Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальный подход к получению базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов"

На правах рукописи

КАРПОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД К ПОЛУЧЕНИЮ БАЗОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ СИНТЕЗА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ

ИЗ СТЕРИНОВ

03.02.03 «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 с :< ,• от к

I 1 ¡. П

Москва 2014

005547975

005547975

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук

Научные руководители: Смирнова Ирина Павловна

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры «Биохимии» ФГБОУ ВПО РУДН

Андрюшина Валентина Александровна

Официальные оппоненты: Блинкова Лариса Петровна

кандидат химических наук, научный сотрудник Центра «Биоинженерия» РАН

ведущии

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова» РАМН

Подборонов Виктор доктор биологических наук,

Михайлович ведущий научный сотрудник ФГБУ

«НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» РАМН

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)

Защита состоится « » 2014 года в & О часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.05 в Федеральном Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Федерального Государственного Бюджетного Образовательного Учреждения Высшего Профессионального Образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « /В » _2014 г.

Учёный секретарь, кандидат биологических наук, доцент//с/. Гигани О.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Стероиды, будучи регуляторами многих жизненно важных процессов в организме человека, нашли широкое применение в качестве лекарственных препаратов в онкологии, заместительной гормональной терапии, как противовоспалительные и антиаллергические средства, а также для решения таких социальных программ, как безопасное планирование семьи. Большая часть из них входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств [Машковский М.Д., 1997].

Потребность в стероидных лекарственных препаратах, как в мире, так и в России с каждым годом возрастает. Это связано с ухудшением общей экологической ситуации и соответственно с возрастающим количеством аллергических и воспалительных заболеваний. Несмотря на растущий спрос на стероидные лекарственные препараты, за последние 20 лет в России производство стероидных субстанций практически прекращено. Дефицит стероидного сырья возмещается за счет импорта, что в значительной степени влияет на стоимость готовых лекарственных форм, которые становятся недоступными для потребителей.

В настоящее время основным стероидным сырьем являются стерины растительного - фитостерины (ФС) и животного - холестерин (ХС) происхождения [Андрюшина В.А. и др., 2004]. Большинство фармацевтических гигантов в области производства стероидных препаратов, такие как Upjohn, Serl (США), Schering (Германия), Mitsubishi (Японии) и другие используют стерины в качестве сырья для стероидного синтеза.

Для нашей страны наиболее перспективным и доступным видом стероидного сырья является ФС, получаемый из сульфатного мыла - отхода переработки древесины. Этот источник сырья для России практически неограничен. Содержание ФС в сульфатном мыле достаточно высокое -около 3% [Conner А., 1976]. Рассматривается также возможность получения ФС из отходов производства рапсового и соевого масел.

Синтез стероидов из стеринов включает в себя окисление и деградацию боковой цепи стеринов.

Несмотря на имеющиеся достижения по химическим методам окисления боковой цепи стеринов, их использование в качестве стероидного сырья становится экономически выгодным только при наличии микробиологического способа окисления боковой цепи ФС (ХС) до 17-кетоандростанов: андростендион (АД), 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД), андростадиендион (АДД), и дегидроэпиандростерон (ДГЭА) - ключевых промежуточных продуктов в синтезе практически всей номенклатуры стероидных препаратов из стеринов [Feng-Qing Wang et al., 2011, Donova M.V., Egorova O.V., 2012].

Поэтому важной задачей является разработка эффективных микробиологических способов получения этих базовых продуктов (АД, АДД, 9а-ОН-АД, ДГЭА) из доступного отечественного сырья.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлась разработка экспериментального подхода к получению базовых соединений для

синтеза фармацевтических стероидов из стеринов. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия проведения микробиологического расщепления боковой цепи стеринов до АД и с помощью культуры Mycobacterium neoaimim разработать метод получения АД при повышенных нагрузках ФС (до 50 г/л).

2. Провести селекционирование культур Rhodococcus для получения штаммов, обладающих высокой 9а-гидроксилизной активностью и с их помощью разработать эффективный метод получения 9а-ОН-АД при повышенных нагрузках АД (до 50 г/л).

3. Исследовать 9а-гидроксилирующую способность культуры Rhodococcus erythropolis на примере стероидов ряда андростана и прегнана.

4. На основе иммобилизованных клеток культуры R. erythropolis создать метод получения 9а-ОН-АД.

5. С помощью смешанных культур актинобактерий М. пеоаигит и R. erythropolis разработать одностадийный метод получения 9а-ОН-АД из ФС.

6. Создать одностадийный способ получения 3-метилового эфира ДГЭА (Ме-ДГЭА) из 3-метилового эфира ХС (Ме-ХС) с помощью культуры М. пеоаигит.

Научная новизна работы.

Впервые определены оптимальные условия микробиологического расщепления боковой цепи стеринов с помощью культуры М, пеоаигит до АД в условиях насыщения среды гидрокарбонатным ионом.

Впервые с помощью культуры М. пеоаигит показана возможность проведения микробиологической трансформации ФС до АД - ценного ключевого соединения для фармацевтической промышленности - при высоких нагрузках, достигающих 50г/л.

Селекционированием микроорганизмов получены 2 новых высокопродуктивных гидроксилирующих штамма, в которых отсутствует фермент 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназа. Штамм Rhodococcus erythropolis с высокой 9а-гидроксилазной активностью, устойчивый к высоким концентрациям диметилформамида в реакционной среде, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Ас-1740 и защищен патентом РФ № 2351645 (Бюллет изобрет №10 10.04.2009). Информация об идентификации штамма Rhodococcus voyshvillii, обладающего устойчивостью к гентамицину, внесена в международную базу данных Genbank для дальнейшего депонирования в ВКПМ.

Впервые с помощью актинобактерии Rhodococcus erythropolis проведено 9а-гидроксилирование стероидов ряда андростана и прегнана. Получено И новых фармацевтически перспективных 9а-гидрокси-аналогов андростанового и прегнанового ряда. Структура новых соединений подтверждена данными ПМР-спектров.

С помощью биокатализатора длительного действия с включением в гранулы клеток оригинальной культуры Я. егуШгороИз разработан новый способ получения 9а-ОН-АД.

Впервые с помощью смешанных культур М. пеоаигит и Я. егуМгороИя проведена микробиологическая трансформация ФС до 9а-ОН-АД без стадии химического выделения полупродукта - АД и применения дорогостоящих солюбилизаторов и токсичных органических растворителей.

С помощью культуры М. пеоаигит разработан новый способ микробиологического получения фармакологически ценного стероидного соединения - Ме-ДГЭА.

Практическая значимость работы.

Усовершенствование процесса микробиологической трансформации стеринов с помощью культур М. пеоаигит и Я. егуЧкгороИз до АД, 9а-ОН-АД, ДГЭА позволило значительно поднять концентрацию стеринов и выход целевых продуктов, которые являются исходными субстратами для промышленных технологий получения высокоактивных стероидных лекарственных препаратов как у нас в стране, так и за рубежом.

Получен оригинальный селективный штамм Я. егу1НгороИ$ и на его основе разработан новый микробиологический метод получения стероидных лекарственных препаратов, который используется в промышленном синтезе высокоактивных стероидных лекарственных препаратов, в том числе и фторированных.

С помощью нового штамма Я. егучЬгороГш получены новые фармацевтически-перспективные 9а-гидрокси - аналоги андростанового и прегнанового ряда, а использование смешанных бактериальных культур М. пеоаигит и Я. егу1кгоро1'ш позволило разработать эффективный способ получения 9а-ОН-АД непосредственно из ФС, позволяющий избежать дополнительных стадий химического выделения и очистки, что значительно позволяет сократить временные и трудовые затраты, а также экологические характеристики процесса.

Разработан новый способ получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры М. пеоаигит.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Осуществление экспериментального микробиологического подхода получения АД из ФС с использованием культуры М. пеоаигит.

2. Исследование 9а-гидроксилазной активности культуры Я. егу(ИгороПя и разработка метода получения 9а-ОН-АД из АД с помощью данного микроорганизма-трансформатора.

3. Использование смешанных культур М. пеоаигит и Я. егуЛгороИз для получения 9а-ОН-АД из ФС.

4. Создание метода получения фармакологически ценного соединения Ме-ДГЭА из Ме-ХС с помощью культуры М. пеоаигит.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 7 статей, 6 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент РФ.

Личный вклад автора в результаты исследования

Состоит в разработке и проведении экспериментальных исследований на всех этапах диссертационной работы, интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (2004, Санкт-Петербург), III международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2005, Москва), международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (2005, Москва), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2005, Москва), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс), International Scientific Conference on «Chemistry for Development and Integration» (2008, Hanoi), VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2012, Москва), VII международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2013, Москва), V Международной научно-практической конференции (2013, Ростов), «Научная кафедральная конференция», кафедра биохимии РУДН (Смирнова И.П., Карпова Н.В.)(2013, Москва).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей главу описания материалов и методов исследования, главу изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемых литературных источников (142), из которых 120 зарубежные. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, иллюстрированная 13 таблицами, 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

Штаммы, использованные в работе. В работе использовали штаммы бактерий Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ас-1634, Rhodococcus sp. 77, Rhodococcus voyshvillii, Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1740 из рабочей коллекции лаборатории «Биотехнология стероидов» Центра «Биоинженерия» РАН.

Культивирование М. neoaurum проводили в течение 5 сут. в жидкой среде следующего состава (г/л): глюкоза-10,0, мука соевая необезжиренная-5,0, лимонная кислота-2,2, H2NCONH2-0,5, NH4C1-1,0, КН2Р04 -0,5, MgS04 -0,5, FeS04-0,05, СаСОз-1,5, рН=6,8-7,5. Выращивание биомассы проводили в конических колбах объёмом 750 мл со 100 мл среды при 28 °С на круговой качалке при скорости перемешивания 220 об/мин.

Культивирование R. erythropolis проводили в течение 3 сут. при 28°С на круговой качалке при 220 об/мин в конических колбах (750 мл) со 100 мл жидкой среды (КГС) следующего состава (г/л): глюкоза-10,0, кукурузный экстракт-15,0, K2HPO4-IA рН=6,8-7,5. Посевной материал (20% об.) переносили среду того же состава и инкубировали в течение 24 ч в тех же условиях.

Трансформацию ФС и 3-метилового эфира ХС с помощью М. neoaurum проводили при 28°С и скорости перемешивания 220 об/мин в конических колбах объёмом 750 мл (с отбойниками) со 100 мл среды следующего состава (г/л): глюкоза-20,0, мука соевая необезжиренная-15,0, лимонная кислота-2,2, H2NCONH2-0,5, NHaCI-1,0, КН2Р04-0,5, MgS04-0,5, FeS04-0,05, СаСОз-2,5, суспензия ФС (3-метиловый эфир ХС (Ме-ХС)), рН=6,8-7,2. Трансформацию АД проводили с помощью культуры R. erythropolis при 28 °С при 220 об/мин в конических колбах с отбойниками объёмом 750 мл со 100 мл КГС.

Анализ продуктов трансформации осуществляли с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ, ПМР-спектрометрии. Для ТСХ использовали пластинки Silufol UV 254 (Чехия) и Sorbfil (Россия). Аликвоты культуральной жидкости (1мл) отбирали с интервалом, определяемым целями эксперимента. Экстракцию стероидов осуществляли 4-кратным объемом этилацетата. Разделение стероидных соединений проводили в системе растворителей: бензол/ацетон (3:1). Визуальную оценку продуктов биоконверсии проводили на хроматоскопе JIX-6 (Россия). Для оценки содержания остаточных стеринов хроматограммы проявляли 1% раствором ванилина в 10% НС104 с последующим нагреванием до появления окрашенных пятен.

Содержание Д4-3-кетостероидов в среде определяли с помощью ВЭЖХ. Выход определяли соотношением выделенного кристаллического продукта в % от теоретического количества.

Для ВЭЖХ использовали колонки «Нуклеосил Cis» 250 х 4.6 мм. Подвижная фаза - смесь 70% метанола с 30% воды, подкисленной концентрированной Н4Р2О7 (1 мл кислоты на 1 л воды). Скорость подвижной фазы - 1,2 мл/мин.

Спектры ПМР снимали на ПМР-спектрометре XL-400 («Varían» США) в CDCb или в смеси CDCb и D-DMSO.

Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом. Оптическую плотность измеряли при 480-520 нм [Герасименко В.А., 2002]. Содержание СО?, определяли на хроматографе ЛХМ 8 МД (Россия), модель 3 с катарометром, газ-носитель - аргон, скорость газа - 20 мл/мин [Гиндуллина Т.М., ДубоваН.М.,2010].

Иммобилизация клеток бактерии R. erythropolis. Культуру выращивали в условиях получения посевного материала, описанных выше. Биомассу, выделенную из 1,2 л культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g (2,16 г в пересчете на вес сухих клеток), иммобилизовали включением в гранулы криогеля ПВС в лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН [Лозинский В.И., 2002].

ПЦР гена 16S рРНК и секвенирование полученных продуктов. Выделение ДНК из актинобактерии проводили согласно методу. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система и соответствующие условия реакции [Булыгина Е.С. и др., 2002].

Анализ последовательностей 16S гРНК. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S гРНК изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLAST [http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий Rhodococcus производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECONW[http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html],

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью Excel [MS Office 2007].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Микробиологическая трансформация фитостерина (ФС) с помощью М.

пеоаигит.

Влияние жирности соевой муки на биоконверсию холестерина (ХС) и ФС в андростендион (АД) с культурой М. пеоаигит.

Из литературных данных известно положительное влияние жирных кислот на выход продуктов расщепления боковой цепи стеринов [Rumijowska A., et al., 1997].

Влияние содержания липидов в среде на трансформацию ХС и ФС до АД с помощью М. пеоаигит изучалось нами на средах с соевой мукой разной жирности. Выход АД из ХС на среде с необезжиренной мукой (жирность 17,79 %) был на 27 % выше, чем на среде с обезжиренной мукой (жирность 0,96 %)

и составил 5,2 г/л. Жирность соевой муки также влияла на процесс трансформации ФС бактериями М. пеоангит. В этом случае различие в выходе АД было меньшим и составило 19%. Биоконверсия ФС в АД на обеих средах была неполной. Достигнуть полной конверсии ФС увеличением времени трансформации на обеих средах не удалось. Таким образом, из проведенных исследований следует, что жирность соевой муки положительно влияет на выход АД как при трансформации ФС, так и ХС. Дальнейшие эксперименты, в которых изучались условия проведения полной конверсии ФС, проводили с необезжиренной соевой мукой.

Влияние концентрации глюкозы и перемешивания культуральной жидкости на процесс трансформации ФС в АД с культурой М. пеоаигит.

Для интенсификации микробиологической трансформации ФС при нагрузке 10 г/л и достижения его полной конверсии процесс проводили в условиях турбулентного перемешивания, которое достигалось использованием качалочных колб с отбойником. В условиях турбулентного перемешивания при начальной концентрации глюкозы в среде 10 г/л и применении 10% инокулята запас глюкозы был исчерпан уже через 40 ч (логарифмическая фаза роста культуры М. пеоаигит) ферментации, а трансформация ФС была не полной и останавливалась на 50 ч с образованием 3,5 г/л АД. Полная конверсия ФС была достигнута в результате увеличения начального содержания глюкозы в среде до 20 г/л. При этом процесс трансформации завершился через 70 ч, а содержание АД составило 5,5 г/л.

Влияние концентрации гидрокарбонатного иона на полноту биоконверсии ФС в АД с культурой М. пеоаигит.

Из литературных данных известно, что, в отличие от ХС, для расщепления боковой цепи ФС с разветвленной боковой цепью при С-24 необходимо присутствие в среде иона НСОз" [8Ш С..Г., 1980; Рщ'птюк) У., 1983]. При определенной концентрации ионов кальция в водной среде и растворенного диоксида углерода происходит реакция: СаСОз +СО2 + НгО <=> Са2+ + 2НСОз' . Турбулентное перемешивание обеспечивает достаточное количество СО2 в культуральной жидкости, а равновесие реакции сдвигается в сторону образования ионов НСОз", поскольку они расходуются в процессе расщепления боковой цепи ФС М. пеоаигит. Для обеспечения реакционной системы гидрокарбонатным ионом в среду для ферментации 10 г/л ФС добавили 2,5 г/л СаСОз. При ламинарном характере перемешивания при ферментации в стандартных качалочных колбах интенсивное образование иона НСОз" не происходило, так как тяжелые частицы карбоната кальция находились в основном в придонном слое культуральной жидкости М. пеоаигит (табл. 1).

Таблица 1.

Содержание углекислого газа (СОг) в культуральной жидкости М. пеоаигит и газовой фазе при различных режимах перемешивания.

Режимы перемешивания Время, ч Содержание СО2

Общее количество, ммоль В культуральной жидкости, ммоль В газовой фазе

ммоль %

Контроль* 40 0,0538 0,0045 0,0492 0,46

Турбулентное 40 0,1613 0,0136 0,1477 1,38

Ламинарное 40 0,1076 0,0091 0,0985 0,92

*контроль-среда с посевным материалом в стационарных условиях.

При турбулентном перемешивании содержание СОг в культуральной жидкости М. пеоаигит и в газовой фазе выше в 1,5 раза по сравнению с тем, которое имеет место при ламинарном перемешивании. Содержание АД через 60 часов трансформации в режиме турбулентного перемешивания составляет 5,0 г/л, в колбах без отбойников - 3,0 г/л. В связи с полученными данными, последующие трансформации ФС проводили в условиях избытка гидрокарбонатного иона, достигаемого турбулентным перемешиванием.

Исследование зависимости скорости накопления АД от дозы посевного материала М. пеоаигит.

При проведении эксперимента по расщеплению боковой цепи ФС, было установлено, что АД появляется в среде на 6 ч трансформации с культурой М. пеоаигит. Можно предположить, что скорость образования АД и его количество зависят от величины посевного материала.

Хорошо известен способ увеличения скорости образования продукта ферментации и сокращения тем самым продолжительности процесса путем использования увеличенного количества посевного материала бактерий Arthrobacter globiformis, который был успешно применен в процессах 1,2-дегидрирования кортикостероидов [Goswami P.C., et al., 1983]. Для того чтобы проверить зависимость скорости образования АД при трансформации ФС культурой М. пеоаигит от количества инокулята был поставлен эксперимент с увеличенной в 3 раза дозой посевного материала (0,45 г/л, турбулентное перемешивание, количество глюкозы - 40 г/л). Эти условия позволили увеличить содержание субстрата в среде с 10 до 15 г/л и достигнуть высокого выхода АД, который составил 70%.

Трансформация ФС с нагрузкой 20 г/л с помощью культуры М. пеоаигит.

Проведение трансформации ФС при повышенной нагрузке 20 г/л, дозе посевного материала была 0,3 г/л, количестве глюкозы- 20 г/л полное потребление глюкозы происходило через 72 ч (рис.1, кривая 1), после чего замедлялось образование АД (рис.1, кривая 2). Внесение в трансформационную среду дополнительной порции глюкозы в количестве 20 г/л через 48 ч трансформации обеспечило непрерывность процесса расщепления боковой цепи. При этом АД образовывался в количестве 12 г/л (рис.1, кривая 3). В этом случае трансформация продолжалась не более 120 ч, а целевой продукт АД был выделен с выходом 9,6-10,1 г/л (70-73%).

Рис.1. Образование АД из ФС и динамика потребления глюкозы. 1- 20 г/л глюкозы;

2 - нагрузка ФС 20 г/л, глюкоза 20 г/л, инокулят 0,3 г/л;

3 - нагрузка ФС 20 г/л, глюкоза 40 г/л, инокулят 0,3 г/л.

Трансформация ФС культурой М. пеоаигит при повышенной

нагрузке 30 и 50 г/л.

При трансформации 30 г/л ФС максимальный выход АД 70% был достигнут при дробном внесении посевного материала - первая порция 0,3 г/л, вторая - 0,15 г/л через 48 ч. Одновременно с второй порцией инокулята подавали дополнительно глюкозу, которая при начальной (одноразовой) дозе инокулята 0,45 г/л через 48 ч была полностью исчерпана (рис.2). Накопление АД замедлялось в период 72-144 ч, несмотря на вторую дополнительную порцию глюкозы через 96 ч (рис.2). В контрольном варианте (0,3 г/л посевного материала и дополнительная порция глюкозы 20 г/л через 48 ч) время трансформации составило 144 ч, а выход АД - 10 г/л. В опыте с дробным внесением инокулята (в сумме 0,45 г/л) и добавлением 2 порций глюкозы (по 15 г/л) через каждые 48 ч, время трансформации составило 144 ч, а выход АД -14,5 г/л (70%).

-0,45 г/л посевного материала, дробное внесение -О.Зг/.ч посевного

материала

-0.45 г/л посевного материала

-потребление глюкозы, 0,3 г/л посевного материала

потребление глюкозы, 0,45 г/л посевного материала

Рис.2. Влияние количества глюкозы посевного материала М. пеоаигит на образование АД из ФС с нагрузкой 30 г/л.

Трансформацию ФС с нагрузкой 50 г/л проводили с использованием концентированной биомассы М. пеоаигит, полученной путем сгущения. Посевная доза составила 0,6 г/л. На 72 и 120 ч трансформации дополнительно вносили по 0,3 г/л инокулята и по 4,5 г/л глюкозы. Применение концентрированной биомассы позволило провести процесс трансформации ФС с нагрузкой 50 г/л за 240 ч с выходом АД 22,6 г/л (65,5%).

Полученные результаты могут послужить основой для создания эффективной технологии промышленного получения АД при высоких нагрузках ФС.

Микробиологические трансформации стероидов с помощью бактериальной культуры Я. егуМггороНя ВКПМ Ас-1740.

Методами лабораторной селекции (выделение монокультуры, обладающей наибольшей 9а-гидроксилирующей активностью) был получен штамм Я. егу^гороШ ВКПМ Ас-1740, который является безплазмидным вариантом штамма ЯИодососсиь яр. 77, что привело к потере способности штамма синтезировать ферменты А5-Д4-изомеразу, З-кетостероид-1,2-дегидрогеназу.

На построенном филогенетическом дереве (рис.3) исследуемый ЯИос1ососсиз егуЧкгороИь вошел в кластер штаммов, включая типовой, относящихся к виду Я. егу1кгороИз, с высоким уровнем сходства последовательностей (99.4-100%) и высоким значением «бутстреп» поддержки достоверности ветвления (98). Изучаемый штамм депонирован в Коллекции Промышленных Микроорганизмов как Я. егучИгороИз ВКПМ Ас-1740.

0.02

98

100

Г 95

Ч~

100

Rhodococcus eiythropolis ЛТСС 13260, U81990 Rhodococcus erythropolis

Rhodococcus erythropolis ATCC 53968, AF001265 Rhodococcus erythropolis DSM 43188г, X80618 Rhodococcus erythropolis ATCC 19566, U82667 Rhodococcus eiythropolis ATCC 19565, U82666 Rhodococcus eiythropolis DCL14, Л.1131637 Rhodococcus globertdus DSM 43954т, X80619 Rhodococcus marinonascens ATCC 35653т, X81933 Rhodococcuspercolatus HAMB! 1752т, X92114 Rhodococcus opticus DSM 43205т. X80630 ■ Rhodococcus fascians ATCC 12974т, X81930

1 Rhodococcus connehacteroides DSM 20151т, X80615

Rhodococcus rhodnii ATCC 3507Г, X81935 Rhodococcus coprophilus ATCC 290801', X81928 ■ Rhodococcus zopjii ATCC 51349т, X81934 Rhodococcus ruber DSM 43338т, X80625

Rhodococcus rhodochrous DSM 43241T, X79288 Рис.3. Филогенетическое дерево Rhodococcus, показывающее положение нового штамма R. erythropolis. Цифрами показаны величины показателя «бутстреп»-анализа, значения менее 95 не указаны. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстояниям).

Определение оптимальных условий проведения трансформации АД при нагрузке 4 г/л штаммом R. erythropolis ПКТ1М Ас-1740.

Важным условием для проведения трансформации стероидов является доступность субстрата для клеток микроорганизма-трансформатора R. erythropolis. Для проведения процесса 9а-гидроксилирования АД вносили в виде мелкодисперсной суспензии или в виде раствора — в этаноле или диметилформамиде (ДМФА).

Таблица 2.

Влияние способа (1-4)* внесения АД (4г/л) на накопление 9а-ОН-АД.

Время, ч Содержание субстрата и продукта трансформации R. erythropolis, г/л

АД 9а-ОН-АД

1 2 3 4 1 2 3 4

20 следы 2,0 0,3 1,2 3,5 1,8 3,5 2,5

24 1,5 - 0,8 3,8 2,3 3,9 3,0

27 - 0,5 - следы 3,9 3,2 3,8 3,8

46 - - - - 2,7 2,8 2,8 3,0

Примечание * 1 - в ДМФА - 4%, 2 - в этаноле - 4%, 3 - размолотый, в виде мелкодисперсной суспензии,4 - размолотый, в виде мелкодисперсной суспензии, без глюкозы, прочерк означает отсутствие стероида.

Лучший результат - полная конверсия АД (4 г/л) - был получен при наличии в среде 1% глюкозы и внесении АД в виде микрокристаллов с размером частиц 10-20 мкм либо в виде раствора в ДМФА (табл. 2). При этом за 24 ч трансформации образовывалось 3,8-3,9 г/л 9а-ОН-АД. Самая низкая скорость 9а-гидроксилирования наблюдалась в присутствии этанола. На вторые сутки инкубации имела место деструкция продукта реакции во всех вариантах.

Для проведения трансформации АД с помощью культуры R. erythropolis при повышенных нагрузках, необходимо было определить максимально возможное количество ДМФА, которое не ингибировало процесс 9а-гидроксилирования.

Конверсия АД в 9а-ОН-АД в присутствии 3-5% ДМФА заканчивалась через 24 ч, а в присутствии 7-9% ДМФА через 40-44 ч, так же как и в контроле (размолотый, в виде мелкодисперсной суспензии). Присутствие в среде ДМФА в концентрации выше от 5% приводило к снижению скорости процесса 9а-гидроксилирования культурой R. erythropolis, поэтому оптимальным количеством ДМФА для трансформации АД с нагрузкой 4 г/г являлось 3%.

Трансформация АД до 9а-ОН-АД культурой R. erythropolis с нагрузкой

субстрата 15-50 г/л.

Для гидроксилирования АД в количестве 15 и 20 г/л увеличили концентрацию глюкозы до 20 г/л, ее вносили в два приема (10 г/л - в трансформационную среду и вторую порцию 10 г/л - в культуральную жидкость через 24 ч трансформации одновременно со второй порцией посевного материала, количество которого также увеличили в 2 раза). Благодаря отсутствию деструкции стероидного субстрата и продукта трансформации, 9а-ОН-АД получен в оптимальных условиях с выходами более 90%.

Трансформацию АД с нагрузкой 50 г/л проводили с использованием плотной биомассы R. erythropolis, посевная доза составила 0,72 г/л. На 7, 24, 30 ч трансформации дополнительно вносили по 16 г/л глюкозы. Применение

концентрированной биомассы позволило провести процесс трансформации АД с нагрузкой 50 г/л за 55 ч с выходом 9а -ОН-АД 65,5%.

Важным преимуществом проведения трансформации АД в 9а-ОН-АД является то, что процесс проходит в нестерильных условиях, что позволит существенно удешевить производство целевого продукта в промышленных масштабах.

Гидроксилирование стероидов ряда андростаиа и прегнана культурой R.

erythropolis.

Нагрузка стероидов, указанных в таблице 3, была определена с учетом их растворимости в водной среде и доступности для культуры R. erythropolis.

Подбор индивидуальных оптимальных условий гидроксилирования I, VI, VII и X позволил сократить время трансформации и увеличить нагрузки указанных стероидов с 1,75 г/л до 4,0-10 г/л.

Таблица 3.

Гидроксилирование стероидов ряда прегнана и андростана, с помощью

культуры R. erythropolis.

Трансформируемый стероид Нагрузка, г/л Способ внесения трансформируемо го стероида Время трансформ ации, ч 9а-гидрокси-производное

Выход % Т пл.,°С

АД(1) 4,0 в ДМФА 22-24 95 222-224

10,0 32-36 85

Тестостерон (II) 1,0 микрокристаллы 18-20 85 221-223

Циангидрин-I (III) 0,5 микрокристаллы 18-20 46 220-223

14 а-ги дро кси -АД (IV) 1,0 в ДМФА 18-20 85 238-242

19-нортестостерон (V) 1,0 комплекс с МЦД 19-20 65 218-223

Спиродиен (VI) 4,0 комплекс с МЦД 15-16 60 240 с разложением

Па-метил-тестостерон (VII) 4,0 комплекс с МЦД 20-22 70 192-194

в ДМФА 24-26 70

17а-гидрокси-прогестерон (VIII) 1,0 комплекс с МЦД 19-20 57 250-253

16-дегидро-прогестерон (IX) 1,0 комплекс с МЦД 17-19 50 *

Кортексолон (X) 2,0 в ДМФА 20-22 80 >250

16а-метил кортексолон (XI) 2,0 в ДМФА 24-26 85 255-257

4,0 46-48 55

Примечание: *9а-ОН-16-дегидропрогестерон получен в смеси с продуктом восстановления кетогруппы при С-20.

Впервые с помощью культуры R. erythropolis были получены 9а-ОН-производные 11 стероидов ряда прегнана и андростана. Структура 9а-ОН соединений подтверждена данными ПМР-спектров. При трансформации II и V происходило окисление 17-гидроксигруппы с образованием 9а-ОН-1 и 9а-ОН-19-нор-1. Впервые получено и охарактеризовано 9а-производное VI.

Как видно из таблицы 3, культура R. erythropolis активно осуществляла 9а-гидроксилирование соединений - IV, I, XI, II, X. Гидроксипродукты были получены с высоким выходом 65-85%.

Трансформация АД иммобилизованной культурой R. erythropolis.

В результате включения бактерии R. erythropolis в гранулированный биокатализатор (ИмК), использованный в нескольких последовательных циклах трансформации АД. Проведено 9 циклов трансформации АД, продолжительность каждого из которых составила 25-31 ч из них в шести циклах (2-7) трансформация закончилась без остаточного АД, в 9-ом цикле активность ИмК уменьшилась примерно на 30%.

Полученные результаты позволяют рассматривать ИмК R. erythropolis Ас-1740 как эффективный биокатализатор многократного действия, снижающий «потребление» биомассы, существенно облегчающий выделение продукта реакции и хранения культуры, что особенно важно для целей масштабирования.

Трансформация ФС до 9а-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости при использовании смешанных культурами М. пеоаигит и R. erythropolis в присутствии солюбилизатора и без него.

Трансформацию ФС до 9а-ОН-АД смешанными культурами проводили в две последовательные стадии:

1) отщепление боковой цепи ФС культурой М. пеоаигит с образованием АД, который накапливался в среде в виде крупных кристаллов, многократно превышающих размером бактериальные клетки, и поэтому был недоступен для дальнейшей трансформации в 9а-ОН-АД. Для решения этой проблемы трансформацию проводили в присутствии метил-р-циклодекстрина (МЦД), который образовывал водорастворимый комплекс с АД.

2,)трансформация АД без выделения его из культуральной жидкости в 9а-ОН-АД культурой R. erythropolis;

Трансформация ФС при нагрузке 30 г/л в АД была проведена в оптимальных условиях с выходом 15,2 г/л АД через 6 сут. После добавления культуры R. erythropolis в культуральную жидкость через 22 ч трансформации был получен 9а-ОН-АД. Продукт содержал по данным ВЭЖХ 80% 9а-ОН-АД и 1,5% не вступившего в реакцию АД. Выход 9а-ОН-АД в пересчете на трансформируемые ФС составил 56 %.

Поскольку МЦД является дорогостоящим реагентом, процесс трансформации ФС проводили с нагрузкой 30 г/л до 9а-ОН-АД без солюбилизатора.

С целью предотвращения процесса укрупнения образующихся кристаллов АД, зависящего в значительной степени от концентрации стероида, 9а-гидроксилирующую культуру Я. егуиИгороНъ вносили на 70 ч трансформации. Образовывающийся АД не накапливался, а сразу гидроксилировался до 9а-ОН-АД. Время трансформации составило 168 ч, а 9а-ОН-АД был получен с выходом 61%.

Получение 9а-ОН-АД из ФС с помощью двух культур актинобактерий, осуществляющих последовательно отщепление боковой цепи ФС с образованием АД и его 9а-гидроксилирование, можно рассматривать как эффективный способ промышленного получения 9а-ОН-АД - исходного соединения для получения 11р-гидрокси-9а-галоидсодержащих аналогов ряда прегнана и ряда андростана.

Получение нового 9а-гидрокснлирующего штамма Ююйососст

уоуя/и'ИШ.

Из культуры Якоёососст ар. 77 путем ступенчатой селекции на среде, содержащей антибиотик гентамицин, был выделен штамм, обладающий устойчивостью к гентамицину (60 мкг/мл). На основании анализа последовательности его 16Б гРНК штамм был охарактеризован как 111юс]ососс113 \>оуч1п>ШИ, и информация об индентификации размещена в международной базе данных ОепЬапк. Использование этого штамма позволило провести трансформацию АД с нагрузкой 10 г/л. Был получен 9а-ОН-АД с выходом 98% за 25 ч.

Микробиологическая трансформация 3-метилового эфира ХС до 3-метилового эфира ДГЭА культурой М. пеоаигит.

ДГЭА и его аналоги являются ценными фармакологическими препаратами, поэтому разработка микробиологического синтеза ДГЭА из доступного стероидного сырья является одной из важнейших задач современной микробной трансформации стероидов.

При трансформации 6 г/л 3-метилового эфира ХС культурой М. пеоаигит в присутствии гидроксипропил-р-циклодекстрина (ГПЦД) был получен 3-метиловый эфир ДГЭА с высоким выходом - 77,2% за 168 ч.

Апробация микробиологического метода получения АД с помощью М. пеоаигит и в 9а-ОН-АД с помощью К. егугкгороИя в ферментерах.

Апробация методов микробиологической трансформации при нагрузке стероидных субстратов (ФС и АД) 10 г/л проводили в стандартных ферментерах БюВепсИ объемом 15 л в условиях, разработанных в процессе данного исследования. Была показана воспроизводимость разработанных микробиологических методов. АД из ФС был получен с выходом 70% , время трансформации составило 68-72 ч, 9а-ОН-АД из АД был получен с выходом 80% за 28-32 ч.

Таким образом, культуры М. пеоаигит и К. егуЛгороГм позволили осуществить получение ценных соединений, таких как АД и 9а-ОН-АД.

выводы

1. Определены оптимальные условия микробиологического расщепления боковой цепи стеринов с помощью актинобактерии М. пеоаигит ВКПМ Ас-1634 и разработан метод получения АД с выходом 65,5% за 240 ч при нагрузке ФС 50 г/л.

2. Проведена селекция, идентификация новых штаммов К. егу1ИгороП.\ ВКПМ Ас-1740 и Я. уоуяИуПШ. С помощью штамма Я. егу1ИгороИз Ас-1740 определены оптимальные условия 9а-гидроксилирования АД и разработан метод получения 9а-ОН-АД с выходом 65, 5 % за 55 ч при нагрузке АД 50 г/л.

3. Впервые микробиологическим методом с использованием нового штамма Я. егу^гороШ Ас-1740 получены фармакологически перспективные 9а-производные ряда андростана и прегнана с высокими выходами (60-90%).

4. На основе иммобилизованных клеток Я. егуМгороНя ВКПМ Ас-1740 разработан метод синтеза 9а-ОН-АД, который был получен с выходом 70-98%, при общем времени трансформации 254 ч (9 циклов).

5. Использование смешанных культур актинобактерии М. пеоаигит Ас-1634 и Я. егугЬгороНз ВКПМ Ас-1740 позволило разработать одностадийный метод получения 9а-ОН-АД непосредственно из ФС (30 г/л), в результате чего 9а-ОН-АД получен с выходом 61% за 168 ч.

6. С помощью культуры М. пеоаигит Ас-1634 создан микробиологический метод получения 3-метилового эфира ДГЭА из 3-метилового эфира ХС. При нагрузке 3-метилового эфира ХС 6 г/л был получен 3-метиловый эфир ДГЭА с выходом 77,2% за 168 ч.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ФС - фитостерины

ХС- холестерин

АД - андрост-4-еи-З,17-дион

9а-ОН-АД - 9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион

АДД - андроста-1,4-диен-3,17-дион

ДГЭА - дегидроэпиандростерон, (3(3-гидроксиандрост-5-ен-17-он) Ме-ДГЭА - 3-метиловый эфир ДГЭА Ме-ХС 3- метиловый эфир ХС

ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография ТСХ- тонкослойная хроматография ПМР- протонный магнитный резонанс ИмК- иммобилизованный биокатализатор ПВС - поливиниловый спирт МЦД - метил-Р-циклодекстрин ГПЦД - гидроксипропил-Р-циклодекстрин ДМФА — диметилформамид

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молчанова М.А., Родина Н.В., Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Савинова Т.С., Стыценко Т.С. Отщепление боковой цепи стеринов с помощью Mycobacterium neoaurum в присутствии синтетических полимеров// Тезисы доклада на Всероссийской научно-технической конференции - выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации».-2004.-С. 153-157.

2. Родина Н.В., Молчанова М.А., Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Савинова Т.С., Стыценко Т.С. Использование культуры Mycobacterium neoaurum для получения андростендиона и андростадиендиона из стеринов//Тезисы доклада на 3 международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»-2005.-Т. 1.- С.84-85.

3. Родина Н.В. Образование АД из смеси фитостеринов штаммом Mycobacterium neoaurum в среде с высоким содержанием глюкозы// Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Москва, 2005.-С.205.

4. Rodina N.V., Molchanova М.А., Voishvillo N.E., Andryushina V.A., Stytsenko T.S., Savinova T.S , Skryabin K.G. The use of Mycobacterium neoaurum cell culture for production of androstenedione and androstadienedione from sterols//Biothechnology, agriculture and the food industry. Nova Science Publishers, Inc., New York, 2006. -P. 145-155.

5. Молчанова M.A., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Родина Н.В., Войшвилло Н.Е. Получение андроста-1,4-диен-3,17-диона из стеринов с

помощью штамма Mycobacterium neoaurum ВКПМ АС-1656// Биоорганическая химия.-2007.-Т.ЗЗ.-№ 3.-С.379-384.

6. Родина Н.В. Проведение процесса ферментации в условиях насыщения среды гидрокарбонатным ионом с целью получения андростендиона// Тезисы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты».-Пущино, 2007.-С.37.

7. Родина Н.В., Молчанова М.А., Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С. Превращение фитостеринов в андростендион с помощью Mycobacterium neoaurum!! Прикладная биохимия и микробиология.-2008.-Т. 44.- № 1.-С.56-62.

8. Родина Н.В. Получение 9а-гидроксистероидов с помощью культуры Rhodococcus erythropolisH Симпозиальный доклад на XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».-Москва, 2008.-С.66.

9. Andryushina V.A., Luu Duc Huy, Rodina N. V., Truong Nam Hai, Nguyen Thi Quy, Nguyen Thi Diep, Voyshvillo N.E. Synthesis of 9a-Hydroxyandrostenedione with a New Strain of Actinobacteria Rhodococcus erythropolisH International Scientific Conference on "Chemistry for Development and Integration".-Hanoi, 2008,- P.191- 194.

10. Роднна Н.В. Получение ключевых соединений для синтеза лекарственных препаратов стероидной природы// «Наука и технологии». Краткие сообщения XXVIII Российской школы,- г. Миасс, 2008,- С.55-57.

11. Родина Н.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Турова Т.П., Баслеров Р.В., Пантелеева А.Н., Войшвилло Н.Е. Введение 9а-гидроксигруппы в андрост-4-ен-3,17-дион с помощью нового штамма актинобактерии// Прикладная биохимия и микробиология.-2009.-Т.45.-№4.- С.439-445.

12. Войшвилло Н.Е., Родина Н.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Скрябин К.Г. Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740 для получения 9а-гидроксистероидов //Пат РФ № 2351645 (Бюллет изобрет №10 10.04.2009).

13. Андрюшина В.А., Родина Н.В., Стыценко Т.С., Лью Дук Хи, Дружинина

A.B., Ядерец В.В., Войшвилло Н.Е. Получение 3,17-дикетостероидов из соевых стеринов с помощью актинобактерий Mycobacterium neoaurum, Pimelobacter simplex и Rhodococcus erythropolisH Прикладная биохимия и микробиология. -2011.-Т. 47,- № 3,- С.297-301.

14. Карпова-Родина Н.В., Андрюшина В.А., Ядерец В.В., Дружинина A.B., Стыценко Т.С., Шаскольский Б.Л., Лозинский В.И., Лью Дук Хи, Войшвилло Н.Е. Трансформация Д4-3-кетостероидов свободными и иммобилизованными клетками актинобактерии Rhodococcus erythropolisH Прикладная биохимия и микробиология.- 2011,- Т. 47. -№ 4.-С.429-435.

15. Савинова Т. С., Diep N.T., Войшвилло H. Е., Андрюшина В. А., Карпова Н.

B., Белецкая И. П., Luu D. Huy Извлечение смеси фитостеринов из отходов переработки соевых бобов и использование ее в производстве 9а-гидроксиандросте-4-ен-3,17-диона// Хим.-фарм. ж.,-2012.- Т.46. -№3. -С.34-38.

16. Карпова Н.В., Андрюшина В.А., Дружинина A.B., Стыценко Т.С., Ядерец

B.В., Рябев А.Н., Подорожко Е.А., Лозинский В.И. Оценка эффективности стероид-трансформирующих бактериальных и грибных клеток, иммобилизованных в гранулы криогеля ПВС// VII международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития».-Москва, 2013 -Ч.1.-

C.225-226.

17. Дружинина A.B., Карпова Н.В. Стыценко Т.С., Рябев А. Н., Подорожко Е.А., Лозинский В.И., Андрюшина В.А. Разработка эффективного способа получения высокоактивных дегидроаналогов стероидов// Тезисы на V Международной научно-практической конференции.-Ростов, 2013.- С.161-162.

* Карпова Н.В.=Родина Н.В.

Карпова Наталья Викторовна (Россия)

«Разработка микробиологических методов получения базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стертое» Диссертационная работа посвящена изучению условий проведения микробиологической трансформации стероидов с целью получения ценных ключевых соединений - 17-кетоандростанов - андростендиона (АД), 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД), и дегидроэпиандростерона (ДГЭА), используемых для синтеза жизненно важных стероидных лекарственных препаратов.

В результате проведенных селекционных работ получены эффективные штаммы-трансформаторы М. пеоаигит и R. erythropolis и определены оптимальные условия получения целевых продуктов с их помощью. На основании полученных экспериментальных данных разработаны перспективные способы синтеза АД, 9а-ОН-АД, ДГЭА с высоким выходом при повышенных нагрузках субстрата.

Разработанные методы могут быть рекомендованы для внедрения на промышленном и полупромышленном уровне.

Karpova Natalya Viktorovna (Russia)

«Development of microbiological methods of the key compounds production for the synthesis ofpharmaceutical steroids from sterols» The dissertation is about studying the conditions of microbiological transformation of steroids to obtain the key compounds - 17 ketoandrostans -androstenedione (AD), 9a- hydroxy-AD (9a-OH-AD), and dehydroepiandrosterone (DHEA ), using for the synthesis of vital steroid drugs.

As a result of selection works the new effective strains M. neoaurum and R. erythropolis were obtained and the optimal conditions to production of the key compounds by these strains were determined. Based on the experimental data perspective methods of AD, 9a-OH-AD, DHEA synthesis with a high yield and substrate loading were developed. The developed methods can be recommended for the industrial and semi-industrial level.

Работа посвящается памяти к.б.н. Войшвилло Натальи Евгеньевны.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н. Андрюшиной В.А. и д.б.н., профессору Смирновой И.П. за всестороннюю поддержку при выполнении диссертации, к.х.н. Стыценко Т.С., к.б.н. Дружининой A.B. за неоценимую помощь при планировании и выполнении работы, сотрудникам группы молекулярной диагностики за идентификацию культур, Соловьевой Н.П. за помощь в снятии и интерпретации ПМР спектров, сотрудникам лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН Лозинскому В.И., Рябеву А. Н. за совместную работу по иммобилизации клеток.

Заказ № 13-Р/04/2014 Подписано в печать 04.04.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Наталья Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЦЕНТР «БИОИНЖЕНЕРИЯ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201457302

КАРПОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД К ПОЛУЧЕНИЮ БАЗОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ СИНТЕЗА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ ИЗ СТЕРИНОВ

03.02.03 «Микробиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Смирнова Ирина Павловна кандидат химических наук Андрюшина Валентина Александровна

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ СТР.

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................5

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 13

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................13

1.1 Характеристика и биологическая роль некоторых стероидных соединений..............................................................................................................................................................13

1.2 Важнейшие базовые стероидные соединения, получаемые микробиологической трансформацией стеринов................................................................18

1.3 Сырье для получения базовых стероидных соединений....................................22

1.4 Механизм деградации стеринов микроорганизмами....................................................24

1.4.1 Микробиологическое расщепление стероидного ядра....................................29

1.4.2 Микробиологическое расщепление боковой цепи стеринов........................29

1.5 Взаимодействие микроорганизмов с гидрофобными стероидными субстратами..............................................................................................................................................................................................35

1.5.1 Использование циклодекстринов и их производных в микробиологических трансформациях стероидов..............................................................36

1.5.2 Применение иммобилизованных биокатализаторов..........................................39

1.6 Подбор штамма-трансформатора............................................................................................43

1.7 Процесс микробиологического 9а-гидроксилирования......................................44

1.8 Применение смешанных культур микроорганизмов................................................46

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................................49

2.1 Микроорганизмы и методы их культивирования......................................................50

2.2 Условия проведения микробиологических трансформаций..............................50

2.2.1 Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. пеоаигит.. 50

2.2.2 Проведение процесса трансформации АД с помощью Я. е^ИгороИя 51

2.3 Реактивы для выращивания культур и проведения процесса трансформации....................................................................................................................................................52

2.4 Выделение продуктов микробиологической трансформации........................53

2.5 Методы анализов, используемые в микробиологических трансформациях......................................................................... 54

2.5.1 Тонкослойная хроматография (ТСХ)........................................ 54

2.5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)............. 55

2.5.3 Ядерный магнитный резонанс............................................................ 55

2.5.4 Определение содержания глюкозы........................................... 56

2.5.5 Определение содержания СОг................................................. 56

2.6 Метод иммобилизации клеток бактерии Я. егуЖгороШ.................... 56

2.7 ПЦР гена 168 рРНК, секвенирование полученных продуктов и

анализ последовательностей 16Б гРНК................................................. 57

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................ 58

3.1 Микробиологическая трансформация фитостерина (ФС) с помощью

М. пеоаигит............................................................................. 58

3.1.1 Определение оптимальных условий микробиологической трансформации ФС с помощью М. пеоаигит.................................... 59

3.1.1.1 Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. пеоаигит.................................... 59

3.1.1.2 Влияние концентрации глюкозы и характера перемешивания культуральной жидкости М. пеоаигит на процесс трансформации ФС в АД.......................................................................................... 62

3.1.1.3 Влияние концентрации гидрокарбонатного иона на полноту биоконверсии ФС в АД с помощью М. пеоаигит............................... 63

3.1.1.4 Исследование зависимости скорости накопления АД от дозы посевного материала М. пеоаигит................................................... ^

3.1.2 Трансформация ФС с нагрузкой 20 г/л помощью культуры М. пеоаигит................................................................................. 69

3.1.3 Трансформация ФС с нагрузкой 30 г/л с помощью культуры М. пеоаигит.................................................................................. 70

3.1.4 Трансформация ФС культурой М. пеоаигит при повышенной

нагрузке (50 г/л)...................................................................... 72

3.2 Микробиологические трансформации стероидов с помощью бактериальной культуры Я. егуМгороШ ВКПМ Ас-1740....................... 73

3.2.1 Идентификация нового штамма Я. егуМгороНя............................ 74

3.2.2 Определение оптимальных условий проведения трансформации АД при нагрузке 4 г/л с помощью нового штамма Я. егуЖгороШ... 77

3.2.3 Трансформация АД до 9а-ОН-АД культурой Я. егуЖгороШ с нагрузкой субстрата 6-20 г/л......................................................... 79

3.2.4 9а-гидроксилирование АД культурой Я. егуМгороШ с нагрузкой субстрата 50 г/л.......................................................................... 81

3.2.5 Гидроксилирование стероидов ряда андростана и ряда прегнана культурой Я. егуМгороШ.............................................................. 82

3.3 Трансформация АД иммобилизованной культурой Я. егу^гороШ...... 87

3.4 Трансформация ФС в 9а-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. пеоаигит и Я. егуЖгороШ........ 90

3.4.1 Трансформация ФС в 9а-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. пеоаигит и Я. егуМгороШ в присутствии солюбилизатора........................................................90

3.4.2 Трансформация ФС до 9а-ОН-АД смешанными культурами М. пеоаигит и Я. етуМгороШ без солюбилизатора.................................. 91

3.5 Получение нового 9а-гидроксилирующего штамма Якос1ососсш....... 92

3.6 Микробиологическая трансформация 3-метилового эфира ХС до 3-метилового эфира ДГЭА культурой М. пеоаигит............................ 94

3.7 Апробация микробиологического метода получения АД из ФС с помощью М. пеоаигит и превращения его в 9а-ОН-АД с помощью Я.

егуЖгороШ в ферментерах................................................................................ 95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 99

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ......................................... 100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................... 104

ВВЕДЕНИЕ

Стероиды, будучи регуляторами многих жизненно важных процессов в организме человека, нашли широкое применение в качестве лекарственных препаратов в онкологии, заместительной гормональной терапии, как противовоспалительные и антиаллергические средства, а также для решения таких социальных программ, как безопасное планирование семьи. Большая часть из них входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств (Машковский М.Д., 2012).

Потребность в стероидных лекарственных препаратах, как в мире, так и в России с каждым годом возрастает. Это связано с ухудшением общей экологической ситуации и соответственно с возрастающим количеством аллергических и воспалительных заболеваний. Несмотря на растущий спрос на стероидные лекарственные препараты, за последние 20 лет в России производство стероидных субстанций практически прекращено. Дефицит стероидного сырья возмещают за счет импорта, что в значительной степени влияет на стоимость готовых лекарственных форм, которые становятся недоступными для потребителей.

В настоящее время основным стероидным сырьем являются стерины растительного и животного происхождения - фитостерины (ФС) и холестерин (ХС) соответственно (Андрюшина В.А., и др., 2004). Большинство фармацевтических гигантов в области производства стероидных препаратов, такие как Upjohn (США), Serl (США), Schering (Германия), Mitsubishi (Япония) и др. используют стерины в качестве сырья для стероидного синтеза.

Для нашей страны наиболее перспективным и доступным видом стероидного сырья является ФС, получаемый из сульфатного мыла - отхода переработки древесины. Этот источник сырья для России практически неограничен. Содержание ФС в сульфатном мыле достаточно высокое - около 3% (по сухому весу) (Conner А., 1976). Рассматривается также возможность получения ФС из отходов производства рапсового и соевого масел.

Синтез стероидов из стеринов включает в себя окисление и деградацию боковой цепи стеринов.

Несмотря на имеющиеся достижения по химическим методам окисления боковой цепи стеринов, их использование в качестве стероидного сырья становится экономически выгодным только при наличии микробиологического способа окисления боковой цепи ФС (ХС) до 17-кетоандростанов: андростендиона (АД), 9а-гидрокси-АД (9а-ОН-АД), андростадиендиона (АДД), и дегидроэпиандростерона (ДГЭА) - ключевых промежуточных продуктов в синтезе практически всей номенклатуры стероидных препаратов из стеринов (Wang F., et al., 2011, Donova M.V., Egorova O.V., 2012).

Поэтому важной задачей нашего исследования является разработка эффективных микробиологических способов получения этих базовых продуктов (АД, АДД, 9а-ОН-АД, ДГЭА) из доступного отечественного сырья.

Расщепление боковой цепи стеринов с сохранением стероидного скелета осуществляют следующими способами: синтезом модифицированных стеринов; инкубацией стеринов в присутствии соединений, ингибирующих действие ферментов 9а-гидроксилазы или 1,2-дегидрогеназы; получение мутантных штаммов. Самым эффективным из этих способов деградации боковой цепи стеринов до 17-кето-андростанов является применение селективных мутантных штаммов бактерий, которые успешно применяются в промышленных микробиологических процессах (Wei W., et al., 2010).

Для окисления боковой цепи стеринов в мировой практике получены и используются мутантные штаммы микроорганизмов родов Mycobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Arthrobacter, Flavobacterium.

Серьезными проблемами в процессах микробиологической трансформации являются ингибирование процесса деградации боковой цепи стеринов продуктами реакции и низкая растворимость стеринов в воде (1 мг/л), что делает их недоступными для микроорганизмов. Для проведения ферментативного расщепления субстрат вносят в среду в форме

микрокристаллов (1-10 мкм), получают его водорастворимые формы или используют природные или синтетические полимеры.

Одним из важнейших базовых стероидов является андростендион (АД), из которого по совмещенной схеме синтеза может быть получена большая часть стероидных гормональных препаратов - гестагены, андрогены, минерало- и глюкокортикоиды, диуретики, анаболики и др. (Zhang X., et al., 2009).

В промышленном масштабе АД в основном получают из фитостеринов (ФС) и ХС с помощью мутантных штаммов рода Mycobacterium.

9а-ОН-АД - базовое соединение для получения 11Р-гидрокси-9а-галоидсодержащих аналогов ряда прегнана, обладающих высокой противовоспалительной и антиаллергической активностями, пользующихся широким спросом на фармацевтическом рынке. 9а-ОН-АД получают либо непосредственно из стеринов (иногда в присутствии адсорбентов), либо из АД. Конверсия АД в 9а-ОН-АД наиболее эффективно осуществляется мутантными штаммами микроорганизмов, у которых блокирован синтез фермента 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназы, отвечающего за нежелательную деструкцию стероидной молекулы (R. van der Geize, et al., 2008).

Преимущество микробиологического гидроксилирования актинобактериями очевидно, поскольку данная реакция в положение С9 полициклической системы стероидной молекулы химическим способом в промышленных масштабах не выгодно экономически и из соображений производственной безопасности. Также перспективным способом получения базовых гидроксисоединений является применение иммобилизованных культур микроорганизмов. Иммобилизованные биореагенты обеспечивают возможность многократного использования биомассы, создания длительных полунепрерывных и непрерывных микробиологических процессов, в которых существенно упрощаются способы выделения и очистки продуктов реакции (Fokina V.V., et al., 1996).

Дегидроэпиандростерон (ДГЭА) - полифункциональный стероидный гормон, который вырабатывается естественным образом надпочечниками из ХС и может

служить для организма отправным материалом для производства других гормонов, таких как эстрогены или андрогены.

ДГЭА производят из дефицитного стероидного сырья - диосгенина и в медицинской практике применяют при лечении онкологических, сердечнососудистых заболеваний, а также он обладает иммуностимулирующим действием.

В последнее время появилось много публикаций об уникальных биологических свойствах 7а-гидроксилированных производных ДГЭА (Janeczko Т., et al., 2009). У этой группы веществ установлено наличие противораковой, иммуностимулирующей, антихолестеринемической и ноотропной активностей, эффективности при лечении болезни Альцгеймера, что делает проблему их синтеза чрезвычайно актуальной.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлась разработка экспериментального подхода получения базовых соединений для синтеза фармацевтических стероидов из стеринов. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия проведения микробиологического расщепления боковой цепи стеринов до АД и с помощью культуры Mycobacterium neoaurum разработать метод получения АД при повышенных нагрузках ФС (до 50 г/л).

2. Провести селекционирование культур Rhodococcus для получения штаммов, обладающих высокой 9а-гидроксилазной активностью, и с их помощью разработать эффективный метод получения 9а-ОН-АД при повышенных нагрузках АД (до 50 г/л).

3. Исследовать 9а-гидроксилирующую способность культуры Rhodococcus erythropolis на примере стероидов ряда андростана и ряда прегнана.

4. На основе иммобилизованных клеток культуры R. erythropolis создать метод получения 9а-ОН-АД.

5. С помощью смешанных культур актинобактерий М. пеоаигит и Я. егуЖгороПя разработать одностадийный метод получения 9а-ОН-АД из ФС.

6. Создать одностадийный способ получения 3-метилового эфира ДГЭА (Ме-ДГЭА) из 3-метилового эфира ХС (Ме-ХС) с помощью культуры М. пеоаигит.

Научная новизна работы

Впервые определены оптимальные условия (влияние концентрации глюкозы, дозы посевного материала, режимов перемешивания и т.д.) микробиологического расщепления боковой цепи стеринов с помощью культуры М. пеоаигит до андростендиона в условиях насыщения среды гидрокарбонатным ионом.

Впервые с помощью культуры М. пеоаигит показана возможность проведения микробиологической трансформации фитостерина до

андростендиона - ценного ключевого соединения для фармацевтической промышленности - при высоких нагрузках, достигающих 50 г/л.

Селекционированием Юю(1ососст эр, получены 2 новых высокопродуктивных гидроксилирующих штамма, в которых отсутствует фермент 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназа. Штамм Ююйососсш егуЖгороНя с высокой 9а-гидроксилазной активностью, устойчивый к высоким концентрациям диметилформамида в реакционной среде, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Ас-1740 и защищен патентом РФ № 2351645 (Опубликовано 10.04.2009. Бюл. №10). Информация об идентификации штамма ЯЪ.о(1ососст уоузкуШИ, обладающего устойчивостью к гентамицину, внесена в международную базу данных ОепЬапк для дальнейшего депонирования в ВКПМ.

Впервые с помощью актинобактерии Якос1ососст егуЛгороИя проведено 9а-гидроксилирование стероидов ряда андростана и ряда прегнана. Получено 11

новых фармацевтически перспективных 9а-гидрокси-аналогов андростанового и прегнанового рядов. Структура новых соединений подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса ЯМР 'Н.

С помощью биокатализатора длительного действия с включением в гранулы клеток оригинальной культуры Я. егугкгороИз разработан новый способ получения 9а-ОН-АД.

Впервые с помощью смешанных культур М. пеоаигит и Я. егуЖгороИз проведена микробиологическая трансформация фитостерина до 9а-гидроксиандростендиона без стадии химического выделения полупродукта -андростендиона - и применения дорогостоящих солюбилизаторов и токсичных органических растворителей.

Разработан экспериментальный подход микробиологического получения фармакологически ценного стероидного соединения - 3-метилового эфира ДГЭА с помощью культуры М. пеоаигит.

Практическая значимость

Усовершенствование процесса микробиологической трансформации стеринов с помощью культур М. пеоаигит и Я. егу^гороШ до АД, 9а-ОН-АД, ДГЭА позволило значительно поднять концентрацию стеринов и выход целевых продуктов, которые являются исходными субстратами для промышленных технологий получения высокоактивных стероидных лекарственных препаратов как у нас в стране, так и за рубежом.

Получен оригинальный селективный штамм Я. егугкгороШ и на его основе разработан новый микробиологический метод, который может быть использован в промышленном синтезе высокоактивных стероидных лекарственных препаратов, в том числе и фторированных.

С помощью нового штамма Я. егуНю-ороИя по