Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus

Ноговицина, Екатерина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus"

На правах рукописи

НОГОВИЦИНА Екатерина Михайловна

003058134

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ Р-СИТОСТЕРОЛАИЕГОЗр-АЦИЛ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА ИНОООСОССиБ

03 00 07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2007

003058134

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные руководители

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна

кандидат химических наук Гришко Виктория Викторовна Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович

Ведущая организация Казанский государственный университет, кафедра микробиологии, Казань

Защита состоится «f f» aiü-lfl. 2007 г BÜZ часов на заседании диссертационного совета Д 004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева, д 13 Факс (342)2446711

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http //www iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссеотационного совета.

чл -корр РАН

Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биотрансформация стеролов растительного и животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, в результате которой осуществляются реакции окисления Зр-гидроксильной группы в оксогруппу, окислительного отщепления алифатической боковой цепи стерола, изомеризации и дегидрогенизации -основная стадия процесса промышленного получения многих лекарственных гормональных препаратов Среди оксигенированных метаболитов стеролов обнаружены вещества с выраженной противовоспалительной, иммуносупрессивной, гестагенной, диуретической, анаболической, контрацептивной, антифунгицидной активностью В отличие от химического синтеза, микробиологические методы конверсии органических соединений дают возможность получать целевые продукты с высоким выходом в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях Ферментативный катализ позволяет осуществлять направленную трансформацию гидрофобных стериновых субстратов с высокой степенью регио- и стереоселективности, что является необходимым требованием для проявления биологической активности образующихся стероидных продуктов

Процесс окислительной биотрансформации стеролов растительного и животного происхождения в андростановые соединения наиболее эффективно катализируется с использованием прокариотных организмов (Донова, 2006, 2007, Mahato, Majumdar, 1993, Mahato, Garai, 1997, Femandes et al, 2003) Одним из наиболее доступных стериновых субстратов для микроорганизмов является Р-ситостсрол - растительный стерол, получаемый из отходов деревообрабатывающей промышленности Известно, что в большинстве случаев первый этап биоконверсии Р-ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, ответственной за реакции окисления Зр-гидроксильной группы в оксогруппу и изомеризации двойной связи при С-5 в С-4 положение При этом образуется 3-оксосоединение - стигмаст-4-ен-З-он, который может в дальнейшем трансформироваться до андростановых производи

- андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона На следующей схеме представлены возможные пути биотрансформации р-ситостерола

Стигмаст-4-ен-З-он

НО'

Андрост-4-ен-3,17-дион

(5-Ситостерол

А н дро ста-1,4-диен-3,17-дион

В настоящее время накапливается все больше сведений о способности к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеролов представителями класса Actinobacteria (Stackebrandt et al, 1997) Среди актинобактерий высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты отличаются представители рода Rhodococcus Следует отметить, что типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста родококков, способность их усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты в широком диапазоне концентрации и расти на минимальных средах, специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем и активность в экстремальных условиях внешней среды - все это делает использование этой группы актинобактерий технологически перспективным Однако следует отметить, что сегодня известны пока лишь единичные работы по биоконверсии Р-ситостерола интактными клетками родококков (Iida et al, 1985, Murohisa, Iida, 1993, Mahato, Garai, 1997, MacLachlan et al, 2000) В связи с этим актуальным является поиск новых бактериальных культур, катализирующих целевые реакции трансформации соединений с циклопергидропентанофенантреновым остовом С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www îegm ru/iegmcol),

включающего большое собрание чистых идентифицированных непатогенных штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных субстратов (Catalogue of strains, 2005), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления стеролтрансформирующей активности в пределах данного рода, подобрать оптимальные условия и, по возможности, выявить новые продукты биоконверсии р-ситостерола

Цель настоящего исследования - оценка возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для биокаталитического окисления Р-ситостерола и его ЗР-ацилпроизводных

Основные задачи исследования

1 Исследовать биокаталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении Р-сигостерола Отобрать штаммы -наиболее активные биотрансформаторы Р-ситостерола

2 Разработать оптимальные условия процесса окислительной трансформации Р-ситостерола с использованием алканотрофных родококков

3 Провести сравнительное исследование холестеролоксидазной активности коллекционных культур родококков

4 Изучить влияние индукторов и ингибиторов на стеролтрансформирующую активность родококков

Научная новизна. Проведен анализ биокаталитической активности большого массива коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении Р-ситостерола и его ЗР-ацилпроизводных Выявлена корреляция между видовой принадлежностью штаммов родококков и стеролтрансформирующей активностью Показано, что представители вида R ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении Р-ситостерола Установлено, что родококки активно трансформируют p-ситостерол в стигмаст-4-ен-З-он в соокислительных условиях в процессе роста на н-гексадекане Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола Экспериментально обосновано, что связанная пальмитиновая кислота, являющаяся структурным аналогом алифатической боковой цепи Р-ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков Обнаружено, что

родококки в условиях кометаболизма в присутствии ростового субстрата глюкозы и ингибитора 9а-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи ß-ситостерола с образованием андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона Впервые обнаружено, что клетки R ruber катализируют наряду с реакциями окисления ß-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата ß-ситостерола Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, которая реализуется в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталическом потенциале актинобактерий рода Rhodococcus В результате проведенных исследований отобраны культуры Rhodococcus spp, трансформирующие ß-ситостерол с образованием целевых продуктов, востребуемых в фармацевтической практике Активные штаммы -биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах ß-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http //www iegm ru/iegmcol)

Основные положения, выносимые на защиту

1 Актинобактерии рода Rhodococcus проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении ß-ситостерола в соокислительных условиях в присутствии с н-гексадекана с образованием до 98 % стигмаст-4-ен-З-она

2 Холсстеролоксидаза представителей R ruber обладает более высокой активностью в отношении ß-ситостерола по сравнению с таковой к холестеролу Холестеролоксидазная активность родококков индуцируется при использовании пальмитата ß-ситостерола

3 Клетки R ruber катализируют наряду с реакциями окисления ß-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата ß-ситостерола

4 Предварительно адаптированные к (3-ситостеролу клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибиторов 9а-гидроксилазы катализируют образование андростановых производных - андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004, II Всероссийской конференции «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» Пермь, 2004, I и II Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2006

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 16 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 231 литературный источник, в том числе 49 на русском и 182 на английском языках

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков inJex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5 28, номер госрегистрации 01 9 70 005279), а также в рамках ФЦТНП РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие» Исследования поддержаны грантом РФФИ № 04-03-32063

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рабочая коллекция бактериальных культур. В работе использовали 128 штаммов из Региональной профилированной коллекции алканотрофных

микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов , 1994, http //www iegm ni/iegmcol/), принадлежащих к пяти видам Rhodococcus R erythropohs (41), "R longus" (6), R opacus(7),R rhodochrous (3), R ruber (71)

Условия культивирования. Родококки выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на орбитальных шейкерах (150 об/мин) при температуре 28°С Базовый состав минеральной среды культивирования включал следующие компоненты (г/л) KN03- 1,0, КН2Р04 - 1,0, К2НР04 х ЗН20 - 1,0, NaCl - 1,0, MgS04 х 7Н20 - 0,2, СаС12 х ЗН20-0,02 (Каталог штаммов , 1994) В среду добавляли дрожжевой экстракт и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974) При подборе эффективного растворителя ß-ситостерола испытывали ацетон, диметилсульфоксид, изопропанол, полипропиленгликоль, Твин-40, Твин-60, Твин-80, или Тритон Х-100 В среду культивирования родококков вносили 0,5 г/л ß-ситостерола в качестве единственного источника углерода и энергии При проведении экспериментов в соокислительных условиях в качестве косубстратов использовали «-гексадекан (0,1 об %), глицерин (1,0%) или глюкозу (1,0%) При этом ß-ситостерол добавляли в среду культивирования родококков в виде раствора в изопропаноле одновременно с внесением бактериальных клеток или через 24-72 ч их роста При исследовании зависимости между ростовым и биотрансформационным процессами испытывали питательные среды, отличающиеся по составу минеральных солей, источнику углерода (глицерин, глюкоза или ацетат аммония) или азота (нитраты или аммонийный азот) В отдельных экспериментах для ингибирования 9а-гидроксилазы, инициирующей деструкцию полициклического остова стеролов, в ростовую среду добавляли 0,48 мМ 8-гидроксихинолина, Co(NC>3)2, NaN3 или 0,01-0,48 мМ 2,2' -дипиридила Для доказательства ферментативной природы реакции этерификации ß-ситостерола дополнительно проводили опыты в присутствии нежизнеспособных клеток родококков, предварительно выдержанных при температуре 120°С в течение 20 мин Исследования по изучению субстратной специфичности холестеролоксидазы и условий индукции активности данного фермента проводили с использованием базовой минеральной среды в соокислительных условиях в присутствии н-гексадекана Посевным материалом служили родококки (5,0 х 105 клеток/мл), предварительно выращенные на

мясопептонном агаре или минеральной среде с добавлением 0,2 г/л ß-ситостерола в присутствии глюкозы

Содержание клеточного белка и остаточного ß-ситостерола определяли через каждые 24 ч эксперимента Определение белка осуществляли модифицированным методом Лоури (Горина, Яковлева, 1980), содержание остаточного ß-ситостерола в культуральной жидкости - ферментативным методом С С Allain (1974) с использованием коммерческой тест-системы контроля уровня холсстерола (ООО «Ольвекс Диагностикум», Санкт-Петербург) и спектрофотометра Lambda EZ201 «Perkm-Elmer» (США) Контроль чистоты исследуемых культур проводили с помощью светового микроскопа Axiostar plus (Германия) с фазово-контрастным устройством

Исследование продуктов биотрансформацни. Продукты

биотрансформации ß-ситостерола и его Зр-ацилпроизводных экстрагировали этилацетатом Объединенные экстракты сушили с помощью сульфата натрия, растворитель удаляли на роторном испарителе Качественное определение продуктов биотрансформации ß-ситостерола проводили методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием пластин «Merck» (Германия) Для обнаружения стигмаст-4-ен-З-она и андростановых производных использовали ультрафиолетовый облучатель КФ-4М (Россия), другие соединения (в частности, ß-ситостерол, его сложные эфиры и пр) регистрировали после опрыскивания 5 %-м раствором H2S04 и последующего прогревания пластины при 95-100°С в течение 2-3 мин Более детально продукты биотрансформации ß-ситостерола анализировали с помощью методов хромато-масс-спектрометрии с использованием газового хроматографа Agilent 6890N (США) (кварцевая колонка HP-5MS SN US 15189741-1) на базе аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН, и высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа Милихром «Научприбор» (Россия) (колонка 6 3x0 2 см с фазой Lichrosorb RP-18) на базе Института органической химии им Н Н Ворожцова СО РАН, Новосибирск При изучении влияния различных растворителей ß-ситостерола на трансформирующую активность родококков, в опытах по оптимизации условий биоконверсии стерола до андростановых производных, а также при исследовании процесса биоконверсии сложных эфиров ß-ситостерола качественный и

количественный анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом УФ спектроскопии с использованием спектрофотометра Lambda EZ201 «Perkm-Elmer» (США)

Продукты биоконверсии p-ситостерола выделяли с использованием методов препаративной тонкослойной хроматографии на пластинах фирмы «Merck» (Германия) или колоночной хроматографии на силикагеле фирмы «Merck» (Германия) Элюснтом служила смесь гексана с добавлением от 5 до 95 % этилацетата Оптическое вращение [ocD] соединений определяли для соответствующих растворов в этаноле на поляриметре 341 Perkin-Elmer (США) при длине волны 589 нм Температуру плавления кристаллических соединений измеряли на приборе ПТП (Россия) Соотношение продуктов реакции и структуру индивидуальных соединений подтверждали данными ЯМР !Н спектрометрии Спектры ЯМР 'Н для растворов в CDCI3 записывали на спектрометре Vanan Mercury Plus 300 (300 МГц, внутренний стандарт - ГМДС) на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc, 2003), Statistica, версия 6 0 (StatSoft Inc. 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью г-критерия Стьюдента (Лакин, 1990) Для кластерного анализа использовали показатели взвешенного среднего числа пары группы, расстояние между которыми рассчитывалось по формуле City-block Manhattan distance, позволяющей снизить влияние отдельных больших различий между объектами на рассчитываемое расстояние

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По нашим данным, все исследуемые штаммы родококков используют Р-ситостерол в качестве единственного источника углерода и энергии Как видно из табл 1, уровень биоконверсии стерола, как правило, не превышает 20 % Штамм R ruber ИЭГМ 233, деградирующий более 25 % p-ситостерола и характеризующийся более выраженной стеролтрансформирующей активностью, использовался нами в дальнейших исследованиях в качестве модельного

Биотрансформация ß-ситостерола клетками родококков

Штамм Сумма продуктов реакции, г/л Содержание в сумме продуктов реакции, г/л

ß-ситостерола стигмаст-4-ен-З-она

Абиотический контроль 0,50 ±0,001 0,50 + 0,001 Не обнаружено

R erythropolis ИЭГМ 22 0,49 ±0,011 0,47 ±0,013 0,014 ±0,0008 (2,79)*

R erythropolis ИЭГМ 23 0,46 + 0,018 0,43 + 0,002 0,008 ± 0,0010 (1,73)

R erythropolis ИЭГМ 179 0,48 ± 0,025 0,45 ± 0,005 0,012 ±0,0017 (2,50)

R erythropolis ИЭГМ 183 0,50 ± 0,002 0,48 ± 0,007 0,011 ±0,0023 (2,19)

R ruber ИЭГМ 77 0,49 ± 0,009 0,47+0,018 0,002 ± 0,0010 (0,40)

R ruber ИЭГМ 80 0,49 ± 0,010 0,45 ± 0,037 Не обнаружено

R ruber ИЭГМ 233 0,36 ± 0,023** 0,34 ± 0,005** 0,012 ±0,0017 (3,30)

R ruber ИЭГМ 322 0,45 ± 0,011 0,43+0,010 Не обнаружено

Примечание *В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-З-она в сумме продуктов реакции Р-Ситостерол добавляли в среду культивирования родококков в виде порошка в качестве единственного источника углерода и энергии Приведены данные после 5 сут культивирования родококков **Полученные результаты достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при р<0,05

Влияние условий культивирования на холестеролоксидазную активность родококков. При подборе условий повышения биодоступности Р-ситостерола оказалось, что при использовании синтетических сурфактантов в качестве растворителей стерола наблюдается повышение степени стеролдегрдадирующей активности родококков, что приводит к достоверному снижению содержания Р-ситостерола в среде после 5 сут роста бактериальных клеток Так, с помощью метода УФ спектроскопии обнаружено, что в присутствии Твина-40 продукция стигмаст-4-ен-З-она увеличивается в 2 раза по сравнению с таковой при добавлении Р-ситостерола в среду культивирования в нерастворенном виде (табл 2) Однако присутствие сурфактантов в составе экстрактов продуктов биотрансформации Р-ситостерола препятствует проведению хромато-масс-спектрометрического анализа образцов, полученных

при скринировании В связи с этим в качестве растворителя Р-ситостерола мы использовали изопропанол (табл 2), который способствует некоторому повышению стеролтрансформирующей активности родококков

Таблица 2

Влияние используемых растворителей р-ситостерола на стеролтрансформационную активность клеток R ruber ИЭГМ 233

Растворитель Содержание в сумме продуктов реакции, г/л

Р-ситостерола р-ситостерол стигмаст-4-ен-З-он

Без растворителя (Контроль) 0,34 ± 0,005 0,012 + 0,0017(2,4)*

Ацетон 0,40 ± 0,027 0,010 ± 0,0040 (2,0)

Диметилсульфоксид 0,46 ± 0,006 0,009 + 0,0001 (1,8)

Изопропанол 0,37 ±0,051 0,016 ±0,0071 (3,2)

Полипропиленгл иколь 0,29 ±0,029 0,009 + 0,0037(1,7)

Твин-40 0,29 ±0,010 0,051 ±0,0042** (9,4)

Твин-60 0,19 ±0,020 0,027 ±0,0012** (5,7)

Твин-80 0,04 + 0,012** 0,009 ± 0,0090 (1,8)

Тритон Х-100 0,31 ±0,033 Не обнаружено

Примечание *В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-З-она от исходной концентрации (0,5 г/л) р-ситостерола "^Экспериментальные показатели статистически достоверно отличаются от результатов остальных вариантов опыта при р<0,05

С целью повышения степени биоконверсии Р-ситостерола родококки выращивали в присутствии глицерина, глюкозы или н-гексадекана Как видно из рис 1, в присутствии глюкозы максимальный (до 71,3 %) уровень биодеструкции Р-ситостерола достигается при росте родококков при условии добавления стерола в ростовую среду через 2 сут от начала эксперимента при переходе культуры в раннюю стационарную фазу роста

Время, сут

Рис. 1. Биодеградация (1-е и то с те рол а с использованием R. ruber ИЭГМ 233.

! - в качестве источника углерода - ¡i-ситостерал (контроль), 2 - добавление стерола ъ среду с глюкозой одновременно с внесением культуры, 3 - мере! ] сут роста культуры, 4 -через 2 сут роста культуры, 5 - через 3 сут роста культуры, 6 - кривая роста культуры, выращенной в присутствии глюкозы. Стрелками указан момент внесения стерола. ♦Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при р<0,05.

При исследовании влияния на эффективность процесса биоконверсии других ростовых субстратов (рис. 2) выявлено, что уровень стеролде градирую щей активности родококкоз в присутствии глицерина или н-гексадекана ниже, чем такой ой при использовании глюкозы Однако в присутствии глюкозы наблюдается значительная потеря стеринового субстрата, о чем свидетельствует низкий выход суммы продуктов реакции, при этом выход стигмаст-4-ен-З-она составляет лишь 14 % от исходной концентрации стерола. Образование стшмаст-4-ен-З-она наиболее активно протекает в условиях соокислительного роста родококков в присутствии н-гексадекана (табл. 3), В течение 7 сут культивирования бактериальных клеток в средс с Р-ситостеролом накапливается 0,35 г/jl стигмаст-4-ен-3-она, в то время как общая сумма продуктов реакции составляет 0,46 г/л.

r о с.

u ь

u о ts

в: к я

е-

о Ьй

1— т т

± i

Рис 2 Содержание остаточного Р-ситостерола при росте R. ruber ИЭГМ 233 в присутствии Р-ситостерола в качестве единственного источника углерода (2), а также в »окислительных условиях в присутствии глицерина (3), к-гексадекана (4) или глюкозы (5)

1 - абиотический контроль Стрелкой указано время внесения стерола ♦Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при р<0,05

Таблица 3

Биотрансформация p-ситостерола клетками R ruber ИЭГМ 233 в присутствии различных ростовых субстратов

Ростовой субстрат Сумма продуктов реакции, г/л Содержание в сумме продуктов реакции, г/л

Р-ситостерол стигмаст-4-ен-З-он

Без косубстрата 0,39 0,37 ±0,051 0,02 ± 0,007 (5,2, 4,0)

(контроль)

н-Гексадекан 0,46 0,11 ±0,018* 0,35 ±0,098** (76,1,70,0)

Глицерин 0,27 0,21 ±0,023 0,06 ± 0,007 (22,2, 12,0)

Глюкоза 0,13 0,06 ± 0,004** 0,07 ± 0,007 (53,9,14,0)

Примечание В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-З-она в сумме продуктов реакции и от исходной концентрации (0,5 г/л) Р-ситостерола в ростовой среде Приведены данные после 7 сут культивирования родококков *Достоверно по отношению к контролю при р<0,05 ** Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта при р<0,01

Как видно из представленной на рис 3 дендрограммы, построенной по данным определения содержания стигмаст-4-ен-З-она в сумме продуктов

биотрансформации, большинство исследуемых штаммов родококков в присутствии н-гексадекана трансформируют Р-ситостерол с образованием стигмаст-4-ен-З-она При этом обнаруживается корреляция между видовой принадлежностью исследуемых штаммов родококков и их стеролтрансформирующей активностью Так, представители R ruber характеризуются более выраженной конвертирующей активностью в отношении p-ситостерола (группа В, рис 3) На рис 4 представлены хроматограммы продуктов биотрансформации стерола клетками родококков, полученные с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии

Исследование субстратной специфичности холестеролоксидазы. Как

было отмечено выше, превращение Р-ситостерола в стигмаст-4-ен-З-он катализируется ферментом холестеролоксидазой Как правило, максимальная активность бактериальной холестеролоксидазы проявляется в отношении холестерола (MacLachlan et al, 2000) В результате сравнительных исследований трансформирующей активности родококков в отношении холестерола и Р-ситостерола нами обнаружено, что по уровню образования 4-ен-З-оновых продуктов представители R ruber отличается более высокой активностью холестеролоксидазы в отношении Р-ситостерола, а не холестерола (табл 4) Следует отметить, что в литературе встречаются единичные сведения (Wovcha et al, 1979, Barthakur et al, 1996) о способности мутантных штаммов микобактерий к более эффективной биотрансформации растительных стеролов с разветвленной боковой цепью по сравнению с холсстеролом

При исследовании субстратной специфичности холестеролоксидазы родококков в отношении ЗР-ацилпроизводных p-ситостерола нами выявлена зависимость активности фермента бактериальных клеток от длины ацильного фрагмента (R = СН3СОО- или CiSH31COO-) в молекуле сложного эфира Р-ситостерола При постановке данных экспериментов был выбран штамм R erythropolis ИЭГМ 487, характеризующийся умеренной холестеролоксидазной активностью в отношении Р-ситостерола (см табл 4)

Рис 3 Дендрограмма, иллюстрирующая результаты биотрансформации р -ситостерола родококками при росте па н-гексадекане.

Дендрограмма построена на основании данных по определению содержания стигмаст-4-ен-З-она в сумме продуктов биотрансформации Р-ситостерола

Рис. 4. Хроматограммы продуктов биотрансформации р-снтостерола клетками родококков в с ооки сл ите л ь н ы х условиях в присутствии н-гсксадскаиа

1 - етигмаст-4-ен-З-он; 2 - р-ситостерол.

Как видно из табл. 5, данный штамм при росте на н-гексадекане конвертирует 26,3 % стерола в стигмаст-4-ен-З-он. При использовании пальмитата Р-ситостерола у род о кокков значительно повышается активность холестеролоксидазы, при этом образуется 54,4 % стигмаст-4-ен-З-она (табл. 5), При биоконверсии ацетата р-снтосгерола регистрируется присутствие только Р-ситостерола (14,5 %) - продукта гидролиза сложноэфирной связи. Полученные данные согласуются с предположением (На1регп, 1981) об индуктивном влиянии жирнокислотного остатка, представляющего собой структурный аналог алифатической боковой цепи молекулы стерола, на синтез холестеролэстеразы и последующую продукцию холестеролоксидазы.

Биотрансформация холестерола и ß-ситостерола при роете клеток родококков па «-гексадекане

Штамм Продукты биотрансформации стеролов, %

Холест-4-ен-З-он Стигмаст-4-ен-З-он

Абиотический контроль Не обнаружено Не обнаружено

R erythropolis ИЭГМ 10 82,8 ±4,23 67,5 ± 3,23*

R erythropolis ИЭГМ 16 97,9 ±2,11 10,5 ± 8,56*

R erythropolis ИЭГМ 267 93,3 ±6,51 37,3 ± 23,48

R erythropolis ИЭГМ 507 85,5 ± 14,49 48,6 ±0,07*

R erythropolis ИЭГМ 487 100,0 ±0,00 26,3 ± 1,26*

R ruber ИЭГМ 80 23,6 ±5,18 29,1 ± 10,49

R ruber ИЭГМ 233 34,3 ± 11,41 71,2 ± 11,20*

R ruber ИЭГМ 235 39,2 ± 1,53 70,0 ± 20,65

R ruber ИЭГМ 381 83,4 ± 9,47 75,0 ± 8,77

R ruber ИЭГМ 468 23,6 ±7,93 51,6 ±4,99*

Примечание Приведены данные после 5 сут культивирования родококков ♦Экспериментальные показатели достоверно (р<0,05) отличаются от результатов, полученных при использовании в качестве субстрата биоконверсии холестерола

Таким образом, в результате проведенных исследований нами подобраны условия направленного биокаталического окисления ß-ситостерола и его производных до стигмаст-4-ен-З-она, предусматривающие использование изопропанола в качестве растворителя данных стеролов, ростового субстрата н-гексадекана и представителей R ruber - эффективных биокатализаторов ключевого процесса конверсии ß-ситостерола Образующийся в процессе биотрансформации стигмаст-4-ен-З-он может использоваться непосредственно в качестве лекарственного препарата для лечения андрогензависимых заболеваний (Streber, 1993)

Биотрансформация сложных эфиров Р-ситостерола клетками R erythropohs ИЭГМ 487 при росте на п-гексадекане

Стерин Содержание в сумме продуктов реакции, %

остаточный стерин Р-ситостерол стигмаст-4-ен-З-он

Р-Ситостерол (контроль) 73,7 - 26,3 ± 1,26

Ацетат Р-ситостсрола 85,5 14,5 Не обнаружено

Пальмитат Р-ситостерола 22,2 31,5 54,4 ±8,10*

Примечание Приведены данные после 5 сут культивирования родококков ♦Данные достоверно (р<0,05) отличаются от контроля

Исследование влияния состава питательной среды и адаптированной формы биокатализатора на процесс биотрансформации Р-ситостерола.

Необходимо отметить, что во всех экспериментах по биотрансформации Р-ситостерола регистрируется довольно низкий (до 1 %) уровень андростановых производных - интермедиатов органического синтеза современных лекарственных средств В связи с этим при разработке оптимальных условий процесса отщепления боковой цепи Р-ситостерола нами было испытано 10 питательных сред для культивирования родококков, различающихся по минеральному составу, источникам углерода и азота Использование лишь одной питательной среды D Wilmanska с соавт (1995), содержащей глюкозу и азот в аммонийной форме, позволило незначительно (до 4,0 %) увеличить выход андростановых производных При этом в качестве основного продукта биоконверсии Р-ситостерола у скринированных штаммов родококков (табл 6) наряду со стигмаст-4-ен-З-оном обнаруживается ацетат p-ситостерола (до 75,5 %) - продукт этерификации стерола Использование приема предварительной адаптации клеток родококков на среде D Wilmanska с соавт (1995) с добавлением 0,2 г/л p-ситостерола в качестве индуктора стеролтрансформирующей активности не привело к увеличению выхода андростановых производных, но позволило значительно (до 99 %) повысить выход ацетата Р-ситостерола Как видно из табл 6, способность к этерификации Р-ситостерола характерна в основном для представителей вида R ruber

Таблица 6

Биотрансформация ß-ситостерола при росте клеткок родококков в течение 5 сут в среде D. Wilmanska с соавт. (1995)

Неадаптированные клетки Адаптированные клетки

Штамм Остаточный стерол, % Стигмаст-4-ен-З-он, % Ацетат Р-ситостерола*, % Остаточный стерол,% Стигмаст-4-ен-З-он, % Ацетат Р-ситостерола, %

R ruber ИЭГМ 179 26,76 73,24 0,00 0,00 24,99 74,98

R ruber ИЭГМ 233 54,22 7,76 50,25 13,20 21,20 65,60

R ruber ИЭГМ 381 15,11 21,22 63,67 30,06 37,16 92,90

R ruber ИЭГМ 467 25,44 18,64 55,92 20,15 20,00 59,85

R ruber ИЭГМ 577 24,43 18,89 56,68 1,98 0,00 99,01

R ruber ИЭГМ 583 11,42 14,76 73,82 0,00 21,17 84,70

R ruber ИЭГМ 597 15,42 21,14 63,43 2,21 0,00 97,89

R erythropolis ИЭГМ 10 17,68 18,90 63,42 27,55 16,73 55,72

R erythropolis ИЭГМ 478 16,01 23,89 59,99 6,83 31,05 62,11

R erythropolis ИЭГМ 270 82,10 17,90 0,00 83,60 16,40 0,00

R erythropolis ИЭГМ 509 77,09 22,91 0,00 95,13 4,87 0,00

R erythropolis ИЭГМ 507 9,4 15,10 75,50 14,41 20,37 65,21

R erythropolis ИЭГМ 766 87,3 12,7 0,00 <2,00 <2,00 0,00

Примечание *При использовании нежизнеспособных клеток родококков ацетат ß-ситостерола не образуется

Биотрансформация Р-ситостерола алканотрофными родококками в присутствии ингибиторов 9а-гидроксилазы Необходимо отметить, что в скрининговых опытах с использованием адаптированных клеток родококков нами обнаружен штамм егуЛгорокз ИЭГМ 766, катализирующий процесс практически 100 %-го разрушения Р-ситостерола (см табл 6) Для получения андростановых производных мы исследовали биотрансформационную активность данного штамма в присутствии различных ингибиторов 9а-гидроксилазы, катализирующей начальную стадию деструкции полициклического остова молекулы стерола Как видно из табл 7, используемые ингибиторы проявляют практически одинаковое влияние на стеролдеградирующую активность И егуЛгоро1и ИЭГМ 766 При этом андростановые соединения в сумме продуктов реакции не регистрируются С целью обеспечения выхода андростановых производных нами были подобраны оптимальная концентрация и время внесения ингибиторов в среду культивирования Аналитические исследования продуктов биотрансформации Р-ситостерола, полученных в условиях ингибирования 9а-гидроксилазы родококков и выделенных в индивидуальном виде методом колоночной хроматографии, свидетельствуют о том, что добавление 0,03 мМ 2,2'-бипиридила через 24 часа роста родококков способствует повышению выхода андростановых производных с 4,0 до 31,5 % (табл 8)

Установлено, что при росте бактериальных клеток в течение 5 сут в среде О \Vilmanska с соавт (1995) в присутствии 0,03 мМ 2,2'-бипиридила повышение выхода андростановых производных наблюдается на фоне снижения стеролдеградирующей активности Я егугИгорокз ИЭГМ 766 по сравнению с контрольным вариантом (рис 5) При этом внесение в питательную среду ингибитора в концентрации 0,03 мМ не оказывает негативного воздействия на скорость роста исследуемой культуры

Структура андростановых продуктов биотрансформации р-ситостерола -андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона- подверждена с помощью методов ЯМР и масс-спектрометрии, УФ спектроскопии

Биотрансформация р-ситостерола клетками Я егуЛгорокь ИЭГМ 766 в присутствии ингибиторов 9а-гидроксилазы

Ингибитор* Сумма продуктов реакции, г/л Содержание в сумме продуктов реакции, г/л (%)

Р-ситостерол стигмаст-4-ен-З-он

Без ингибитора 0,12 + 0,005 0,02 ±0,008 0,08 ± 0,006

(контроль)

№N3 0,50 ± 0,004 0,38 ± 0,022 0,17 + 0,050

Со(М03)2 0,32 ±0,098 0,37 ±0,009 0,08 ±0,005

2,2'-Бипиридил 0,43 ± 0,073 0,41 ±0,010 0,16 ±0,031

8-Гидроксихинолин 0,50 ± 0,006 0,33 ± 0,021 0,20 ±0,022

Примечание *Ингибиторы вносили в среду И \Vilmanska с соавт (1995) в концентрации 0,48 мМ Достоверность между контрольным и опытным вариантом при р<0,05

Таблица 8

Биоконверсия р-ситостерола II. егуЛгороШ ИЭГМ 766 в присутствии ингибитора 2,2'-бипиридила

Концентрация Сумма Содержание в сумме продуктов реакции, г/л

2,2'-бипиридила, мМ (мг%) продуктов реакции, г/л р-ситостерол стигмаст-4-ен-3-он андростановые производные

Без ингибитора (контроль) 0,12 ±0,005 0,02 ±0,008 0,08 ± 0,006 Не обнаружено

0,03 (0,5) 0,35 ±0,064 0,20 ± 0,023 0,07 ± 0,020 0,10 ±0,011 (31,5)*

0,09(1,5) 0,41 ±0,038 0,26 ±0,013 0,08 ±0,010 0,07 ± 0,009 (17,1)

0,16(2,5) 0,49 ±0,014 0,20 ±0,012 0,22 ± 0,008 0,07 ±0,016 (14,2)

0,22 (3,5) 0,49 ± 0,008 0,36 ±0,031 0,09 ±0,004 0,04 ±0,022 (8,1)

0,48 (7,5) 0,49 ± 0,008 0,38 ± 0,045 0,07 + 0,027 0,04 ±0,013 (8,1)

Примечание *В скобках приведено процентное содержание андростановых производных в сумме продуктов реакции Достоверность между контрольными и опытными данными при р<0,05

0 Cl

1 о

4> X

к *

& 3

Время, сут

Рис. 5. Бнодегрзда«ия p-ситостерола при росте адат нроваичых клеток R, erythropolis ИЭГМ 766 в среде D. Wilmariska с соавт. (1995).

1,2- содержание остаточного р-снтостерола в среде без ингибитора (контроль) и в присутствии 0,03 мМ 2,2'-бип при лила, соответственно, 3, 4 - накопление клеточного белка в присутствии 2,2'-бипирщшла и без ингибитора (контроль), соответственно. Стрелкой указано время внесения ингибитора. Достоверность между контрольным и опытным вариантом при *р<0,0к +*р<0,05.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что изученные коллекционные штаммы бактерий рола Rhodococcus способны к осуществлению направленной биотрансформации ^-ситостерола до соединений, широко востребуемых в фармацевтической практике. Показано, что холестеролоксидазная реакция ролококков с образованием 4-ен-З-оновых производных наиболее эффективно протекает в присутствии ростового субстрата к-гексадскана. Холестеролоксидазная активность родококков может быть индуцирована при использовании в качестве субстрата биоконверсии сложного эфира р-ситостерола и пальмитиновой кислоты. В процессе ацилирования наиболее целесообразно использование предварительно адаптированных к стеролу клеток R. ruber, катализирующих в условиях к о метаболизма с глюкозой образование до 98,0 % ацетата ji-снтостерола Обнаружен штамм R. erythropolis ИЭГМ 766, конвертирующий {)-ситостерол ло андрост-4-ен-3,17-диона (26,0 %) и андроста-1,4-диен-3,17-диона (5,5 %) в условиях использования в качестве косубстрата глюкозы и добавления 0,03 мМ 2,2'-дипиридила через 1 сут роста бактериальных клеток.

Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения p-ситостерола являются R erythropolts ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766, R ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597, трансформирующие ß-ситостерол с образованием ацетата ß-ситостерола, стигмаст-4-ен-З-она, андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99 %

Активные штаммы - биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах ß-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http //www legm ru/iegmcol)

Выводы

1 Установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus активно трансформируют Р-ситостерол в стигмаст-4-ен-З-он в условиях кометаболизма в процессе роста на н-гексадекане Наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении p-ситостерола характеризуются представители вида R ruber, при этом выход основного окисленного продукта достигает 98,0 %

2 Выявлена зависимость холестерочоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола Экспериментально обосновано, что пальмитат Р-ситостерола оказывает индуктивное воздействие на холестеролоксидазную активность родококков

3 Установлено, что родококки, предварительно адаптированные к Р-ситостеролу, при росте на глюкозе в присутствии ингибитора 9а-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи Р-ситостерола с образованием андростановых производных

4 Впервые обнаружено, что клетки R ruber катализируют наряду реакциями окисления Р-ситостерола реакцию ацилирования с образованием (до 99,0 %) ацетата Р-ситостерола Экспериментально подтверждена энзиматическая природа реакции этерификации стерола, более эффективно реализуемой в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата

5 Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения p-ситостерола являются R erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766, R ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172. ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597 трансформирующие Р-ситостерол с образованием ацетата Р-ситостерола, стигмаст-4-ен-З-она, андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99,0 %

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ноговицина Е М, Гришко В В, Ившина И Б Биотрансформация стеринов бактериями рода Rhodococcus sensu striclo/fMarep X Всерос научно-практ конф «Экология проблемы и пути решения» 4 2- Пермь, 2002 -С 138-144

2 Ноговицина Е М Биотрансформация сложных эфиров ß-ситостерола алканотрофными родококками//Матер II Междунар конф «Экология и научно-технический прогресс» -Пермь, 2003 -С 125-126

3 Ноговицина Е М Индуктивное влияние сложных эфиров ß-ситостерола на холсстеролоксидазную активность родококков//Матер Региональной конф молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» - Пермь, 2004 - С 80-85

4 Ноговицина Е М , Гришко В В , Ившина И Б Трансформация сложных эфиров ß-ситостерола под воздействием штамма Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 487//Матер III Всерос конф «Химия и технология растительных веществ» -Саратов, 2004 - С 104-106

5 Ноговицина Е М, Гришко В В, Ившина И Б, Толстиков А Г Биотрансформация ß-ситостерола в присутствии биокатализатора Rhodococcus ruber ИЭГМ 233 и ингибиторов 9а-гидроксилазы//Матер II Всерос конф «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» -Пермь,2004 - С 178-181

6 Ноговицина Е М, Гришко В В , Кукина Т П, Ившина И Б Изучение способности алканотрофных родококков к биотрансформации стигмаст-5-ен-Зр-ола//Вестник Пермского госуниверситета Серия Биология - 2004 — N 2 -С 118-122

7 Ившина И Б , Гришко В В , Ноговицина Е М , Кукина Т П , Толстиков Г А Биотрансформация ß-ситостерола и сложных эфиров ß-ситостерола актинобактериями рода /?Ло</ососсы5//Прикладная биохимия и микробиология -2005 -Т 41,N 6-С 626-633

8 Ноговицина Е М, Гришко В В, Каменских Т Н, Ившина И Б Использование коллекционных штаммов родококков с выраженной активностью холестеролоксидазы для биотрансформации р-ситостсрола//Матер II Междунар конф «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» - Пермь-Казань-Пермь, 2005 - С 74-75

9 Ноговицина Е М, Гришко В В , Ившина И Б Биотрансформация Р-ситостерола актинобактериями рода ЮюНососсиа в условиях ингибирования 9а-гидроксилазы//Матер I Всерос молодежной школы-конф «Актуальные аспекты современной микробиологии» - Москва, 2005 — С 99-100

10 Ноговицина Е М, Гришко В В Биотрансформация Р-ситостерола с использованием целых клеток алканотрофных родококков//Матер II Всерос молодежной школы-конф «Актуальные аспекты современной микробиологии» -Москва, 2006 - С 85-86

НОГОВИЦИНА Екатерина Михайловна

БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ Р-СИТОСТЕРОЛА И ЕГО Зр-АЦИЛ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS

Автореферат

Подписано в печать 10 04 2007 Тираж 120 экз Уел печ л 1,0 Формат 60x90/16 Набор компьютерный Заказ № 242к/2007

Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм» 614025, г Пермь, ул ГХасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ноговицина, Екатерина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Микробиологическая трансформация стеролов

1.1. Биотрансформация стеролов под действием холестеролоксидазы

1.2. Биологическая деградация боковой цепи стеролов

1.3. Способы повышения биодоступности стеролов

1.4. Биотрансформация полициклического циклопентанопер- ^ гидрофенантренового остова

1.5. Одностадийный биокаталитический синтез фармацевтически значимых производных на основе стеролов

1.6. Биотехнологический потенциал актинобактерий рода

Rhodococcus

1.6. Биотрансформация стеролов и стероидов с использованием родококков

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур

2.2. Условия культивирования бактериальных культур

2.3. Использованные в работе реагенты

2.4. Анализ продуктов биотрансформации

2.5. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Поиск штаммов родококков, эффективно трансформирующих р-ситостерол

3.1. Исследование способности родококков использовать

Р-ситостерол в качестве единственного источника углерода

3.2. Биотрансформация Р-ситостерола алканотрофными родококками в присутствии органических растворителей

3.3. Биотрансформация Р-ситостерола клетками алканотрофных родококков в присутствии дополнительных источников 69 углерода

3.4. Исследование Р-ситостеролтрансформирующей активности коллекционных культур родококков в условиях соокисления 74 с и-гексадеканом

Глава 4. Исследование холестеролоксидазной активности ^ коллекционных штаммов актинобактерий рода Rhodococcus

4.1. Сравнительная оценка холестеролоксидазной активности родококков в отношении холестерола и р-ситостерола

4.2. Зависимость каталитической активности родококков от природы ацильного заместителя в молекуле этерифицирован- 83 ного стерола

Глава 5. Влияние условий роста родококков на процесс биотрансформации Р-ситостерола

5.1. Исследование влияния состава питательной среды и адаптированной формы биокатализатора на процесс биотрансформации (З-ситостерола

5.2. Биотрансформация (З-ситостерола алканотрофными родококками в присутствии ингибиторов 9а-гидроксилазы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus"

Актуальность проблемы. Биотрансформация стеролов растительного и животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, в результате которой осуществляются реакции окисления 3(3-гидроксильной группы в оксогруппу, окислительного отщепления алифатической боковой цепи стерола, изомеризации и дегидрогенизации -основная стадия процесса промышленного получения лекарственных гормональных препаратов. Среди оксигенированных метаболитов стеролов обнаружены вещества с выраженной противовоспалительной, иммуносупрессивной, гестагенной, диуретической, анаболической, контрацептивной, антифунгицидной активностью. В отличие от химического синтеза, микробиологические методы конверсии органических соединений дают возможность получать целевые продукты с высоким выходом в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях. Ферментативный катализ позволяет осуществлять направленную трансформацию гидрофобных стериновых субстратов с высокой степенью регио- и стереоселективности, что является необходимым требованием для проявления биологической активности образующихся стероидных продуктов.

Процесс окислительной трансформации стеролов растительного и животного происхождения в андростановые соединения наиболее эффективно катализируется с использованием прокариотных организмов (Донова, 2006, 2007; Mahato, Majumdar, 1993; Mahato, Garai, 1997; Fernandes et al, 2003). Одним из наиболее доступных стериновых субстратов для микроорганизмов является (3-ситостерол - растительный стерол, получаемый из отходов деревообрабатывающей промышленности. Известно, что в большинстве случаев первый этап биоконверсии р-ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, ответственной за реакции окисления ЗР-гидроксильной группы в оксогруппу и изомеризации двойной связи при С-5 в С-4 положение. При этом образуется 3-оксосоединение - стигмаст-4-ен-З-он, который в дальнейшем трансформируется до соответствующих андростановых производных. На рис. 1 представлены основные пути биотрансформации Р-ситостерола.

Холестеролоксидаза

Стигмаст-4-ен-З-он о р-Ситостерол

А ндрост-4-ен-3,17-дион о

Андроста-1,4-диен-3,1 7-дион Рис. 1. Основные пути микробной трансформации Р-ситостерола.

В настоящее время накапливается все больше сведений о способности к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеролов представителями класса Actinobacteria (Stackebrandt et al, 1997). Среди актин обактерий высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты отличаются представители рода Rhodococcus. Следует отметить, что типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста родококков, их способность усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты в широком диапазоне концентрации и расти на минимальных средах, специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем и активность в экстремальных условиях внешней среды - все это делает использование этой группы актинобактерий технологически перспективным. Однако следует отметить, что сегодня известны пока лишь единичные работы по биоконверсии [З-ситостерола интактными клетками родококков (Iida et al., 1985; Murohisa, Iida, 1993; Mahato, Garai, 1997; MacLachlan et al., 2000). В связи с этим актуальным является поиск новых бактериальных культур, катализирующих целевые реакции трансформации соединений с циклопентанопергидрофенантреновым остовом. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol), включающего большое собрание чистых идентифицированных непатогенных штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных субстратов (Catalogue of strains, 2005), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления стеролтрансформирующей активности в пределах данного рода, подобрать оптимальные условия и, по возможности выявить новые продукты биоконверсии (З-ситостерола.

Цель настоящего исследования - оценка возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для биокаталитического окисления (З-ситостерола и его 3(3-ацилпроизводных.

Основные задачи исследования

1. Исследовать биокаталитическую активность коллекционных культур родококков разных видов в отношении (З-ситостерола. Отобрать штаммы - наиболее активные биотрансформаторы (З-ситостерола.

2. Разработать оптимальные условия процесса окислительной трансформации (З-ситостерола с использованием алканотрофных родококков.

3. Провести сравнительное исследование холестеролоксидазной активности коллекционных культур родококков.

4. Изучить влияние индукторов и ингибиторов на стеролтрансформирующую активность родококков.

Научная новизна. Проведен анализ биокаталитической активности большого массива коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении |3-ситостерола и его 3|3-ацилпроизводных. Выявлена корреляция между видовой принадлежностью штаммов родококков и их стеролтрансформирующей активностью. Показано, что представители вида R. ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении (3-ситостерола. Установлено, что родококки активно трансформируют Р-ситостерол в стигм аст-4-ен-З-он в соокислительных условиях в процессе роста на н-гексадекане. Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола. Экспериментально обосновано, что связанная пальмитиновая кислота, являющаяся структурным аналогом алифатической боковой цепи p-ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков. Обнаружено, что родококки в условиях кометаболизма в присутствии ростового субстрата глюкозы и ингибитора 9а-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи Р-ситостерола с образованием андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. Впервые обнаружено, что клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления p-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата P-ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, более эффективно реализуемой в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биокаталическом потенциале актинобактерий рода Rhodococcus. В результате проведенных исследований отобраны культуры Rhodococcus spp., трансформирующие Р-ситостерол с образованием целевых продуктов, востребуемых в фармацевтической практике. Активные штаммы - биотрансформаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств. Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах P-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Rhodococcus проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении p-ситостерола в соокислительных условиях в присутствии с н-гексадекана с образованием до 98 % стигмаст-4-ен-З-она.

2. Холестеролоксидаза представителей R. ruber обладает более высокой активностью в отношении Р-ситостерола по сравнению с оптимальным субстратом для данного фермента холестеролом. Холестеролоксидазная активность родококков индуцируется при использовании пальмитата Р-ситостерола.

3. Клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления p-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата р-ситостерола.

4. Предварительно адаптированные к p-ситостеролу клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибиторов 9а-гидроксилазы активно катализируют образование целевых андростановых производных - андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004; II Всероссийской конференции «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» Пермь, 2004; I и II Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2006.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 16 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ноговицина, Екатерина Михайловна

104 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus активно трансформируют Р-ситостерол в стигмаст-4-ен-З-он в условиях кометаболизма в процессе роста на н-гексадекане. Наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении Р-ситостерола характеризуются представители вида R. ruber, при этом выход основного окисленного продукта достигает 98,0 %.

2. Выявлена зависимость холестеролоксидазной активности родококков от длины ацильного фрагмента в молекуле сложного эфира стерола. Экспериментально обосновано, что пальмитат р-ситостерола оказывает индуктивное воздействие на холестеролоксидазную активность родококков.

3. Установлено, что родококки, предварительно адаптированные к Р-ситостеролу, при росте на глюкозе в присутствии ингибитора 9а-гидроксилазы 2,2'-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи Р-ситостерола с образованием андростановых производных.

4. Впервые обнаружено, что клетки R. ruber катализируют наряду с реакциями окисления p-ситостерола реакцию ацилирования с образованием ацетата Р-ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа реакции этерификации стерола, более эффективно реализуемой в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата.

5. Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения p-ситостерола являются R. erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766; R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597, трансформирующие Р-ситостерол с образованием ацетата р-ситостерола, стигмаст-4-ен-З-она, андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99,0 %.

105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что бактерии рода Rhodococcus способны к активной трансформации Р-ситостерола. Большинство исследуемых культур родококков проявляют холестеролоксидазную активность в отношении Р-ситостерола с образованием стигмаст-4-ен-З-она - важного в фармацевтическом отношении соединения. По данным S. Streber (1993), стигмаст-4-ен-З-он может использоваться непосредственно в качестве лекарственного средства при лечении андрогензависимых заболеваний. Нами подобраны условия биокаталического окисления Р-ситостерола до стигмаст-4-ен-З-она с максимальным выходом целевого продукта, предусматривающие использование изопропанола в качестве растворителя стерола, ростового субстрата н-гексадекана и наиболее эффективных биокатализаторов ключевого процесса конверсии Р-ситостерола - представителей R. ruber. Обнаружено, что остаток пальмитиновой кислоты в молекуле сложного эфира стерола, являющийся структурным аналогом алифатической боковой цепи Р-ситостерола, оказывает индуктивное воздействие на активность холестеролоксидазы родококков.

В результате анализа литературных данных можно сделать вывод о том, что среди родококков в основном описана способность штаммов R. equi и отдельных представителей вида R. erythropolis к трансформации стеролов (MacLachlan et al, 2000; van der Geise et al., 2000). Сведения о наличии стеролтрансформирующей способности у представителей R. ruber отсутствуют. В результате проведенных исследований получены данные, свидетельствующие о том, что коллекционные штаммы R. ruber проявляют более выраженный уровень холестеролоксидазной активности в отношении Р-ситостерола по сравнению с холестеролом, который является, как правило, оптимальным субстратом для микробной холестеролоксидазы (MacLachlan et al., 2000). Такая активность среди природных штаммов микроорганизмов не известна, однако описаны отдельные примеры мутантных штаммов микобактерий, способных к более эффективной трансформации стеролов с разветвленной боковой цепью по сравнению с холестеролом (Wovcha et al., 1979; Barthakur et al., 1996). Кроме того, обнаружено, что клетки R. ruber катализируют наряду с окислительными процессами реакцию ацилирования стерола с образованием ацетата Р-ситостерола. Экспериментально подтверждена энзиматическая природа данной трансформационной реакции, которая реализуется в присутствии глюкозы в качестве ростового субстрата. Известно, что процесс ферментативной этерификации органических соединений с участием гидролитических ферментов липаз или эстераз наиболее эффективно протекает в среде органических растворителей (в водных условиях равновесие реакции, как правило, сдвигается в сторону гидролиза сложноэфирной связи). В связи с этим можно предположить, что в подобранных нами условиях у родококков активизируется трансферазный фермент - бактериальный аналог известного фермента млекопитающих ацетил-коэнзим А: холестерол ацилтрансферазы, который в условиях глюкозосодержащей культуральной среды катализирует эффективное ацетилирование р-ситостерола.

При подборе оптимальных условий биоконверсии p-ситостерола до андростановых производных обнаружен штамм R. erythropolis ИЭГМ 766, который после предварительной адаптации к Р-ситостеролу проявляет высокую стеролдеградирующую активность. Выявлена питательная среда, содержащая глюкозу и азот в аммонийной форме, при культивировании в которой клетки родококков в условиях ингибирования 9а-гидроксилазной активности катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи Р-ситостерола с образованием андростановых производных. Наиболее активными биокатализаторами процесса окислительного превращения Р-ситостерола являются R. erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 487, ИЭГМ 766; R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 235, ИЭГМ 577, ИЭГМ 597, трансформирующие Р-ситостерол с образованием ацетата р-ситостерола, стигмаст-4-ен-З-она, андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона, выход которых составляет от 31,5 до 99,0 %.

Активные штаммы-биокатализаторы и полученные экспериментальные сведения могут быть использованы при разработке биотехнологических способов получения целевых соединений - ключевых интермедиатов синтеза лекарственных средств. Полученная информация о наиболее активных биотрансформаторах Р-ситостерола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для широкого использования в каналах сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ноговицина, Екатерина Михайловна, Пермь

1. Алехина Т.М. Микробиологическая трансформация водорастворимых стероидов / Т.М. Алехина, В.М. Рыжкова, Т.И. Гусарова // Хим.-фарм. журн. - 1992. - Т. 26, № 9-10. - С. 106-107.

2. Алехина Т.М. Микробиологическая трансформация соединений включения стероидов с (З-циклодекстрином / Т.М. Алехина, В.М. Рыжкова, Т.И. Гусарова и др. //Хим.-фарм. журн. 1993. - Т. 27, № 4, с. 59-62.

3. Амелина А.С. Трансформация ситостерина различными бактериями /

4. A.С. Амелина, Ю.Н. Коробова, Н.Н. Гречушкина и др. // Хим.-фарм. журн. 1982. - Т. 29, № 6. - С. 82-87.

5. Ахрем А.А. Микробиологические трансформации стероидов / А.А. Ахрем, Ю.А. Титов М.: Наука, 1965. - 504 с.

6. Баюнова В.И. Трансформация андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона с помощью Beauveria sp. / В.И. Баюнова, К.Н. Габинская, Т.С. Колыванова и др. // Хим.-фарм. журн. 1989. - Т. 23, № 4. -С. 471-473.

7. Борман Е.А. Трансформация ситостерина в 9а-оксиандростендион культурой Mycobacterium sp. 207 в присутствии абсорбционной смолы / Е.А. Борман, Ю.В. Редикюльцев, К.А. Кощеенко и др. // Прикл. биохимия и микробиология, 1992.-Т. 26, №6.-С. 551-556.

8. Вдовина Н.В. Изучение физиолого-биохимических свойств культуры Nocardia erythropolis, осуществляющей отщепление боковой цепи стеринов / Н.В. Вдовина, М.И. Бухар, К.А. Кощеенко // Прикл. биохимия и микробиология. 1982. - Т. 18, № 3. - С. 293-300.

9. Войшвилло Н.Е. Идентификация нового штамма трансформирующих стероиды микобактерий как Mycobacterium neoaurum / Н.Е. Войшвилло,

10. B.А. Андрюшина, Т.С. Савинова и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 2. - С. 173-179.

11. Войшвилло Н.Е. Стероидтрансформирующая активность диссоциативных вариантов Rhodococcus sp. / Н.Е. Войшвилло, A.M. Турута,

12. А.В. Камерницкий и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1993.1. Т. 27, №3,-С. 424-430.

13. Войшвилло Н.Е. Трансформация андростендиона бактериями, деградирующими стерины / Н.Е. Войшвилло, В.А. Андрюшина, Т.С. Савинова, Т.С. Стыценко // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. -Т. 40, №5.-С. 536-543.

14. Вычерова О.В. Биотрансформация 3,17-дикетоандростанов / О.В. Вычерова, В.М. Николаева, М.В. Донова // Матер. Школы-конф. «Горизонты физико-химической биологии». 2000. - С. 138-142.

15. Габинская К.Н. Изучение состава сред для роста микобактерий, отщепляющих боковую цепь ситостерина / К.Н. Габинская, Ю.Н. Коробова, О.В. Мессинова // Хим.-фарм. журн. 1984. - Т. 18, № 12. -С.1480-1482.

16. Герасимова МЛ. Синтез и микробиологическое гидроксилирование 16а,17а-диоксозамещенных 20-оксо-5а-прегнанов / M.JI. Герасимова, Т.И. Гусарова, В.М. Рыжкова и др. // Хим.-фарм. журн. 1989. - Т. 23, № 10. -С. 1259-1263.

17. Горина И.А. Быстрый метод определения содержания белка в клетках микроорганизмов / И.А. Горина, В.И. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология. 1980. - Т. 16, № 6. - С. 936-937.

18. Гриненко Г.С Микробиологическое получение андрост-4-ен-3,17-диона / Г.С. Гриненко, Е.В. Попова, К.Н. Габинская // Хим.-фарм. журн. -2002.-Т. 36, №9.-С. 50-51.

19. Гришко В.В. Биотрансформация изопимаровой и дегидроабиетиновой кислот с использованием бактерий рода Rhodococcus / В.В. Гришко, А.В. Воробьев, И.Б. Ившина, и др. // Химия в интересах устойчивого развития. -2000.-№8.-С. 693-698.

20. Демаков В.А. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis продуцент нитрилгидратазы / В.А. Демаков, А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова и др. //

21. Патент РФ № 2196822 - 2003.

22. Донова М.В. Трансформация стероидных соединений актинобактериями: Автореферат дис. .докт. биол. наук / М.В. Донова. -Пущино, 2006. 46 с.

23. Донова М.В. Трансформация стероидных соединений актинобактериями / М.В. Донова // Прикл. биохимия и микробиология. -2007.-Т. 43,№ 1.-С. 5-18

24. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991.-544 с.

25. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничное, А.А. Оборин Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 с.

26. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. - 163 с. (www.iegm.ru/iegmcol/).

27. Климашина М.М. Изучение субстратной специфичности ферментов биотрансформации культуры Nocardia erythropolis / М.М. Климашина, И.В. Викторовский, Н.П. Михайлова, К.А. Вьюнов // Известия АН. Сер. биол. -1989. -№3.- С. 429-434.

28. Колыванова Т.С. Гидроксилирование тестостерона и метилтестостерона с помощью Rhisopus nigricans / Т.С. Колыванова, В.И.

29. Баюнова, К.Н. Габинская и др. // Хим.-фарм. журн. 1985. Т. 19, № 6. -С. 722-724.

30. Колыванова Т.С. Исследование продуктов микробиологической трансформации 19-оксиситостерина / Т.С. Колыванова, В.И. Баюнова, К.Н. Габинская и др. // Хим.-фарм. журн. 1982. - Т. 16, № 3. - С. 334-338.

31. Колыванова Т.С. Микробиологическое гидроксилирование андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона / Т.С. Колыванова, В.И. Баюнова, К.Н. Габинская и др. // Хим.-фарм. журн. 1989. - Т. 23, № 5. -С. 635-637.

32. Кураков В.В. Влияние начальной концентрации (3-ситостерина на процесс его микробиологической трансформации в андрост-4-ен-3,17-дион / В.В. Кураков, Ю.Н. Коробова, В.М. Рыжкова // Хим.-фарм. журн. 1993. -Т. 27, № 5. - С. 65-67.

33. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин М.: Высшая школа, 1990. -352 с.

34. Милько Е.С. Отщепление боковой цепи ситостерина R-, S- и М-вариантами микобактерий / Е.С. Милько, Ю.Н. Коробова, К.Н. Габинская, Н.С. Егоров//Микробиология.- 1982.-Т. 5, № 1.-С. 166-167.

35. Нестеренко О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина Киев: Наук, думка, 1985. -336 с.

36. Оборин А.А. Нефтегазопоисковая геомикробиология / А.А. Оборин, Е.В. Стадник Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - 407 с.

37. Попова Е.В. Синтез 17(3-гидроксиандроста-1,4-диен-3-диона микробиологическим путем / Е.В. Попова, К.Н. Габинская, С.Д. Шувалова и др.//Хим.-фарм. журн. 2001. Т. 35, №3.-С. 53-54.

38. Романенко В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов / В.И. Романенко, С.И. Кузнецов Ленинград: Наука, 1974. - 194 с.

39. Рыжкова В.М. Исследование зависимости направления микробиологического гидроксилирования от структуры замещенных прегнанов / О.А. Нестеренко, В.М. Рыжкова, Т.М. Быкова, Г.А. Клубничкина и др. // Хим.-фарм. журн. 1986. - Т. 20, № 7. - С. 873-876.

40. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений / А.А. Семенов -Новосибирск: Наука, 2000. 664 с.

41. Скрябин Г.К. Использование микроорганизмов в органическом синтезе / Г.К. Скрябин, JI.A. Головлева М.: Наука, 1976. - 336 с.

42. Суходольская Г.В. Стероид-11 (3-гидроксилазная активность Curvularia lunata ВКМ F-644 и факторы ее стабилизации / Г.В. Суходольская, С.А. Гулевская, С.Б. Чинчолкар и др. // Прикл. биохимия и микробиология. -1996.-Т. 32, № 1.-С. 69-67.

43. Толстиков А.Г. Энантиоселективное биокаталитическое окисление органических сульфидов в хиральные сульфоксиды / А.Г. Толстиков, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // В кн.: Современные проблемы асимметрического синтеза. Екатеринбург, 2003. - С. 165-205.

44. Трутко С.М. Зависимость пути трансформации стероидов бактериями Agrobacterium tumefaciens от внутриклеточного уровня НАД(Ф)Н / С.М. Трутко, А.Ю. Аринбасарова, В.А. Шнырова, В.К. Акименко // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 2. - С. 171-176.

45. Турута A.M. Микробиологическое гидроксилирование 16а, 17а-эпоксипрогестерона / A.M. Турута, А.В. Камерницкий, А.А. Коробов и др. // Хим.-фарм. журн. 1990. - Т. 24, № 6. - С. 52-55.

46. Физер JI. Стероиды / Л. Физер, М. Физер М.: изд-во Мир, 1964. -983 с.

47. Фокина В.В. Дегидрирование стероидных субстратов бактериальными клетками, включенными в криогель поливинилового спирта / В.В. Фокина, А.Ю. Аринбасарова, A.JI. Зубов и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. - Т. 31, № 2. - С. 213-219.

48. Чичикалова М.М. Физико-химический анализ продуктов биотрансформации эргостерина культурой Nocardia erythropolis / М.М. Чичикалова, И.В. Викторовский, Н.П. Михайлова, К.А. Вьюнов // Прикл. биохимия и микробиология. 1988. - Т. 24, № 2. - С. 170-174.

49. Шувалова С.Д. Гидроксилирование андрост-4-ен-3,17-диона с помощью гриба Curvularia lunata / С.Д. Шувалова, К.Н. Габинская, Е.В. Попова и др. // Хим.-фарм. журн. 2001. - Т. 35, № 5. - С. 44-45.

50. Abd El-Hady A. Production of prednisolone by Pseudomonas oleovorans cells incorporated into PVP/PEO radiation crosslinked hydrogels / A. Abd El-Hady, H.A. Abd El-Rehim // J. Biomed. Biotechnol. 2004. - V. 4. -P. 219-226.

51. Ahmad S. Biotransformations of sterols: selective cleavage of the side chain / S. Ahmad, K. Garg, B.N. Johri // Biotechnol. Adv. 1992. - V. 10, № 1. - P. 167.

52. Ahmad S. Cholesterol side-chain cleavage by immobilized cells of Rhodococcus equi DSM 89-133 / S. Ahmad, P.K. Roy, S.K. Basu, B.N. Johri // Indian J. Exp. Biol. 1993. - V. 31, № 4. - P. 319-322.

53. Ahmad S. Immobilization of Rhodococcus equi DSM 89-133 onto porous celite beads for cholesterol side-chain cleavage / S. Ahmad, B.N. Johri // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - V. 37. - P. 468-469.

54. Ahmad S. Microbial transformation of sterols to C19-steroids by Rhodococcus equi / S. Ahmad // World J. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V. 7, №5.-P. 557-561.

55. Aldrich Catalog/Handbook of Fine Chemicals. 2003-2004. - P. 128.

56. Al-Awadi S. Studies on Bacillus stearothermophilus. Part III. Transformation of testosterone / S. Al-Awadi, M. Afzal, S. Oommen // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 62. - P. 48-52.

57. Aldrich Catalog/Handbook of Fine Chemicals. 1992. - P. 94-95.

58. Allain C.C. Enzymatic determination of total serum cholesterol / C.C. Allain, L.S. Poon, C.S.G. Chan et al II Clin. Chem. 1974. V. 20. - P. 470-475.

59. Ambrus G. Microbial transformation of P-sitosterol and stigmasterol into 26-oxygenated derivatives / G. Ambrus, E. Ilkoy, A. Jekkel et al II Steroids. -1995.-V. 60.-P. 621-625.

60. Angelova B. 9a-hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by resting Rhodococcus sp. cells / B. Angelova, S. Mutafov, T. Avramova et al II Process Biochem. 1996. - V. 31. - P. 179-184.

61. Angelova B. Hydroxylation of androstendione by resting Rhodococcus sp. cells in organic media / B. Angelova, P. Fernandes, A. Crus // Enzyme Microb. Technol. 2005. - V. 37. - P. 718-722.

62. Angelova B. Lipophilic compounds in biotechnology-interactions with cells and technological problems / B. Angelova, H. Schamauder // J. Biotechnol. -1999.-V. 67.-P. 13-32.

63. Antosz F.J. 9a-hydroxi-bis-nor-cholanic acid / F.J. Antosz, W.J. Haak, M.G. Wovcha // USA patent. № 4062880. - 1977.

64. Aono R. Oxidative byconversion of cholesterol by Pseudomonas sp. strain ST-200 in water-organic solvent two-phase system / R. Aono, N. Doukyu, H. Kobayashi // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, № 7. - P. 2518-2523.

65. Arand M. Structure of Rhodococcus erythropolis limonene-l,2-epoxide hydrolase reveals a novel active site / M. Arand, B.M. Hallberg, J. Zou et al. // EMBO J. 2003. - V. 22, № 11. - P. 2583-2592.

66. Banerjee T. Mixed culture bioconversion of 16-dehydropregnenolone acetate to androsta-l,4-diene-3,17-dione optimization of parameters / T. Banerjee, A. Shukla, K. Shinde, S. Patil // Biotechnol. Prog. 2003. - V. 19, № 2. - P. 662664.

67. Bar R. Ultrasound enhanced bioprocesses: Cholesterol oxidation by Rhodococcus erythropolis / R. Bar // Biotechnol. Bioeng. 1988. - V. 32, № 5. -P.655-663.

68. Barthakur S. Steroid transformation by mutants of Mycobacterium sp. with altered response to antibiotics / S. Barthakur, M.K. Roy, S.K. Bera, A.C. Chosh // J. Basic Microbiol. 1996. - V. 36, № 6. - P. 383-387.

69. Beard T.M. Enantioselective biotransformations using rhodococci / T.M. Beard, M.I. Page // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74, № 1-3. - P. 99106.

70. Bell K.S. The genus Rhodococcus / K.S. Bell, J.C. Philp, D.W.J. Aw, N. Christofi // J. Appl. Microbiol. 1998.-V. 85.-P. 195-210.

71. Benasson C.S. The microbiological hydroxylation of 3a,5-cycloandrostanes by Cephalosporium aphidicola / C.S. Benasson, J.R. Hanson, L.I. Huerou // Phytochemistry. 1999. - V. 52. - P. 1279-1282.

72. Biggs C.B. Process for the microbial transformation of steroids / C.B. Biggs, T.R. Руке, M.C. Wovcha // USA patent. № 4211841. - 1980.

73. Bortolini О. Biotransformation on steroid nucleus of bile acids / O. Bortolini, A. Medici, S. Poli // Steroids. 1997. V. 62. - P. 564-577.

74. Boynton J. The hydroxylation of some 13a-methylsteroids by Cephalosporium aphidicola / J. Boynton, J.R. Hanson, C. Hunter // Phytochemistry. 1997. - V. 45, № 5. - P. 951-956.

75. Cabral J.M.S. Biotransformation in organic media by enzymes and whole cells / J.M.S. Cabral, M.R. Aires-Barros, H. Pinheiro, D.M.F. Prazeres // J.

76. Biotechnol. 1997. -V. 59. - P. 133-143.

77. Catalogue of strains of Regional Specialized Collections of Alkanotrophic Microorganisms. 2006 www.iegm.ru/iegmcol.

78. Cauet G. Pregnenolone esterification in Saccharomyces cerevisiae. A potential detoxification mechanism / G. Cauet, E. Degryse, C. Ledoux // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 261. - P. 317-324.

79. Coulter A.W. Studies on the microbiological degradation of steroid ring A A.W. Coulter, P. Talalay // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243, № 12. - P. 32383247.

80. Cruz A. Effect of phase composition on the whole-cell bioconversion of (3-sitosterol in biphasic media / A. Cruz, P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinheiro // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2002. - V. 19-20. - P. 371-375.

81. Cruz A. Solvent partitioning and whole-cell sitosterol bioconversion activity in aqueous-organic two-phase systems / A. Cruz, P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinheiro // Enzyme Microb. Technol. 2004. - V. 34. - P. 342353.

82. Cruz A. Whole-cell bioconversion of p-sitosterol in aqueous-organic two-phase systems / A. Cruz, P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinheiro // J. Mol. Catal.-2001.-V. 11.-P. 579-585.

83. Dacheva V.K. Synthesis of 9a-hydroxysteroids by a Rhodococcus sp. / V.K. Dacheva, N.E. Voishvillo, A.V. Kamernitskii et al. II Steroids. 1989. - V. 54, № 3.-P. 271-286.

84. Dias A.C. Sterol side-chain cleavage with immobilized Mycobacterium cells in water-immiscible organic solvents / A.C. Dias, J.M. Cabral, H.M. Pinheiro // Enzym. Microb. Technol. 1994. -V. 16, № 8. - P. 708-714.

85. Dias A.C.P. Isolation of a biodegradable sterol-rich fraction from industrial wastes / A.C.P. Dias, P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinheiro // Bioresour. Technol. 2002. - V. 82, № 3. - P. 253-260.

86. Dogra N. Biotransformation of cholesterol by Micrococcus sp. mediated by plasmid DNA / N. Dogra, G.N. Qazi // World J. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 15. -P. 411-415.

87. Donova M.V. Microbial conversion of sterol-containing soybean oil production waste / M.V. Donova, D.V. Dovbnya, G.V. Sukhodolskaya et al. II J. Chem. Technol. 2004. - V. 80, № 1. - P. 55-60.

88. Donova M.V. Modified CDs-mediated enhancement of microbial sterol side-chain degradation / M.V. Donova, D.V. Dovbnya, K.A. Koshcheyenko // Proc. Int. Symp. Cyclodextrins. 1996. - P. 8527-8530.

89. Donova M.V. Mycobacterium sp. mutant strain producing 9a-hydroxyanrostendione from sitosterol / M.V. Donova, S.A. Gulevskaya, Dovbnya D.V., I.F. Puntus // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 67, № 5. -P. 671-678.

90. Doukyu N. Purification of extracellular cholesterol oxidase with high activity in the presence of organic solvents from Pseudomonas sp. strain ST-200 / N. Doukyu, R. Aono // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, № 5. -P. 1929-1932.

91. Dutta R.K. Metabolic blocks in the degradation of |3-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans / R.K. Dutta, M.K. Roy, H.D. Singh // J. Basic Microbiol. 1992. - V. 32, № 2. - P. 167-176.

92. Egorova O.V. Production of androstendione using mutants of Mycobacterium sp. / O.V. Egorova, S.A. Gulevskaya, I.F. Puntus et al. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002. - V. 77, № 2. - P. 141-147.

93. Elalami A. Characterization of a secreted cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. GKI (CIP 105 335) / Elalami A., J. Kreit, A. Filali-Maltouf et al. II World J. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 15. - P. 579-585.

94. Faramarzi A.M. Microbial hydroxylation of progesterone with Acremonium strictum / A.M. Faramarzi, M.T. Yazdi, M. Amini // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 222. - P. 183-186.

95. Fernandes P. Bioconversion of a hydrocortisone derivative in an organic-aqueous two-liquid-phase system / P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinheiro // Enzyme Microb. Technol. 1995. - V. 17. - P. 163-167.

96. Fernandes P. Influence of some operational parameters on the bioconversion of sitosterol with immobilized whole cells in organic medium / P. Fernandes, J.M.S. Cabral, H.M. Pinhero // J. Mol. Catal. B: Enzym. 1998. -V. 5,№ 1-4.-P. 307-310.

97. Fernandes P. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments / P. Fernandes, A. Cruz, B. Angelova et al. II Enzyme Microb. Technol. 2003. - V. 32, № 6. - P. 688-705.

98. Ferreira N.P. Microbiological process for degradation of steroids / N.P. Ferreira // USA patent. 1990. - № 4923403.

99. Ferreira N.P. The microbial of 3aa-H-4a-(3'-propionic acid)-5a-hydroxy-7a3-methylhexahydro-indan-1 -one-5-lactone from cholesterol / N.P. Ferreira, P.M. Robson, J.R. Bull, W.H. Van der Walt // Biotechnol. Lett. 1984. - V. 6,8.-P. 517-522.

100. Finnerty R.W. The biology and genetics of the genus Rhodococcus / R.W. Finnerty // Annu. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 193-218.

101. Fokina V.V. Microbial conversion of pregna-4,9(l l)-diene-17a,21-diol-3,20-dione acetates by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D / V.V. Fokina,

102. G.V. Sukhodovskaya, B.P. Baskunov et al II Steroids. 2003. - V. 68. - P. 415421.

103. Fujii C. Essential tyrosine residues in 3-ketosteroid A'-dehydrogenase from Rhodococcus rhodochrous / C. Fujii, S. Morii, M. Kadode // J. Biochem. 1999. -V. 126, №4. -P. 662-667.

104. Fujishiro K. Purification and properties of new Brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase produced by E. coli MM294/pnH10 / K. Fujishiro, H. Uchida, K. Shimokawa et al. II FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 215, № 2. - P. 243248.

105. Fukyama M. Purification and some properties of cholesterol oxidase from Schizophyllum comunne with covalently bound flavin / M. Fukyama, Y. Miyake // J. Biochem. 1979. - V. 85, № 5. - P. 1183-1193.

106. Greca M.D. Biotransformation of progesterone by the green alga Chlorella emersonii C211-8H / M.D. Greca, A. Fiorentino, G. Pinto et al II Phytochemistry. 1996. - V. 41, № 6. - P. 1527-1529.

107. Groh H. Preparation of 3-ketodesogestrel metabolites by microbial transformation and chemical synthesis / H. Groh, R. Schon, M. Ritzau et al II Steroids. 1997. V. - 62, № 5. - P. 437-443.

108. Halpern M.G. Cholesterol oxidase from bacteria. Industrial enzymes from microbial sources / M.G. Halpern // Chem. Technol. Rev. 1981. - V. 186. — P. 3-22.

109. Hesselink P.G.M. Optimization of steroid side chain cleavage of Mycobacterium sp. in the presence of cyclodextrins / P.G.M. Hesselink, S. Van Viet, H. De Vries, B. Witholt // Enzyme Microb. Technol. 1989. - V. 11. - P. 398-404.

110. Hill F.F. Microbial conversion of sterols. 1. Selection of mutants for production of 20-carboxy-pregna-l,4-dien-3-one / F.F. Hill, J. Schindler, R. Schmid et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1982. - V. 15, № 5. - P. 25-32.

111. Holland H.L. Microbial hydroxylation of 2-oxatestosterone / H.L. Holland, G. Lakshmaiah II J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999. - V. 6. - P. 83-88.

112. Huang C. Production of androstenones from phytosterol by mutants of Mycobacterium sp. / C. Huang, Y. Chen, W. Liu // Enzyme Microb. Technol. -2006. V. 39, № 5. - P. 296-300.

113. Hung B.R. Testosterone as biotransformation product in steroid conversion by Mycobacterium sp. / B.R. Hung, A. Falero, N. Llanes et al. II Biotechnol. Lett. 1994. - V. 16.-P. 497-500.

114. Iida M. Biotransformation sitosterol by Rhodococcus sp. / M. Iida, T. Murohisa, A. Yoneyama, H. Iizuka // J. Ferment. Technol. 1985. - V. 63. -P. 559-562.

115. Iida M. Production of 20-carboxypregnan derivative / M. Iida, M. Yoshihama. // Japan Patent. 1989. - № JP188000053454.

116. Imada Y. 9a-hydroxy steroids / Y. Imada, S. Mizuno // USA patent. -1981.-№4255344.

117. Isobe K. Purification and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents from y-Proteobacterium Y-134 / K. Isobe, K. Shoji, Y. Nakanishi // J. Biosci. Bioeng. 2003. - V. 95. - P. 257-253.

118. Isobe K. The second cholesterol oxidase produced by y-Proteobacterium Y-134 / K. Isobe, N. Mori, N. Wakao // J Biosci. Bioeng. 2003. - V. 96, № 3. -P. 257-261.

119. Jadoun J. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 4. Enzyme vs microbial oxidation of cholesterol / J. Jadoun, R. Bar // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 40, № 4. - P. 477-482.

120. Jadoun J. Microbial transformations in a cyclodextrin medium. Part 3. Cholesterol oxidation by Rhodococcus erythropolis / J. Jadoun, R. Bar // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 40, № 2-3. - P. 230-240.

121. Kieslich K. Microbial side-chain degradation of sterols / K. Kieslich // J. Basic. Microbiol. 1985. - V. 25. - P. 461-474.

122. Kim K.P. Degradation of cholesterol by Bacillus subtilis SFF34 isolated from Korean traditional fermented flatfish / K.P. Kim, C.H. Rhee, H.D. Park // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. - P. 468-472.

123. Knight J.C. Isolation of methyl 3-hydroxy-9-oxo-9,10-seco-23,24-dinor-1,3,5( 10)-cholatrienoate / J.C. Knight, M.G. Wovcha // Steroids. 1985. - V. 46, №2-3.-P. 789-796.

124. Kolek T. Biotransformation XLVII: transformations of 5-ene steroids in Fusarium culmorum culture / T. Kolek // J. Steroid. Biochem. 1999. - V. 71, № 1-2.-P. 83-90.

125. Korycka-Machala M. Enhancement of (3-sitosterol transformation in Mycobacterium vaccae with increased cell wall permeability / M. Korycka-Machala, A. Rumijowska-Galewicz, K. Lisowska et al. II Acta Microbiol. Pol. -2001.-V. 50, №2.-P. 107-115.

126. Koryka-Machala M. Polycations increase the permeability of Mycobacterium vaccae envelopes to hydrophobic compounds / M. Koryka-Machala, A. Ziolkowski, A. Rumijowska-Galewicz et al. II Microbiology. -2001.-V. 147.-P. 2769-2781.

127. Koryka-Machala M. The effect of ethambutol on mycobacterial cell wall permeability to hydrophobic compounds / M. Koryka-Machala, A. Rumijowska-Galewicz, J. Dziadek//Polish J. Microbiol. 2005. - V. 54, № 1. - P. 5-11.

128. Kreit J. Extracelullar cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. cells / J. Kreit, G. Lefebvre, P. Germain //J. Biotechnol. 1992. - V. 24. - P. 177-188.

129. Kreit J. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus erythropolis / J. Kreit, G. Lefebvre, P. Germain // J. Biotechnol. 1994. - V. 33. -P. 271-282.

130. Krishenowski D. Two novel microbial conversion products of progesterone derivatives / D. Krishenowski, K. Kieslich // Steroids. 1993. - V. 58. - P. 278281.

131. Kumar R. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor / R. Kumar, J.S. Dahiya, D. Singh, P. Nigam // Bioresour. Technol. 2001. - V. 78. - P. 209-211.

132. Labaree D. A direct stereoselective synthesis of 7f3-hydroxytestosterone / D. Labaree, R.M. Hoyte, R.B. Hochberg // Steroids. 1997. - V. 62, № 6. - P. 482486.

133. Lai K.M. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgari / K.M. Lai, M.D. Scrimshaw, J.N. Lester // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68, № 2. - P. 859-864.

134. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J.C. Philp // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74, № 1-3. - P. 59-70.

135. Larkin M.J. Applied aspects of Rhodococcus genetics / M.J. Larkin, R. Demot, L.A. Kulakov, I. Nagy // Antonie van Leuvenhoek. 1998. - V. 74. -P.133-153.

136. Lee C.Y. The production of androsta-l,4-diene-3,17-dione from cholesterol using 2-step microbial transformation / C.Y. Lee, C.D. Chen, W.H. Liu // Appl. Microbiol. Biotecnol. 1993. - V. 38, № 4. - P. 447-452.

137. Lee S. Purification and characterization of cholesterol oxidase from Pseudomonas sp. and taxonomic study of the strain / S. Lee, H. Rhee, W. Tae et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V. 31. - P. 542-546.

138. Leon R. Whole-cell biocatalysis in organic media / R. Leon, P. Fernandes, H.M. Pinheiro, J.M.S. Cabral // Enzyme Microb. Technol. 1998. - V. 23. -P. 483-500.

139. Liu W.H. Bioconversion of cholesterol to cholest-4-en-3-one in aqueous/organic solvent two-phase reactors / W.H. Liu, W.C. Horng, M.S. Tsai //Enzyme Microb. Technol. 1996. - V. 18.-P. 184-185.

140. Liu W.H. Production of testosterone from cholesterol using a single-step microbial transformation by mutant of Mycobacterium sp. / W.H. Liu, C.K. Lo // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 19. - P. 269-272.

141. Llanes N. Conversion of |3-sitosterol by Mycobacterium sp. NRRL B-3805 cells immobilized on Celite supports / N. Llanes, P. Fernandes, R. Leon et al. I/ J. Mol. Catal. B: Enzym.-2001. V. 11.-P. 523-530.

142. Lo C.K. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by mutant of Mycobacterium sp. / C.K. Lo, C.P. Pan, W.H. Liu // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 28. - P. 280-283.

143. MacLachlan J. Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications / J. MacLachlan, A.T.L. Wotherspoon, R.O. Ansell, C.J.W. Brooks // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000. - V. 72. - P. 169-195.

144. Mahato S.B. Advances in microbial steroid biotransformation / S.B. Mahato, S. Garai // Steroids. 1997. -V. 62. - P. 332-345.

145. Mahato S.B. Current trends in microbial steroid biotransformation / S.B. Mahato, I. Majumdar // Phytochemistry. 1993. - V. 34, № 4. - P. 883-898.

146. Mahato S.B. Metabolism of sitosterol by Pseudomonas species / S.B. Mahato, S. Banerjee, A. Mukherjee, R. Kumar // Biochem. J. 1981. - V. 196. -P. 629-631.

147. Mahato S.B. Steroid transformation by microorganisms-II / S.B. Mahato, S. Banerjee // Phytochemistry. 1985. -V. 24, № 7. - P. 1403-1421.

148. Mahato S.B. Steroid transformations by microorganisms-III/ S.B. Mahato, S. Banerjee, S. Podder // Phytochemistry. 1989. - V. 28. - P. 7-40.

149. Marshesk W.L. Microbial degradation of sterols / W.L. Marshesk, S. Kraychy, R.D. Muir // Appl. Microbiol. 1972. - V. 23, № 1. - P. 72-77.

150. Martin C.K.A. Microbial transformation of P-sitosterol by Nocardia sp. M 29 / C.K.A. Martin, F. Wagner // Eur. J. Appl. Microbiol. 1976. - V. 2. -P.-243-255.

151. Martin C.K.A. Sterols / C.K.A. Martin // In: Biotechnology, A comprehensive treatise. Ed. K. Kieslich. Weinheim: Verlag chemie. 1984. -V. 6a.-P. 79-96.

152. Mccune R.W. Competitive inhibition of adrenal A5-3|3-hydroxysteroid dehydrogenase and A 5-3-ketosteroid isomerase activities by adenosine 3',5'-monophosphate / R.W. Mccune, R. Siney, P.L. Young // J. Biol. Chem. 1970. -V. 245, N. 15.-P. 3859-3667.

153. Murohisa T. Microbial degradation of 19-hydroxisterol side-chains / T. Murohisa, M. Iida//J. Ferment. Bioeng. 1993. - V. 75, № l.-P. 13-17.

154. Murohisa T. Studies on microbial transformation (XXVI). Some new intermediates in microbial side chain degradation / T. Murohisa, M. Iida // J. Ferment. Bioeng. 1993.-V. 75.-P. 174-180.

155. Nishikawa D. Process for the microbiological oxidation of steroids / D. Nishikawa, Y. Imada, M. Kinoshite et al. II USA patent. 1977. - № 4057469.

156. Nissen S.E. Effect of AC AT inhibition on the progression of coronary atherosclerosis / S.E. Nissen, E.M. Tuzcu, H.B. Brewer // N. Engl. J. Med. -2006. V. 354, № 12. - P. 1253-1263.

157. Owen R.W. Bioconversion of lithocholic acid under anaerobic conditions by Pseudomonas sp. strain NCIB 10590 / R.W. Owen, R.F. Bilton I I Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48, № 3. - P. 606-609.

158. Owen R.W. The degradation of cholesterol by Pseudomonas sp. NCIB 10590 under aerobic conditions / R.W. Owen, A.N. Mason, R.F. Bilton // J. Lipid Res.- 1983.-V. 24.-P. 1500-1511.

159. Patel R.N. Biocatalytic synthesis of chiral intermediates / R.N. Patel // Food Technol. Biotechnol. 2004. - V. 42, № 4. - P. 305-325.

160. Pa til S. Bioconversion of 3|3-acetoxypregna-5,16-diene-20-dione to androsta-l,4-diene-3,17-dione by mixed bacterial culture / S. Patil, A. Shukla, K. Shinde, T. Banerjee // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. - P. 95-97.

161. Peres C. Bioconversion of phytosterols to androstanes by mycobacteria growing on sugar cane mud / C. Peres, A. Falero, B.R. Hung et al. II J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32, № 3. - P. 83-86.

162. Peres C. Isolation and partial characterization of a new mutant for sterol biotransformation in Mycobacterium sp. / C. Peres, E. Peres, E. Herve // Biotechnol. Lett. 1995.-V. 17,№ 11.-P. 1241-1246.

163. Peres C. Resistance to androstanes as an approach for androstandienedione yield enhancement in industrial mycobacteria / C. Peres, A. Falero, N. Llanes et al. /I J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 623-626.

164. Phase N. Natural oils are better than organic solvents for the conversion of soybean sterols to 17-ketosteroids by Mycobcterium fotuitum / N. Phase, S. Patil // World J. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 10, № 2. - P. 228-229.

165. Pollio A. Biotransformations of progesterone by Chlorella spp. / A. Pollio, G. Pinto, M.D. Greca et al // Phytochemistry. 1996. - V. 42, № 3. - P. 685688.

166. Rhee C. Two novel extracellular cholesterol oxidases of Bacillus sp. isolated from fermented flatfish / C. Rhee, K. Kim, H. Park // Biotechnol. Lett. -2002.-V. 24.-P. 1385-1389.

167. Roglic U. The influence of f3-cyclodextrin on the kinetics of progesteronevtransformation by Rhizopus nigricans / U. Roglic, P. Znidarsic-PIazI, I. PlazI // Biocatal. Biotransform. 2005. - V. 23, № 5. - P. 299-305.

168. Salva T.J.G. Some enzymatic properties of cholesterol oxidase produced by Brevibacterium sp. / T.J.G. Salva, A.M. Liserre, A.L. Moretto et al. II Rev. Microbiol. 1999. - V. 30. - P. 315-323.

169. Santos R.A. Steroid bioconversion in a novel aqueous two-phase system / R.A. Santos, J.C.G. Caldeira, H.M. Pinheiro, J.M.S. Cabral // Biotechnol. Lett. 1991.- V. 13, №5.-P. 349-354.

170. Sarangthem K. Microbial bioconversion of metabolites from fermented succulent bamboo shoots into phytosterols / K. Sarangthem, T.N. Singh // Curr. Sci. -2003. V. 84, № 12.-P. 1544-1547.

171. Sardessai Y. Isolation of an organic-solvent-tolerant cholesterol-transforming Bacillus species BC1, from coastal sediment / Y. Sardessai, S. Bhosle // Mar. Biotechnol. 2003. - V. 5. - P. 116-118.

172. Schubert K. Formation of sterol esters in the bacterial cell / K. Schubert, G. Kaufmann //Biochim. Biophys. Acta. 1965 -V. 106, № 3, 2. - P. 592-597.

173. Schubert K. Esterification of sterols with fatty acids and with succinic acid in mycobacteria / K. Schubert, G. Kaufmann, C. Horhold // Biochim. Biophys. Acta.-1969.-V. 176,№ l.-P. 163-169.

174. Sedlaczek L. Effect of inhibitors of cell envelop synthesis on P-sitosterol side chain degradation by Mycobacterium sp. NRRL MB 3683 / L. Sedlaczek, B.M. Gorminski, K. Lisowska // J. Basic. Microbiol. 1994. - V. 34, № 6. -P. 387-399.

175. Sedlaczek L. The effect of cell wall components on glycine-enhanced sterol side chain degradation to androstene derivatives by mycobacteria / L. Sedlaczek,

176. К. Lisowska, М. Korycka et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 52, №4.-P. 563-571.

177. Sehgal S.N. Microbial aromatisation of steroids into equilin / S.N. SehgaJ, C. Vezina // Appl. Microbiol. 1970. - V. 20, № 6. - P. 875-879.

178. Seidel L. Selection and characterization of new microorganisms for the manufacture of 9-OH-AD from sterols / L. Seidel, C. Horhold // J. Basic. Microbiol. 1992. - V. 32. - P. 49-55.

179. Shapiro S.S. An analysis of variance test for normality (complete samples) / S.S. Shapiro, M.B. Wilk // Biometrika. 1965. - V. 52, № 3-4. - P. 591-611.

180. Shomer U. Production of steroid-ring-B-seco acid from 3-sitosterol and influence of surfactants on sterol uptake in Nocardia sp. M 29-40 / U. Shomer, F. Wagner//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1980. -V. 10, № 1-2. - P. 99-106.

181. Sih C.J. Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms. XIV. Pathway of cholesterol side chain oxidation / C.J. Sih, H.H. Tai, Y.Y. Tsong et al. II Biochemistry. 1968. - V. 7. - P. 796-807.

182. Sih C.J. Process for preparing steroids / C.J. Sih. // US patent. 1988. -№ 4755463.

183. Sih C.J. The mechanism of microbial conversion of cholesterol into 17-ketosteroids / C.J. Sih, H.H. Tai, Y.Y. Tsong // J. Am. Chem. Soc. 1967. -V. 89.-P. 1957-1958.

184. Slijkhuis H. 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacterium species CBS 482.86 / H. Slijkhuis, A.F. Marx // US patent. 1994. - № 5298398.

185. Slijkhuis H. Microbial preparation of 9a-hydroxy-17-keto steroids / H. Slijkhuis, A.F. Marx // USA patent. 1992. - № 566055.

186. Smith K.E. Microbial transformation of steroids. 8. Transformation of progesterone by whole cells and microsomes of Aspergillus fumigatus / K.E. Smith, F. Ahmed, R. Williams, S.L. Kelly 11 J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1994. - V. 49, № l.-P. 93-100.

187. Smith M. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween-80 medium / M. Smith, J. Zahnley, D. Pfeifer, D. Goff // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59, № 5. p. 1425-1429.

188. Smolders A.J.J. Steroid bioconversion in microemulsion system / A.J.J. Smolders, H.M. Pinheiro, P. Noronha, J.M.S. Cabral // Biotechnol. Bioeng. 1991.-V. 38, № 10.-P. 1210-1217.

189. Sojo M. Cell-linked and extracellular cholesterol oxidase activities from Rhodococcus erythropolis. Isolation and physiological characterization / M. Sojo, R. Bru, D. Lopes-Molina et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. -P. 583-589.

190. Spassov G. Bioconversion of sitosterol to androstene-dione by mutants of Mycobacterium vaccae / G. Spassov, V. Pramatorova, R. Vlahov, G. Reinhold // Dokl. Bulg. Acad. Nauk. 1993. - V. 46. - P. 123-126.

191. Staebler A. Optimization of androstendione production in an organic-aqueous two-liquid phase system / A. Staebler, A. Cruz, W. Goot van der et al. II J. Mol. Catal. B: Enzym. 2004. - V. 29. - P. 19-23.

192. Streber S. Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent disease. US patent. 1993. № 5264428.

193. Szczebara F.M. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast / F.M. Szczebara, C. Chandelier, C. Villeret et al. II Nat. Biotechnol. 2003. - V. 21. - P. 143-148.

194. Taketani S. Characterization of sterol-ester synthetase in Saccharomyces cerevisiae / S. Taketani, T. Nishino, H. Katsuki // Biochim. Biophys. Acta. -1979.-V. 575,№ l.-P. 148-155.

195. Tenneson M.E. The degradation of cholic acid by Pseudomonas sp. N.C.I.B. 10590 / M.E. Tenneson, J.D. Baty, R.F. Bilton, A.N. Mason // Biochem. J. 1979. - V. 184. - P. 613-618.

196. Tomioka H. Some enzymatic properties of Зр-hydroxysteroid oxidase produced by Streptomyces violascens / H. Tomioka, M. Kagava, S. Nakamura // J. Biochem. 1976. - V. 79, № 5. - P. 903-915.

197. Tomioka N. Isolation and characterization of a cesium-accumulation bacteria / N. Tomioka, H. Uchiuama H., O. Yagi. 1992. - V. 47, № 58. -P. 1019-1023.

198. Toyama M. Alteration of substrate specificity of cholesterol oxidase from Streptomyces sp. by site-directed mutagenesis / M. Toyama, M. Yamashita, M. Yoneda et al. II Protein Eng. 2002. - V. 15, № 6. - P. 477-484.

199. Van der Geize R. Engineering of steroid biotransformation in Rhodococcus: Philosophy Doctorate Thesis / R. Van der Geize Groningen, 2002. - 120 p.

200. Van der Geize R. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications / R. Van der Geize, L. Dijkhuizen // Curr. Opin. Microbiol 2004 - V. 7, № 3 - P. 255-261.

201. Van der Geize R. Molecular and functional characterization of the kstD2 gene of Rhodococcus erythropolis SQ1 encoding a 3-ketosteroid A'-dehydrogenase isoenzyme / R. Van der Geize // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 3285-3292.

202. Van der Geize R. Targeted disruption of the kstD gene encoding a 3-ketosteroid A'-dehydrogenase isoenzyme of Rhodococcus erythropolis strain SQ1 / R. Van der Geize // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 20292036.

203. Van der Werf M.J. Metabolism of carveol and dihydrocarveol in Rhodococcus erythropolis DCL14 / M.J. Van der Werf, A.M. Boot // Microbiology. -2000. V. 146.-P. 1129-1141.

204. Varma R. Biosynthesis of cholesterol oxidase by Streptomyces lavendule NCIM 2421 / R. Varma, S. Nene // Enzyme Microbial. Technol. 2003. - V. 33. -P. 286-291.

205. Venkatramesh M. Expression of Streptomyces 3-hydroxysteroid oxidase gene in oilseed for converting phytosterols to phytostanols / M. Venkatramesh, B. Karunandaa, B. Sun et al II Phytochemistry 2003. - V. 62. - P. 39-46.

206. Vidal M. Selection of Mycobacterium sp. strains with capacity to biotransform high concentrations of |3-sitosterol / M. Vidal, J. Becerra, M.A. Mondaca, M. Silva //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2001. V. 57. - P. 385-389.

207. Wadhwa L. Progesterone side-chain cleavage by Bacillus sphaericus / L. Wadhwa, E.S. Kelvin // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 192. - P. 179183.

208. Wang Z. Biotransformation of phytosterol to produce androstadienedione by resting cells of Mycobacterium in cloud point system / Z. Wang, F. Zhao, D. Chen, D. Li // Process Biochem. 2006. - V. 41. - P. 557-561.

209. Wang Z.F. Lecithin-enhanced biotransformation of cholesterol to androsta-l,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione / Z.F. Wang, Y.L. Huang, J.F. Rathman, S.T. Yang // J. Chem. Technol. Biotecnol. 2002. - V. 77, № 12. -P. 1349-1357.

210. Warhurst A.M. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus / A.M. Warhurst, A.C. Fewson // Crit. Rev. Biotechnol. 1994. - V. 14, № 1. -P. 29-73.

211. Watanabe К. Degradations of 4-cholesten-3-one and 1,4-androstadiene-3,17-dione by cholesterol-degrading bacteria / K. Watanabe, H. Aihara, N. Tachi, R. Nakamura // J. Appl. Bacteriol. 1987. - V. 62, № 2. - P. 151-155.

212. Watanabe K. Isolation and identification of cholesterol degrading Rhodococcus strains from food and animal origin and their cholesterol oxidase activities / K. Watanabe, H. Shimisu, H. Aichara et al II Appl. Microbiol. -1986.-V. 32.-P. 137-147.

213. Weber A. Process for production of 4-androsten-3,17-dione, l,4-androstadiene-3,17-dione from ergosterol with Mycobacterium / A. Weber, M. Kennecke // US patent. 1996. - № 5516649.

214. Wilmanska D. Identification of cholesterol oxidase from fast-growing Mycobacterial strains and Rchodococcus sp. / D. Wilmanska, J. Dziadek, A. Sajduda et al II J. Ferment. Bioeng. 1995. - V. 79. - P. 119-124.

215. Wovcha M.G. Composition of matter and process. / M.G. Wovcha, K.E. Brooks // US patent. 1981. - № 4293646.

216. Wozny M.E.E. Transformation of 25-hydroxycholesterol by Rhizoctonia muneratii / M.E.E. Wozny, T.R. Smith, R.L. Angus, E.T. Kaiser // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 43, № 3. - P. 572-577.

217. Yazdi M.T. Biotransformation of AD and ADD using Nostoc muscorum / M.T. Yazdi, M.A. Faramarsi, H. Ghostinroudi et al II Iran. J. Pharm. Res. -2004.-V. 2.-P. 84-85.

218. Yazdi M.T. Cholesterol-degrading bacteria: isolation, characterization and bioconversion / M.T. Yazdi, F. Malekzadeh, H. Khatami, N. Kamranpour // World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 16. - P. 103-105.

219. Yazdi M.T. Production of cholesterol oxidase by a newly isolated Rhodococcus sp. / M.T. Yazdi, F. Malekzadeh, G. Zarrini et al II World J. Microbiol. Biotechnol.-2001.-V. 17.-P. 731-737.

220. Yoshimoto T. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants / T. Yoshimoto, F. Nagai, J. Fujmoto et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2004. -V. 79,№9.-P. 5283-5289.

221. Zaffaroni P. Method for the microbiological conversion of steroids / P. Zaffaroni, A.M. Gamalerio // US patent. 1981. - № 4273872.

222. Zhang X. Gram-scale chromatographic purification of b-sitosterol. Synthesis and characterization of b-sitosterol oxides / X. Zhang, P. Geoffrey, M. Miesch et al II Steroids. 2005. - V. 70. - P. 886-895.

Информация о работе

Ноговицина, Екатерина Михайловна
кандидата биологических наук
Пермь, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы