Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотрансформация бетулина актинобактериями рода Rhodococcus

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биотрансформация бетулина актинобактериями рода Rhodococcus"

На правах рукописи

тарасова Екатерина Владимировна

биотрансформация бетулина актинобактериями

рода шюоососст

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2014

2 О НАР ¡¡и

005546053

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна

кандидат химических наук, доцент Гришко Виктория Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории выживаемости микроорганизмов ФГБУН Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Мулюкин Андрей Львович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник филиала ФГУП "НПО Микроген" МЗ РФ "Пермское НПО "Биомед" Грязнова Диана Васильевна

Ведущая организация: Казанский (Приволжский) федеральный университет (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18)

Защита состоится апреля 2014 г. в^часов на заседании диссертационного

совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат разослан "Л{"¿МЦЯС-' 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полициклические тритерпеноиды растительного происхождения представляют интерес в качестве исходных соединений в синтезе новых фармакологически активных веществ. Бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол, С30Н50О2, CAS: 473-98-3) - пентациклический тритерпеноид лупанового ряда, содержание которого во внешнем слое коры березы достигает 20-35%, активно используется для получения противовоспалительных, гепапротекторных, противоопухолевых, противовирусных, антималярийных, антибактериальных соединений (Tolstikov et al., 2005; Alakurtti et al., 2006; Santos et al., 2009). Помимо химических модификаций предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов, так как биокатализ открывает возможность получать целевые продукты с высокой степенью регио- и стереоселективности в одну технологическую стадию при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Примеры биотрансформации бетулина пока немногочисленны (Parra et al., 2009; Muffler et al., 2011) и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности представителей грибов Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Dothideomycetes, Rhodotorula. Описаны процессы окислительного расщепления бетулина до 4,28-дигидрокси-3,4-секолуп-20(29)-ен-3-овой кислоты при участии Chaetomium longirostre IFO 9873 (Akihisa et al., 2002) и окисления бетулина до бетулиновой кислоты с участием Armillaria luteo-virens Sacc QH, Aspergillus foetidus Zu-G 1, Aspergillus oryzae Sacc QH (Chen et al., 2009; Liu et al., 2010). Недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa FI0 (Мао et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013).

В качестве одного из перспективных интермедиатов в синтезе биологически активных соединений особый интерес представляет 3-оксопроизводное бетулина -бетулон (Koohang et al., 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010; Orlov et al., 2011). Описаны процессы химического синтеза цитотоксичных циано- и азапроизводных бетулина на основе бетулона (Koohang et al., 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010). В отличие от трехстадийного химического синтеза бетулона использование микроорганизмов позволяет осуществлять одностадийное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина в оксогруппу при сохранении нативной С(28) гидроксильной группы. Однако описанные процессы биотрансформации бетулина до бетулона с использованием условно-патогенных дрожжей R. mucilaginosa F10 (Мао et al, 2012) и грибов Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013) имеют значительные недостатки, поскольку осуществляются в условиях использования сложных питательных сред, характеризуются высокой продолжительностью,

невысоким уровнем биоконверсии субстрата при внесении низких концентраций исходного соединения. Кроме того, использование грибов в качестве биокатализаторов потенциально опасно вследствие характера их посевного материала (споры) и способности к синтезу микотоксинов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием. В связи с этим актуальным является поиск непатогенных микроорганизмов, способных эффективно катализировать окислительные трансформации бетулина.

Одной из активно используемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода ЯИоЛососсш. Не мицелиальный характер роста, политрофность и лабильность метаболических систем, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах, высокая каталитическая активность и отсутствие выраженных патогенных свойств (Ившина и др., 1987; 1У5Ыпа с/ о/., 1998; Ьагкт е/ а!., 2006; МаПткоуа е/ а/., 2009; Киуикта, 1узЫпа, 2010) обусловливают перспективность реализации уникальных метаболических систем родококков для окислительной биотрансформации бетулина.

Цель настоящей работы - исследование возможности использования актинобактерий рода ИИос1ососси$ для селективной биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина.

Основные задачи исследования

1. Исследовать каталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении бетулина. Отобрать штаммы - наиболее активные биотрансформаторы бетулина и определить условия его эффективной биоконверсии.

2. Сравнить бетулинтрансформирующую активность нерастущих и иммобилизованных актинобактериальных клеток. Изучить механизм взаимодействия актинобактериальных клеток с тритерпеновым субстратом и возможные пути его трансформации.

3. Разработать прогнозную модель процесса биотрансформации бетулина в высоких концентрациях с использованием методов математического моделирования.

4. Оценить возможность использования продуктов бактериального окисления бетулина для последующего синтеза биологически активных соединений химическими методами.

Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерии рода Л/го<Л>сосси5 к биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. В качестве основного метаболита биоконверсии бетулина идентифицирован бетулон - продукт региоселективного окисления вторичной гидроксильной группы бетулина. Установлено, что уровень

бетулинтрансформирующей активности родококков зависит от концентрации н-гексадекана в среде культивирования. Подобраны оптимальные условия биоконверсии бетулина с использованием суспензий нерастущих клеток. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату. Экспериментально подтверждено, что нерастущие клетки характеризуются высоким уровнем каталитической активности в отношении бетулина в повышенных (до 3,0 г/л) концентрациях. Определены основные кинетические закономерности процесса биотранформации бетулина нерастущими клетками, предложена математическая модель, адекватно описывающая процесс биотрансформации. В результате сравнительного анализа трансформирующей активности родококков разных видов установлено, что наиболее высокая степень биоконверсии бетулина до бетулона достигается при использовании нерастущих клеток Л. гЪос1ос11гож и Л. егуЛгороШ. На основе бетулона, полученного в результате бактериальной трансформации бетулина, путем последующей химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биотрансформирующих свойствах родококков. Экспериментально обоснована способность родококков разных видов к региоселективному окислению пентациклического тритерпеноида растительного происхождения бетулина в бетулон. Сравнительный анализ каталитической активности растущих и нерастущих клеток выявил высокий биотехнологический потенциал нерастущих клеток, применение которых позволяет существенно сократить (с 240 до 24 ч) продолжительность процесса биотрансформации и получить целевой продукт с высоким (60%) выходом. Использование простых (буферных) растворов в качестве трансформационной среды способствует упрощению выделения бетулона как исходного соединения для синтеза биологически активных соединений. На способ получения бетулона путем бактериальной трансформации бетулина нерастущими клетками Я. гИо/^осИгоия ИЭГМ 66, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1898, составлена Заявка № 2013137269 от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ. Полученные данные могут быть использованы для разработки технологии эффективного получения бетулона с использованием родококков. Результаты диссертационных исследований используются в лекционных курсах "Биоразнообразие и систематика микроорганизмов" для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета. Информация о наиболее активных штаммах-биотрансформаторах бетулина включена в

компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет (http://www.iegrn.ru/iegmcol/strains/index.html).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Rhodococcus в присутствии ростовых субстратов н-гексадекана, глюкозы, глицерина катализируют региоселективное окисление бетулина с образованием бетулона. При использовании растущей культуры родококков максимальный выход целевого продукта (72,2%) достигается в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч.

2. Использование суспензий нерастущих клеток родококков позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации бетулина (0,5 г/л) до 24 ч. При этом нерастущие клетки наиболее активно трансформируют бетулин при слабощелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) и оптимуме клеточной биомассы в количестве 10 г/л. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.

3. В условиях использования повышенных концентраций бетулина (от 1,0 до 3,0 г/л) нерастущие клетки в течение 24 ч катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 57% соответственно. Наиболее высокой бетулинтрансформирующей активностью характеризуются представители R. erythropolis и R. rhodochrous.

4. На основе бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, путем химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2011", Воронеж, 2011; VII Молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2011; 4th Annual Russian-Korean Conference "Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology", Новосибирск, 2012; XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2013; Региональной конференции "Конкурс РФФИ - Пермский край. 10 лет: итоги и перспективы", Пермь, 2013; 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, 2013.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий ("Вестник Уральской медицинской академической науки", "Российский журнал биомеханики") и изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus

("Process Biochemistry"). Подана заявка № 2013137269 "Способ получения бетулона" от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований работ, в том числе 18 отечественных и 190 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека" (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (Соглашение № 8793), а также грантами Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-5589.2012.4), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН (проект № 12-П-4-1044, номер госрегистрации 01201256869), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (проект № 11-04-96012-р_урал_а).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Химическую модификацию бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, проводили на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь (лаборатория биологически активных соединений, зав. лабораторией - к.х.н. Гришко В.В.). Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой - д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 104 штамма родококков, принадлежащих к видам R. erythropolis (33), 'R. longus' (10), R. opacus (14), R. rhodochrous (17), R. ruber (30) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер 768 во Всемирной федерации коллекций культур, www.iegm.ru/iegmcol).

Условия культивирования. Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 100 мл питательной среды. Культивирование проводили на орбитальной качалке Certomat IS (Sartorius, Германия) при 160 об/мин и 28°С. В опытах по биотрансформации бетулина использовали минеральную среду следующего состава (г/л): К2НР04 - 1,0; КН2Р04 - 1,0; KNCb - 1,0; NaCl - 1,0; MgS04-7H20 - 0,2; СаС12-2Н20 - 0,02; FeCb - 0,001 (Каталог штаммов..., 1994). В среду добавляли 0,1% дрожжевого экстракта (Микроген, Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). Исходное значение рН реакционной среды составляло 6,8-7,0 до инокуляции. В качестве субстратов роста использовали глюкозу (1,0%), глицерин (1,0%) или н-гексадекан (0,1; 1,0; 3,0 об.%). В отдельных экспериментах для культивирования родококков использовали мясопептонный бульон (МПБ) производства ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0; пептон ферментативный - 8,0; NaCl - 4,0; рН 7,0-7,4. Бактерии, выращенные на мясопептонном агаре (МПА) в течение 48 ч, вносили в среду культивирования до конечной концентрации 6,5x106 клеток/мл. Бетулин (0,5 г/л) в культуральную среду добавляли в виде раствора в диметилсульфоксиде (1:10 мг/мл) через 48 ч с начала культивирования родококков. В данных условиях динамику образования бетулона отслеживали с интервалом 24 ч в течение 240 ч.

Условия иммобилизации. В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) производства ПО "Азот", Невинномысск, Россия. Иммобилизацию клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66, предварительно выращенных в минеральной среде с добавлением 3,0 об.% н-гексадекана, осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС по методике, описанной в работе (Kuyukina et al., 2006). Клеточную суспензию и раствор ПВС смешивали в соотношении 1:2 v/v. Последующие этапы гранулирования, замораживания и оттаивания осуществляли согласно указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и добавляли в минеральную среду из расчета 200 гранул (5,0±0,6х10б клеток/мл) на 100 мл среды.

Подготовка суспензий нерастущих клеток. Под термином "нерастущие клетки" (resting cells) понимаем трижды отмытые от питательной среды жизнеспособные клетки стационарной фазы роста, прекратившие свое деление в силу исчерпания источников питания или в силу каких-либо иных причин (Эль-Регистан, 2005) и перенесенные из питательной среды в буферный раствор. Клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 предварительно выращивали в МПБ и минеральной среде в присутствии глюкозы (1,0%), глицерина (1,0%) или н-гексадекана (1,0 об.%) в

течение 48-72 ч. Родококки в стационарной фазе роста осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин и трижды промывали эквивалентным объемом фосфатного буфера (рН 7,0) с последующим центрифугированием. Для получения фосфатного буферного раствора со значением рН 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 к 500 мл 0,1 М КН2РО4 (13,6 г/л) добавляли 56, 291, 461 и 481 мл 0,1 М NaOH (4 г/л) соответственно и доводили дистиллированной водой до 1000 мл (Справочник биохимика, Досон и др., 1991). Отмытые клетки ресуспендировапи в 100 мл фосфатного буфера (рН 6,0; 7,0; 8,0 или 9,0) и доводили оптическую плотность клеточных суспензий до значений ОШоо 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8 с последующим пересчетом на сухой вес клеточной биомассы. Бетулин вносили в подготовленную клеточную суспензию в концентрации 0,5; 1,0; 2,0 или 3,0 г/л. Продолжительность экспериментов по биотрансформации бетулина нерастущими клетками составляла 96 ч, при оценке динамики накопления бетулона пробы отбирали каждые 24 ч. В сравнительных исследованиях бетулинтрансформирующей активности нерастущих клеток использовали подготовленные аналогичным образом клеточные суспензии родококков разных видов.

Получение клеточных фракций. Суспензию клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в 100 мл фосфатном буфере (рН 7,0; ОПбоо 2,0) обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора Soniprep 150 (MSE, Великобритания) при амплитуде 10 мкм в течение 60 мин. Полученный гомогенат центрифугировали при охлаждении 6000 об/мин в течение 10 мин. Для выделения мембраносвязанных ферментов осадок ресуспендировали в 100 мл 1% раствора Тритона Х-100 в фосфатном буфере (рН 7,0), перемешивали на орбитальном шейкере в течение 30 мин и затем центрифунировали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок, содержащий неэкстрагируемые ферменты, ресуспендировали в 100 мл фосфатном буфере (рН 7,0). Подготовленные клеточные фракции: (1) супернатант с внутриклеточными ферментами; (2) супернатант с мембранносвязанными ферментами, (3) ресуспендированные соникаты с ферментами, не экстрагируемыми детергентами, использовали в сравнительных исследованиях по биотрансформации бетулина (0,5 г/л) и наиболее изученных структурных аналогов бетулина - Р-ситостерола (0,5 г/л) и холестерола (0,5 г/л). В качестве контроля использовали суспензию клеток R, rhodochrous ИЭГМ 66 (ОПбоо 2,0) в 100 мл фосфатном буферном растворе (рН 7,0).

Определение дыхательной активности родококков проводили с помощью 6-канального респирометра Micro-OxymaxR (Columbus Instruments, США) в стеклянных флаконах Micro-Oxymax вместимостью 300 мл, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (ОШоо 2,6) в фосфатном буфере и бетулин в концентрации 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 г/л. Постоянное перемешивание (300 об/мин) осуществляли с помощью

многоместной магнитной мешалки RT 10 (Power IKAMAG, Германия) в течение 96 ч при температуре 28±2°С. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин1) и количество потребляемого кислорода (мкл). В качестве контроля использовали бактериальную суспензию в фосфатном буфере (ОГЬоо 2,6) без добавления бетулина.

Исследование продуктов биотрансформации. Для выделения продуктов биотрансформации бетулина постферментационную среду подкисляли 10%-ным водным раствором НС1 до рН 3,0-4,0 и трижды экстрагировали эквивалентным объемом этилацетата. Объединенные экстракты последовательно промывали 1%-ным водным раствором ЫагСОз и дистиллированной водой (до рН 7,0). Полученный этилацетатный экстракт обезвоживали над NajSOi. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя (Heidolph, Германия). Качественный состав метаболитов предварительно контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на высокоэффективных пластинах с силикагелем ПТСХ-П-В (Sorbfil, Россия). Наличие продуктов окисления бетулина фиксировали при обработке пластин в системе растворителей этилацетат:гексан (1:4) и опрыскивании пластинок 5% H2SO4 с последующим прогреванием в течение 2-3 мин при 95-100°С. Количественный анализ продуктов биотрансформации бетулина осуществляли методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с использованием хроматографа Agilent 6890N/5975B (Agilent Technologies, США), оборудованного капиллярной колонкой HP-5ms (30 м х 0,25 мм, 0,25 мкм) и работавшего в режиме ионизации электронным ударом (70 эВ). В качестве газа-носителя использовали гелий (1 мл/мин). Вводили 0,2 мкл этилацетатного экстракта с делением потока (от 1:1 до 11:1). Температура колонки программировалась от 100 до 300°С с повышением температуры со скоростью 50°С/мин. Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z от 40 до 460 а.е.м. В экстрактах, содержащих остаточный н-гексадекан, время начала детектирования продуктов биотрансформации выбирали через 5 мин после выхода н-гексадекана. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST08 MS Library. Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечным коэффициентом подобия, превышающим 90%.

Эксперименты по препаративному получению бетулона проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл клеточной суспензии (ОПбоо 2,6) R. rhodochrous ИЭГМ 66 в фосфатном буфере (рН 8,0) и 0,3 г бетулина, растворенного в 3 мл ДМСО, при постоянном перемешивании (160 об/мин) и температуре 28°С. Через 24 ч продукты биотрансформации трижды экстрагировали эквивалентным объемом этилацетата. Полученные продукты биотрансформации (0,28 г) разделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле 60-200 цш

(Merck, Германия), соотношение вещества и сорбента « 1 :50, элюент -гексан:этилацетат (9:1). Пороговое значение температуры в точке плавления определяли на приборе OptiMelt МРА100 (Stanford Research Systems Inc., США).

Бетулон (1, луп-20(29)-ен-28-ол-3-он) - белый порошок. Т„л 120,5°С (н-гексан-этилацетат, 5:1) (лит.: Т„л 94-96°С (w-гексан) (Hata et al., 2002), 175-176°С (Tinto étal., 1992). MS, m/z (отн. интенсивность): 440,4 (9,51, М+).

Химическая модификация бетулоиа, полученного в результате бактериального окисления бетулина.

28-Гидрокси-3-гидроксиминолуп-20(29)-ен (2). Смесь продуктов биотрансформации бетулина (по данным ХМС, содержание соединения 1 составляло 4 ммоль) и 12 ммоль гидрохлорида гидроксиламина растворяли в 50 мл смеси этанол-пиридин (5:1). Реакционную смесь кипятили в течение 2-3 ч. Ход реакции контролировали с использованием ТСХ. По окончании реакции растворитель упаривали, остаток разбавляли водой и экстрагировали 30 мл хлороформа, органический слой отделяли, сушили над безводным MgS04. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент -гексан-этилацетат, 5:1. Выход соединения 2 - 61%. Т. пл. 240,9°С. Яг 0,4 (гексан:этилацетат 7:3). [а]2й2 +6,1° (с 0,5, СНСЬ).

28-Бензоилоксн-3-гидроксиминолуп-20(29)-ен (3). К раствору 2 ммоль соединения 2 в 15 мл пиридина добавляли 4 ммоль бензоилхлорида, реакционную смесь выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ. Реакционную смесь промывали 20%-ным раствором соляной кислоты (3x20 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой последовательно промывали раствором N814003, водой, отделяли и сушили над безводным М£804, растворитель упаривали в вакууме водоструйного насоса. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюент

гексан:этилацетат - 7:1. Выход соединения 3 - 65%. Т. пл. 225,9°С. Rf 0,4 (гексан:этилацетат 5:1). [а] ;; -2,1° (с 0,5, СНСЬ).

28-Бензоилокси-2-циано-3-норлуп-4(23),20(29)-диен (4). К раствору 1,5 ммоль соединения 3 в 10 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона добавляли 3 ммоль (0,27 мл) тионилхлорида. После перемешивания реакционной смеси в течение 30 мин растворитель отгоняли досуха в вакууме водоструйного насоса. К остатку добавляли 10 мл безводного хлористого метилена, растворитель отгоняли. Процедуру повторяли трижды до полного удаления хлорирующего агента. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюент гексан:этилацетат -7:1. Выход соединения 4 - 74%. Т. пл. 89,4°С. Rf 0,6 (гексан:этилацетат 7:3). [а]?,2 +25,5° (с 0,8, СНСЬ).

28-Гидрокси-2-циано-3-норлуп-4(23),20(29)-диен (5). Раствор 1,3 ммоль соединения 4 в 30 мл 3% спиртового раствора КОН кипятили в течение 1 ч. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ. Растворитель отгоняли, к остатку добавляли 30 мл воды, продукт экстрагировали этилацетатом (2x30 мл), органический слой отделяли, промывали водой и сушили над безводным MgS04. Растворитель упаривали, остаток очищали методом флэш-хроматографии. Элюент -гексан/этилацетат (5:1). Выход соединения 5 - 81%. Т. пл. 96,5°С. Rf 0,35 (гексан:этилацетат 7:3). [а] 202 +34,7° (с 0,3, СНСЬ). ИК спектр: 2248 (C^N), 3452 (ОН).

Химическую модификацию бетулона и физико-химический анализ продуктов трансформации бетулина проводили на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь (лаборатория биологически активных соединений, зав. лабораторией - к.х.н. Гришко В.В.).

Атомно-силовая микроскопия (АСМ). Визуализацию родококков осуществляли с помощью атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D (Asylum Research, США) на базе Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета. На предметное стекло наносили 15-20 мкл клеточной суспензии, препарат сушили на воздухе в течение 20 мин. Сканирование с помощью АСМ осуществляли в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м. Обработку полученных изображений проводили с помощью программы Igor Pro 6.22А (WaveMetrics, США).

Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина. В математическом анализе экспериментальных данных использовали модифицированный метод наименьших квадратов (Линник и др., 1962; Gill et al., 1981). Для нахождения точки минимума суммы квадратов применяли модифицированный метод Ньютона, основанный на спектральном разложении

матрицы Гессе (Gill et al., 1981). Математический анализ экспериментальных данных проводили на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой - д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc., 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью /-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Бетулинтрансформируюицая активность коллекционных культур родококков. По нашим данным, в присутствии глюкозы, глицерина или н-гексадекана, а также в условиях использования МПБ родококки катализируют региоселективное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина (1) с образованием бетулона (2) (рис. 2).

Как видно из табл. 1, наиболее высокий (44,9%) уровень образования бетулона достигается в присутствии 1,0 об.% н-гексадекана.

Таблица 1

Биотрансформация бетулина клетками Я. гЬо(1ос11гот ИЭГ1У1 66

Условия Содержание в сумме продуктов реакции, %

Бетулин Бетулон

Абиотический контроль 100 -

Богатая питательная среда (МПБ) 64,5±2,12 35,5±3,01

Минеральная среда с добавлением глюкозы (1,0%) 92,5±4,23 7,5±0,52

Минеральная среда с глицерина (1,0%) добавлением 74,6±3,81 25,4±3,24

Минеральная среда с н-гексадекана (1,0 об.%) добавлением 48,0±4,15 44,9±4,73

При исследовании влияния концентрации н-гексадекана на интенсивность процесса биотрансформации бетулина показана прямая зависимость между уровнем образования бетулона и содержанием н-алкана в среде культивирования. Максимальный (72,2%) выход бетулона регистрируется в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч (рис. 3).

80 Рис. 3. Биотрансформация

бетулина (0,5 г/л) клетками й. гИойвскгош ИЭГМ 66 при различном содержании н-гексадекана (об.%) в среде инкубации: 1 - 0,1; 2 - 1,0; 3 -3,0.

Бетулин вносили через 48 ч.

'Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, р<0,05.

В результате сравнительного анализа бетулинтрансформирующей активности родококков разных видов в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана выявлена гетерогенность зависимости между уровнем образования целевого продукта и видовой принадлежностью культур. Как видно из табл. 2, высокая степень биоконверсии бетулина характерна для отдельных представителей видов R. erythropolis, 'R. longus', R. rhodochrous, R. ruber, при этом максимальный выход бетулона достигается при использовании R. rhodochrous ИЭГМ 66.

Высокая степень биоконверсии бетулина в присутствии н-гексадекана обусловлена, по-видимому, повышением уровня гидрофобности клеточной стенки родококков и синтезом биосурфактантов при росте родококков в данных условиях, что способствует взаимодействию бактериальных клеток с гидрофобным тритерпеновым субстратом. Однако, несмотря на относительно высокий (72,2%) выход целевого продукта, длительность (240 ч) процесса биоконверсии и наличие остаточного (до 0,9 об.%) углеводорода в смеси продуктов биотрансформации (в полученных экстрактах, при проведении ГХ-МС анализа, при выделении бетулона в чистом виде) ограничивают возможность использования растущей культуры для получения бетулона.

Таблица 2

Биотрансформация бетулина родококками в присутствии н-гексадекана

Вид, штамм Бетулон, %

Абиотический контроль 0,0

Л. егуМггороЧь

ИЭГМ 199 39,9±3,63

ИЭГМ 200 45,3±3,64

ИЭГМ 203 'И. 101^118' 53,5±4,23

ИЭГМ 30 10,9±3,12

ИЭГМ 31 34,2±2,17

ИЭГМ 32 Д. ораст 38,5±3,42

ИЭГМ 223 /?. г1ю1/ос/1гош 9,8±2,03

ИЭГМ 66 72,2±4,81

ИЭГМ 73 6,6±0,82

ИЭГМ 608 Д. гиЬег 37,6±2,13

ИЭГМ 79 42,9±2,31

ИЭГМ 226 2,9±0,24

ИЭГМ 228 42,9±2,33

В сравнительных исследованиях каталитической активности нерастущих и иммобилизованных родококков в отношении бетулина установлено, что после иммобилизации клетки теряют бетулинтрансформирующую способность, что, очевидно, связано со снижением степени доступности тритерпенового субстрата для клеток, заключенных в матрицу ПВС. В то время как нерастущие клетки сохраняют способность к региоселективному окислению бетулина в бетулон (рис. 4). При этом уровень образования целевого продукта определяется условиями их предварительного культивирования. Как видно из рис. 4, наибольший (24 и 40%) выход бетулона достигается при использовании клеток, предварительно выращенных в присутствии н-гексадекана или МПБ. Применение нерастущих клеток существенно сокращает продолжительность биотрансформации бетулина, а использование буферного раствора позволяет значительно упростить выделение бетулона из смеси продуктов биотрансформации.

45 „ 2.5

hJl 1

I —■1 + - O

8 [J

Рис. 4. Биотрансформация бетулина (0,5 г/л) нерастущими клетками Я. гНойосИгош ИЭГМ 66, предварительно выращенными в минеральной среде с добавлением н-гексадекана, 1,0 об.% (1), глюкозы, 1,0% (2), глицерина, 1,0% (3) или в МПБ (4).

Условия процесса: ОПбоо 2,0; фосфатный буфер (рН 7,0), продолжительность 48 ч.

7

3

4

'Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, р<0,05.

i:-.' ^ Ьетулон. %

Количество биомассы. ОПбОО,

'И

Биотрансформация бетулина с использованием полученных клеточных фракций из родококков. По данным отдельных авторов, в реакциях микробного окисления вторичной гидроксильной группы тритерпеновых спиртов и кислот (с использованием мицелиальных грибов, бацилл или нокардий) принимают участие холестеролоксидаза (Bastos et al., 2007) или 3(3-гидроксистероид дегидрогеназа (Leipold et al., 2010). Оба фермента локализуются преимущественно в цитоплазме или связаны с клеточной мембраной и катализируют реакцию окисления Зр-гидроксильной группы стеролов (холестерола, p-ситостерола) и стероидов с образованием соответствующих кетонов.

Как видно из табл. 3, полученный супернатант с мембранносвязанными ферментами родококков катализирует реакцию окисления зр-гидроксигруппы холестерола и Р-ситостерола с образованием 4-ен-3-оновых производных, в то время как в отношении бетулина данный супернатант не активен. Незначительный (10,6%) уровень конверсии бетулина в бетулон наблюдается при использовании супернатанта с внутриклеточными ферментами родококков. Увеличение (до 22,4%) выхода бетулона регистрируется в процессе биотрансформации бетулина ресуспендированными соникатами родококков, содержащими компоненты клеточных стенок и, возможно, элементы бактериальных мембран с интегральными белками, имеющими гидрофобный якорь и связанные с мембраной за счет более прочных гидрофобных взаимодействий. Все это свидетельствует о прочной связи катализирующего окисление бетулина фермента с клеточной мембраной родококков. При этом следует особо отметить, что суммарная (33%) активность внутриклеточных ферментов и ферментов, прочно связанных с клеточной мембраной родококков, практически сопоставима с бетулинтрансформирующей активностью (40%) целых клеток.

Таблица 3

Окислительная биотрансформация бетулина, холестерола и р-ситостерола с использованием клеточных фракций из R. rhodochrous ИЭГМ 66

Клеточная фракция Бетулон Холестенон Стигмаст-4-ен-З-он

Целые клетки +++ +++ ++*

Супернатант с внутриклеточными ферментами + + +

Супернатант с мембранносвязанными ферментами - +++ ++

Ресуспендированные соникаты клеток +++ + +

Примечание. *Обозначена интенсивность образования оксопроизводного, по данным ТСХ и ГХ-МС.

Полученные результаты дают основание к предположению о том, что окислительная биотрансформация бетулина родококками протекает благодаря адгезии бактериальной клетки к тритерпеновому субстрату, что подтверждается данными АСМ. Как видно из рис. 5, при внесении бетулина в концентрации 3,0 г/л клетки агрегируют с тритерпеновым субстратом.

0 -0.52 б

Рис. 5. АСМ-изображение (а) и трехмерная проекция (б) осажденной на поверхности стекла клетки Д. г1ю(1ос1иои$ ИЭГМ 66 в присутствии бетулина (3,0 г/л).

Интенсификация процесса биотрансформации. Известно, что значительное влияние на активность ферментов оказывает уровень водородного показателя (рН среды), который определяет степень ионизации функциональных групп и конформацию каталитического центра фермента. При исследовании влияния рН буферного раствора на процесс биотрансформации бетулина (0,5 г/л) выявлено, что

наиболее высокая степень образования бетулона достигается в условиях слабощелочной реакции среды. При рН 8,0 и 9,0 выход целевого продукта составляет 45%. Полученные результаты согласуются с данными X. Yang с соавт. (2007) о максимальной активности 3(3-гидроксистероид дегидрогеназы актинобактерий рода Mycobacterium при рН 8,5-9,5, в то время как холестеролоксидаза актинобактерий рода Rhodococcus проявляет наибольшую активность при рН 7,0-7,5 (Yazdi et al., 2008; Lashkarian et al., 2010), что может свидетельствовать об участии дегидрогеназы в окислении бетулина.

Нами установлена характерная зависимость между количеством биомассы нерастущих клеток и выходом целевого продукта. Как видно из рис. 6, максимальный (65%) выход бетулона регистрируется при использовании 10 г/л (ОШоо 2,6) клеточной биомассы. Дальнейшее повышение (до 25 г/л) количества биомассы приводит к резкому снижению степени биоконверсии бетулина. Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен ограничениями процессов массопереноса при увеличении (более 10 г/л) клеточной биомассы.

Рис. 6. Влияние количества биомассы R. rhodochrous ИЭГМ 66 на процесс биотрансформации бетулина (0,5 г/л). Условия процесса: фосфатный буфер (рН 8,0), продолжительность 48 ч.

80 70 60 50

40 | 30 1 20 10

дШВЬ^к^иЫПйЯШ.ВаВ.д

1,4 1,6 1.8 2.0 2.2 2.4 2,6 2.8 Оптическая плотность клеточной суспензии. ОПыю ' . Количество биомассы, г/л —♦— Бетулон. %

Серия дальнейших экспериментов посвящена изучению возможности биотрансформации бетулина в условиях повышенных (в 2-6 раз) концентраций нерастущими клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66 с использованием методов микроскопических исследований. Результаты этих исследований представлены на рис. 7, из которых выявлена тенденция к агрегации клеток с частицами тритерпенового субстрата (рис. 76). При этом повышение концентрации вносимого бетулина приводит к увеличению размера агломератов (рис. 7в).

а б в

Рис.7. Клетки Я. г1гос1ос1ггои8 ИЭГМ 66 в фосфатном буфере с добавлением 0,5 (а), 1,0 (б) или 3,0 (в) г/л бетулина (фазово-контрастная микроскопия, хЮОО).

В процессе исследования респираторной активности родококков установлено, что бетулин в концентрации от 0,5 до 3,0 г/л не оказывает ингибирующего влияния на дыхание бактериальных клеток. При этом скорость потребления Ог практически не зависит от концентрации вносимого бетулина и достигает максимальных значений в течение первых 24 ч эксперимента, что совпадает с периодом наибольшей каталитической активности родококков в отношении 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 г/л бетулина с образованием 60, 56,8, 51,7 и 40% бетулона соответственно. Сравнительно высокий уровень метаболической активности нерастущих родококков на начальном этапе процесса биотрансформации бетулина, по-видимому, может быть связан с запуском адаптационных механизмов при переносе жизнеспособных клеток в среду без источников питания (Эль-Регистан, 2005; Мулюкин, 2010). В последующие часы наблюдается постепенное снижение и стабилизация интенсивности дыхания и каталитической активности родококков. На рис. 8 представлена характерная зависимость уровня образования бетулона от скорости потребления О2.

8|, _ -1.6 Рис. 8. Динамика образования

бетулона (1) и респираторная активность (2) нерастущих клеток Я. гИос1ос11гош ИЭГМ 66 2 в процессе биотрансформации

^ бетулина (0,5 г/л).

I Условия процесса: фосфатный

| буфер (рН 8,0), ОПбоо 2,6.

о

Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина. С

помощью методов математического моделирования разработана кинетическая модель процесса биотрансформации бетулина в условиях использования различных концентраций субстрата. Математический анализ экспериментальных данных проводили в соответствии с соотношением >>(г)=а;(1-ехр(-г/а2)). При этом параметры аI, а? определялись концентрацией субстрата. Полученные теоретические кривые (и экспериментальные точки) приведены на рис. 9. Из графиков видно практически полное соответствие экспериментальных данных и теоретических результатов, что подтверждает адекватность разработанной математической модели для описания процесса биотрансформации бетулина.

во 80

о

70- ----- 70-

0

60 ■ 60-

а-

§ 50- § 50-

п §

£ 40- 1' 40-

30 30

да со

20- 20-

ю- • Концентрация бетулина = 0,5 г/л 10

0 20 40 60 80 100 0

Время, час

80 70 60

1 50 I -(О

о

| 30 т

20 10

Концентрация бетулина - 2.0 г/л

40 60 Время чае

/ Концентрация бетулина - 1.0 г/л

40 60 Врет, час

80 70 60 50' 40 ' 30 20 10 0

Концентрация бетулина = 3,0 г/л

40 60 Время, час

Рис. 9. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина клетками Д. гИо^оскгтк ИЭГМ 66.

Несмотря на то, что максимальный (75%) уровень биоконверсии бетулина в бетулон регистрируется при использовании 0,5 г/л бетулина через 96 ч, как видно из рис. 10, наиболее подходящими условиями для препаративного получения бетулона

(40%) является внесение бетулина в концентрации 3,0 г/л и продолжительность процесса 24 ч.

0.5 1.0 2.0

Концентрация бетулина. г/л

- 1.4

I 1.2 • 1

0.8 "S

о

0.6 £ ЦЭ

0.4

- 0.2 0

Рис. 10. Образование бетулона в процессе биотрансформации

бетулина нерастущими клет-ками Я. гкоЛккгош ИЭГМ 66.

Условия процесса: фосфатный буферный раствор (рН 8,0); ОПбоо 2,6 продолжительность 24 ч.

В результате исследования процесса биотрансформации бетулина (3,0 г/л) в подобранных условиях (рН 8,0; ОПбоо 2,6) с использованием нерастущих клеток родококков разных видов установлено, что наиболее высокой степенью биоконверсии бетулина характеризуются коллекционные культуры, принадлежащие к R. rhodochrous и R. erythropolis (табл. 4). В отличие от растущей культуры (см. табл. 2), нерастущие клетки R. opacus и 'R. longus' катализируют образование лишь следовых (менее 5%) количеств бетулона, а таковые R. ruber вообще не проявляют бетулинтрансформирующих свойств. Предполагается, что окисление 3(3-гидроксильной группы тритерпеновых кислот и спиртов - начальный этап расщепления кольца А тритерпеноидов и образования секопроизводных, перспективных противоопухолевых агентов (Akihisa et al., 2002). Для определения возможности более глубокого окисления бетулина родококками исследовали способность представителей R. rhodochrous и R. erythropolis к биотрансформации бетулона. Процесс биотрансформации бетулона проводили с использованием растущих и нерастущих клеток родококков. Показано, что в условиях использования МПБ или фосфатного буферного раствора родококки не способны к биоконверсии бетулона. В присутствии 1 об.% н-гексадекана через 7 сут регистрируется частичное (5%) обратимое восстановление бетулона в бетулин. Нами не выявлено других ожидаемых продуктов биотрансформации бетулона (бетулоновой кислоты и секопроизводных бетулина), что подтверждает высокий уровень селективности актинобактерий рода Rhodococcus в отношении бетулина.

Таблица 4

Биотрансформация бетулина (3,0 г/л) нерастущнмн клетками родококков

Вид, штамм Бетулон, %

R. rhodochrous

ИЭГМ 62 39±3,51

ИЭГМ 66 40±4,12

ИЭГМ 608 29,9±3,03

ИЭГМ 647 24,1 ±1,24

ИЭГМ 655 24,4± 1,13

ИЭГМ 760 R. erythropolis 36,6±3,82

ИЭГМ 266 26,3±2,11

ИЭГМ 678 17±0,45

ИЭГМ 682 14,9±0,45

ИЭГМ 683 R. opacus 20,2±3,22

ИЭГМ 61 <5

ИЭГМ 246 'R. longus' <5

ИЭГМ 488 <5

ИЭГМ 692 R. ruber <5

ИЭГМ 90 0,0

ИЭГМ 237 0,0

Химический синтез 3,4-секобетулина на основе бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина. В связи с неспособностью родококков катализировать образование секопроизводных бетулина реакцию окислительного расщепления кольца бетулона проводили с помощью химических агентов. Полученный при максимальной (3,0 г/л) нагрузке бетулина экстракт продуктов биотрансформации, содержащий бетулон (1), вводили в дальнейшие химические превращения без предварительной очистки бетулона (1). Химический синтез 3,4-секобетулина (5) включал реакции оксимирования и фрагментации по Бекману (рис. 1). Так, обработкой смеси продуктов биотрансформации солянокислым гидроксиламином в смеси этанола и пиридина с выходом 61% был получен оксим бетулона (2). Для исключения возможной изомеризации с участием свободной С(28) гидроксильной группы оксима (2) под действием кислотных агентов в процессе

расщепления кольца А использовали бензильную защиту (выход 28-бензоилоксипроизводного (3) составил 65%). Следует отметить, что полученный во второй стадии оксим (2) напрямую может быть использован в синтезе гетероциклических и функционализированных тритерпеновых производных. В реакции Бекмана с участием тионилхлорида использовали бензоилоксипроизводное (3), расщеплением кольца А которого с выходом 74% получено соответствующее 3,4-секопроизводное (4). Последующим щелочным гидролизом соединения (4) синтезирован целевой 3,4-секобетулин (5) (выход 81%).

Заключение. В результате проведенных исследований проведена оценка возможности биотрансформации растительного пентациклического тритерпеноида бетулина с использованием актинобактерий рода Н!юс1ососсих. При сравнении бетулинтрансформирующей активности 104 коллекционных культур родококков разных видов отобран штамм Я. гкойоскгош ИЭГМ 66, эффективно катализирующий образование бетулона - ключевого интермедиата в синтезе биологически активных соединений. Максимальный (свыше 70%) уровень биоконверсии бетулина (0,5 г/л) регистрируется в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана в течение 240 ч. Существенное сокращение (до 24 ч) длительности процесса биотрансформации бетулина достигается при использовании нерастущих клеток. Оптимальными условиями трансформации бетулина нерастущими клетками являются предварительное выращивание родококков в богатой питательной среде (МПБ), слабощелочная реакция среды (рН 8,0-9,0) и использование клеточной биомассы в количестве 10 г/л. Разработанная математическая модель позволяет адекватно прогнозировать продолжительность процесса биотрансформации бетулина и возможный выход целевого продукта в зависимости от исходной концентрации бетулина. В экспериментах с использованием различных клеточных фракций родококков подтверждена прочная связь ферментов, катализирующих региоселективное окисление бетулина, с клеточной мембраной родококков. С использованием методов микроскопического анализа выявлена тенденция к агрегации клеток с бетулином и формированию клеточных агломератов. По-видимому, нахождение клеток в составе агломератов позволяет популяции адаптироваться к условиям, при которых одиночные клетки не способны к превращению бетулина. По результатам исследований предложен новый подход к синтезу 3,4-секобетулина, основанный на использовании процесса предварительного окисления бетулина нерастущими клетками Я. гИоскэсИгоия ИЭГМ 66 до бетулона и последующей его химической модификации в 3,4-секопроизводное, перспективного в качестве противоопухолевого агента. Использование бетулона в качестве ключевого интермедиата в химическом синтезе функционализированных производных (А-секопроизводных и

гетероциклических, в частности) бетулина позволит расширить спектр новых тритерпеновых соединений с ценной биологической активностью.

ВЫВОДЫ

1. На основе генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов впервые показана способность актинобактерий рода Л/гойЬсосс«5 к биотрансформации растительного пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. В качестве основного метаболита идентифицирован бетулон - продукт региоселективного окисления вторичной гидроксильной группы бетулина. Отобран наиболее активный штамм-биотрансформатор Я гЪос1ос11гои$ ИЭГМ 66, катализирующий образование бетулона (72,2%) в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана в течение 240 ч.

2. Обоснована возможность оптимизации процесса биотрансформации бетулина за счет использования нерастущих клеток, трансформирующих бетулин при слабощелочных (рН 8,0-9,0) условиях среды и оптимуме клеточной биомассы в количестве 10 г/л в течение 24 ч. Экспериментально подтверждено, что окислительная биотрансформация бетулина протекает благодаря адгезии актинобактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.

3. Определены основные кинетические закономерности и предложена прогнозная математическая модель процесса биотрансформации бетулина нерастущими клетками, позволяющая прогнозировать его длительность и выход целевого продукта в зависимости от исходной концентрации бетулина. Показано, что в условиях повышенных концентраций бетулина (1,0-3,0 г/л) нерастущие клетки катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 57% соответственно. Наиболее высокой бетулинтрансформирующей активностью характеризуются представители Я. егучИгороИз и Я. гИоАкИгош.

4. На основе бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, путем последующей химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Тарасова Е.В. Биокаталитическое получение 3-оксобетулина - ключевого интермедиата в синтезе фармакологически активных соединений / Е.В. Тарасова, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011. -№4/1 (38).-С. 203-204.

2. Математическое моделирование биомеханики процесса биотрансформации бетулина нерастущими клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 / И.Б. Ившина, Е.В. Тарасова, М.А. Осипенко, Ю.И. Няшин, В.В. Гришко, А.А. Горбунов // Российский журнал биомеханики. - 2013. - Т. 17, №1(59). -С. 110-121.

3. Grishko V.V. Biotransformation of betulin to betulone by growing and resting cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 / V.V. Grishko, E.V. Tarasova, I.B. Ivshina // Process Biochemistry. - 2013. - V. 48, N. 11. - P. 1640-1644.

Публикации в других журналах и сборниках

4. Тарасова Е.В. Биотрансформация бетулина покоящимися клетками родококков / Е.В. Тарасова, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Матер. IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2011". - Воронеж, 2011. - Т. 1. - С. 91 -93.

5. Тарасова Е.В. Биокаталитическое окисление бетулина покоящимися клетками родококков / Е.В. Тарасова, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Матер. VII Молодежной школы конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии". - Москва, 2011. - С. 150—153.

6. Тарасова Е.В. Биотрансформация бетулина актинобактериями рода Rhodococcus / Е.В. Тарасова, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Матер, международной научно-практической конференции "XL неделя науки СПбГПУ". - Санкт-Петербург, 2011.-Т. XXI.-С. 48-49.

7. Tarasova E.V. A Combined Microbial and Chemical Synthesis of A-Secoderivative of Betulin / E.V. Tarasova, E.G. Unizhuk, V.V. Grishko, I.B. Ivshina // Book of Abstract 4th Annual Russian-Korean Conference "Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology". - Novosibirsk, 2012. - C. 159.

8. Тарасова Е.В. Получение бетулона с использованием родококков / Е.В. Тарасова, В.В. Гришко, И.Б. Ившина Получение бетулона с использованием родококков // Сборник тезисов 17 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 2013. - С. 370.

9. Stable catalysts based on bioresources from the collection of alkanotrophs [Computer file] / I. Ivshina, M. Kuyukina, A. Krivoruchko, A. Elkin, E. Tarasova, A. Mukhutdinova // Abstracts of the FEMS Microbiology Congress 2013, Leipzig, Germany, July 21-25, 2013. - Computer data (1 page of pdf file). - Leipzig, 2013. - 1 USB Flash Drive.-P. 1380.

Гришко В.В., Тарасова Е.В., Ившина И.Б. Способ получения бетулона. Заявка на патент Российской Федерации № 2013137269 от 08.08.2013. В настоящий момент находится на стадии экспертизы по существу.

ТАРАСОВА Екатерина Владимировна

биотрансформация бетулина актинобактериями

рода янооососст

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ 06.03.2014 Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасова, Екатерина Владимировна, Пермь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи 04201457035 ^Т^О^Ы^

тарасова Екатерина Владимировна

биотрансформация бетулина актинобактериями

рода яновососст

03.02.03. Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна кандидат химических наук, доцент Гришко Виктория Викторовна

Пермь-2014

список сокращений

концентрация вещества в плазме, при которой его терапевтический эффект составляет 50% от максимально возможного для данного вещества

атомно-силовая микроскопия газовая хромато-масс-спектрометрия диметилсульфоксид инфракрасная спектроскопия мясопептонный агар поливиниловый спирт тонкослойная хроматография спектроскопия ядерно-магнитного резонанса

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов 12

1.1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов 12 олеананового, урсанового и лупанового типа

1.2. Использование актинобактерий рода ШкнЛососст для 48 направленной биоконверсии терпеноидных соединений

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы исследования 57

2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 57

2.2. Условия культивирования 57

2.3. Контрольные эксперименты 58

2.4. Иммобилизация бактериальных клеток в полимерном 58 носителе

2.5. Подготовка суспензий нерастущих клеток 59

2.6. Получение клеточных фракций из родококков 61

2.7. Определение дыхательной активности 61

2.8. Определение жизнеспособности нерастущих клеток 62 родококков

2.9. Количественный и качественный анализ продуктов 62 биотрансформации бетулина

2.10. Препаративное получение бетулона 63

2.11. Химическая модификация бетулона, полученного в 64 результате бактериального окисления бетулина

2.12. Атомно-силовая микроскопия 66

2.13. Математическое моделирование процесса 66 биотрансформации бетулина

2.14. Статистическая обработка результатов 67

Глава 3. Исследование бетулинтрансформирующей активности 68 коллекционных культур родококков, поиск активных биотрансформаторов бетулина

Глава 4. Подбор оптимальных условий процесса 83

биотрансформации бетулина

Глава 5. Математическое моделирование процесса 99

биотрансформации бетулина

Глава 6. Химико-ферментативный синтез фармакологически 111

перспективных секопроизводиых бетулина

Заключение 112

Выводы 115

Список литературы 116

введение

Актуальность проблемы. Полициклические тритерпеноиды растительного происхождения представляют интерес в качестве исходных соединений в синтезе новых фармакологически активных веществ. Бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол, С30Н50О2, CAS: 473-98-3) - пентациклический тритерпеноид лупанового ряда, содержание которого во внешнем слое коры березы достигает 20-35%, активно используется для получения противовоспалительных, гепапротекторных, противоопухолевых, противовирусных, антималярийных, антибактериальных соединений (Tolstikov et al., 2005; Alakurtti et al., 2006; Santos et al., 2009). Помимо химических модификаций предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов, так как биокатализ открывает возможность получать целевые продукты с высокой степенью регио- и стереоселективности в одну технологическую стадию при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Примеры биотрансформации бетулина пока немногочисленны (Parra et al., 2009; Muffler et al., 2011) и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности представителей грибов Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Dothideomycetes, Rhodotorula. Описаны процессы окислительного расщепления бетулина до 4,28-дигидрокси-3,4-секолуп-20(29)-ен-3-овой кислоты при участии Chaetomium longirostre IFO 9873 (Akihisa et al., 2002) и окисления бетулина до бетулиновой кислоты с участием Armillaria luteo-virens Sacc QH, Aspergillus foetidus Zu-Gl, Aspergillus oryzae Sacc QH (Chen et al., 2009; Liu et al., 2010). Недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa F10 (Мао et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013). В качестве одного из перспективных интермедиатов в синтезе биологически активных соединений особый интерес представляет 3-оксопроизводное бетулина - бетулон (Koohang et al, 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010; Orlov et al., 2011). Описаны процессы химического синтеза цитотоксичных циано- и азапроизводных бетулина на основе бетулона (Koohang et al., 2009; Mar et al., 2009; Mar et al., 2010). В отличие

от трехстадийного химического синтеза бетулона использование микроорганизмов позволяет осуществлять одностадийное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина в оксогруппу при сохранении нативной С(28) гидроксильной группы. Однако описанные процессы биотрансформации бетулина до бетулона с использованием условно-патогенных дрожжей Rhodotorula mucilaginosa F10 (Мао et al., 2012) и грибов Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013) имеют значительные недостатки, поскольку осуществляются в условиях использования сложных питательных сред, характеризуются высокой продолжительностью, невысоким уровнем биоконверсии субстрата при внесении низких концентраций исходного соединения. Кроме того, использование грибов в качестве биокатализаторов потенциально опасно вследствие характера их посевного материала (споры) и способности к синтезу микотоксинов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием. В связи с этим актуальным является поиск непатогенных микроорганизмов, способных эффективно катализировать окислительные трансформации бетулина.

Одной из активно используемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus. Не мицелиальный характер роста, политрофность и лабильность метаболических систем, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах, высокая каталитическая активность и отсутствие выраженных патогенных свойств (Ившина и др., 1987; Ivshina et al., 1998; Larkin et al2006; Martinkova et al, 2009; Kuyukina, Ivshina, 2010) обусловливают перспективность реализации уникальных метаболических систем родококков для окислительной биотрансформации бетулина.

Цель настоящей работы - исследование возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для селективной биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина.

Основные задачи исследования

1. Исследовать каталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении бетулина. Отобрать штаммы — наиболее

активные биотрансформаторы бетулина и определить условия его эффективной биоконверсии.

2. Сравнить бетулинтрансформирующую активность нерастущих и иммобилизованных актинобактериальных клеток. Изучить механизм взаимодействия актинобактериальных клеток с тритерпеновым субстратом и возможные пути его трансформации.

3. Разработать прогнозную модель процесса биотрансформации бетулина в высоких концентрациях с использованием методов математического моделирования.

4. Оценить возможность использования продуктов бактериального окисления бетулина для последующего синтеза биологически активных соединений химическими методами.

Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерий рода Якойососсж к биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. В качестве основного метаболита биоконверсии бетулина идентифицирован бетулон - продукт региоселективного окисления вторичной гидроксильной группы бетулина. Установлено, что уровень бетулинтрансформирующей активности родококков зависит от концентрации н-гексадекана в среде культивирования. Подобраны оптимальные условия биоконверсии бетулина с использованием суспензий нерастущих клеток. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату. Экспериментально подтверждено, что нерастущие клетки характеризуются высоким уровнем каталитической активности в отношении бетулина в повышенных (до 3,0 г/л) концентрациях. Определены основные кинетические закономерности процесса биотранформации бетулина нерастущими клетками, предложена математическая модель, адекватно описывающая процесс биотрансформации. В результате сравнительного анализа трансформирующей активности родококков разных видов установлено, что наиболее высокая степень биоконверсии бетулина до бетулона достигается при использовании нерастущих клеток Л. гкосИоскгот и Я. егу1кгороН$. На основе

бетулона, полученного в результате бактериальной трансформации бетулина, путем последующей химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биотрансформирующих свойствах родококков. Экспериментально обоснована способность родококков разных видов к региоселективному окислению пентациклического тритерпеноида растительного происхождения бетулина в бетулон. Сравнительный анализ каталитической активности растущих и нерастущих клеток выявил высокий биотехнологический потенциал нерастущих клеток, применение которых позволяет существенно сократить (с 240 до 24 ч) продолжительность процесса биотрансформации и получить целевой продукт с высоким (60%) выходом. Использование простых (буферных) растворов в качестве трансформационной среды способствует упрощению выделения бетулона как исходного соединения для синтеза биологически активных соединений. На способ получения бетулона путем бактериальной трансформации бетулина нерастущими клетками Я. гксхЛоскгош ИЭГМ 66, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1898, составлена Заявка № 2013137269 от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ. Полученные данные могут быть использованы для разработки технологии эффективного получения бетулона с использованием родококков. Результаты диссертационных исследований используются в лекционных курсах "Биоразнообразие и систематика микроорганизмов" для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета. Информация о наиболее активных штаммах-биотрансформаторах бетулина включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.litml).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Я1ю(1ососсш в присутствии ростовых субстратов н-гексадекана, глюкозы, глицерина катализируют региоселективное окисление

бетулина с образованием бетулона. При использовании растущей культуры родококков максимальный выход целевого продукта (72,2%) достигается в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч.

2. Использование суспензий нерастущих клеток родококков позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации бетулина (0,5 г/л) до 24 ч. При этом нерастущие клетки наиболее активно трансформируют бетулин при слабощелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) и оптимуме клеточной биомассы в количестве 10 г/л. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.

3. В условиях использования повышенных концентраций бетулина (от 1,0 до 3,0 г/л) нерастущие клетки в течение 24 ч катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 57% соответственно. Наиболее высокой бетулинтрансформирующей активностью характеризуются представители R. erythropolis и R. rhodochrous.

4. На основе бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, путем химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2011", Воронеж, 2011; VII Молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2011; 4th Annual Russian-Korean Conference "Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology", Новосибирск, 2012; XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2013; Региональной конференции "Конкурс РФФИ - Пермский край. 10 лет: итоги и перспективы", Пермь, 2013; 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, 2013.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных

изданий ("Вестник Уральской медицинской академической науки", "Российский журнал биомеханики") и изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus ("Process Biochemistry"). Подана заявка № 2013137269 "Способ получения бетулона" от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований работ, в том числе 18 отечественных и 190 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека" (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (Соглашение № 8793), а также грантами Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-5589.2012.4), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН (проект № 12-П-4-1044, номер госрегистрации 01201256869), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (проект № 11-04-96012-р_урал_а).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Химическую модификацию бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, проводили на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь (лаборатория биологически активных соединений, зав. лабораторией — к.х.н. Гришко В.В.). Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального

исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой — д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям и учителям чл.-корр. РАН Ирине Борисовне Ившиной, к.х.н. Виктории Викторовне Гришко, а также коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН за помощь на всех этапах диссертационной работы.

Глава 1. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ПЕНТАЦИКЛИЧЕСКИХ

ТРИТЕРПЕНОИДОВ

1.1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов олеананового,

урсанового и луианового типа

Пентациклические тритерпеноиды - метаболиты растений и животных, представлены более чем двумя десятками структурных типов, среди которых наиболее распространены тритерпеноиды типа лупана, гопана, фриделана, урсана и олеанана (рис. 1). Данные соединения построены из пяти одинаково сочлененных колец и различаются положением метальных групп. Тритерпеноиды в свободном состоянии - это нелетучие липофильные вещества, растворимые в органических растворителях и нерастворимые в воде (Семенов, Карцев, 2000).

а б

в г

Д е

Рис. 1. Основные структурные типы пентациклических тритерпеноидов: лупан (а), олеанан (б), урсан (в), гопан (г), тараксеран (д), бауран (е), фриделан (ж).

Типичными представителями тритерпеноидов лупанового ряда является бетулин (1, луп-20(29)-ен-3р,28-диол) и бетулиновая кислота (2, 3ß-rnflpokcmiyn-20(29)-ен-28-овая кислота), обнаруживаемые во многих видах листопадных деревьев рода Betula (Береза). В тонкой внешней коре (бересте) Betula alba (Береза белая) содержание бетулина достигает 10—35%, при этом большая часть его находится в микрокристаллической форме, что обусловливает белый цвет березовой коры. Бетулин активно используется для получения противовирусных, противовоспалительных, противоопухолевых соединений (Tolstikov et al., 2005). Бетулиновая кислота и ее производные проявляют высокую противораковую, анти-ВИЧ, противовирусную, противовоспалительную, антисептическую, антимикробную, противомалярийную, антилейшманиозную, антигельминтную, фунгицидную активность (Yogeeswari, Sriram, 2005; Moghaddam et al., 2012). Вследствие селективной цитотоксичности против раковых клеток и удовлетворительного терапевтического индекса, бетулиновая кислота рассматривается как п