Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков

Криворучко, Анастасия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков"

На правах рукописи

003448820 КРИВОРУЧКО Анастасия Владимировна

АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

03 00 07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 к окт 2008

Пермь-2008

003448820

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного университета и на базе лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Саралов Александр Иванович кандидат биологических наук Грязнова Диана Васильевна

Ведущая организация Казанский государственный университет, Казань

Защита состоится «б » HjDiVjÉjffl 2008 г в iJL часов на заседании диссертационного совета ДМ004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева.д 13 Факс (342)2446711

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http //www íegm ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Биологическая особенность актинобактерий рода Rhodococcus - способность к окислительной биотрансформации нефтяных углеводородов и ксенобиотиков Данное свойство наряду со многими другими, как то олигокарбо- и нитрофилия, выраженная степень гидрофобности клеточной стенки, наличие пилевидных тяжей и шишковидных выростов, способность синтезировать биосурфактанты, повышенная склонность к клеточной дифференциации, колонизации поверхностей, способность к клеточной агрегации и тд - определяет интерес к данной группе актинобактерий как объекту промышленного использования и перспективных технологий Реализация биотехнологического потенциала родококков требует разработки устойчивых биокатализаторов и обеспечения их гарантированной функциональной стабильности Одним из способов повышения стабильности биокатализаторов на основе живых бактериальных клеток является использование приема адсорбционной иммобилизации Закрепленные клетки обладают повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды (колебаниям температуры, концентрации ионов, влажности, антибиотикам, элиминации простейшими), повышенной каталитической активностью (Семченко и др , 2003, McLean et al, 1997, Obuekwe, Al-Muttawa, 2001, Shin et al, 2002, Resch et al, 2005) При этом адсорбционная иммобилизация является наиболее простым способом закрепления бактериальных клеток, не сопровождается стрессовым воздействием на клетки и имитирует их поведение в природе (Сироткин и др , 2007)

медицинском инструментарии) (Hoppe et al, 1997, Zhang et al, 2005, Landry et al, 2006) В последние годы появились единичные работы (Gertler et al, 2004), посвященные изучению механизмов адгезии родококков Исследования особенностей процесса адгезии клеток родококков приобретают особую актуальность еще и потому, что родококки сегодня признаются наряду с сульфатредуцирующими бактериями основными участниками биокоррозионных процессов, они обнаруживаются в составе коррозионно-активных биопленок, образующихся на металлических поверхностях (Азизов, 2007, Volkland et al, 2000)

Цель настоящей работы - детальное исследование процесса адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на твердых носителях

Основные задачи исследования

1 Исследовать адгезивные свойства родококков, принадлежащих к разным

видам

2 Исследовать кинетику и термодинамику процесса адсорбционной иммобилизации клеток родококков на поверхности минеральных и органических носителей Выявить факторы, определяющие максимальную величину адсорбции клеток родококков

3 Исследовать жизнеспособность и углеводородокисляющую активность иммобилизованных клеток родококков в отношении индивидуальных углеводородов и сырой нефти

4 В условиях модельного эксперимента оценить возможность использования иммобилизованных клеток родококков для биоремедиации нефтезагрязненной почвы

адгезии клеток родококков Впервые с использованием методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования исследованы кинетика и термодинамика процесса адсорбции родококков на поверхности твердых носителей Определены контролируемые условия монослойного распределения клеток родококков на носителе, обеспечивающие высокую каталитическую активность родококков в отношении н-гексадекана (104 мгл"1 ч'1) и сырой нефти (31 мгл"1 ч1)

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление об особенностях процесса адсорбционной иммобилизации алканотрофных родококков на твердых носителях В результате проведенных исследований отобраны штаммы ЛЛос/ососст« врр с максимальной (68-85% прикрепленных клеток) степенью адгезивной активности В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе древесных опилок, куриных перьев и отходов кожевенного производства Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и углеводородному субстрату впервые использован прием гидрофобизации носителей Экспериментально обосновано, что наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Л/го^ососсг«-биосурфактант (1 0,1) или олифа (1 0,2) Определены оптимальные величины площади поверхности и гидрофобности носителей, обеспечивающие их максимальную (38 мг сухих клеток/г носителя) адсорбционную емкость На основе иммобилизованных на модифицированном опиле клеток родококков получен эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой

углеводородокисляющей активностью закрепленных родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев и возможностью повторного использования На основе УФ-спектрофотометрии разработан экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях

Основные положения, выносимые на защиту

1 Исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью Строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивной активностью не выявляется

Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования

2 Использование приема гидрофобизации поверхности органических носителей способствует существенному увеличению их адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков Наиболее эффективными гидрофобизующими агентами являются ДЛо^ососст«-биосурфактант и олифа

3 Клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных опилках, характеризуются максимальной углеводородокисляющей активностью

4 Для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы целесообразно применение клеток родококков, закрепленных на гидрофобизованном древесном опиле

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2004, II Межрегиональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 2007, I и III Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005,2007, II FEMS Congress of European Microbiologists, Мадрид, Испания, 2006, I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008", Казань, 2008, III Международной конференции "Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал", Пермь-Н Новгород-Пермь, 2008

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них четыре в рецензируемых научных журналах

Объем и структура работы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 27 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 226 наименований, в том числе 73 на русском и 153 на английском языках

Связь работы с крупными программами. Работа выполнена на базе кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Является частью исследований, проводимых в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5 28, номер госрегистрации 01 9 70 005279), а также в рамках ФЦНТП РФ \\Ii ССЛСДО ¡3 алия и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие» Исследования поддержаны грантами РФФИ № 04-04-97518-р_офи, INTAS 01-2151 и NATO ESP NR NRCLG 982051

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рабочая коллекция, условия культивирования родококков. В работе использовали культуры родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www iegm ru/iegmcol/), принадлежащих к видам Rhodococcus erythropohs (2 штамма), "R longus" (2 штамма), R opacus (2 штамма), R rhodochrous (2 штамма), R ruber (2 штамма), а также 142 мутантных клона R ruber ИЭГМ 231, полученных методом неспецифического in vitro Тп5 мутагенеза Мутагенез бактериальных клеток проводили с использованием транспозомного комплекса EZ TN™ <KAN-2>Tnp Transposome™ (Epicentre Technologies, США) методом электропорации Присутствие Тп5 транспозона в ДНК клеток родококков подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции Родококки выращивали на мясопептонном агаре (МПА), в мясопептонном бульоне (МПБ) или в минеральной среде К (Каталог штаммов , 1994) с добавлением н-гексадекана или смеси полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), состоящей из антрацена, аценафтена, нафталина и фенантрена, в качестве единственного источника углерода и энергии при 28°С в течение 28-120 ч Культивирование родококков в жидких средах осуществляли при перемешивании (160 об/мин)

Исследование адгезивных свойств клеток родококков. Адгезивную активность клеток родококков изучали с использованием 96-луночных полистирольных микропланшетов (Медполимер, Санкт-Петербург) по окрашиванию прикрепленных клеток кристаллическим фиолетовым (Huber et al, 2001) Использовали покоящиеся (суспендированные в натрий-фосфатном буфере) или растущие (суспендированные в питательной среде) клетки Степень гидрофобности, заряд и величину свободной поверхностной энергии клеток родококков определяли методом MATS (Microbial adhesion to solvents) по величине адгезии клеток к органическим субстратам н-гексану, н-декану, к-гексадекану, этилацетату, диэтиловому эфиру, хлороформу (Bellone-Fontaine et al, 1996) Влияние ЛАо^ососсих-биосурфактанта на адгезионный процесс изучали с использованием очищенного препарата биосурфактанта (Kuyukma et al, 2001), выделенного из клеток R ruber ИЭГМ 231, выращенных в присутствии и-додекана ЛАос/ососсчи-биосурфактант наносили на поверхность лунок планшета в виде раствора lxlO'-lxlO6 нг/мл изопропанола Эмульгирующую активность бактериальных культур оценивали по индексу эмульгирования н-гексадекана, который регистрировали через 6 мин, 1 ч, 24 ч и далее через каждые сутки в течение 1 недели

Исследование кинетики и термодинамики процесса адсорбции клеток родококков. В качестве носителей использовали углеродный материал на основе каталитического волокнистого углерода (КВУ), материалы на основе керамзита (Институт катализа имени Г К Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия), целлюлозосодержащие материалы на основе кукурузных початков (компания "Hodmarket", Сегед, Венгрия) и древесных опилок, кератинсодержащие материалы на основе куриных перьев и коллагенсодержащие материалы на основе отходов кожевенного производства (Институт элементоорганических соединений имени АН Несмеянова РАН, Москва, Россия) Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и углеводородному субстрату использовали прием гидрофобизации носителей С этой целью поверхность керамзита обрабатывали с помощью графитизированного углерода (Коваленко и др, 2004), органические носители - с помощью н-гексадекана, силиконовой эмульсии, Лйо</ососс1«-биосурфактанта или олифы в объемном соотношении носителя и

олифы 1 2,0, 1 1,5, 1 0,2 или 1 0,1 Носители сравнивали между собой по величине сорбционной влажности, водопоглощающей способности и относительной гидрофобности, которую определяли по расположению носителей в системе н-гексадекан/вода

Иммобилизацию клеток родококков проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 50 мл клеточной суспензии и 4 мл носителя, на орбитальном шейкере при 130 об/мин в течение 1-10 сут Иммобилизацию на КВУ проводили в статических условиях Процесс адсорбции контролировали нефелометрически при 600 нм с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США) Десорбцию иммобилизованных клеток проводили 1М NaCl Для исследования кинетики и термодинамики адсорбционного процесса использовали методы профилометрии высокого разрешения с помощью интерференционного микроскопа New View 5000 (Zygo, США) и инфракрасного сканирования с помощью инфракрасной камеры CEDIP Silver 450М (CEDIP Infrared Systems, Франция) Изменение свободной энергии Гиббса при взаимодействии клеток родококков с поверхностью носителей определяли методом прикрепленной капли с использованием дистиллированной воды и н-гексадекана в качестве стандартных жидкостей при измерении краевых углов смачивания (Bos et al, 1999, Elkin et al, 1999) Разработку математической модели адсорбции клеток родококков при различных скоростях перемешивания клеток и частиц носителя проводили на базе кафедры теоретической механики Пермского государственного технического университета (зав кафедры, д т н Ю И Няшин)

Сравнительные исследования жизнеспособности и функциональной активности свободных и иммобилизованных клеток родококков. Численность жизнеспособных клеток родококков определяли микрометодом точечных высевов (Веслополова, 1995) и по окрашиванию иодонитротетразолием фиолетовым (Wrenn, Venosa, 1996) Углеводородокисляющую активность клеток родококков оценивали в модельных экспериментах по биодеградации н-гексадекана, модельной и сырой нефти (Осинское месторождение, скв 499, р20 = 0,8896 г/см3) В качестве модельной нефти использовали смесь индивидуальных углеводородов (н-декан, н- ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-нонадекан - 11,90 вес % каждый, пристан - 3,96 вес %, антрацен, аценафтен,

нафталин, фенантрен - 2,68 вес % каждый) Содержание остаточных углеводородов определяли весовым методом после экстракции хлороформом, ПАУ - экспрессным методом, разработанным на основе использования УФ-спектрофотометрии Структурный анализ экстрагированных нефтепродуктов проводили с применением газового хроматографа Agilent 6890N, снабженного квадрупольном масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973N и кварцевой колонкой НР-5 MS SN US 1518974-1 (Agilent Technologies, США)

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в 312-кратной повторности Математическую обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерных программ Excel 2003 и Statistica v 60 Определяли тип распределения, рассчитывали медиану, средние значения и стандартные отклонения Для сравнения групп использовали непарные критерии Стьюдента, Крускала-Уоллиса, Ньюмена-Кейлса и F-критерий Связь между переменными определяли с помощью коэффициентов корреляции Пирсона или Спирмена в зависимости от типа распределения (Лакин, 1990, Гланц, 1999) РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus. В табл 1 представлены результаты исследований адгезионных характеристик различных представителей родококков По нашим данным, исследуемые бактериальные штаммы обладают различной адгезивной активностью в отношении гидрофобной твердой поверхности При этом строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивными свойствами не выявлено Установлено, что штаммы родококков в пределах одного вида по показателю адгезии отличаются друг от друга в 1,2-5,6 раза Большинство культур обладает невысокой адгезивной активностью от 11,4 до 29,6% прикрепленных клеток Наиболее высокий уровень адгезии 68,1 и 84,7%, соответственно, выявлен в отношении двух штаммов R erythropolis ИЭГМ 271 и R ruber ИЭГМ 231

В сравнительных исследованиях адгезивной активности растущих и покоящихся клеток родококков, выращенных на разных средах, установлено влияние условий культивирования на адгезивную способность родококков Выявленный эффект при этом наблюдается не у всех используемых в работе культур, а лишь у трех штаммов R erythropolis ИЭГМ 271, R rhodochrous

Таблица 1

Адгезивная активность исследуемых штаммов родококков

Штамм Адгезивная активность, % прикрепленных клеток

R erythropolis ИЭГМ 271 84,7 ± 20,5

R erythropolis ИЭГМ 708 11,4 ±4,7

"R longus" ИЭГМ 32 58,1 ± 10,5

"R longus " ИЭГМ 68 12,9 ±3,6

R opacus ИЭГМ 56 42,1 ±5,5

R opacus ИЭГМ 60 12,3 ± 3,2

R rhodochrous ИЭГМ 66 25,0 ± 5,5

R rhodochrous ИЭГМ 608 29,6 ±6,7

R ruber ИЭГМ 231 68,1 ±22,5

R ruber ИЭГМ 327 14,2 ±3,2

Примечание Адгезивную активность клеток родококков изучали с использованием 96-луночных полистирольных микропланшетов по окрашиванию прикрепленных клеток кристаллическим фиолетовым

ИЭГМ 608 и R ruber ИЭГМ 231 Как видно из рис 1, прединкубация родококков в присутствии н-гексадекана способствует увеличению их адгезивной активности в 3-6 раз по сравнению с таковой родококков, выращенных на МПА, растущие в МПБ клетки в 5-13 раз лучше прикрепляются к твердой поверхности, чем покоящиеся

Для более детального изучения адгезивных свойств клеток родококков получена библиотека Тп5 мутантов, обладающих различной адгезивной и эмульгирующей активностью Установлено, что мутантные клоны с выраженной эмульгирующей активностью и, наоборот, потерявшие способность к эмульгированию, характеризуются повышенной (в 1,5-3,3 раза) адгезивной активностью по сравнению с таковой родительского штамма (рис. 2) Известно (Ivshma et al, 1998), что эмульгирующая активность родококков обусловлена их способностью синтезировать биосурфактанты При этом Rhodococcus-биосурфактанты способствуют изменению физико-химических свойств клеточной поверхности, что, в свою очередь, сопровождается изменением адгезивности бактериальных клеток

о о

а <

40 -

20 -

Л. егуЛгороИз ИЭГМ 271

Я. г1ю<1ос11гои$ ИЭГМ 608

Я. гиЬег ИЭГМ 231

Рис. 1. Адгезивная активность растущих и покоящихся клеток родококков.

А - растущие клетки родококков в МПБ; Б - покоящиеся клетки родококков, предварительно выращенные на МПА, В - покоящиеся клетки родококков, предварительно выращенные на минеральной среде в присутствии н-гексадекана.

Адгезивная активность, % Число Тп5 мутантов

40,8-73,4 4

9,9-94,2 22

47,5-59,6 3

47,5-92,7 3

27,7 Исходный

штамм

75 100 125 Время, ч

Рис. 2. Адгезивная и эмульгирующая активности Тп5 мутантов.

'Динамика индекса эмульгирования н-гексадекана данными Тп5 мутантами статистически достоверно отличается от таковой исходного штамма при р<0,05.

По нашим данным, в экспериментах с нанесением Шо<1ососси$-биосурфактанта на поверхность твердого субстрата установлено, что присутствие даже незначительных (10 нг/мл) его количеств способствует увеличению числа закрепленных клеток родококков в 1,8-2,3 раза (рис. 3).

Концентрация КНойососсш -биосурфактанта, Щнг/мл]

Рис. 3. Влияние ШюЛососсиз-биосурфактанта на адгезию клеток родококков.

В табл. 2 приведены значения коэффициентов корреляции и их достоверность между величинами адгезии клеток родококков к твердой поверхности и МАТБ-субстратам. По нашим данным, не наблюдается статистически достоверной корреляции между исследуемыми показателями адгезии. Это свидетельствует о том, что адгезивные свойства клеток родококков не

Таблица 2.

Коэффициенты корреляции между величинами адгезии клеток родококков к полистиролу и МАТ8-субстратам

МАТЭ-субстрат Г™, мДж/м2 у", мДж/м2 у", мДж/м2 К-Сиирмена Р

н-Гексан 18,4 0,0 0,0 0,22 0,45

Диэтиловый эфир 16,7 0,0 16,4 0,28 0,32

н-Декан 23,9 0,0 0,0 0,36 0,21

Этилацетат 23,9 0,0 19,4 0,06 0,85

н-Гексадекан 27,7 0,0 0,0 0,42 0,14

Хлороформ 27,2 3,8 0,0 0,37 0,20

Примечание. улв, у' - неполярный и полярный (обусловленные наличием "+" и "-" заряженных групп) компоненты поверхностной свободной энергии (цит. по Ве11опе-Роп1ате е/ а/., 1996); И-Спирмска- коэффициент корреляции Спирмена (р<0,05).

зависят от интегральных характеристик клеточной поверхности, таких как степень гидрофобности и заряд- Очевидно, взаимодействие клеток родококков с твердым субстратом происходит при участии не всей поверхности клеточной стенки, а лишь на ее отдельных участках, которые обычно являются характерными выростами, пилями, фибриллами (Ившина и др., 1982; Глазачева и др., 1990). Эти участки содержат адгезины, обладают повышенной гидрофобностью, низкой величиной свободной поверхностной энергии и способны легко преодолевать энергетический барьер при сближении с субстратом (Bos et al., 1999).

Кинетика и термодинамика процесса адсорбции клеток родококков. В результате изучения кинетики адсорбции клеток родококков установлена зависимость между исследуемыми показателями данного процесса и природой используемых носителей. Как видно из рис. 4, адсорбция клеток родококков на нативных носителях завершается через 1-3 сут, тогда как на гидрофобизованных -через 4-6 сут. Однако важно отметить, что использование приема гидрофобизации способствует значительному (от 1,3 до 43,0 раз) увеличению адсорбционной емкости носителей. Исключение составляют лишь носители на основе древесных опилок, обработанных олифой в объемном соотношении древесных опилок и

1,200 1,000 0,800

S п:

о 0,600 \о 1

0,400 0,200 0,000

Рис. 4. Кинетика процесса адсорбции клеток родококков.

Носители на основе: 1 - КВУ; 2 - кукурузных початков; 3 - древесных опилок; 4 -куриных перьев; 5- кожевенных отходов; 6-9 - древесных опилок, гидрофобизованных олифой 1:1,5 (6) или 1:0,2 (7), Rhodococcus-биосурфактантом (8), н-гексадеканом (9); 10 -куриных перьев, гидрофобизованных силиконовой эмульсией; 11 - кожевенных отходов, гидрофобизованных силиконовой эмульсией.

Время, сут

Негидрофобизованные носители

Гидрофобизованные носители

олифы 1:1,5 или 1:2,0, на поверхности которых практически не происходит адсорбции бактериальных клеток.

Известно (Козляк и др., 1991; Самонин, Еликова, 2004), что основным фактором эффективности адсорбционного процесса является величина удельной поверхности носителя, доступная для закрепления бактериальных клеток. В связи с этим мы проводили сканирование поверхности целлюлозосодержащих носителей в электронном микроскопе. На электронограммах, представленных на рис. 5, можно заметить, что избыточная гидрофобизация олифой приводит к сглаживанию рельефа поверхности древесных опилок, что ведет к уменьшению площади поверхности и, соответственно, к снижению величины адсорбционной емкости носителя.

Древесные опилки Древесные опилки. Древесные опилки,

гидрофобизованные гидрофобизованные

олифой 1:2,0 олифой 1:0,2

Рис. 5. Поверхность целлюлозосодержащих носителей в электронном сканирующем микроскопе.

Электронограммы выполнены на базе Напиер университета, Эдинбург, Великобритания.

В табл. 3 приведены величины адсорбционной емкости испытуемых носителей в зависимости от их физико-химических свойств. По нашим данным, наиболее высокой адсорбционной емкостью характеризуются органические носители на основе древесных опилок, куриных перьев и кожевенных отходов, гидрофобизованных н-гексадеканом, силиконовой эмульсией, Ююс1ососст-биосурфактантом или олифой в соотношении 1:0,2, сорбирующие от 60 до 90% клеток родококков. При этом выявлена четкая положительная (11=0,77, /7=0,04)

Таблица 3

Адсорбционная емкость и физико-химические свойства носителей клеток родококков

Материал носителя Адсорбционная емкость, % Сорбционная влажность, г Н20/г носителя Водопоглощаю-щая способность, г НгО/г носителя Расположение в системе С1 б/ вода АО, мДж/м2

Куриные перья 1,0 0,27±0,02 н о С1б/Вода -7,5

Древесные опилки + О 1 2,0 5,1* 0,12±0,02* 0,39±0,02* С16 -24,8*

Керамзит 14,3 н о н о Вода -1,9

Керамзит со слоем графитизированного угля (1,56%) 18,7* н о н о Вода н о

Кукурузные початки 19,4 0,20±0,01 нд Вода -11,0

Древесные опилки + 0 1 1,5 19,4* 0,10±0,02* 0,28±0,03* С16 -25,0*

КВУ 27,0 н о н о Вода н о

Кожевенные отходы 32,9 н о н о Вода н о

Древесные опилки 46,8 0,34±0,02 2,55±0,15 Вода -12,9

Древесные опилки + О 1 ОД 49,4 0,33±0,02 1,60±0,10* Сгб/Вода -10,6

Куриные перья + СЭ 62,7* 0,26±0,01 н о С1б/Вода -10,5

Древесные опилки + БС 67,0* 0,78±0,02* 1,54±0,02* Ск/Вода -14,2

Древесные опилки + О 1 0,2 79,4* 0,35±0,01 1,24±0,09* С)6/Вода -12,5

Древесные опилки + с16 86,1* 0,31 ±0,02 1,68±0,12* С]б/Вода -13,2

Куриные перья + О 1 0,2 86,2* 0,30±0,02 н о С1б/Вода -15,8*

Древесные опилки + СЭ 90,8* н о н о С1б/Вода н о

Кожевенные отходы + СЭ 93,1* н о н о Вода н о

Примечание С16 - н-гексадекан, О - олифа, БС - Л/юс/ососсги-биосурфактант, СЭ - силиконовая эмульсия, Дй - изменение энергии Гиббса, н о - не определено, достоверно при р<0,05 от негидрофобизованного носителя

корреляция между адсорбционной емкостью и сорбционной влажностью носителей.

В результате использования сугубо физических методов исследования -профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования - получены новые данные об адсорбции и активности адсорбированных клеток родококков. В частности, при использовании интерференционного микроскопа обнаружены различия в расположении клеток на поверхности носителей, обработанных различными гидрофобизаторами. Так, на поверхности древесных опилок, обработанных н-гексадеканом, клетки родококков располагаются в виде кластеров, в отличие от остальных носителей, на поверхности которых клетки располагаются равномерно на всей площади (рис. 6).

Древесные опилки с иммобилизованными клетками родококков

•Р

Древесные опилки, обработанные н-гексадеканом, с иммобилизованными клетками родококков

' А,"

1Ш4

Древесные опилки, обработанные олифой 1:0,2, с иммобилизованными клетками родококков

Древесные опилки, обработанные олифой 1:0,2 (без клеток)

Рис. 6. Поверхность органических носителей в интерференционном микроскопе

(Ув. х 4000).

Стрелками указаны иммобилизованные клетки родококков.

На рис. 7 представлены результаты инфракрасного сканирования поверхности носителей на основе древесных опилок. Как видно из представленных данных, количество клеток родококков, при котором наблюдается их монослойное распределение на поверхности твердых носителей, составляет от 1,1-107 до 1,9-107 КОЕ/см2 носителя. При этом присутствие клеток на носителе создает дополнительный источник тепла (А1, °С), по величине которого судят об их активности и, как следствие, эффективности способа предварительной подготовки носителя. По нашим данным, гидрофобизация поверхности древесных опилок Шюскэсосст-биосурфактантом или олифой в соотношении 1:0,2 создает наиболее благоприятные условия для закрепления клеток родококков, обеспечивая их высокую метаболическую активность, тогда как обработка н-гексадеканом приводит к 23%-ному снижению активности.

№ п/п Способ обработки поверхности носителя Л1:, °С Число живых клеток родококков/см2 носителя

1 Гидрофобизация олифой 1:0,2 3,14±0,73 1,4х107

2 Гидрофобизация ЯЬос1ососст-биосурфактантом 2,97±0,61 1,1 х107

3 Гидрофобизация н-гексадеканом 2,29±0,72* 1,9х107

4 Гидрофобизация олифой 1:1,5 1,38±0,53* 0,4x107*

Рис. 7. Поверхность носителей на основе древесных опилок в инфракрасной камере.

А - поверхность носителя без клеток родококков; Б - поверхность носителя с иммобилизованными клетками родококков; достоверно при /?<0,05 от остальных значений.

На основании данных, полученных в экспериментах по математическому моделированию, построена кинетическая модель процесса адсорбции клеток родококков при различных скоростях перемешивания бактериальных клеток и частиц носителя:

п. (О=т-рттттт-^^ М'Т« ^+ехР( 'Т' ^+1'

(к{<о) - (К(со) -1) ехр(-I / 7} (а>))\

где П;(() - концентрация свободных клеток родококков в суспензии в момент времени I, КОЕ/мл, п!0 - исходная концентрация клеток в суспензии, КОЕ/мл, со -круговая частота, рад/мин, Т, - общее время иммобилизации, ч, Тл - общее время десорбции, ч, К - число клеток, образующихся в процессе фрагментации, 7} -время фрагментации, ч С помощью разработанной модели подобраны оптимальные режимы перемешивания с использованием круговых частот от 2л 110 до 2л 160 рад/мин, которые обеспечивают адсорбционную емкость до 100% прикрепленных клеток родококков и не влияют на процесс фрагментации бактериальных клеток (К<1,2)

Жизнеспособность и функциональная активность иммобилизованных клеток родококков. В табл 5 представлены результаты сравнительных экспериментов с использованием свободных и иммобилизованных клеток родококков По нашим данным, в иммобилизованном состоянии родококки сохраняют углеводородокисляющую активность При этом они в 1,6-6,0 раз более активны, чем свободные клетки Как видно из табл 5, убыль углеводорода из среды культивирования родококков происходит не только за счет окисления его иммобилизованными клетками, но и сорбции материалом носителя

При исследовании динамики процесса биодеградации «-гексадекана клетками родококков обнаружено, что иммобилизация способствует стабилизации их функциональной активности Так, адсорбированные родококки дольше сохраняют высокую углеводородокисляющую активность (на протяжении всего периода эксперимента), тогда как процесс деградации углеводорода свободными клетками начинает замедляться на четвертые сутки эксперимента (рис 8)

На рис 9 представлены результаты экспериментов по биодеградации н-гексадекана иммобилизованными клетками родококков, выращенными в различных питательных средах По нашим данным, предварительное выращивание родококков в присутствии н-гексадекана (с целью индукции оксигеназ) и последующая их иммобилизация на носителях способствует 2-х-кратному

Таблица 5

Убыль //-гексадекана из среды культивирования родококков

Вариант опыта Убыль С,6, % Адсорбция С|б носителем, % Активность клеток, мг окисленного С]б/мг АСВ клеток

Суспензия свободных клеток родококков 16,4 — 5±1

Клетки, иммобилизованные на кожевенные отходы 12,9* н д 19±3*

Клетки, иммобилизованные 20,7 н д И ±2*

на кожевенные отходы + СЭ

Клетки, иммобилизованные на древесные опилки + СЭ 34,4* 44,0 16±0*

Клетки, иммобилизованные на древесные опилки + БС 34,5* 23,4 6±1

Клетки, иммобилизованные на древесные опилки + 01 0,1 41,0* 8,5 19±Г

Клетки, иммобилизованные на кукурузные початки 52,6* н д 30±4*

Клетки, иммобилизованные на древесные опилки + О 1 0,2 65,5* 22,0 11±2*

Клетки, иммобилизованные на куриные перья 65,5* 48,3 30±0*

Клетки, иммобилизованные на древесные опилки 73,3* 8,5 20±2*

Клетки, иммобилизованные на куриные перья + СЭ 86,2* 75,9 6±0

Примечание С16 - н-гексадекан, О - олифа, БС - ЛйоЛ?сосси.у-биосурфактант, СЭ - силиконовая эмульсия, н д - ниже детектируемого уровня, достоверно при р<0,05 от свободных клеток

Время, сут

Рис 8 Динамика биодеградации н-гексадекана клетками родококков

А - свободные клетки, Б - иммобилизованные клетки, достоверно при р<0,05

увеличению скорости процесса биодеградации н-гексадекана иммобилизованными клетками, при этом количество клеток на носителе не изменяется. Родококки, иммобилизованные на гидрофобизованных олифой (1:0,2) древесных опилках, проявляют максимальную (104 мг гексадекана-л"'-ч"') углеводородокисляющую активность.

70 120

12 3 12 3

Носители

Рис. 9. Биодеградации «-гексадекана иммобилизованными клетками родококков.

Среда культивирования: А - мясопептонный бульон; Б - минеральная среда с н-гексадеканом. Носители: 1 - древесные опилки, гидрофобизованные н-гексадеканом; 2 -древесные опилки, гидрофобизованные олифой 1:0,2; 3 - древесные опилки, гидрофобизованные олифой 1:1,5; достоверно при р<0,05.

В экспериментах с использованием модельной и сырой нефти установлено, что иммобилизованные клетки родококков в 2 раза быстрее окисляют углеводороды с длиной цепи 12-19 атомов углерода и ПАУ по сравнению со свободными клетками, и в отличие от свободных клеток иммобилизованные клетки родококков способны к более эффективному (до 66%) окислению полиароматического углеводорода антрацена (рис. 10).

г 14 «

О «

ё 10

I <Н

Рис.

я 4 -я о

* 20

0 2 3 6

Время, нед

10. Динамика биодеградации нефтяных углеводородов клетками

родококков в условиях опыта с модельной нефтью.

А - свободные клетки; Б - иммобилизованные клетки; достоверно при р<0,05.

Модельные эксперименты по биоремедиации нефтезагрязнениой почвы с использованием иммобилизованных клеток родококков. По нашим данным, использование иммобилизованных клеток родококков способствует 65%-ному удалению нефти из почвы в течение 6 недель, что оказывается на 23% эффективнее, чем в контрольной почве (рис. 11).

На рис. 12 показана динамика биодеградации ПАУ иммобилизованными клетками родококков. Следует отметить, что для детекции ПАУ в почве применялся модифированный экспресс-метод на основе УФ-спектрофотометрии, результаты которого показали полное совпадение с данными хроматомасс-спектрометрии. С помощью использованного метода установлено, что применение иммобилизованных родококков эффективно для очистки почвы с высоким (500 мг ПАУ/г почвы) уровнем загрязнения ПАУ и способствует 40%-ной деградации данных приоритетных загрязнителей в течение 7 месяцев.

600

с 500

5 400

< зоо

3 200

е-

а з: 100

у =-ода+ 498,61 R2= 0,71,Í> =0,04

О 50 100 150 200

Время, суг

Рис. 12. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов с использованием иммобилизованных клеток

родококков в почве.

Вариант опыта

Рис. 11. Изменение концентрации нефзи в почве после 6 недель биоремедиации.

1 - Исходная концентрация; 2 -контроль (почва без внесения клеток родококков); 3 - почва с иммобилизованными клетками родококков.

В табл. 6 представлены основные характеристики биокатализатора на основе иммобилизованных клеток родококков, разработанного нами для ускорения процесса деградации нефтяных углеводородов в почве. Полученный биокатализатор характеризуется высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных клеток родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев, возможностью повторного использования и отвечает основным требованиям промышленной биотехнологии. При этом исходным сырьем для его изготовления является относительно дешевый, доступный материал, представляющий собой отходы деревообрабатывающей промышленности. В качестве гидрофобизаторов древесных опилок рекомендуется использовать ЛЛо^ососсм^-биосурфактант - агент с высокой степенью экологической безопасности, либо олифу в соотношении 1:0,2, обработка которой обеспечивает максимальную углеводородокисляющую активность биокатализатора.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучены особенности процесса адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков. В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе древесных опилок, куриных перьев и отходов кожевенного производства. Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и

Таблица 6

Характеристика биокатализатора, полученного на основе иммобилизованных клеток

родококков

Параметр Носитель обработан олифой 1 0,2 Носитель обработан биосурфактантом

Материал носителя Древесные опилки

Диаметр частиц биокатализатора, мм 1-3

Клеточная нагрузка на носителе, мг АСВ кпеток/г носителя 38 29

Водопоглощающая способность, г НгО/г носителя 1,2±0,09 1,5±0,02

Сорбционная влажность, г паров НгО/г носителя 0,3±0,01 0,3±0,03

Каталитическая активность в отношении, мг окисленного субстрата/л/ч

н-гексадекана 104 43

сырой нефти 31 —

Продолжительность хранения без потери функциональной активности, мес 8

Количество циклов повторного использования 2

углеводородному субстрату впервые использован прием гидрофобизации носителей С помощью Тп5 мутантов исследованы адгезионные характеристики родококков С использованием методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования изучены кинетика и термодинамика адсорбции родококков на поверхности твердых носителей Показано, что адгезивные свойства клеток родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования Отобраны штаммы родококков с максимальной степенью адгезивной активности Выявлено стимулирующее влияние Лйог/ососом-биосурфактанта на процесс адгезии клеток родококков Установлены оптимальные величины площади поверхности и гидрофобности носителей, обусловливающие их максимальную адсорбционную емкость Определены контролируемые условия монослойного распределения клеток родококков на носителе, обеспечивающие высокую каталитическую активность родококков в отношении н-гексадекана и сырой нефти На основе иммобилизованных на модифицированном опиле клеток родококков получен эффективный катализатор процесса биодеградации нефтяных углеводородов

25 Выводы

1 Установлено, что исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования

2 Показано, что прием гидрофобизация поверхности органических носителей способствует существенному (от 1,3 до 43,0 раз) увеличению адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков Наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Rhodococcus-биосурфактант (1 0,1) и ошфа (1 0,2)

3 Впервые обоснована возможность использования методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования для контролирования монослойного распределения клеток родококков на поверхности твердых носителей

4 Установлено, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных опилках, характеризуются максимальной (104 мг гексадекана л"1 ч"1) углеводородокисляющей активностью

5 Обоснована целесообразность применения иммобилизованных клеток родококков для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной лочвы В модельных экспериментах с использованием иммобилизованных клеток родококков достигнута 65%-ная степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение 6 недель биоремедиации

6 На основе клеток R ruber ИЭГМ 231, иммобилизованных на модифицированном древесном опиле, разработан эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных клеток родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев, возможностью повторного использования На основе УФ-спектрофотометрии разработан и апробирован экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Криворучко А В Поиск эффективных способов иммобилизации алканотрофных родококков на минеральных и органических носителях//Матер II междунар конф "Экология и научно-технический прогресс" - Пермь, 2003 -С 297-302

2 Рычкова M И, Куюкина M С , Криворучко А В , Ившина И Б Сравнительная характеристика нефтедеградирующих свойств биопрепаратов микробного происхождения//Вестник Пермского университета Серия Биология -2004 -Вып 2-С 142-147

3 Криворучко А В Изучение углеводородокисляющей активности иммобилизованных клеток актинобактерий рода Rhodococcusl/Cб трудов молодых ученых ИЭГМ УрО РАН "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" - Екатеринбург-Пермь, 2004 - С 102-110

4 Криворучко А В , Куюкина M С , Ившина И Б Сравнительное изучение углеводородокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток актинобактерий рода RhodococcusZ/Матер II Регион конф "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" - Саратов, 2004 - С 44

5 Криворучко А В , Ившина И Б Эффективные способы поверхностной иммобилизации клеток алканотрофных родококков//Матер I Всерос молодежной школы-конф "Актуальные аспекты современной микробиологии" - Москва, 2005 -С 93-94

6 Криворучко А В , Куюкина M С , Ившина И Б Изучение процесса биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными клетками родококков//Труды II Всерос конф "Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах" - Краснодар, 2005 - С 73-75

7 Krivoruchko А V , Ivshina I В , Kuyukina M S , Podorozhko E A , Lozinsky VI, Philp J С Immobilized Rhodococcus cells as new bioaugmentation agents for crude oil-contaminated soil bioremedmtion//Abstracts of 2nd FEMS Congress of European Microbiologists - Spam, Madrid, 2006 -P 120

8 Куюкина M С , Ившина И Б , Осипенко M А , Няшин Ю И , Тюленева А H, Серебрянникова M К, Криворучко А В Кинетическая модель процесса

иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе//Рос журн биомех -2007 -Т 11, №2 - С 79-87

9 Ившина И Б , Куюкина М С , Рычкова М И , Криворучко А В , Каннингхэм К Дж, Пешкур Т А, Андерсон П Экологически безопасная технология биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов//Матер IV Междунар конф "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности" - Санкт-Петербург, 2007 - С 94-95

10 Криворучко А В Особенности процесса иммобилизации клеток родококков на твердых носителях//Матер III Всерос молодежной школы-конф "Актуальные аспекты современной микробиологии" - Москва, 2007 - С 55-57

11 Криворучко А В , Ившина И Б, Куюкина М С Эффективный биокатализатор процесса окисления нефтяных углеводородов//Матер Межрегион конф "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" -Пермь, 2007 -С 68-70

12 Kuyukina М , Ivshma I, Knvoruchko А , Podorozhko Е , Lozmsky V, Cunningham С , Philp J Novel biocatalysts based on immobilized Rhodococcus cells for oil-contaminated water punfication//J Biotechnol -2007 -V 131 -P 99-100

13 Криворучко А В , Рубцова E В , Серебренникова M К, Куюкина М С, Ившина И Б Исследование адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus с помощью Тп5 мутагенеза//Ученые записки КГУ Серия Естественные науки -Казань, 2008 -Т 150, №4 -стр 143-147

14 Рубцова Е В , Криворучко А В , Куюкина М С , Ившина И Б Адгезивные свойства коллекционных культур Rhodococcus spp//Матер VI Междунар конф "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" -Минск, 2008 -Т 2 - С 259-261

15 PodorozhkoЕ А, LozinskyVI, IvshinalB, KuyukinaMS, Knvoruchko A V , Philp J С , Cunningham С J Hydrophobised sawdust as a earner for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing bacterium Rhodococcus ruberllBiores Technol -2008 -V99,№ 6 - P 2001-2008

КРИВОРУЧКО Анастасия Владимировна

АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

Автореферат

Подписано в печать 06 10 2008 Тираж 120 экз Уел печ л 1,0 Формат 60x84/16 Набор компьютерный Заказ № 746/2008

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Криворучко, Анастасия Владимировна

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Адсорбционная иммобилизация клеток микроорганизмов: 10 кинетика процесса, механизмы, практическое применение

1.1. Понятие иммобилизации. Физиологические особенности 10 иммобилизованных клеток микроорганизмов

1.2. Иммобилизация в биотехнологии. Биокатализаторы на основе 14 иммобилизованных клеток микроорганизмов

1.3. Способы иммобилизации живых микробных клеток

1.4. Механизмы адсорбционной иммобилизации живых микробных 31 клеток

1.5. Состояние проблемы адсорбционной иммобилизации в 46 отношении углеводородокисляющих актинобактерий рода Якос^ососсиз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Рабочая коллекция, условия культивирования родококков

2.2. Определение адгезивной активности коллекционных культур 58 родококков

2.3. Получение мутантов для изучения адгезивной активности клеток 59 родококков

2.4. Оценка влияния Шюс1ососсш-биосурфактанта на адсорбцию 61 родококков

2.5. Характеристика используемых носителей

2.6. Кинетика адсорбции клеток родококков. Оценка адсорбционной 64 емкости носителей

2.7. Математическое моделирование процесса адсорбции

2.8. Использование физических и физико-химических методов

2.9. Оценка жизнеспособности и углеводородокисляющей активности 70 свободных и иммобилизованных клеток родококков

2.10. Модельные эксперименты по биоремедиации нефтезагрязненной 71 почвы с использованием иммобилизованных родококков

2.11. Определение содержания остаточных нефтяных углеводородов

2.12. Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. Характеристика адгезивных свойств актинобактерий 75 рода Шгойососст

Глава 4. Взаимодействие клеток родококков с поверхностью 87 твердых носителей

Глава 5. Жизнеспособность и функциональная активность 110 иммобилизованных клеток родококков

Глава 6. Модельные эксперименты по биоремедиации 128 нефтезагрязненной почвы с использованием иммобилизованных родококков

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков"

Актуальность проблемы. Биологическая особенность актинобактерий рода Rhodococcus — способность к окислительной биотрансформации нефтяных углеводородов и ксенобиотиков. Данное свойство наряду со многими другими, как то: олигокарбо- и нитрофилия, выраженная степень гидрофобности клеточной стенки, наличие пилевидных тяжей и шишковидных выростов, способность синтезировать биосурфактанты, повышенная склонность к клеточной дифференциации, колонизации поверхностей, способность к клеточной агрегации и т. д. - определяет интерес к данной группе актинобактерий как объекту промышленного использования и перспективных технологий. Реализация биотехнологического потенциала родококков требует разработки устойчивых биокатализаторов и обеспечения их гарантированной функциональной стабильности. Одним из способов повышения стабильности биокатализаторов на основе живых бактериальных клеток является использование приема адсорбционной иммобилизации. Закрепленные клетки обладают повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды (колебаниям температуры, концентрации ионов, влажности, антибиотикам, элиминации простейшими), повышенной каталитической активностью (Семченко и др., 2003; McLean et al., 1997; Obuekwe, Al-Muttawa, 2001; Shin et al., 2002; Resch et al., 2005). При этом адсорбционная иммобилизация является наиболее простым способом закрепления бактериальных клеток, не сопровождается стрессовым воздействием на клетки и имитирует их поведение в природе (Сироткин и др., 2007).

Прикладная задача использования иммобилизованных родококков в биотехнологических процессах требует решения фундаментальной проблемы, связанной с изучением закономерностей адгезии живых клеток родококков, поиском физико-химических и биологических факторов, регулирующих адгезию. В отношении родококков, которые являются сравнительно новым объектом биотехнологии, эти процессы изучены очень мало по сравнению, например, с медико-биологическими агентами Streptococcus, Pseudomonas, Mycobacterium (в данных случаях описана адгезия к эпителиальным, иммунным клеткам; достаточно хорошо изучены эти процессы в отношении образования биопленок на медицинском инструментарии) (Норре et al., 1997; Zhang et al., 2005; Landry et al., 2006). В последние годы появились единичные работы (Gertler et al., 2004), посвященные изучению механизмов адгезии родококков. Исследования особенностей процесса адгезии клеток родококков приобретают особую актуальность еще и потому, что родококки сегодня признаются наряду с сульфатредуцирующими бактериями основными участниками биокоррозионных процессов, они обнаруживаются в составе коррозионно-активных биопленок, образующихся на металлических поверхностях (Азизов, 2007; Алехова и др., 2005; Volkland et al., 2000).

Цель настоящей работы — детальное исследование процесса адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на твердых носителях.

Основные задачи исследования

1. Исследовать адгезивные свойства родококков, принадлежащих к разным видам.

2. Исследовать кинетику и термодинамику процесса адсорбционной иммобилизации клеток родококков на поверхности минеральных и органических носителей. Выявить факторы, определяющие максимальную величину адсорбции клеток родококков.

3. Исследовать жизнеспособность и углеводородокисляющую активность иммобилизованных клеток родококков в отношении индивидуальных углеводородов и сырой нефти.

4. В условиях модельного эксперимента оценить возможность использования иммобилизованных клеток родококков для биоремедиации нефтезагрязненной почвы.

Научная новизна. С помощью мутантов родококков, полученных путем in vitro неспецифического Тп5 мутагенеза и обладающих различной адгезивной и эмульгирующей активностью, исследованы адгезионные характеристики родококков разных видов из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol/). Установлено, что адгезивные свойства клеток родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования. Выявлено стимулирующее влияние Т?/20б?ососсш,-биосурфактанта на процесс адгезии клеток родококков. Впервые с использованием методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования исследованы кинетика и термодинамика процесса адсорбции родококков на поверхности твердых носителей. Определены контролируемые условия монослойного распределения клеток родококков на носителе, обеспечивающие высокую каталитическую активность родококков в отношении w-гексадекана (104 мг-л^-ч"1) и сырой нефти (31 Mr-л''-ч"1).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление об особенностях процесса адсорбционной иммобилизации алканотрофных родококков на твердых носителях. В результате проведенных исследований отобраны штаммы Rhodococcus spp. с максимальной (68-85% прикрепленных клеток) степенью адгезивной активности. В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе древесных опилок, куриных перьев и отходов кожевенного производства. Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и углеводородному субстрату впервые использован прием гидрофобизации носителей. Экспериментально обосновано, что наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Я/20й?ососсг«-биосурфактант (1:0,1) и олифа (1:0,2). Определены оптимальные величины площади поверхности и гидрофобности носителей, обеспечивающие их максимальную (38 мг сухих клеток/г носителя) адсорбционную емкость. На основе иммобилизованных на модифицированных древесных опилках клеток родококков получен эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев и возможностью повторного использования. На основе УФ спектрофотометрии разработан экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве. Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью. Строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивной активностью не выявляется. Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования.

2. Использование приема гидрофобизации поверхности органических носителей способствует существенному увеличению их адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков. Наиболее эффективными гидрофобизующими агентами являются ЯИ ос1ососсш-биосурфактант и олифа.

3. Клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных опилках, характеризуются максимальной углеводородокисляющей активностью.

4. Для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы целесообразно применение клеток родококков, закрепленных на гидрофобизованных древесных опилках.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2004; II Межрегиональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 2007; I и III Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2007; II FEMS Congress of European Microbiologists, Мадрид, Испания, 2006; I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008", Казань, 2008; III Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал", Пермь-Н. Новгород-Пермь, 2008.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них четыре в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура работы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 226 наименований, в том числе 73 на русском и 153 на английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Криворучко, Анастасия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью. Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования.

2. Показано, что прием гидрофобизации поверхности органических носителей способствует существенному (от 1,3 до 43,0 раз) увеличению адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков. Наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Rhodococcus-биосурфактант (1:0,1) и олифа (1:0,2).

3. Впервые обоснована возможность использования методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования для контролирования монослойного распределения клеток родококков на поверхности твердых носителей.

4. Установлено, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных опилках, характеризуются максимальной (104 мг н-гексадека-на/(л-ч)) углеводородокисляющей активностью.

5. Обоснована целесообразность применения иммобилизованных клеток родококков для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы. В модельных экспериментах с использованием иммобилизованных клеток родококков достигнута 65%-ная степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение б недель биоремедиации.

6. На основе клеток R. ruber ИЭГМ 231, иммобилизованных на модифицированных древесных опилках, разработан эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных клеток родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев, возможностью повторного использования. На основе УФ спектрофотометрии разработан и апробирован экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве. Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа является первым комплексным исследованием адгезивных свойств актинобактерий рода Ююйососст. В результате проведенных исследований установлено, что исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью. Строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивной активностью в отношении твердой поверхности не выявляется. Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования. Показано, что коллоидный и физико-химический подходы, используемые при описании процессов бактериальной адсорбции, не позволяют выявить все факторы, обусловливающие закрепление клеток родококков на твердой поверхности (Козляк и др., 1991; Воб а1, 1999; УасНПо-ЯосЬ^иег et а1, 2004). По-видимому, основную роль в адгезии родококков играют специфические взаимодействия. Экспериментально доказано стимулирующее влияние Rhodococcus-6víocy^a.ктзш:a на адсорбционный процесс родококков. Так, присутствие биосурфактанта на твердой поверхности способствует 1,8-2,3-кратному увеличению адсорбированных клеток родококков; обнаружена положительная корреляция (Я=0,50, р=0,04) между адгезивной и эмульгирующей активностью Тп5 мутантов родококков.

В литературе адгезивную способность клеток родококков связывают с наличием у них мощной липофильной клеточной стенки (Ившина и др., 1987; Ившина, 1997; Коваленко и др., 1999; ВепсШ^ег et а/., 1993; 8око1оузка а1, 2003). Поэтому особое внимание в работе уделено изучению влияния гидрофобных взаимодействий на адсорбционный процесс алканотрофных родококков. Нами не выявлено статистически достоверной зависимости между показателями гидрофобности (величиной АСадг, водопоглощающей способностью, процентом адсорбции я-гексадекана материалом носителей и расположением носителей в двухфазной системе н-гексадекан/вода) и адсорбционной емкостью используемых носителей в отношении клеток родококков. Однако экспериментально доказано, что гидрофобизация поверхности органических носителей н-гексадеканом, силиконовой эмульсией, олифой 1:0,1 и 1:0,2, а также /?/гос?ососсг^-биосурфактантом приводит к 1,3-43,0-кратному увеличению степени адсорбции и изменению кинетики адсорбционного процесса. Эти эффекты обусловлены появлением множества гидрофобных сайтов на поверхности носителя, характеризующихся высоким сродством к липофильным клеткам родококков. Следует отметить, что прием гидрофобизации с использованием перечисленных агентов был применен нами впервые.

Нами получена физико-химическая модель адсорбции клеток родококков и выявлены основные факторы данного процесса. По нашим данным, основным фактором адсорбции клеток родококков на минеральных и органических носителях является величина удельной поверхности. Это доказывает существование корреляции (11=0,77, р=0,04) между сорбционной влажностью и адсорбционной емкостью носителей в отношении клеток родококков, а также электронограммы поверхности носителей. Впервые для исследования процесса адсорбционной иммобилизации клеток родококков апробированы сугубо физические методы профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования, которые позволили нам определить условия монослойного распределения клеток родококков на твердой поверхности, обеспечивающие высокую метаболическую активность иммобилизованных родококков.

Наряду с физико-химической моделью нами получена математическая модель адсорбции клеток родококков, которая позволяет определить оптимальные гидродинамические условия данного процесса. Все выявленные закономерности использованы при подборе штаммов с высокой адгезивной активностью, разработке оптимального способа гидрофобизации носителя и создании эффективного биокатализатора для биоремедиации нефтезагрязненной почвы. По нашим данным, наиболее активными штаммами являются Я. егу^гороШ ИЭГМ 271 и Я. гиЪег ИЭГМ 231, наиболее эффективными адсорбентами родококков — органические материалы на основе древесных опилок. Установлено, что оптимальным способом гидрофобизации является обработка олифой в объемном соотношении носитель:гидрофобизатор, равном 1:0,2, а также Якос1ососсш-биосурфактантом - гидрофобизатором, характеризующимся высокой степенью экологической безопасности. Кроме того, клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-алканов и иммобилизованные на данные носители проявляют максимальную каталитическую активность, окисляя до 104 мг н-гексадекана/(л-ч).

По нашим данным, использование иммобилизованных клеток алканотрофных родококков в процессах биоремедиации нефтезагрязненных экосистем имеет существенные преимущества по сравнению с применением свободных клеток. Такими преимуществами являются (1) прочное закрепление родококков на поверхности носителя, (2) повышение биодоступности сорбированных углеводородов для ферментных систем микроорганизмов и (3) 2-х-кратное ускорение процесса извлечения нефтяных углеводородов из среды. В модельных экспериментах с использованием иммобилизованных родококков была достигнута 65% степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение 13 недель биоремедиации. Кроме того, показано, что иммобилизованные клетки родококков обладают высокой углеводородокисляющей активностью в отношении таких труднодоступных соединений, как ПАУ. При этом в ходе проведенных исследований нами разработан экспрессный метод детекции ПАУ в почве на основе УФ спектрофотометрии.

147

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Криворучко, Анастасия Владимировна, Пермь

1. АбелянВ.А. Новый метод иммобилизации клеток микроорганизмов поперечной сшивкой / В.А. Абелян // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. -Т. 36, №3,-С. 359-364.

2. Азизов Р.Э. Кинетические закономерности формирования коррозионно активных биопленок и подходов к их элиминированию: Автореф. . канд. хим. наук / Р.Э. Азизов. Москва, 2007. - 24 с.

3. Алехова Т. А. Мониторинг микроорганизмов-деструкторов на пилотируемых орбитальных комплексах / Т.А. Алехова, A.A. Александрова, Т.Ю. Новожилова и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. - Т. 41, № 4. -С. 435-443.

4. Архипов Г.С. Технология кожи. Учебник для учащихся профессионально-технических училищ / Г.С. Архипов, A.A. Головтеева М.: Легпромбытиздат, 1988. -224 с.

5. Бандман Л. Л. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводиые углеводородов; Справ, изд. / А.Л. Бандман, Г.А. Войтенко, Н.В. Волкова и др. // Под ред. В.А. Филова и др. Л.: Химия, 1990.-732 с.

6. Бекер М.Е. Системы с иммобилизованными клетками для получения биогаза и этанола / М.Е. Бекер, А.П. Гринберг, Я.Э. Блумберг, Л.Я. Лабане // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987.-С. 72-86.

7. Веслополова Е.М. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов / Е.М. Веслополова // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 2. - С. 279-284.

8. Выдрякова Г.А. Формирование агрегированных структур светящимися бактериями в присутствии углеводов / Г.А. Выдрякова, Т.В. Кирпиченко, A.A. Лифантьева // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 2. - С. 282-284.

9. Гвоздяк П.И. Иммобилизованные микроорганизмы в очистке сточных вод от ксенобиотиков / П.И. Гвоздяк // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987. - С. 56-62.

10. Глазачева Л.Е. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и н-бутан / Л.Е. Глазачева, И.Б. Ившина, A.A. Оборин // Микробиология. 1990. - Т. 59, вып. 2. -С. 301-306.

11. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц // Пер. с англ. Ю.А. Данилова. Под ред. Н.Е. Бузикашвили и Д.В. Самойлова. — М.: Практика, 1999.-459 с.

12. До сон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991. - 544 с.

13. Егоров II.С. Биосшпез биологически активных веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов / Н.С. Егоров, Н.С. Ландау, Е.А. Бормап, И.Б. Кочова // Прикл. биохим. и микробиол. 1984. - Т. 20, вып. 5.-С. 579-592.

14. Жубанова A.A. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / A.A. Жубанова, М.Х. Шигаева // Биотехнология. Теория и практика. 1997. — №2.-С. 1-10.

15. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев М.: Изд-во МГУ, 1987.-255 с.

16. Зимои А.Д. Физическая химия / А.Д. Зимон М.: Агар, 2006. - 320 с.

17. Зуева H.H. Высокоэффективные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов / H.H. Зуева // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". — Пущино, 1987. С. 123-132.

18. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие: Дис. .докт. биол. наук / И.Б. Ившина. Пермь, 1997.- 197 с.

19. Ившина И.Б. Элсктронпомикроскопическое изучение факультативных газоиспользующих Rhodococcus rhodochrous / И.Б. Ившина, O.A. Нестеренко, JI.E. Глазачева, В.П. Шсховцов // Микробиология. 1982. - Т. 51, вып. 3. — С. 477-481.

20. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, P.A. Пшеничнов, A.A. Оборин. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 123 с.

21. Ившина И.Б. Экологические аспекты использования родококков — новых продуцентов биосурфактантов / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И. Рычкова // Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала. Пермь, 1993. — С. 29-30.

22. Ившина И.Б. Применение экологически безопасной экспресс-технологии очистки нефтезагрязненных почв и грунтов (на примере районов нефтедобычи Пермской области) / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, С.М. Костарев // Нефтяное хозяйство. 2003. - № 9. - С. 116-119.

23. Ившииа И.Б. Бпочрансформация ß-ситостерола и сложных эфиров ß-ситостерола актинобактериями рода Rhodococcus / И.Б. Ившина, В.В. Гришко, Е.М. Ноговнципа и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. -Т. 41, №6. -С. 626-633.

24. Ившина И.Б. Алкапотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции не пригодных к использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева и др. // Прикл. биохим. и микробиол. — 2006.-№4.-С. 443-447.

25. Илялетдипов АЛ I. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод иммобилизованными клетками микроорганизмов-деструкторов / А.Н. Илялетдипов, P.M. Алиева // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987. — С. 62-72.

26. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.- 163 с.

27. Кестнер А.И. Иммобилизованные растительные клетки / А.И. Кестнер, H.I3. Архангельская // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущипо, 1987. - С. 39-48.

28. Кирейчева J1.B. Состав для биологической очистки почв от нефти и нефтепродуктов / JI.B. Кирейчева, О.Б. Хохлова // Патент РФ. № 2215596. — 2003.

29. Китова А.Е. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 /

30. A.Е. Китова, Т.Н. Кувпчкина, А.Ю. Аринбасарова, А.Н. Решетилов // Прикл. биохим. и микробиол. 2004. - Т. 40. - № 3. - С. 307-311.

31. Коваленко Г. А. Углеродные материалы как адсорбенты для биологически активных веществ и бактериальных клеток / Г.А. Коваленко,

32. B.А. Семиколепов, Е.В. Кузнецова и др. // Коллоидн. журн. 1999. -Т. 61, № б.-С. 787-795.

33. Козляк Е.И. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции (обзор) / Е.И. Козляк, М.М. Якимов, И.Б. Уткин и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 1991. - Т. 27, вып. 6. - С. 788-803.

34. Кондратенко В.М. Препарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов /В.М. Кондратенко, В.П. Холоденко, И.А. Дунайцев и др. // Патент РФ. № 2191753. - 2002.

35. Коронеллн Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32, № 6. - С. 579585.

36. Коронелли Т.В. Поверхностно-активные свойства некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, С.Г. Юферова //Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1990. -№ 1. - С. 14-18.

37. Кощеенко К. Л. Иммобилизация клеток микроорганизмов / К.А. Кощеенко, Г.В. Суходольская // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пуицшо, 1987. - С. 4-15.

38. Кудинов В.И. Способ очистки поверхностей от загрязнений нефтью и нефтепродуктами / В.И. Кудипов, Е.И. Богомольный, Б.М. Сучков и др. // Патент РФ. № 2104103. - 1998.

39. Кузьмичева И.В. Влияние иммобилизации на метаболизм дрожжей / И.В. Кузьмичева, В.В. Плотникова, И.В. Гриц, В.Н. Леонтьев // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 3. - С. 251-255.

40. Куюкина М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение: Дис. .докт. биол. наук/ М.С. Куюкина. Пермь, 2006. - 295 с.

41. Ладыгин A.B. Сорбент для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрязнений "Москат" / A.B. Ладыгин // Патент РФ. № 2143947. — 2000.

42. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакип. М. : Высшая шк., 1990. - 352 с.

43. Ландау JT.Д. Статистическая физика. Часть 1. Издание 5-е / Л.Д. Ландау, Е.М. Лифншц. - М.: Физматлит, 2005. - 616 с.

44. Максимов АЛО. Иммобилизация на углеродных сорбентах штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего питрилгидратазной активностью / А.Ю. Максимов, Ю.Г. Максимова, М.В. Кузнецова и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 2007. - Т. 43, № 2. - С. 193-198.

45. Максимова Ю.Г. Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus: Автореф. дисс. .канд. биол. паук / Ю.Г. Максимова. Пермь, 2006. - 22 с.

46. Манаков M.II. Мембранный биореактор как метод иммобилизации клеток / М.Н. Манаков, Н.С. Марквичев // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". — Пущино, 1987. С. 157-163.

47. Медведева Н.Г. Иммобилизация уксуснокислых бактерий на углеродных волокнах и использование их для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведева, Ю.А. Гриднева, A.A. Лысенко, В.И. Сухаревич // Биотехнология. 2001. - № 5. - С. 51-57.

48. Нестерспко O.A. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / O.A. Нестерепко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наукова думка, 1985. -336 с.

49. Николаев ТО.И. Регуляция адгезии клеток Pseudomonas fluorescens к стеклу летучими соединениями, выделяемыми культурой / Ю.И. Николаев, Д. Проссер, Р.И. Бич глн // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - С. 352-355.

50. Николаев Ю.А. Насыщенные С21-С33 углеводороды авторегуляторы адгезии Pseudomonas fluorescens на сгекле / Ю.А. Николаев, Н.С. Паников, С.М. Лукин, Г.А. Осипов // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 2. - С. 174181.

51. Николаев Ю.А. Внеклеточная протеаза как регулятор обратимой адгезии Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Н.С. Паииков // Микробиология. 2002. - Т. 71, № 5. - С. 629-634.

52. Ньтс П.С. Общие принципы создания высокоэффективных биокатализаторов па основе клеток микроорганизмов / П.С. Ныс, A.B. Скляренко, П.Л. Заславская, Ю.Э. Бартошевич // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". -Пущино, 1987. С. 27-38.

53. Няпикова Г.Г. Иммобилизация па хитине Bacillus mucilaginosus — продуцента экзополисахарпдов / Г.Г. Няникова, Е.Э. Куприна, О.В. Пестова, С.В. Водолажская // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. - Т. 38, №3. -С. 300-304.

54. Пешкур Т.А. Аккумуляция цезия актинобактериями рода Rhodococcus / Т.А. Пешкур // Дисс. .капд. бпол. паук. — Пермь, 2002. 119 с.

55. Пешкур Т.А. Особенности аккумуляции цезия бактериальными клетками Rhodococcus ruber при росте на н-гексадекаие / Т.А. Пешкур, И.Б. Ившина//Экология. -2003,-№ 1.-С. 69-71.

56. Пирог Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти /

57. Т.П. Пирог, Т.Д. Шевчук, И.Н. Волошина, НИ. Грегирчак // Прикл. биохим. имикробиол. -2005.-Т. 41, № 1.-С. 58-63.

58. Порозова С.Е. Изменение структуры алюмосиликатных материалов в присутствии бактерий рода Rhodococcus sensu stricto / С.Е. Порозова, В.Я. Беккер, И.Б. Ившина и др. // Журн. прикл. химии. 2002. - Т. 75, вып. 3. — С. 443-446.

59. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие / Под ред. Н. С. Егорова. 2-е изд. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. — 215 с.

60. Самонип В.В. Изучение закономерностей адсорбции бактериальных клеток па пористых носителях / В.В. Самонип, Е.Е. Еликова // Микробиология.-2004. Т. 73, №6.-С. 810-816.

61. Семчепко Г.Д. Особенности взаимодействия микроорганизмов с кремнеземным сорбентом / Г.Д. Семченко, В.Н. Николаенко, Т.П. Осолодчеико // Огнеупоры и техн. керамика. 2003. - № 11. - С. 20-23.

62. Синицып Д.П. Иммобилизоваипые клетки микроорганизмов / А.П. Синицып, Е.И. Райпипа, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ, 1994.-288 с.

63. Сироткип Д.С. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы / Д.С. Сироткин, Г.И. Шагинурова, К.Г. Ипполитов. — Казань: Изд-во "Фон" АН РТ, 2007. 160 с.

64. Слабова О.И. Иммобилизация олиготрофных бактерий на пористых носителях методом сорбции / О.И. Слабова, Д.И. Никитин // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 3. - С. 430-432.

65. Старостина Н.Г. Селективный отбор культур Escherichia coli и Pseudomonas putida с повышенной устойчивостью к процессу иммобилизации в полпакриламидпом геле / Н.Г. Старостина, К.А. Луста, Б.А. Фихте // Микробиология. 1986. - Т.55, вып. 1.-С. 100-103.

66. Федорович В.В. Разработка феноменологической модели кинетики бактериальной адсорбции па иизкоэнергетических поверхностях /

67. В.В. Федорович, С.В. Калюжный, П. ваи дер Мирен, В. Верстрает // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43, № 6. - С. 417-419.

68. Чугунов В.А. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В.А. Чугунов, В.П. Холоденко, З.М. Ермоленко и др. // Патент РФ. № 2193533. - 2002.

69. Шеховцова Н.В. Кинетика роста Arthrobacter globiformis и Pseudomonas fluorescens на средах со стекловолокном / Н.В. Шеховцова, Д.Г. Звягинцев, Н.С. Паников // Микробиология. 1992. - Т. 61, вып. 6. - С. 995-1004.

70. Штильман М.И. Успехи в использовании полимеров для иммобилизации клеток / М.И. Штильман // Сб. науч. трудов "Иммобилизованные клетки в биотехнологии". Пущино, 1987. - С. 104-114.

71. Abed R.M.M. Bacterial diversity of a cyanobacterial mat degrading petroleum compounds at elevated salinities and temperatures / R.M.M. Abed, A. Al-Thulcair, D. de Beer // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. - V. 57, № 2. -P. 290-301.

72. Absolom D.R. Surface thermodynamics of bacterial adhesion / D.R. Absolom, F.V. Lamberti, Z. Policova et al. II Appl. Environ. Microbiology. -1983.-V. 46, № l.-P. 90-97.

73. Abu-Salah K. Microbial degradation of aromatic and polyaromatic toxic compounds adsorbed on powdered activated carbon / K. Abu-Salah, G. Shelef, D. Levanon et al. II J. Biotechnol. 1996. - V. 51. - P. 265-272.

74. Adamczyk Z. Kinetics of localized adsorption of colloid particles / Z. Adamczyk, B. Siwek, M. Zembala, P. Weronski // Langmuir. 1992. — V. 8. — P. 2605-2610.

75. Adamczyk Z. Kinetics of localized adsorption of colloid particles / Z. Adamczyk, B. Siwelc, M. Zembala, P. Belouschek // Adv. Coll. Interface Sei. -1994.-V. 48.-P. 151-280.

76. Adamczyk Z. Irreversible adsorption of colloid particles at heterogeneous surfaces / Z. Adamczyk, B. Siwelc, P. Weronski, E. Musial // Appl. Surf. Sei. -2002.-V. 196.-P. 250-263.

77. Adamczyk Z. Irreversible adsorption of colloid particles on heterogeneous surfaces / Z. Adamczyk, K. Jaszczolt, B. Siwelc // Appl. Surf. Sei. 2005. — V. 252.-P. 723-729.

78. Ahmad S. Cholesterol side-chain cleavage by immobilized cells of Rhodococcus equi DSM 89-133 / S. Ahmad, P.K. Roy, S.K. Basu, B.N. Johri // Indian J. Experim. Biol. 1993. - V. 31, № 4. - P. 319-322.

79. Anton V. Identification of the sugars involved in mycobacterial cell aggregation / V. Anton, P. Rouge, M. Daffe // FEMS Microbiol. Letters. 1996. -V. 144.-P. 167-170.

80. Arenskötter M. Identification and application of plasmids suitable for transfer of foreign DNA to members of the genus Gordonia / M. Arenskötter, D. Baumeister, R. Kalscheuer, A. Steinbüchel // Appl. Environ. Microbiol. 2003. -V. 69, №8.-P. 4971-4974.

81. Arevalo-Ferro C. Biofilm formation of Pseudomonas putida IsoF: the role of quorum sensing as assessed by proteomics / C. Arevalo-Ferro, G. Reil, A. Görg et al. II Syst. Appl. Microbiol. 2005. - V. 28. - P. 87-114.

82. Baikova S.V. The intensification of dimethylphthalate destruction in soil / S.V. Baikova, A.S. Samsonova, Z.M. Aleshchenkova, A.N. Shcherbina // Euras. Soil Sci. 1999. - V. 32, №6.-P. 701-704.

83. Baillif S.A. A new in vitro model to study staphylococcal biofilm formation on intraocular lenses under hydrodynamic conditions / S.A. Baillif, L. Kodjikian, E. Casoli et al. II Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2005. - V. 46. - P. 5080—B283.

84. Bakker D.P. Multiple linear regression analysis of bacterial deposition to polyurethane coatings after conditioning film formation in the marine environment / D.P. Bakker, H.J. Busscher, J. van Zanten // Microbiology. 2004. - V. 150. - P. 1779-1784.

85. Bastiaens L. Isolation of adherent polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)degrading bacteria using PAH-sorbing carriers / L. Bastiaens, D. Springael, P. Wattiau et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, № 5. - P. 18341843.

86. Bavington C. Stopping bacterial adhesion: A novel approach to treating infections / C. Bavington, C. Page // Respiration. 2005. - V. 72. - P. 335-344.

87. Bell K.S. The genus Rhodococcus / K.S. Bell, J.C. Philp, D.W.J. Aw, N. Christofi //J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 85. - P. 195-210.

88. Bos R. Physico-chemistry of initial microbial adhesive interactions its mechanisms and methods for study / R. Bos, H.C. van der Mei, H.J. Busscher // FEMS Microbiol. Rev. - 1999. - V. 23. - P. 179-230.

89. Bunt C.R. The effects of pH, ionic strength and polyvalent ions on the cell surface hydrophobicity of Escherichia coli evaluated by the BATH and HIC methods / C.R. Bunt, D.S. Jones, I.G. Tucker 11 Inter. J. Pharmaceutics. 1995. -V. 113.-P. 257-261.

90. Busalmen J.P. Ellipsometric measurement of bacterial films at metal-electrolyte interfaces / J.P. Busalmen, S.R. de Sánchez, D.J. Schiffrin // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64, № 10. - P. 3690-3697.

91. Busalmen J.P. Adhesion of Pseudomonas fluorescens (ATCC 17552) to nonpolarized and polarized thin films of gold / J.P. Busalmen, S.R. de Sánchez // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, № 7. - P. 3188-3194.

92. Busscher H.J. Kinetics of adhesion of the oral bacterium Streptococcus sanguis CH3 to polymers with different surface free energies / H.J. Busscher, M.H.W.J.C. Uyen, A.W.J, van Pelt et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51, №5.-P. 910-914.

93. Busscher H.J. Streptococcus thermophilus and its biosurfactants inhibit adhesion by Candida spp. on silicone rubber / H.J. Busscher, C.G. van Hoogmoed, G.l. Geertsema-Doombusch et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63, № 10.-P. 3810-3817.

94. Carvalho M.F. A GAC biofilm reactor for the continuous degradation of 4-chlorophenol: treatment efficiency and microbial analysis / M.F. Carvalho, I. Vasconcelos, A.T. Bull, P.M.L. Castro // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. -V. 57.-P. 419-426.

95. Chang J.H. Desulfurization of light gas oil in immobilized-cell systems of Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 // J.H. Chang, Y.K. Chang, H.W. Ryu, H.N. Chang // FEMS Microbiol. Letters. 2000. - V. 182, № 2. - P. 309312.

96. Chen G. Equilibrium and kinetic adsorption of bacteria on alluvial sand and surface thermodynamic interpretation / G. Chen, M. Rockhold, K.A. Strevett // Res. Microbiol.-2003.-V. 154.-P. 175-181.

97. Cloarec O. Improvement of UV spectrophotometry methodology for the determination of polycyclic aromatic compounds in contaminated soils /

98. O. Cloarec, C. Gonzalez, E.M. Touraud, O. Thomas // Analytica Chemica Acta. -2002.-V. 435.-P. 245-252.

99. Colombo A.V. Corynebacterium diphtheriae surface proteins as adhesins to human erythrocytes / A.V. Colombo, J.R. Hirata, C.M.R. de Souza et al II FEMS Microbiol. Letters.-2001.-V. 197.-P. 235-239.

100. Dawson J.J.C. Application of biological indicators to assess recovery of hydrocarbon impacted soils / J.J.C. Dawson, E.J. Godsiffe, LP. Thompson et al. II Soil Biol. Biochem. 2007. - V. 39. - P. 164-177.

101. De Greve H. Combining sites of bacterial fimbriae / I-I. De Greve, L. Wyns, J. Bouckaert // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. - V. 17. - P. 506-512.

102. Edwards J.A. Bordetella bronchiseptica adherence to cilia is mediated by multiple adhesin factors and blocked by surfactant protein A / J.A. Edwards, N.A. Groathouse, S. Boitano // Infect. Immun. 2005. - V. 73, № 6. - P. 3618-3626.

103. ElkinB. Wettability, chemical and morphological data of hydrophobic layers by plasma polymerization on smooth substrates / B. Elkin, J. Mayer, B. Shindler, U. Vohner // Surf. Coat. Techn. 1999. - V. 116-119. - P. 836-840.

104. Ellen R.P. In vitro models that support adhesion specificity in biofilms of oral bacteria / R.P. Ellen, G. Lepine, P.-M. Nghiem // Adv. Dent. Res. 1997. - V. 11, № l.-P. 33-42.

105. Fernandes P.J. Construction of Rhodococcus random mutagenesis libraries using Tn5 transposition complexes / P.J. Fernandes, J.A. Powell, A.C. Archer // Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 2529-2536.

106. Fiedler D. New packing materials for bioreactors based on coated and fiber-reinforced biocers / D. Fiedler, A. Thron, U. Soltmann, H. Bottcher // Chem. Mater. 2004. - V 16. - P. 3040-3044.

107. Finnerty W.R. The biology and genetics of the genus Rhodococcus / W.R. Finnerty // An. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 193-218.

108. Foster T.J. Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus / T.J. Foster, M. Hook // Trends Microbiol. 1998. - V. 6, № 12. - P. 484-488.

109. Ganguly S. Enhanced stabilization of nitrile hydratase enzyme from Rhodococcus sp. DAP 96253 and Rhodococcus rhodochrous DAP 96622: A Diss. .Degree of PhD / S. Ganguly Tbilisi: Georgia State University, 2005. - 119 p.

110. Girardeau J. Pilins of fimbrial adhesins of different member species of Enterobacteriaceae are structurally similar to the C-terminal half of adhesin proteins / J. Girardeau, Y. Bertin IIFEBS Letters. 1995. - V. 357. - P. 103-108.

111. Gómez-Suárez C. Influence of extracellular polymeric substances on deposition and redeposition of Pseudomonas aeruginosa to surfaces / C. Gómez-Suárez, J. Pasma, A.J. van der Borden et al. II Microbiology. 2002. - V. 148. -P. 1161-1169.

112. Heilmann C. Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation / C. Heilmann, C. Gerke, F. Perdreau-Remington, F. Götz // Infect. Immun. 1996. - V. 64, № 1. - P. 277-282.

113. Hori K. Isolation, characterization and application to off-gas treatment of toluene-degrading bacteria / K. Hori, S. Yamashita, S. Ishii et al. II J. Chem. Eng. Japan. 2001. - V. 34, № 9. - P. 1120-1126.

114. HuberB. The cep quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility / B. Huber, K. Riedel, M. Hentzer et al. II Microbiology. 2001. - V. 147.-P. 2517-2528.

115. Ivshina I.B. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species / I.B. Ivshina, M.S. Kuyukina, J.C. Philp, N. Christofi // World J. Microbiol. Biotechnol. 1998. -V. 14.-P. 711-717.

116. Iwabuchi N. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous / N. Iwabuchi, M. Sunairi, H. Anzai et al. II Appl. Environ. Microbiol. -2000. V. 66, № 11.-P. 5073-5077.

117. Jacobs A. Kinetic adhesion of bacterial cells to sand: Cell surface properties and adhesion rate / A. Jacobs, F. Lafolie, J.M. Herry, M. Debroux // Colloids Surf. B: Biointerfaces. 2007. - V. 59. - P. 35-45.

118. Jezequel K. Soil bioaugmentation by free and immobilized bacteria to reduce potentially phytoavailable cadmium / K. Jezequel, T. Lebeau // Bioresour. Technol. 2008. - V. 99. - P. 690-698.

119. Kim D. Regioselective oxidation of xylene isomers by Rhodococcus sp. strain DK17 / D. Kim, Y.-S. Kim, J.W. Jung et al. II FEMS Microbiol. Letters.2003.-V. 223.-P. 211-214.

120. Kim J.-W. Enhanced-rate biodégradation of organophosphate neurotoxin by immobilized nongrowing bacteria / J.-W. Kim, E.I. Rainina, W.W. Mulbry // Biotechnol. Prog. 2002. - V. 18. - P. 429-436.

121. Kovalenko G.A. Bioepoxidation of propylene by non-growing cells of Rhodococcus sp. / G.A. Kovalenko, T.B. Ivshina, E.V. Kuznetsova et al. Il Chemistry for Sustainable Development. 2003. - V. 11. - P. 117-121.

122. Krekeler C. Influence of physicochemical bacterial surface properties on adsorption to inorganic porous supports / C. Krekeler, H. Ziehr, J. Klein // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991.-V. 35.-P. 484-490.

123. Kubâc D. Biotransformation of nitriles by Rhodococcus equi A4 immobilized in LentiKats® / D. Kubâc, A. Cejkovâ, J. Masâk et al. II J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2006. - V. 39. - P. 59-61.

124. KuyukinaM.S. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction / M.S. Kuyukina, LB. Ivshina, J.C. Philp et al. Il J. Microbiol. Methods. 2001. - V. 46, №2. - P. 149-156.

125. Kuyukina M.S. Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land farming techniques / M.S. Kuyukina,

126. B. Ivshina, M.I. Ritchkova et al. II Soil Sediment Contamination. 2003. - V. 12. -P. 85-99.

127. Lameiras S. Biosorption of Cr (VI) using a bacterial biofilm supported on granular activated carbon and on zeolite / S. Lameiras, C. Quintelas, T. Tavares // Bioresour. Technol. 2008. - V. 99. - P. 801-806.

128. Landry R.M. Mucm-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance / R.M. Landry, D. An, J.T. Hupp et al. Il Mol. Microbiol.-2006.-V. 59, № l.-P. 142-151.

129. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J. Philp // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - P. 59-70.

130. Larsen P. Amyloid-like adhesins produced by floc-forming and filamentous bacteria in activated sludge / P. Larsen, J.L. Nielsen, D. Otzen, P.H.Nielsen // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - V. 74, № 5. - P. 1517-1526.

131. Li F. Identification of Candida albicans genes that induce Saccharomyces cerevisiae cell adhesion and morphogenesis / F. Li, S.P. Palecelc // Biotechnol. Prog.-2005.- V. 21.-P. 1601-1609.

132. Liang M.N. Measuring the forces involved in polyvalent adhesion of uropathogenic Escherichia coli to mannose-presenting surfaces / M.N. Liang, S.P. Smith, S.J. Métallo et al II PNAS. 2000. - V. 97, № 24. - P. 13092-13096.

133. Loosdrecht M.C.M. The role of bacterial cell wall hydrophobicity in adhesion / M.C.M. van Loosdrecht, J. Lyklema, W. Norde et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1987.-V. 53, № 8.-P. 1893-1897.

134. López A. The interphase technique: a simple method of cell immobilization in gel-beads / A. López, N. Lázaro, A.M. Marqués // J. Microbiol. Methods. -1997.-V. 30.-P. 231-234.

135. Maclcay D. Illustrated Plandbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals, Vol. Ill, Volatile organic chemicals / D. Mackay, W.Y. Shiu, K.C. Ma Chelsea: Lewis publishers Inc., 1993.- 916 p.

136. Mangan M.W. Random insertion mutagenesis of Rhodococcus equi / M.W. Mangan, W.G. Meijer // FEMS Microbiol. Letters. 2001. - V. 205. -P. 243-246.

137. Masak J. Colonization of surfaces by phenolic compounds utilizing microorganisms / J. Masak, A. Cejkova, V. Jirku et al. // Environ. International. -2005.-V. 31, №2.-P. 197-200.

138. Mattos-Guaraldi A.L. Cell surface components and adhesion in Corynebacterium diphtheriae / A.L. Mattos-Guaraldia, L.C.D. Formiga, G.A. Pereira // Microbes Infect. 2000. - V. 2. - P. 1507-1512.

139. McLean R.J.C. Evidence of autoinducer activity in naturally occurring biofilms / R.J.C. McLean, M. Whiteley, D.J. Stickler, W.C. Fuqua // FEMS Microbiol. Letters. 1997. - V. 154. - P. 259-263.

140. Meylheuc T. Adsorption of biosurfactant on solid surfaces and consequences regarding the bioadhesion of Listeria monocytogenes L028 / T. Meylheuc, C.J. van Oss, M.-N. B el lone-Fontaine // J. Appl. Microbiol. 2001. - V. 91. - P. 822832.

141. Microbial biofilms / Ed. by H.M. Lappin-Scott, W. Costerton, J. Lynch. -Cambridge University Press, 2003. 324 p.

142. Mireles J.R. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation / J.R. Mireles, A. Toguchi, R.M. Harshey // J. Bacteriol. 2001. - V. 183, № 20. - P. 5848-5854.

143. Mogensen J.E. Barriers to folding of the transmembrane domain of the Escherichia coli auto transporter adhesin involved in diffuse adherence / J.E. Mogensen, D. Tapadar, M.A. Schmidt, D.E. Otzen // Biochemistry. 2005. -V. 44, № 11.-P. 4533 -4545.

144. Naito M. Long-term repeated biodesulfurization by immobilized Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 cells / M. Naito, T. Kawamoto, K. Fujino et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 55. - P. 374-378.

145. Nassif X. Gonococcal lipooligosaccharide: an adhesin for bacterial dissemination? / X. Nassif// Trends Microbiol. 2000. - V. 8, № 12. - P. 539540.

146. Neu T.R. Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of bacteria with interfaces / T.R. Neu // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60, № 1. -P. 151-166.

147. Obuekwe C.O. Self-immobilized bacterial cultures with potential for application as ready-to-use seeds for petroleum bioremediation / C.O. Obuekwe, E.M. Al-Muttawa // Biotechnol. Letters. 2001. - V. 23. - P. 1025-1032.

148. Odenbreit S. Adherence properties of Helicobacter pylori: Impact on pathogenesis and adaptation to the host / S. Odenbreit // Int. J. Med. Microbiol. -2005.-V. 295.-P. 317-324.

149. O'Toole G.A. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis /G.A. O'Toole, R. Koltcr//Mol. Microbiol. 1998. - V. 28, №3.-P. 449-461.

150. Owen S.A. Re-cvaluation of the hypothesis that biodégradation surfactants stimulate surface attachment of competent bacteria / S.A. Owen, N.J. Russel, W.A. House, G.F. White // Microbiology. 1997. - V. 143. - P. 3649-3659.

151. Philp J.C. Allcanolrophic Rhodococcas ruber as a biosurfactant producer / J.C. Philp, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. -2002.-V. 59.-P. 318-324.

152. Pretzer G. Biodiversity-based identification and functional characterization of the mannose-specific adhesin oí Lactobacillus plantarum / G. Pretzer, J. Snel, D. Molenaar et al. //J. Bacteriol. -2005. V. 187, № 17.-P. 6128-6136.

153. Prieto M.B. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolilc® in packed-bed reactor / M.B. Prieto, A. Hidalgo, J.L. Serra , M.J. Llama // J. Biotechnol. -2002. V. 97, № 1.-P. 1-11.

154. QuelcE. Rhodococcus sp. F92 immobilized on polyurethane foam shows ability to degrade various petroleum products / E. Quelc, Y. Ting, H.M. Tan // Bioresour. Technol. -2006. V. 97, № 1. - P. 32-38.

155. Rao S. Transposon mutagenesis in Rhodococcus sp. 124 via GentR transposomes / S. Rao // Bug Journal. 2003. - V. 6. - P. 151-156.

156. Resch A. Differential gene expression profiling of Staphylococcus aureus cultivated under biofilm and planlctonic conditions / A. Resch, R. Rosenstein, C. Nerz, F. Gotz // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71, № 5. - P. 2663-2676.

157. Rubinsztein-Dunlop S. Identification of two new Helicobacter pylori surface proteins involved in attachment to epithelial cell lines / S. Rubinsztein-Dunlop, B. Guy, L. Lissolo, H. Fischcr // J. Med. Microbiol. 2005. - V. 54. - P. 427-434.

158. Sadovskaya I. Extracellular carbohydrate-containing polymers of a model bio film-producing strain, Staphylococcus epidermidis RP62A / I. Sadovskaya, E. Vinogradov, S. Flahaut et al. II Infect. Immun. 2005. - V. 73, № 5. - P. 30073017.

159. SafonovaE. Biotrcatmcnt of industrial wastewater by selected algal-bacterial consortia / E. Safonova, K.V. Kvitko, M.I. Iankevitch et al. II Eng. Life Sei.2004. V. 4, № 4. - P. 347-353.

160. Shin M. Evaluation of support materials for the surface immobilization and decolorization of amaranth by Trametes versicilor / M. Shin, T. Nguyen, J. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - P. 218-223.

161. Shleeva M.O. Formation and resuscitation of "nonculturable" cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase / M.O. Shleeva, K. Bagramyan, M.V. Telkov et al. II Microbiology. 2002. - V. 148.-P. 1581-1591.

162. Sokolovska I. Carbon source-induced modifications in the mycolic acid content and cell wall permeability of Rhodococcus erythropolis El / I. Sokolovska, R. Rozenberg, C. Ricz et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, № 12. -P. 7019-7027.

163. Sorongon M.L. Hydrophobicity, adhesion, and surface-exposed proteins of gliding bacteria / M.L. Sorongon, R.A. Bloodgood, R.P. Burchard // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57, № 11.-P. 3193-3199.

164. Starks A.M. Assembly of CS1 pili: the role of specific residues of the major pilin, Coo A / A.M. Starks, B.J. Froehlich, T.N. Jones, J.R. Scott // J. Bacteriol. -2006.-V. 188, № l.-P. 231-239.

165. Steffan S. Azo dye biodegradation by microbial cultures immobilized in alginate beads / S. Steffan, L. Bardi, M. Marzona // Environment International. —2005.-V. 31, №2.-P. 201-205.

166. Stoll A. Comparison of the heavy metal sorptive properties of three types of immobilized non-viable Sacchciromyces cerevisiae biomass / A. Stoll, J.R. Duncan // Proc. Biochem. 1997. - V. 32, № 6. - P. 467-472.

167. Sutcliffe I.C. Cell envelope composition and organisation in the genus Rhodococcus / I.C. Sutcliffe // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. — P. 49-58.

168. Suzuki T. Immobilization of Prototheca zopfii in calcium-alginate beads for the degradation of hydrocarbons / T. Suzuki, T. Yamaguchi, M. Ishida // Proc. Biochem. 1998.-V. 33, № 5.-P. 541-546.

169. Svensäter G. Protein expression by planktonic and biofilm cells of Streptococcus mutans / G. Svensäter, J. Welin, J.C. Willems et al. II FEMS Microbiol. Letters.-200l.-V. 205.-P. 139-146.

170. Takahashi Y. Contribution of sialic acid-binding adhesin to pathogenesis of experimental endocarditis caused by Streptococcus gordonii DL1 / Y. Takahashi, E. Takashima, K. Shimazu et al. II Infect. Immun. 2006. - V. 74, № 1. - P. 740743.

171. Tatarczak M. Identification of putative adhesin genes in shigatoxigenic Escherichia coli isolated from different sources / M. Tatarczak, K. Wieczorek, B. Posse, J. Oselc // Vet. Microbiol. 2005. - V. 110. - P. 77-85.

172. Thomas W. Catch-bond model derived from allostery explains force-activated bacterial adhesion / W. Thomas, M. Forero, O. Yakovenko et al. Il Biophys. J. 2006. - V. 90. - P. 753-764.

173. Toledo-Arana A. The enterococcal surface protein, Esp, is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation / A. Toledo-Arana, J. Valle, C. Solano et al. II Appl. Environ. Mocrobiol.-2001,-V. 67, № 10.-P. 4538-4545.

174. Tolker-Nielsen T. Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms / T. Tolker-Nielsen, U.C. Brinch, P.C. Ragas et al. II J. Bacteriol. 2000. - V. 182, №22.-P. 6482-6489.

175. Tsuneda S. Extracellular polymeric substances responsible for bacterial adhesion onto solid surface / S. Tsuneda, H. Aikawa, H. Hayashi et al. II FEMS Microbiol. Letters. 2003. - V. 223. - P. 287-292.

176. Uraizee F.A. A model for diffusion controlled bioavailability of crude oil components / F.A. Uraizee, A.D. Venosa, M.T. Suidan // Biodegradation. 1998. -V. 8.-P. 287-296.

177. Vadillo-Rodriguez V. Relations between macroscopic and microscopic adhesion of Streptococcus mitis strains to surfaces / V. Vadillo-Rodriguez, H.J. Busscher, W. Norde et al. II Microbiology. 2004. - V. 150. - P. 1015-1022.

178. Vanhaecke E. Kinetics of Pseudomonas aeruginosa adhesion to 304 and 316-L stainless steel: role of cell surface hydrophobicity / E. Vanhaecke, J.-P. Remon, M. Moors et ai II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, № 3. -P. 788-795.

179. Volkland LLP. Corrosion inhibition of mild steel by bacteria / H.P. Volkland , H. Harms, K. Knopf et al. II Biofouling. 2000. - V. 15, № 4. -P. 287-297.

180. Walker J.D. Microbial petroleum degradation: use of mixed hydrocarbon substrates / J.D. Walker, R.R. Colwell // Appl. Microbiol. 1974. - V. 6, № 6. -P. 1053-1060.

181. Walker S.L. Influence of growth phase on adhesion kinetics of Escherichia coli D21g / S.L. Walker, J.E. Hill, J.A. Redman, M. Elimelech // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71, № 6. - P. 3093-3099.

182. Walsh P.K. Cell growth patterns in immobilization matrices / P.K. Walsh, D.M. Mai one // Biotcchnol. Adv. — 1995. V. 13. - P. 13-43.

183. Wang B.-E. Biosorption behavior ofazo dye by inactive CMC immobilized Aspergillus fumigatus beads / B.-E. Wang, Y.-Y. Hu, L. Xie, K. Peng // Bioresour. Technol. 2008. - V. 99. - P. 794-800.

184. WarhustA.M. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus / A.M. Warhust, C.A. Fcwson // Cr. Rev. Biotechnol. 1994. - V. 14, № 1. - P. 2973.

185. Whyte L.G. Biodegradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. / L.G. Whyte, J. Hawari, E. Zhou et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, № 7. - P. 2578-2584.

186. Wrenn B.A. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable number procedure / B.A. Wrenn, A.D. Venosa // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42. - P. 252-258.

187. Xu L. Role of the h/xS quorum-sensing system in biofilm formation and virulence of Staphylococcus epidermidis / L. Xu, H. Li, C. Vuong et al. II Infect. Immun. 2006. - V. 74, № 1. - P. 488-496.

188. Yajima A. A. Identification of platelet receptors for the Streptococcus gordonii DL1 sialic-acicl-binding adhesion / Yajima, Y. Takahashi, K. Kohishi // Microbiol. Immunol. 2005. - V. 49, № 8. - P. 795-800.

189. Yousef F. In silico analysis of large microbial surface proteins / F. Yousef, M. Espinosa-Urgel // Res. Microbiol. 2007. - V. 158. - P. 545-550.

190. Yun S. Removal of volatile fatty acids with immobilized Rhodococcus sp. B261 / S. Yun, Y. Ohta // Bioresour. Technol. 2005. - V. 96. - № 1. - P. 41-46.

191. Zhang Y. Inactivation of Streptococcus gordonii SspAB alters expression of multiple adhesin genes / Y. Zhang, Y. Lei, A. Nobbs et al. II Infect. Immun. -2005. V. 73, № 6. - P. 3351-3357.

Информация о работе

Криворучко, Анастасия Владимировна
кандидата биологических наук
Пермь, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно