проводили в защищенных от света стеклянных флаконах Micro-Oxymax вместимостью 300 мл с объемом минеральной среды RS 100 мл, содержащей 0,002 % ДГ, при постоянном перемешивании (400 об/мин) на многоместной магнитной мешалке RT 10 (Power IKAMAG, Германия). Измерение

клеточного дыхания проводили каждые 42 мин в течение 48-153 ч. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин), а также количество (мкл) выделяемого СОг.

Аналитические методы. Содержание ДГ в среде культивирования актинобактерий определяли методом ВЭЖХ с использованием хроматографа LC Prominence 20А (Shimadzu, Япония), оборудованного хроматографической колонкой с обращенно-фазным сорбентом Discovery® HS С18 (250x4,6 мм, 5 мкм) и диодно-матричным детектором (SPD-M20A). Подобранные нами оптимальные условия хроматографического определения ДГ: подвижная фаза — смесь ацетонитрил — 0,1 %-ный р-р трифторуксусной кислоты, линейное возрастание доли ацетонитрила в элюенте - с 30 до 80 об.% за 20 мин, расход подвижной фазы - 1,2 мл/мин, температура колонки - 40 °С, объем вводимой пробы - 20 мкл; длина волны детектирования ДГ - 246 нм. В описанных условиях время удерживания ДГ составляло 9,53±0,02 мин. Регистрацию и обработку хроматографической информации осуществляли с помощью программы LCSolution (v/1,25 rus).

Пробоподготовка культуральной жидкости для проведения хроматографического анализа. Аликвотную часть (2 мл) культуральной жидкости, содержащую ДГ, продукты его биодеструкции, бактериальные клетки и продукты их жизнедеятельности, помещали в пробирку Эппендорфа и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Освобожденную от клеток и взвешенных частиц надосадочную жидкость фильтровали через мембранный шприцевой нейлоновый фильтр (Agilent Technologies, США) с диаметром пор 0,2 мкм. Состав продуктов разложения ДГ анализировали методом ГХ-МС с использованием хромато-масс-спектрометрической системы Agilent 6890N/5973N (Agilent Technology, США), оборудованной капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,25 мм и работавшей в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. В качестве газа-носителя использовали гелий. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами из библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Версия 1,7) for Use with Microsoft ® Windows ™ Users' Guide.

Определение токсичности продуктов биодеструкции ДГ. Острую токсичность определяли экспресс-методом В.Б. Прозоровского (1978) при однократном внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам ДГ и смеси продуктов его биодеструкции на базе Пермской государственной фармацевтической академии. Фитотоксичность в отношении овса Avensa sativa L. проводили в соответствии с Методическими рекомендациями по обоснованию класса опасности отходов производства и потребления по фитотоксичности (2007). Токсичной концентрацией исследованного вещества считали таковую, вызывающую угнетение морфометрических (длина корней) показателей растений >20 % .

Математическое моделирование процесса биодеструкции ДГ. В анализе экспериментальных данных использовали метод наименьших квадратов (Линник и др., 1962; Gill et al., 1981) и данные о динамике процесса биодеструкции ДГ клетками

R. rhodochrous ИЭГМ 647. Кинетическое моделирование проводили на базе кафедры теоретической механики ПНИПУ (зав. кафедрой - д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в 3-8-кратной повторности. Обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерной программы Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Биодеструкция ДГ. Все использованные в работе коллекционные штаммы актинобактерий Dietzia, Gordonia и Rhodococcus сохраняли жизнеспособность в присутствии ДГ в диапазоне концентраций от 50 до 80 мг/л. Для родококков показатели МПК в отношении ДГ оказались значительно выше (50-300 мг/л) по сравнению с таковыми для диетций (МПК 50-80 мг/л) и гордоний (МПК 50—100 мг/л). Представители экологически значимых видов родококков R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber характеризовались более выраженной (МПК>200 мг/л) устойчивостью по отношению к ДГ. Наиболее устойчивыми к ДГ оказались штаммы R. erythropolis ИЭГМ 213, ИЭГМ 767 (МПК 200 мг/л), R. ruber ИЭГМ 326, ИЭГМ 343, ИЭГМ 345, ИЭГМ 348 (МПК 200 мг/л), R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 (МПК 300 мг/л), ранее изолированных из сточных вод городских очистных сооружений и нефтезагрязненных почв и воды. Для дальнейших экспериментов были отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326. Отобранные штаммы способны к использованию ДГ в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Процесс разложения ДГ в виде фармацевтической субстанции (20 мг/л) с использованием нативных бактериальных клеток протекал крайне медленно (более 90 сут), что свидетельствовало о высокой химической устойчивости молекулы исходного ксенобиотика (рис. 1, линия 3). Остаточное содержание ДГ в инкубационной среде на 36 сут ферментации составляло около 74 %.

Рисунок 1. Биодеструкция ДГ в качестве единственного источника углерода (3, 4) и при внесении глюкозы (5) нативными (3) и прединкубированными (4, 5) клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 - абиотический контроль; 2 - контроль биосорбции.

Время, сут

В процессе разложения ДГ существенного роста родококков не наблюдалось. В контроле абиотической деструкции исходная концентрация ДГ изменялась в пределах от 2 до 10 %. В контрольном варианте опыта с инактивированными

клетками обнаруживалось незначительное (до 10-15 %) понижение исходной концентрации ДГ, что свидетельствовало о возможной неспецифической биосорбции экотоксиканта.

Для повышения ДГ-деструктирующей способности родококков были использованы различные приемы: прединкубация клеток в присутствии низких концентраций метаболизируемого субстрата (Soudi, Kolahchi, 2011); введение в инкубационную среду энергетических косубстратов (Gauthier et al., 2010); варьирование условий культивирования родококков (Debasmita, Rajasimman, 2013); иммобилизация бактериальных клеток на различных носителях (Cassidy et al., 1996); использование ЦПК в качестве инокулята (Solyanikova et al., 2011).

Применение родококков, предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ, позволяло сократить продолжительность процесса разложения экотоксиканта до 60 сут (рис. 1, линия 4). В данных условиях наблюдался незначительный прирост биомассы (от 2,3x107 до 6,8x107 клеток/мл) в течение первых 5 сут, после чего происходило резкое снижение (до 3,1х106 клеток/мл) численности родококков. Культивирование предварительно выращенных в присутствии низких концентраций ДГ родококков в минеральной среде с добавлением глюкозы позволяло сократить продолжительность процесса биодеструкции ДГ до 42 сут (рис. 1, линия 5). Количество колониеобразующих единиц достигало максимальных (9,1x108 клеток/мл) значений на 5 сут эксперимента. В присутствии других косубстратов роста (сахарозы, этанола, глицерина) биоконверсия ДГ была выражена значительно в меньшей степени.

Сравнительный анализ дыхательной активности родококков показал, что в присутствии глюкозы регистрируется наиболее высокая их метаболическая

Рисунок 2. Скорость выделении CCh в процессе биодеструкции ДГ в качестве единственного источника углерода (3) и при внесении глюкозы (4) клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 - абиотический контроль без внесения глюкозы, 2 - абиотический контроль с глюкозой.

Расчетные средние показатели (12,91 мкл/мин) скорости выделения СОг родококками в присутствии глюкозы на 6 сут эксперимента были в 1,28 раза выше таковых (10,10 мкл/мин) в присутствии ДГ в качестве единственного источника углерода. В абиотических контролях средние значения респирации были практически равны

активность по отношению к ДГ (рис. 2, линия 4).

40

0 14 29 44 59 74 8' Воемя. ч

104 119 134 149

нулю (рис. 2, линии 1. 2). Отсюда очевидно, что, процесс разложения ДГ непосредственно зависел от каталитической активности родококков.

При исследовании влияния температуры на ДГдеструктирукицую активность родококков выявлено, что наиболее высокие показатели убыли ДГ регистрировались при 28 °С (рис. 3).

С ) 35

о

СО

О.

>-.

В 28

о.

п

о>

Ь—' 18

£

З-

О 10 20 30 40 50 60 70 Содержание ДГ, %

Рисунок 3. Влияние различных температур на биодеструкцию ДГ с использованием клеток Я г/инк/скмии ИЭГМ 647. Продолжительность эксперимента - 15 сут; прединкуби-рованные клетки выращивали 90 100 в присутствии глюкозы. 1 -абиотический контроль; 2 -контроль биосорбции.

5

Как видно из рис. 4, оптимальный уровень кислотности для биодеструкции ДГ - рН среды 6,8. При этом остаточный уровень содержания ДГ на 15 сут эксперимента составлял 38,1 %. В кислых (рН 5,0; 6,0) условиях биодеструкция ДГ клетками к. гИосЯосИроия ИЭГМ 647 не обнаруживалась. Использование минеральной среды со значениями рН 7,0 и выше приводило к выпадению ДГ в хлопьевидный осадок, ДГ становился труднодоступным для биоразложения.

и

КС

-

£ о-<и

ч о

и

100 80 60 40 20 | 0

123

П

5,0

6,0 6,2 6,4 6,6 Показатели рН

И

6,8 7,0

Рисунок 4. Биодеструкция ДГ с использованием клеток Д. гИойосИгоия ИЭГМ 647 (3) при разных показателях рН кислотности среды на 15 сут эксперимента. 1 - абиотический контроль, 2 — контроль биосорбции.

Как видно из рис. 5, чередование высоких (160 об/мин) и низких (60 об/мин) показателей скорости перемешивания среды культивирования родококков позволяет снизить продолжительность процесса биодеструкции ДГ до 15 сут.

5 10

Время, сут

15

Рисунок 5. Биодеструкция ДГ с использованием клеток /?. гкоЛосктоиа ИЭГМ 647 (3) при разных показателях скорости

перемешивания среды.

1 - абиотический контроль,

2 - контроль биосорбции. В эксперименте использовали прединкубированные клетки, выращенные в присутствии глюкозы.

В экспериментах с использованием ДГ в виде готовых лекарственных форм (таблетках или растворах для инъекций) установлено, что присутствующие в них вспомогательные вещества не влияли на скорость процесса биодеструкции экотоксиканта.

Определение ДГ и кинетическое моделирование процесса его биодеструкции в культуральной жидкости Л. гНос1осИгоиа. Поскольку публикации, посвященные определению ДГ в культуральной жидкости бактерий, отсутствуют, проведение экспериментов потребовало уточнения методических аспектов тестирования культуральной жидкости штаммов-биодеструкторов на присутствие данного фармполлютанта. В связи с этим была разработана методика определения ДГ в среде культивирования актинобактерий методом обращенно-фазной ВЭЖХ. Оценены специфичность, линейность, воспроизводимость и точность методики. Установлено, что оптимальное разделение пиков ДГ и продуктов его разложения возможно в режиме градиентного элюирования при использовании хроматографических сорбентов группы алкилсиликагелей и кислой (3,0) рН подвижной фазы (смесь ацетонитрил - 0,1 %-ный р-р трифторуксусной кислоты). Хроматограммы, приведенные на рис. 6, являются подтверждением высокой разделяющей способности разработанного метода градиентного ВЭЖХ при 246 нм.

В

5 200 £

|150 р ИМ

I 50 ?

о о

250 200 150 100 50 0

ДГ

Л_

8 10 12 14

2

8 10 12 14

10 12 14 I. мин

Рисунок 6. Хроматограммы культуральной жидкости К. г/юг/осйгон.? ИЭГМ 647 после 6 сут эксперимента (В). А — контроль среды (минеральная среда К8 без ДГ), Б - абиотический контроль (ДГ в минеральной среде Я8).

Пики веществ, присутствующих в минеральной среде (рис. 6А) и в среде с ДГ (рис. 6Б,В), а также пики веществ, образующихся в среде в процессе биодеструкции ДГ (рис. 6В), не перекрываются, что свидетельствует о специфичности условий анализа. Зависимость площади пика ДГ (Б) от концентрации раствора (С) в интервале 0,00020,002 % имеет линейный характер и описывается уравнением 8=0,105x106хС. На линейность методики в использованном диапазоне концентраций ДГ указывает полученный коэффициент корреляции 0,999.

С целью определения скорости процесса биодеструкции ДГ, анализа воспроизводимости и прогнозирования результатов применяли параллельное эксперименту кинетическое моделирование. Установлено, что процесс биологической деструкции ДГ адекватно отражает кинетическое уравнение первого порядка с

сЬс

переменной "константой" скорости реакции — = -кЦ)-х, где к(1)=(а/2)1+Ь - линейная

Л

функция времени процесса, ах- концентрация ДГ в момент времени /. Параметр Ь отвечает за скорость процесса биодеструкции, параметр а отражает величину ускорения или замедления процесса биодесгрукции во времени. По первым трем результатам измерения концентрации ДГ производили расчет параметров "константы" скорости реакции и строили предварительную зависимость концентрации ДГ от времени - 1-ое приближение. Для последующих приближений процедуру расчетов повторяли с появлением каждой новой экспериментальной точки.

(,сут '-с>'г

Рисунок 7. Изменение "константы" скорости (А) и сходимость рассчитанных кинетических кривых (Б) процесса биодеструкции ДГ клетками Л. гИойвскгои^ ИЭГМ 647 при кинетическом моделировании по трем (1), четырем (2) и пяти (3) экспериментальным точкам (•).

На рис. 7А представлены графики к(1)=(оУ2)1+Ь изменения "константы" скорости процесса биодеструкции ДГ от времени, рис. 7Б - кинетические кривые изменения концентрации ДГ в процессе биодеструкции, полученные по значениям параметров а и Ь для 3, 4 и 5 начальных экспериментальных точек. Как видно из рис. 7, кинетическое моделирование, параллельное во времени проводимым экспериментам, позволяет оптимизировать планирование исследований по биодеструкции ДГ, сократить продолжительность эксперимента за счет

теоретического прогноза, оценить воспроизводимость и определить время окончания процесса биодеструкции. Выявленные закономерности учитывались при постановке экспериментов по биодеструкции ДГ в различных условиях.

Физико-химические и морфофизиологические особенности родококков в присутствии ДГ. Воздействие ДГ на родококки сопровождалось изменением свойств их клеточной поверхности. По сравнению с нативными клетками это выражалось в увеличении показателей электрокинетического заряда от -25,0±3,29 до -20,8±0,98 мВ и суммарных клеточных липидов от 17,1±1,80 до 72,6±8,02 мг/г АСВ. Полученные данные свидетельствовали о повышении степени гидрофобности родококков в присутствии ДГ, что было также подтверждено методом агрегации клеток под действием раствора сульфата аммония.

Ответной реакцией родококков на присутствие ДГ в среде культивирования в соокислительных условиях является формирование компактных клеточных агрегатов, насчитывающих до десяти и более жизнеспособных клеток (рис. 8Г).

90 05 10 1.0 20 25

10 15

Рисунок 8. АСМ-изображения клеток Я. г1к)(1()с11Г(ш$ ИЭГМ 647, выращенных в течение 3 сут в МПБ (А) и 10 сут в среде Я8 в присутствии ДГ в качестве единственного источника углерода (Б, В) и при внесении глюкозы (Г).

Стрелками указаны зоны лизиса отдельных клеток.

Нахождение клеток в составе агломератов, по-видимому, позволяет популяции адаптироваться к условиям, при которых одиночные клетки не способны к биодеструкции ДГ. Характерной особенностью штамма К гкойоскгош ИЭГМ 647 в присутствии ДГ является также выраженное увеличение показателя

среднеквадратичной шероховатости (от 141,9±5,20 до 164,3±7,60 нм) клеточной поверхности. В данных условиях нередко отмечается отслоение клеточной оболочки и излитие внутриклеточного содержимого во внешнюю среду (рис. 8В). В условиях полноценной питательной среды родококки росли автономно, формируя удлиненные (2,47±0,14 нм) палочки с закругленными концами с относительно гладкой клеточной поверхностью с малоразвитым рельефом (рис. 8А). В присутствии ДГ обнаруживались клетки более округлых (2,02±0,11 нм) форм (рис. 8Б).

Биодеструкция ДГ иммобилизованными клетками. В окружающей природной среде микроорганизмы существуют в основном в иммобилизованном виде. В связи с этим интерес представляло сравнительное исследование ДГ деструктирующей активности свободных и иммобилизованных на различных носителях бактериальных клеток. Как видно из рис. 9А, применение родококков, иммобилизованных на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород) позволяло существенно сократить (до 7 сут) продолжительность процесса биодеструкции ДГ по сравнению с таковой при использовании свободных клеток (см. рис. 1, 5).

д 1 2 г-

А 100 ПГРН т Ь шп 1 2

Шш1т

0 2 4 6 0 5 10 15

Время, сут Время, сут

Рисунок 9. Биодеструкция ДГ (2) с использованием иммобилизованных на древесном носителе (А) и в матрице криогеля (Б) клеток Л. гкойосНтоиь ИЭГМ 608. 1 - абиотический контроль.

Очевидно, полученный результат обусловлен более высокой физиологической устойчивостью иммобилизованных на твердом носителе клеток к действию экотоксиканта (уап ЬооБёгесЫ <?/ а!., 1990; Са8з1(1у ег а/., 1996). При использовании клеток, включенных в матрицу криогеля на основе ПВС, остаточное содержание ДГ на 15 сут эксперимента составляло еще 78 % (рис. 9Б). Это объясняется, тем, что ДГ становился, по-видимому, наименее доступным для родококков, включенных в криогель.

Биодеструкция ДГ покоящимися клетками. Актуальность разработки приемов повышения деструктивной активности родококков обусловлена тем, что в природных системах практически отсутствуют оптимальные ростовые условия (температура, рН, N и пр.). Как видно из табл. 1, оптимальным приемом увеличения эффективности биодеструкции ДГ при повышенной (35±2 °С) температуре оказалось применение в качестве инокулята ЦПК. В экспериментах использовали штамм

R. ruber ИЭГМ 326, устойчивый (МПК=200 мг/л) к воздействию ДГ, обладающий более низкой эффективностью его разложения по сравнению с другими штаммами-биодеструкторами ДГ и образующий ЦПК в азотолимитирующей среде при температуре окружающей среды. Полученные ЦПК обладали повышенной устойчивостью к нагреванию в течение 10 мин в диапазоне температур 55-90 °С и морфологическими особенностями, отличавшими их от вегетативных клеток, как то: укороченная округлая форма, наличие наружного капсульного слоя и др.

Таблица 1. Биодеструкция ДГ вегетативными клетками (ВК) и ЦПК R. ruber ИЭГМ 326

Тип инокулята Температура, °С Кол-во СОг, мл/л Валовое потребление ДГ Потребление ДГ на кол-во биомассы, мг/г АСВ

мг/л %от контроля начало опыта конец опыта

Биодеструкция ДГ в качестве единственного источника С

ВК 27±2 120,0 1,6 100,0 контроль 8,0 16,0

ЦПК 27±2 87.5 2,0 125,0 10,0 10,0

ВК 35±2 7.8 0,7 42,0 3,5 7,0

ЦПК 35±2 16.8 2,5 156,0 13,0 13,0

Биодеструкция ДГ в присутствии глюкозы

ВК 27±2 720,0 8.8 550,0 44,0 7,0

ЦПК 27±2 920,0 9,2 575,0 46,0 10,0

Примечание. Приведены данные, полученные через 2 сут инкубации.

Следует отметить, что интенсивность разложения ДГ в качестве единственного источника углерода вегетативными клетками R. ruber ИЭГМ 326 при 35±2 °С через 48 ч не превышала лишь 0,7 мг/л ДГ, тогда как при использовании в качестве инокулята ЦПК она составляла 2,5 мг/л. Эффективность биодеструкции ДГ соответствовала при этом 156 % от контроля. Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что использование покоящихся форм обеспечивало 3,7-кратное преимущество перед вегетативными клетками для биодеструкции ДГ в условиях, неоптимальных для протекания метаболических процессов. При инокулировании среды с ДГ суспензией ЦПК и последующей инкубации при 35 °С дыхательная активность возобновлялась через более короткий (4 ч) промежуток времени по сравнению с таковым (11ч) при 27 °С (рис. 10). При этом максимальная скорость (3,9 мкл/мин, см. рис. 10Б) и общий объем (16,8 мл/л, см. табл. 1) выделенной углекислоты также были выше, чем в вариантах инокулирования вегетативными клетками.

20 Б

'5 *

з

0 3 5 8 10 13 15 18 20 23 25 28 30 33 35 38 40 43 45 48

0 3 5 8 11 13 16 18212426 293234 37 40 4245 48

Время, ч

Время, ч

Рисунок 10. Скорость дыхательной активности в процессе биодеструкции ДГ в качестве единственного источника углерода и энергии после инокулирования среды суспензиями вегетативных (3) и покоящихся (2) клеток R. ruber ИЭГМ 326 и инкубации при 27 °С (А) и 35 °С (Б). 1 - абиотический контроль.

В экспериментах по биодеструкции ДГ в присутствии глюкозы при использовании в качестве инокулятов, как ЦПК, так и вегетативных клеток при оптимальной (27±2 °С) температуре максимальная скорость выделения СОг и его общее количество были существенно выше, чем без добавления соокисляемого субстрата (см. табл. 1). Интенсивность деструкции ДГ в валовом отношении - 8,8 и 9,2 мг/л при использовании вегетативных клеток и ЦПК, соответственно, что составляло почти 50 % убыли ДГ. В данных условиях использование ЦПК в качестве инокулята давало лишь незначительное преимущество по сравнению с инокулированием вегетативными клетками: общее количество выделенного СОг, валовое потребление ДГ не превышали 1,5 раза. По результатам ГХ-МС анализа, в процессе биодеструкции ДГ после инокуляции вегетативными клетками или ЦПК через 48 ч образовывались одинаковые продукты бактериальной деструкции ДГ, в частности производные протокатеховой кислоты по установленному нами пути обмена.

Возможные пути биодеструкции ДГ. Токсичность продуктов биодеструкции. Возможная схема преобразования ДГ родококками представлена на рис. 11. По нашим данным, разложение ДГ (соединение 1) родококками идет через дегидрирование изохинолинового цикла с образованием 1-(3,4-диэтоксибензоил)-6,7-диэтоксиизохинолина (соединение 9), а также по пути окисления мегиленового звена бензильной группы молекулы с образованием 1-(3,4-диэтоксибензоил)-6,7-диэтокси-3,4-дигидроизохинолина (соединение 2). Важным подтверждением образования соединения 2 является наличие в масс-спектре иона с М+=193 (фрагмент 8), соответствующего остатку 3,4-диэтоксибензоила. 1-(3,4-диэтоксибензоил)-6,7-диэтокси-3,4-дигидроизохинолин в дальнейшем расщепляется с образованием лактама (соединение 3). Это наиболее вероятное соединение является структурным аналогом производных изокарбостирила. Образование данного гидрированного производного 6,7-диэтокси-изохинолин-1(2Н)-она согласуется с общими представлениями о химическом окислении производных 1-бензилизохинолина.

о

Рисунок 11. Пути биодеструкцни ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 608.

(1) 1 -(3,4-диэтоксибензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (ДГ),

(2) 1-(3,4-диэтоксибензоил)-6,7-диэтокси-3,4-дигидроизохинолин, (3) 1-оксо-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, (4) 2-(2-аминоэтил)-4,5-диэтоксибензойная кислота, (5) 3,4-диэтоксибензальдегид, (6) 3,4-диэтоксибензойная кислота, (7) этиловый эфир 3,4-диэтоксибензойной кислоты, (8) 3,4-диэтоксибензоил, (9) 1-(3,4-диэтоксибензил)-6,7-диэтоксиизохинолин.

Известно, что замещенные 1(2Н)-изохинолоны широко используются как строительные блоки в органическом синтезе и обладают разнообразными видами биологической активности (Griffin et al., 1998; Virag, Szabo, 2002).

Особо следует отметить образование 2-(2-аминоэтил)-4,5-диэтоксибензойной кислоты (соединение 4. m/z=252,8, М+, 2,0 %), свидетельствующей о раскрытии цикла гидрированного изохинолона.

Вышеуказанные соединения к концу ферментации не обнаруживались в инкубационной среде, что подтверждало дополнительные стадии превращения метаболитов. К концу ферментации в инкубационной среде аккумулировались продукты - производные протокатеховой кислоты (3,4-диэтоксибензальдегид, соединение 5), 3,4-диэтоксибензойная кислота, соединение 6) и этиловый эфир 3,4-диэтоксибензойной кислоты, соединение 7). Данные соединения обнаруживались в среде вплоть до полного исчезновения ДГ и не выявлялись в контрольных экспериментах.

Токсичность продуктов биодеструкции ДГ в отношении овса Avensa sativa L. не выявлена (рис. 12), в то время как при обработке проростков овса водными

растворами ДГ отмечено подавление роста надземных и подземных органов, сопровождающееся морфологическими изменениями, в частности сужением листовой пластинки, снижением тургора осевой части проростка.

Рисунок 12. Изменение

i»

морфомечрических показателей овса Avensa sativa L. при воздействии ДГ и продуктов его биодеструкции. 1 - абиотический контроль; 2 - биотический контроль; 3 - 0,001 % ДГ; 4 - 0,002 % ДГ; 5-0,01 % ДГ; 6 - 1,0 % ДГ; 7 -продукты биодеструкции ДГ.

15

2 о 12

яз" г 9

S

§ 6

3

0

1 2 3 □ длина корня

5 6 7 3 длина стебля

В соответствии с классификацией OECD (2001), продукты биодеструкции ДГ обладают менее выраженной (3 класс) токсичностью по сравнению с таковой ДГ (2 класс опасности).

Заключение. В результате проведенных исследований впервые установлена способность бактерий рода Rhodococcus к биодеструкции ДГ - устойчивого фармацевтического экотоксиканта. Выявлено, что выраженную (МПК>200 мг/л) устойчивость к ДГ имеют представители экологически значимых видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber. Наиболее высокая ДГ-деструктирующая активность отмечена у штаммов R. erythropolis ИЭГМ 767, R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326.

Способность родококков к разложению ДГ различалась в зависимости от условий культивирования, типа инокулята и присутствия в среде глюкозы. Отмечено, что в оптимальных условиях культивирования родококков (в присутствии глюкозы, предварительном выращивании клеток при низких (2 мг/л) концентрациях ДГ, 28 °С, pH 6,8 и чередовании (160 и 60 об/мин) скоростей перемешивания) полное разложение 20 мг/л ДГ с использованием свободных клеток происходит через 15 сут. При этом характерной особенностью родококков на присутствие в среде культивирования ДГ является изменение их физико-химических и морфофизиологических свойств, что, по-видимому, можно рассматривать как механизмы адаптации клеток и, как следствие, повышения их устойчивости к токсическому воздействию экотоксиканта.

Показано, что иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород) родококки характеризуются наиболее высокой ДГ деструктирующей активностью по сравнению со свободными клетками. Использование иммобилизованных клеток позволяет сократить продолжительность эксперимента биодеструкции ДГ с 15 до 7 сут.

В сравнительных исследованиях каталитической активности вегетативных и дормантных клеток при биодеструкции ДГ установлена возможность повышения ДГ-деструктирующего потенциала родококков с использованием ЦПК при неоптимальной (35±2 °С) температуре.

В результате проведенных исследований впервые разработана методика хроматографического определения ДГ в культуральной жидкости родококков в процессе его биодеструкции, пригодная для использования в лабораторных условиях при поиске штаммов-активных биодеструкторов ДГ. Предложена кинетическая модель, позволяющая прогнозировать длительность и оптимальное время окончания процесса биодеструкции ДГ.

Выявлено, что процесс бактериального разложения ДГ происходит с раскрытием изохинолинового цикла и сопровождается образованием простых ароматических соединений - производных протокатеховой кислоты. Ранее в работах по биодеструкции папаверина, близкого по химической структуре к ДГ, отсутствовали сведения, подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла соединения (Hauer et al., 1982). Продукты биодеструкции ДГ не обладают выраженной токсичностью по сравнению с таковой ДГ.

Полученные экспериментальные данные и отобранные штаммы могут служить основой для разработки биотехнологических способов высокоэффективного удаления фармполлютантов из сточных вод.

ВЫВОДЫ

1. На основе генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов впервые показана способность актинобактерий рода Rhodococcus к использованию дротаверина гидрохлорида в качестве единственного источника азота, углерода и энергии. Родококки экологически значимых видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber обладают выраженной (МПК>200) толерантностью к дротаверину. Полное разложение 20 мг/л дротаверина в течение 15 сут клетками R. rhodochrous ИЭГМ 608 и ИЭГМ 647, предварительно выращенных в условиях низких (2 мг/л) концентраций дротаверина, достигается в присутствии глюкозы при 28 °С, рН 6,8 и чередовании скоростей (160 и 60 об/мин) перемешивания культуральной жидкости.

2. Разработана методика детекции и количественного определения дротаверина гидрохлорида в культуральной жидкости родококков, характеризующаяся выраженной воспроизводимостью и точностью анализа. Изучены основные кинетические закономерности и предложена математическая модель, позволяющая прогнозировать длительность и время окончания процесса биодеструкции дротаверина.

3. Выявлены характерные физико-химические (повышение дзета-потенциала, гидрофобное™ клеток) и морфофизиологические (уменьшение размеров, увеличение шероховатости, формирование клеточных агрегатов) изменения родококков под воздействием дротаверина.

4. Показано, что наиболее высокой метаболической активностью и устойчивостью к воздействию дротаверина обладают родококки, иммобилизованные на твердом носителе (адсорбенте на основе древесных пород). По сравнению с вегетативными клетками обосновано преимущество использования цистоподобных покоящихся клеток R. ruber ИЭГМ 326 в качестве инокулята, для биодеструкции дротаверина при неоптимальной (35±2°С) температуре.

5. Определены возможные пути разложения дротаверина гидрохлорида с использованием штаммов R. rhodochrous ИЭГМ 608, ИЭГМ 647 и R. ruber ИЭГМ 326. Впервые получены сведения, подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла соединения дротаверина гидрохлорида. Анализ конечных продуктов биодеструкции дротаверина в постферментационной среде культивирования родококков выявил наличие простых органических соединений - производных протокатеховой кислоты, не обладающие выраженной токсичностью по сравнению с таковой дротаверина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Респираторная активность клеток Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 при биодеструкции ацетаминофена / Л.Н. Мухугдинова, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1(38).-С. 178-180.

2. Biodégradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous 1EGM 608 / I.B. Ivshina, E.V. Vikhareva, M.I. Richkova, A.N. Mukhutdinova, Ju.N. Karpenko // World Journal of Microbiology and Biotechnology. -2012. - V. 28. - P. 2997-3006.

3. Хроматографическое определение дротаверина гидрохлорида и кинетическое моделирование процесса его биодеструкции в культуральной жидкости R. rhodochrous / Ю.Н. Карпенко, А.А. Селянинов, А.Н. Мухугдинова, М.И. Рычкова, А.А. Баранова, Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина // Журнал аналитической химии. - 2014. -Т. 69, № 7. - С. 750-755.

4. Идентификация компонентов комплексного лекарственного средства но-шпалгии и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков / Е.В. Вихарева, А.Н. Плотников, А.Н. Мухугдинова, И.И. Мишенина, А.А. Поспелова, ЕЛО. Тумилович // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 9. - С. 1032-1037.

5. Drotaverine hydrochloride degradation using cyst-like dormant cells of Rhodococcus ruber / I.B. Ivshina, A.N. Mukhutdinova, H.A. Tyumina, H.V. Vikhareva, N.E. Suzina, G.I. El'-Registan, A.L. Mulyukin // Current Microbiology. - DOI: 10.1007/s00284-014-0718-1.

Публикации в других журналах и сборниках

1. Мухугдинова А.Н. Бактериальная биодеградация дротаверина гидрохлорида / А.Н. Мухугдинова, М.И. Рычкова, И.Б. Ившина // Сборник тезисов 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века". Пущино, 2012. - С. 271-272.

2. Мухугдинова А.Н. Исследование фитотоксичности дротаверина гидрохлорида и продуктов его биологической трансформации / А.Н. Мухугдинова, М.И. Рычкова, И.Б. Ившина // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых "Симбиоз Россия 2012". Тверь, 2012.-С. 178-180.

3. Панова К.С. Продукты биодеструкции дротаверина гидрохлорида актинобактериями рода Rhodococcus / К.С. Панова, А.Н. Мухугдинова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. Пермь, 2012. - № 9. - С. 147-149.

4. Использование тонкослойной хроматографии для обнаружения кодеина, дротаверина и продуктов их биодеструкции в постферментационных культуральных средах родококков / А.Н. Плотников, А.Н. Мухугдинова, И.И. Мишенина, А.А. Поспелова, Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. Пермь, 2013. -№ 10. — С. 92-94.

5. Метаболиты биодеструкции дротаверина гидрохлорида / А.Н. Мухугдинова, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина // Сборник тезисов 17 Международной

Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2013.- С. 351-352.

6. Мухутдинова А.Н. Биодеструкция азотсодержащих фармполлютантов / А.Н. Мухутдинова, A.A. Селянинов, И.Б. Ившина // Материалы международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы развития биотехнологий". Екатеринбург, 2013.-С. 148-150.

7. Мухутдинова А.Н. Поиск штаммов-активных биодеструкторов фармполлютантов / А.Н. Мухутдинова, Е.А. Тюмина, A.A. Поспелова // Материалы Научно-практической конференции молодых ученых "Междисциплинарные исследования". Пермь, 2013. — Т. 1. - С. 47-50.

8. Обнаружение продуктов биологической деструкции дротаверина в культуральных жидкостях родококков методом тонкослойной хроматографии / И.И. Мишенина, А.Н. Плотников, Е.В. Вихарева, A.A. Поспелова, А.Н. Мухутдинова, М.И. Рычкова // Материалы XX Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва, 2013. - С. 387- 88.

9. Stable catalysts based on bioresources from the collection of alkanotrophs [Computer file] / I. Ivshina, M. Kuyukina, A. Krivoruchko, A. Elkin, E. Tarasova, A. Mukhutdinova //Abstracts of the FEMS Microbiology Congress 2013, Leipzig, 2013 - P. 1380.

10. Исследование продуктов биодеструкции дротаверина гидрохлорида ассоциациями актинобактерий рода Rhodococcas / А.Н. Плотников, А.Н Мухутдинова, Ю.Н. Карпенко, М.И. Рычкова, Ю.В. Епанешникова, Е.В. Вихарева // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. Пермь, 2014. - № 11.-С. 125-127.

11. Мухутдинова А.Н. Влияние условий культивирования Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 647 на биодеструкцию дротаверина гидрохлорида -фармацевтического экотоксиканта / А.Н. Мухутдинова // Вестник Пермского университета. Серия Биология. - 2014. - Вып. 2. - С. 39—42.

12. Мухутдинова А.Н. Влияние фармацевтического экотоксиканта дротаверина гидрохлорида на морфологические особенности клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647 / А.Н. Мухутдинова, И.О. Коршунова // Материалы VII Всероссийского с международным участием конгресса молодых биологов "Симбиоз Россия 2014". Екатеринбург, 2014. - С. 134-135.

Патент на изобретение

Ившина И.Б., Вихарева Е.В., Рычкова М.И., Мухутдинова А.Н., Карпенко Ю.Н. Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида. Патент РФ 2496866. Заявка от 23.05.2012. Зарег. в Госреестре изобр. Российской Федерации 27.10.2013.

Мухугдинова Анна Наилевна

БИОДЕСТРУКЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ 25.12.2014 Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13