Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансформация стероидных соединений актинобактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Донова, Марина Викторовна
1 ВВЕДЕНИЕ.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями.
2.1.1 Гидроксилирование.
2.1.2 Дегидрирование.
2.1.3 Гидрирование.
2.1.4 Эпоксидирование.
2.1.5 Окисление спиртов'в кетоны или альдегиды.
2.1.6 Гидролиз стероидных эфиров.
2.1.7 Окисление кетонов в эфиры и лактоны (реакция Байера-Виллигера).
2.1.8 Восстановление карбонильных соединений.
2.1.9 Деградация.
2.2 Трансформация стеринов.
2.2.1 Стерины и источники их получения.
2.2.2 Микробиологическая трансформация стеринов.
2.2.2.1 Деградация боковой цепи.
2.2.2.2 Окисление стероидного ядра.
2.2.2.3 Методы предотвращения деструкции стероидного ядра.
2.3 Ферменты модификации стероидного ядра у 53 актинобактерий.
2.3.1 Холестеролоксидаза.
2.3.2 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа (3-КСД) и получение штаммов с 55 блокированной активностью 3-КСД.
2.3.2.1 Индуцибельность 3-КСД.-.
2.3.2.2 Свойства 3-КСД.
2.3.2.3 Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ.
2.3.2.4 Субстратная специфичность 3-КСД.
2.3.2.5 Локализация 3-КСД.
2.3.2.6 Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки.
2.3.3 Свойства 9а-гидроксилазы.
2.3.4 Свойства 17-гидроксистероидцегидрогеназ (17-ОН-СДГ).
2.3.4.1 Физиологическая роль 17-ОН-СДГ.;.
2.3.4.2 Субстратная специфичность 17-ОН-СДГ.
2.3.4.3 Индукция бактериальных 17-ОН-СДГ.
2.3.4.4 Локализация 17-ОН-СДГ у микроорганизмов.
2.3.4 Дезацетилирование и свойства стероидных эстераз.
2.4 Взаимодействие клеток актинобактерий с гидрофобными 70 стероидными субстратами.
2.4.1 Строение клеточной стенки микобактерий и ее 71 проницаемость.
2.4.2 Взаимодействие актинобактерий со стеринами.
2.4.3 Модификация структуры КС и трансформация стеринов.
2.5 Трансформация стероидных соединений в присутствии 76 циклодекстринов (ЦД).
2.5.1 ЦД и их применение.
2.5.2 Производные ЦД.
2.5.3 Константа стабильности комплексов ЦД с органическими 81 соединениями.
2.5.4 Применение ЦД в биотехнологии.
2.5.5 Применение ЦД в биотрансформации стероидов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы.87,
3.1.1 Перечень материалов, использованных в работе.
3.1.2 СКАМ и получение препаратов на его основе.88i
3.2 Микроорганизмы и их культивирование.
3.2.1 Культивирование актинобактерий.
3.3 Определение чувствительности микобактерий к антибактериальным ' ' агентам.91.
3.4 Селекция и мутагенез микобактерий.
3.4.1 Индукция мутаций.
3.4.2 Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9-ОН-АД.
3.5 Трансформация стероидных соединений.
3.5.1 Трансформация стеринов и ДГЭА в колбах.
3.5.2 Трансформация СКАМа и его препаратов.
3.5.3 Трансформация стероидов андростанового и прегнанового ряда.
3.6 Очистка стероидтрансформирующих ферментов микобактерий.
3.6.1 Очистка Зр-гидроксистероидоксидазы.
3.6.2 Очистка 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД).
3.6.3 Очистка 17-гидроксистероиддегидрогеназ (17-ОН-СДГ).
3.7 Характеристики ферментов.
3.8 Определение локализации 17-ОН-СДГ.
3.8.1 Получение сферопластов Mycobacterium sp. Etl.
3.8.2 Определение локализации 17-ОН-СДГ фракционированием клеток.
3.8.3 Определение локализации 17-ОН-СДГ цитохимической реакцией.
3.9 Фракционирование клеток Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д.
3.10 Изучение влияния модифицированных циклодекстринов (МЦД) на Mycobacterium spp.
3.10.1 Влияние МЦД на рост и агрегацию микобактерий.
3.10.2 Определение миколовых кислот.
3.10.3 Определение свободных липидов.
3.10.4 Определение состава жирных кислот.
3.10.5 Определение углеводного состава полисахаридов клеточных стенок.
3.11 Электронная микроскопия.
3.11.1 Просвечивающая электронная микроскопия.
3.11.2 Метод замораживания - скалывания.
3.12 Физико-химические методы.
3.12.1 Построение фазовых диаграмм растворимости стероидов в растворах ЦД.
3.12.2 Определение константы стабильности комплексов ЦД со стероидами.
3.13 Аналитические методы.
3.13.1 Выделение и очистка стероидов.
3.13.2 Анализ стероидов.
4 Результаты и обсуждение.
4.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями.
4.1.1 Идентификация 7-гидроксилированных стероидов.
4.1.2 Сопоставительный анализ 3-КСД активности штаммов рода Nocardioides.
4.1.3 Сопоставительный анализ 17-ОН-СДГ активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus.
4.1.4 Продукты трансформации ситостерина штаммами Mycobacterium spp.
4.1.5 Трансформация различных стеринов микобактериями.
4.1.6 Трансформация стеринсодержащего отхода производства соевого масла.
4.1.6.1 Трансформация скама.
4.1.6.2 Биоконверсия препарата М.
4.1.6.3 Биоконверсия образцов скама, предобработанных химическими способами
4.2 Получение мутантных штаммов Mycobacterium spp.
4.2.1 Определение чувствительности Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д к антибактериальным препаратам.
4.2.2 Получение мутантных штаммов из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д, определение их способности к росту на 3,17-дикетостероидах и деградации боковой цепи Р-ситостерина.
4.2.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантными штаммами.
4.2.4 Мутагенез и селекция штаммов, продуцирующих 9-ОН-АД.
4.2.4.1 Получение мутантного штамма Mycobacterium sp. 2-4М.
4.2.4.2 Трансформация ситостерина мутантным штаммом Mycobacterium sp. 2-4М
4.2.4.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантом Mycobacterium sp. 2-4М.
4.3 Ферменты модификации стероидного ядра стеринтрансформирующих микобактерий: выделение, функции и свойства.
4.3.1 ЗР-гидроксистероидоксидаза (3-СО).
4.3.1.1 Очистка внеклеточной 3-СО.
4.3.1.2 Трансформация стероидов ферментными препаратами 3-СО.
4.3.1.3 17-ОН-СДГ активность препаратов внеклеточных ферментов.
4.3.2 17Р-Гидроксистероиддегидрогеназа.
4.3.2.1 Выделение, очистка и изучение свойств внутриклеточных 17-ОН-СДГ.
4.3.2.2 Свойства внутриклеточных 17-ОН-СДГ.
4.3.3 Локализация 17-ОН-СДГ Mycobacterium sp. Etl.
4.3.3.1 Изучение локализации 17-ОН-СДГ методом фракционирования.
4.3.3.2 Изучение локализации 17-ОН-СДГ цитохимическим методом.
4.3.4 3-Кетостероид-1(2)-дегидрогеназаЛ^со6ас/еп'шя sp. ВКМ Ас-1817Д.
4.3.4.1 1(2)-Дегидрирование 9-ОН-АД и АД.
4.3.4.2 Индукция 3-КСД.
4.3.4.3 Очистка 3-КСД.
4.4 Трансформация стеринов микобактериямн в присутствии МЦД.
4.4.1 Биотрансформация стеринов в присутствии различных МЦД.
4.4.2 Константы стабильности комплексов стероидов с МЦД.
4.4.3 Выяснение связи между основными показателями биотрансформации и физико-химическими характеристиками растворов МЦД. Гипотеза "ЦД емкости среды".
4.4.4 Влияние МЦД на деструкцию 9-ОН-АД Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д
4.4.4.1 Доказательство образования комплекса включения 9-ОН-АД с МЦД.
4.4.4.2 Кинетические характеристики процесса дегидрирования 9-ОН-АД.
4.4.4.3 Изучение доступности комплекса [МЦД - 9-ОН-АД] для 3-КСД.
4.4.5 Влияние МЦД на рост микобактерий, состав и проницаемость их клеточной стенки.
4.4.5.1 Влияние МЦД на рост Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816Д.
4.4.5.2 Влияние МЦД на адгезивные свойства клеток.
4.4.5.3 Влияние модификаций КС на стеринтрансформирующую активность.
4.4.5.4 Взаимодействие клеток с субстратом в присутствии МЦД.
4.4.5.5 Ультраструктура клеток и клеточной стенки.
4.4.5.6 Влияние МЦД на химический состав КС.
4.5 Биоконверсия стероидов прегнанового ряда культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033.
4.5.1 Биоконверсия прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона.
4.5.2 Конверсия 21-ацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона.
4.5.3 Биоконверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона.
4.5.3.1 Изучение возможности неферментативной ацильнрй миграции ацетильной группы.
4.5.3.2 Влияние рН на биоконверсию диацетата.
4.5.3.3 Влияние строения прегна-4,9(11)-диеновых стероидов на их конвертируемость.
4.5.3.2 Биоконверсия 17а,21 -диацетата прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21диола в оптимальных условиях.
4.5.4 Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона.
4.5.4.1 Влияние индукции.
4.5.4.2 Влияние биомассы.
4.5.4.3 Локализация стероид-эстераз.
4.5.4.4 Селективная биоконверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона в 21-ацетокси-прегна-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-дион.
4.6 Биотехнологические методы получения стероидов андростанового и прегнанового ряда.
4.6.1 Разработка биотехнологического способа получения тестостерона из ситостерина.
4.6.2 Биотехнологии получения АД, АДД, 9-ОН-АД.
4.6.3 Биотехнологические методы получения 1 (2)-дегидроаналогов стероидов прегнанового и андростанового ряда.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансформация стероидных соединений актинобактериями"
Актуальность проблемы.
Стероиды, органические соединения, содержащие циклопентанпергидрофенантреновое ядро, составляют обширный класс, включающий крайне важные физиологически активные вещества: гормоны, желчные кислоты, сердечные гликозиды, стерины и др., играющие важную роль в качестве регуляторов жизненных процессов.
Стероиды занимают важное место среди лекарственных препаратов, применяемых для лечения и профилактики различных групп заболеваний в различных областях медицины: эндокринологии, онкологии, ревматологии, офтальмологии, дерматологии, гематологии, реаниматологии, гинекологии и др. При этом ряд препаратов, применяемых, в том числе, по жизненно-важным показаниям, не имеет нестероидных аналогов.
Промышленный синтез многих стероидных субстанций стал возможен лишь после разработки микробных методов их получения. Современное развитие фармацевтической индустрии стероидных производств нацелено на широкое внедрение биотехнологических процессов и замену ими многостадийных химических синтезов (Fernandes et ah, 2003).
Актинобактерии представляют собой обширный класс грамположительных бактерий, включающий 5 подклассов, 6 порядков и 10 подпорядков, объединяющих по крайней мере 35 семейств (Slackebrandt et ai, 1997). Они широко используются в качестве продуцентов биологически активных соединений, способны к ассимиляции гидрофобных субстратов и обладают высокоактивными ферментными системами, катализирующими трансформации различных органических соединений, в том числе стероидных. Однако, имеющиеся литературные данные ограничены сведениями о биокаталитических возможностях представителей лишь нескольких таксонов актннобактерий. Актуальными задачами остаются системный анализ стероидтрансформирующей активности штаммов различного таксономического положения, целенаправленный поиск и получение на основе генетической модификации высокоэффективных биокатализаторов, селективно проводящих известные или новые реакции трансформации стероидов.
Важной проблемой является изучение биоконвертируемости синтетических, не существующих в природе, стероидных аналогов. Структурная модификация путем введения галогенов, ацетильных, метальных заместителей, дополнительных двойных связей и др. может существенным образом влиять на возможности и особенности микробной конверсии стероидов. Эта проблема, в частности, касается трансформации актинобактериями 9(11)-ненасыщенных, фтор- и метилзамещенных прегнанов и их ацетилированных производных - ключевых интермедиатов синтеза многих современных лекарственных препаратов.
До недавнего времени основной акцент в исследованиях биоконверсии стероидов был значительно смещен в биотехнологическую область, при этом изучению биохимических основ процессов уделялось незаслуженно мало внимания. Между тем, изучение свойств и локализации ферментов, катализирующих ключевые реакции трансформации стероидов у актинобактерий - модификацию стероидного ядра, окисление Зр-гидроксигруппы, 17Р-восстановление, дезацетилирование, является весьма актуальным.
Биоконверсии стероидных соединений актинобактериями осложнены крайне низкой растворимостью субстратов и продуктов, а также особенностями строения клеточной стенки, обусловливающими не только высокую адгезивность клеток, но и транспортные барьеры для поступления липофильных и гидрофильных соединений. Одним из наиболее эффективных методов повышения эффективности биоконверсий в настоящее время признано использование циклодекстринов, - циклических олигосахаридов, образующих растворимые комплексы включения с гидрофобными соединениями. Однако их влияние на клетки актинобактерий и катализируемые ими процессы не было изучено.
Состояние вопроса.
Отличительными особенностями актинобактерий является высокое (>50%) содержание Г+Ц-пар в ДНК, сложное строение клеточной стенки, и ряд других филогенетических и хемотаксономических признаков (Stackebrandt et а!., 1997; Labeda, Kroppenstedt, 2000). Известна способность ряда актинобактерий к деградации боковой цепи стеринов и прегнанов, окислению стероидных спиртов, деэтерификации, введению, изомеризации и восстановлению двойных связей, восстановлению кетогрупп, гидроксилированию и др. При этом, в отличие от других микроорганизмов, актинобактерии способны проводить многие реакции регио- и стереоспецифично. Однако исследования проводились с использованием относительно узкого круга актинобактерий, в основном, представителей семейств Mycobacteriaceae, Nocardiaceae и Streptomycetaceae, а также единичных штаммов других таксонов. Данные о биокаталитических возможностях других актинобактерий в отношении стероидных соединений практически отсутствовали.
Поиск новых микробных биокатализаторов для гидроксилирования известных и вновь синтезированных стероидных соединений продолжается постоянно в связи с высокой физиологической активностью гидроксипроизводных стероидов. Традиционно, ключевая роль при проведении подобных работ отводится мицелиальным грибам. Однако в последние годы такой поиск не привел к идентификации новых систем с необычной регио- или стереоспецифической активностью.
Исследования гидроксилирующей активности касались, в основном, 3-кетостероидов прегнанового и андростанового ряда, и в меньшей степени, желчных кислот и эстранов. Актинобактерии (представители родов Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces) наиболее эффективно гидроксилировали 3-кетостероиды в. положениях 9а и 16а (Борман с соавт., 1992; Турута с соавт., 1992; Mutafov et al, 1997; Berrie et al, 1999 и др.). Имеются единичные сообщения об осуществлении актинобактериями гидроксилирования стероидов в положениях lip, 12(а/р), 14а, 15(а/Р), 17, 19 (Charney, Herzog, 1967; Климашина с соавт., 1988; Войшвилло с соавт., 2004).
Способность актинобактерий гидроксилировать дегидроэпиандростерон (ДГЭА) и другие ЗР-спирты не была изучена. Между тем, недавние открытия в области фармации показали важную роль таких стероидов и, в особенности, их гидроксипроизводных, в формировании иммунного и эндокринного ответа организма на стрессовые воздействия, при лечении расстройств памяти и сна, в качестве антиконвульсантов и нейропротекторов (Loria, 1997, Hampl et al., 2000, Pelissier et al, 2004).
Запатентованы отдельные штаммы родов Amycolata, Sphingomonas и Streptomyces, способные к введению гидроксильной группы в положение 25 стеринов (Takeda et al, 1997). Однако в целом, биокаталитический потенциал актинобактерий в отношении гидроксилирования стероидов изучен.
После обнаружения в 50х годах прошлого века возможности деградации боковой цепи стеринов микроорганизмами, биотехнологические методы стали основой промышленного получения 3,17-дикетоандростанов (андростендиона - АД, андростадиендиона - АДД, 9а-оксиандростендиона - 9-ОН-АД), из которых далее химическим, биотехнологическим или комбинированным путем синтезируют фармацевтические субстанции разных классов (Kieslich, 1985; Mahato, Garai, 1997 и др.). Способность к осуществлению селективной деградации боковой цепи стеринов описана, в основном, для представителей субпорядка Corynebacterineae, при этом максимальная активность отмечена для быстрорастущих микобактерий.
Процесс микробной деградации боковой цепи стеринов представляет собой последовательность 14 реакций, катализируемых, по крайней мере, 9 катаболическими ферментами (Szentirmai, 1990). Необходимым условием получения 3,1710 дикетоандростанов является ингибирование или полное блокирование активности ключевых ферментов, ответственных за деструкцию стероидного ядра - 3-кетостероид-1 (2)-дегидрогеназы (3-КСД) и 9а-гидроксилазы. Блокирование активности одного из этих ферментов приводит к получению 9-ОН-АД или АДД, при отсутствии активности обоих ферментов основным продуктом трансформации является АД.
Методы предотвращения микробной деструкции стероидного ядра принято классифицировать следующим образом:
- химическая модификация субстрата путем введения в 3-е положение защитной группировки;
- ингибирование активности ключевых ферментов, ответственных за раскрытие стероидного ядра, химическими агентами;
- получение мутантов с блокированными 3-КСД и(ли) 9а-гидроксилазой.
Разработаны эффективные способы микробной деградации боковой цепи стеринов, и благодаря этому в настоящее время свыше 60% АД и АДД производится в мире биотехнологическим способом, постепенно замещая сложный химический синтез (Ahmad et al., 1992). Перспективным представляется недавно сформированное направление исследований, связанное с получением 3,17-дикетоандростанов из промышленных стеринсодержащих отходов целлюлозно-бумажных, маслобойных и сахарных производств без выделения индивидуальных стеринов (Szykula et al., 1991, Dias et al., 2002, Perez et al., 2005).
В целом, высокая потребность Фарминдустрии в первичных стероидах, прежде всего - АД и АДД, обусловила значительный сдвиг исследований в прикладную сферу. Между тем, многие фундаментальные проблемы микробной деградации боковой цепи стеринов остаются нерешенными. В частности, мало изучены биохимические основы этого полиферментного процесса, его связь с основным клеточным метаболизмом, физико-химические аспекты трансформации стеринов, являющихся крайне гидрофобными соединениями.
Восстановление 17-кетогруппы андростанов является одной из ключевых и наиболее распространенных реакций стероидного метаболизма. Она сопровождает различные процессы стероидных трансформаций микроорганизмами и играет большую роль в регуляции пула восстановительных эквивалентов и детоксикации экзогенных стероидов.
Этот процесс известен с 40-х годов двадцатого века и интенсивно исследовался преимущественно у Comamonas testosteroni и ряда мицелиальных грибов. 17ргидроксистероидцегидрогеназная (17-ОН-СДГ) активность была описана также для представителей Streptomyces и нокардиоформных актинобактерий.
Наличие 17р-редуктазной активности у штаммов актинобактерий, селективно деградирующих боковую цепь стеринов, открывает перспективы одностадийного получения тестостерона и его производных из стеринов без промежуточного выделения АД. Этот подход является альтернативой использующемуся в настоящее время 4-хстадийному химическому синтезу тестостерона из АД. Показана принципиальная возможность получения тестостерона из стеринов с помощью микобактерий, однако, биохимические основы процесса не были изучены.
Микробиологическое 1-дегидрирование, - введение двойной связи между С-1 и С-2 в кольце А стероидов, - является одним из наиболее известных процессов биоконверсии стероидов. Изучены особенности процесса 1-дегидрирования гидрокортизона, его 6а-метилированного производного, разработаны эффективные методы получения преднизолона и других 1-дегидроаналогов (Аринбасарова с соавт., 1984; 1995). Исследованы свойства 3-КСД у Nocardia corallina, Arthrobacter simplex, Mycobacterium fortuitum (Itagaki et al., 1990; Molnar et al., 1995; Wovcha et al., 1979). Показано существование нескольких изоформ фермента различной локализации у стеринтрансформирующего штамма Rhodococcus erythropolis (van der Geize et al2002). На процессе биоконверсии гидрокортизона исследована взаимосвязь 1-дегидрирования и 20р-восстановления у Arthrobacter globiformis (Medentsev et al., 1985).
Однако, литературные данные о 1-дегидрировании синтетических стероидов, в частности, 9(11)-ненасыщенных прегнанов ограничены. Сообщалось о том, что процесс биоконверсии может сопровождаться нежелательной ароматизацией кольца А, либо деструкцией стероидного ядра (Wolf, Kominek, 1984). Данные о возможности биоконверсии ацетатных форм Д4,9(11^-3-кетостероидов в доступной литературе отсутствовали.
Физико-химические аспекты биотрансфоумации стероидных соединений. Биоконверсии стероидных соединений в значительной степени осложнены их гидрофобностью. Растворимость стеринов в воде не превышает 2 мг/л (Haberland, Reynolds, 1973), растворимость ряда андростанов и прегнанов находится в пределах 20-50 мг/л (US Pharmacopoeia, 2003). Предложено большое число методов, направленных на повышение эффективности биоконверсии гидрофобных стероидных субстратов:
1) получение химическим путем растворимых производных субстратов (Ambrus et al., 1980; Bohme, Horhold, 1980 и др.);
2) микронизация субстрата до размеров частиц, сопоставимых с размером бактериальных клеток (Atrat et al., 1992; Kutney et al, 1999);
3) добавление субстрата в виде раствора в органическом растворителе (Sonomoto et al., 1983; Wang et al., 1995; Weber et al, 1996; Lee etal., 1993 и др.);
4) использование детергентов (Perez et al., 1995; Slijkhuis, Marx, 1994; Smith et al., 1993; Kutney et al., 1999; Wang et al., 2004 и др.);
5) использование двухфазных систем с органическими растворителями, несмешивающимися с водой, или с высокомолекулярными полимерами (Cruz et al., 2001, Cruz et al., 2004; Dias et al., 1994; Flygare, Larsson, 1989 и др.);
6) использование солюбилизирующих агентов на основе высокомолекулярных полимеров, а также нативных циклодекстринов (а, Р, у) (Hesselink et al., 1989);
7) применение липосомальных сред (Goetshel, Bar, 1992).
Однако большинство предложенных методов не обеспечивает необходимой продуктивности процесса и имеет лишь ограниченное применение.
Многие проблемы биоконверсии стероидных соединений актинобактериями связаны с особенностями строения их клеточной стенки, с ее низкой проницаемостью для органических субстратов. С целью повышения эффективности биотрансформации стероидов за счет изменения проницаемости клеточной стенки использовали ванкомицин, глицин, лецитин, поликатионы - протамин, полимиксин В, нонапептид или полиэтиленимин (Lisowska et al., 1996, Sedlazcek et al., 1999, Rumijowska et al., 1997, Korycka-Machala et al, 2001).
В целом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что, несмотря на большое число работ, посвященных трансформации стероидных соединений актинобактериями, многие вопросы, имеющие ключевое значение для решения проблемы регуляции селективности процессов и повышения их эффективности, остаются недостаточно изученными. В частности, практически не исследованы свойства ферментов, участвующих в процессе трансформации стеринов до С^-стероидов и особенности регуляции их активности, мало изучена физиология стероидтрансформирующих актинобактерий, вопросы транспорта гидрофобных субстратов через клеточную оболочку, а также физико-химические закономерности процессов. Сложившийся в литературе значительный крен исследований в феноменологическую область был обусловлен недостаточностью арсенала применяемых методов и сложностью исследуемых объектов. Лишь в последнее время появились единичные работы, частично восполняющие пробелы в изучении фундаментальных основ биохимических и физико-химических процессов при биоконверсии стероидов актинобактериями.
Цель и задачи работы.
ЦЕЛЬЮ настоящей работы являлась оценка биокаталитического потенциала актинобактерий в отношении ключевых реакций трансформации стероидных соединений, изучение биохимических основ процессов и разработка биотехнологических методов получения стероидов андростанового и прегнанового ряда. Задачи исследования: оценить стероидтрансформирующую активность актинобактерий различного таксономического положения и создать коллекцию штаммов - биокатализаторов ключевых процессов конверсии стероидов;
- исследовать процессы трансформации стеринов до С^-стероидов микобактериями и получить мутантные штаммы с высокой 17р-гидроксистероиддегидрогеназной и 9а-гидроксилазной активностями;
- выделить, изучить локализацию и свойства ключевых ферментов модификации стероидного ядра у стеринтрансформирующих микобактерий;
- изучить возможности и закономерности биоконверсии ацетилированных 3-кето-9(11)-ненасыщенных прегнанов культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д; в рамках решения задачи - исследовать свойства и локализацию стероидных эстераз;
- исследовать влияние циклодекстринов на физиолого-биохимические характеристики актинобактерий и выяснить механизм стимуляции биопроцессов в циклодекстриновых средах;
- разработать биотехнологические методы и технологии получения ключевых стероидных интермедиатов и субстанций.
Научная новизна работы.
Исследован биокаталитический потенциал более 140 штаммов актинобактерий, относящихся к 7 подпорядкам, 14 семействам, 33 родам и 93 видам, в отношении ключевых реакций биоконверсии стероидных соединений. Впервые обнаружена способность представителей 9 родов актинобактерий к осуществлению региоспецифического гидроксилирования ЗР-спиртов в положениях 7а и 7р. Выявлены новые штаммы актинобактерий с 9а-, lip- и 14а-гидроксилазной активностями в отношении 3-кетостероидов, а также способные к введению гидроксильной группы в боковую цепь стеринов. Полученные результаты значительно пополнили сведения о разнообразии гидроксилазных систем актинобактерий.
Впервые показана возможность микробиологического 1-дегидрирования 3-кетостероидов прегнанового ряда, ненасыщенных по кольцам С и Д, и их ацетилированных производных. Изучены особенности конверсии прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21-диола, его 21-моноацетата и 17,21-диацетата культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что 1-дегидрирование сопровождается дезацетилированием в положении 21 и 20р-восстановлением. Впервые установлена неферментативная миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической конверсии 17а,21-диацетата Д4'9(11)-3-кетостероида. Изучен процесс биоконверсии 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона N. simplex. Показано, что в отличие от 3-КСД, стероид-эстеразы являются конститутивными ферментами. Установлена их цитозольная и мембраносвязанная локализация.
Выявлена корреляция таксономического положения актинобактерий и наличием у них Зр-гидроксистероидоксидазной (3-СО) активности. Впервые обнаружена, выделена и охарактеризована внеклеточная 3-СО микобактерий. Показано, что наряду с окислением Зр-гидроксигруппы и изомеризацией двойной связи из положения 5 в положение 4 фермент осуществляет гидроксилирование в положении 6. Полученные экспериментальные данные и научные предпосылки указывают на ключевую роль фермента во взаимодействии клетки с гидрофобным стероидным субстратом и его транспорте через клеточную оболочку. Установлено наличие у стеринтрансформирующих микобактерий также внеклеточных 17р-гидроксистероиддегидрогеназной (17-ОН-СДГ), 3-кетостероид-1-дегидрогеназной (3-КСД) и 1-ен-редуктазной активностей.
Изучены полиферментные процессы окисления стеринов штаммами микобактерий, у которых блокированы один или оба ключевых фермента, ответственные за деградацию стероидного ядра - З-кетостероид-1-дегидрогеназа и (или) 9а-гидроксилаза. При исследовании трансформации ситостерина штаммом с блокированной 3-КСД активностью показано, что гидроксилированию в положении 9а- подвергаются преимущественно интермедиаты с частично окисленной боковой цепью при С-17. Полученные данные меняют имеющиеся представления о биохимическом механизме окисления стеринов штаммами, продуцирующими 9-ОН-АД. Изучена З-кетостероид-1-дегидрогеназа, запускающая механизм деструкции стероидного ядра у Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д. Показано, что фермент локализован преимущественно в цитоплазме, активен как в отношении АД, так и в отношении 9-ОН-АД, индуцируется АД, в то время, как ни 9-ОН-АД, ни 9-гидроксилированные стероиды с частично окисленной боковой цепью не являются индукторами 3-КСД.
Впервые выделены и охарактеризованы две формы внутриклеточных 17р-ОН-СДГ стеринтрансформирующих микобактерий; с использованием оригинального цитохимического метода установлена локализация фермента в периферических областях цитоплазмы. Установлена взаимосвязь процессов 17р~восстановления и 1-ен-гидрирования 3,17-дикетоандростанов.
Установлен эффект стимуляции процессов биоконверсии стероидов химически модифицированными циклодекстринами (МЦД). Экспериментально подтверждено образование комплексов включения стероида с МЦД. На модельной реакции 1-дегидрирования 9-ОН-АД впервые показано, что комплексная форма стероида не доступна ферментативной атаке. Впервые установлено, что наряду с солюбилизацией стероидов за счет образования растворимых комплексов включения механизм действия циклодекстринов включает модификацию клеточной оболочки актинобактерий и изменение ее проницаемости для гидрофильных и гидрофобных субстратов. Структурные изменения клеточной стенки под действием МЦД затрагивают, в основном, липидный бислой и ассоциированные с ним белки, при сохранении целостности миколиларабиногалактанового каркаса. Следствием структурных изменений клеточной поверхности является стимуляция роста, изменение адгезивности актинобактерий и их стероидтрансформирующей активности.
Практическое значение работы.
Создана коллекция стероидтрансформирующих штаммов актинобактерий, осуществляющих ключевые процессы биоконверсии стероидных соединений: деградацию боковой цепи стеринов, модификацию Зр-ол-5-ен- в З-кето-4-ен-структуру, окисление-восстановление кислородной функции при С-17, введение и восстановление двойной связи в положении 1, гидроксилирование Зр-спиртов в положениях 7а и 7р, и З-кето-4-ен-стероидов в положениях 9а, lip, 14а, а также деэтерификацию стероидных эфиров. Получены мутантный штамм из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д, отличающийся высокой 17-ОН-СДГ активностью, а также штамм с 9а-гидроксилазной активностью, отличающийся отсутствием 3-КСД, специфичной к 9-ОН-АД. Оба мутанта сохраняли способность к эффективной деградации боковой цепи ситостерина. Штаммы могут быть использованы для получения фармацевтических субстанций.
Результаты, полученные в работе, использованы в качестве фундаментальной основы для разработки биотехнологий и биотехнологических методов получения фармацевтических субстанций и ключевых интермедиатов органического синтеза современных лекарственных препаратов.
Разработаны и масштабированы до опытно-промышленного уровня биотехнологии получения АД, АДД, 9-ОН-АД - ключевых полупродуктов синтеза фармацевтических стероидов. По своим основным параметрам технологии конкурентоспособны с известными мировыми аналогами. Способы получения АД, АДД и 9-ОН-АД запатентованы.
Предложены эффективные методы предобработки стеринсодержащего сырьевого материала - отхода производства соевого масла, и показана эффективность их использования в биотехнологических процессах получения 3,17-дикетостероидов без применения трудоемкой и дорогостоящей процедуры получения высокоочищенных стеринов.
Предложен эффективный одностадийный биотехнологический метод получения тестостерона из ситостерина. В сравнении с используемым в настоящее время четырехстадийным химическим синтезом из АД, новый метод является более селективным и экологичным. По своим выходным параметрам метод превосходит известные аналоги.
Разработан и защищен Патентом РФ высокоэффективный способ получения 1-дегидропроизводных 3-кетостероидов. Применение способа обеспечивает 20-кратное повышение выхода преднизолона и других дегидропроизводных в сравнении с лучшими известными аналогами. Предложены эффективные способы получения метандростенолона из метилтестостерона, и болденона из АД, обеспечивающие полную конверсию субстрата.
Предложены эффективные биотехнологические методы получения 17- и 21-ацетата прегна-1,4,9(11 )-триен-17а,21 -диол-3,20-диона, 21 -ацетоксипрегна-1,4,9( 11), 16( 17)тетраен-3,20-диона. Применение разработанных методов позволит заменить ряд низкоэффективных химических стадий в синтезе фторированных кортикостероидов.
Апробация результатов и публикации. Материалы диссертации докладывались на конференции Biotrans-1995, Уорик, 1995, Великобритания; 8th Intern. Cyclodextrin Symp., 1996, Будапешт, Венгрия; BIOTRANS'97 Conference, Монпелье, Франция; 9th Intern. Symp. on Cyclodextrin, 1998, Сантьяго де Компостелла, Испания; 11th Intern. Cyclodextrin Symp., 2002, Рейкьявик, Исландия; Intern. Symp. "Modem problems of microbial biochemistry and biotechnology", Пущино, 2000; 5th Intern. Symp. Biocatalysis and Biotransformation (Biotrans-2001), Дармштадт, Германия; 6th Intern. Symp. Biotrans-2003, Оломоуц, Чехия; на конференциях "Биотехнология Подмосковья" 2002 и 2004 г.г., 12th Int. Cyclodextrin Symposium, 2004, Монпелье, Франция; Internat. Congr. Biocatalysis, BioCat-2004, 2004, Гамбург, Германия; на Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества», 2005, Минск-Нарочь, Республика Беларусь; 34th
Workshop Japan/CIS (Токио, 2005), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им.Г.К. Скрябина РАН (1998-2005 г.г.).
Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений, Лаборатории энзиматической деградации органических соединений и Лаборатории микробной энзимологии ИБФМ им.Г.К. Скрябина РАН.
По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из них экспериментальных статей и изобретений - 31, обзоров - 2.
Благодарности. Автор выражает благодарность всем сотрудникам Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ им.Г.К. Скрябина РАН, принимавшим участие в данной работе. Их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях.
Особую признательность выражаю проф. К.А. Кощеенко - инициатору этой работы, к.х.н. Г.С. Гриненко (ЦХЛС ВНИХФИ, Москва) - за предоставление образцов стероидов и ценные консультации, к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН) - за проведение электронной микроскопии, н.с. Б.П. Баскунову (ИБФМ РАН) и к.х.н. О.С. Анисимовой (ЦХЛС ВНИХФИ, Москва) - за масс-спектрометрический анализ стероидных соединений, к.х.н. К.Ф. Турчину (ЦХЛС ВНИХФИ) и к.х.н. Аверину А.Д. (МГУ им.М.В. Ломоносова) - за проведение анализов методом ямр-спектроскопии, к.б.н. В.Н. Ильченко и к.х.н. Н.Ф. Зеленковой (ИБФМ РАН) - за помощь при анализе химического состава клеточных стенок микобактерий, д.б.н. Л.И. Евтушенко (ИБФМ РАН) - за предоставление штаммов и ценные советы, Dr. Е. Nordhoff, S. Kardinal и A. Klein (Schering AG, Германия) - за предоставление стероидных соединений и плодотворное сотрудничество, Dr. К.В. Han (LG Life Sciences, Южная Корея) - за предоставление образца соевого скама и поддержку работы, проф. И.Н. Топчиевой (МГУ им. М.В.Ломоносова), к.х.н. А.Н. Калиниченко (НИОПИК, Москва), Prof. Josef Pitha (National Institute of Health, США) - за предоставление образцов химически модифицированных циклодекстринов и ценные дискуссии.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 281 страницах, содержит 58 таблиц и 81 рисунков. Список литературы включает 341 наименований, из них 294 иностранных работ.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Донова, Марина Викторовна
ВЫВОДЫ:
1. Проведен системный анализ биокаталитической активности широкого ряда актинобактерий в отношении стероидов различной структуры. Установлена корреляция стероидтрансформирующей активности и таксономического положения штаммов. Впервые обнаружена способность представителей 9 родов актинобактерий к регио- и стереоспецифическому введению гидроксильных групп в положения 7а и 70 3(3-гидроксистероидов без структурной перестройки кольца А. Крайне редкая для актинобактерий 1 ip-гидроксилазная активность впервые обнаружена у представителей 6 родов актинобактерий. Выявлены новые штаммы с 9а- и 14а- гидроксилазными активностями, а также способные к введению гидроксильной группы в боковую цепь стеринов при С-17. Создана коллекция стероидтрансформирующих культур актинобактерий.
2. Впервые показана возможность микробиологического 1-дегидрирования синтетических 3-кетостероидов прегнанового ряда, ненасыщенных по кольцам С и Д, и их моно- и диацетилированных производных. Установлена связь 1-дегидрирования, 21-дезацетилирования и 20Р-восстановления и определены факторы целенаправленного регулирования селективности реакций при трансформации ацетилированных Д4,9(1|)-прегна-3,20-дионов культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что в отличие от З-кетостероид-1-дегидрогеназ, стероид-эстеразы являются конститутивными ферментами, представленными цитозоль-растворимыми и мембрано-ассоциированными формами.
3. Изучены полиферментные процессы окисления стеринов штаммами микобактерий, у которых блокированы один или оба ключевых фермента, ответственные за деградацию стероидного ядра. На основе штамма Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д, окисляющего ситостерин до андростендиона, получены мутантные штаммы, отличающиеся высокой 17-гидроксистероиддегидрогеназной и 9а-гидроксилазной активностями при сохранении способности к деградации боковой цепи ситостерина при С-17. Установлено, что при полиферментном окислении стеринов гидроксилированию в положении 9а подвержены преимущественно интермедиаты с частично окисленной боковой цепью при С-17.
4. Впервые изучены свойства и локализация ряда ключевых ферментов модификации стероидного ядра у стеринтрансформирующих микобактерий. Обнаружена и изучена внеклеточная ЗР-гидроксистероидоксидаза, которая наряду с окислением Зр-гидрокси группы и А5 —> А4 изомеризацией катализирует также гидроксилирование в положении 6. Выделены и охарактеризованы две внутриклеточные 17р-гидроксистероиддегидрогеназы, различающиеся по строению, функциям и свойствам. С использованием оригинального цитохимического метода установлена локализация фермента в периферических областях цитоплазмы. Изучены свойства цитозольной 3-кетостероид-1-дегидрогеназы, запускающей механизм деградации стероидного ядра у Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д.
5. Установлен эффект стимуляции процессов биоконверсии стероидов химически модифицированными циклодекстринами. На модельной реакции 1-дегидрирования 9а-гидроксиандростендиона впервые показано, что комплексная форма стероида не доступна ферментативной атаке. Показано, что наряду с солюбилизацией стероидов за счет образования растворимых комплексов включения механизм действия циклодекстринов включает изменение проницаемости клеточной оболочки микобактерий для гидрофильных и гидрофобных субстратов.
6. Впервые показано, что разрушение под действием модифицированного циклодекстрина липидного бислоя, полное или частичное удаление из клеточной оболочки нековалентно связанных липидов и ассоциированных с ними белков при сохранении целостности арабиногалактанового каркаса клеточной стенки способствует интенсификации процессов биоконверсии стероидов и роста микобактерий.
7. Результаты, полученные в работе, реализованы в предложенных биотехнологических методах и биотехнологиях получения ценных стероидных соединений. Разработаны и защищены Патентами РФ биотехнологические методы получения андростендиона, андростадиендиона, 9а-гидроксиандростендиона и 1-дегидроаналогов стероидов. Впервые продемонстрирована возможность биоконверсии стеринсодержащего промышленного отхода без глубокой очистки фитостерина. Предложен оригинальный биотехнологический метод получения тестостерона из ситостерина. Разработанные биотехнологии и биотехнологические методы могут быть использованы при производстве широкого ряда современных лекарственных препаратов.
Заключение
Проведенные исследования существенно расширили преставления о биокаталитических возможностях актинобактерий, разнообразии и совершенстве их ферментных систем, способных атаковать как природные, так и синтетические стероидные соединения. Наличие у большого числа актинобактерий, относящихся к разным таксономическим группам, стероидтрансформирующей активности и ее широкий спектр свидетельствуют о важности реакций конверсии стероидов для микробной физиологии. Процессы трансформации могут играть роль в детоксификации экзогенных стероидов, регуляции пула восстановительных эквивалентов, являться этапом утилизации стероида в качестве источника углерода и энергии. В последнее время появились сведения о наличии у некоторых микроорганизмов гормональной сигнальной системы (steroid hormone signalling system), включающей сигнальную молекулу стероида, мишень -стероидтрансформирующий фермент и стероидсвязывающий белок. Не исключено, что элементы такой примодиальной системы трансдукции, прообраза гормональной сигнальной системы млекопитающих, могут быть выявлены и у актинобактерий.
В результате проведенной работы получены новые сведения о гидроксилирующей активности актинобактерий. Впервые обнаруженная нами способность представителей 9 родов актинобактерий к введению гидроксильных групп в положения 7а- и 70-, боковую цепь стеринов, выявление новых штаммов с 110-, 9а- и 14а- гидроксилазными активностями в сочетании с данными литературы свидетельствует о разнообразии гидроксилазных систем актинобактерий.
Дальнейшие исследования в этой области позволят установить энзимологию процессов, гены, кодирующие данные ферменты, и их корреляцию с эукариотическими системами. Такие исследования важны для изучения гомологии микробных гидроксилаз с гидроксилазными системами высших организмов. С учетом недавних открытий в области медицины, свидетельствующих о важности 7-гидрокси 30-ол-5-ен стероидов в формировании иммунного ответа организма и терапии многих серьезных заболеваний, не исключено, что подобные гидроксилазные системы актинобактерий могут быть применены для разработки микробных моделей стероидного метаболизма у высших организмов (microbial models of mammalian steroid metabolism).
Представители Pseudonocardianeae, Streptomycineae, Streptosporangineae трансформировали 30-ол-5-ен стероиды без структурной модификации кольца А. Напротив, первичная атака коринеформных актинобактерий (подпор. Corynehacterineae) на Зр-гидроксистероиды, в том числе, стерины, как правило, сфокусирована на окислении 3 р-гидроксигруппы.
Механизм утилизации стеринов включает прямой контакт клеток с поверхностью гидрофобного субстрата. Существует предположение о существовании в зоне контакта подвижной мезофазы, функция которой состоит в постепенном растворении стерина, запуске механизма его потребления и транспорта в клетку. Предположительно, мезофаза может состоять из гликолипидов, внеклеточных ферментов, стерина и воды (Atrat et al., 1991). Как показали наши исследования, разрушение липидного бислоя под действием МЦД, полное или частичное удаление из клеточной оболочки нековалентно связанных липидов при сохранении целостности арабиногалактанового каркаса клеточной стенки способствует интенсификации процессов биоконверсии стероидов и роста микобактерий. Вероятно, эти процессы наряду с обусловленной МЦД частичной солюбилизацией стерина приводят к расширению мезофазы.
Научные предпосылки и полученные экспериментальные данные показали, что определенную роль в стимуляции транспорта стероидов может играть 3-СО и другие стероидтрансформирующие ферменты, ассоциированные с поверхностными клеточными структурами микобактерий. Для Rhodococcus sp. было показано наличие каналов, состоящих из стероидсвязывающих или стероидтрансформирующих белков, соединяющих цитоплазму с клеточной поверхностью (Wagner et al., 1992). Возможно, что впервые обнаруженная нами внеклеточная 3-СО играет также роль транспортного белка. Показан многофункциональный характер внеклеточной 3-СО, осуществляющей окисление 3-гидроксигруппы, Д5-*Д4-изомеризацию и 6-гидроксилирование. Установлена тесная взаимосвязь 3-СО, 17Р-ОН-СДГ и 1-ен-редуктазной активностей.
Актинобактерии способны проводить обратимое восстановление карбонильных групп стероидов. Одной из наиболее распространенных и наименее изученных реакций при этом являлось 17Р-восстановление 17-кетоандростанов. Анализ данных литературы показал, что ферменты, выделенные из различных организмов, отличаются по молекулярному весу, строению и функциям. Энзиматические основы процесса 17Р-восстановления, свойства 17Р-ОН-СДГ у микобактерий не были изучены, не исследована взаимосвязь процесса с другими реакциями модификации стероидного ядра, сопровождающими окисление боковой цепи стеринов. Нами впервые были выделены и охарактеризованы две формы внутриклеточных 17Р-ОН-СДГ, различающихся по строению, функциям и свойствам, с использованием оригинального цитохимического метода установлена внутриклеточная локализация фермента в периферических областях цитоплазмы и его слабая ассоциация с цитоплазматической мембраной.
В отличие от других групп микроорганизмов актинобактерии обладают большим количеством дегидрогеназ, способных вводить двойные связи между углеродными атомами в стероидном ядре. Активность наиболее распространенной из них, 3-КСД, была подтверждена для представителей Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces и впервые выявлена нами для ряда штаммов Actinoplanes, Micromonospora, Nocardioides. Особую роль фермент играет в деградации стероидного ядра актинобактериями: сочетание его активности с 9а-гидроксилазной приводит к раскрытию кольца В и запускает механизм полной деструкции стероида. Полученные нами данные о свойствах 3-КСД Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д, проявляющей активность как в отношении 9-ОН-АД, так и АД, свидетельствуют о разнообразии ферментов, осуществляющих данную реакцию, даже у близкородственных актинобактерий.
Отсутствие 3-КСД активности у другого стеринокисляющего штамма, Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д позволило использовать его в качестве исходного организма при получении мутанта с 9а-гидроксилазной активностью. Такой мутант был получен при использовании комбинации методов классического мутагенеза и селекции под давлением ситостерина.
Получены новые сведения о механизме деградации боковой цепи стеринов штаммами с 9а-гидроксилазной активностью. Показано, что гидроксилированию преимущественно подвергаются интермедиаты с частично окисленной боковой цепью, а не образующийся в результате окисления боковой цепи АД, как было принято считать ранее.
Установление возможности эффективной биоконверсии ряда синтетических стероидов, биоконвертируемость которых осложнена наличием дополнительных двойных связей и ацетильных заместителей, свидетельствует об эффективности и пластичности ферментного аппарата актинобактерий. При использовании Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д показана связь 1-дегидрирования с процессами дезацетилирования и 20р-восстановления, и неферментативной 17 —> 21 миграцией ацетильной группы при трансформации диацетилированного стероида. Показан конститутивный характер стероидных эстераз N.simplex, а также их цитозольная и мембраносвязанная локализация.
С учетом низкой растворимости большинства стероидов особое значение при их биотрансформации имеет обеспечение доступности гидрофобных субстратов ферментативной атаке. Проблема усугубляется, когда, как в случае деградации боковой цепи стеринов микобактериями, ферменты окисления стероидов локализованы внутри клетки, а клеточная оболочка является серьезным барьером для транспорта субстрата в клетку. При этом образующиеся гидрофобные продукты (например, АД) экскрецируются из клетки и сорбируются на клеточной поверхности, что может создавать дополнительные препятствия для дальнейшего транспорта субстрата в клетку. Кроме того, образующиеся продукты трансформации (АДД, АД) могут быть токсичны для клеток биокатализатора (Perez et al, 2005).
Для комплексного решения указанных проблем нами предложено использование МЦД - химически замещенных циклических олигосахаридов, образующих со стероидами комплексы, растворимые в широком диапазоне концентраций. Позитивный эффект применения различных типов МЦД показан на процессах биоконверсии актинобактериями стеринов, андростанов и прегнанов.
Показано, что эффект зависит от структуры и концентрации МЦД. С использованием метода масс-спектрометрии экспериментально подтверждено образование комплекса включения образующегося 3,17-дикетоандростана с МЦД (на модели 9-ОН-АД - метил-Р-ЦД). В отличие от нативных (немодифицированных) ЦД, МЦД образуют комплексы, растворимые в широком диапазоне концентраций.
Проведение биоконверсии стеринов в среде с МЦД позволяло значительно стимулировать процесс, обеспечивало высокую скорость и выход целевых С^-стероидов и побочных продуктов трансформации - стероидных Сгг-спиртов. Было установлено, что в гомогенных системах соотношение образующихся при биоконверсии С19/С22 стероидов коррелирует с соотношением их максимальных растворимостей в среде с МЦД.
На модельной реакции 1-дегидрирования 9-ОН-АД Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д нами впервые было показано, что комплекс включения стероида в МЦД не подвержен ферментативной атаке. Вероятно, связывание с МЦД блокирует образование фермент-субстратного комплекса.
Проведенные нами исследования впервые показали, что МЦД модифицируют клеточную оболочку микобактерий, что приводит к изменению ее проницаемости как для гидрофобных, так и для гидрофильных соединений. В частности, установлено, что структурные модификации затрагивают, в основном, внешние слои клеточной стенки -липидный бислой и ассоциированные с ним белки, при этом арабиногалактановый каркас КС сохранялся, обеспечивая сохранение интактности клеток и внутриклеточных структур.
Полученные данные использованы в качестве фундаментальной основы для разработки новых конкурентоспособных биотехнологий и биотехнологических методов получения целого ряда ценных стероидных соединений - ключевых интермедиатов синтеза современных лекарственных препаратов (Рис.81). андрост-4-ен-З,17-дион О андроста-1,4-диен-З,17-дион О
9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион ОН тестостерон
ОН
1 -де гидротестостерон
НО^^^ЧЗН андрост-5-ен-зр,7р-диол-17-он ctf*5 андрост-5-ен-Зр,7а-ДИОЛ-17-он 1 преднизолон q О юн
20-гидроксиметилпрегн-4-ен-3-он
НО" v ^ 'ОН О"' андрост-5-ен-Зр,7р, 17-триол 17а-гидроксипрегна-1,4,9(11)-триен-3,20-дион- \ i i
-21-ацетат qVsJ^N/ qH 20-гидроксиметилпрегна-1,4-диен-З-он i I j ;юн андрост-5-ен-Зр,7а,17-триол о'прегна-1,4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-дион
• ОН ipema-1,4,9(11), 16(17)-тетраен-21 -ол-3,20-дион
Рис. 81. Структуры стероидных соединений, которые могут быть получены с помощью актинобактерий при использовании разработанных нами биотехнологий и биотехнологических методов.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Донова, Марина Викторовна, Пущино
1. Алехина Т.М., Рыжкова В.М., Гусарова Т.И., Кураков В.В., Клубничкина Г.А. Микробная трансформация комплексов включения стероидов с Р-циклодекстрином. Хим.-Фарм. Журн. 1993, т. 4, 59-62.
2. Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Скрябин К.Г., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г. Евразийский патент, 2002, №003049.
3. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А. Ковалентное связывание клеток с активированным силикагелем. Прикл. биохим. микробиол., 1980, т. 16, N6, 854-861.
4. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А. Использование водно-органических систем в энзиматической трансформации стероидов. Прикл. биохим. микробиол., 1983, т. 19,. N 1,20-31.
5. Аринбасарова А.Ю. Окислительно-восстановительные превращения гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis. Диссерт. на соискание уч. степ. канд. Биол.наук. Пущино. 1985.
6. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А., Андрюшина В.А., Гриненко Г.С., Скрябин Г.К. Способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов. Патент РФ, 1993, №1830949.
7. Аринбасарова А.Ю., Фокина В.В., Карпов А.В., Меденцев А.Г., Кощеенко К.А. 1-ен-дегидрирование ба-метилгидрокортизона клетками Arthrobacter globiformis 193. Биохимия, 1995, т. 60, N 10, 1679-1687.
8. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука. 1970. 525 с.
9. Бенина Е. М., Гернет М. В., Логинова JI. Т. 1983. Влияние условий культивирования на биосинтез а-амилазы. Ферменты и спиртовая промышленность, N 1, 36-38.
10. Борман Е.А., Кощеенко К.А., Винокурова Н.Г., Романова И.В. Микробиологический гидролиз стероидных эфиров культурой Arthrobacter citreus ВКМ 654. Прикл. биохим. микробиол., 1985, т. 21, N 4, 437-444.
11. Борман Е.А., Редикульцев Ю.В., Кощеенко К.А., Турута A.M., Камерницкий А.В. Трансформация ситостерина в 9а-оксиандростендион клетками Mycobacterium sp. 207 в присутствии адсорбента. Прикл. биохим. микробиол., 1992, т.28, N4, 551-556
12. Борман Е.А., Туркина М.В. Изучение особенностей иммобилизации и трансформации стеринов включенными в ПААГ клетками Mycobacterium phlei 1026. Прикл. биохим. микробиол., 1983, т. 3, 372-377.
13. Вдовина Н.В., Бухар М.И., Кощеенко К.А. Изучение физиолого-биохимических свойств культуры Nocardia erythropolis, осуществляющей отщепление боковой цепи стеринов. Прикл. биохим. микробиол., 1982, т. 18, N 3, 293-302.
14. Войшвилло Н.Е., Парнес Я.А. Селективное расщепление стеринов микроорганизмами. Биол. науки, 1981, т. 2, 32-46.
15. Войшвилло Н.Е., Турута A.M., Камерницкий А.В., Джлантиашвили Н.Д., Дайчева-Спасова В.К. Микробиологическая трансформация ЗР-гидрокси-5а-Н-прегнанов в их Д4-3-кето-9а-гидроксипроизводные. Хим.-фарм. журн., 1992, т. 26, 64-48.
16. Войшвилло Н.Е., Истомина З.И., Камерницкий А.В., Весела И.В., Решетова И.Г., Стрелкова О.Г. Поиск микроорганизмов, способных к 9а-гидроксилированию Зр-гидроксистероидов. Прикл. биохим. микробиол., 1994, т. 30, N 4-5, 617-623.
17. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С. Трансформация андростендиона и андростадиендиона бактериями, деградирующими стерины. Прикл. биохим. микробиол., 2004, т. 40, N 5, 536-543.
18. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: "Мир". 1974. 488 с.
19. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Королев Ю.Н., Комарова Т.И. Индуцируемые субстратом изменения клеток и клеточных оболочек Mycobacterium parafinicum. Микробиология, 1980, т. XLIX, N 5, 761-765.
20. Демченко Б.И., Коняхин А.Н., Васильев В.Н., Тропина В.И., Домрачеев Н.В., Наумова Г.А. Трансформация 21-ацетата Зр,17а-дигидроксипрегн-5-ен-20-она культурой Corynebacterium mediolanum. Хим.-Фарм. Журнал, 1979, том 13, 76 78
21. Диксон М., Уэбб Е. Ферменты. М.: "Мир". 1982, 92-109.
22. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: "Мир". 1991, 160-162.
23. Егоров Н.С., Кестнер А. И., Вокк Р.А. История исследования циклодекстринов, свойства и области их применения. Итоги науки и техники. Микробиология, 1988, т.20, 4-52.
24. Ившина И.Б., Гришко В.В., Ноговицина Е.М., Кукина Т.П., Толстиков Г.А. Биотрансформация Р-ситостерола и его сложных эфиров актинобактериями рода Rhodococcus. Прикл. биохим. микробиол., 2005, т.41, N6, 626-633
25. Кестнер А.И., Пальм Т.Б. 1988. Применение циклодекстринов в биотехнологии и пищевой промышленности. Итоги науки и техники. Микробиология. Т. 21 стр. 128-152
26. Климашина М.М., Викторовский И.В., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. Анализ продуктов биотрансформации эргоста-7,22-диен-ЗР-ола культурой Nocardia erythropolis. Прикл. биохим. микробиол., 1988, т. 24, N 5, 647-652.
27. Компанцева У. В., Гаврилин М. В., Ушакова JI. В. 1996. Производные Р-ЦД и перспективы их использования в фармации (обзор). Хим.-фарм. журн., Вып.4, 43-47.
28. Кощеенко К.А., Аринбасарова А.Ю., Донова М.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Пашкин И.И., Кузькина И.Ф., Кирш Э.Ю., Карапутадзе Т.М., Зубов В.П. Способ получения дегидроаналогов стероидов. Патент РФ, 1995, №2042687.
29. Красильников Н.А., Скрябин Г.К., Асеева И.В., Корсунская JI.O. Дегидрирование в положении 1(2) гидрокортизона при помощи Mycobacterium sp. 193. Докл. АН СССР, 1959, т. 128, N 5,1063-1065.
30. Лестровая Н.Н., Бухар М.И. Доказательство участия двух ферментов в процессе микробиологического 1,2-дегидрирования и восстановления Д'-связи в кольце А стероидов. Биохимия, 1970, т. 35. С. 1182-1186.
31. Лестровая Н.Н. Локализация З-оксостероид-Д'-дегидрогеназы в клетках Mycobacterium rubrumn Arthrobacter globiformis. Микробиология, 1981, т. 50, вып. 4, 619-625.
32. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков: "Торсинг". 1997, т. 2, 60-67.
33. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: "Мир". 1976. 436 с.
34. Навашин С.М, Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.: "Медицина". 1982, 495 с.
35. Поглазова М.Н., Бирюзова В.И., Зажигалина И.А. Изменение структурной организации дыхательного аппарата Mycobacterium rubrum в зависимости от условий культивирования. Микробиология, 1979, т. XLVIII, N 2, 286-295.
36. Скрябин Г.К., Северина JI.O., Торгов И.В. Окисление холестерина и желчных кислот микроорганизмами. Изв. АН СССР, сер. биол., 1966, N6, 914-916
37. Северина JI.O., Сыс Ж.Д., Ленская Г.С. Потребление желчных кислот и холестерина микроорганизмами, использующими холевую кислоту. Микробиология, 1967, том XXXVI, вып.З, 435 -437
38. Турута A.M., Войшвилло Н.Е., Камерницкий А.В. Микробиологическое гидроксилирование 5а-Н-стероидов. Успехи химии, 1992, т. 61, № 10, 1883-1931
39. Физер Л., Физер М. Стероиды. М.: "Мир". 1964, 982 с.
40. Фокина В.В., Суходольская Г.В., Гулевская С.А., Гавриш Е.Ю., Евтушенко Л.И., Донова М.В. 1(2)-Дегидрирование стероидных субстратов штаммом Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Микробиология, 2003, т. 72, N 1, 33-39.
41. Хефтман Э. Биохимия стероидов. М.: "Мир". 1972, 175 с.
42. Чинчолкар С.Б., Суходольская Г.В., Баклашова Т.Г., Кощеенко К.А. Особенности 110-гидроксилирования стероидных соединений мицелием Curvularia lunata ВКМ F-644 в присутствии Р-циклодекстрина. Прикл. биохим. микробиол., 1992, т. 28. N 5, 685-693.
43. Чинчолкар С. Б. Культивирование и стероид-1 ip-гидроксилазная активность свободного и иммобилизованного мицелия Curvularia lunata ВКМ F-644. Диссерт. На соискание степ. канд. биол. наук, Пущино, 220 с.
44. Чичикалова М.М., Викторовский И.В., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. Физико-химический анализ продуктов биотрансформации эргостерина культурой Nocardia erythropolis. Прикл. биохим. микробиол., 1988, т. 24, N 2, 170-174.
45. Abou El-Hawa M., Mahfouz W., Taha O., Sallam L.A.R. A'-Dehydrogenation of Cortisol with bacteria. I. Screening experiments and some physiological studies. Egypt J. Microbiol.,1993(a), v. 28, 119-130.
46. Abou El-Hawa M., Mahfouz W., Taha O., Sallam L.A.R. A^Dehydrogenation of Cortisol with bacteria. II. Some aspects of the enzymic dehydrogenation of Cortisol with Corynebacterium equi. Egypt J. Microbiol., 1993(6), v. 28, 215-222.
47. Abul-Hajj Y.J. Isolation of vitamin K2 (35) from Nocardia restrictus and Corynebacterium simplex. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, 2356-2360.
48. Abul-Hajj Y, Qian H. Transformation of steroids by algae. J. Nat. Product., 1986, v.49, N2, 244-248.
49. Ahmad S., Garg S.K., Johri B.N. Biotransformation of sterols: Selective cleavage of the side chain. Biotechnol. Adv., 1992, v. 10, 1-67.
50. Alexander D.L., Fisher J.F. A convenient synthesis of 7a- hydroxycholest-4-en-3-one by the hydroxypropyl-|3-cyclodextrin-facilitated cholesterol-oxidase oxidation of 3p,7a-cholest-5-en-3,7-diol. Steroids, 1995, v.60, N 3, 290-294.
51. Ambrus G., Jekkel A., Ilkoy E., Horvath G., Bocskei Z. Novel 26-oxygenated products in microbial degradation of ergosterol. Steroids, 1995, v.60, N 9, 626-629.
52. Ambrus G., Ilkoy E., Jekkel A., Horvath G., Bocskei Z. Microbial transformation of 3-sitosterol and stigmasterol into 26-oxygenated derivatives. Steroids, 1995, v.60, N 9, 621625.
53. Angelova В., Mutafov S., Avramova Т., Dimova I., Boyadjieva L. 9a-Hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by resting Rhodococcus sp. cells. Process Biochem., 1996, v.31, 179184.
54. Arinbasarova A.Yu,, Medentsev A.G., Akimenko V.K., Koshcheyenko K.A., and Skryabin G.K. Redox reactions in hydrocortisone transformation by Arthrobacter globiformis cells. J. Steroid Biochem., 1985, v. 23, N 3, 307-312.
55. Arinbasarova A.Yu., Karpov A.V., Fokina V.V., Medentsev A.G., Koshcheyenko K.A. Kinetic characteristics of 1-en-dehydrogenation of 6a-methylhydrocortisone by cells of Arthrobacter globiformis 193. Enzyme Microb. Technol., 1996, v. 19, 501-506.
56. Atrat P., Deppmeyer V., and Horhold C. Efficient purification of a microbial steroid 1-dehydrogenase by electrophoretic desorption from the affinity matrix on a preparative scale. J. Chromatog., 1980, v. 189, 279-283.
57. Atrat P., Hosel P., Richter W., Meyer H.W., Horhold C. Interactions of Mycobacterium fortuitum with solid sterol substrate particles. J. Basic Microbiol., 1991, v. 31, N 6, 413-422.
58. Atrat P.G., Koch В., Szekala В., Horhold-Schubert C. Application of newly syntheszed detergents in the side chain degradation of plant sterols by Mycobacterium fortuitum. J. Basic Microbiol., 1992, v.32, N 3, 147-157.
59. Atrat P.G., Wagner В., Wagner M., Schumann G. Localization of the cholesterol oxidase in Rhodococcus erythropolis IMET 7185 studies by immunoelectron microscopy. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1992, v. 42, N 2, 193-200.
60. Bar R. Cyclodextrin-aided bioconversions and fermentations. Trends in Biotechnol., 1989(a), v. 7, N 1,2-4.
61. Bar R. Cyclodextrin-aided microbial transformation of aromatic aldehydes by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989(b), v. 31, 25-28.
62. Bar R., Ulitzur S. Bacterial toxicity of cyclodextrins: luminous Escherichia coli as a model. Appl.Microbiol.Biotechnol., 1994, v. 41, N 5, 574-577.
63. Bardi L., Mattei A., Steffan S., Marzona M. Hydrocarbon degradation by a soil microbial population with P-cyclodextrin as surfactant to enhance bioavailability. Enz. Microb. Technol., 2000, v. 27, N 9, 709-713.
64. Barthakur S., Roy M.K., Bera S.K., Ghosh A.C. Steroid transformation by mutants of Mycobacterium sp. with altered response to antibiotics. J. Basic Microbiol., 1996, v. 36, 383387.
65. Bendinger В., Rijnaarts H.H.M., Altendorf K., Zehnder A.J.B. Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids. Appl. Environm. Microbiol., 1993, v. 59, 3973-3977.
66. Bhattacharyya P.K., Krishna R.M., Natarajan R.D., Ramgopal M., Madyashta P., Madyastha K.R. Microbial oxidation of sterol side chains. J.Ind. Chem. Soc., 1984, vol.51, 1-154
67. Birke M., Hoerhold C., Groh H., Depmeyer V., Naumann H., Schildbatch A., Daehnardt S., Schnaner F. Microbial manufacture of 9a-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione from sterols. DDR (German) Patent. 1992(a). N 298,278 (Yenapharm Gmbh., Yena).
68. Birke M., Schildbatch A., Heller I., Hoerhold C., Siedel L., Atrat P. Microbial manufacture and recovery of 9a-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione. DDR (German) Patent. 1992(6). N 298,278 (Yenapharm Gmbh., Yena).
69. Bohme H., Horhold C. Degradation of steroids. XVI. Microbial side chain degradation of structurally modified sterols. Z. Allg. Mikrobiol., 1980, v. 20, N 2, 85-93.
70. Borrego S., Niubo E., Ancheta O., Espinosa M.E. Study of the microbial aggregation in Mycobacterium using image analysis and electron microscopy. Tissue and Cell, 2000, v.32, 494-500.
71. Bortolini O., Medici A., Poli S. Biotransformation of the steroid nucleus of bile acids. Steroids, 1997, v. 62,564-577
72. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, v. 72, 248-254
73. Breitling R., Laubner D., Adamski J. Structure-based phylogenetic analysis of short-chain alcohol dehydrogenases and reclassification of the 17p-hydroxysteroid dehydrogenase family. Mol. Biol. Evol., 2001, v. 18, N 12, 2154-2161.
74. Brennan P. J., Nikaido H. The envelope of mycobacteria. Annu. Rev. Biochem., 1995, v. 64, 29-63.
75. Buckland B.C., Lilly M.D., Dunnill P. Cholesterol oxidase synthesis by Nocardia. Biotechnol. Bioeng., 1976, v. XVIII, 601-621.
76. Cabrera J., Pruneda Paz J., Genti-Raimondi S. Steroid-inducible transcription of the 30/170-hydroxysteroid dehydrogenase gene (3$!\l$-hsd) in Comamonas testosteroni. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2000, v. 73, 147-152.
77. Capek A., Hanc 0., Tadra M. Microbial transformations of steroids. Acad. Publish. House of the Czechoslovak Acad. Sci., Prague, 1966, 239 p.
78. Catroux Y., Fournier J., Blachere H. Importance de la forme cristalline de e'acetate de cortisone pour la dehydrogenation en C-l par Arthrobacter simplex. Can. J. Biochem., 1968, v. 46, 537-542.
79. Chang F.N., Sih C.J. Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms. 7. Properties of the 9a-hydroxylase. Biochemistry, 1964, v.3, 1551-1557.
80. Charney W., Herzog H.L. Microbial transformations of steroids. Academic press, N.-Y. -London, 1967, 728 p.
81. Chatterjee D. The mycobacterial cell wall: structure, biosynthesis and sites of drug action. Current Opinion in Chem. Biol., 1997, v.l, 579 588.
82. Cheetham P., Dunnill P., Lilly M. The characterization and interconversion of three forms of cholesterol oxidase extracted from Nocardia rhodochrous. Biochem. J., 1982, v. 201, N3, 515-521.
83. Chen K.-C., Chang C.-C., Chiu C.-F., Ling A.-C. Mathematical simulation of pseudo-crystal lofermentation of hydrocortisone by Arthrobacter simplex. Biotechnol. Bioeng., 1985, v.27, 253-259.
84. Chen K.-C., Wey H.-C. Dissolution enzyme kinetics of 1 lp -hydroxylation of cortexolone by Curvularia lunata. Enz. Microb. Technol., 1990, v. 12, 616-621.
85. Conner A.H., Nagaoka M., Rowe J.W., Perlman D. Microbial conversion of tall oil sterols to C-19 steroids. Appl. Environ. Microbiol., 1976, v. 32, N 2, 310-311.
86. Conners A.H., Rowe J.W. Neutrals in southern pine tall oil. J. Am.Oil Chem. Soc., 1975, v. 52, 334-338.
87. Cruz A., Fernandes P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Whole-cell bioconversion of sitosterol in aqueous-organic two-phase systems. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 2001, v. 11, 579-585.
88. Cruz A., Fernandes , Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Solvent partitioning and whole-cell sitosterol bioconversion activity in aqueous-organic two-phase systems. Enz. Microb. Technol., 2004, v. 34, N 3-4, 342-353.
89. Csaba G., Inczefi-Gonda A., Feher T. Induction of steroid binding sites (receptors) and presence of steroid hormones in the unicellular Tetrahymena pyriforms. Сотр. Biochem. Physiol., 1985, v. 82, N 3, 567-570.
90. Cserhati, Т., Forgacs E. Effect of carboxymethyl- P-cyclodextrin on the hydrophobicity parameters of steroidal drugs. Carbohydr. Polym., 1999, v. 38, 171-177.
91. Dai J., Zhang S., Sakai J., Bai J., Oku Y., Ando M. Specific oxidation of C-l oxygenated 4(20),11-taxadienes by microbial transformation. Tetrahedron Lett., 2003, v. 44, N 5, 10911094
92. Daffe M., Draper P. The envelope layers of mycobacteria with reference to their pathogenicity. Adv. Microb. Physiol., 1998, 39, 131-203
93. Datcheva V.K., Voishvillo N.E., Kamernitskii A.V., Vlahov R.J., Reshetova I.G. Synthesis of 9a-hydroxysteroids by a Rhodococcus sp. Steroids, 1989, v. 54, N 3, 271-286.
94. Davis B. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1964, v. 124, 404-409.
95. Decreau R.A., Marson C.M., Smith K.E., Behan J.M. Production of malodorous steroids from androsta-5,16-dienes and androsta-4,16-dienes by Corynebacteria and other human axillary bacteria. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2003, v. 87, N (4-5), 327-336.
96. Dias A.C.P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Sterol side-chain cleavage with immobilized Mycobacterium cells in water immiscible organic solvents. Enz. Microb. Technol., 1994. v. 16, 708-714.
97. Dias A.C.P., Fernandes P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Isolation of biodegradable sterol-rich fraction from industrial wastes. Bioresource Technol., 2002, v. 82, N 3, 253-260.
98. Dlugonski J., Wilmanska D. Deleterious effects of androstenedione on growth and cell morphology of Schizosaccharomyces pom.be. Antonie van Leeuwenhoek, 1998, v. 73, 189194.
99. Dodson R.M. and Muir R.D. Microbial transformations VI: The microbiological aromatization of steroids. J. Am. Chem. Soc., 1961, v. 83, 4627-4631.
100. DograN., Quazi G.N. Biotransformation of cholesterol by Micrococcus species mediated by plasmid DNA. World J. Microbiol. Biotechnol., 1999, v. 15, 411-415.
101. Dogra N., Quazi G.N. Steroid biotransformation by different strains of Micrococcus sp. Folia Microbiol., 2001, v. 46, 17-20.
102. Doukyu N., Aono R. Cloning, sequence analysis and expression of a gene encoding an organic solvent- and detergent-tolerant cholesterol oxidase of Burkholderia cepacia strain ST-200. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, v. 57, N 1-2, 146-152.
103. Draper P. The anatomy of mycobacteria. In-. The Biology of Mycobacteria, v. 1. Part 1. Ratledge C. and Stanford J. (eds.). Academic Press, London-New York. 1982.
104. Dray F.J., Cotillon A.C. 7a-Hydroxylation od dehydroepiandrosterone and pregnelone by bioconversion using Fusarium moniliforme. Патент Франции. 1999. FR №2771105.
105. Drobnic K., Krizaj I., Gubensek F., and Komel R. Improved purification of steroid dehydrogenase from Nocardia opaca and partial characterization of its cloned gene sequence. Biochem. Biophys. Res. Com., 1993, v. 190, N 2, 509-515.
106. Duchene D. New trends in cyclodextrins and derivatives. Ed. Dominique Duchene. Editions de Sante.19, rue Louis-le-Grand-75002, Paris. 1991, 604p.
107. Duchmann H., Trager L. Purification and characterization of a 3,17p-hydroxysteroid dehydrogenase from Streptomyces hydrogenans. Z. Naturforsch., 1979, v. 34, 533-540.
108. Dutta R.K., Roy M.K., Singh H.D. Metabolic blocks in the degradation of P-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. J. Basic Microbiol., 1992, v. 32, N 3, 167176.
109. Feldman D., Burshell D., Stathis P., Loose D. An estrogen-binding protein and endogenous ligand in Saccharomyces cerevisiae: possible hormone receptor system. Science, 1982, v. 218,297-298.
110. Fernandes P., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Influence of some operational parameters on the bioconversion of sitosterol with immobilized whole cells in organic medium. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 1998, v. 5, 307-310.
111. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments. Enz. Microb. Technol. 2003. v. 32. 688-705.
112. Flygare S., Larsson P.O. Steroid transformation in aqueous two phase systems: side chain degradation of cholesterol by Mycobacterium sp. Enzyme Microb. Technol., 1987, v. 9, 494499.
113. Francis M., Watanabe M. Membrane-associated steroid-binding proteins of Pseudomonas testosteroni. Can. J. Microbiol., 1981, v. 27, 1290-1297.
114. Fromming K.-H., Szej'tly J. Cyclodextrins in pharmacy. In: Topics in inclusion science, v. 5. Davies J.E.D. (ed.). Kluwer Ac. Publishers, 1993, 1-81.
115. Gadda G., Wels G., Pollegioni L., Zucchelli S., Ambrosius D., Pilone M., Ghisla S. Characterization of cholesterol oxidase from Streptomyces hydroscopicus and Brevibacterium sterolicum. Eur. J. Biochem., 1997, v. 1, N 250(2), 369-376.
116. Germain P., Schneider F. Transformation of cholest-4-ene-3-one by Nocardia corallina. Bull.Soc.Chim.Fr., 1980, 1-2, 96
117. Ghanem K.M., Yuself H.H. Some nutritional requirements of a mixed culture transforming Reichstein's compound S into prednisolone. Can. J. Microbiol., 1992, v. 38, 753-757.
118. Ghanem K.M., El-Aassar S.A., Yuself H.H. Transformation of Reichstein's compound S into prednisolone by immobilized mixed cultures. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1992, v.54, 115-121.
119. Goetschel R., Bar R. Formation of mixed crystals in microbial conversion of sterols and steroids. Enz. Microb. Technol., 1992, v. 14, 462-469.
120. Goren Т., Harnik M., Rimon S., Aharonowitz Y. 1-Ene-steroid reductase of Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J. Steroid Biochem. 1983, v. 19, N 6, 1789-1797.
121. Goswami P., Singh H., Baruah P. Factors limiting the microbial conversion of sterols to 17-ketosteroids in the presence of metal chelate inhibitors. Folia Microbiol., 1984. v. 29, 209-216.
122. Goswami P., Hazarika A.K., Singh H.D. Hydrocarbon pseudosolubilizing and emulsifying protein produced by Pseudomonas cepacia N1. J. Ferment. Bioeng., 1994, v. 77, 28-31.
123. Groh H., Komel R., Deppmeyer V., Schade W. and Horhold C. Steroid transforming enzymes from microorganisms: the reverse reaction of the steroid 1-dehydrogenase from Nocardia. J. Steroid Biochem., 1980, v. 13, 1413-1415.
124. Groman E, Engel L. Hydroxysteroid dehydrogenase of Pseudomonas testosteroni. Separation of 17p-hydroxysteroid dehydrogenase from 3(17)p-hydroxysteroid dehydrogenase and comparison of the two enzymes. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 485, 249-254.
125. Gutierrez A., del Rio H.C., Martinez M.J., Martinez A.T. The biotechnological control of pitch in paper pulp manufacturing. Trends in Biotechnol., 2001, v. 19, N 9, 340 348.
126. Haberland M.E., Reynolds J.A. Self-association of cholesterol in aqueous solution. Proc. Natl. Acad. Sci. 1973. v. 70. 2313-2316
127. Hayakawa S., Kurokawa K. Microbiological dehydroxylation of cholic acid. Nature (London), 1963, vol. 199, 490 492
128. Hesselink P.G.M., van Vliet S., de Vries H., Witholt B. Optimization of steroid side-chain cleavage by Mycobacterium sp. in the presence of cyclodextrins. Enz. Microb. Technol., 1989, v. 11, 398-404.
129. Hessels G., Dijkhuizen L., van der Geize R. Microbial 9a-hydroxylation of steroids. WO Patent, 2001, N0131050.
130. Higushi Т., Connors K. Phase solubility techniques. In: Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation. Reilly C. (ed.). Wiley Interscience, N.-Y., 1965, 177-122.
131. Holland H.L. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts. Steroids, 1999, v. 64, 178-186.
132. Horhold C., Gottschald В., Grosse H.-H. Microbial transformation of sterols tothandrostane-compounds in presence of organic resins. Proc. V Internat. Con.f on Chem. and Biotechnol. of Biol. Active Natur. Prod. 1989, 92-110.
133. Hui J., Gordon N., Kajioka R. Permeability barrier to rifampicin in mycobacteria. Antimicrob. Agents Chemoter., 1997, v. 11, 773-779.
134. Hung В., Falero A., Llanes N., Perez C., Ramirez MA. Testosterone as biotransformation product in steroid conversion by Mycobacterium sp. Biotechnol. Lett., 1994, v. 16, 497-500.
135. Hydroxysteroid dehydrogenase. In: Enzymes and Related Biochemicals. Worthlington: Bedford, USA. 1979, 105-106.
136. Imata Y., Takahashi K. Japanese Patent. 1979. №79147998.
137. Imata Y., Takahashi K., Katogi S. Japanese Patent. 1979. №7959395.
138. Imada Y., Mizuno S. Eur. Pat. 1980. №11235.
139. Ishaque M., Sticht Groh V. Oxidation of insoluble palmitic acid and water soluble palmitic acid - methylated cyclodextrin complex by Mycobacterium leprae and M. phlei. Microbios; 1993, v.75, N 303, 107-115.
140. Itagaki E, Iwaya T. Purification and characterization of 17p-hydroxysteroid dehydrogenase from Cylindrocarbon radicicola. J. Biochem. 1988, v. 103, 1039-1044.
141. Itagaki E., Hatta Т., Wakabayashi Т., Suzuki K. Spectral properties of B-ketosteroid-Д1-dehydrogenase from Nocardia corallina. Biochim. Biophys. Acta, 1990(a), v. 1040, N 2, 281-286.
142. Itagaki E., Matushita Т., Hatta T. Steroid transhydrogenase activity of B-ketosteroid-Д1-dehydrogenase from Nocardia corallina. J. Biochem., 1990(6), v. 108, N 1, 122-127.
143. Jadoun J., Bar R. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 3. Cholesterol oxidation by Rhodococcus erythropolis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993(a), v. 40, 230240.
144. Jadoun J., Bar R. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 4. Enzyme vs. Microbial oxidation of cholesterol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993(6), v. 40, 477-482.
145. Jarlier V., Nikaido H. Microbacterial cell wall: Structure and role in natural resistance to antibiotics. FEMS Microbiol. Lett., 1994, v. 123, 11-18.
146. Jekkel A, Csajagi E., Ilkoy E., Ambrus G. Genetic recombination by spheroplast fusion of sterol-transforming Mycobacterium strains. J. Gen. Microbiol., 1989, v. 135, 1727-1733.
147. Jekkel nee B.A., Albrecht K., Ambrus G., Lang Т., Szabo I.M., Ilkoy E., Konczol K., Moravcsik I., Hantos G., Simonovits E., Lengyel nee S.Z., Vida Z., Csajagi E.
148. Microbiological process for preparing 9a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione. US Patent. 1991. №5,004,695.
149. Jiu J., Marsheck W., Kvetkas M. Microbial production of testosterone and 1-dehydrotestosterone. US Patent. 1983. № GB 2 103 620 A.
150. Kastelic-Suhadolc Т., Lenasi H. Androgen binding proteins in Cochliobolus lunatus. FEMS Microbiol. Lett., 1993, v. 108, 121-126.
151. Kieslich K. Microbial side-chain degradation of sterols. J. Basic Microbiol., 1985, v. 25, 461-474.
152. Knight J.C., Wovcha M.G. British Patent. 1983. № GB 2,102,429.
153. Kondo E., Masuo. E. Pseudocrystallofermentation of steroids: a new process for preparing prednisolone by a microorganism. J. Gen. Appl. Microbiol. 1961, v. 7, 113-117.
154. Korycka-Machala M., Ziolkowski A., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Sedlaczek L. Polycations increase the permeability of Mycobacterium vaccae cell envelopes to hydrophobic compounds. Microbiology, 2001, v. 147, 2769-2781.
155. Kreiner M., Braunegg G., de Raadt A., Griengl H., Kopper I., Sukcharoen O., Weber H. Influence of Additives on the Biohydroxylation of Protected Carboxylic Acids and Ketones. Food Technol. Biotechnol., 1997, v. 35, N 2, 99-106.
156. Kumar R., Dahiya J.S., Singh D., Nigam P. Biotransformation of cholesterol using Lactobacillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. Bioresource Technol., 2001, v.78, 209-211.
157. Kutney J., Milanova R.K., Vassiliev C.D., Stefanov S.S., Nedelcheva N.V. Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadienedione. WO Patent, 1999, № 9949075.
158. Labeda D.P., Kroppenstedt R.M. Phylogenetic analysis of Saccharothrix and related taxa: proposal for Actinosynnemataceae fam. nov. Internat. J. Systemat. Evolut. Microbiol., 2000, v. 50,331-336
159. Lacave C., Laneelle M.A., Laneelle G. Mycolic acid synthesis by Mycobacterium aurum cell-free extracts. Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1042, 315-323.
160. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature, 1970, v. 227, 680-685.
161. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M., Belie I. Fungal 17p-hydroxysteroid dehydrogenase. FEMS Microbiol. Lett., 1992, v. 99, 49-52.
162. Lanisnik-Rizner Т., Zakelj-Mavric M., Plemenitas A., Zorko M. Purification and characterization of 17p-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus tunatus. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1996, v. 59, 205-214.
163. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M. Characterization of fungal 17p-hydroxysteroid dehydrogenases. Сотр. Biochem. Physiol. Part B. 2000, v. 127, 53-63.
164. Lanisnik Т., Adamski J., Zakelj-Mavric M. Expression of 17p-hydroxysteroid dehydrogenases inmesophilic and extremophilic yeast. Steroids, 2001, v. 66, 49-54.
165. Lamb D., Kelly D., Manning N., Kelly S. A sterol biosynthetic pathway in Mycobacterium. FEBS Lett., 1998, v. 437, 142-144.
166. Lefebvre Y., Schultz R., Groman E., Watanabe M. Localization of 3p- and 17p-hydroxysteroid dehydrogenase in Pseudomonas testosteroni. J. Steroid Biochem., 1979, v. 10, 523-528.
167. Lee C., Liu W. Production of androsta-l,4-diene-3,17-dione from cholesterol using growing cells of Mycobacterium sp. NRRL B-3683 adsorbed on solid carriers. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. v. 36. 598-603.
168. Lee С., Chen D., Liu W. Production of androsta-l,4-diene-3,17-dione from cholesterol using two-step microbial transformation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, v. 38, 447452.
169. Llanes N., Hung В., Falero A., Perez C., Anguila B. Glucose and lactose effect on AD and ADD bioconversion by Mycobacterium sp. Biotechnol. Lett., 1995, v. 17, 1237-1240.
170. Llanes N., Fernandes P., Leon R., Cabral J.M.S., Pinheiro H.M. Conversion of p-sitosterol by Mycobacterium sp. NRRL B-3805 cells immobilized on Celite supports. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 2001, v. 11, 523-530.
171. Linde Co. Aromatic hydrocarbon degradation using a cyclodextrin complexing agent. German Patent, 1994, DE 4238430
172. Lisowska К., Korycka M., Hadlaw-Klimaszewska O., Ziolkowski A., Sedlaczek L. Permeability of mycobacterial cell envelopes to sterols: peptidoglycan as the diffusion barrier. J. Basic Microbiol., 1996, v. 36, 407-419.
173. Liu W.-H., Kuo C.-W., Wu K.-L., Lee C.-Y., Hsu W.-Y. Transformation of cholesterol to testosterone by Mycobacterium sp. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1994, v. 13, 167-171.
174. Liu W.-H., Horng W.-C., Tsai M.-S. Bioconversion of cholesterol to cholest-4-en-3-one in aqueous/organic solvent two phase reactors. Enz. Microb. Technol., 1996, v. 18, 184-189.
175. Liu W.-H., Lo C.-K. Production of testosterone from cholesterol using a single-step microbial transformation by Mycobacterium sp. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1997, v. 19, 269-272.
176. Lo C.-K., Wu K.-L., Liu W.-H. Interconversion of androst-4-ene-3,17-dione and testosterone by an enzyme from Mycobacterium sp. or its resting cells. Food Sci. Agric. Chem., 2001, v. 3,30-35.
177. Lo C.-K., Pan C.-P., Liu W.-H. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002, v. 28, 280-283.
178. Lobastova T.G., Sukhodolskaya G.V., Nikolayeva V.M., Baskunov B.P., Turchin K.F., Donova M.V. Hydroxylation of carbazoles by Aspergillus flavus VKM F-1024. FEMS Microbiol. Letters, 2004. v. 235, N 1, 51-56
179. Loukas, Y.L., Vraka, V., Gregoriadis, G. Use of a nonlinear least-squares model for the kinetic determination of the stability constant of cyclodextrin inclusion complexes. Int. J. Pharmaceutics, 1996, v. 144, 22-231.
180. Lowry O., Rosenbrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, 265-267.
181. Luong J.H.T., Brown R.S., Male K.B., Cattaneo M.V., Zhao S. Enzyme reactions in the presence of cyclodextrins: biosensors and enzyme assays. Trends Biotechnol., 1995, v. 13, N11,457-463.
182. Luu-The V. Analysis and characteristics of multiple types of human 17p-hydroxysteroid dehydrogenase. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2001, v. 76, 143-151.
183. Male K.B., Brown S., Luong J.H.T. Enzymatic oxidation of water-soluble cyclodextrin-polynuclear aromatic hydrocarbon inclusion complexes, using lignin-peroxidase. Enzyme Microb.Technol., 1995, v. 17, N 7, 607-614.
184. MacLachlan J., Wotherspoon A., Ansell R., Brooks C. Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000. v. 72. N 5. 169-195.
185. Mahato S.B., Mukherjee A. Steroid transformations by microorganisms. Phytochemistry, 1984, v. 23, N10, 2131-2154.
186. Mahato S.B., Banerjee S. Steroid transformations by microorganisms II. Phytochemistry, 1985, v. 24, N 7, 1403-1421.
187. Mahato S.B., Banerjee S., Podder S. Novel microbial transformation of 16-dehydro pregnenolone by Arthrobacter simplex. Tetrahedron Lett. 1987, v. 28, N 44, 5315-5318.
188. Mahato S.B., Garai S. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids, 1997, v. 62, 332-345.
189. Mahato S., Majumdar I. Current trends in microbial steroid transformation. Phytochemistry, 1995, v. 34, 883-898.
190. Moreau R.A., Whitaker B.D., Hicks K.B. Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses. Progress in Lipid Research, 2002, v. 41, N 6, 457-500.
191. Marsheck W.J., Kraychy S., Muir R.D. Microbial degradation of sterols. Appl. Microbiol., 1972, v. 23, 72-77.
192. Marsheck W.J., Jiu J., Wang P.T. US Patent. 1983. № 4,397,947.
193. Martin C. Sterols. In: Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes. Rehm H.-J. and Reed G. (eds.). v. 6a «Biotransformations». 1984, 79-97.
194. Matsuda H., Arima H. Cyclodextrins in transdermal and rectal delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 1999, v. 1,N36(1), 81-99.
195. Medentsev A.G., Arinbasarova A.Y., Koshcheyenko K.A., Akimenko V.K. and Skryabin G.K. Regulation of 3-ketosteroid-l-en-dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis cells by a respiratory chain. J. Steroid Biochem., 1985, v. 23, N 3, 365-368.
196. Minninkin D. Chemical principles in the organization of the lipid components in the mycobacterial cell envelope. Res. Microbiol., 1991, v. 142, 419-481.
197. Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd. Japanese Patent. 1980. №80,138,395.
198. Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd. Japanese Patent. 1981. №JP 81,109,594.
199. Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd. Japanese Patent. 1982. №JP 8208 794.
200. Mukherjee E., Banerjee S, Mahato S.B. Transformation of cholic acid by Arthrobacter simplex. Steroids, 1993, v. 58, N 10, 484-490.
201. Murohisa Т., Iida M. Studies on microbial transformation (XXVI). Microbial degradation of 19-hydroxysterol side-chains. J. Ferment. Bioeng., 1993(a), v. 75, 13-17.
202. Murohisa Т., Iida M. Studies on microbial transformation (XXVII). Some new intermediates in microbial side-chain degradation. J. Ferment. Bioeng., 1993(6), v. 76, 174177.
203. Mutafov S., Angelova В., Avramova Т., Boyadjieva L., Dimova I. The inducibility of 9a-hydroxylating activity in resting Rhodococcus sp. cells. Process Biochem., 1997, v. 32, 585589.
204. Nagasawa M., Hashiba H., Watanabe N., Bae M., Tamura G., Arima K. Microbial transformation of sterols. Part IV. С-19-steroid intermediates in the degradation of cholesterol by Arthrobacter simplex. Agr. Biol. Chem., 1970(a), v. 34, N 5, 801-804.
205. Nagasawa M., Watanabe N., Tamura G., Arima K. Microbial transformation of sterols. Part III. Substrate specificity for cleaving steroid side chains by Arthrobacter simplex. Agr. Biol. Chem., 1970(6), v. 34, N 5, 798-800.
206. Nagasawa M., Watanabe N., Hashiba H., Murakami M., Bae M., Tamura G., Arima K. Microbial transformation of sterols. V. Inhibitors of microbial degradation of cholesterol. Agr. Biol. Chem., 1970(b), v. 34, 838-844.
207. Nakao Y., Mitsuo K., Suzuki M. Method for producing ergosterol and its esters. US Patent. 1975, №3,884,759.
208. Nikaido H., Jarlier V. Permeability of the mycobacterial cell wall. Res. Microbiol., 1991, v. 142, 437-441.
209. Nobile A., Charney W., Perlman D., Herzog H., Payne C., Tully M., Jevnik M., Hershberg E. Microbiological transformation of steroids. 1. A''4-diene-3-ketosteroids. J. Amer. Chem. S., 1955, v. 77, N 15, 1484-1488.
210. Nordling E, Oppermann U, Jornvall H, Peterson B. Human type 10 17p-hydroxysteroid dehydrogenase: molecular modeling and substrate docking. J. Mol. Graph. Model., 2001, v. 19, N6, 514-520.
211. Nunez-Delicado E., Sojo M., Sanchez-Ferrer A., Garcia-Carmona F. Cyclodextrins as diethylstilbestrol carrier system: characterization of diethylstilbestrol-cyclodextrins complexes. Pharm. Res., 1999(a), v. 16, N 6, 854-858.
212. Nunez-Delicado E., Sojo M.M., Sanchez-Ferrer A., Garcia-Carmona F. Hydroperoxidase activity of lipoxygenase in the presence of cyclodextrins. Arch. Biochem. Biophys., 1999(6), v,15,N 367(2), 274-280.
213. Osipowicz В., Krezel Z., Siewinski A. Biotransformation XXXIII. Oxidation of 3P and 17a-hydroxysteroids by Nocardia rubra cells in heptane-water system. J. Basic Microbiol., 1992, v. 32, 215-216.
214. Penasse I., Peyre H. Studies of S-oxo-steroid-A'-oxidoreductase of Arthrobacter simplex. Steroids, v. 12, 1968, 525-544.
215. Perez C., Perez I., Herve E. Isolation and partial characterization of new mutant for sterol biotransformation in Mycobacterium sp. Biotechnol. Lett., 1995, v. 17, 1241-1246.
216. Perez С., Falero A., Llanes N., Hung B.R., Herve M.E., Palmero A., Marti E. Resistance to androstanes as an approach for androstandienedione yield enhancement in industrial mycobacteria. J. Basic Microbiol., 2003, v. 43, N 2, 113-120.
217. Perez C., Falero A., Hung B.R., Tirado S., Balcinde Y. Bioconversion of phytosterols to androstanes by mycobacteria growing on sugar cane mud. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2005, v. 32, N 3, 83-86.
218. Peterson G., Thoma R., Perlman D., Fried G. Metabolism of progesterone by Cylindrocarpon radicicola and Streptomyces lavendulae. J. Bacteriol., 1957, v. 74, N 5, 684-688.
219. Peterson D. Microbial transformation of steroids and their application to the preparation of hormones and derivatives. In: Biochemistry of industrial micro-organisms. Rainbow C. and Rose A. H. (eds.). Ac. Press, London andN.- Y. 1963, 538-597.
220. Phase N., Patil S. Natural oils are better than organic solvents for the conversion of soybean sterols to 17-ketosteroids by Mycobacterium fortuitum. World J. Microbiol. Biotechnol., 1994, v. 10, 228-229.
221. Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Activity and stability of an entrapped-cell system for the A'-dehydrogenation of steroids in organic media. Biotechnol. Bioeng., 1992(a), v. 40, 11231127.
222. Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Microenvironmental effects on steroid A'-dehydrogenation in organic media using immobilized whole cells. Prog. Biotechnol., 1992(6), v. 8, 129-136.
223. Pinheiro H.M., Cabral J.M.S., Adlercreutz P. Quinones as external electron acceptors in steroid A1 -dehydrogenation with entrapped cells in organic medium. Biocatalysis, 1993, v. 7. 83-96.
224. Plemenitas A., Lenasi H., Hudnik-Plevnik T. Identification of progesterone binding sites in the plasma membrane of the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1993, v. 45,281-285.
225. Plesiat P., Grandguillot M., Harayama S., Vragar S., Michel-Briand Y. Cloning, sequencing, and expression of the Pseudomonas testosteroni gene encoding 3-oxosteroid delta 1-dehydrogenase. J. Bacterid., 1991, v. 173, N 22, 7219-7227.
226. Prauser H. Nocardioides, a new genus of the order Actinomycetales. Int. J. Syst. Bacteriol. 1976, v. 26, 58-65.
227. Rajkhowa R.C., Goswami P., Singh H.D. Mode of uptake of sterol by Arthrobacter simplex. World J. Microbiol. Biotechnol., 2000, v. 16, 63-68.
228. Rapp P., Bock H., Wray V., Wagner F. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes. J. Gen. Microbiol., 1979, v. 115, 491-503.
229. Ratledge C. Lipids: cell composition, fatty acid biosyntheses. In: The Biology of the Mycobacteria, v. 1, Part 1. Ratledge C. and Stanford J. (eds.). Academic press, London, New York. 1982, 632p.
230. Reiche R., Heller I., Hoerhold C., Gotlsehaldf B. Manufacture of androsta-l,4-diene-3,17-dione from sterols with Mycobacterium. DDR Patent. 1992. №300,364.
231. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J.Cell Biol., 1963, v. 17, 208-213.
232. Ringold H.J., Hayano M. and Stefanovic V. The stereochemistry and mechanism of bacterial C-l,2-dehydrogenation of steroids. J. Biol. Chem. 1963, v. 238, 1960-1965.
233. Rheinwald J., Chakrabarty A., Gunsalus J. A transmissible plasmid controlling camphor oxidation in Pseudomonasputida. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, 885-890.
234. Rogli U., Znidarsi-Plazl P., Plazl P. The influence of P-cyclodextrin on the kinetics of progesterone transformation by Rhizopus nigricans. Biocat. Biotransform., 2005, v. 23, N 5, 299 305
235. Ryu D. Y., Lee B.K., Thoma R.W., Humphrey A.E. Semicontinuos production of 3 ketosteroid A'-dehydrogenase for steroid transformation at high substrate concentration. Chem. Eng. Progr. Symp. Ser., 1971, v. 67, N 108, 80-83.
236. Rumijowska A., Lisowska K., Ziolkoeski A., Sedlaczek L. Transformation of sterols by Mycobacterium vaccae: effects of lecithin on the permeability of cell envelopes to sterols. World J. Microbiol. Biotechnol., 1997, v. 13, 89-95.
237. Rupprecht R., Holsboer F. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuropsychpharmacological perspectives. Trends Neurosci., v. 1999, N 22, 410-416.
238. Salmond W.G., Sacks C.E., Wovcha M.G. Ger.Offen. 1983. № DE 3,225,747.
239. Sarmah U., Roy M.K., Singh H.D. Steroid transformation by a strain of Arthrobacter oxydans incapable of steroid ring degradation. J. Basic Microbiol., 1989, v. 29, 85-92.
240. Sebek O.K., Perlman D. Microbial transformation of steroids and sterols. In: Microbial Technology, vol.1,2nd ed. Acad. Press, New-York, 134p.
241. Schlosser D., Irrgang S., Schmauder H.-P. Steroid hydroxylation with free and immobilized cells of Penicillium raistrickii in the presence of P-cyclodextrin. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, v. 39, 6-20.
242. Schmid A., Dordick J., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B. Industrial Biocatalysis today ' and tomorrow. Nature, 2001, v. 409, 258-268.
243. Schultz R.M., Groman E.V., Engel L.L. 3(17)p-hydroxysteroid dehydrogenase of Pseudomonas testosteroni. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, 3775-3783.
244. Schoemer U., Martin C. Microbial transformation of sterols. Biotechnol Bioeng., 1980, v.22, N 11, 11-24.
245. Schwartz A., Bar R. Cyclodextrin-enhanced degradation of toluene and p-toluic acid by Pseudomonasputida. Appl.Environ.Microbiol., 1995, v. 61, N 7, 2727-2731.
246. Sebek O.K., and Perlman D. Microbial technology. Eds. Peppier H. J. and Perlman D. Ac. Press, v. 1, 1979, 483-496.
247. Sedlaczek L. Biotransformation of steroids. Crit. Revs. Biotechnol., 1988, v. 7, 187-236.
248. Sedlaczek L., Gorminski B.M., Lisowska K. Effect of inhibitors of cell envelope synthesis on P-sitosterol side chain degradation by Mycobacterium sp. NRRL MB 3683. J. Basic Microbiol., 1994, v. 34, 387-399.
249. Seidel L., Horhold C. Selection and characterization of new microorganisms for the manufacture of 9-OH-AD from sterols. J. Basic Microbiol., 1992, v. 32, 49-55
250. Shirokane Y., Nakamura K., Mizusawa K. Purification and some properties of an extracellular Зр-hydroxysteroid oxidase produced by Corynebacterium cholesterolicum. J. Ferm. Technol., 1977, v. 55, 337-346.
251. Shull G.M., Kita D.A. US Patent, 1959, № 2905592.
252. Sih J.C., Bennett E.R. Steroid-1-dehydrogenase of Nocardia restrictus. Biochim. Biophys. Acta, 1962, v. 56, 584-592.
253. Sih С. J., Wang К. С., Gibson D. Т. On the mechanism of ring cleavage in the degradation of 9,10-seco steroids by microorganisms. J. Amer. Chem. Soc., 1967, v. 87, 1386-1388.
254. Singer Y., Shity H., Bar R. Microbial transformations in a cyclodextrin medium: Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol.,1991, v. 35, 731-737.
255. Singh M., Sharma R., Banerjee U. C. Biotechnological applications of cyclodextrins. Biotechnol. Adv., 2002, v. 20, N 5-6, 341-359.
256. Slijkhuis H., Marx A.F. Preparation of 9a-17-keto steroids using Mycobacterium sp. CBS 582 86 Patent, 1994, № 5,298,398.
257. Smith M., Zahnley J., Pfeifer D., Goff D. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween 80 medium. Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59, N 5, 1425-1429.
258. Sojo M., Bru R., Garcia-Garmona F. Rhodococcus erythropolis ATCC 25544 as a suitable source of cholesterol oxidase: cell-linked and extracellular enzyme synthesis, purification and concentration. BMC Biotecnol., 2002, v. 26, N 2(1), 3-10.
259. Sonomoto K., Usui N., Tanaka A., Fukui S. 9a-Hydroxylation of 4-androst3,17-dione by gel-entrapped Corynebacterium sp. Cells. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1983, v. 17, 203-210.
260. Spassov G., Pramatarova V., Vlahov R., Reinhold G. Bioconversion of sitosterol to androstenedione by mutants of Mycobacterium vaccae. Dokl. Bulg. Acad. Nauk, 1993, v. 46, 123-126
261. Srivastava A., Patil S. Investigation of some physico-chemical parameters involved in the biotransformation of cholesterol to 17-ketosteroids by Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153. J. Microb. Biotechnol., 1994, vol. 9, N2, 101-112
262. Stadtman Т., Clerkes A., Anfmsen C. Studies on the microbiological degradation of cholesterol. J. Biol. Chem., 1954, v. 206, 511-512
263. Stella V.J., Rajewski R.A. Cyclodextrins: their future in drug formulations and delivery. Pharm. Res., 1997, v. 14, 556-567.
264. Strijewski A. The steroid-9a-hydroxylation system from Nocardia species. Eur. J. Biochem., 1982, v. 128, N 1, 1251-1235.
265. Steinert H.-J., Vorlop K.D., Klein J. Transformation of sitosterol to androsta-l,4-diene-3,17-dione by immobilized Mycobacterium cells. Ind. J. Biochem. Biophys., 1991, v. 28, 150-154.
266. Subramanyam V.R., Pal B.B., Monahty K. Inducibility and stability of auxotropic mutations in Mycobacterium fortuitum, M. smegmatis and M. vaccae. Lett. Appl. Microbiol., 1989, v. 8, 161-164.
267. Sukhodolskaya G.V., Nikolaeva V.M., Donova M.V., Gulevskaya S.A., Baskunov B.P., Koshcheyenko K.A., Turchin K.F. Conversion 1-benzoylindole by Aspergillus strains. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, v. 53, 695-700.
268. Szejtli J. Utilization of cyclodextrins in industrial products and processes. J. Mater. Chem., 1997, v.5, 575-587.
269. Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Duchene D. (ed.). Published in France by Editions de Sante, 1991, 625p.
270. Szentirmai A. Microbial physiology of side chain degradation of steroids. J. Ind. Microbiol., 1990, v. 6, 101-116.
271. Szykula H., Hebda C., Orpiszewski J. Microbial transformation of neutral fraction and upgraded neutral fraction of Polish tall-oil. Biotechnol. Lett., 1991, v. 13, 917-921.
272. Takeda K., Yoshioka Т., Dobashi K., Terasawa T. A biological process for producing steroids hydroxylated at the 25-position. 1997. №EP 091673. (Mercian Corp. (JP). Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. (JP).
273. Tarnok I. and Tarnok Zs. Mycobacterial mutants, numerical taxonomy and species concept. In: Genetics of Actynomycetales. Freeksen E., Tarnok I., Thumium J.P. (eds.). Stutgart: Verlag. 1978, 121-128.
274. Tenneson M.L., Bilton R.F., Drasar B.S., Masan A.N. The possible role of catabolic plasmids in bacterial steroid degradation. FEBS Letters. 1979. v. 102, 311-315.
275. Thompson E.D., Knights B.A., Parks L.W. Identification and properties of sterol-binding polysaccharide isolated from Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.304, 132-141.
276. Trias J., Jarlier V., Benz R. Porins in the cell of mycobacteria. Science, 1992. v. 258, 1479-1481.
277. Trias J., and Benz R. Permeability of the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Molecular Microbiol., 1994, v. 14, 238-290.
278. Yamashita M., Toyama M., Ono H., Fujii I., Hirayama N., Murooka Y. Separation of two reactions, oxidation and isomerization, catalyzed by Streptomyces cholesterol oxidase. Protein Eng., 1998, v. 11, N 11, 1075-1081.
279. Yan J.L., Lee S.S., Wang K.C. Microbial transformation of 3-hydroxy-5,6-cyclopropaanocholestanes an alternative route to 6-methylsteroids. Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59, N 4, 1025-1029.
280. Yazdi M.T., Malekzadesh F., Khatami H., Kamranpour N. Cholesterol-degrading bacteria: isolation, characterization and bioconversion. World J. Microbiol. Biotechnol., 2000, v. 16, 101-106.
281. Uden W.V., Woeydenbag H., Prar N. Cyclodextrins as a useful tool for the bioconversion in plant cell biotechnology. Plant Cell Tissue Organ. Cult., 1994, v. 38, 103-113.
282. Udou Т., Ogawa M., Mizuguchi Y. Spheroplast formation of Mycobacterium smegmatis and morphological aspects of their reversion to the bacillary form. J. Bacteriol., 1982, v. 151, N2, 1035-1039
283. The United States Pharmacopeia. USP 26. The national formularity. NF 21. Solubilities. Reference tables. US Pharmacopeial Convention, INC. 12601 Twinbrook Parway, Rockwille, MD 20852, 2588-2594
284. Uvardy N.W., Bartho I., Mantos G., Trinn M., Vida Z.S., Szejtly J., Stadler-Szoke A., Haben I., Balas-Czurda M. Belgian Patent no. 894501, 1983 (Chem.Abs.99:4069)
285. Vidal M., Becerra J., Mondaca M.A., Silva M. Selection of Mycobacterium sp. strains with capacity to biotransform high concentrations of P-sitosterol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, v. 57, 385-389.
286. Vischer E., Wettstein A. Enzymatic transformations of steroids by microorganisms. Adv. Enzymol., N.-Y. London, Vol. 20, 1958, 1-237.
287. Vorbrodt H.M., Adam G., Porzel A., Horhold C., Danhardt S., Bohme K.H. Microbial degradation of 2a, 3a-dihydroxy-5a-cholestan-6-one by Mycobacterium vaccae. Steroids, 1991, v. 56, N 12, 586-588.
288. Wagner В., Atrat P.G., Clark-Curtiss J.E., and Wagner M. Localization of the steroid 1-dehydrogenease in Rhodococcus erythropolis IMET 7030 by immunoelectron microscopy. J. Basic Microbiol., 1992, v. 32, N 1, 65-71.
289. Wang K.C., Chiang N., Su C.C. Microbial transformation of 5p-steroids with Mycobacterium sp. (NRRL B-3805). Chin. Pharm. J. (Taipei). 1994, v. 46, 227-232.
290. Wang K.C., You B.-J., Yan J.-L., Lee S.-S. Microbial transformation of lanosterol derivatives with Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J. Nat. Prod. 1995, v. 58, 1222-1227.
291. Wang K.C., Wang P.-H., Lee S.-S. Microbial transformation of protopanaxadiol and protopanaxatriol derivatives by Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J. Nat. Prod., 1997, v. 60, N 12, 1236-1241.
292. Wang Z., Zhao F., Нао X., Chen D., Li D. Microbial transformation of hydrophobic compound in cloud point system. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 2004, v. 27, N 4-6, 147153.
293. Ward O.P., Young C.S. Reductive biotransformations of organic compounds by cells or enzymes of yeast. Enz. Microb. Biotechnol., 1990, v. 12, 482-493.
294. Watanabe M., Phillips K., Chen Т. Steroid-receptor in Pseudomonas testosteroni realeased by osmotic shock. J. Steroid Biochem., 1973, v. 4, 613-621.
295. Weber A., Kennecke M. Manufacture of 4-pregnene-3,20-dione and its derivatives by microbial transformation of pregnanes. (Schering AG). World Patent, 1992, № 9203,571.
296. Weber A., Kennecke M., Klages U., Nickish K., Rhode R. Process for the production of 17-oxosteroids via the fermentative oxidation of 17p-hydroxysteroids by Mycobacterium. US Patent, 1995, № 5,472,854.
297. Weber A., Kennecke M. Process for the production of 4-androstene-3,17-dione and 1,4-androstadiene-3,17-dione from ergosterol with Mycobacterium. US Patent, 1996, №5,516,649.Iproduction. Chem. Abstr., 1997, v. 91, 173386.
298. Wilmanska D., Dziadek J., Sajduda A., Milczarek K., Yaworski A., Murooka Y. Identification of cholesterol oxidase from fast-growing mycobacterial strains and Rhodococcus sp. J. Ferm. Bioeng., 1995, v. 79, 119-124.
299. Winter J., Rourke-Locasio S., Bokkenheuser V., Mosbach E., Conen B. Reduction of 17-keto steroids by anaerobic microorganisms isolated from Human fecal flora. Biochim. Biophys. Acta, 1984, v. 795, 208-211.
300. Wix G., Buki K., Tomorken E., Ambrus G. Inhibition of steroid nucleus degradation in mycobacterial transformation. Steroids, 1968, v. 11,N3, 401-413.
301. Wolf H.J., Kominek L.A. Improved steroid-1-dehydrogenation using heat-dried cells. Annals of N.-Y. Acad. Sci. Eds.: Laskin A.I., Tsao G.T., Wingard L.B. in: Enzyme Engineering 7, 1984, vol, 434, 106- 109
302. Wovcha M.G., Antosz F.J., Knight J.C., Kominek L.A., Руке T.R. Bioconversion of sitosterol to useful steroidal intermediates by mutants of Mycobacterium fortuitum. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 22, N 531(3), 308-321.
303. Wovcha M.G., Antosz F.J., Beaton J.M., Garcia A.B., Kominek L.A. US Patent, 1979(a). №4,175,006.
304. Wovcha M.G., Brooks K.E. and Kominek L.A. Evidence for two steroid 1,2-dehydrogenase activities in Mycobacterium fortuitum. Biochim. Biophys. Acta, 1979(6), v.574, 471-479.
305. Wovcha M.G., Knight J.C., Garcia A.B. Fr. Demande. 1982. № FR 2,505,360.
306. Zhang L., Zhang E., Wu Z. Yaoxue Xuebao. 1981. №16, 356.
307. Zhou W.S., Shen J.M. Hua Hsuen Hsuen Pao. 1980. №38, 251
308. Zorko M., Gottlieb H., Zakelj-Mavric M. Pluripotency of 17P-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. Steroids, 2000, v. 65, 4653.
-
Донова, Марина Викторовна
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 2006
-
ВАК 03.00.07
- Трансформация стеродных соединений актинобактериями
- Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов
- Характеристика ответных реакций актинобактерий рода Rhodococcus на воздействие факторов водной среды
- Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков
- Биокаталитическое окисление β-ситостерола и его 3β-ацил производных актинобактериями рода Rhodococcus
