Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus

Максимова, Юлия Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus"

На правах рукописи

МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна

биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий

рода шюпососсиь

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь-2006

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Демаков Виталий Алексеевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор биологических наук Кариунниа Тамара Исаковна

Ведущая организация: Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа

Защита состоится 2006 г. в ^ часов на заседании

Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс; (342)244 67 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «Л&», ИСиЛ^С? 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, член-корреспондент РАН

Ив шина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В естественной среде, особенно в почве, ил ах и на поверхности растений, микроорганизмы существуют в основном в иммобилизованном состоянии. Способность прикрепляться к поверхности твердых веществ является естественным свойством бактериальных клеток, которое может быть использовано в технологиях, реализующих нх биосинтетические и биокаталитические возможности. Известно, что адсорбция микроорганизмов на поверхности носителя ведет к изменениям некоторых физиологических процессов, протекающих в клетках, в частности, ферментативных реакций. Однако это слияние в настоящее время недостаточно исследовано.

Использование ферментов и клеток, обладающих определенной ферментативной активностью, в качестве биокатализаторов в органическом синтезе является быстро развивающимся направлением биотехнологии. Применение ферментов в промышленном биокатализе ограничено вследствие их низкой стабильности и высокой стоимости чистых препаратов. Иммобилизация клеток микроорганизмов дает ряд преимуществ, как перед свободными клетками, так и перед иммобилизованными ферментами. Живая клетка представляет собой готовый биохимический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других, способствующих поддержанию каталитической активности системы на высоком уровне (Тривен, 1983).

Успешным опытом применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза является производство амидов, в частности, акрил амида с применением биомассы тпр ил гидролиз ующик микроорганизмов (Астаурова, 1991; Безбородое, 1991; Kobayashi et al., 1991; Pogorelova et al., 1996; Bunch, 1998; Hughes et ah, 1998;Baneijee etal, 2002; Mylerova, Martinkova, 2003). Для улучшения характеристик биокатализатора, наряду с подбором высокоактивных штаммов, необходим поиск подходящего носителя для иммобилизации бактерий, используемых в промышленном производстве. Дня иммобилизации, главным образом, используется метод включения в массу носителя: геля альгяната кальция либо бария (Hann, 1999; Dias et ah, 2001; Graham, 2000), агара и атарозы (Colby et al, 2000) к-каррагинана {Dias et al, 2001), поливинилового спирта (Mylerova, Martinkova, 2003) и полиамидамида (Watanabe, 1987; Kobayashi et al, 1992; Hughes et al, 1998). В то же время недостаточно внимания уделяется адсорбционной иммобилизации, в частности, на активированных углеродных носителях, отличающихся инертностью, невысокой стоимостью, химической и биологической стойкостью. Несмотря на то, что первые работы, посвященные адсорбции клеток на углях были выполнены в 1898 году, длительное время эти носители не использовались для иммобилизации (Давнденко, 1995).

Цель настоящего исследования - изучение влияния иммобилизации клеток и свойств носителей на ферментативную активность и физиологические характеристики актинобактерий рода Rhodococcus, обладающих нитрилгидратазной активностью.

Основные задачи исследования:

1. Изучить воздействие различных способов иммобилизации на нитрилгидратазнуто активность штаммов R. ruber gtl и R. erythropolis 84.

2. Определить сорбционную емкость исследуемых носителей по отношению к микроорганизмам, субстрату и продукту ферментативной реакции.

3. Оценить возможность многократного использования иммобилизованных клеток в биокаталитическом процессе.

4. Сравнить возможность роста клеток штамма R. ruber gll на активных углях различных видов и новых углеродсодержащих носителях.

Научная новизна. На основе сравнительного анализа выявлены преимущества адсорбционного метода иммобилизации клеток промышленно значимых штаммов, обладающих высокой шприлгидратазной активностью, перед методами включения в гель и ковалентного присоединения. Установлено, что адсорбционная иммобилизация не приводит к потере нитрилгидратаэной активности, в отличие от других изученных методов. Обнаружено, что адсорбция на активных углях стабилизирует иитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования биокатализатора. Впервые показано влияние пористой структуры, дисперсионного состояния ряда углеродсодержащих адсорбентов, свойств поверхности композиционных материалов на адсорбцию клеток, субстрата и продукта маркерной ферментативной реакции.

Теоретическое и практическое значение работы. Выполненные исследования расширяют представления о воздействии различных способов иммобилизации на ферментативную активность микробных клеток. Выявлен наиболее эффективный метод иммобилизации промышленно значимых нитрилгидролизующих бактерий. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологического процесса синтеза акриламида иммобилизованным биокатализатором в непрерывных условиях, а также при разработке технологии очистки стоков от акрилонитрила и оптимизации технологических режимов очистки растворов акриламида.

Основные положения, выноснмые на защиту,

]. Наиболее перспективными носителями для адсорбционной иммобилизации клеток родококков являются адсорбенты, обладающие следующими характеристиками: (1) развитая система макропор, (2) мелкодисперсиость, (3) шероховатый поверхностный слой.

2. Адсорбционная иммобилизация стабилизирует нитрилгидратаэную активность в условиях повышенной температуры и воздействия высоких концентраций токсичного субстрата, обеспечивая многократное использование биокатализатора.

3. Включение клеток в ионотропные, термотролные и ковал ентносвязанные гели приводит к значительному снижению скорости нитрилгидратазной реакции.

4. Ко валентное связывание в ряде случаев обеспечивает более высокую клеточную нагрузку носителя, чем адсорбция, но приводит к снижению нитрилгидратазной активности.

Апробация работы в публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», ГГущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005; Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ.

Объем в структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 12 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов н методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 159 наименований работ отечественных (33) и зарубежных (126) авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514, 2005-2006 гг, программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004-2006 гг., молодежного гранта УрО РАН №35,2004 г.

Список принятых сокращений: ГХ - газовая хроматография, ОП - оптическая плотность, НАК - нитрил акриловой кислоты, АА - акр ил амид, LB - среда Луриа-Бертани, КВУ - каталитический волокнистый углерод, ПААГ - полиакриламидный гель, ПВС - поливиниловый спирт, МИК - минимальная ингибирующая концентрация.

Благодарности. Автор выражает благодарность лроф, д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; к.х.н., с.н.с. Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН ГЛ. Коваленко за предоставленные образцы

углеродсодержащнх носителей и помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии образцов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. Объектом исследования являются штаммы Я. ruber gtl и R. eryihropolis 84, обладающие высокой нитрил гидратазной активностью, полученные в результате селекции в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН.

Среды я условия культивирования. Для выращивания ннтрилгидролнзующих бактерий использовалась синтетическая среда N (солевая основа) следующего состава (г/л): KIIjPO, - 1,0; К5НР04><ЗН20 - 1,6; NaCI - 0,5; MgS04*?HiO - 0,5; СаС12 - 0,005; СоС1г*бН20 - 0,01; FeS04*7Hj0 - 0,005; рН 7,2 ± 0,2. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1%, азота—NH4CI в концентрации 10 мМ.

Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл при температуре 28°С и постоянном перемешивании со скоростью вращения 120об./мин. Бактериальный рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при Х=540 нм с учетом разведения. Одна единица ОПМо соответствует 0,436 мг сухих клеток.

Носители для адсорбционной иммобилизации. В качестве носителей использовались углеродные сорбенты: уголь активный березовый дробленый БАУ, уголь ахтивный гранулированный ФТД, активная углеродная ткань «Урал», активный нетканый материал «Войлок», углеродный активный материал ФАС на основе фуриловой смолы (пр-во Россия), уголь активный дробленый NORIT РК 1-3 (пр-во Голландия), уголь-сырец, измельченный до порошкообразного состояния с размером частиц 50-300 мкм. Ряд носителей был представлен композиционными материалами на основе керамзита с синтезированными на поверхности слоями каталитического волокнистого углерода (КВУ) и графитоподобного углерода. В качестве адсорбентов также использовались углеродные носители марок Сибунит, приготовленный путем карбонизации графитизированной сажи, и Сапропель, приготовленный путем карбонизации илистых отложений озер, а также массивный КВУ.

Определение нктрн л гидратазной активности иммобилизованных клеток н клеток в суспензии. Нитрилгидратазную активность иммобилизованных клеток и бактерий в суспензии измеряли по изменению концентрации амида в реакционной среде за 10 минут трансформации. Удельную активность фермента определяли как количество амида в мкмоль, образуемое за 1 минуту биомассой бактерий, соответствующей 1 мг сухого веса. Единица нитрилгидратазной активности (1 ЕД) соответствует 1 мкмоль амида/мг сухих клеток/мин.

Определение сорбцнонкой емкости носителей по отношению к клеткам, субстрату и продукту нитрнлгмдратазной реакции. Количество адсорбированных клеток определяли по разности оптической плотности (ОПж) культуральной срсды до и после сорбции. Сорбцнонную емкость по отношению к клеткам выражали в мг сухих клеток на г носителя. Количество адсорбированного акриламида определяли по разности оптической плотности (ОПмо) раствора акрил амида до и после сорбции. Концентрацию акрилонитрила в надое адочной жидкости после сорбции определяли на газовом хроматографе Chrom 5d ("LP", Чехославакня).

Определение операционной стабильности иммобилизованных клеток и клеток в суспензии. Операционную стабильность иммобилизованных и свободных клеток оценивали по сохранению каталитической активности при последовательном проведении циклов ннтрилгмдратазной реакции. Цикл реакции представлял собой 20-минутную полную трансформацию акрилонитрила, вносимого до концентрации 10% (объем/объем) в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера, с последующей отмывкой клеточного центрифугата, либо носителя с иммобилизованными клетками 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2±0,05. Реакция катализировалась иммобилизованными или свободными клетками активностью 200 мкмоль/мг/мнн, взятыми в количестве 2,5 мг, в пересчете на сухой вес. Отбор проб на определение нитрилгидратазной активности проводили через 10 минут после внесения субстрата.

Статистическая обработка. Все опыты повторяли не менее трех раз. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы. Достоверность различий оценивали с использованием критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов программ MS Excel 2003 и Statistics.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфология клеток актннобактернй рода Rhodococcus, выращенных на минимальной н богатой средах. Изучение морфологии с помощью фазово-контрастной микроскопии показало, что на стадии наибольшей каталитической активности палочковидные клетки R. ruber gtl достигают а длину 1-7 мкм, a R. erythropolis 84 -3 мкм (рис.1,2). Клетки, выращенные на жидкой синтетической среде N, до фазы роста, соответствующей максимальной активности, были взяты для иммобилизации.

• : . ■ л.

/ у ":: .. (. ,. «

да Ш^ФШШФ^;

• ^ 4 мкм

Рис.2. Клетки Д егу1ЬгороШ 84 в первой трети экспоненциал!.ной фазы роста на жидкой минимальной срезе.

Сорбцнонная емкость активных углей по отношению к клеткам родококков, субстрату н продукту нитрил газ ратазной реакции. Определена способность клеток родококков адсорбироваться на углеродных носителях, отличающихся по структуре и пористости. Процесс адсорбции зависит от площади доступной поверхности и адгезии клеток к поверхности носителя. Очевидно, что площадь поверхности пористых носителей, доступная для адсорбции клеток, слагается в основном из макропор, превышающих по размерам микробную клетку.

Установлено, что наибольшее количество клеток адсорбирует БЛУ - 14,6 мг сухих хл. на 1 г носителя (табл. 1). БЛУ обладает развитой системой макропор (1,35-1,45 смэ/г>, что составляет 80-82% от общего объема пор. Показано, что дисперсионное состояние углеродных сорбентов также имеет значение для процесса адсорбции клеток. Так, мелкодисперсность ФТД и угля-сырца обеспечивает адсорбцию родококков, сравнимую с БЛУ. Среди изученных сорбентов, активный нетканый материал «Войлок» имеет наименьший суммарный объем пор - 0,60-0,68 см3/г, в то время хак у ФЛС суммарный объем микро- и мезопор на порядок превышает объем макропор, что отражается на процессе адсорбции клеток. Па процесс адсорбции влияют поверхностные свойства как носителя, так и микробной клетки, а основной вклад в адсорбционные взаимодействия вносят гидрофобные связи. Известно, что родококки обладают гидрофобной поверхностью, а активные угли являются гидрофобными сорбентами (Давиденко, 1995), что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток на этих носителях.

Рис.1. Клетки A ruber gtl в стационарной фазе роста на жидкой минимальной среде.

Таблица 1.

Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к клеткам родо кокков, субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции

Носители Сорбционная емкость

к клеткам, мг сухих кл7г к НАК, мг/г к акриламиду, мг/г

Носители, свободные от клеток Носители, нагруженные клетками

БАУ 14,б±1,0 350,0±б,5 22,0±2,5 б,6±2,9

1ЯОЫТ РК1-3 13,2±1,1 27 В,3± 1,0 1б,7±1,7 7,5±0,б

ФТД 12,0±2,3 217,4±1,1 1М±1,0 9,5±0,9

уголь-сырец 12,4±1,0 187,3±17,3 2,9±0,5 0,1±0,1

«Урал» 9,5±1,0 287,4±2,1 27,2±1,8 1б,8±0,6

«Войлок» 7,4±1,7 36б,0±51,0 10,б±0,5 4,6±1,б

ФАС 8,1±1,1 359,0*49,3 1б,5±0,7 11,2±3,2

Для адекватной оценки нитрилгидратазной активности иммобилизованных клеток бактерий необходимо определить количество адсорбированных на носителях субстрата и продукта ферментативной реакции. Определена сорбционная емкость углеродных носителей по отношению к акрилотлрилу — субстрату ферментативной реакции, катализируемой нитрилгидратазой. Показано, что высокой сорбционной емкостью (до 350-400 мг/г) обладали БАУ, «Войлок» и ФАС (табл. 1). Минимальная адсорбция наблюдалась на угле сырце. Следуя полученным данным, на БАУ, «Войлоке» и ФАС сорбируется около 15% субстрата, внесенного в концентрации 1 М и 50% - 0,3 М.

При использовании иммобилизованных клеток в производственных процессах важно, чтобы продукт ферментативной реакции минимально адсорбировался на носителе. С целью оценки сорбционной емкости углеродных сорбентов по отношению к продукту реакции проводили адсорбцию акриламида из 10 мМ раствора. Установлено, что носители с иммобилизованными на них клетками адсорбируют значительно меньше акриламида, чем свободные от клеток (табл. I).

Рис. 3. Клетки R. ruber gtl, адсорбированные на активных углях. А, Б - БАУ, В - ФТД, Г - NORIT РК 1-3, Д - ткань «Урал», Е - «Войлок».

С помощью сканирующего электронного микроскопа были получены микрофотографии клеток родококков, адсорбированных на углеродных носителях (рис. 3). Обнаружено, что поверхность макропор БАУ и N0(117 РК 1-3 эффективно

заполняется клетками, которые густо покрывают ее подобно сетке или платной пленке. Диаметр макропор БАУ, Г-ЮЫТ РК 1-3 и ФТД находится в диапазоне 5-40 мкм, 2-30 мкм и 7-15 мкм соответственно, что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток, достигающих в фазе наибольшей каталитической активности от I до 7 мкм в длину. Напротив, у ФАС пористая структура создается в основном микропорами, недоступными для клеток, адсорбция которых наблюдается лишь па небольшой площади поверхности гранул.

Таким образом, клетки более полно покрывают поверхность макропор дробленого активного угля БАУ, ЫОЫТ РК 1-3 и угля-сырца, в отличие от волокон «Войлока» и доступной поверхности ФАС. Меньшая сорбционная емкость «Войлока» и ФАС по сравнению с другими активными углями подтверждается электронно-микроскопическим методом. Как показано далее, данные микроскопии согласуются с результатами экспериментов по выращиванию клеток в присутствии сорбентов: на ФАС образуется значительно меньше биомассы, чем на других активных углях.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что для иммобилизации каталитически активных клеток наиболее предпочтительными среди изученных носителей являются дробленые активные угли, т.к. они сочетают наибольшую способность к адсорбции клеток с наименьшей адсорбцией продукта нитр и лпндратазн ой реакции. Значения адсорбционной емкости гранулированного активного угля ФТД и мелкодисперсного угля-сырца по отношению к клеткам и акриламиду приближаются к таковым дробленых активных углей, но эти носители в большей степени подвержены абразивному истиранию, что затрудняет их использование в технологических процессах.

Сорбционная емкость новых углеродсодержащих носителей но отношению к клеткам родококков и акриламиду. Проведена иммобилизация клеток Я. гиЫг ¿П н Д. егуЛгороШ 84 на новых углеродсодержащих адсорбентах, В качестве носителей были выбраны композиционные материалы на основе керамзита с синтезированными на поверхности слоями каталитического волокнистого углерода (КВУ) и графитоподобного углерода, а также массивный КВУ и углеродные носители, приготовленные путем карбонизации графитизированной сажи (Сибунит) и илистых отложений озер (Сапропель),

Установлено, что независимо от морфологии углеродного слоя, адсорбционная емкость композиционных материалов на основе керамзита, как и массивного КВУ, по отношению к родококкам составляла 4 мг сухих клеток на 1 г носителя (табл. 2). Сорбционная емкость Сапропеля по отношению к клеткам составила 2,5 мг сухих клеток на 1 г носителя. Показано, что внутренняя поверхность шнрокопоркстого Сапропеля доступна для адсорбции клеток микроорганизмов размером 1 мкм и более. Величина адсорбции родококков на мезопористом Снбуните сравнима с адсорбцией клеток на

Сапропеле и достигает 2 мг/г носителя, что может быть связано с эффективной адсорбцией клеток на более шероховатой поверхности Сибушгга. В отличие от композиционных материалов на основе керамзита и массивного КВУ, Сибунит и Сапропель адсорбировали акриламид. .

Таблица 2.

Сорбционяяя емкость углерод содержащих носителей по отношению к клеткам родококков н акриламнду

Углсродсодержащие носители Сорбционная емкость по отношению к клеткам, мг сухого веса/г носителя Сорбционная емкость по отношению к акриламцду, мг/г

Массивный КВУ 4,35±0,14 0

Керамзит/ 4,13 ±0,3 8 0

графнтоподобны й слой

Керамзит/КВУ-сл ой 4,09*0,03 0

(6,47 вес%)

Керамэит/КВ У-слой 4,17±0,05 0

(2,84 - 3,63 вес%)

Сибунит 2,01*0,17 5,31 ±0,60

Сапропель 2,55±0,25 3,92±0,53

Рост штамма R. ruber gtl па углеродных сорбентах и образование акриламида н м мобилизован и ымн клетками. Показано, что процесс адсорбции на углеродных материалах не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность клеток. При культивировании родококков в присутствии углеродных сорбентов рост клеток происходил в основном на носителях (табл. 3). При этом количество выросшей на них (за исключением «Войлока» и ФАС) биомассы, превышало таковую без сорбента, что подтверждено гравиметрически и по возрастанию общей активности (рис. 4).

Определено количество акриламида, образующегося в результате трансформации HAK биомассой R. ruber gtl, выросшей на сорбентах в течение 7-и суток культивирования (рис. 4). Установлено, что биомасса на активных дробленых и гранулированных углях, угле - сырце и ткани «Урал» образует в результате 10-минутной конверсии 1,3 М раствора HAK больше акриламнда, чем 7-и суточная суспензия клеток. Таким образом, очевидно, что при адсорбции на широкопористых носителях создаются благоприятные условия для роста бактерий.

Таблица 3.

Рост штамма В, гиЬег%И в жидкой фазе в присутствии углеродных сорбентов

Время роста, ч

Носитель 4 24 48 72 96

ОПц0 ЕД опш ЕД ОП„0 ЕД оп„„ ЕД ОП540 ЕД

Суспензия клеток 0,022 165 0,094 162 0,616 123 0,760 126 0,784 163

БАУ 0,006 23 0,01« 14 0,04 37 0,044 75 0,058 92

ЫОШТ РК 1-3 0,004 9 0,067 9 0,102 9 0,124 28 0,072 35

ФТД 0,007 0 0,041 0 0,217 34 0,260 83 0,260 64

уголь-сырец 0,002 0 0,005 0 0,166 5 0,272 36 0,112 14

«Урал» 0,002 0 0 0 0 0 0 0 0 0

«Войлок» 0,001 О 0 0 0 0 0 0 0 0

ФАС 0,023 46 0,054 106 0,228 219 0,196 209 0,036 279

БД - нитрилгидратазная активность среды культивирования, мкмоль амнаа/мг сухих клеток/мин.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Обшая активность биомассы Я. гиЬег& 1, полученной на углеродных носителях в течение 7-и суток роста.

] - БАУ, 2 ~ ЫОЫТ РК 1-3, 3 - ФТД, 4 - уголь-сырец, 5 - «Урал», 6 - «Войлок», 7—ФАС. 100%- нитрилгидратазная активность 7-и суточной суспензии клеток.

Нитрил гид ратвпная активность в операционная стабильность биоката лизятора, иммобилизованного на углеродных сорбентах. Определена нитрилгидратазная активность клеток родококков, иммобилизованных на углеродных носителях. Установлено, что скорость нигрилшдратаэной реакции, равная максимальной для шггактных клеток, у иммобилизованных на углеродных сорбентах родококков достигается при возрастании концентрации субстрата до 0,8-1,3 М. При высоких концентрациях субстрата нитрилщдратазная активность клеток, адсорбционно иммобилизованных на активных углях и новых углеродсодержащих носителях, превышает на 20-40% ее максимальное значение у интактных клеток.

С целью оценки операционной стабильности клеток Я ruber gil и R. erythropoiis 84 проведены повторные циклы полной трансформации 13 ммоль акрилонитрила (концентрация раствора - 10%). Оказалось, что нитрилщдратазная активность суспензии клеток R. ruber gtl уже во втором цикле реакций снижается в два раза, а к 6-му циклу остается менее 10 % первоначальной активности (рис. 5А).

т-

4 5 6 7 Количество циклов

100 во 60 40 20 0

4 Б в

Количество циклов

Рис. 5. Полная конверсия 10%-ного (объем/объем) HAK суспензией клеток A-R. ruber gtl, Б - R. erythropoiis 84.

100% • исходная нитрнлгцдратазная активность клеточной суспензии.

В то же время, китрилгидратазная активность суспензии клеток R. erythropoiis 84 уже ко 2-му циклу составила лишь 10% от первоначальной активности (рис. 5Б). Более низкая операцио1шая стабильность нитрнлгидратазы клеток R. erythropoiis 84, по-видимому, связана с ее меньшей термостабильностью у этого штамма (Кузнецова, 2004) и быстрой инактивацией при экзотермической реакции гидролиза нитрила.

Определено влияние адсорбционной иммобилизации клеток на операционную стабильность внутриклеточной нитрилгидратазы при повторных циклах полной

конверсии 10%-ного(обУоб.) раствора HAK (рис. 6). % %

«отчество циклов Колтестео циклов

Рис. б. Операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах.

1 - уголь-сырец, 2 - БАУ, 3 - «Войлок», 4 - ЖЖГГ РК 1-3, 5 - ФТД, 6 - «Урал», 7 - ФАС. 100% - исходная нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток.

Показано, что клетки И гиЬег$.\, адсорбированные на волокнистых углеродных материалах, начинают терять свою активность после прохождения пяти циклов реакции. Би о катализатор, иммобилизованный на БАУ, ФТД и ФАС сохраняет первоначальную активность на протяжении б циклов, а на угле-сырце и МОЮТ РК 1-3 — на протяжении 7 циклов реакций.

При конверсии акрилошггрнла адсорбционно иммобилизованными клетками Я. егуЛгороШ 84 подобного сохранения нитрилгидратазной активности не наблюдалось. Однако нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток в биокаталитическом процессе была несколько более стабильной, чем у клеток в суспензии: ко второму циклу регистрировали 30% остаточной активности, тогда как в суспензии - лишь 10%.

Сохранение активности в повторных циклах трансформации НАК при более высоких его концентрациях, по сравнению с технологическими, может объясняться защитным действием активных углей. Вероятно, оно проявляется не столько в адсорбции части токсичного субстрата, сколько в отведении (вследствие разности теплопроводности носителя и водной фазы) от клеток избыточного тепла, выделяющегося в результате экзотермической реакции трансформации нитрила, тепловой выход которой составляет 18-19 ккал/мсль (Аликин, 1999).

Скорость нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками родококков, включенными в гели альгината бария, к-каррагннана и агара.

Показано, что каталитическая активность клеток родококков при иммобилизации включением в гранулы гелей альгината бария, к-каррагинана и агара, резко падает.

О 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5

Концентрация HAK, М

Рис. 7. Скорость нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками R. ruber gtl, иммобилизованными включением в гель альгината барня.

100% - нитрилгидратазная активность клеток в суспензии.

Так, при возрастании концентрации HAK до 0,3 М скорость нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками R. ruber gtl, иммобилизованными в геле альгината бария, увеличивалась, а при дальнейшем повышении концентрации оставалась на уровне, не превышающем 11% максимальной активности клеток в суспензии (рис.7). Очевидно, что снижение скорости нитрилгидратазной реакции при включении клеток в гели связано с затруднением массо обмена в порах геля.

Иммобилизация клеток актннобактерий рода Rhodococcus ковалентным и мггаллохелатным способами. Определено количество клеток, иммобилизованных методами связывания с енликагелем, активированным хлоридом хрома (III); с полиамидом, активированным глутаральдегидом и с гидрооксидом титана (IV), в грамме носителя. Установлено, что наибольшей сорбционной емкостью по отношению к клеткам обладает гидрооксид титана (IV), который может связать до 200 мг бактерий (по сухому весу), а наименьшей — активированный хлоридом хрома сшшкагель (табл. 4). В то же время, клетки, ковалектно связанные с активированным енликагелем, сохраняют до 75% исходной нитрилгидратазной активности, тогда как хелатиро ванные гидрооксидом титана — не более 62%, а связанные с активированным полиамидом - не более 40%.

Таблица 4.

Сорбцноиная емкость активированных носителей по отношению к клеткам к ннтрилгидратазная активность родококков при ковалектком связывании

Носитель Сохранение активности, % Сорбцнонная емкость, мг/г

Силикагель, 40/100 мкм* 65,0±9,2 0,26*0,02

активированны й

хлоридом хрома (III) 100/250 мкм* 60,8±5,б 0,23±0,01

Гидрооксид титана (IV) 52,2*10,3 200

1,5%** 29,0 ±0,8 9,9±0,5

Полиамид, 2,5%** 26,5 ± 1,0 29,0±3,5

активированный глутаральдегидом 5%** 35,0 ±3,9 29,0*3,5

12,5%** 32,6 ±5,9 29,0±3,5

* - размер гранул силикагепя

** - концентрация раствора глутаралмегида (вес/объем)

Определена операционная стабильность клеток, иммобилизованных ковалентным и метаялохелатным способами. Клетки, иммобилизованные методом ковалентного связи ваггия на активированном силикагеле, не теряли нитрилгидратазную активность в течение 5 циклов последовательных ферментативных реакций (рис.8). Затем активность резко снижалась и к 8-му циклу составляла 6-9% от исходной. Однако, при иммобилизации бактерий на гидрооксиде титана (IV) не было обнаружено существенной стабилизации китрилгидратазной активности клеток (рнс.9): уже во 2-м цикле она составляла лишь 50% от первоначальной, а в 4-м цикле - около 20%,

Изучена операционная стабильность клеток, иммобилизованных на полиамиде, активированном 12,5% глутаральдегидом, с дофиксацней 0,1% глутаральдегидом и без дофиксации (рис. 10). Показано, что иммобилизованные клетки, дофиксированныс 0,1% раствором глутаральдегкца, в течение 5 циклов полной конверсии 10% раствора акрилояитрила сохраняют активность на более высоком уровне, чем не подвергнутые дофиксации. Так, во втором цикле у дофиксированных клеток сохранялось 83% нитрилгидратвзной активности, а у иммобилизованных без дофиксации - 37%, к третьему циклу оставалось 33% и 8%, а к шестому - 7% и 1%, соответственно.

Количество uncnos

Рис. 8. Операционная стабильность клеток R. ruber gtl* иммобилизованных на активированном силнкагеле.

1 - снликагель с зернистостью 40/100 мкм,

2 - силнкагель с зернистостью 100/250 мкм

100 % - исходная нитрилгидратазная актив

Количество циклов

Рис. 9. Операционная стабильность клеток R. ruber gll, «датированных гндрооксндом титана (IV).

иммобилизованных клеток.

Количество циклов

Рис. 10. Операционная стабильность клеток R. ruber gtl, иммобилизованных активированном 12,5% глутаральдегндом полиамиде.

1 - иммобилизованные клетки дофиксированы 0,1% глутаральдегкдом,

2 - иммобилизованные клетки без дофиксацни.

100% • исходная нитрилгидратазная активность иммобилизованных клеток.

В результате проведенных исследований установлено, что клетки R. ruber и R. erythropoOs, обладающие нитрилгидратазной активностью, эффективно адсорбируются и прочно удерживаются на углеродных носителях. Адсорбция на пористых и волокнистых углях и углеродсодержащих материалах не снижает, а стабилизирует иитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования бнокатализатора. Таким образом, адсорбция на углеродных носителях представляется наиболее перспективным способом иммобилизации клеток Jthodococcus для использования в микробиологических и биохимических исследованиях, а также в промышленной микробиологии. При сравнении иммобилизованных клеток R. ruber gtl и R. erythropalis 84 установлено, что преимущества адсорбционной иммобилизации более выражены для штамма Л. ruber gtl, нитрил гидратаза которого обладает большей термостабильностью и удельной активностью, чем нитрилгидратаза R. erythropolis 84. Таким образом, адсорбционно иммобилизованные клетки штамма R. ruber gtl представляют собой высокоактивный и стабильный биокатализатор и могут быть рекомендованы к использованию при разработке процесса биотехнологического синтеза акрила мида.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что адсорбционное взаимодействие обеспечивает эффективное связывание клеток с пористыми и волокнистыми углеродными носителями (от б до 15 мг клеток родококков на 1 г носителя в пересчете на сухой вес), при этом адсорбция клеток возрастает с увеличением доли макропор в структуре носителя, дисперсности и шероховатости его поверхности.

2. Установлено, что нитрилгидратазная активность адсорбционно иммобилизованных клеток R. ruber gtl и R. erythropolb 84 сохраняется на уровне активности клеток в суспензии, а при повышении концентрации субстрата до 1,3 М превышает ее в 1,2-2,8 раза.

3. Обнаружено, что включение клеток родококков в ионотропные и термотропные гели ведет к значительному снижению скорости нитрилгидратазной реакции (от 3 до 11 % от исходной), а включение в ковалентносвязанные полиакриламидные гели вызывает ее подавление (остаточная активность иммобилизованных клеток - 0,2%).

4. Определено, что металлохелатная иммобилизация на гидроокснде титана обеспечивает связывание большого количества биомассы - до 200 мг сухих клеток на 1 г носителя, при сохранении нитрилгидратазной активности до 62% от исходной. При ковалентном присоединении клеток нитрилгидратазная активность также снижается и не превышает 70% активности клеток в суспензии.

5. Установлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы иммобилизованных клеток, определяемая возможностью многократной полной трансформации 13 ммоль HAK, выше у клеток родококков, адсорбированных на активных углях, чем у иммобилизованных методами включения в гель, а также хелатирования ионами металлов и ковалентного присоединения.

6. Выявлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы адсорбционно иммобилизованных клеток штамма R. ruber gtl выше, чем Д. erythropotis 84.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

К Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов C.B., Максимова Ю.Г., Демаков В .А.. Влияние нитрилов и амидов на рост и ннтрилгадратазную активность штамма Rhodococcus зр. gtl//Прикладная биохимия и микробиология, - 2003. - Т. 39, N. 1.-С. 63-68.

2. Демаков В.А., Максимов А,Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов C.B., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis -продуцент нитрнлгидратазы". Патент на изобретение РФ № 2196822, Приоритет от 25.07.2001, Зарегистрир.в Госреестре изобр. 20.01.03,

3. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимов АЛО. Влияние иммобилизации клеток штамма Rhodococcus sp.gtl на активность нитрилгидратазы//Бнология наука XXI века: Матер, 7-й Путинской конф. молодых ученых. - Пущнко, 2003. - С. 115.

4. Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Иммобилизация клеток бактерий рода Rhodococcus, обладающих ннтрклгидратазной активностью/ТВ кн.: Экология: проблемы и цуги решения. -Пермь: ПГУ, 2003, - С, 124-127.

5. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов C.B., Овечкина Г.В., Максимова ЮГ., Ремезовская Н.Б., Гуссв ВА. Биоконвсрсия нитрилов штаммами-продуцентами нитрилгидролизующих ферментов//Биотехнологня: состояние и перспективы развития: Матер. II Московского междунар. конгресса. - М., 2003. - С. 279.

6. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов C.B., Максимов А.Ю. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gtl//В кн.: Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. - Пермь, 2004, - С, 93-101.

7. Максимова Ю.Г,, Кузнецова М.В., Козлов C.B., Максимов А.Ю, Олондсв В.Ф., Демаков В.А. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации бактерий -продуцентов нитрилгидратаз//Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: Матер. Всеросс. научной конф, с международным участием. - Белгород, 2004. - С. 93-96.

8. Максимова Ю.Г,, Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Операционная стабильность биокатализатора на основе R. ruber gtl, иммобилизованного включением в гель//Биотехнология микробов: Всеросс. симпозиум с международным участием. - М., 2004.-С.61.

9. Максимова Ю.Г,, Кузнецова М.В., Козлов C.B., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Биокатализатор на основе нитрилгидратазного штамма Rhodococcus sp.gtl, иммобилизованного на различных носителях .//Биология - наука XXI века: Матер. 8-й Путинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2004, - С. 269.

10. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Козлов C.B.,

Овечкина Г.В., Демаков В.А. Конверсия нитрилов карбоновых кислот штаммами R. erythropolts 84 н R. ruber gtl - продуцентами нитрилгидратаэ//Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии; Матер. Междунар. конф. -Минск, 2004. - С. 302-303.

11. Demakov V.A., Maksimov A.Yu., Kuznetsova M.V., Kozlov S.V., Maksimova Vu.G., Ovechkina G.V., Remezovskaya N.B., Gusev V.A. Nitrile bioconversion by strains producing nitrile hydrolyzing enzymesZ/Biotechnoîogy and Industry. - 2004, - P. 1-7.

12. Максимова Ю.Г. Сравнительный анализ и оценка различных способов иммобилизации Штамма Rhodococcus ruber gtl - продуцента нитрилгидратазы// Биотехнология; состояние и перспективы развития: Матер. III Московского междунар. конгресса. - М., 2005. - С. 199-200.

13. Максимова Ю.Г., Коваленко Г.А„ Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Иммобилизация клеток Rhodococcus ruber gtl, обладающих нитрилгидратазной активностью, на углеродсодержащих носителях//Там же. - С, 13.

14. Максимова Ю.Г., Максимов АЛО,, Демаков В.А, Сравнение различных способов иммобилизации штамма Rhodococcus ruber gtl - продуцента нитрилгидратазы//Биология - наука XXI века: Матер. 9-й Пушинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2005. - С. 355.

15. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus ruber gl 1//Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал: Матер. II Междунар. конф. - Пермь, 2005. - С. 61-62.

16. Максимова Ю.Г., Максимов АЛО., Демаков В.А. Влияние повышенной температуры на иммобилизованные клетки штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего ннтрилгцдратазой//Биологня - наука XXI века: Матер. 10-Й Пушинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2006. - С. 383.

17. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Биотрансформация нитрилов и эфиров карбоновых кислот//Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Матер. Междунар. науч. конф. - Минск, 2006. - С. 362-365.

18. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Иммобилизация бактерий, шдратирующих нитрилы//Микробные биотехнологии: Матер. Междунар. научн. конф. -Одесса, 2006.-С. 194.

Подписано в печать 15.11.2005. Бумага ВХИ. Формат 60X90/16. Набор компьютерный. Тираж 100 экз. Усл. веч, л, 1,0. Заказ № ) 19к/200б.

Издательский дом "Пресстайм" Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максимова, Юлия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ

1.1. Микробная конверсия нитрилов карбоновых кислот

1.2. Преимущества иммобилизации

1.3. Классификация методов иммобилизации

1.4. Иммобилизация на поверхности материала носителя

1.5. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации микроорганизмов

1.6. Иммобилизация клеток в массе носителя

1.7. Иммобилизация клеток с использованием мембранной технологии 32 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Среды культивирования

2.3. Носители для адсорбционной иммобилизации

2.4. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик

2.5. Определение активности нитрилгидратазы

2.6. Определение сорбционной емкости носителей по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции

2.7. Определение операционной стабильности иммобилизованных клеток и клеток в суспензии

2.8. Адсорбционная иммобилизация клеток бактерий

2.9. Иммобилизация бактериальных клеток включением в гель

2.10. Ковалентная иммобилизация бактериальных клеток

2.11. Микроскопия

2.12. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОВАКТЕРИЙ

РОДА RHODOCOCCUS НА УГЛЕРОДНЫХ СОРБЕНТАХ

3.1. Морфология клеток родококков, выращенных на минимальной и полноценной средах

3.2. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к клеткам бактерий

3.3. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции

3.4. Электронно-микроскопическое изучение адсорбции клеток родококков на углеродных носителях

3.5. Нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток родококков

3.6. Рост штамма R. ruber gtl на углеродных сорбентах и образование акриламида иммобилизованными клетками

3.7. Операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах

3.8. Влияние повышенной температуры на нитрилгидратазную активность клеток R. ruber gtl, иммобилизованных на БАУ

ГЛАВА 4. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS НА НОВЫХ УГЛЕРОДСОДЕРЖАЩИХ НОСИТЕЛЯХ

4.1. Сорбционная емкость новых углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам родококков и акриламиду

4.2. Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях

4.3. Рост клеток штамма R. ruber gtl на новых углеродсодержащих носителях

4.4. Электронно-микроскопическое изучение клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях

ГЛАВА 5. ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS МЕТОДАМИ: ВКЛЮЧЕНИЯ В ГЕЛЬ, МЕТАЛЛОХЕЛАТНЫМ И КОВАЛЕНТНОГО СВЯЗЫВАНИЯ С НОСИТЕЛЕМ

5.1. Скорость нитрилгидратазной реакции и операционная стабильность клеток родококков, включенных в гели альгината бария и кальция

5.2. Сохранение нитрилгидратазной активности клеток родококков, иммобилизованных включением в гели к-каррагинана и агара

5.3. Иммобилизация клеток родококков включением в ковалентносшитый ПААГ

5.4. Связывание клеток родококков с силикагелем, активированным хлоридом хрома (III)

5.5. Хелатирование клеток родококков гидрооксидом титана (IV)

5.6. Иммобилизация клеток родококков на полиамиде, активированном глутаральдегидом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus"

Актуальность проблемы

В естественной среде, особенно в почве, илах и на поверхности растений, микроорганизмы существуют в основном в иммобилизованном состоянии [28]. Способность прикрепляться к поверхности твердых веществ является естественным свойством бактериальных клеток, которое может быть использовано в технологиях, реализующих их биосинтетические и биокаталитические свойства. Известно, что адсорбция микроорганизмов на поверхности носителя ведет к изменениям некоторых физиологических процессов, протекающих в клетках, в частности, ферментативных реакций. Однако это влияние в настоящее время недостаточно исследовано [15].

Использование ферментов и клеток, обладающих определенной ферментативной активностью, в качестве биокатализаторов в органическом синтезе является быстро развивающимся направлением биотехнологии. По сравнению с традиционными химическими катализаторами, ферменты обладают значительным преимуществом, позволяя проводить синтез в мягких условиях, не требующих повышенной температуры, давления, агрессивных сред. Вследствие этого биокаталитические способы синтеза и конверсии органических соединений представляют собой малоотходные, высокоспецифичные, экологически безопасные, энергосберегающие процессы [33].

Эффективность биокаталитических процессов может быть увеличена путем иммобилизации используемых ферментов или клеток и перехода к гетерогенному катализу. В отличие от гомогенного, проходящего в коллоидных системах, гетерогенный катализ позволяет легко отделять биокатализатор от продуктов реакции, использовать проточные системы, а в ряде случаев стабилизировать активность фермента и использовать его повторно [18]. Применение ферментов в качестве биокатализаторов ограничено вследствие их низкой стабильности и высокой стоимости чистых препаратов [15, 18]. Иммобилизация клеток микроорганизмов дает ряд преимуществ, как перед свободными клетками, так и перед иммобилизованными ферментами. Живая клетка представляет собой готовый биохимический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других реакций, способствующих поддержанию каталитической активности системы на высоком уровне [18, 35].

В последние десятилетия ведущим направлением исследований в области микробного биокатализа является трансформация нитрилов [44, 52, 87]. Это вызвано успешным опытом использования нитрилгидролизующих бактерий в крупнотоннажном производстве акриламида, а также связано с перспективой их применения для промышленного синтеза ряда других амидосоединений, востребованных во многих сферах народного хозяйства [40, 55, 98, 118]. Применение иммобилизованных клеток является наиболее перспективным путем совершенствования этих процессов [84, 87, 98,118].

Состояние вопроса. В технологическом процессе иммобилизация была впервые использована более 150 лет назад. Однако бурное развитие методов иммобилизации началось с 70-х гг. XX века, что связано с потребностями фундаментальных исследований в области биохимии, молекулярной биологии, физиологии микроорганизмов и клеток эукариот, а также с разработкой современных биотехнологических производств. Исследования в данной области науки дали разнообразные способы сохранения активности биологических объектов, возможность изменять кинетические параметры, специфичность и стабильность ферментативных систем [16, 33].

Иммобилизация клеток и биополимеров позволяет решить широкий круг аналитических и препаративных задач. Области применения иммобилизации в фундаментальных исследованиях разнообразны - аффинная и циторецепторная хроматография, секвенирование ДНК и белков, синтез олигонуклеотидов, биосинтез ферментов и метаболитов, биосенсоры и др. Наиболее обширной сферой применения методов иммобилизации является биотехнология, в некоторых областях которой их развитие стало лимитирующей стадией [18].

В последние десятилетия продолжается поиск подходящих носителей и методов для иммобилизации промышленно важных штаммов. Разрабатываются технологические процессы производства этанола иммобилизованными клетками [50,79,91,96,110]. Перспективно использование иммобилизованных клеток в молочной промышленности [133]. Иммобилизованные клетки находят применение для получения ферментов: Aspergillus niger - пектиназы [127]; A. oryzae - L-аминоацилазы [155], Bacillus subtilis - щелочной протеазы [104, 146], Rhodococcus equi -холестерол-оксидазы [57]; дрожжи - пептидазы, инвертазы; В. megaterium -ß-амилазы; Е. coli - а-амилазы; щелочной фосфатазы, пенициллин ацилазы; Rhizopus chinensis, А. niger, Candida rugosa - липазы и т.д. [134]. Органические кислоты микробного происхождения, необходимые в медицине и пищевой промышленности, также могут быть получены с использованием иммобилизованных микроорганизмов. Имеются данные о применении иммобилизованных клеток A. niger и Yarrowia lipolitica с целью получения лимонной кислоты, Acetobacter sp. - уксусной кислоты, Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii, L. casei, Rhizopus oryzae, Pedioccus halophilus, Streptococcus salivarius - молочной кислоты [134]. При иммобилизации клеток может возрастать эффективность процессов биосинтеза антибиотиков. Проводятся работы по получению неомицина иммобилизованными клетками Streptomyces marinensis и S. fradiae [43], патулина - Penicillium urticae [47], окситетрациклина - S. rimosus, также имеются данные по синтезу иммобилизованными клетками бацитрацина, никкомицина, кандицидина, цефалоспорина, эритромицина, циклоспорина [134]. В биокаталитических процессах, альтернативных химическим, преимущество использования иммобилизованных клеток отмечается во многих случаях. Так, возрастает выход гидроксилированных углеводородов с сохранением высокой энантиоселективности при использовании в качестве биокатализатора иммобилизованных клеток В. megaterium [39]. Ферментативное восстановление органических нитросоединений с целью получения аминов, широко используемых в фармакологическом и химическом производстве, с более высоким выходом может производиться иммобилизованным биокатализатором на основе клеток Е. coli [12].

Успешным опытом применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза является производство амидов, в частности, акриламида, биомассой нитрилгидролизующих микроорганизмов [4, 5, 44, 52, 87, 98, 118, 131]. Для улучшения характеристик биокатализатора, наряду с подбором высокоактивных штаммов, необходим поиск подходящего носителя для иммобилизации бактерий, используемых в промышленном производстве. Главным образом, в качестве метода иммобилизации использовали метод включения в массу носителя, а в качестве носителя - гель альгината кальция либо бария [66, 81, 84], к-каррагинан [65], гель поливинилового спирта [46] и полиакриламидный гель [87, 98, 151]. В то же время, недостаточно внимания уделяется адсорбционной иммобилизации, в частности, иммобилизации на активированных углеродных носителях, отличающихся инертностью, невысокой стоимостью, химической и биологической стойкостью. Несмотря на то, что первые работы по иммобилизации на углях были выполнены в 1898 году, длительное время эти носители не использовались [11].

О методах, подходящих для иммобилизации очищенных нитрилгидратаз, известно немного. Очищенный фермент из R. equi был иммобилизован на целлюлозе и Эупергите С, но стабильность этих препаратов при повторном использовании была низкой [118].

Основные задачи исследования:

1. Изучить воздействие различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штаммов R. ruber gtl и R. erythropolis 84.

3. Оценить возможность многократного использования иммобилизованных клеток в биокаталитическом процессе.

4. Сравнить возможность роста клеток штамма R. ruber gtl на активных углях различных видов и новых углеродсодержащих носителях.

Научная новизна. На основе сравнительного анализа выявлены преимущества адсорбционного метода иммобилизации клеток промышленно значимых штаммов, обладающих высокой нитрилгидратазной активностью, перед методами включения в гель и ковалентного присоединения. Установлено, что адсорбционная иммобилизация не приводит к потере нитрилгидратазной активности, в отличие от других изученных методов. Обнаружено, что адсорбция на активных углях стабилизирует нитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования биокатализатора. Впервые показано влияние пористой структуры, дисперсионного состояния ряда углеродсодержащих адсорбентов, свойств поверхности композиционных материалов на адсорбцию клеток, субстрата и продукта маркерной ферментативной реакции.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Наиболее перспективными носителями для адсорбционной иммобилизации клеток родококков являются адсорбенты, обладающие следующими характеристиками: (1) развитая система макропор, (2) мелкодисперсность, (3) шероховатый поверхностный слой.

2. Адсорбционная иммобилизация стабилизирует нитрилгидратазную активность в условиях повышенной температуры и воздействия высоких концентраций токсичного субстрата, обеспечивая многократное использование биокатализатора.

3. Включение клеток в ионотропные, термотропные и ковалентносвязанные гели приводит к значительному снижению скорости нитрилгидратазной реакции.

4. Ковалентное связывание в ряде случаев обеспечивает более высокую клеточную нагрузку носителя, чем адсорбция, но приводит к снижению нитрилгидратазной активности.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь - Казань - Пермь, 2005, Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006.

По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, в т. ч. статья в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 2003, №1, с. 63-68. и

Получен патент Российской Федерации № 2196822 «Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 25.07.2001.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0 406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514, 2005-2006 гг., программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004-2006 гг., молодежного гранта по УрО РАН №35, 2004 г.

Список принятых сокращений: ГХ - газовая хроматография, ОП -оптическая плотность, HAK - нитрил акриловой кислоты, АА - акриламид, LB - среда Луриа-Бертани, КВУ - каталитический волокнистый углерод, ПААГ - полиакриламидный гель, ПВС - поливиниловый спирт, МИК -минимальная ингибирующая концентрация.

Благодарности. Автор выражает благодарность проф., д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; к.х.н., с.н.с. Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН Г.А. Коваленко за предоставленные образцы углеродсодержащих носителей и помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии образцов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Максимова, Юлия Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что адсорбционное взаимодействие обеспечивает эффективное связывание клеток с пористыми и волокнистыми углеродными носителями (от 6 до 15 мг клеток родококков на 1 г носителя в пересчете на сухой вес), при этом адсорбция клеток возрастает с увеличением доли макропор в структуре носителя, дисперсности и шероховатости его поверхности.

2. Установлено, что нитрилгидратазная активность адсорбционно иммобилизованных клеток R. ruber gtl и R. erythropolis 84 сохраняется на уровне активности клеток в суспензии, а при повышении концентрации субстрата до 1,3 М превышает ее в 1,2-2,8 раза.

4. Определено, что металлохелатная иммобилизация на гидрооксиде титана обеспечивает связывание большого количества биомассы - до 200 мг сухих клеток на 1 г носителя, при сохранении нитрилгидратазной активности до 62% от исходной. При ковалентном присоединении клеток нитрилгидратазная активность также снижается и не превышает 70% активности клеток в суспензии.

5. Установлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы иммобилизованных клеток, определяемая возможностью многократной полной трансформации 13 ммоль НАК, выше у клеток родококков, адсорбированных на активных углях, чем у иммобилизованных методами включения в гель, а также хелатирования ионами металлов и ковалентного присоединения.

6. Выявлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы адсорбционно иммобилизованных клеток штамма R. ruber gtl выше, чем R. erythropolis 84.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмпирические знания об иммобилизации клеток в технологических процессах, накопленные за более чем столетний период применения микроорганизмов в промышленном производстве, привели к необходимости систематизации касающихся данного вопроса сведений, осмысления закономерностей и, как результат, к поиску новых путей и возможностей. Это нашло отражение в неуклонном возрастании интереса к изучению процессов иммобилизации и функционирования иммобилизованных клеток, к разработке технологических схем на основе иммобилизованных клеток с требуемой ферментативной активностью. Микроорганизмы, обладающие ферментами гидролиза нитрилов, также являются объектом всестороннего изучения, что связано, прежде всего, с успешным опытом их применения в крупнотоннажном производстве акриламида из нитрила акриловой кислоты и перспективой использования в синтезе других важных в народном хозяйстве амидосоединений [52, 87, 98, 118].

Штаммы R. ruber gtl и R. erythropolis 84, обладающие высокой активностью нитрилгидратазы в сочетании с низкой амидазной активностью, были иммобилизованы различными способами на ряде носителей, отличающихся по физико-химическим свойствам.

Нами было показано, что адсорбционная иммобилизация на активных углях, отличающихся по пористости и дисперсности, не только не приводила к потере нитрилгидратазной активности, но и давала в результате повышение активности по сравнению с таковой клеток в суспензии. При повышении концентрации субстрата до 1,3 М наблюдалось возрастание ферментативной активности в 1,2-1,4 раза.

Известно, что на способность бактериальных клеток адсорбироваться на носителе влияют как поверхностные свойства клетки, так и физико-химические свойства носителя. В первую очередь, на количество адсорбированных клеток оказывает влияние соотношение макро- и микропор. Так, сорбционная емкость носителя по отношению к клеткам тем выше, чем больше суммарный объем макропор по сравнению с микропорами, причем диаметр макропор должен превышать величину бактериальной клетки. Среди изученных сорбентов данным требованиям в большей степени отвечает дробленый активный уголь БАУ, суммарный объем макропор которого составляет 80-82% от общего объема пор, а диаметр макропор лежит в диапазоне от 5 до 40 мкм, что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток данных видов родококков с длиной клетки в среднем 7 мкм. Мелкодисперсность также повышает величину адсорбции за счет возрастания общей доступной для клеток поверхности. Так, сравнимая с БАУ адсорбция наблюдается на измельченном до порошкообразного состояния угле-сырце и мелкодисперсном гранулированном ФТД.

М.А. Heitkamp и W.P. Stewart, сравнивая новый пористый нейлоновый носитель для клеток микроорганизмов с гранулированным активным углем, отмечают недостатки последнего, среди которых основными являются абразивное истирание и невысокая сорбционная емкость по отношению к клеткам [86]. Может быть подвергнуто сомнению, что в активном гранулированном угле большинство пор недоступно для микроорганизмов, т.к. в процессе изучения активных углей как носителей для иммобилизации целых клеток оказалось, что диаметр макропор дробленых и гранулированных активных углей находится в диапазоне от 5 до 40 мкм, что делает возможным адсорбцию клеток бактерий.

Основной вклад в адсорбцию клеток вносят гидрофобные связи. Известно, что родококки обладают гидрофобной поверхностью, а активный уголь является гидрофобным сорбентом [11]. Кроме того, родококки способны формировать многослойные биопленки на поверхности инертных материалов [21]. Следовательно, гидрофобные сорбенты, в том числе угли, более пригодны для иммобилизации микробных клеток, чем гидрофильные, а микроорганизмы с гидрофобной поверхностью быстрее формируют биопленку на носителе.

При оценке операционной стабильности было выявлено, что клетки R. ruber gtl, теряющие в суспензии 50% нитрилгидратазной активности ко второму циклу полной конверсии 1,3 М раствора HAK, при иммобилизации на активных углях способны выдержать 5-7 циклов конверсии без потери активности. Известно, что тепловой выход реакции гидратации HAK составляет +18-19 ккал/моль [2], а разогрев реакционной смеси приводит к падению активности фермента. В этом случае, вероятной причиной стабилизации нитрилгидратазной активности при адсорбционной иммобилизации бактерий может быть локальный отвод тепла от мест прикрепления иммобилизованных клеток через материал носителя, что устраняет локальные перегревы и снижает скорость тепловой денатурации при работе фермента. Это обусловлено разностью коэффициентов теплопроводности, составляющих для воды - 0,58, а для углеродных материалов - 1,19-1,23 Вт/м/К.

Падение активности после 5-7 циклов конверсии в нашем случае связано с инактивацией фермента, а не с вымыванием клеток, либо фермента из разрушенных клеток, что было определено по отсутствию нитрилгидратазной активности в промыве. В то же время, в литературных источниках подобный факт объясняется слабостью адсорбционных взаимодействий клетки и носителя и, как результат, смывом клеток при проведении последовательных циклов реакций [93].

Клетки штамма R. erythropolis 84 в суспензии обладают гораздо меньшей операционной стабильностью по сравнению с R. ruber gtl. Во втором цикле конверсии сохраняется лишь около 10% первоначальной активности, а стабилизация активности при адсорбционной иммобилизации незначительна и выражается в сохранении 30% активности во втором цикле реакций. Это связано, возможно, с более низкой термостабильностью нитрилгидратазы штамма i?, erythropolis 84 [22].

Тепловая денатурация внутриклеточного фермента при пролонгированном действии на клетки повышенной до 50-70°С температуры зависит от времени воздействия этой температуры. У иммобилизованных клеток она наступает позже и менее выражена, чем у клеток в суспензии, что также обусловлено защитным действием активных углей, которое обусловлено более высокой теплопроводностью этих носителей по сравнению с водой.

Нами была проведена адсорбция клеток родококков на новых углеродсодержащих адсорбентах с различной морфологией углеродного поверхностного слоя, синтезированного на поверхности керамзита, а также на углеродных носителях, приготовленных путем карбонизации графитизированной сажи (Сибунит) и илистых отложений озер (Сапропель). При сравнении новых карбонизированных носителей марки Сибунит и Сапропель установлено, что Сапропель является наиболее предпочтительным носителем для целых клеток вследствие широкопористой структуры.

Проведенные эксперементы подтвердили, что на биокаталитические свойства иммобилизованных клеток родококков существенно влияет морфология углеродного слоя. Как было показано Г.А. Коваленко с соавт., носители с синтезированным на поверхности шероховатым слоем КВУ являются оптимальными для иммобилизации нерастущих клеток дрожжей и растущих клеток алканотрофных родококков. Авторы наблюдали активацию в 1,5-1,8 раза внутриклеточной инвертазы у адсорбированных дрожжевых клеток и возрастание оксигеназной активности в 3,7 раза у адсорбированных родококков по сравнению с суспендированными клетками [21]. Нами было показано, что нитрилгидратазная активность клеток, иммобилизованных на Сапропеле, не только сохраняется на уровне активности клеток в суспензии, но и возрастает в 2-2,8 раза при повышении концентрации субстрата до 1,3 М. У клеток R. ruber gtl, адсорбированных на Сибуните и керамзите со слоем КВУ, наблюдалось повышение нитрилгидратазной активности в 1,22,3 раза. Повышение ферментативной активности адсорбционно иммобилизованных родококков, возможно, объясняется тем, что прикрепленное состояние для почвенных бактерий является естественным физиологическим состоянием в отличие от суспендированного в водной среде.

Активность клеток R. ruber gtl после иммобилизации на носителе со слоем гладкого графитоподобного углерода составляет лишь половину исходной активности суспензии и снижается уже во втором цикле последовательных ферментативных реакций. В то же время, нитрилгидратазная активность клеток, иммобилизованных на адсорбентах с шероховатым КВУ-слоем и на массивном КВУ, сохраняется на уровне активности клеток в суспензии в течение 6 последовательных циклов ферментативных реакций.

Таким образом, среди изученных углеродсодержащих композиционных материалов и карбонизированных адсорбентов наиболее перспективными для целей иммобилизации каталитически активных клеток являются носители с шероховатым КВУ-слоем, либо обладающие развитой системой макропор (Сапропель).

Для решения проблем, связанных с применением иммобилизованных клеток микроорганизмов в биокатализе, необходимы глубокие знания особенностей взаимодействия носителей и клеток, физиологии клеточных популяций, развивающихся внутри носителей и в присутствии носителей [28]. Нами проведено изучение растущих в присутствии активных углей и углеродсодержащих носителей клеток родококков. Было показано, что растущие в присутствии углеродных сорбентов клетки R. ruber gtl адсорбировались в процессе роста на носителях, оставались жизнеспособными и не снижали ферментативную активность. Количество выросшей биомассы превышало таковую в суспензии, что подтверждалось гравиметрически. Показано, что в результате адсорбции на изученных углеродных сорбентах создаются благоприятные условия для роста бактерий. При проведении реакции гидролиза НАК биомассой, адсорбированной на носителях в процессе роста и выросшей без сорбентов на жидкой среде того же состава в течение того же времени, оказалось, что общая активность клеток, адсорбированных на БАУ, NORIT РК 1-3, угле-сырце и Сапропеле превышает таковую клеток в суспензии; на Сибуните, ФТД и углеродной ткани «Урал» соответствует активности клеток в суспензии, а на нетканом материале и ФАС не достигает ее. Самое меньшее количество акриламида было образовано биомассой, адсорбированной на ФАС - всего 3,5 % от количества, образованного контрольной суспензией клеток. В присутствии ФАС рост клеток происходил в основном в среде культивирования, а не на носителе, что обусловлено преобладанием у ФАС микропор. Количество акриламида, образованного родококками, адсорбированными в процессе 7-ми суточного роста на Сапропеле было в 1,5 раза выше, чем клетками, иммобилизованными в процессе роста на Сибуните, и в 1,4 раза выше, чем количество акриламида, образованное 7-и суточной суспензией клеток. Это также может быть связано с широкопористостью Сапропеля, благоприятной для адсорбции клеток. Гладкий графитоподобный углеродный слой не может обеспечить эффективную адсорбцию клеток, в результате чего адсорбированная на нем биомасса производит в процессе конверсии акрилонитрила лишь 2 % от количества акриламида, образованного 7-суточной суспензией клеток.

Нами было изучено включение клеток родококков, обладающих нитрилигидратазной активностью, в ионотропные, термотропные и ковалентносвязанные гели. Несмотря на то, что включение в ионотропные гели альгината привлекает пристальное внимание в силу положительных моментов (высокая клеточная нагрузка, удобная в технологическом смысле форма биокатализатора, легкость отделения биокатализатора от среды, защита от неблагоприятных факторов внешней среды и чужеродной микрофлоры) [33, 39, 57, 77], в наших исследованиях перспективность этого метода иммобилизации для создания биокатализатора гидролиза нитрилов не была подтверждена. У клеток R. ruber gtl, включенных в гель альгината бария, сохранялось лишь 11% первоначальной активности, а у клеток

R. erythropolis 84 - не более 5%. Такое падение активности, вероятно, связано с ограничениями массопереноса в гранулах [8], т.к. при включении в гель альгината на клетки не действуют другие неблагоприятные факторы, такие как повышенная температура и токсичные связующие агенты. При иммобилизации в термотропный гель агара кроме диффузионных ограничений на функционирование фермента в клетке оказывала воздействие повышенная температура. В этом случае нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gtl не превышала 3% от активности клеток в суспензии. Снижение активности при включении клеток в агар отмечают K.D. Chapatwala et al при изучении процесса деструкции цианида клетками P. putida [58], А.Е. Китова с соавт. при изучении деградации 2,4-динитрофенола иммобилизованными клетками R. erythropolis HL РМ-1 [20].

Hughes et al. отмечали сохранение нитрилгидратазной и амидазной активности у штаммов R. erythropolis и R. rhodochrous и нитрилазной активности у штамма R. ruber при включении клеток в ПААГ. Авторы отмечают, что штаммы были устойчивы к условиям полимеризации акриламидного геля [87]. В нашем случае, включение в ковалентносвязанный полиакриламидный гель приводило к сильному падению нитрилгидратазной активности, которая составляла лишь 0,2% первоначальной. Это обусловлено тем, что контакт с токсичными мономерами и образующимися свободными радикалами при полимеризации акриламида отрицательно сказывался на ферментативной активности клеток [19].

Ковалентная иммобилизация клеток родококков также приводила к падению активности нитрил гидратазы. Нами была определена нитрилгидратазная активность клеток, иммобилизованных на силикагеле, активированном хлоридом хрома (III), на полиамиде, активированном глутаральдегидом, и клеток, хелатированных гидророксидом титана (IV). Показано, что при иммобилизации клеток R. ruber gtl на силикагеле, активированном хлоридом хрома (III), сохраняется 80% нитрилгидратазной активности, а при хелатировании клеток гидрооксидом титана (IV) - до 62%.

Активирование полиамида глутаральдегидом в концентрации 1,5%, 2,5%, 5% и 12,5% приводило к снижению нитрилгидратазной активности во всем диапазоне изученных концентраций активирующего вещества. Активность не превышала 40% от максимальной активности клеток в суспензии даже при возрастании концентрации субстрата до 1,63 М, что связано с отрицательным воздействием активирующего вещества на ферментные системы микроорганизма и жизнеспособность клеток в целом.

Таким образом, было показано преимущество адсорбционной иммобилизации каталитически активных клеток по сравнению с включением в гель и ковалентной сшивкой. Основные положительные моменты этого способа иммобилизации заключаются в сохранении, а при возрастании концентрации субстрата и в повышении ферментативной активности нитрилгидратазы по сравнению с таковой суспендированных клеток, а также с возможностью многократного использования иммобилизованных клеток при конверсии высоких концентраций НАК без потери активности. При сравнении иммобилизованных клеток штаммов R. ruber gtl и R. erythropolis 84 установлено, что преимущества адсорбционной иммобилизации более выражены для клеток штамма R. ruber gtl, нитрилгидратаза которого обладает большей термостабильностью и удельной активностью, чем нитрилгидратаза R. erythropolis 84. Из вышесказанного можно заключить, что адсорбционно иммобилизованные клетки штамма R. ruber gtl представляют собой высокоактивный и стабильный биокатализатор и могут быть рекомендованы к использованию при разработке процесса биотехнологического синтеза акриламида.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимова, Юлия Геннадьевна, Пермь

1. Абелян В.А. Иммобилизация клеток включением в аубазидан /

2. B.А. Абелян // Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36, N. 1. - С. 8588.

3. Аликин В.Н. Конверсия специальной технической химии. Пороха, топлива, заряды / В.Н. Аликин, Г.Э. Кузьмицкий, JI.B. Забелин и др. -Пермь: ПНЦ УрО РАН, 1999. С. 39-45.

4. Астаурова О.Б. Адаптация продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 к изменению концентрации аммония в среде / О.Б. Астаурова, Т.Е. Леонова, И.Н. Полякова и др. // Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36, N. 1. - С. 21-25.

5. Астаурова О.Б. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodochrous МО / О.Б. Астаурова, Т.Е. Погорелова, O.P. Фомина и др. // Биотехнология. 1991. - N. 5.1. C. 10-14.

6. Безбородов A.M. Биотехнология продуктов микробного синтеза /

7. A.M. Безбородов. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 165-171.

8. Березин И.В. Инженерная энзимология / И.В. Березин, A.A. Клесов,

9. B.К. Швядас и др. // В кн.: Биотехнология. Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. М.: Высшая школа, 1987. 143 с.

10. Биосенсоры: основы и приложения // Пер. с англ.; под ред. Э. Тернера, И. Карубе, Дж. Уилсон. М.: Мир, 1992. - 614 с.

11. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. М.: КолосС, 2004. - 296 с.

12. Вейко В.П. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8 / В.П. Вейко, A.C. Яненко, М.Г. Алексеева и др. // Биотехнология. 1995. - N. 5-6. - С. 3-5.

13. Воробьева О.В. Биосорбенты для иммобилизации белковых комплексов ферментных препаратов / О.В. Воробьева // Биотехнология. 2004. - N. 2 - С. 70-75.

14. Давиденко Т.И. Угольные материалы носители для иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов / Т.И. Давиденко. - Одесса: Изд-во ФХИ НАН Украины - 1995. - 36 с.

15. Давиденко Т.И. Восстановление нитрозамещенных соединений нативными и иммобилизованными клетками Escherichia coli / Т.И. Давиденко, Г.И. Бондаренко // Прикл. биохим. микробиол. -2000. Т. 36, N. 1.-С. 74-79.

16. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб // Пер. с англ. М.: Мир. -1966.-816 с.

17. Доронина Н.В. Биодеградация метилацетата и этилацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas esterophilus / Н.В.Доронина, Н.М. Назаров, В.А. Ежов, Ю.А. Троценко // Прикл. биохим. микробиол. 2006. - Т. 42, N. 1. - С. 52-54

18. Егоров Н.С. Биотехнология. Проблемы и перспективы / Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов. Т.1. - М.: Высшая школа. - 1987. -С. 99-121.

19. Егорова Т.А. Основы биотехнологии / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. М.: Издательский центр «Академия» - 2003. - 208 с.

20. Забазная Е.Б. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.Б. Забазная, С.В. Козулин, С.П.Воронин // Прикл. биохим. микробиол. 1998. - Т. 34, N. 4. -С. 377-381.

21. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы./ Под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир. - 1988. - 215 с.

22. Калбин Г.Г. Иммобилизация клеток в ионотропные гели карбоксиметилцеллюлозы: Дисс. . канд. техн. наук / Г.Г. Калбин. -Таллинн, 1990.- 179 с.

23. Китова А.Е. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 / А.Е. Китова, Т.Н. Кувичкина, А.Ю. Аринбасарова, А.Н. Решетилов // Прикл. биохим. микробиол. 2004. - Т. 40, N. 3. - С. 307-311.

24. Кузнецова М.В. Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus продуцентов нитрилгидратазы: Дис. . канд. биол. наук / М.В. Кузнецова. - Пермь, 2004. - С. 90, С. 64-65.

25. Курдиш И.К. Применение высокодисперсных материалов в технологии культивирования и получения гранулированных препаратов Agrobacterium radiobacter / И.К. Курдиш, JLB. Титова // Прикл. биохим. микробиол. 2001. - Т. 37, N. 3. - С. 369-373.

26. Макаренко A.A. Деградация «-толуолсульфоната иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) / A.A. Макаренко, А.Ю. Аринбасарова, Т.Н. Кувичкина и др. //Прикл. биохим. микробиол. 2005. - Т. 41, N. 5. - С. 521-524.

27. Нестеренко O.A. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / O.A. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наукова думка, 1985.-С. 112-123.

28. Олонцев В.Ф. Российские активные угли / В.Ф. Олонцев, P.A. Безруков М.: Изд-во ГУ ВШЭ, 1999. - 90 с.

29. Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. -М.: МГУ, 1989. 509 с.

30. Промышленная микробиология // Под ред. Н.С. Егорова. -М.: Высшая школа, 1989. С. 216-235.

31. Рогачева С.М. Респираторная активность микробных клеток Rhodococcus rhodochrous М8, продуцирующих нитрилгидролизующие ферменты / С.М. Рогачева, О.В. Игнатов // Прикл. биохим. микробиол. 2001. - Т. 37, N. 3. - С. 326-331.

32. Сапунова Л.И. Свойства препарата иммобилизованных клеток Arthrobacter sp. продуцента ксилозо(глюкозо)изомеразы / Л.И. Сапунова, А.Г. Лобанок, Е.В. Парахня, И.О. Казакевич // Микробиология. - 2003. - Т. 72, N. 3. - С. 395-399.

33. Сергеев В.В. Выделение и очистка биологически активных веществ циторецепторной аффинной хроматографией: Дисс. . канд. биол. наук /В.В. Сергеев. Л., 1991. - С. 50-53.

34. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. -М.: Изд-во МГУ. 1994. - 288 с.

35. Слабова О.И. Иммобилизация олиготрофных бактерий на пористых носителях методом сорбции / О.И. Слабова, Д.И. Никитин // Микробиология. 2005. - Т. 74, N. 3. - С. 430-432.

36. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М.: Мир. -1983.-213 с.

37. Федоров А.Ю. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы / А.Ю. Федоров, Е.В. Волченко, И.Н. Сингирцев и др. // Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36, N. 1.-С. 59-67.

38. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш. -М.: Мир. 1991.-204 с.

39. Abdel-Naby M.A. Immobilization of Aspergillus niger NRC 107 xylanase and beta-xylosidase, and properties of the immobilized enzymes. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. - V. 38 (1-2). - P. 69-81.

40. Adam W. Biocatalytic asymmetric hydroxylation of hydrocarbons by free and immobilized Bacillus megaterium cells / W. Adam, Z. Lukacs, C. Kahle et al. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2001. - V. 11. - P. 377385.

41. Alfani F. Operational stability of Brevibacterium imperialis CBS 489-74 nitrile hydratase / F. Alfani, M. Cantarella, A. Spera, P. Viparelli // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2001. - V. 11. - P. 687-697.

42. Amarant T. Substrates and inhibitors of the nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrilophilus / T. Amarant, Y. Vered, Z. Bohak // Biotechnol. Appl. Biochem. 1989. - V. 11. - P. 49-59.

43. Anita A. Immobilization of urease on vermiculite / A. Anita, C.A. Sastry, M.A. Hashim // Bioprocess Engineering. 1997. - V. 16. - P. 375-380.

44. Bandi S. Studies on neomycin production using immobilized cells of S. marinensis NUV-5 in various reactor configurations: a technical note / S. Bandi, E. Poluri, A. Kunamneni // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2003. -V. 4(3).-P. 369-374.

45. Banerjee A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - P. 33-44.

46. Basha S.Y. A novel method for immobilization of invertase from the thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus / S.Y. Basha, P. Palanivelu // World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 16. - P. 151154.

47. Bauer A. Polyvinyl alcohol-immobilized -whole-cell preparations for the biotransformation of nitriles / A. Bauer, N. Layh, C. Syldatk, A. Willetts // Biotechnol. Lett. V. 18. - P. 343-348.

48. Berk D.The production of the antibiotic patulin in a three phase fluidized bed reactor. II. The longevity of the biocatalyst / D, Berk, L.A. Behie, A. Jones // Can. J. Chem. Eng. 1984. - V. 62. - P. 120-124.

49. Bozhinova D. Evaluation of magnetic polymer micro-beads as carriers of immobilised biocatalysts for selective and stereoselective transformations / D. Bozhinova, B. Galunsky, G. Yueping et al. // Biotechnol. Lett. 2004. -V. 26.-P. 343-350.

50. Brady D. Characterisation of nitrilase and nitrile hydratase biocatalytic systems / D. Brady, A. Beeton, J. Zeevaart et al. // Appl. Micribiol. Biotechnol. 2004. - V. 64. - P. 76-85.

51. Bunch A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci / A.W. Bunch 11 Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - P. 89-97.

52. Cantarella M. Influence of initial glucose concentration on nitrile hydratase production in Brevibacterium imperialis CBS 498-74 / M. Cantarella,

53. A. Spera, P. Leonetti, F. Alfani // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2002. -V. 19-20.-P.405-414.

54. Chang C.C. Immobilization of Alcaligenes eutrophus using PVA crosslinked with sodium nitrate / C.C. Chang, S.K. Tseng // Biotechnol. Tech. 1998.-V. 12.-N. 12.-P. 865-868.

55. Chang Y.-C. Growth and production of cholesterol oxidase by alginate-immobilized cells of Rhodococcus equi No. 23 / Y.-C. Chang, C.-C. Chou // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. - V. 35. - P. 69-74.

56. Colby J. Immobilization of Rhodococcus AJ270 and use of entrapped biocatalyst for the production of acrylic acid / J. Colby, D. Snell, G.W. Black // Monatshefte fur Chemie. 2000. - V. 131. - P. 655-666.

57. Coradin T. Silica-alginate composites for microencapsulation / T. Coradin, N. Nassif, J. Livage // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 61. -P. 429-434.

58. Cosnier S. Biosensor based on electropolymerized films: new trends / S. Cosnier // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 377. - P. 507-520.

59. Cowan D. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes / D. Cowan, R. Cramp, R. Pereira et al. // Extremophiles. 1998. - V. 2. - P. 207-216.

60. Cramp R.A. Molecular characterisation of a novel thermophilic nitrile hydratase / R.A. Cramp, D.A. Cowan // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1431.-P. 249-260.

61. Demirci A. Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in biofilm reactors / A. Demirci, A.L. Pometto, K-L.G. Ho // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 19. - P. 299-304.

62. Dias J.C.T. Biodégradation of acetonitrile by cells of Candida guilliermondii UFMG-Y65 immobilized in alginate, K-carrageenan and citric pectin / J.C.T. Dias, R.P. Rezende, V.R. Linardi // Braz. J. Microb. -2001.-V. 31.-P. 61-66.

63. Dias J.C.T. Bioconversion of nitriles by Candida guilliermondii CCT 7207 cells immobilized in barium alginate / J.C.T. Dias, R.P. Rezende, V.R. Linardi //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 56. - P. 757-761.

64. Dobreva E. Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable a-amylase, on polymer membranes / E. Dobreva, A. Tonkova, V. Ivanova et al. // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1998. -V. 20.-P. 166-170.

65. Ebbs S. Biological degradation of cyanide compounds / S. Ebbs // Curr. Opin. Biotechnol. 2004. - V. 15. - P. 231-236.

66. Eldin M.S.M. Immobilization of penicillin G acylase onto chemically grafted nylon particles / M.S.M. Eldin, C.G.P.H. Schroën, A.E.M. Janssen et al. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2000. - V. 10. - P. 445-451.

67. Elsgaard L. Ethylene removal by a biofilter with immobilized bacteria / L. Elsgaard // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N. 11. - P. 41684173.

68. Endo I. Nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-774 purification and amino acid sequences /1. Endo, I. Watanabe // FEBS Lett. 1989. - V. 243, N. 1. -P. 61-64.

69. Feng Y. Use of immobilized bacteria to treat industrial wastewater containing a chlorinated pyridinol / Y. Feng, K.D. Racke, J.-M. Bollag // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 73-77.

70. Fukushima Y. A new immobilization technique of whole cells and enzymes with colloidal silica and alginate / Y. Fukushima, K. Okamura, K. Imai, H. Motai //Biotechnol. Bioeng. 1988. - V. 32. - P. 584-594.

71. Gaberlein S. Microbial and cytoplasmic membrane-based potentiometric biosensors for direct determination of organophosphorus insecticides / S. Gaberlein, F. Spener, C. Zaborosch // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2000. V. 54. - P. 652-658.

72. Gouda M.K. Catalytic properties of the immobilized Aspergillus tamarii xylanase / M.K. Gouda, M.A. Abdel-Naby // Microbiol. Res. 2002. -V. 157(4).-P. 275-281.

73. Gough S. Production of ethanol from molasses at 45°C using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in calcium alginate gels and polyvinyl alcohol) cryogel / S. Grough, N. Barron, A.L. Zubov // Bioprocess Engineering. 1998. - V. 19. - P. 87-90.

74. Gough S. Continuous ethanol production from molasses at 45°C using alginate-immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 in a continuous-flow bioreactor / S. Gough, A.P. McHale // Bioprocess Engineering. -1998.-V. 19.-P. 33-36.

75. Graham D. Nitrile biotransformations using free and immobilized cells of a thermophilic Bacillus spp. / D. Graham, R. Pereira, D. Barfield, D. Cowan // Enzyme Microbiol. Technol. 2000. - V. 26. - P. 368-373.

76. Gupte A. Stabilization of alginate beads using radiation polymerized polyacrylamide / A. Gupte, S. D'Souza // J. Biochem. Biophys. Methods. -1999.-V. 40.-P. 39-44.

77. Hallas L.E. Glyphosate degradation by immobilized bacteria: field studies with industrial wastewater effluent / L.E. Hallas, W.J. Adams, M.A. Heitkamp // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58, N. 4. -P. 1215-1219.

78. Hann E.C. 5-cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23 / E.C. Hann, A. Eisenberg, S.K. Fager et al. I I Bioorg. Medicin. Chemistiy. V. 7. - 1999. - P. 2239-2245.

79. He F. Immobilization of acylase on porous silica beads: preparation and thermal activation studies / F. He, R.X. Zhuo, L.J. Liu, M.Y. Xu // React. Functional Polymers. 2000. - V. 45. - P. 29-33.

80. Heitkamp M.A. A novel porous nylon biocarrier for immobilized bacteria / M.A. Heitkamp, W.P. Stewart // Appl. Environ. Microbiol. 1996. -P. 4659-4662.

81. Hughes J. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrylic polymer manufacture / J. Hughes, Y.C. Armitage, K.C. Symes // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74, N. 1-3. - P. 107-118.

82. Imai K. Immobilization of enzyme into poly(vinil alcohol) membrane / K. Imai, T. Shiomi, K. Uchida, M. Miya // Biotechnol. Bioeng. 1986. -V. 28.-P. 1721-1726.

83. Jiang H.-L. Aggregation of immobilized activated sludge cells into aerobically grown microbial granules for the aerobic biodégradation of phenol / H.-L. Jiang, J.-H. Tay, S.T.-L. Tay // Lett. Appl. Microbiol. -2002.-V. 35.-P. 439-445.

84. Jianlong W. Biodégradation of phthalic acid esters by immobilized microbial cells / W. Jianlong, L. Ping, Q. Yi // Environ. International. -1997.-V. 23,N. 6.-P. 775-782.

85. Jirku V. Whole cell immobilization as a means of enhancing ethanol tolerance / V. Jirku // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 22. -P. 147-151.

86. Jirku V. Cell immobilization by covalent linkage / V. Jirku, J. Turkova // In: Methods in enzymology. Colowick S.P., Kaplan N.O. (Eds.). Orlando: Academic Press. 1987. - V. 135. - P. 341-357.

87. Kabaivanova L. Immobilization of cells with nitrilase activity from a thermophilic bacterial strain / L. Kabaivanova, E. Dobreva, P. Dimitrov, E. Emanuilova // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32. - P. 7-11.

88. Katchalski-Katzir E. Eupergit ® C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential / E. Katchalski-Katzir, D.M. Kraemer // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2000. - V. 10. - P. 157-176.

89. Keusgen M. Cyanidase from bacterial sources and its potential for the construction of biosensors / M. Keusgen, P. Milka, I. Krest // BioSensor symposium. Tübingen, 2001. - P. 1-8.

90. Kiyohara P.K. Comparative study between yeasts immobilized on alumina beads and on membranes prepared by two routes / P.K. Kiyohara, U. Lima de Almeida, Santos H. de Souza, Santos P. de Souza // Braz. J. Microbiol. -2003.-V. 34.-P. 129-137.

91. Kobayashi M. Biochemical and genetic analyses of nitrile metabolism in Rhodococcus strains / M. Kobayashi, S. Horinouchi, T. Beppu, S. Shimizu //Biotechnology. 1995. - V. 7-8. - P. 136-138.

92. Kobayashi M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over. / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends Biotechnol. -1992.-V. 10.-P. 402-408.

93. Kovalenko G.A. Catalytic filamentous carbons for immobilization of biologically active substances and non-growing bacterial cells / G.A. Kovalenko, E.V. Kuznetsova, I.S. Mogilnykh et al. // Carbon. 2001. -V.39.-P. 1033-1043.

94. Kunamneni A. Production of alkaline protease with immobilized cells of Bacillus subtilus PE-11 in various matrices by entrapment technique /

95. A. Kunamneni, J. Bezawada, E. Poluri // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2005. -V.6(3).-P. E391-E397.

96. Lai J.-T. Investigation on the immobilization of Pseudomonas isoamylase onto polysaccharide matrices / J.-T. Lai, S.-C. Wu, H.-S. Liu // Bioprocess Engineering. 1998. - V. 18. - P. 155-161.

97. Layh N. Enrichment strategies for nitrile-hydrolysing bacteria / N. Layh,

98. B. Hirrlinger, A. Stolz, H.-J. Knackmuss // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1997.-V.47.-P. 668-674.

99. Linton E.A. Utilization of aliphatic amides and nitriles by Nocardia rhodochrous LL100-21 / E.A. Linton, C.J. Knowles // J. General Microbiol. 1986. - V. 132. - P. 1493-1501.

100. Liu Z. Study on immobilized cells for producing alpha-amylase by using polyvinyl alcohol as the carrier / Z. Liu, J. Wang, Z. Li // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 1997. - V. 14(4). - P. 359-362.

101. Lozinsky V.I. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. / V.I. Lozinsky, F.M. Plieva // Enzyme and Microb. Technol. 1998. -V. 23. - P. 227-242.

102. Love G. Continuous ethanol fermentation at 45°C using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in Calcium alginate and kissiris / G. Love, S. Gough, D. Brady et al. // Bioprocess Engineering. 1998. - V. 18. -P. 187-189.

103. Malik V. Determination of total cholesterol in serum by cholesterol esterase and cholesterol oxidase immobilized and co-immobilized on to arylamine glass / V. Malik, C.S. Pundir // Biotechnol. Appl. Biochem. -2002.-V. 35.-P. 191-197.

104. Manohar S. Enhanced degradation of naphthalene by immobilization of Pseudomonas sp. strain NGK1 in polyurethane foam / S. Manohar, C.K. Kim, T.B. Karegoudar // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 55. -P. 311-316.

105. Martin M. Propachlor removal by Pseudomonas strain GCH1 in an immobilized-cell system / M. Martin, G. Mengs, E. Plaza et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, N. 3 - P. 1190-1194.

106. Mascharak P.K. Structural and functional models of nitrile hydratase / P.K. Mascharak // Coordination Chemistry Rev. 2002. - V. 225. - P. 201214.

107. Mojovic L. Immobilization of lipase from Candida rugosa on a polymer support / L. Mojovic, Z. Knezevic, R. Popadic, S. Jovanovic // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 50. - P. 676-681.

108. Mukerjee-Dhar G. Degradation of polychlorinated biphenyl by cells of Rhodococcus opacus strain TSP203 immobilized in alginate and in solution / G. Mukerjee-Dhar, M. Shimura, K. Kimbara // Enzyme and Microb. Technol. 1998. - V. 23. - P. 34-41.

109. Mylerova V. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes / V. Mylerova, L. Martinkova // Curr. Organic Chem. 2003. - V. 7. - P. 117.

110. Nagasawa T. Nitrile hydratase of Pseudomonas clororaphis B23. Purification and characterization / T. Nagasawa, H. Nanba, K. Ryuno et al. // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 162. - P. 691-698.

111. Nagasawa C. Characterization of a new cobalt-containing nitrile hydratase purified from urea-induced cells of Rhodococcus rhodochrous J1 / C. Nagasawa, K. Takeuchi, H. Yamada // Eur. J. Biochem. 1991. -V. 196.-P. 581-589.

112. Nemati M. Effect of ferrous iron concentration on the catalytic activity of immobilized cells of Thiobacillus ferrooxidans / M. Nemati, C. Webb // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 46. - P. 250-255.

113. Oh Y.-S. Use of microorganism-immobilized polyurethane foams to absorb and degrade oil on water surface / Y.-S. Oh, J. Maeng, S.-J. Kim // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 54. - P. 418-423.

114. Park J.K. Microencapsulation of microbial cells / J.K. Park, H.N. Chang // Biotechnol. Advances. 2000. - V. 18. - P. 303-319.

115. Pashova S. Induction of polymethylgalacturonase biosynthesis by immobilized cells of Aspergillus niger 26 / S. Pashova, L. Slokoska, E. Krumova, M. Angelova // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. -P. 535-540.

116. Pattanapipitpaisal P. Chromate reduction by Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol / P. Pattanapipitpaisal, N.L. Brown, L.E. Macaskie // Biotechnol. Lett. 2001. - V. 23. - P. 61-65.

117. Pencreac'h G. Activity of Pseudomonas cepacia lipase in organic media is greatly enchanced after immobilization on a polypropylene support / G. Pencreac'h, J.C. Baratti // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 630-635.

118. Perei K. Biodegradation of sulfanilic acid by Pseudomonas paucimobilis / K. Perei, G. Rákhely, I. Kiss et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. -V.55.-P. 101-107.

119. Pogorelova T.E. Cobalt-dependent transcription of the nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8 / T.E. Pogorelova, L.E. Ryabchenko, N.I. Sunzov, A.S. Yanenko // FEMS Microbiol. Lett. -1996.-V. 144.-P. 191-195.

120. Pourciel M.L. Development of photo-polymerisable polyvinylalcohol for biotechnological applications / M.L. Pourciel, J. Launay, W. Sant et al. // Sensors and Actuators B. 2003. - V. 94. - P. 330-336.

121. Prévost H. Continuous prefermentation of milk by entrapped yougurt bacteria. I. Development of the process / H. Prévost, C. Diviès // Milchwissen. 1988. - V. 43. - P. 621-625.

122. Ramakrishna S.V. Microbial fermentation with immobilized cells / S.V. Ramakrishna, R.S. Prakasham // Curr. Sci. 1999. - V. 77, N. 1 -P. 87-101.

123. Rangsayatorn N. Cadmium biosorption by cells of Spirulina platensis TISTR 8217 immobilized in alginate and silica gel / N. Rangsayatorn, P. Pokethitiyook, E.S. Upatham, G.R. Lanza // Environ. International. -2004.-V. 30.-P. 57-63.

124. Ryu H.W. Characterization of bioconversion of fumarate to succinate by alginate immobilized Enterococcus faecalis PKY1 / H.W. Ryu, Y.J. Wee // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - V. 91-93. - P. 525-535.

125. Scouten W.H. Enzyme or protein immobilization techniques for applications in biosensor design / W.H. Scouten, J.H.T. Luong, R.S. Brown //Trends Biotechnol.- 1995.-V. 13.-P. 178-185.

126. Shan H. Amonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria / H. Shan, J.P. Obbard // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 57. - P. 791-798.

127. Shriver-Lake L.C. Covalent binding of genetically engineered microorganisms to porous glass beads / L.C. Shriver-Lake, W.B. Gammeter, S.S. Bang, M. Pazirandeh // Analytica Chimica Acta. -2002. -V. 470.-P. 71-78.

128. Stolz A. Enantioselective nitrile hydratases and amidases from different bacterial isolates / A. Stolz, S. Trott, M. Binder et al. //J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1998.-V. 5.-P. 137-141.

129. Storey K.B. Immobilization of amyloglucosidase using two forms of polyurethane polymer / K.B. Storey, J.A. Duncan, A.C. Chakrabarti // Appl. Biochem. Biotechnol. 1990. - V. 23, N. 3. - P. 221-236.

130. Strauss U.T. Stabilization and activity-enhancement of mandelate racemase from Pseudomonas putida ATCC 12336 by immobilization / U.T. Strauss, A. Kandelbauer, K. Faber // Biotechnol. Lett. 2000. - V. 22. -P. 515-520.

131. Syu M.-J. Immobilization materials mixed with activated sludge as column biofilters for the treatment of gaseous stream containing benzene and toluene / M.-J. Syu, Y.-W. Wang // Bioprocess Engineering. 1999. -V.21.-P. 239-244.

132. Szcz^sna-Antczak M. Stability of extracellular proteinase productivity by Bacillus subtilis cells immobilized in PVA-cryogel / M. Szcz^sna-Antczak, T. Antczak, S. Bielecki // Enzyme and Microb. Technol. 2004. - V. 34. -P. 168-176.

133. Szczesna M. PVA-biocatalyst with entrapped viable Bacillus subtilis cells / M. Szczesna, E. Galas, S. Bielecki // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. -V. 11.-2001.-P. 671-676.

134. Tauber M.M. Nitrile hydratase and amidase from Rhodococcus rhodochrous hydrolyze acrylic fibers and granular polyacrylonitriles / M.M. Tauber, A. Cavaco-Paulo, K.-H. Robra, G.M. Gubitz // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, N. 4. - P. 1634-1638.

135. Torres-Bacete J. Covalent immobilization of penicillin acylase from Streptomyces lavendulae / J. Torres-Bacete, M. Arroyo, R. Torres-Guzman et al. // Biotechnol. Lett. 2000. - V. 22. - P. 1011-1014.

136. Uhlich T. Immobilization of enzymes in photochemically cross-linked polyvinyl alcohol / T. Uhlich, M. Ulbricht, G. Tomaschewski // Enzyme and Microb. Technol. 1996. - V. 19.-P. 124-131.

137. Watanabe I. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells / I. Watanabe, Y. Satoh, K. Enomoto et al. // Agric. Biol. Chem. 1987. -V. 51.-P. 3201-3206.

138. Webster N.A. Comparative characterization of two Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production / N.A.Webster, D.K. Ramsden, J. Hughes // Biotechnol. Lett. 2001. -V. 23.-P. 95-101.

139. Wideroe H. Evaluation of the use of Sr2+ in alginate immobilization of cells / H. Wideroe, S. Danielsen // Naturwissenschaften. 2001. - V. 88. -P. 224-228.

140. Yang Y. Immobilization of a-amylase on poly(vinil alcochol)-coated perfluoropolymer supports for use in enzyme reactors / Y. Yang, H.A. Chase //Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. - V. 28. - P. 145-154.

141. Yudanova T.N. Polyvinyl alcohol film materials containing biopolymers: preparation and properties / T.N. Yudanova, I.F. Skokova, E.Yu. Aleshina, L.S. Gal'braikh // Fibre Chemistry. 2000. - V. 32. - P. 347-352.

142. Yudanova T.N. Polyfunctional biologically active polyvinyl alcohol film materials / T.N. Yudanova, I.F. Skokova, E.Yu. Aleshina, L.S. Gal'braikh // Fibre Chemistry. 2001. - V. 33, N. 1. - P. 20-24.

143. Zhang P. Atomic force microscopy for the characterization of immobilized enzyme molecules on biosensor surfaces / P. Zhang, W. Tan // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. - V. 369. - P. 302-307.

144. Zhang Y.-Q. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization / Y.-Q. Zhang // Biotechnol. Advances. 1998. - V. 16. - P. 961-971.

Информация о работе

Максимова, Юлия Геннадьевна
кандидата биологических наук
Пермь, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы